ES2548990T3 - Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante - Google Patents

Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante Download PDF

Info

Publication number
ES2548990T3
ES2548990T3 ES10716326.3T ES10716326T ES2548990T3 ES 2548990 T3 ES2548990 T3 ES 2548990T3 ES 10716326 T ES10716326 T ES 10716326T ES 2548990 T3 ES2548990 T3 ES 2548990T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polyomavirus
antigen
cell line
vector particles
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10716326.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Walter Gerhardus De Vries
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AMARNA HOLDING BV
Original Assignee
AMARNA HOLDING BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AMARNA HOLDING BV filed Critical AMARNA HOLDING BV
Application granted granted Critical
Publication of ES2548990T3 publication Critical patent/ES2548990T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/22052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante que no codifiquen un antígeno T pequeño poliomavírico funcional, que comprende las etapas de: a. Proporcionar una estirpe celular permisiva para poliomavirus natural, comprendiendo dicha estirpe celular un gen codificador de un antígeno T grande poliomavírico funcional integrado de manera estable en el genoma de la célula, en el que la estirpe celular no comprende un gen codificador de un antígeno T pequeño poliomavírico funcional, b. Introducir en dicha estirpe celular un ADN de poliomavirus que no codifique un antígeno T pequeño poliomavírico funcional y que tampoco codifique un antígeno T grande funcional, c. Cultivar dichas células en un medio de crecimiento en condiciones en las que la estirpe celular produzca el antígeno T grande en trans y que permita la formación de partículas de vector poliomavírico recombinante y d. Recoger las partículas de vector poliomavírico recombinante del cultivo celular.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E10716326
30-09-2015
reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias activadoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias cuando sea apropiado. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.989.
El término "heterólogo" se usa ampliamente por todo el documento para indicar que la secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de polinucleótidos, gen o secuencia de nucleótidos en cuestión han sido introducidos en dicha estirpe celular productora de vector vírico de polioma, usando ingeniería genética, es decir, por intervención humana. Un gen heterólogo puede reemplazar en principio un gen equivalente endógeno o ser adicional para los genes endógenos del genoma de la célula huésped o virus de polioma, es decir, que no se encuentra de manera natural en las células de las especies huésped o en virus de polioma.
Por “activador” se quiere decir una secuencia de ADN a partir de la cual se puede iniciar transcripción de ADN ligado de manera operable aguas abajo (es decir, en la dirección 3' en la hebra transcrita de ADN bicatenario). "Ligado de manera operable" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, colocada de manera conveniente y orientada para que se inicie la transcripción del activador. El ADN ligado de manera operable a un activador está “bajo regulación de iniciación transcripcional” del activador.
El activador puede ser un activador constitutivo, un activador inducible o activador específico del tejido. Los términos “constitutivo”, “inducible” y “específico del tejido” como se aplica a un activador es entendido por los expertos en la materia. El activador procede preferiblemente de virus, incluyendo repeticiones terminales largas en 5’ a partir de retrovirus y lentivirus, el activador temprano inmediato de citomegalovirus (CMVie), el activador de factor 1 alfa de elongación humano (EF-1 alfa) y similares. Dichos activadores están fácilmente disponibles y son conocidos en la técnica.
Por “señal de poliadenilación” se quiere decir una secuencia de nucleótidos a partir de los cuales se puede terminar la transcripción y se añade cola poli-A a la transcripción. Como señal de poliadenilación se puede usar cualquier señal de poliadenilación aplicable en células humanas o animales.
Una estirpe celular para uso en un método como se describe en la presente memoria puede proceder de cualquier estirpe celular adecuada conocida en la técnica tal como MDCK, PER.C6, HEK293, CV1 y similares, pero es preferiblemente una estirpe celular Vero o CHO.
Una estirpe celular adecuada es una estirpe celular permisiva de poliomavirus incapaz de expresar el antígeno T pequeño poliomavírico y comprende preferiblemente los siguientes elementos genéticos:
i) el antígeno T grande poliomavírico que codifica dominio o parte del mismo y opcionalmente
ii) un marcador seleccionable tal como un gen de resistencia a neomicina, gen de resistencia a puromicina, gen de resistencia a higromicina u otro marcador.
Dicha estirpe celular puede estar desprovista del intrón grande de la transcripción temprana de poliomavirus que alberga secuencias de ADN específicas del antígeno T pequeño.
La estirpe celular puede incluir una secuencia activadora transcripcional integrada de manera estable en el ADN cromosómico de la estirpe celular, de manera que se puede seleccionar además sobre la base de la actividad del activador transcripcional. Dichos marcadores y dichos procedimientos de selección son conocidos en la técnica.
Se pueden generar estirpes celulares de producción de vectores poliomavíricos diferentes, por ejemplo estirpes celulares productoras de vector vírico SV40, por transinfección de las células con diferentes sectores, tales como plásmidos, dependiendo de su linaje. La metodología para transinfección de estirpes celulares es conocida en la técnica. Por ejemplo, la estirpe celular Vero se usa ampliamente para la producción de partículas víricas para vacunas. Esto ha encontrado muchas aplicaciones en profilaxis de enfermedades víricas.
Una estirpe celular adecuada se puede obtener por transinfección con un primer plásmido que comprende los siguientes componentes:
i) el antígeno T grande poliomavírico que codifica dominio o parte del mismo, desprovisto del intrón grande de la transcripción temprana de poliomavirus que alberga secuencias específicas de antígeno T pequeño y opcionalmente
ii) un marcador seleccionable tal como un gen de resistencia a neomicina, gen de resistencia a puromicina, gen de resistencia a higromicina u otro marcador.
Así un solo vector o plásmido podía soportar tanto el dominio que codifica antígeno T grande poliomavírico como una secuencia marcadora seleccionable. También es posible que se utilicen dos vectores o plásmidos soportando ADN separados, uno soportando el dominio codificador de antígeno T grande poliomavírico y un segundo soportando el marcador seleccionable, dependiendo del diseño. Cualquier elemento genético adicional que se pueda
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E10716326
30-09-2015
requerir para conferir una capacidad de producción de vector poliomavírico en una estirpe celular productora también se puede poner en uno o más vectores de ADN o plásmidos que se puedan usar después para transinfectar la estirpe celular de producción de elección. Por ejemplo, la estirpe celular de producción Vero no contiene ya secuencias de antígeno T poliomavírico en ella, así se le puede añadir el dominio codificador de antígeno T grande, y las células productoras nacientes resultantes que albergan el dominio codificador de antígeno T grande en ellas se pueden seleccionar después, usando un sistema marcador seleccionable.
La presente descripción permite ahora por primera vez la preparación de composiciones que comprenden vectores poliomavíricos recombinantes en cantidades suficientes para fines terapéuticos, sin el riesgo de contaminación con poliomavirus naturales que se encuentran a partir de recombinación entre ADN de vector poliomavírico y ADN de célula huésped. Este fenómeno se describe bien en la bibliografía (Gluzman Y., Cell 23: 175 -182, 1.981; Oppenheim A. y Peleg A., Gene 77: 79 -86, 1.989; Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2.004).
La frecuencia con la que tiene lugar está recombinación está menos bien documentada sin embargo. Los cálculos varían enormemente. Shaul et al estimaron que la recombinación podía tener lugar con una frecuencia de al menos 10-6 (Shaul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3.781-3.784, 1.985), mientras que cálculos más recientes muestran una tasa de recombinación mucho mayor, del orden de 10-3 (Arad et al., Virology 304: 155-159, 2.002).
Un factor de complicación en la estimación de la frecuencia de recombinación es que el poliomavirus natural se replica más rápido que el vector poliomavírico recombinante que carece de antígenos T funcionales codificadores de genes.
Por lo tanto, se establece el número máximo de partículas de vector SV40 recombinante que se podía producir en un cultivo celular convencional de acuerdo con la técnica anterior, sin el aspecto de cualquier partícula revertiente de tipo natural.
Por lo tanto, se infectaron células COS-1 con partículas de vector SV40 recombinante de acuerdo con un protocolo clásico (Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 -791, 2.004) y se calculó el número máximo de partículas de vector vírico que se podían producir sin la aparición de un solo genoma detectable del virus natural como se detecta por un ensayo PCR cuantitativo muy sensible.
Se encontró que hasta 1 x 104 partículas de vector vírico se podían producir con seguridad sin la aparición de una cantidad detectable de partículas revertientes naturales en la mayoría de los experimentos realizados. Un número significativo de preparaciones comprendiendo 1 x 105 partículas de vector vírico sin embargo, fue positivo para partículas revertientes naturales, mientras que todas las preparaciones comprendiendo 1 x 106 partículas de vector vírico estaban contaminadas con virus naturales y así no eran seguras para uso médico.
El hecho de que las preparaciones de vector poliomavírico de acuerdo con la técnica anterior no son seguras para uso médico se subraya por el hecho de que las partículas SV40 naturales en las preparaciones que comprenden más de 1 x 106 partículas de vector SV40 recombinante fueron capaces de infectar células permisivas de SV40 in vitro cuando se ensayaron de acuerdo con un método de la técnica anterior como se describe por Katzman R. B. et al., (Journal of Virological Methods 150: 7 -13, 2.008).
La presente descripción permite ahora por primera vez la preparación de una composición que comprende más de 1 x 106 partículas de vector poliomavírico sin que esté presente ninguna partícula de poliomavirus natural en la composición. La descripción proporciona por lo tanto una composición que comprende más de un millón de partículas de vector poliomavírico recombinante que no codifican un antígeno T pequeño poliomavírico funcional y que tampoco codifican un antígeno T grande, siendo incapaces dichas partículas de poliomavirus de replicación en células que son permisivas para el poliomavirus natural, caracterizada por que la composición no contiene una única partícula de poliomavirus que sea capaz de replicación en células que sean permisivas para el poliomavirus natural en el que dichas células no expresan un antígeno T grande poliomavírico funcional. Dichas preparaciones pueden contener ventajosamente 1 x 107 partículas de vector o más, tal como hasta 1 x 108, 1 x 109,1 x 1010 ó 1 x 1011 partículas de vector o más.
La expresión “incapaz de replicación en células que son permisivas para el poliomavirus natural” significa que la composición no contiene una sola partícula de poliomavirus revertiente natural entre al menos 1 x 106 partículas de vector poliomavírico. Esto se puede medir por el ensayo PCR cuantitativo como se describe por Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 -791, 2.004 o infectando una estirpe celular permisiva para el poliomavirus natural presente en la composición. En el último caso, la ausencia de una única placa en el ensayo de placa (Katzman R. B. et al., Journal of Virological Methods 150: 7 -13, 2.008) indica la ausencia de una sola partícula de poliomavirus natural.
En una realización preferida, la preparación como se describe en la presente memoria se refiere a una composición que comprende un poliomavirus de primate, tal como un poliomavirus de simio, más en particular un SV40, virus de simio 12 (SV12), poliomavirus linfotrópico, poliomavirus de mono verde africano o poliomavirus de chimpancé. Las estirpes celulares permisivas para el poliomavirus de primate se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en: células Vero, células CV1, células PerC.6, células HEK293 y similares.
imagen7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E10716326
30-09-2015
El ADN de plásmido purificado del vector SV40 pSL-PL (De La Luna, S. et al., Journal of General Virology 74: 535 539, 1.993) se sometió a PCR usando oligonucleótidos WdV105 y WdV106. El fragmento de ADN multiplicado resultante comprendía la señal de poliadenilación de SV40 flanqueada por un sitio de restricción BamHI en el extremo 5’ y un sitio de restricción Notl en el extremo 3’. Este fragmento de señal de poliadenilación de SV40 se digirió con BamHI y Notl y el fragmento de ADN largo de 150 pb resultante se aisló de un gen de agarosa y se clonó en un plásmido pBluescript SK digerido asimismo (Promega), proporcionando pAM002.
Se sometió ADN de plásmido pEF5/FRT/5-DEST (Invitrogen) purificado a PCR usando los oligonucleótidos WdV101 y WdV102. El fragmento de ADN multiplicado resultante que comprendía la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (BGH, por sus siglas en inglés) flanqueada por un sitio de restricción Xhol y uno Notl con posterioridad en el extremo 5’ y un sitio de restricción Kpnl en el extremo 3'. Este fragmento de señal de poliadenilación de BGH se digirió con Kpnl y Notl, y se aisló el fragmento de ADN largo de 250 pb resultante de un gel de agarosa y se ligó al plásmido pAM002 digerido asimismo. Se realizó la transformación con esta mezcla de ligadura en una cepa E. coli insensible a metilación. Esto dio como resultado plásmido pAM003.
Se hibridaron los dos oligonucleótidos complementarios WdV103 y WdV104 incubándolos en un baño de agua que se dejó enfriar de manera autónoma desde la temperatura de ebullición a temperatura ambiente, proporcionando un dictador de and que contenía con posterioridad un sitio de restricción adherente Notl, un Padl, Sbfl, Pmel y un sitio de restricción intacto AscI y un sitio de restricción adherente Clal. Se ligó este ligador al plásmido pAM002 que se digirió con Notl y Clal y se aisló de un gel de agarosa. Se usó con posterioridad la mezcla de ligadura para transformar una cepa E. coli insensible a metilación, proporcionando pAM004.
Se digirió ADN de plásmido purificado del vector de SV40 pSL-PL con Clal y BamHI. El fragmento de ADN de 2,6 kb resultante que contiene el origen de SV40 y la región última de SV40 se purifica de agarosa y se clona en pAM004 digerido asimismo. Esto dio como resultado el nuevo plásmido de vector de SV40 pAM005.
Ejemplo 2: Clonación molecular de un vector de expresión de luciferasa de SV40 y la producción de partículas de vector de luciferasa de SV40 recombinante.
Se usó el plásmido de expresión pGL3 (Promega) como plantilla para clonar la luciferasa de luciérnaga usando PCR. Se diseñaron dos oligonucleótidos WdV389: 5'-TTGGCGCGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC-3' (SEC ID Nº 7) y WdV407: 5'-CCCTTAATTAATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC-3' (SEC ID Nº 8) que contenía respectivamente los sitios de restricción AscI y Pacl. El fragmento de luciferasa multiplicado de PCR se digirió con AscI y Pacl con posterioridad y se ligó en pAM005, dando como resultado pAM006.
Se diseñaron dos oligonucleótidos WdV437 5' GGGATCCAGACATGATAAGATACATTG 3' (SEC ID Nº 9) y WdV442: ATAGTTTAGCGGCCGCAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTG (SEC ID Nº 10) que contenían sitio de restricción respectivamente BamHI y Notl. Se usó el vector pSL-PL como plantilla para clonación de la secuencia remolque de antígeno T grande usando PCR. Se digirió el fragmento PCR resultante con BamHI y Notl y se clonó en el pAM006 de BamHI y Notl (parcialmente digerido), dando como resultado pAM020.
Se produjeron partículas de vector SV40 recombinante codificando la luciferasa de luciérnaga (SV-Luc) según Vera
M. et al., Molecular Therapy 10: 780 -791, 2.004. Se transinfectaron células COS-1 con ADN de pAM020 digerido y recircularizado con Not1 y tres días después de transinfección se prepararon lisados brutos del cultivo celular por congelación-descongelación repetida. Se multiplicaron las partículas de vector SV-Luc en una vuelta en células COS-1 creciendo en un matraz T175. Las partículas de vector SV-Luc se concentraron finalmente y se purificaron del lisado bruto por ultracentrifugación en gradiente de sacarosa, proporcionando un stock de vector con 5 x 1011 copias de genoma de SV-Luc por mililitro de cultivo celular.
Ejemplo 3: Construcción de un plásmido de expresión que codifica el antígeno T grande de SV40.
Se diseñó un sitio de clonación múltiple sintético (MCS, por sus siglas en inglés) conteniendo los sitios de restricción para Notl, Pacl, Sbfl, Pmel, AscI y Clal. Se diseñaron dos oligonucleótidos WdV436: 5'-GCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT-3' (SEC ID Nº 11) y WdV437: 3'-CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC-5'. (SEC ID Nº 12). Se hibridaron ambos oligonucleótidos WdV436 y WdV437 entre sí y se ligaron en pBluescript SK-(Promega), proporcionando el plásmido recombinante pAM007.
Se diseñaron dos oligonucleótidos para introducir un sitio de restricción Notl adicional WdV452: CGGCGGCCGCGTAC (SEC ID Nº 13) y WdV453: GCGGCCGC. Se hibridaron ambos oligonucleótidos y se ligaron a pAM007, proporcionando el vector recombinante pAM008.
El vector de expresión pLenti6.3/V5DEST__verA (Invitrogen) se usó como una plantilla para clonar el activador temprano inmediato de citomegalovirus (CMVie) usando PCR. Se diseñaron dos oligonucleótidos:
WdV286: 5'-TTGGCGCGCCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGG-3' (SEC ID Nº 14) y
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E10716326
30-09-2015
WdV220: 3'-GACAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGCGGAGGCTGGATCG-5' (SEC ID Nº 15) flanqueando el activador de CMV. Los oligonucleótidos WdV286 y WdV220 contenían los sitios de restricción AscI y HindlII respectivamente. Con posterioridad, se sometió pLenti6.3/V5DEST_verA purificado a PCR usando los oligonucleótidos WdV286 y WdV220, proporcionando un fragmento de ADN activador de CMV. Este fragmento fue digerido con AscI y Hindlll y ligado en pBluescript SK-, proporcionando pAM009.
El vector de expresión pGL4.22 (Promega) se usó como una plantilla para clonar el gen de resistencia a los antibióticos de puromicina N-acetiltransferasa usando PCR. Se diseñaron dos oligonucleótidos:
WdV454: 5'-CCACCCAAGCTTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCG-3' (SEC ID Nº 16) y
WdV455: 3'-TATCCGCTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGC-5' (SEC ID Nº 17) flanqueando el gen de resistencia a los antibióticos de puromicina N-acetiltransferasa y conteniendo los sitios de restricción Hindlll y Xhol, respectivamente. Se sometió plásmido pGL4.22 a PCR usando los oligonucleótidos WdV454 y WdV455, proporcionando el ADNc de puromicina N-acetiltransferasa. Este fragmento fue digerido con Hindlll y Xhol y ligado en pAM009, proporcionando pAM010.
El vector de expresión pEF5/FRT/5-DEST (Invitrogen) se usó como una plantilla para clonar la señal de poliadenilación de BGH usando PCR. Se diseñaron dos oligonucleótidos: WdV456: 5’-CAACCGCTCGAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3' (SEC ID Nº 18) y WdV457: 5'-CGGGGTACCCCATAGAGCCCACCGCATCCCC-5’ (SEC ID Nº 19) flanqueando la señal de poliadenilación y conteniendo los sitios de restricción Xhol y Kpnl, respectivamente. Se sometió el pEF5/FRT/V5-DEST de plásmido a PCR usando los oligonucleótidos WdV456 y WdV457, proporcionando el ADNc de la señal de poliadenilación de BGH. Este fragmento se digirió con Xhol y Kpnl y se ligó en pAM010, proporcionando pAM011.
Se digirió pAM008 de plásmido con AscI y Pmel y el fragmento de ADN que comprendía el dominio codificador de puromicina N-acetiltransferasa se purificó de un gel de agarosa y se ligó a pAM008, proporcionando pAM012. Se usó ADN de un clon de ADN de SV40 de longitud completa (número de ATCC VRMC-2) como plantilla para clonar la región codificadora de antígeno T de SV40 usando PCR. Se diseñaron dos oligonucleótidos: WdV408: ACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC (SEC ID Nº 20) conteniendo un sitio de recombinación attB1 y WdV409:
TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGG (SEC ID Nº 21) conteniendo un sitio de recombinación attB2. WdV408 y WdV409 fueron usados para multiplicar por PCR la región codificadora de antígeno T genómico. Con posterioridad se generó un clon de puerta de entrada del fragmento de ADN generado y pDONR221, dando como resultado pAM013. Se generó un plásmido de expresión de antígeno T por recombinación de la puerta entre pAM013 y pEF5/FRT/V5-DEST, dando como resultado pAM014.
Los sitios de restricción de Notl y Pmel en pAM014 de plásmido fueron eliminados por digestión con Notl y Pmel de pAM014 seguido por un tratamiento de ADN polimerasa T4 y ligadura de nuevo, proporcionando pAM015. Se aisló con posterioridad la casete de expresión de antígeno T por una digestión con Sphl seguido por un tratamiento de ADN polimerasa T4 y una digestión con Nrul.
Para generar un plásmido de lanzadera se diseñaron dos oligonucleótidos:
WdV448:
TCCTGCAGGCGGGGTACCCTAGTCTAGACTAGCCGCGGGGAGTTTAAACAGCT (SEC ID Nº 22) y
WdV449:
GTTTAAACTCCCCGCGGCTAGTCTAGACTAGGGTACCCCGCCTGCAGGAGTAC (SEC ID Nº 23) Se hibridaron los oligonucleótidos WdV448 y WdV449 generando un fragmento de ADN conteniendo los sitios de restricción Kpnl, Sbfl, Kpnl, Xbal, Sacll, Pmel y Sacl. Este fragmento de ADN se ligó en pBluescript SK-(Promega) digerido con Kpnl y Sacl, proporcionando pAM016. Se digirió pBluescript SK-de plásmido con Kpnl y Xbal y se aisló el fragmento de ADN MCS de un gel de agarosa. El fragmento de ADN de MCS se ligó en pAM016 digerido con Kpnl y Xbal, dando como resultado pAM017.
Se aisló la casete de expresión de antígeno T conducido por EF1 alfa de pAM015 por una digestión con Nrul y Sphl seguido por un tratamiento de ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN resultante se clonó en pAM017 digerido con EcoRV, dando como resultado pAM018.
Se digirió pAM018 de plásmido con Sbfl y Pmel y el fragmento de ADN que comprendía la casete de expresión de antígeno T se aisló de un gel de agarosa y se clonó en pAM012 digerido con Sbfl y Pmel, dando como resultado pAM019.
Se diseñaron cuatro oligonucleótidos: WdV487: 5'-GCAGGCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3' (SEC ID Nº 24) y WdV490: 3'-CCATTCATCAGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGCCTCCAAAG-5' (SEC
imagen8

Claims (1)

  1. imagen1
ES10716326.3T 2009-04-22 2010-04-22 Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante Active ES2548990T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09158498 2009-04-22
EP09158498A EP2243836A1 (en) 2009-04-22 2009-04-22 Method for the production of recombinant polymavirus vector particles
PCT/EP2010/055330 WO2010122094A1 (en) 2009-04-22 2010-04-22 Method for the production of recombinant polyomaviral vector particles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2548990T3 true ES2548990T3 (es) 2015-10-22

Family

ID=40983547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10716326.3T Active ES2548990T3 (es) 2009-04-22 2010-04-22 Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9587226B2 (es)
EP (2) EP2243836A1 (es)
JP (1) JP5756795B2 (es)
KR (1) KR101813723B1 (es)
CN (1) CN102695800B (es)
AU (1) AU2010240900B2 (es)
BR (1) BRPI1016173A2 (es)
CA (1) CA2759596C (es)
DK (1) DK2421982T3 (es)
EA (1) EA022206B1 (es)
ES (1) ES2548990T3 (es)
MX (1) MX2011010612A (es)
WO (1) WO2010122094A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2314707A1 (en) * 2009-10-26 2011-04-27 Amarna Therapeutics B.V. Method for the expression of a recombinant protein in a mammalian cell
WO2014008382A1 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for jc polyomavirus propagation and detection
WO2015075213A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Amarna Holding B.V. Method for restoring immune tolerance in vivo
EP3105311A1 (en) 2014-02-10 2016-12-21 Univercells NV System, apparatus and method for biomolecules production
CN105780797A (zh) 2014-12-26 2016-07-20 深圳市博德维环境技术有限公司 气膜建筑及其基础
NL2030945B1 (en) 2022-02-15 2023-08-21 Amarna Holding B V Polyomaviral gene delivery vector particle comprising a nucleic acid sequence encoding a phosphatase activity-possessing polypeptide
NL2033264B1 (en) 2022-10-10 2024-04-26 Amarna Holding B V Composition and method for the production of polyomaviral vector particles

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999027123A2 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Modified sv40 viral vectors
IL145463A0 (en) 2001-09-16 2002-06-30 Yissum Res Dev Co A packaging complementation cell-line for sv40 vectors
CN100577808C (zh) * 2003-09-09 2010-01-06 艾塞特生物技术有限公司 利用多瘤病毒和eb病毒序列的啮齿动物表达系统
WO2005024030A1 (en) 2003-09-09 2005-03-17 Acyte Biotec Pty Ltd Rodent expression systems utilising polyoma virus and epstein barr virus sequences
GB2439543A (en) 2006-06-27 2008-01-02 Viruvation B V Polyoma viral vector production cell lines and nucleic acids expressing dsRNA viral sequences

Also Published As

Publication number Publication date
EP2421982B1 (en) 2015-07-01
BRPI1016173A2 (pt) 2019-10-01
CN102695800B (zh) 2015-11-25
EA022206B1 (ru) 2015-11-30
KR101813723B1 (ko) 2017-12-29
JP5756795B2 (ja) 2015-07-29
KR20120006062A (ko) 2012-01-17
US20120040399A1 (en) 2012-02-16
AU2010240900A1 (en) 2011-10-20
CN102695800A (zh) 2012-09-26
DK2421982T3 (en) 2015-10-05
EP2243836A1 (en) 2010-10-27
US9587226B2 (en) 2017-03-07
EP2421982A1 (en) 2012-02-29
EA201101532A1 (ru) 2012-04-30
MX2011010612A (es) 2012-01-12
CA2759596C (en) 2017-08-01
WO2010122094A1 (en) 2010-10-28
AU2010240900B2 (en) 2015-06-11
JP2012524531A (ja) 2012-10-18
CA2759596A1 (en) 2010-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2548990T3 (es) Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante
Kriegler Gene transfer and expression: a laboratory manual
JP6093358B2 (ja) アデノ随伴ウイルスベクターの産生細胞
PT2699270T (pt) Viriões de vírus adeno-associado com cápside variante e métodos de utilização dos mesmos
ES2931180T3 (es) Sistema de tipo Tet-on lentivírico de promotor dual muy inducible
Rupprecht et al. Controlled removal of a nonviral episomal vector from transfected cells
WO2016077938A1 (es) Plásmidos y método para obtener partículas virales
Kruse et al. Cre/LoxP-HBV plasmids generating recombinant covalently closed circular DNA genome upon transfection
Zhang et al. A vector based on the chicken hypersensitive site 4 insulator element replicates episomally in mammalian cells
Ortı́n Multiple levels of posttranscriptional regulation of influenza virus gene expression
Vera et al. Factors influencing the production of recombinant SV40 vectors
JP6795530B2 (ja) 大きな核酸をクローニングするためのアデノウイルスベクターを作製する手段
Arad et al. A new packaging cell line for SV40 vectors that eliminates the generation of T-antigen-positive, replication-competent recombinants
US20170159070A1 (en) Transposon for genome manipulation
CA2655725A1 (en) Improvements in or relating to organic compounds
ES2809479T3 (es) Composiciones promotoras
US20120237974A1 (en) Method for the expression of a recombinant protein in a mammalian cell
US20050118699A1 (en) Packaging complementation cell-line for sv-40 vectors
US20230175011A1 (en) Maintaining dna fragments in eukaryotic cells, approaches and uses
Choi et al. Evaluation of tTA-mediated gene activation system on human cytomegalovirus and herpes simplex virus type-1 infections
Ackford Optimizing Foreign Gene Expression in Recombinant Fowl Adenovirus 9 Vectors
EP2589661A1 (en) Posttranscriptional Element
ITMI20120489A1 (it) Sistema di espressione gspe-express