WO2016077938A1 - Plásmidos y método para obtener partículas virales - Google Patents

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Marcelo CORTEZ SAN MARTÍN
Eugenio Spencer Ossa
Carolina TAMBLEY ZAMORANO
Daniela TORO ASCUY
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Universidad De Santiago De Chile
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine, veterinary medicine, molecular biology, immunology and biotechnology, specifically, with the development of vaccines and adjuvants therefor, and treatments.
  • the scope of the invention corresponds mainly to the aquaculture industry. More specifically, the present invention relates to a viral RNA expression plasmid and a method of obtaining viral particles based on said plasmids.
  • ISA Infectious salmon anemia
  • Atlantic salmon Salmo salar
  • ISA Infectious salmon anemia
  • the clinical signs of this disease are the presence of pale gills, ascites, hemorrhagic liver necrosis, splenomegaly, congestive bowel and severe anemia (14).
  • ISA was first reported in Norway in 1984 (28), subsequently diagnosed in Canada (4), Scotland (27), United States (18), Faroe Islands (Denmark) (18) and Chile (16).
  • the etiologic agent of this disease is a pleomorphic virus wrapped in
  • infectious salmon anemia virus which belongs to the family Orthomixoviridae (8). Its genome consists of 8 negative polarity ssRNA segments (ns-RNA) that code for 10 proteins and that have non-translatable regions (UTR) at both ends (26).
  • Segment 5 codes for the Fusion protein (F), which has been shown to be present on the surface of the viral membrane, allowing in the first steps of infection, the fusion of the viral particle membrane with the cell endosome, allowing the release of RNPs to the cell cytoplasm (3).
  • Segment 6 codes for the Hemagglutinin-Esterase (HE) protein, which is also present on the viral surface and whose function is to bind a sialic acid residue located in the cellular receptor (15). The HE protein also exhibits receptor destructive activity (RDE), thus favoring the release of new viral particles that emerge from the cell membrane (21).
  • F Fusion protein
  • RDE receptor destructive activity
  • HPR Highly Polymorphic Region
  • the first HPRO strain was identified in Scotland in wild salmon that had no clinical signs of ISA, categorized as an avirulent strain
  • segment 7 is suggested to code for nonstructural proteins analogous to NS1 and NS2 of influenza A virus (19).
  • segment 8 encodes a transcript containing two overlapping open reading frames (ORFs).
  • the ORF1 encodes the matrix protein (M) and the ORF2 codes for the M2 protein, it has been shown that the M2 protein is involved in modulating the type I IFN response in conjunction with the NS1 protein (12).
  • Influenza Virus In the case of Influenza Virus, the detailed study of the virus has been possible thanks to the development of a reverse genetics system, which allows manipulating the genome of the virus, being able to determine the possible causes of virulence, as well as the detailed study of each one of the functions of viral proteins (13).
  • the most commonly used reverse genetics system in Influenza virus corresponds to the plasmid-based system and allows the generation of recombinant viruses from cloned cDNAs.
  • the 8 genomic RNAs are transcribed under the command of the RNA Polymerase I and at least the proteins that constitute the ribonucleoproteic complex are expressed under the command of RNA polymerase II (10, 24).
  • the present invention demonstrates that the ITS-1 region of salmon rDNA from Atlántico has a transcription promoter activity, which has been maintained for millions of years, however, to confirm this statement it was necessary to perform in vitro transcription assays.
  • the present invention seeks to solve the problem of the technique of providing a molecular genetic system that allows to obtain particles Functional virals from ns-RNA.
  • Another objective of this invention is to provide a method of expressing autogenous or exogenous proteins to the viral particle employed, as well as expressing RNA nucleic acids of the interfering RNA type.
  • ASK cells (www.atcc.org, CRL 2747) derived from Atlantic salmon kidney were grown in Leibovitz medium (L-15, Hyclone) supplemented with 50 ⁇ g / mL gentamicin, 10% fetal bovine serum (SFB, Corning cellgro®, Mediatech), 6 mM L-glutamine (Corning cellgro®, Mediatech) and 40 ⁇ -mercaptoethanol (Gibco®, Life Technologies).
  • Leibovitz medium L-15, Hyclone
  • RTG-2 cells (http: //www.phe- culturecollections.org.uk, ECACC 90102529) derived from rainbow trout gonad tissue were cultured in minimal essential medium (MEM, Hyclone) supplemented with 50 ⁇ g / mL gentamicin , 10% SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 10 mM L-glutamine (Corning cellgro®, Mediatech), 1% non-essential amino acids (Hyclone) and 10 mM HEPES (Hyclone).
  • MEM minimal essential medium
  • CSE-1 19 cells derived from coho salmon embryo http://www.phe-culturecollections.org.uk, ECACC 95122019) were cultured in minimal essential medium (MEM, Hyclone) supplemented with 50 ⁇ g / mL gentamicin, 10% SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 2 mM L-glutamine (Corning cellgro®, Mediatech), 1% non-essential amino acids (Hyclone). Cell lines were grown at 16 ° C without CO 2 , with the exception of CSE-1 19.
  • MEM minimal essential medium
  • HEK293 (ATCC CRL 1573) human embryonic kidney cells were cultured in Eagie's Minimum EssentiaS medium (EMEM, Hyclone) supplemented with 50 ⁇ / ⁇ gentamicin, 10% SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 10 mM L- glutamine (Corning cellgro®, Mediatech), 1% non-essential amino acids (Hyclone) and 10 mM HEPES (Hyclone).
  • EEM Eagie's Minimum EssentiaS medium
  • ST cells (www.atcc.org, CRL 1746) cells derived from pig testis, were grown in Eagle "s Minimum Essen ⁇ iai medium (EMEM, Hyclone) supplemented with 50 ⁇ g / mL gentamicin, 10% SFB (Corning cellgro ®, Mediatech), 10 mM L-glutamine (Corning cellgro®, Mediatech), 1% non-essential amino acids (Hyclone) and 10 mM HEPES (Hyclone).
  • EMEM Eagle "s Minimum Essen ⁇ iai medium
  • Virus purification was performed from 40 mL of supernatant from ASK cells infected with strain ISAV901_09. After 14 days post infection, the cell supernatant was taken and clarified at 1 000 x g for 20 min at 4 ° C. Then the supernatant was ultracentrifuged at 133,200 x g for 2 hours at 4 ° C and the pellet obtained was suspended in 100 ⁇ of TNE buffer overnight at 4 ° C. Then the suspension was loaded in 4 mL of a 20% w / v sucrose mattress in TNE buffer and ultracentrifuged at 124,200 x g for 2 hours at 4 ° C and finally the obtained pellet was resuspended in 50 ⁇ of TNE buffer. Viral RNA Extraction
  • RNA viral RNA
  • the extraction of viral RNA (vRNA) was performed from 50 ⁇ of purified ISAV901_09 virus, using the commercial kit EZNA Total RNA Kit II (Omega, Bio-Tek, Inc.) according to the manufacturer's instructions. Subsequently the RNA Purified was quantified by measuring the absorbance at 260 nm by the Nanoquant Infinite M200 pro kit (TECAN, Austria) and a vRNA concentration of 2.7 pg / pL was obtained. The vRNA was stored at -80 ° C until use.
  • Sequences were included that include the 5 'and 3' UTR non-coding ends of the eight genomic segments of Fourrier and cois., Kulshreshtha and cois., And Merour and cois., Publications (1, 1, 17, 20). These sequences correspond to two Scottish isolates (390/98 and 982/08), one Norwegian isolate (Glesvaer / 2/90), two Canadian isolates (NBISA01 and RPC NB 98-049) and one Chilean (ADL-PM 3205 ISAV) . Multiple alignment was performed using the ClustalW2 program. With the analysis of the alignments, the universal splitters were designed to amplify the entire 8 segments including the 5 'and 3' UTR regions of any ISAV strain (Table I). RT-PCR
  • the viral RNA of ISAV901_09 (7) was obtained by extraction from purified virus, the cDNA of the eight genomic segments was obtained by RT-PCR.
  • the SuperScript TM One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) kit was used following the manufacturer's instructions.
  • the first F ⁇ forward) (10 ⁇ ) and corresponding first R (reverse) (Table I) and 50 ng of viral RNA were used.
  • Taba 1 Splitters to amplify the 8 complete ISAV segments Splitter splitter F (forward) 5 'to 3' splitter R (reverse) 5 'to 3'
  • the cDNAs of the ISAV genomic segments were cloned into the pGEMT-easy vector (Promega) following the manufacturer's instructions. Three clones of each plasmid were sequenced using the universal splitters for T7 and SP6 promoter, in addition to internal splitters for each segment as described in Cottet and cois (7).
  • Vector pSS-UGR / S6-Notl-HPR and pSS-UGR / S6-EGFP-HPR A construct was designed based on the pSS -URG vector that has the complete sequence (including 3 'and 5' UTR ends) in antisense and inverted segment 6 of ISAV 901_09. As a marker, the vector has added frame in the region of segment 6 HPR exactly nine nucleotides containing the restriction site for NotI enzyme nt 1 015 5 '- gtagca [GCGGCCGCA] acatct-3' nt 1 036 ( Figure 2). The designed vector, which was called pSS-UGR / S6-Notl-HPR, was synthesized in GenScript Co.
  • ASK cells were seeded at a density of 2.5 x 10 4 cells / cm 2 per well in a 24-well plate (SPL), in Leibovitz Medium (L-15, Hyclone) supplemented with gentamicin (50 g / mL) and 10% fetal bovine serum (SFB, Hyclone) grown at 18 ° C until reaching a confluence of 80%.
  • the cells were transfected with the pSS-URG / S6-Notl-HPR vector, using Fugene 6 (Promega) in a 1: 6 ratio according to the manufacturer's specifications.
  • RNA obtained was subjected to RT-PCR using splitters for the Notl restriction site and the 5 ' UTR end of the viral segment 6 (Table 3).
  • CDNA was obtained by reverse transcription (RT) using the enzyme M-MuLV Reverse Transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, 2001 ⁇ / ⁇ _ New England BioLabs). Reverse transcription mixing was performed at a final volume of 25 ⁇ according to the manufacturer's specifications. Subsequently, the cDNA was used to perform a PCR reaction, with the Paq5000 DNA polymerase (Agilent Technologies). The PCR products were visualized by electrophoresis at 90 volts for 1 h in a 2% agarose gel stained with ethidium bromide (10 mg / mL) ( Figure 3).
  • ASK cells were seeded at a density of 2.5 x 4 4 cells / cm 2 in Nunc TM Lab-Tek TM II Chamber Slide TM System plates and then incubated for 72 h at 18 ° C.
  • the cells were transfected by Fugene 6 (Promega) 1: 6 according to the manufacturer's specifications.
  • Fugene 6 Promega
  • For the generation of ISAVr 901 - 09 a total of 250 ng of a mixture of the vectors pTriex-3-PB2, pTriex-3-PB1, pTriex-3- ⁇ and pCI-neo-NP and 1 ⁇ g total of the eight pSS-URG vectors (pSS-URG / 1-8).
  • ASK cells were seeded at a density of 2.5 x 10 4 cells / cm 2 per well in 8-well Nunc TM Lab-Tek TM II Chamber Slide TM System plates and were cultivated at 16 ° C until reaching 90% confluence. Then, the cells were washed with PBS twice and blind passages were made with 100 ⁇ _ of a 1: 10 dilution of the supernatant either from passage 0 (P0) at 7 days post transfection or from the different passages at 7 days post ISAVr S6 EGFP " HPR infection in L-15 medium without SFB with gentamicin (50 pg / rnL).
  • RNA extraction, RT-PCR and qRT-PCR in real time RNA extraction, RT-PCR and qRT-PCR in real time:
  • RNA of 350 ⁇ was extracted from the supernatant of the ASK cells transfected with the 12 plasmids at 7 days post transfection (P0 of ISAVr S6 "EGFP" HPR ) or supernatants from the 1st passages on the 4th, with the extracted RNA the segment 6 RNAv, EGFP and Segment 6-EGFP were detected by RT-PCR.
  • the GoTaq® Green Master Mix (Promega) kit and the Forward (S6 or EGFP) and Reverse (S6 or EGFP) splitters were used.
  • the thermal program used corresponds to: 95 Q C for 2 min, 35 cycles of 95 Q C for 30 s, 59.1 Q C for EGFP or 54 ° C for S6 or S6-EGFP 30 s, 72 Q C for 30 s and a final extension of 72 Q C for 5 min.
  • a re-amplification of the PCR products was performed using the same splitters.
  • the PCR re-amplification products were visualized by 1% agarose gel electrophoresis (w / v) run at 90 V for 45 min and stained with ethidium bromide (10 mg / ml_).
  • a real-time qRT-PCR was performed using the absolute quantification method described by Mu ⁇ ir and Kibenge (22), making a standard curve from plasmid pSS-URG / S8.
  • the real-time RT-PCR analysis was carried out on the Eco Real-Time PCR System (lllumina) using the SensiMix TM SYBR® Hi-ROX Kit (Bioline) commercial kit according to the manufacturer's instructions, using the F-S8 and R-S8 splitters (Table 4).
  • the thermal profile used to amplify the region of segment 8 was 1 cycle of initial denaturation of 10 min at 95 Q C, followed by 40 cycles of amplification (15 s to 95 ° C, 15 s to 60 Q C and 15 s to 72 Q C). After the amplification cycles a dissociation cycle was performed (30 s at 95 ° C, 30 s at 55 ° C and 30 s at 95 ° C). This procedure was performed for passage 4 of the recombinant virus. The results obtained were analyzed in the EcoStudy software program. Confocal Microscopy
  • ASK cells infected with rlSAVS6-EGFP-HPR in each passage of the recombinant virus were analyzed by confocal microscopy using the procedure described by Rivas-Aravena and cois. (Four. Five).
  • the fixed cells were observed with an LSM 510 confocal microscope (Zeiss) using the LSM image Browser program to detect rlSAVS6-EGFP-HPR by visualizing the fluorescence of EGFP.
  • rISAV was detected using anti-HE monoclonal antibody (BiosChile) as previously described (45).
  • ASK cells were seeded at a density of 2.5 x 4 4 cells / cm 2 per well of a 12-well plate (SPL) and incubated at 16 ° C to reach a confluence of 100%. Titration of the ISAVr S6 "EGFP" HPR variant of Passage 4 was performed. The procedure was performed as described by Castillo-Cerda et al (35).
  • ASK cells were seeded at a density of 2.5 x 4 4 cells / cm 2 per well in a 48-well plate (SPL) and incubated at 16 ° C to reach a confluence of 100%.
  • a titration of the passage 4 of ISAVr S6 "EGFP" HPR was performed .
  • serial dilutions of each viral inoculum were made with a dilution factor 10 from 10 "1 to 10 " 6 in L-15 medium without SFB. Then, the culture medium was removed and 400 ⁇ of viral inoculum was added to each well and incubated at 16 ° C for 4 h to allow adsorption of the virus.
  • the inoculum was removed from each well, the cells were washed twice with PBS and then the L-15 medium supplemented with 10% SFB, 6mM L-glutamine (Corning cellgro®, Mediatech), 40 ⁇ ⁇ - was added mercaptoethanol (Gibco®, Life Technologies), gentamicin 50 ⁇ g / mL.
  • the plates were incubated for 7 days at 16 ° C.
  • supernatants from each well were analyzed by quantifying fluorescence using the Nanoquant Infinite M200 pro equipment (TECAN, Austria), exiting at 485 nm and capturing the emission at 535 nm. These supernatants were also used for total RNA extraction and subsequent real-time qRT-PCR to quantify the RNAv of segment 8 of ISAV, and thus determine the number of copies of segment 8 of the cell culture as described above.
  • HPR HPR , using as control the fourth passage of ISAVr 901 - 09 , in addition to the wild ISAV901_09.
  • an infection with an MOI of 0.01 was performed for each viral isolate.
  • the kinetics of infection was performed by collecting samples at 0, 2, 4 and 7 days post infection, then RNA extraction, DNase treatment and then a real-time qRT-PCR was performed to quantify the RNAv of segment 8 of ISAV of each cell culture supernatant (22).
  • Particle display ASK cells were seeded as indicated above and were grown at 16 Q C until 90% confluence was reached. Cells were then infected with 400 ⁇ of a 1: 10 virus isAVr S6 EGFP "HPR in their 4th passage or 4th passage rISAV 901-09 or ISAV901_09 wild as a control Four days after infection the cells. They were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer at pH 7.2 for 6 hours at room temperature and then washed with 0.1 M sodium cadodilate buffer at pH 7.2 for 18 h at 4 Q C.
  • Figure 1 Obtaining the plasmids that will allow the transcription of the 8 RNAv of ISAV901_09: (1) Plasmids pSS-URG and the plasmid containing each of the genomic segments of ISAV are digested with the restriction enzyme Sapl. The digestion products are visualized on a 1% agarose gel, and Then they are purified. (2) The digested product corresponding to the genomic segment of ISAV and the plasmid pSS-URG that is linear are ligated with T4 ligase, to subsequently use this ligation to transform chemocompetent bacteria. (3) From the clones containing the expected recombinant plasmids a purification is performed to corroborate the correct insertion of the genomic segment by sequencing
  • Figure 2 Scheme of the design of the pSS-URG, pSS-URG / S6-Notl and pSS-URG / S6-EGFP-HPR cassettes.
  • the universal vector contains the sequence of: promoter of S. salar (SS prom); ribozyme hammerhead (HH rib); hepatitis ⁇ virus ribozyme (HDV rib); ⁇ -globin rabbit transcription terminator (Term).
  • Plasmid pSS-URG / S6-Not and pSS-URG / S6-EGFP-HPR contain the antisense and inverted segment 6 cDNA, which includes the 5 'and 3' UTRs and their respective modifications; the restriction site A / I heard / or the EGFP coding sequence.
  • Figure 3 RT-PCR of the 6-Notl-HPR segment from ASK salmon cells transfected with plasmids pSS-URG / S6-Not-HPR. Agarose gel electrophoresis of segment 6 RT-PCR products at different post transfection times. ASK cells were transfected using Fugene 6 (Promega), the plasmid used was pSS-URG / segment 6.
  • Figure 4 Reverse genetics to obtain recombinant ISA viruses: ASK cells are transfected with the 8 plasmids pSS-URG / S1 -8, which will allow transcription of the 8 vRNA (ISAV genome), together with 4 plasmids that will allow The expression of the proteins that make up the cRNP (PB2, PB1, PA and NP). Co-transfection of these 12 plasmids in the same cell will allow the formation of the 8 cRNP in the nucleus, which are the minimum unit necessary to form an ISAV viral particle. These cRNPs will allow the transcription and replication of the vRNAs, allowing the synthesis of all the proteins that form the virus and the generation of new cRNPs, thus forming recombinant viral particles.
  • Figure 5 RT-PCR of the 6-Notl-HPR segment from ST (a) and human HEK-293 (b) pig cells, both transfected with plasmid pSS-URG / S6-Notl-HPR using Fugene 6 (Promega) . Agarose gel electrophoresis of segment 6 RT-PCR products at different post transfection times.
  • Figure 6 Electron Microscopy Analysis of recombinant ISAVs from sections of infected ASK cells. Cytoplasmic membrane with ISAV particles emanating from infections with: (A) WT ISAV 901_09, (B) rlSAVS6-EGFP-HPR and (C) rISAV 901_09. (D) Endosomal section showing rISAV 901 _09 particles within endosomes, which would correspond to the initial steps of the fusion of viral and endosomal membranes. Bar: 200 nm
  • Genome of strain ISAV 901 _09 adapted to cell culture
  • the complete genome of a viral isolate adapted to cell culture such as ISAV 901_09 was sequenced.
  • the alignments between the non-coding regions (UTR) of the 5 'and 3' ends of the complete sequences of the six isolates of ISAV, two Scots (390/98 and 982/08), one Norwegian (Glesvaer / 2/90) , two Canadians (NBISA01 and RPC NB 98-049) and one Chilean (ADL-PM 3205 ISAV) have a high conservation at the ends of each viral genomic segment, which allowed designing the universal splitters described in Table I.
  • the splitters were used to amplify the genome of the Chilean strain ISAV 901 _09.
  • the result of the sequencing of the eight viral genomic segments is shown in Table IV.
  • the sizes of the eight viral segments range from 2267 bp to 906 bp for segments 1 and 8, respectively.
  • the sequence of the 3'UTR regions was found to vary from 7 nucleotides in segment 6 to 48 nucleotides in segment 3, there being no differences in the size of each 3 ' UTR end previously described for the 6 genomes analyzed, except for the addition of a nucleotide at the 3'end UTR of segment 7.
  • the sequences of the ends of ISAV 5'UTR 901_09 range from 67 nucleotides in the segment 4-147 nucleotides in segment 3.
  • the alignment of the UTR regions also indicate that ISAV 901 _09 has a high similarity with the ISAV strain Glesvaer / 2/90 (between 97% and 98% identity).
  • RNA viruses such as Hammerhead ribozymes and of the hepatitis delta virus ( ⁇ ), together with genomic elements of the species Salmo salar.
  • the designed vector was called pSS-URG (plasmid for Salmo salar Universal Reverse Genetic).
  • the correctly spliced elements Containing the vector ordered from left to right are: As a promoter the ITS-1 region of Salmo salar, a sequence of the Hammerhead ribozyme, the hepatitis delta virus ( ⁇ ) ribozyme, and between the sequences of the two Ribozymes incorporate two cutting sites for the enzyme Sap I (New England Biolabs) and finally as a transcription terminator the rabbit beta globin terminator was incorporated ( Figure 2).
  • This vector would allow cloning without incorporating additional sequences, any viral segment, thanks to the use of a distant cutting enzyme such as Sap I. In this way a vector is presented that will be the basis of the reverse genetics system for the ISA virus. .
  • the eight genomic segments of ISAV were subcloned into it from the synthetic genomes using the distant cutting enzyme Sap I (Data not shown).
  • Sap I distant cutting enzyme
  • two genetic elements were inserted into the HPR zone of the universal vector containing the universal segment 6.
  • the first genetic variant corresponds to the insertion in the HPR zone of a sequence of nine nucleotides with the cut-off site for the Notl enzyme, naming this new vector pSS-URG / S6-Notl-HPR.
  • a second genetic variant corresponds to the cloning product of the sequence that codes for EGFP using the previously created Not I site, thus obtaining the new vector called pSS-URG / S6-EGFP-HPR. Functionality analysis of the pSS-URG vector by ex vivo transcription assay
  • ASK cells were transfected with plasmid pSS-URG / S6-Notl-HPR in an ex vivo transcription assay.
  • the functionality analysis was performed by detecting the RNAv at times 0, 3, 6, 9, 12 and 15 hours post transfection (hpt) through RT-PCR.
  • the reverse transcription reaction was performed using a single first complementary to the Not I restriction site. Surprisingly the result of the analysis allows visualizing a PCR product from 3 hpt, which increases in intensity until 15 hpt ( Figure 3) .
  • RNA can be expressed in the form of interfering RNAs, silencing RNAs or also micro RNAs.
  • the minimum functional unit of the virus corresponds to the Ribonucleoproteic complex (RNP), which consists of viral RNA that is bound by multiple copies of NP and by the viral polymerase that includes the PB1, PB2 and subunits. PA.
  • RNP Ribonucleoproteic complex
  • the ORFs of segments 1 to 4 of ISAV901_09 were cloned into expression vectors commanded by the Cytomegalovirus promoter.
  • the vector pTriex-3 Novagen
  • the ORFs of segments 1, 2 and 4 were cloned, obtaining vectors pTRiex3-PB2, pTRiex3-PB1, pTRiex3-PA.
  • segment 3 was cloned, generating the pCI-neo-NP vector (Data not shown).
  • the transfection of these vectors into salmon cells allows the expression of the recombinant proteins PB2, PB1, PA and NP respectively.
  • ASK cells were co-transfected with twelve plasmids, of which four correspond to the expression vectors pTRiex 3-PB2, pTRiex 3-PB1, pTRiex 3-PA and pCI-neo-NP and the remaining eight correspond to plasmids for genetics reverse pSS-URG with each of the eight genomic segments of ISAV901_09 in the form of DNA, replacing the native segment 6 with Seg6-Notl-HPR.
  • pTRiex 3-PB2 corresponds the expression vectors pTRiex 3-PB2, pTRiex 3-PB1, pTRiex 3-PA and pCI-neo-NP and the remaining eight correspond to plasmids for genetics reverse pSS-URG with each of the eight genomic segments of ISAV901_09 in the form of DNA, replacing the native segment 6 with Seg6-Notl-HPR.
  • RNAv (Notl / HPR) was detected, by RT-PCR, obtaining a product of expected size of 306 bp both in the RNA extracted from the transfection supernatant and from the two subsequent passages suggesting the presence of infectious viruses.
  • the supernatant from the second passage was used to infect a greater amount of ASK cells. From the infected cells, which showed an obvious cytopathic effect (data not shown), the recombinant virus was visualized by transmission electron microscopy.
  • Figure 6 shows spherical particles similar to viruses with diameters close to 100 nm, suggesting that they correspond to recombinant viruses.
  • ASK cells were co-transfected with twelve plasmids at once: four of them correspond to the expression vectors pTRiex 3-PB2, pTRiex3-PB1, pTRiex3-PA and pCI-neo-NP; the remaining eight plasmids correspond to the vectors pSS-URG / 1, pSS-URG / 2, pSS-URG / 3, pSS-URG / 4, pSS-URG / 5, pSS-URG / 7 and pSS-URG / 8; also incorporating segment 6 with the vector pSS-URG / S6-EGFP-HPR, the virus that contains EGFP in the HPR zone of the HE protein will be called ISAVr
  • the culture supernatant (Passage 0, P0) was analyzed at 7 days post-transfection (dpt). For this, the RNAv of Segment 6, as well as the coding sequence of EGFP in a second PCR product, and finally an area containing both Segment 6 and EGFP part was initially detected by RT-PCR. The results showed that the RT-PCR products for Segment 6 have a difference in the migration distance of the PCR products, for the native virus (-300 bp) and the recombinant virus that possess EGFP in the HE protein (1 .000 bp).
  • the RT-PCR of the EGFP coding sequence has a -500 bp product, which is not observed in the native virus analyzed.
  • an amplification product of -800 bp for the recombinant virus was obtained as expected. Infectivity of the iSAVr S6 EGFP HPR in ASK cells
  • EGFP fluorescence was used as a reporter.
  • ASK cells infected with the supernatant containing the first ISAVr S6 EGFP HPR progeny were analyzed under a confocal microscope at 7 days post infection. The results of the analysis show that it is possible to visualize cells that emit green fluorescence attributable to EGFP, corresponding to the first passage of the ISAVr S6 "EGFP" HPR virus.
  • the distribution of the EGFP brand is mainly in the cytoplasm and towards the plasma membrane, fluorescence not being observed in the cell nucleus.
  • a lysis plate assay was performed on ASK cells. The result of the lysis plate test showed that the recombinant virus has the ability to generate lysis plaques just like the wild virus, obtaining a viral titer of the order of 1 x 10 4 PFU / mL.
  • this recombinant virus was evaluated.
  • Four blind passages of infection were made in ASK cells with 7-day lapses.
  • a RT-PCR was performed to detect the RNAv of both Segment 6, and the coding sequence for EGFP and a region of the hybrid sequence EGFP-S6.
  • the result of the analysis allowed to visualize a 500 bp EGFP PCR product and the 800 bp EGFP-S6 hybrid sequences, indicating the presence of segment 6 containing the EGFP gene in all the supernatants analyzed.
  • the PCR product of segment 6 shows a 300 bp product in the supernatant of ASK cells infected with wild ISAV901_09 virus as expected, contrasting with the 1,000 bp of the PCR product obtained in each of the four passages of the virus ISAVr S6 "EGFP" HPR , whose larger size is the consequence of having incorporated the EGFP gene into segment 6.
  • an analysis was performed by confocal microscopy in ASK cells infected.
  • the lSAVr S6 "EGFP" HPR virus acquires the ability to infect other species of salmonids or loses infectivity in permissive cells (ASK cells), an infection kinetics was performed in RTG-2, CSE-1 19 and ASK cells.
  • the ex vivo assay was performed for 7 days using the fluorescent fourth passage of recombinant virus and compared to the wild virus ISAV901_09 and the fourth passage of a wild type recombinant virus generated for this assay rISAV 901-09 (MOI of 0.01) .
  • the analysis at 0, 2, 4 and 7 dpi performed by qRT-PCR quantifying the number of copies of segment 8 in each supernatant showed that none of the three viruses analyzed had the ability to replicate in RTG-2 cells or CSE-1 19 cells.
  • RNAv RNA was transfected into ASK cells, using Fugene 6 (Promega) at a 1: 6 ratio and according to the specifications of the maker.
  • Fugene 6 Promega
  • the transfection kinetics which occurs at 0, 3, 6, 9, 12 and 15 hpt, the cells are removed to perform total RNA extraction, the possible contaminating DNA was removed with DNase I.
  • RNAv of segment 6 Notl was detected the RNAv of segment 6 Notl by RT-PCR using splitters specific for segment 6 Notl.
  • the analysis allows observing a PCR product of expected size of 306 bps from 3 hpt, which increases in intensity until 15 hpt ( Figure 3). Therefore, it is shown that plasmid pSS-URG is functional.
  • the ability to transcribe viral RNA is not limited to salmon cells cultured at 16 QC .
  • functionality was observed in the human cell line.
  • ISAVr correlation between the number of viral copies and the measured fluorescence
  • the ISAVr S6 "EGFP" HPR virus has similar characteristics to the wild virus by infecting ASK cells, and also has the advantage of being able to monitor the infection thanks to the incorporation of EGFP as a reporter, it was proposed to determine if there is a correlation between viral load and fluorescence in the infection supernatant produced by this recombinant virus.
  • the analysis performed at serial dilutions of the fluorescent recombinant virus through qRT-PCR and fluorescence quantification allowed to establish that there is a direct relationship that shows an increase in the detected fluorescence as the viral titer of the solution increases, observing a fluorescence intensity of 500 units / mL for a title of 2x1 0 6 copies / mL.
  • NP viral nucleoprotein
  • NLS monopartite nuclear localization sign
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Abstract

Método para producir virus ARN monocatenario negativo; plásmido recombinante funcional en células animales, que consta de un esqueleto pSS-URG; método de obtención de partículas virales; y uso para expresar ARN, proteínas autógenas o exógenas al virus.

Description

La presente invención se relacionada con el campo de la medicina, medicina veterinaria, la biología molecular, la inmunología y la biotecnología, específicamente, con el desarrollo de las vacunas y de adyuvantes para las mismas, y tratamientos. El campo de aplicación de la invención corresponde principalmente a la industria acuícola. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un plásmido de expresión de RNAs virales y un método de obtención de partículas virales basado en dichos plásmidos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La anemia infecciosa del salmón (ISA) es una enfermedad que afecta principalmente al salmón del atlántico {Salmo salar) causando enormes pérdidas en la salmonicultura mundial (1 , 14). Los signos clínicos de esta enfermedad son presencia de branquias pálidas, ascitis, necrosis hemorrágica del hígado, esplenomegalia, intestino congestivo y anemia severa (14). ISA fue reportada por primera vez en Noruega el año 1984 (28), posteriormente fue diagnosticada en Canadá (4), Escocia (27), Estados Unidos (18), las Islas Faroe (Dinamarca) (18) y Chile (16). El agente etiológico de esta enfermedad es un virus pleomórfico envuelto de
45 a 140 nm de diámetro, denominado virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), el cual pertenece a la familia Orthomixoviridae (8). Su genoma consta de 8 segmentos de ssRNA de polaridad negativa (ns-RNA) que codifican para 10 proteínas y que tienen regiones no traducibles (UTR) en ambos extremos (26).
Hasta el momento hay escaso conocimiento sobre las funciones que cumplen cada una de las proteínas de ISAV. La evidencia bioinformática indica que los segmentos 1 , 2 y 4 codificarían para las subunidades de la RNA polimerasa RNA dependiente (RpRd), análogas a PB2, PB1 y PA del virus Influenza A, respectivamente. El segmento 3 codifica para la proteína NP, la cual se ha reportado que posee la capacidad de unir ssRNA (2). En Influenza se ha demostrado que estos cuatro polipéptidos se asocian a cada uno de los ocho segmentos de RNA viral para formar los complejos Ribonucleoproteicos (RNPs) (23). Estas ocho unidades de RNPs corresponden a la unidad mínima infecciosa requerida para comenzar una infección celular (23). El segmento 5 codifica para la proteína de Fusión (F), que se ha demostrado está presente en la superficie de la membrana viral, permitiendo en los primeros pasos de la infección, la fusión de la membrana de la partícula viral con el endosoma celular, permitiendo la liberación de los RNPs al citoplasma celular (3). El segmento 6 codifica para la proteína Hemaglutinina- Esterasa (HE), que también está presente en la superficie viral y cuya función es unir un residuo de ácido siálico ubicado en el receptor celular (15). La proteína HE presenta además actividad destructora de receptor (RDE, receptor destroying enzyme), favoreciendo así la liberación de las nuevas partículas virales que emergen desde la membrana celular (21 ). En contraste a lo observado en hemaglutinina del virus influenza A cuya región del tallo (stalk) está altamente conservada, se ha reportado que la proteína HE de ISAV presenta una región altamente variable hacia el extremo carboxilo terminal y colindante a la región transmembrana, llamada Región Altamente Polimórfica (HPR, highly Polymorphism región) (9). Esta región HPR codifica para 35 aminoácidos y en base a su alto polimorfismo se han descrito cerca de 30 variantes en Europa, Norteamérica y Chile (30, 31 , 32). Una teoría explica esta variación como un fenómeno de deleciones a partir de una cepa ancestral que presenta la región HPR de mayor longitud que es denominada HPRO
(33) . La primera cepa HPRO fue identificada en Escocia en salmones silvestres que no presentaban signos clínicos de ISA, catalogándose como una cepa avirulenta
(34) . En contraste aquellas cepas que presentan deleciones en esa zona sí son capaces de desarrollar signos clínicos y mortalidad asociados a ISA con carácter virulento. El segmento 7 se sugiere que codifica para las proteínas no estructurales análogas a NS1 y NS2 del virus influenza A (19). Finalmente, el segmento 8 codifica para un transcrito que contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF, Open Reading Frame) superpuestos. El ORF1 codifica para la proteína de matriz (M) y el ORF2 codifica para proteína M2, se ha demostrado que la proteína M2 está involucrada en la modulación de la respuesta de IFN de tipo I en conjunto con la proteína NS1 (12).
En el caso de Virus Influenza, el estudio detallado del virus ha sido posible gracias al desarrollo de un sistema de genética reversa, el que permite manipular el genoma del virus, pudiendo determinar las posibles causas de la virulencia , así como el estudio detallado de cada una de las funciones de proteínas virales (13). El sistema de genética reversa más utilizado en virus Influenza corresponde al sistema basado en plásmidos y permite generar virus recombinantes a partir de cDNA clonados. Aquí se transcriben los 8 RNA genómicos bajo el comando de la RNA polimerasa I y se expresan al menos las proteínas que constituyen el complejo ribonucleoproteico bajo el comando de la RNA polimerasa II (10, 24).
Hasta el momento no existen reportes que describan un sistema de genética reversa exitoso en ISAV. Una dificultad importante para generar un sistema de genética reversa corresponde el contar con el promotor definido para la RNA polimerasa I, el cual aún no ha sido descrito para Salmón del Atlántico. La dificultad radica en que los promotores para RNA Polimerasa I son estrictamente especie específicos, no presentan una estructura genética clara y se encuentran en la región IGS del rDNA, las cuales son extensas (6). La identificación de la secuencias correspondientes al promotor para Pol I y sus enhancers es un trabajo difícil considerando que la región IGS en el género Salmo varía entre 15-23 kb de largo (5) Por este motivo y ante la necesidad de contar con un promotor con las características del de RNA Pol I, en este trabajo evaluamos la capacidad que tendría la región ITS-1 (Internal Transcribed Sequences) de 571 pb descrita previamente para Salmo salar (Salmón del Atlántico) (25). Se ha descrito recientemente en nemátodos mediante análisis bioinformáticos que la región ITS-1 contiene motivos promotores de transcripción y motivos reguladores, no habiéndose demostrado hasta ahora dicha función (29). En ese estudio los autores sugieren que en la región ITS-1 del rDNA existen motivos con características de promotor y reguladores de la transcripción, que se han mantenido conservados durante los millones de años de evolución divergente entre especies del mismo género, aunque sugieren la realización de ensayos de transcripción in vitro para demostrarlo.
La presente invención demuestra que la región ITS-1 del rDNA de salmón del Atlántico tiene actividad de promotor de la transcripción, que se ha mantenido durante millones de años, sin embargo, para confirmar esta afirmación fue necesario realizar ensayos de transcripción in vitro.
Dado que para Chile y el resto de los países salmonicultores existe la urgente necesidad de lograr dilucidar los factores de virulencia, mecanismos de patogénesis del virus ISA, y una vacuna de última generación eficaz contra el único miembro del genero Isavirus; se hace necesaria la implementación de un sistema de genética reversa plasmidial que permita generar virus ISA recombinante (ISAVr). Con este fin se aborda el desafío de desarrollar un sistema de genética reversa para ISAV basado en plásmidos y utilizando elementos innovadores como es el uso de la región ITS-1 de salmón, nunca antes descrita como elemento promotor. Elección que resultó ser clave para el éxito del sistema que se describirá a continuación.
Si bien esta metodología ha sido desarrollada inicialmente para conseguir partículas virales del virus ISA, paralelamente se ha logrado comprobar que, en otras especies de vertebrados superiores, este sistema de expresión es exitoso para producir moléculas de RNA sin nucleótidos adicionales en sus extremos, lo que amplía de manera significativa la utilidad de esta técnica. De esta forma, con este sistema de expresión ahora es posible obtener cualquier proteína o RNA deseado, en un sinnúmero de tipos celulares diferentes. Un ejemplo de ello, es la capacidad que tiene este sistema de transcribir el RNA viral a las 12 hpt tanto en una línea celular humana HEK 293 como en una línea celular de cerdo ST, incubadas a 37QC.
Por lo tanto, la presente invención busca solucionar el problema de la técnica de proporcionar un sistema de genética molecular que permita obtener partículas virales funcionales a partir de ns-RNA. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un método de expresión de proteínas autógenas o exógenas a la partícula viral empleada, así como también expresar ácidos nucleicos del tipo ARN de interferencia. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Líneas celulares empleadas
Las células ASK (www.atcc.org, CRL 2747) derivadas de riñon de Salmón del Atlántico fueron cultivadas en medio Leibovitz (L-15, Hyclone) suplementado con 50 μg/mL de gentamicina, 10% de suero fetal bovino (SFB, Corning cellgro®, Mediatech), 6 mM L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech) y 40 μΜ β- mercaptoetanol (Gibco®, Life Technologies). Las células RTG-2 (http://www.phe- culturecollections.org.uk, ECACC 90102529) derivadas de tejido de gónadas de trucha arcoiris fueron cultivadas en medio esencial mínimo (MEM, Hyclone) suplementado con 50 μg/mL de gentamicina, 10% de SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 10 mM L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech), 1 % de aminoácidos no escenciales (Hyclone) y 10 mM de HEPES (Hyclone). Las células CSE-1 19 derivadas de embrión de salmón coho (http://www.phe-culturecollections.org.uk, ECACC 95122019) fueron cultivadas en medio esencial mínimo (MEM, Hyclone) suplementado con 50 μg/mL de gentamicina, 10% de SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 2 mM L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech), 1 % de aminoácidos no escenciales (Hyclone). Las líneas celulares fueron crecidas a 16°C sin CO2, a excepción de CSE-1 19. Las células HEK293 (ATCC CRL 1573) células humanas embrionarias de riñon fueron cultivadas en medio Eagíe's Mínimum EssentiaS (EMEM, Hyclone) suplementado con 50 μς/ιηί de gentamicina, 10% de SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 10 mM L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech), 1 % de aminoácidos no escenciales (Hyclone) y 10 mM de HEPES (Hyclone). Las células ST (www.atcc.org, CRL 1746) células derivadas de testículo de cerdo, fueron cultivadas en medio Eagle"s Mínimum Esseníiai (EMEM, Hyclone) suplementado con 50 μg/mL de gentamicina, 10% de SFB (Corning cellgro®, Mediatech), 10 mM L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech), 1 % de aminoácidos no escenciales (Hyclone) y 10 mM de HEPES (Hyclone).
Purificación de partículas virales de ISAV
La purificación de virus se realizó a partir de 40 mL de sobrenadante de células ASK infectadas con la cepa ISAV901_09. Tras 14 días post infección se tomó el sobrenadante celular que fue clarificado a 1 .000 x g durante 20 min a 4°C. Después el sobrenadante se ultracentrifugo a 133.200 x g durante 2 horas a 4°C y el pellet obtenido se suspendió en 100 μΐ de buffer TNE por toda la noche a 4°C. Luego la suspensión se cargó en 4 mL de un colchón de sacarosa al 20% p/v en buffer TNE y se ultracentrifugo a 124.200 x g por 2 horas a 4°C y finalmente el pellet obtenido se resuspendió en 50 μΐ de buffer TNE. Extracción de RNA viral
La extracción de RNA viral (vRNA) se realizó a partir de los 50 μί de virus ISAV901_09 purificado, utilizando el kit comercial E.Z.N.A. Total RNA Kit II (Omega, Bio-Tek, Inc.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Posteriormente el RNA purificado se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm mediante el equipo Nanoquant Infinite M200 pro (TECAN, Austria) y se obtuvo una concentración del vRNA de 2,7 pg/pL El vRNA fue almacenado a -80°C hasta su uso.
Amplificación de los 8 segmentos genómicos completos de ISAV 901 _09, análisis bioinformático y diseño de partidores.
Se recopilaron las secuencias que incluyen los extremos no codificantes 5' y 3' UTR de los ocho segmentos genómicos de las publicaciones de Fourrier y cois., Kulshreshtha y cois., y Merour y cois., (1 1 , 17, 20). Estas secuencias corresponden a dos aislados escoceses (390/98 y 982/08), un aislado noruego (Glesvaer/2/90), dos aislados canadienses (NBISA01 y RPC NB 98-049) y uno chileno (ADL-PM 3205 ISAV). El alineamiento múltiple se realizó utilizando el programa ClustalW2. Con el análisis de los alineamientos se diseñaron los partidores universales que permiten amplificar los 8 segmentos completos incluyendo las regiones 5' y 3' UTR de cualquier cepa de ISAV (Tabla I). RT-PCR
El RNA viral de ISAV901_09 (7) se obtuvo por extracción desde virus purificado, el cDNA de los ocho segmentos genómicos se obtuvo por RT-PCR. Con este fin se utilizó el kit SuperScript™ One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para obtener el cDNA de cada segmento en la reacción de RT-PCR se utilizó el primer F {forward) (10 μΜ) y primer R (reverse) correspondiente (Tabla I) y 50 ng de RNA viral.
Taba 1 : Partidores para amplificar los 8 segmentos de ISAV completos Partidor partidor F (forward) 5' a 3' partidor R (reverse) 5' a 3'
1 a AGCTAAGAATGGACTTTATATCAGAAAAC AACCTTCGAAGCCAAACAGATAG
ACG
1 b CAATATCAAGTCCGTTCGACGTGG AGTAAAAAATGGACATTTTATTGATTAAAAGTATCG
TC
2 AGCAAAGAACGCTCTTTAATAACC AGTAAAAAATGCTCTTTTACTTATTAAAAAT
3 AGCAAAGATTGCTCAAATCCC AGTTAAAATTGCTCTTTTCTTTATTTG
4 AGCTAAGATTGGCTGTTTCAAGA AGTAAAAATTGGCTTTTTGGAAAA
5 AGTTAAAGATGGCTTTTCTAACAATTTT AGTAAAAATTGGCTATTTATACAATTAATAATG
6 AGCAAAGATGGCACGATTCA AGTAAAAAATGCACTTTTCTGTAAACG
7 AGCTAAGATTCTCCTTCTACAATGGA AGTAAAAATTCTCCTTTTCGTTTTAAA
8 AGCAAAGATTGGCTATCTACCA AGTAAAAAAAGGCTTTTTATCTTTTG
Secuenciación
Los cDNAs de los segmentos genómicos de ISAV fueron clonados en el vector pGEMT-easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tres clones de cada plasmido fueron secuenciados utilizando los partidores universales para promotor T7 y SP6, además de partidores internos para cada segmento como lo descrito en Cottet y cois (7).
Los resultados de secuenciación fueron analizados mediante el programa BioEdit Sequence Alignment Editor 7.1 .3, y para confirmar la identidad de las secuencias se realizó un alineamiento local utilizando el servidor BLAST. Además se realizó un alineamiento múltiple utilizando el servidor CLUSTALW2 entre las secuencias obtenidas de los extremos 3' y 5' UTR de todos los segmentos de ISAV901_09. Una vez obtenidas las secuencias completas de los 8 segmentos de ISAV901_09 (con los extremos 3' y 5' UTR), estas fueron utilizadas para sintetizar el genoma de ISAV901_09 (Genscript Co. USA) incorporando en sus extremos los sitios de corte para la enzima Sapl, y así evitar errores en el clonamiento posterior en el vector pSS-URG. Diseño del plásmido vector universal pSS-URG
Para tener un plásmido que permita la transcripción de los vRNA de ISAV se diseñó un cásete que fue sintetizado utilizando los avances en biología sintética (Genscript Co) el cual se incorporó en el plásmido pUC57. El nuevo vector construido fue denominado pSS-URG (plasmid for Salmo Salar Universal Reverse Genetic). En la figura 1 c se puede observar el esquema de todos los elementos necesarios para la correcta transcripción de los vRNA. Ordenados de izquierda a derecha se tiene: Como promotor la región ITS-1 de Salmo salar, la secuencia de la ribozima Hammerhead; la ribozima del virus de la hepatitis delta (δ); entre las secuencias de las dos ribozimas se encuentran los sitios de corte para la enzima de corte distante Sap I (NewEngland Biolabs) y finalmente el terminador de la transcripción de Beta globina de conejo. Este diseño innovador permite insertar cualquier segmento genómico del ISAV, o cualquier otra secuencia nucleotídica, sin incorporar secuencias adicionales en ambos extremos del vRNA. Posteriormente se procedió a clonar en el plásmido pSS-URG, utilizando la enzima Sap I, cada uno de los ocho cDNAs de los segmentos completos de ISAV. Se obtiene así una colección de plásmidos denominados pSS-URG/1 , pSS-URG/2, pSS-URG/3, pSS-URG/4, pSS-URG/5, pSS-URG/6, pSS-URG/7 y pSS-URG/8 (figura 1 e).
Vector pSS-UGR/S6-Notl-HPR y pSS-UGR/S6-EGFP-HPR Se diseñó un constructo en base al vector pSS -URG que tiene la secuencia completa (incluyendo los extremos 3' y 5' UTR ) en antisentido e invertida del segmento 6 de ISAV 901 _09. A modo de marcador , el vector tiene añadidos en marco en la región HPR del segmento 6 exactamente nueve nucleótidos que contienen el sitio de restricción para la enzima Notl nt 1 .015 5'- gtagca[GCGGCCGCA]acatct-3' nt 1 .036 (Figura 2). El vector diseñado , que fue llamado pSS-UGR/S6-Notl-HPR, fue sintetizado en GenScript Co. usando como base pUC57. Para generar el vector pSS-URG/S6-EGFP-HPR se clonó la secuencia que codifica para EGFP en el vector pSS-UGR/S6-Notl-HPR utilizando el sitio de restricción Not I de la región HPR (Figura 2).
Vectores para expresar las proteínas PB2, PB1 , PA y NP de ISAV901 09
A partir de los ORFs de los segmentos 1 , 2, 3 y 4 del virus ISA 901 _09 que codifican para PB2, PB1 , PA y NP respectivamente (ID nro:7, 8, 9, 10) y que se encuentran clonados en el vector pGemT-easy (7), se realizó PCR de alta fidelidad con Pfx Platinum (Invitrogen). Los partidores utilizados para la amplificación de cada uno de los genes se observan en la Tabla 2, los cuales incluyen sitios de corte para las enzimas Ncol, Smal y Xhol (New england biolabs). El clonamiento de los ORFs de PB2 y PA se realizó con las enzimas de restricción Ncol y Xhol, el clonamiento del ORF de PB1 fue realizado con las enzimas de restricción Smal y Xhol y el del ORF que codifica para NP fue con las enzimas de restricción Mlul y Xbal. Para la expresión de PB2, PB1 y PA, los ORFs de los segmentos 1 , 2 y 3 fueron clonados en el vector pTriex3 (Novagen), por otro lado, para la expresión de la proteína NP el ORF del segmento 3 fue clonado en el vector pCI-neo (Promega). Tabla 2: Partidores para amplificar los ORF PB2, PB1 , PA y NP de ISAV901_09 para clonamiento en vectores CMV.
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Ensayo de transcripción ex vivo, cinética de transfeccion de células ASK con vector pSS-URG/Seg6-Notl
Para probar la funcionalidad del vector base pSS-URG, se sembraron células ASK a una densidad de 2,5 x 104 células/cm2 por pocilio en placa de 24 pocilios (SPL), en Medio Leibovitz (L-15, Hyclone) suplementado con gentamicina (50 g/mL) y 10% de suero fetal bovino (SFB, Hyclone) cultivándose a 18°C hasta llegar a una confluencia del 80%. Las células se transfectaron con el vector pSS-URG/S6- Notl-HPR, utilizando Fugene 6 (Promega) en una razón 1 :6 de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las células se incubaron a 16QC por 3 h, luego la mezcla fue removida y las células fueron lavadas 2 veces con PBS, comenzando con la cinética de transfeccion que se analiza a 0, 3, 6, 9, 12 y 15 h. De cada pocilio en cada punto de la cinética se extrajo el RNA total de las células con el kit comercial E.Z.N.A. Total RNA Kit II (Omega, Bio-Tek), el DNA fue eliminado con el tratamiento con RQ-DNasa (promega). El RNA obtenido fue sometido a RT-PCR utilizando partidores para el sitio de restricción de Notl y el extremo 5'UTR del segmento 6 viral (Tabla 3).
Tabla 3: Partidores para amplificar el vRNA de S6-Notl
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Se obtuvo el cDNA mediante transcripción reversa (RT) utilizando la enzima M-MuLV Reverse Transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, 2001Ι/μΙ_ New England BioLabs ). La mezcla de transcripción reversa se realizó a un volumen final de 25 μΙ_ de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Posteriormente se utilizó el cDNA para realizar una reacción de PCR, con la DNA polimerasa Paq5000 (Agilent Technologies). Los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis a 90 volts por 1 h en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (10 mg/mL) (Figura 3).
Generación de ISAV recombinantes (ISAVr) mediante sistema de genética reversa basada en plásmidos
Se sembraron células ASK a una densidad de 2,5 x 104 células/cm2 en placas Nunc™ Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System y luego incubadas por 72 h a 18°C. Las células fueron transfectadas mediante Fugene 6 (Promega) 1 :6 de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Para la generación del ISAVr901-09 se utilizó un total de 250 ng de una mezcla de los vectores pTriex-3-PB2, pTriex-3-PB1 , pTriex-3-ΡΑ y pCI-neo-NP y 1 μg total de los ocho vectores pSS-URG (pSS-URG/1 -8). La recuperación de los virus de rlSAVS6-Notl-HPR y rlSAVS6-EGFP-HPR se realizó mediante el reemplazo de pSS-URG/6 con pSS-UGR/S6-Notl-HPR y pSS-URG/S6- EGFP-HPR respectivamente. A continuación, las células fueron incubadas con 1 mL de medio L-15 por 7 días a 16°C (Figura 4).
Infección de células ASK con isAVrS6 EGFP HPR
Las células ASK se sembraron a una densidad de 2,5 x 104 células/cm2 por pocilio en placas Nunc™ Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System de 8 pocilios y se cultivaron a 16°C hasta alcanzar un 90% de confluencia. Luego, las células se lavaron con PBS dos veces y se realizaron pasajes ciegos con 100 μΙ_ de una dilución 1 :10 del sobrenadante ya sea del pasaje 0 (P0) a los 7 días post transfección o de los diferentes pasajes a los 7 días post infección de ISAVrS6 EGFP" HPR en medio L-15 sin SFB con gentamicina (50 pg/rnL). Las células fueron incubadas por 4 h a 16°C, luego se lavaron dos veces con PBS y se agregó 500 μΐ de medio L-15 con 10% SFB y gentamicina (50 pg/rnL), luego se incubaron por 7 días a 16°C. Cada pasaje viral fue obtenido con este procedimiento cada 7 días hasta el cuarto pasaje de ISAVrS6 EGFP HPR, además de P0. El sobrenadante de cada pasaje fue almacenado a -20°C hasta su posterior análisis (Figura 4).
Detección de iSAVrS6 EGFP HPR
Extracción de RNA, RT-PCR y qRT-PCR en tiempo real:
Para detectar el ISAVrS6 EGFP HPR, se extrajo RNA total de 350 μΐ del sobrenadante de las células ASK transfectadas con los 12 plásmidos a los 7 días post transfección (P0 de ISAVrS6"EGFP"HPR) o sobrenadantes de los pasajes ciegos 1 ro al 4to, con el RNA extraído se detectó el RNAv del segmento 6, EGFP y Segmento 6-EGFP mediante RT-PCR.
Previo a la reacción de RT-PCR, al RNA se le realizó un tratamiento con DNasa libre de RNasa (Promega). Para la reacción de transcripción reversa (RT), se utilizaron los partidores F-UTR-S6 (Tabla 1 ), F-S6 (Tabla 3) o EGFP (Tabla 4), utilizando la enzima M-MLV RT (200 ϋ/μΐ Promega) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Tabla 4: Partidores para la detección de vRNA de S6-EGFP-HPR
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Para el PCR se utilizó el kit GoTaq® Green Master Mix (Promega) y los partidores Forward (S6 o EGFP) y Reverse (S6 o EGFP). El programa térmico utilizado corresponde a: 95QC por 2 min, 35 ciclos de 95QC por 30 s, 59,1 QC para EGFP o 54°C para el S6 o S6-EGFP 30 s, 72QC por 30 s y una extensión final de 72QC por 5 min. En todos los casos, se realizó una re-amplificación de los productos de PCR utilizando los mismos partidores. Los productos de re-amplificación de PCR, fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v) corridos a 90 V por 45 min y teñidos con bromuro de etidio (10 mg/ml_).
Para detectar el número de copias del vRNA, se realizó un qRT-PCR en tiempo real utilizando el método de cuantificacion absoluta descrito por Muñir y Kibenge (22), realizándose una curva estándar a partir del plásmido pSS-URG/S8. El análisis de RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo en el equipo Eco Real-Time PCR System (lllumina) utilizando el kit comercial SensiMix™ SYBR® Hi-ROX Kit (Bioline) de acuerdo a las indicaciones del fabricante, utilizando el partidores F-S8 y R-S8 (Tabla 4). El perfil térmico utilizado para amplificar la región del segmento 8 fue 1 ciclo de desnaturación inicial de 10 min a 95QC, seguido de 40 ciclos de amplificación (15 s a 95°C, 15 s a 60 QC y 15 s a 72QC). Tras los ciclos de amplificación se realizó un ciclo de disociación (30 s a 95°C, 30 s a 55°C y 30 s a 95°C). Este procedimiento fue realizado para el pasaje 4 del virus recombinante. Los resultados obtenidos fueron analizados en el programa EcoStudy software. Microscopía Confocal
En el día 7-post infección, células ASK infectadas con rlSAVS6-EGFP-HPR en cada pasaje del virus recombinante fue analizado por microscopía confocal usando el procedimiento descrito por Rivas-Aravena y cois. (45). Las células fijadas fueron observadas con un microscopio confocal LSM 510 (Zeiss) usando el programa LSM image Browser para detectar rlSAVS6-EGFP-HPR mediante la visualización de la fluorescencia de EGFP. Adicionalmente rISAV fue detectado usando anticuerpo monoclonal anti-HE (BiosChile) como fue descrito previamente (45).
Titulación por ensayo de placas de lisis
Se sembraron células ASK a una densidad de 2,5 x104 células/cm2 por pocilio de una placa de 12 pocilios (SPL) y se incubaron a 16°C hasta alcanzar una confluencia del 100%. Se realizó una titulación de la variante de ISAVrS6"EGFP"HPR del Pasaje 4. Se realizó el procedimiento según lo descrito por Castillo-Cerda et al (35).
Ensayo de cuantificación de fluorescencia de isAVrS6 EGFP HPR
Se sembraron células ASK a una densidad de 2,5 x104 células/cm2 por pocilio en una placa de 48 pocilios (SPL) y se incubaron a 16°C hasta alcanzar una confluencia del 100%. Se realizó una titulación del pasaje 4 de ISAVrS6"EGFP"HPR. Para esto, se realizaron diluciones seriadas de cada inoculo viral con un factor de dilución de 10 desde 10"1 hasta 10"6 en medio L-15 sin SFB. Luego, se removió el medio de cultivo y se agregaron 400 μΐ de inoculo viral a cada pocilio y se incubó a 16°C durante 4 h para permitir la adsorción del virus. Posteriormente, el inoculo fue retirado de cada pocilio, se lavaron las células dos veces con PBS y a continuación, se agregó el medio L-15 suplementado con 10% SFB, 6mM L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech), 40 μΜ β-mercaptoetanol (Gibco®, Life Technologies), gentamicina 50 μg/mL. Las placas fueron incubadas por 7 días a 16°C. Al final de la infección, los sobrenandantes de cada pocilio fueron analizados cuantificando fluorescencia mediante el equipo Nanoquant Infinite M200 pro (TECAN, Austria), exitando a 485 nm y capturando la emisión a 535 nm. Estos sobrenadantes también se utilizaron para extracción de RNA total y un posterior qRT-PCR en tiempo real para cuantificar el RNAv del segmento 8 de ISAV, y determinar así el número de copias del segmento 8 del cultivo celular como se describió anteriormente.
Cinética de Infección de ISAV901_09, ISAVr901-09, isAVrS6 EGFP HPR
Se realizaron infecciones de células ASK con el cuarto pasaje de ISAVrS6 EGFP"
HPR, utilizando como control el cuarto pasaje de ISAVr901-09, además del ISAV901_09 silvestre. Para cada aislado viral se realizó una infección con una MOI de 0,01 . La cinética de infección fue realizada colectando muestras a los 0, 2, 4 y 7 días post infección, luego se realizó una extracción de RNA, tratamiento con DNasa y a continuación un qRT-PCR en tiempo real para cuantificar el RNAv del segmento 8 de ISAV de cada sobrenadante de cultivo celular (22).
Visualización de partículas Las células ASK fueron sembradas como se indicó más arriba y fueron cultivadas a 16QC hasta alcanzar un 90% de confluencia. Las células fueron luego infectadas con 400 μΐ de una dilución 1 :10 de virus isAVrS6 EGFP"HPR en su 4to pasaje, o bien el 4to pasaje de rISAV901-09 o ISAV901_09 silvestre como control. A los cuatro días post infección las células fueron fijadas con 2,5% glutaraldehído en buffer cacodilato 0,1 M a pH 7,2 por 6 horas a temperatura ambiente y luego lavadas con buffer cadodilato de sodio 0,1 M a pH 7.2 por 18 h a 4QC. Posteriormente las muestras fueron fijadas con 1 % de Tetraoxido de Osmio acuoso por 90 minutos y luego de lavadas con agua destilada fueron teñidas con una solución acuosa de 1 % acetato de Uranilo por 60 minutos. Las muestras fueron después deshidratadas con lavados de 20 minutos cada vez con una serie de buffers que contenían acetona 50, 70, 2 x 95 y 3 x 100%. Las muestras finalmente fueron embebidas en resina epon/acetona razón 1 :1 durante toda la noche y luego embebidas en resina epon pura la cual fue polimerizada a 60QC por 24h. Los cortes finos (60-70 nm) se obtuvieron en ultramicrotomo Sorvall MT-5000 y luego se montaron sobre grillas de cobre para luego teñir con acetato de Uranilo 4% en metanol por 2 min y luego citrato por 5 min. Las muestras fueron observadas con microscopio electrónico Philips Tecnai 12 a 80 kV (Figura 6).
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Obtención de los plásmidos que permitirán la transcripción de los 8 RNAv de ISAV901_09: (1) Los plásmidos pSS-URG y el plásmido que contiene cada uno de los segmentos genómicos de ISAV son digeridos con la enzima de restricción Sapl. Los productos de la digestión son visualizados en un gel de agarosa al 1 %, y luego son purificados. (2) El producto digerido correspondiente al segmento genómico de ISAV y el plasmido pSS-URG que se encuentra lineal son ligados con T4 ligasa, para posteriormente utilizar esta ligación para transformar bacterias quimiocompetentes. (3) Desde los clones que contienen los plásmidos recombinantes esperados se realiza una purificación para corroborar la correcta inserción del segmento genómico mediante secuenciación
Figura 2: Esquema del diseño de los casetes pSS-URG, pSS-URG/S6-Notl y pSS- URG/S6-EGFP-HPR. El vector universal contiene la secuancia de: promotor de S. salar (SS prom); ribozima hammerhead (HH rib); ribozima de virus hepatitis δ (HDV rib); terminador de transcripción β-globin de conejo (Term). Los plasmidios pSS- URG/S6-Not y pSS-URG/S6-EGFP-HPR contienen el cDNA del segmento 6 antisentido e invertido, el cual incluye los 5' y 3' UTRs y sus respectivas modificaciones; el sitio de restricción A/oí/ o la secuencia codificante de EGFP.
Figura 3: RT-PCR del segmento 6-Notl-HPR desde células de salmón ASK transfectadas con plásmidos pSS-URG/S6-Not-HPR. Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT-PCR del segmento 6 a diferentes tiempos post transfección. Células ASK fueron transfectadas utilizando Fugene 6 (Promega), el plásmido utilizado fue pSS-URG/segmento 6.
Figura 4: Genética reversa para obtención de virus ISA recombinantes: Se transfectan células ASK con los 8 plásmidos pSS-URG/S1 -8, los cuales permitirán la transcripción de los 8 vRNA (genoma de ISAV), en conjunto con 4 plásmidos que permitirán la expresión de las proteínas que conformar el cRNP (PB2, PB1 , PA y NP). La co-transfección de estos 12 plásmidos en una misma célula, permitirán la formación de los 8 cRNP en el núcleo, los cuales son la unidad mínima necesaria para formar una partícula viral de ISAV. Estos cRNPs permitirán la transcripción y replicación de los vRNA, permitiendo la síntesis de todas las proteínas que forman el virus y la generación de nuevos cRNPs, formando así partículas virales recombinantes.
Figura 5: RT-PCR del segmento 6-Notl-HPR desde células de cerdo ST (a) y células humanas HEK-293 (b), ambas transfectadas con plásmido pSS-URG/S6-Notl-HPR utilizando Fugene 6 (Promega). Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT-PCR del segmento 6 a diferentes tiempos post transfección. Figura 6: Análisis por Microscopía Electrónica de ISAV recombinantes desde secciones de células ASK infectadas. Membrana citoplasmática con partículas de ISAV yemando desde infecciones con: (A) WT ISAV 901 _09, (B) rlSAVS6-EGFP- HPR and (C) rISAV 901_09. (D) Sección endosomal mostrando partículas de rISAV 901 _09 dentro de endosomas, que corresponderían a los pasos iniciales de la fusión de membranas virales y endosomal. Barra: 200 nm.
EJEMPLOS
Genoma de la cepa ISAV 901 _09 adaptado a cultivo celular
Se secuenció el genoma completo de una aislado viral adaptado a cultivo celular como es ISAV 901_09 (HPR 1 c). Los alineamientos entre las regiones no codificantes (UTR) de los extremos 5' y 3' de las secuencias completas de los seis aislados de ISAV, dos escoceses (390/98 y 982/08), uno noruego (Glesvaer/2/90), dos canadienses (NBISA01 y RPC NB 98-049) y uno chileno (ADL-PM 3205 ISAV) poseen una elevada conservación en los extremos de cada segmento genómico viral, lo que permitió diseñar los partidores universales descritos en la tabla I. Los partidores fueron utilizados para amplificar el genoma de la cepa chilena ISAV 901 _09. El resultado de la secuenciación de los ocho segmentos genómico virales se muestra en la tabla IV. Los tamaños de los ocho segmentos virales van desde 2267 pb hasta 906 pb para los segmentos 1 y 8, respectivamente.
La secuencia de las regiones 3'UTR resultaron variar desde 7 nucleótidos en el segmento 6 hasta 48 nucleótidos en el segmento 3, no existiendo diferencias en el tamaño de cada extremo 3'UTR descritos previamente para los 6 genomas analizados, excepto por la adición de un nucleótido en el extremo 3'UTR del segmento 7. Las secuencias de los extremos 5'UTR de ISAV 901_09 varían desde 67 nucleótidos en el segmento 4 hasta 147 nucleótidos en el segmento 3. El alineamiento de las regiones UTR también indican que ISAV 901 _09 tiene elevada similitud con la cepa de ISAV Glesvaer/2/90 (entre un 97% y 98% de identidad).
Diseño de vector universal para genética reversa de ISAV
Con el objetivo de lograr un vector que exprese los segmentos de RNA viral de largo completo y sin nucleótidos adicionales, aprovechando los avances logrados en biología sintética, se realizó un diseño innovador integrando elementos usados anteriormente en genética reversa de virus RNA como son las ribozimas Hammerhead y del virus de la hepatitis delta (δ), junto a elementos genómicos de la especie Salmo salar. El vector diseñado fue denominado pSS-URG (plasmid for Salmo salar Universal Reverse Genetic). Los elementos correctamente empalmados que contiene el vector ordenados de izquierda a derecha son: A modo de promotor la región ITS-1 de Salmo salar, una secuencia de la ribozima Hammerhead, la ribozima del virus de la hepatitis delta (δ), y entre las secuencias de las dos ribozimas se incorporan dos sitios de corte para la enzima Sap I (New England Biolabs) y finalmente como terminador de la transcripción se incorporó el terminador de Beta globina de conejo (Figura 2). Este vector permitiría clonar sin incorporar secuencias adicionales, cualquier segmento viral, gracias al uso de una enzima de corte distante como es Sap I. De esta manera en este estudio se presenta un vector que será la base del sistema de genética reversa para el virus ISA. Una vez sintetizado el plásmido pSS-URG, se logró subclonar en éste los ocho segmentos genómicos de ISAV a partir de los genomas sintéticos utilizando la enzima de corte distante Sap I (Datos no mostrados). Además de clonar los ocho segmentos virales, a modo de marcador genético y con la finalidad de demostrar que los virus generados son agentes recombinantes y no corresponden a una contaminación del procedimiento, se insertaron dos elementos genéticos en la zona HPR del vector universal que contiene el segmento 6. La primera variante genética corresponde a la inserción en la zona HPR de una secuencia de nueve nucleótidos con el sitio de corte para la enzima Notl, denominando a éste nuevo vector pSS- URG/S6-Notl-HPR. Una segunda variante genética corresponde al producto del cloning de la secuencia que codifica para EGFP utilizando el sitio Not I creado previamente, de esta forma se obtiene el nuevo vector denominado pSS-URG/S6- EGFP-HPR. Análisis de funcionalidad del vector pSS-URG por ensayo de transcripción ex vivo
Para determinar si el conjunto de los elementos incluidos en el vector permiten la expresión del RNA viral en células de salmón, y ante la incertidumbre de la funcionalidad del promotor sugerido en la región ITS-1 de Salmo salar, se procedió a transfectar células ASK con el plásmido pSS-URG/S6-Notl-HPR en un ensayo de transcripción ex vivo. Para determinar la existencia de un proceso de transcripción el análisis de funcionalidad fue realizado detectando el RNAv en los tiempos 0, 3, 6, 9, 12 y 15 horas post transfeccion (hpt) a través de RT-PCR. La reacción de transcripción reversa fue realizada utilizando un único primer complementario al sitio de restricción Not I. Sorprendentemente el resultado del análisis permite visualizar un producto de PCR a partir de las 3 hpt, el cual aumenta en intensidad hasta los 15 hpt (Figura 3). Este resultado estaría indicando que a partir del plásmido pSS-URG/S6-Notl-HPR transfectado, la célula está generando un RNA que posee el sitio de restricción Notl y que por lo tanto la región ITS-1 de Salmo salar corresponde a un elemento promotor. Con el fin de demostrar la generación de un RNA viral sin nucleótidos adicionales se realizó un RT-PCR con primers específicos para cada ribozima, los resultados mostraron que no fue posible obtener un producto de amplificación con los primers que reconocen las secuencias de la ribozimas en ningún punto de la cinética, indicando que el RNA generado no posee regiones adicionales como por ejemplo las ribozimas (datos no mostrados).
Estos resultados permiten sugerir que el uso de la región ITS-1 y su inclusión en el vector pSS-URG para expresar cualquier tipo de RNA en el interior de las células. Por ejemplo se pueden expresar RNA en forma de RNA interferentes, RNA de silenciamiento o también micro RNAs.
Obtención de virus ISA recombinante (ISAVr)
Como ya ha sido reportado para virus Influenza, la unidad mínima funcional del virus corresponde al complejo Ribonucleoprotéico (RNP), el cual consta de RNA viral que es unido por múltiples copias de NP y por la polimerasa viral que incluye las subunidades PB1 , PB2 y PA. Con la finalidad de formar los complejos RNP en las células de salmón se clonaron los ORFs de los segmentos 1 al 4 de ISAV901_09 en vectores de expresión comandados por el promotor de Citomegalovirus. De esa forma utilizando el vector pTriex-3 (Novagen) se clonaron los ORFs de los segmentos 1 , 2 y 4, obteniendo los vectores pTRiex3- PB2, pTRiex3-PB1 , pTRiex3- PA. Además utilizando el vector pCI-neo (Promega) se clonó el segmento 3 generando el vector pCI-neo-NP (Datos no mostrados). La transfeccion de estos vectores en células de salmón permiten la expresión de las proteínas recombinantes PB2, PB1 , PA y NP respectivamente.
Generación de iSAVrS6 Notl HPR
Para la generación de ISAVr S6-Not|-HPR ! células ASK fueron co-transfectadas con doce plásmidos, de los cuales cuatro corresponden a los vectores de expresión pTRiex 3-PB2, pTRiex 3-PB1 , pTRiex 3-PA y pCI-neo-NP y los ocho restantes corresponden a los plásmidos para genética reversa pSS-URG con cada uno de los ocho segmentos genómicos de ISAV901_09 en forma de DNA, reemplazando el segmento 6 nativo por Seg6-Notl-HPR. Con el fin de amplificar y determinar la presencia de virus recombinante, tras la transfeccion de las células, se realizaron dos pasajes ciegos en células ASK infectando con los sobrenadantes obtenidos de las transfecciones anteriores. Por una parte se detectó la presencia del RNAv del segmento 6 (Notl/HPR), mediante RT-PCR, obteniéndose un producto de tamaño esperado de 306 bp tanto en el RNA extraído del sobrenadante de transfección como de los dos pasajes posteriores sugiriendo la presencia de virus infecciosos. El sobrenadante del segundo pasaje se utilizó para infectar una mayor cantidad de células ASK. A partir de las células infectadas, las cuales mostraban un evidente efecto citopático (datos no mostrados), el virus recombinante se visualizó por microscopía electrónica de transmisión. En la Figura 6 se observa partículas esféricas semejantes a virus con diámetros cercanos a los 100 nm, sugiriendo que éstas corresponden a los virus recombinantes. Por lo tanto, fue posible detectar un virus recombinante isAVrS6"Notl"HPR en células infectadas, con una actividad replicativa y un efecto citopático reproducible en los pasajes posteriores a su generación. Generación de ISAVrS6 EGFP HPR
Con el objetivo de generar virus ISA recombinante que contuviera un gen reportero como EGFP, de tal forma que facilitara su seguimiento ex vivo y descartar que los resultados se traten de resultados artefactuales o de una contaminación. Células ASK fueron co-transfectadas con doce plásmidos a la vez : cuatro de ellos corresponden a los vectores de expresión pTRiex 3-PB2, pTRiex3-PB1 , pTRiex3-PA y pCI-neo-NP; los ocho plásmidos restantes corresponden a los vectores pSS- URG/1 , pSS-URG/2, pSS-URG/3, pSS-URG/4 , pSS-URG/5 , pSS-URG/7 y pSS- URG/8; incorporando además el segmento 6 con el vector pSS-URG/S6-EGFP-HPR, el virus que contiene EGFP en la zona HPR de la proteína HE se llamará ISAVr
EGFP-HPR
Para determinar si efectivamente después de la transfección se generaron partículas virales recombinantes, se analizó el sobrenadante de cultivo (Pasaje 0, P0) a los 7 días post-transfeccion (dpt). Para esto se detectó inicialmente mediante RT-PCR el RNAv del Segmento 6, así como la secuencia codificante de EGFP en un segundo producto de PCR y por último una zona que contiene tanto parte Segmento 6 como EGFP. Los resultados mostraron que los productos de RT-PCR para el Segmento 6, tienen diferencia en la distancia de migración de los productos de PCR, para el virus nativo (-300 pb) y el virus recombinante que poseen EGFP en la proteína HE (1 .000 pb). El RT-PCR de la secuencia codificante de EGFP presenta un producto de -500 pb, el cual no se observa en el virus nativo analizado. Para el RT-PCR del S6-EGFP se obtuvo de acuerdo a lo esperado un producto de amplificación de -800 pb para el virus recombinante. Infectividad del iSAVrS6 EGFP HPR en células ASK
Para determinar si el sobrenadante de las células ASK transfectadas con doce plásmidos contiene efectivamente la variante viral ISAVrS6"EGFP"HPR con características de un agente infeccioso, se utilizó la fluorescencia de EGFP como reportero. Las células ASK infectadas con el sobrenadante que contendría la primera progenie ISAVrS6 EGFP HPR fueron analizadas bajo microscopio confocal a los 7 días post infección. Los resultados del análisis muestran que es posible visualizar células que emiten fluorescencia verde atribuible a EGFP, correspondiendo al primer pasaje del virus ISAVrS6"EGFP"HPR. La distribución de la marca de EGFP se encuentra principalmente en el citoplasma y hacia la membrana plasmática , no observándose fluorescencia en el núcleo celular. Para confirmar que el sobrenadante de las células transfectadas (pasaje 0) contiene el virus lSAVrS6"EGFP"HPR con capacidad lítica, se realizó un ensayo de placas de lisis en células ASK. El resultado del ensayo de placas de lisis mostró que el virus recombinante tiene la capacidad de generar placas de lisis al igual que el virus silvestre, obteniéndose un título viral del orden de 1 x104 PFU/mL.
Estabilidad de iSAVrS6 EGFP HPR
Posteriormente, se evaluó la capacidad de este virus recombinante de mantener su infectividad y su fluorescencia en cultivo celular. Se realizaron cuatro pasajes ciegos de infección en células ASK con lapsos de 7 días. Luego a cada sobrenadante de los pasajes del virus recombinante , se realizó un RT -PCR para detectar el RNAv tanto del Segmento 6, como de la secuencia codificante para EGFP y una región de la secuencia híbrida EGFP-S6. El resultado del análisis permitió visualizar un producto de PCR de EGFP de 500 pb y las secuencias híbridas EGFP-S6 de 800 pb, indicando la presencia del segmento 6 que contiene el gen de EGFP en todos los sobrenadantes analizados. El producto de PCR del segmento 6 muestra un producto de 300 pb en el sobrenadante de células ASK infectadas con virus ISAV901_09 silvestre como era de esperar, contrastando con los 1 .000 pb del producto de PCR obtenido en cada uno de los cuatro pasajes del virus ISAVrS6"EGFP"HPR, cuyo mayor tamaño es la consecuencia de haber incorporado el gen de EGFP en el segmento 6. Para determinar que en cada uno de los cuatro pasajes no solo se tuviera un virus con capacidad infecciosa, si no que con capacidad de fluorescer, indicando correcto plegamiento de HE con EGFP en la zona HPR, se realizó un análisis por microscopía confocal en células ASK infectadas. La microscopía confocal mostró células que emiten fluorescencia verde en todos los pasajes analizados, aumentando en cada pasaje la abundancia de células fluorescentes. Estos resultados sugieren que la región de la proteína HE escogida para incorporar EGFP no es afectada por la incorporación de este ORF, permitiendo así generar un virus ISA recombinante quimérico capaz de replicar, infectar y propagarse en múltiples pasajes sin perder la capacidad de fluorecer. La titulación del cuarto pasaje ciego realizado al virus ISAVrS6"EGFP"HPR mediante qRT-PCR en tiempo real resultó en un título de 3,63 x 106 copias Seg 8/mL y a un valor de 6,5 x 105 PFU/mL obtenido por ensayo de placas de lisis. Mostrando un tamaño de placa de lisis similar al observado tras realizar ensayo de placas al virus ISAV901_09 silvestre. Infectividad del isAVrS6 EGFP HPR en líneas celulares de salmónidos
Con el objetivo de determinar si al incorporar una secuencia en la zona HPR el virus lSAVrS6"EGFP"HPR adquiere la capacidad de infectar otras especies de salmónidos o bien pierde la infectividad en células permisivas (células ASK), se realizó una cinética de infección en células RTG-2, CSE-1 19 y ASK. El ensayo ex vivo se realizó durante 7 días utilizando el cuarto pasaje del virus recombinante fluorescente y se comparó con el virus ISAV901_09 silvestre y el cuarto pasaje de un virus recombinante tipo silvestre generado para este ensayo rISAV901-09 (MOI de 0,01 ). El análisis a los 0, 2, 4 y 7 dpi realizado por qRT-PCR cuantificando el número de copias del segmento 8 en cada sobrenadante mostró que ninguno de los tres virus analizados tuvo la capacidad de replicar en las células RTG-2 ni en las células CSE-1 19.
En contraste, la cinética de infección realizada en células ASK mostró que inicialmente el virus ISAV 901 _09 presenta un mayor número de copias que los virus recombinantes, rISAV901 e rlSAVS6"EGFP"HPR Al segundo día post infección no obstante se produce un aumento en el número de copias de los virus recombinantes logrando alcanzar títulos cercanos a las 1 .000 copias segmento 8/mL, con valores similares al virus nativo. Estos resultados sugieren que la incorporación de EGFP en la zona HPR de la proteína HE no altera el comportamiento replicativo del virus recombinante fluorescente en células ASK, y tampoco amplía el rango de hospedero al menos en los ensayos ex vivo realizados en células RTG-2 ni en las células CSE- 1 19.
Estos resultados permiten concluir que es posible incorporar en el plásmido pSS-URG una secuencia que codifique tanto para una proteína viral, como para una proteína exógena o bien quimérica. Logrando así generar un virus ISA recombinante modificado o quimérico, estas modificaciones no alterarían o afectarían sus características infecciosas o de propagación.
Funcionalidad del plásmido pSS-URG en líneas celulares de salmón, cerdo y humano
Para determinar la capacidad del vector pSS-URG/S6-Notl-HPR de transcribir el segmento 6 en forma de RNAv, se transfectó en células ASK, utilizando Fugene 6 (Promega) a una razón 1 :6 y de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Se considera 0 hpt el momento de añadir la mezcla de transfección a las células. La incubación inicial transcurre por 3 horas a 16QC. Trascurrido el tiempo de incubación la mezcla de transfección fue removida y las células fueron lavadas dos veces con PBS, siendo éste el tiempo 3 hpt. En cada punto de la cinética de transfección, que ocurre a las 0, 3, 6, 9, 12 y 15 hpt, las células son removidas para realizar la extracción de RNA total, el posible DNA contaminante fue eliminado con DNasa I. Con el RNA obtenido se detectó el RNAv del segmento 6 Notl mediante RT-PCR utilizando partidores específicos para el segmento 6 Notl. El análisis permite observar un producto de PCR de tamaño esperado de 306 pbs a partir de las 3 hpt, el cual va aumentando en intensidad hasta los 15 hpt (Figura 3). Por lo tanto, se demuestra que el plásmido pSS-URG es funcional.
Sorprendentemente la capacidad de transcribir el RNA viral no se circunscribe a células de salmón cultivadas a 16QC. Utilizando el mismo procedimiento (con las incubaciones a 37QC), pero realizado solo a las 12 hpt se observó funcionalidad en la línea celular humana HEK 293 y la línea celular de cerdo ST, incubadas a 37QC (Figura 5). Esto se ve reflejado en la obtención de un producto de RT-PCR del tamaño esperado lo que permite concluir que el vector es funcional en líneas celulares de salmón incubada a 16QC y de mamíferos incubadas a 37QC. Siendo una herramienta que permitiría la expresión de cualquier RNA en células o tejidos de animales vertebrados, sean de sangre fría o sangre caliente. ISAVr : correlación entre el número de copias virales y la fluorescencia medida
En vista que el virus ISAVrS6"EGFP"HPR tiene características similares al virus silvestre al infectar células ASK, y que además tiene la ventaja de poder monitorizar la infección gracias a la incorporación de EGFP como reportero, se propuso determinar si existe correlación entre la carga viral y la fluorescencia en el sobrenadante de infección producida por este virus recombinante. El análisis realizado a diluciones seriadas del virus recombinante fluorescente a través de qRT- PCR y de cuantificación de la fluorescencia permitió establecer que existe una relación directa que muestra un aumento de la fluorecencia detectada a medida que aumenta el titulo viral de la solución, observándose una intensidad de fluorescencia de 500 unidades/mL para un titulo de 2x1 06 copias/mL.
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Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un método para producir un virus ns-RNA quimérico, CARACTERIZADO porque comprende:
a) transfectar células animales con un vector de expresión o un set de vectores de expresión capaces de expresar una nucleoproteína y RNA polimerasa RNA dependiente;
b) transfectar la célula animal de a) con un vector de expresión o un set de vectores de expresión con secuencias nucleotídicas que codifican moléculas de RNA recombinante.
2. El método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque las células se cultivan en condiciones adecuadas para la replicación celular de las células transfectadas.
3. El método de la reivindicación 1 y 2, CARACTERIZADO porque se obtienen partículas virales recombinantes funcionales.
4. Un plásmido recombinante funcional en células animales, CARACTERIZADO porque consta de un esqueleto pSS-URG en el cual se pueden introducir secuencias genómicas de virus que se expresan en forma de ARN.
5. Un plásmido recombinante funcional en células animales según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque dicho plásmido es funcional en células animales.
6. Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el plásmido pSS-URG contiene la secuencia del promotor de S. salar encontrado en la región ITS-1; secuencia de la ribozima Hammerhead; un sitio de clonamiento; secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis δ; y el terminador de la transcripción de la β-globina de conejo.
7. Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4 a 6, CARACTERIZADO porque el promotor de S. salar tiene una secuencia ID nro:1
8. Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4 a 6, CARACTERIZADO porque la secuencia de la ribozima Hammerhead tiene una secuencia ID nro:2.
9. Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4 a 6, CARACTERIZADO porque el sitio de clonamiento tiene una secuencia ID nro: 3.
10. Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4 a 6, CARACTERIZADO porque la secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis δ tiene una secuencia ID nro:4.
1 1 . Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4 a 6, CARACTERIZADO porque el terminador de la transcripción de la β-globina de conejo tiene una secuencia ID nro:5.
12. Un plásmido recombinante funcional en células animales según las reivindicación 4 a 1 1 , CARACTERIZADO porque en dicho plásmido permite clonar secuencias genéticas de origen animal, vegetal, protista, fungico, bacteriano o viral utilizando la enzima de restricción de corte distante Sapl.
13. Un plásmido recombinante funcional en células animales según la reivindicación 4 a 12, CARACTERIZADO porque dicho plásmido es transfectado a una célula animal permitiendo la transcripción del gen, obteniendo un ARN sin nucleotidos adicionales en sus extremos.
14. Un plásmido de expresión, CARACTERIZADO porque codifica las proteínas necesarias para generar el cRNP.
15. Un plásmido de expresión según la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque se clonan por separado las secuencias PB2 ID nro: 7, PB1 ID nro: 8, PA ID nro: 9 y NP ID nro: 10 de ISAV 901_09.
16. Método de obtención de partículas virales, CARACTERIZADO porque comprende:
a) transfectar células animales con un vector de o un set de vectores de expresión capaces de expresar una nucleoproteína y RNA polimerasa RNA dependiente secuencias PB1 ID nro: 7, PB2 ID nro: 8, PA ID nro: 9 y NP ID nro: 10 de ISAV901 -09.
b) transfectar la célula animal de a) con un vector de expresión o un set de vectores de expresión pSS-URG con secuencias nucleotídicas que codifican moléculas de RNA recombinante bajo el control de la secuencia del promotor de S. salar encontrado en la región ITS-1; secuencia de la ribozima Hammerhead; un sitio de clonamiento; secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis δ; y el terminador de la transcripción de la β-globina de conejo;
c) Obtener partículas virales recombinantes.
17. Uso de las partículas virales, CARACTERIZADO porque sirven para expresar ácidos nucleicos del tipo ARN.
18. Uso de las partículas virales según la reivindicación 17, CARACTERIZADO porque sirven para expresar proteínas autógenas o exógenas al virus.
19. Uso de las partículas virales según la reivindicación 17, CARACTERIZADO porque sirven para expresar ácidos nucleicos del tipo ARN interferentes, ARN de silenciamiento o también micro ARNs.
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