KR101813723B1

KR101813723B1 - 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자의 제조 방법

Info

Publication number: KR101813723B1
Application number: KR1020117027688A
Authority: KR
Inventors: 데 왈터 게르하르두스 브리스
Original assignee: 아마르나 홀딩 비브이
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2017-12-29
Also published as: EP2421982B1; US20120040399A1; JP5756795B2; WO2010122094A1; MX2011010612A; EP2243836A1; EA022206B1; AU2010240900B2; AU2010240900A1; DK2421982T3; JP2012524531A; BRPI1016173A2; EA201101532A1; US9587226B2; CA2759596A1; KR20120006062A; CA2759596C; CN102695800A; ES2548990T3; EP2421982A1

Abstract

본 발명은 바이러스 입자, 바이러스 벡터 입자 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자 및 폴리오마바이러스 벡터 생산 세포주를 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 시미안 바이러스 40(SV40) 바이러스 벡터 입자와 같은 시미안 폴리오마바이러스 벡터 입자의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 그의 용도 및 유전 질환, 이식 거부반응, 자가면역 질환, 감염성 질환, 알레르기 또는 암을 치료하기 위한 바이러스 벡터 입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 제조 방법 및 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 생성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYOMAVIRAL VECTOR PARTICLES}

본 발명은 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 바이러스 벡터 입자 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자 및 폴리오마바이러스 벡터 생산 세포주를 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 시미안(simian) 바이러스 40(SV40) 바이러스 벡터와 같은 시미안 폴리오마바이러스 벡터의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 그의 용도, 및 유전자 질환, 이식 거부반응, 자가면역 질환, 감염성 질환, 알레르기 또는 암을 치료하기 위한 바이러스 벡터 입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 제조 방법 및 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 생성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

지난 수십 년간, 표적 세포에서 유전자 또는 핵산의 도입 및 적절한 발현을 위한 효과적인 유전자 또는 핵산 전달 기술의 개발에 많은 노력을 기울여 왔다. 유전 질환을 치료하기 위해 이상 유전자를 복구하거나, 또는 암 및 감염성 질환을 치료하기 위해 면역 반응을 유도하거나, 또는 예를 들면, 이식 거부반응을 방지하거나 자가면역 질환 및 알레르기를 치료하기 위해 면역 관용을 유도/복구하기 위해 면역 반응을 억제하기 위해 치료용 유전자 또는 핵산이 사용될 수 있다. 치료용 유전자 또는 핵산은 노출된 분자로서 또는 지질 및/또는 단백질성 화합물에 패키징된 핵산으로서 투여될 수 있다.

바이러스는 그의 숙주 표적 세포내에 그의 유전자 정보를 전달하고 발현시키기 위해 발달되었기 때문에, 바이러스 벡터가 유전자 전달 비히클로서 개발되었으며 살아있는 세포내에 유전자 정보를 전달하는 단연코 가장 효과적인 수단인 것으로 밝혀졌다. 많은 바이러스 벡터 유전자 전달 시스템이 임상전 및 임상 시험에서 개발되고 시험되었다. 이러한 시험들은 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 레트로바이러스, 파보바이러스 및 폴리오마바이러스로부터 유래된 현재 사용되는 벡터들이 일반적으로 사용하기에 안전하며 표적 세포에 치료 유전자를 전달하는데 효과적임을 보여주었다.

현재 사용되는 바이러스 유전자 전달 벡터의 주 단점은 이들이 많은 수의 환자를 치료하기에 충분한 양으로 생산될 수 없다는 점이다. 대부분의 바이러스 벡터는 벡터 및 벡터 성분들을 암호화하는 플라스미드 DNA로 생산자 세포를 형질감염시켜 생성된다. 상기 방법은 일반적으로 세포 배양물 부피 ml 당 백만 내지 천만개의 벡터 입자를 제공한다. 임상 시험에서, 유리한 임상 효과를 달성하기 위해서는 일반적으로 1 x 10¹⁰ 내지 1 x 10¹² 개의 벡터 입자가 환자에게 투여되어야 한다. 이것은 1000명의 환자를 치료하기 위해서는 충분한 양의 벡터 입자를 제공하기 위해 백만 리터 이상의 세포 배양물이 필요함을 의미한다.

또한, 임상전 및 임상 시험은 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스 및 레트로바이러스 벡터와 같은 시험된 바이러스 유전자 전달 벡터의 대부분이 환자에서, 바이러스 벡터 성분 및 치료용 유전자 산물과 관련된 강한 면역 반응을 유도함을 보여주었다. 결과적으로, 이들 벡터는 환자에게 오직 1회만 투여될 수 있는 반면에, 도입된 치료 유전자의 발현 수준은 급격히 감소한다. 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유도된 바이러스 벡터는 동물에서 면역 반응을 유도하지 않으며 면역학적으로 불활성이다. 그러나, 대부분의 인간 개체군은 그 헬퍼 바이러스, 예를 들면, 아데노바이러스와 함께 야생형 AAV와 접하였으며, 그 결과 AAV 캡시드 단백질에 대해 강한 CTL 메모리를 나타내었다. 결과적으로, AAV-형질도입 세포는 신속히 제거되고, AAV 바이러스 벡터에 의해 도입된 치료용 유전자 또는 핵산의 발현 수준은 급속히 감소된다.

원핵 세포에서 생성된 것과 비교하여 포유동물 세포에서 생성된 재조합 단백질의 수율은, 강한 프로모터의 사용 및/또는 다중복제 전이유전자 삽입, 또는 전사를 증대시키기 위한 다른 방법들에도 불구하고, 일반적으로 낮다. 바이러스 복제 가능 벡터 또는 레플리콘(replicon)이 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 생성을 위한 발현 시스템으로서 장기간 사용되어 왔다. 상기 벡터에서 표적 유전자는 바이러스 프로모터의 전사 조절하에 발현될 수 있으며, 이때 목적하는 mRNA가 형질감염 직후에 세포질내에 매우 높은 수준으로 축적되어 대량의 표적 단백질을 생성할 수 있다. 지금까지 레플리콘-기본 발현 시스템을 사용한 성공은 제한되었었다. RNA 바이러스를 기초로 하는 레플리콘 시스템은 일반적으로 단지 단시간동안만 재조합 단백질을 생성하는 반면, DNA 바이러스로부터 유도된 레플리콘 시스템은 일반적으로 상업적으로 사용되는 세포주에서 잘 복제되지 않는다.

우리가 알기로는, 인간에서 면역학적으로 불활성이면서 많은 수의 환자를 치료하기에 충분한 양으로 생성될 수 있는 바이러스 유전자 전달 벡터는 단지 하나만이 존재한다. 또한, 상기 바이러스 유전자 전달 벡터는 포유동물 세포주에서 재조합 단백질 생성을 위한 레플리콘 시스템으로 사용될 수 있다. 상기 바이러스 벡터 시스템은 시미안 바이러스 40(SV40), 시미안 폴리오마바이러스로부터 유도된다.

폴리오마바이러스는 20면체 캡시드를 갖는 비-외피형 DNA 바이러스의 한 부류로 이루어진다. 이들은 인간, 원숭이, 설치류 및 조류를 포함한 다양한 동물 종으로부터 분리된다. BK, JC, WU, KI 및 머켈(Merkel) 세포 폴리오마바이러스로 불리우는 5가지의 인간 폴리오마바이러스가 기술되었다. 많은 원숭이 폴리오마바이러스가 기술되었으며, 그중에서 SV40이 가장 잘 알려져 있다. SV40은 인간 세포에서 잘 복제되지 않으며 인간에서의 감염은 드물다. 가끔 있는 SV40 감염은 원숭이로부터 상기 동물과 밀접하게 접촉하는 살아있는 사람에게 바이러스의 전염을 통해 또는 SV40으로 오염된 일단의 불활성화 폴리오바이러스 입자들에 의한 백신화를 통해 야기되었다.

SV40은 5.25 kbp 길이의 원형 이중 가닥 DNA 게놈을 갖는다. SV40 게놈은 2개의 조절 영역, 프로모터/기점 영역 및 폴리아데닐화 영역으로 이루어진다. 프로모터/기점 영역은 500 bp 길이이며 2개의 대향되는 프로모터, 초기 및 후기 프로모터(각각 SVEP 및 SVLP), 복제 기점 및 패키징 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 영역은 100 bp 길이이며 초기 및 후기 전사체 둘 다의 폴리아데닐화 신호를 함유한다. SVEP는 숙주-암호화 스플라이싱 인자에 의해 소형 및 대형 종양(T) 항원을 암호화하는 2개의 상이한 mRNA로 스플라이스되는 초기 1차 전사체의 발현을 유도한다.

대형 T 항원은 DNA 복제 및 SVLP의 활성화에 필요한 복제효소-관련 단백질이다. 바이러스 복제에서 소형 T 항원의 정확한 역할은 불분명하게 남아있지만, 소형 T 항원은 대형 T 항원과 함께 여러 포유동물 세포 유형의 형질전환에 필요하다. 소형 T 항원의 주 효과는 세린-트레오닌 단백질 포스파타제 2A와의 그의 상호작용을 통해 일어난다. 소형 T 항원의 포스파타제 2A-결합 영역은 소형 T 항원의 유일한 카복시-종결 말단에 위치한다.

대형 T 항원 및 소형 T 항원 둘 다 효과적인 폴리오마바이러스 복제에 필요함은 선행 기술에서 잘 입증되어 있다[Fahrbach K.M. et al., Virology 370, (2):255-263 (2008)].

SVLP는 숙주-암호화 스플라이싱 인자에 의해 바이러스 캡시드 단백질 VP1, 2 및 3으로 스플라이스되는 후기 1차 전사체의 발현을 유도한다. T 항원은 SV40-감염 세포에 대해 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하는, 폴리오마 바이러스의 주 면역원성 성분이며 캡시드 단백질은 부 면역원성 성분이다.

SV40 T 항원은 협력하여 1차 포유동물 세포를 불멸화시키고, 확립된 포유동물 세포주를 형질전환시키고, 면역-저하된 어린 설치류에서 종양을 유도한다. 많은 보고서들이 SV40 감염이 만성적으로 발현된 T 항원의 종양유발 활성에 의해 야기된 인간 악성종양과 관련됨을 제시하고 있다[Butel J.S. and Lednicky J.A., Journal of the National Cancer Institute 91:119-134 (1999)].

바이러스 캡시드 단백질의 발현은 대형 T 항원의 존재에 의존성이므로, 벡터를 복제-불능으로 만들기 위해서 및 인간에서 그의 면역원성을 완전히 배제시키기 위해 T 항원-특이적 서열을 폴리오마 바이러스 벡터에서 결실시켰다.

SV40으로부터 유도된 T 항원-결실된 폴리오마 바이러스 벡터를 제조하고 시험하였으며, 이때 치료용 유전자 또는 핵산을 바이러스 SVEP의 전사 조절하에 표적 세포에서 트랜스로 발현시킨다. 상기 벡터는 다수의 인간 조직 및 세포 유형, 예를 들면, 골수[Rund D. et al., Human Gene Therapy 9:649-657 (1998)], 간[Strayer D.S. and Zern M.A., Seminars in Liver Disease 19:71-81 (1999)], 및 수지상 세포[Vera M. et al., Molecular Therapy 12:950-959 (2005)] 내로 유전자 전이를 위한 가능한 벡터로서 오랫동안 알려져 왔다.

폴리오마바이러스 벡터, 예를 들면, SV40은 비-분열 세포 및 활성적 분열 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있다. 상기 벡터는 T 항원을 암호화하는 영역이 결여되어 있고 그 결과 바이러스 캡시드 단백질을 발현시키지 않기 때문에, 이들은 비-면역원성이어서[Strayer D.S. and Zern M.A., Seminars in Liver Disease 19:71-81 (1999)] 동일한 개체에 반복 투여를 가능케 한다. 또한, 삽입된 치료용 유전자 구조물은 약하지만 구성성 프로모터인 SVEP의 전사 조절하에 발현되므로, 상기 벡터는 생체내에서 치료용 단백질의 장기 발현을 유도한다. 따라서, 폴리오마바이러스 벡터, 예를 들면, SV40-유래 벡터는 상기 언급된 용도에 사용될 수 있는 치료용 유전자 또는 핵산 전이에 유망한 후보이다.

그의 복제 가능성으로 인해, 폴리오마바이러스계 레플리콘은 또한 포유동물 세포에서 항체, 성장 인자 및 호르몬과 같은 재조합 단백질의 생성을 증대시키는데 매우 유리하다.

T 항원-결실 SV40 입자는 SV40의 용균 성장을 허용하며 T 항원을 트랜스로 공급하는 시미안 세포에서 생성되었다. 현재 사용되는 SV40 벡터 패키징 세포주는 COS 세포주, 특히 COS-1 및 COS-7이다[Gluzman Y., Cell 23:175-182 (1981)]. COS 세포주는 SV40 DNA를 갖는 원숭이 CV1 세포의 형질전환에 의해 생성되었다. SV40 T 항원을 트랜스로 발현하는 또 다른 세포주는 CMT4이다. CV1-유래 CMT 세포주는 T 항원이 마우스 메탈로티오네인 프로모터의 전사 조절하에 발현된 SV40 DNA를 사용하여 생성되었다[Gerard R.D. and Gluzman Y., Molecular and Cellular Biology 5:3231-3240 (1985)].

그러나, 상기 세포주의 사용에 중요한 문제점이 있다. 구축된 패키징 세포주(COS 또는 CMT)에서 T 항원-결실된 SV40 벡터의 계대배양은 많은 경우에 야생형 복제-가능 SV40 입자의 발생을 야기한다[Gluzman Y., Cell 23:175-182 (1981); Oppenheim A. and Peleg A., Gene 77:79-86 (1989); Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)].

이것은 염색체적으로 삽입된 SV40-특이 서열과 핵 SV40 벡터-특이 서열 사이의 뉴클레오티드 서열 상동성-의존성 재조합에 의해 일어나기 쉽다. 복제 가능 야생형 바이러스 입자의 발생 및 상기 통상적인 패키징 세포주에서 T 항원 종양단백질의 존재는 의료 목적의 SV40 벡터의 사용을 실행할 수 없게 만들었다.

인간 배아 신장 293(HEK293) 세포주는 SV40 감염에 반-허용적으로, 이것은 단지 적은 비율의 감염 세포가 바이러스 복제를 조장하는 것을 의미한다. 대부분의 세포는 지속적으로 감염되며 매우 낮은 수준의 바이러스 복제를 나타낸다.

HEK293 세포주의 유도체는 라우스 육종 바이러스 장기 반복 프로모터의 전사 조절하에 SV40 초기 영역을 발현하는 HEK293T 세포주이다. HEK293T 세포는, SV40 소형 T 항원 mRNA에 유리한 스플라이싱 바이어스로 인해 매우 소량의 대형 T 항원 및 대량의 소형 T 항원을 발현한다. 베라(Vera) 등은 HEK293T가 SV40 바이러스 벡터 생성을 별로 조장하지 못함을 밝혀내었다[Vera M., et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)].

T 항원 종양단백질이 HEK293T 세포에 존재하고 복제 가능 SV40 바이러스가 나타날 위험이 존재하기 때문에, 의료 목적으로 SV40 벡터를 생산하기 위해 상기 세포주를 사용하는 것은 바람직하지 않으며 실행가능하지 않다.

HEK293TT 세포주는 SV40 대형 T 항원을 암호화하는 유전자 구조물에 의한 안정한 형질감염에 의해 생성된 HEK293T의 유도체로서 개발되었다. HEK293TT 세포는 재조합 인유두종 바이러스(HPV) 슈도-벡터 입자의 생성에 사용된다. 재조합 HPV 슈도-벡터 입자는, SV40 복제 기점 및 HPV 캡시드 유전자를 갖는 플라스미드 및 SV40 복제 기점 및 HPV 슈도-게놈을 갖는 플라스미드로 세포를 형질감염시켜 HEK293TT에서 생성된다[Buck C.B. et al., Methods in Molecular Medicine 119:445-462 (2005)].

HEK293T의 유도체로서 HEK293TT가 소형 및 대형 T 항원 종양단백질을 축적시키고 SV40 복제를 거의 조장하지 못하므로, 의료 목적의 재조합 SV40 벡터를 생성하기 위해 상기 세포주를 사용하는 것도 또한 바람직하지 않고 실행가능하지 않다.

WO 03/025189 호는 주장하는 바에 따르면 의료 용도에 안전한 SV40 벡터 입자의 생성을 가능케하는 패키징 상보성 세포주를 기술하고 있다. 그러나, 본원에 기술된 패키징 세포주는 여전히 상당량의 소형 및 대형 T 항원 종양단백질을 축적시킨다.

문헌 [Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)]은 CMT4 및 HEK293T와 같은 특정 세포주에서 문제의 재조합 SV40 벡터 입자의 생성 능력이 매우 낮을 수 있음을 보여주었으며, WO 03/025189 호에 기술된 세포주, 예를 들면, COT-2가, 아마도 상기 세포 유형에서 소형 T 항원 mRNA에 유리한 스플라이싱 바이어스로 인해, 또한 재조합 SV40 바이러스 입자에 대한 생산자 세포주로서 효과적이지 않음을 언급하고 있다.

WO 08/000779 호는 RNA 간섭(RNAi)의 바이러스 억제제, 예를 들면, 백시니아 바이러스 E3L 및 인플루엔자 A 바이러스 NS1 단백질을 사용하여 고농도의 적당한 SV40 바이러스 벡터를 생성함으로 상기 문제를 해결하는 방법을 기술하고 있다. WO 08/000779 호에 기술된 패키징 세포주는 본원에서 전술한 선행 기술의 패키징 세포주의 문제점에 대한 해결책을 제공하지 않는다.

중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 마우스 폴리오마바이러스 초기 영역을 제공하여 CHOP 세포주를 생성하였다(Heffernan and Dennis, Nucleic Acids Research 19:85-92 (1991)]. 많은 CHOP 세포주가 마우스 폴리오마바이러스 복제 기점을 갖는 포유동물 발현 벡터인 플라스미드 CDM8(인비트로겐)의 복제를 조장하였다. CHOP 세포주에서 복제 수준은, 아마도 CHO 세포에서 소형 T 항원 또는 중간 T 항원 mRNA에 유리한 스플라이싱 바이어스로 인해, 상기 시스템을 상업적 용도로 관심을 끌게 하기에 충분하지 않았다.

당해 분야에는 사용하기에 안전하고 고농도의 바이러스 벡터 입자를 생성하는 재조합 폴리오마바이러스 입자에 대한 효과적인 생산 시스템에 대한 필요가 존재한다. 그러므로, 본 발명의 목적은 폴리오마바이러스 입자의 안전하고 효과적인 생산 방법 및 그에 의해 수득할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 또한 포유동물 세포에서 대량의 재조합 단백질의 생산에 사용될 수 있음을 인지해야 한다.

상기 목적은, (a) 작용성 대형 T 항원은 발현시킬 수 있지만 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원은 발현할 수 없는, 야생형 폴리오마바이러스에 허용되는 세포주를 제공하고, (b) 상기 세포주에 작용성 소형 T 항원을 암호화할 수 없는 폴리오마바이러스 DNA를 도입하고, (c) 상기 세포를 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자의 생성을 가능케 하는 조건하에 성장 배지중에서 배양하고, (d) 세포 배양물로부터 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 수확하는 단계를 포함하는, 작용성 소형 T 항원을 발현할 수 없는 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 제조하기 위한 방법이 제공된다는 점에서 본 발명에 의해 충족되었다.

상기 방법에 의해 제조된 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자는 작용성 소형 T 항원을 발현시킬 수 없으며 야생형 폴리오마바이러스 입자로 복귀될 수 없다. 이것은 폴리오마바이러스 벡터에서 뿐 아니라 폴리오마바이러스 벡터 생산자 세포주에서도 작용성 소형 T 항원을 암호화하는 유전자의 완전한 결여에 기인할 수 있다.

이것은 본 발명에 이르러 처음으로 단일 야생형 폴리오마바이러스 입자없이 상당수의 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 제조를 가능하게 한다. 상기 방법에서 생성된 바이러스 벡터 입자는 야생형 폴리오마바이러스에 허용되며 작용성 대형 T 항원을 발현하지 않는 세포에서 복제될 수 없다. 따라서, 상기 조성물은 의학적 치료에 사용하기에 안전하다.

지금까지, 야생형 폴리오마바이러스 복귀돌연변이체 재조합체 없이 대량의 폴리오마바이러스 벡터 입자를 생성하는 것은 가능하지 않았다. 본 발명을 이용하여, 이제 단일 야생형 바이러스가 존재하지 않으면서 대량의 균일한 바이러스 벡터 입자를 수득하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 작용성 소형 T 항원을 발현할 수 없으므로 야생형 폴리오마바이러스에 허용되는 대형 T 항원-결핍 세포에서 복제될 수 없는 폴리오마바이러스 입자를 10⁶ 개 이상 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용하기 위한 세포주는 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 발현하고 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원은 발현하지 않도록 유전자 변형된 폴리오마바이러스에 허용되는 통상적인 포유동물 세포주일 수 있다. 본 발명에 따른 세포주는 폴리오마바이러스 복제 기점을 갖는 원형 DNA 분자를 복제할 수 있기 때문에 재조합 단백질의 제조에 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 전술한 바와 같은 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 폴리오마바이러스의 대형 T 항원이 단독으로 폴리오마바이러스 캡시드 단백질의 발현을 조장하며 폴리오마바이러스 소형 T 항원이 상기 목적에 필요하지 않음을 밝혀내었다. 이것은, 세포에서 폴리오마바이러스 T 항원의 부재하에 SVEP가 사이토메갈로바이러스(CMV) 속발성 초기 프로모터와 같은 다른 바이러스 프로모터에 비해 구성요소이지만 약한 프로모터인 반면, SVLP는 전사 또는 전사후 수준에서 정지되는 것을 의미한다. 놀랍게도, SV40-허용 세포에서, SV40 대형 T 항원은 단독으로 SV40 바이러스 벡터 DNA의 증식을 유지할 수 있으며 SVLP를 활성화시킬 수 있으므로, 캡시드 단백질의 축적을 유도하고 SV40 바이러스 벡터 입자의 효과적인 생성을 야기한다.

선행 기술에서, 소형 T 항원을 암호화하는 데 결함이 있는 SV40 균주가 생성되었다. 문헌 [Gauchat et al., Nucleic Acids Research 14:9339-9351 (1988)]은 소형 T 항원이 결여되어 있지만 감염 세포에서 작용성 대형 T 항원을 생성하는 SV40 결실 돌연변이체 dl883을 기술하고 있다. 상기 돌연변이 바이러스 균주를 사용하여 원숭이 신장 세포 및 CV-1 세포 배양물을 감염시킨 경우, 돌연변이 바이러스 균주는 대형 T 항원-매개 세포 분열 및 후속 바이러스 복제를 유도하는데 있어 야생형 SV40보다 덜 효과적이었다. 저자는 소형 T 항원이 헬퍼 기능을 가져 대형 T 항원이 세포 분열 및 바이러스 복제를 유도하는 것을 돕는 것으로 결론지었다. 따라서, 상기 선행 기술은 야생형 SV40으로 감염된 세포와 비교하여 dl883으로 감염된 많은 세포가 분열되지 않으며 바이러스 입자를 생성하지 않음을 보여주므로, 본 발명과는 다르게 교지하고 있다. 세포에서 소형 T 항원의 부재는 바이러스 벡터 생성에 결정적인 것으로 교지하고 있다.

상기 고샤트(Gauchat) 등의 문헌은 바이러스 입자가 생성되는지 아닌지에 대해서는 결론짓지 않고 있다. 이들은 단지 세포에서 바이러스 DNA의 생성을 측정할 뿐이며, 이것은 손상되지 않은 바이러스 입자의 생성과는 다르다.

그러므로, 본 발명은 숙련된 자에게 반직관적이다. 또한, 숙련된 자에게는 소형 T 항원이 RNAi의 효과적인 억제제임이 공지되어 있다. RNAi는 항바이러스 기전으로 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에, 세포내 소형 T 항원의 양의 감소는 RNAi-기본 항바이러스 활성의 증가를 유도하여 바이러스 입자의 감소된 생성을 야기할 것으로 예상되었다. 본 발명자들은 놀랍게도 그 반대가 사실임을 밝혀내었다. 대형 T 항원이 트랜스로 제공되는 경우, 즉, 세포주가 대형 T 항원을 생성하는 경우(이때, 세포주 및 폴리오마바이러스 균주는 둘 다 작용성 소형 T 항원이 결여되어 있다), 폴리오마바이러스 입자가 대량으로 생성된다. 본 발명과 고샤트 등의 결과의 차이점은 고샤트 등에 기술된 실험에서 작용성 대형 T 항원이 시스로 제공, 즉, 감염 세포에서 복제되는 폴리오마바이러스 벡터상에 제공된다는 것이다. 이것은 명백하게 일부 세포 사멸 및 매우 비효과적인 바이러스 벡터 생산을 초래한다.

본 발명은 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자 및 폴리오마바이러스 벡터 패키징 세포주 및 폴리오마바이러스 레플리콘의 복제를 조장하는 세포주의 복제 방법을 제공하며, 이때 상기 폴리오마바이러스 벡터 및 레플리콘은 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 발현할 수 없다.

본 발명에서, 모든 세포는 폴리오마바이러스 벡터 생성에 기여하며, 1 x 10⁶ 또는 심지어 1 x 10¹¹ 바이러스 벡터 입자/세포 배양물 부피 ml의 수준이 본 발명에 따른 방법으로 수득될 수 있다.

이와 관련하여 "작용성 대형 T 항원" 또는 "그의 작용성 부분"이란 표현은 그들이 유도되는 대형 T 항원에 기인할 때 본 발명을 수행하기 위해 필요한 바와 동일한 기능을 수행할 수 있으며, 보다 특히, 폴리오마바이러스 바이러스 벡터 DNA의 증식을 지속할 수 있고 폴리오마바이러스에 허용되는 세포에서 SVLP를 활성화시킬 수 있는 폴리오마바이러스로부터 수득가능한 대형 T 항원 또는 그의 단편 또는 유사체를 의미한다.

대형 T 항원의 작용성은, 폴리오마바이러스 대형 T 항원 또는 그의 단편 또는 유사체를 암호화하는 발현 플라스미드를 야생형 폴리오마바이러스에 허용되는 세포에서 T 항원-결실된 폴리오마바이러스 벡터 DNA와 함께 동시-발현시키고, 폴리오마바이러스 벡터 입자가 생성되는지 여부를 측정함으로써 검사할 수 있다. 상기 분석에서 단일 폴리오마바이러스 입자가 생성되는 경우 폴리오마바이러스 대형 T 항원 또는 그의 단편 또는 유사체는 작용성 대형 T 항원인 것으로 결론지을 수 있다. 이것은 전자 현미경 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다.

이와 관련하여 "작용성 소형 T 항원" 또는 "그의 작용성 부분"이란 표현은 그들이 유도되는 대형 T 항원에 기인할 때 본 발명을 수행하기 위해 필요한 바와 동일한 기능을 수행할 수 있으며, 보다 특히, 단백질 포스파타제 2A와 상호작용하고/하거나 그를 억제할 수 있는 폴리오마바이러스로부터 수득가능한 대형 T 항원 또는 그의 단편 또는 유사체를 의미한다. 소형 T 항원의 작용성은 문헌 [CHO U.S. et al., PLoS Biology 5(8):e202 (2007)]에 기술된 바와 같이 폴리오마바이러스 소형 T 항원 또는 그의 단편 또는 유사체 및 단백질 포스파타제 2A 사이에 결합 분석을 이용하여 검사할 수 있다. 상기 분석에서 상호작용 및/또는 억제가 배경보다 높은 경우 소형 T 항원 또는 그의 단편 또는 유사체는 작용성 소형 T 항원인 것으로 결론지을 수 있다.

본 발명에 유용한 세포주는 폴리오마바이러스 대형 T 항원 또는 그의 작용성 부분을 발현할 수 있으며, 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원은 발현할 수 없다. 결과적으로, 본 발명의 세포주는 폴리오마바이러스-암호화된 T 항원 종양단백질을 축적하지 않으며, 폴리오마바이러스 벡터 및 염색체적으로 삽입된 폴리오마바이러스 대형 T 항원 서열 간의 재조합에 의해 본 발명의 세포로부터 복제 가능 야생형 폴리오마바이러스는 유발될 수 없다.

본 발명에 사용하기 위한 세포주는 숙련된 자에 의해 통상의 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 또한, 숙련된 자는 본 발명에 사용하기 위한 세포주를 수득하기 위해 실시예에 제공된 지침을 따를 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 예를 들면, 소형 T 항원-특이적 서열을 결실시킴으로써, 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원 또는 그의 작용성 단편을 암호화하는 유전자(상기 유전자 서열은 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 발현할 수 없다)를 포함하는 폴리오마바이러스 허용 세포주, 바람직하게는 영장류 세포주 또는 훨씬 더 바람직하게는 시미안 세포주, 예를 들면, 베로(Vero) 세포주(참조, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 ECACC 88020401, 유럽 종균협회, 영국 윌셔 살리스버리)를 제공하는 것이다. 상기 세포주는 T 항원-결실 폴리오마바이러스 벡터를 증식시키고 패키징할 수 있다.

숙련된 자라면 본 발명의 세포주에서 생성되는 재조합 폴리오마바이러스 벡터, 예를 들면, SV40 벡터가 T 항원-특이 유전자 서열을 포함하지 않을 수도 있으며, 따라서 대형 T 항원이 결여된 포유동물 세포에서 복제될 수 없음을 인지할 것이다. 예시된 T 항원-결실된 SV40 레플리콘은 본 발명의 생산 세포주에서 높은 비율로 복제되는 것으로 나타났다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드 서열 상동성"은 두 폴리뉴클레오티드 사이에 상동성의 존재를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는, 두 폴리뉴클레오티드중 뉴클레오티드의 어느 한 서열이 동일한 경우 또는 한 폴리뉴클레오티드의 센스 서열과 다른 폴리뉴클레오티드의 안티센스 서열이 최대한 부합되게 정렬될 때 동일한 경우에 "상동성" 서열을 갖는다. 두개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성을 갖는 국소 영역을 확인하고 비교하기 위한 비교 창에 대해 2개 이상의 서열의 부분들을 비교함으로써 수행된다. 비교 창은 일반적으로 약 20 내지 200개 인접 뉴클레오티드의 길이이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 "서열 상동성 퍼센트", 예를 들면, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 상동성은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교창과 비교하여 측정할 수 있는데, 이때 비교창중 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교할 때 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는 (a) 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 있는 위치의 수를 측정하여 부합된 위치의 수를 수득하고; (b) 부합된 위치의 수를 비교 창 중의 위치의 총수로 나누고; (c) 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 퍼센트를 수득함으로써 산출한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 알고있는 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 또는 검사에 의해 수행할 수 있다. 용이하게 이용가능한 서열 비교 및 다중 서열 정렬 알고리즘은 각각 베이직 로칼 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)[Altschul, S.F., Journal of Molecular Biology 215:413 (1990); Altschul, S.F. et al., Nucleic Acid Research 25:3389-3402 (1997)] 및 클루스타아이더블유(ClustaIW) 프로그램으로 이들은 둘 다 인터넷에서 이용가능하다. 다른 적합한 프로그램으로는 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG), 미국 위스콘신주 매디슨) 중 갭(GAP), 베스트핏(BESTFIT) 및 파스타(FASTA)가 포함된다.

핵산 서열간 상동성은 변성시 서로에 하이브리드화되는 핵산 서열의 능력과 관련하여 결정될 수 있다(예를 들면, 50 내지 65 ℃의 온도에서 400 mM NaCl, 40 mM PIPES(pH 6.4), 1 mM EDTA의 조건하에서, 및 12 내지 16 시간동안 하이브리드화시킨 후 세척시킴)[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons (1992)].

일반적으로 말해서, 당해 분야에 숙련된 자라면 재조합 유전자 발현을 위한 폴리오마바이러스 벡터 및 디자인 프로토콜을 잘 구성할 수 있다. 프로모터 서열, 터미네이터 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 대로 다른 서열을 포함하여, 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택하거나 구축할 수 있다. 추가의 상세한 설명에 대해서는, 예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 참조하시오.

용어 "이종"은 문제의 핵산 서열, 폴리뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드의 유전자 또는 서열이 유전자 공학을 이용하여, 즉, 인간 중재에 의해 상기 폴리오마 바이러스 벡터 생산자 세포주내에 도입되었음을 나타내기 위해 전체에 걸쳐 광범위하게 사용된다. 이종 유전자는 원칙적으로 내인성 등가 유전자를 대체할 수 있거나, 또는 숙주 세포 또는 폴리오마 바이러스의 게놈의 내인성 유전자에 부가적일 수 있다, 즉, 숙주 종의 세포에서 또는 폴리오마 바이러스에서 비-천연적으로 발생된다.

"프로모터"는 그로부터 하위에(즉, 이중 가닥 DNA의 센스 가닥 상에서 3' 방향으로) 작동가능하게 연결된 DNA의 전사가 개시될 수 있는 DNA 서열을 의미한다. "작동가능하게 연결된"은 프로모터로부터 개시될 전사를 위해 적절히 위치하고 배향된 동일 핵산 분자의 일부로서 연결된 것을 의미한다. 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA는 프로모터의 "전사 개시 조절하에" 있다.

프로모터는 구성성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직-특이성 프로모터일 수 있다. 프로모터에 적용된 바와 같은 용어 "구성성", "유도성" 및 "조직-특이성"은 당해 분야에 숙련된 자에게 잘 인지되어 있다. 프로모터는 바람직하게는, 레트로바이러스 및 렌티바이러스로부터의 5'-긴 말단 반복서열, 사이토메갈로바이러스 속발성 초기 프로모터(CMVie), 인간 연장 인자 1 알파 프로모터(EF-1 알파) 등을 포함하여 바이러스로부터 유도된다. 상기 프로모터는 용이하게 이용가능하며 당해 분야에 공지되어 있다.

"폴리아데닐화 신호"는 그로부터 전사가 종결될 수 있고 폴리-A 꼬리가 전사체에 부가되는 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 신호로서 인간 또는 동물 세포에서 적용가능한 임의의 폴리아데닐화 신호를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 세포주는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 세포주, 예를 들면, MDCK, PER.C6, HEK293, CV1 등으로부터 유도될 수 있으나, 베로 또는 CHO 세포주가 바람직하다.

본 발명에 따른 적합한 세포주는 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 발현할 수 없는 폴리오마바이러스 허용 세포주이며, 바람직하게는 다음의 유전 요소를 포함한다: i) 폴리오마바이러스 대형 T 항원 암호화 영역 또는 그의 부분, 및 선택적으로, ii) 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 또는 기타 마커와 같은 선택성 마커.

상기 세포주는 소형 T 항원-특이적 DNA 서열을 갖는 폴리오마바이러스 초기 전사체의 거대 인트론이 결여될 수 있다.

바람직한 태양에서, 세포주는 세포주의 염색체 DNA내에 안정하게 통합된 전사가능한 인핸서 서열을 포함할 수 있으므로, 상기 세포주는 또한 전사가능한 인핸서의 활성을 기준으로 선택될 수 있다. 상기 마커 및 상기 선택 절차는 당해 분야에 공지되어 있다.

다양한 폴리오마바이러스 벡터 생산 세포주, 예를 들면, SV40 바이러스 벡터 생산자 세포주가 세포를 그의 종에 따라, 다양한 벡터, 예를 들면, 플라스미드로 감염시킴으로써 생성될 수 있다. 세포주의 형질감염 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 베로 세포주는 백신용 바이러스 입자의 생성에 널리 사용된다. 상기 세포주는 바이러스 질환의 예방에 많은 용도를 찾아내었다.

적합한 세포주는 하기 성분: i) 소형 T 항원-특이 서열을 갖는 폴리오마바이러스 초기 전사체의 거대 인트론이 결여된 폴리오마바이러스 대형 T 항원 암호화 영역 또는 그의 부분, 및 선택적으로, ii) 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 또는 다른 마커와 같은 선택성 마커를 포함하는 1차 플라스미드로 형질감염시킴으로써 수득될 수 있다.

따라서, 단일 벡터 또는 플라스미드는 폴리오마바이러스 대형 T 항원 암호화 영역 및 선택성 마커 서열을 둘 다 가질 수 있다. 2개의 별개의 DNA 함유 벡터 또는 플라스미드를 사용하는 것도 또한 가능한데, 이때 하나는 디자인에 따라, 폴리오마바이러스 대형 T 항원 암호화 영역을 가지며 두번째는 선택성 마커를 갖는다. 생산자 세포주에 폴리오마바이러스 벡터 생성 능력을 제공하기 위해 필요할 수 있는 임의의 또 다른 유전 요소들이 또한 하나 이상의 DNA 벡터 또는 플라스미드 상에 배치될 수 있으며, 상기 벡터 또는 플라스미드는 이어서 선택된 생산 세포주를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 베로 생산 세포주는 그 안에 미리 폴리오마바이러스 T 항원 서열을 함유하지 않으므로, 대형 T 항원 암호화 영역을 그 중에 부가시킬 수 있으며, 그 중에 대형 T 항원 암호화 영역을 갖는 생성된 발생초기 생산자 세포가 선택성 마커 시스템을 이용하여 선택될 수 있다.

본 발명은 이제 처음으로, 폴리오마바이러스 벡터 DNA와 숙주 세포 DNA 사이의 재조합으로부터 야기되는 야생형 폴리오마바이러스의 오염 위험없이 치료 목적에 충분한 양으로 재조합 폴리오마바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 제조를 가능케 한다. 상기 현상은 문헌 [Gluzman Y., Cell 23: 175-182 (1981); Oppenheim A. and Peleg A., Gene 77: 79-86 (1989); Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791 (2004)]에 잘 설명되어 있다.

그러나, 상기 재조합이 일어나는 빈도는 별로 보고되어 있지 않다. 평가는 매우 다양하다. 샤울(Shaul) 등은 재조합이 10^-6 이상의 빈도로 일어날 수 있다고 평가한 반면[Shaul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3781-3784 (1985)], 보다 최근의 평가는 대략 10^-3으로 훨씬 더 높은 재조합률을 나타내고 있다[Arad et al., Virology 304:155-159 (2002)].

재조합 빈도를 평가하는데 있어 복잡한 요인은 야생형 폴리오마바이러스가 작용성 T 항원을 암호화하는 유전자가 결여된 재조합 폴리오마바이러스 벡터보다 더 빨리 복제된다는 것이다.

그러므로, 임의의 야생형 복귀돌연변이체의 출현없이, 선행 기술에 따라 통상적인 세포 배양물에서 생성될 수 있는 최대 수의 재조합 SV40 벡터 입자를 구축하였다.

그러므로, COS-1 세포를 표준 프로토콜[Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)]에 따라 재조합 SV40 벡터 입자로 감염시키고, 매우 민감한 정량적 PCR 분석에 의해 검출할 때 야생형 바이러스의 단일 검출가능한 게놈의 발생없이 생성될 수 있는 최대 수의 바이러스 벡터 입자를 계산하였다.

1 x 10⁴ 이하의 바이러스 벡터 입자가 수행된 대부분의 실험에서 검출가능한 양의 야생형 복귀돌연변이체의 발생없이 안전하게 생성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 1 x 10⁵ 바이러스 벡터 입자를 포함하는 제제의 상당수가 야생형 복귀돌연변이체에 양성인 반면, 1 x 10⁶ 바이러스 벡터 입자를 포함하는 제제는 모두 야생형 바이러스로 오염되었으며 따라서 의학적 용도에 안전하지 않다.

선행 기술에 따른 폴리오마바이러스 벡터 제제가 의학적 용도에 안전하지 않다는 사실은, 1 x 10⁶ 이상의 재조합 SV40 벡터 입자를 포함하는 제제중 야생형 SV40 입자가 문헌 [Katzman R.B. et al., Journal of Virological Methods 150:7-13 (2008)]에 기술된 바와 같은 선행 기술의 방법에 따라 시험할 때 시험관내에서 SV40-허용 세포를 감염시킬 수 있다는 사실에 의해 뒷받침된다.

본 발명은 이제 처음으로 조성물에 존재하는 어떤 야생형 폴리오마바이러스 입자도 없이 1 x 10⁶ 이상의 폴리오마바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 제조를 가능케 한다. 그러므로, 본 발명은 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 발현할 수 없고 야생형 폴리오마바이러스에 허용되는 세포에서 복제될 수 없는 1 x 10⁶ 이상의 폴리오마바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 제제는 유리하게는 1 x 10⁷ 이상의 벡터 입자, 예를 들면, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹⁰ 또는 1 x 10¹¹ 이상의 벡터 입자를 함유한다.

"야생형 폴리오마비이러스에 허용되는 세포에서 복제될 수 없는"이란 표현은 조성물이 1 x 10⁶ 이상의 폴리오마바이러스 벡터 입자들 중에 단일 야생형 복귀돌연변이체 폴리오마바이러스 입자를 함유하지 않음을 의미한다. 이것은 문헌 [Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)]에 기술된 바와 같은 정량적 PCR 분석에 의해, 또는 조성물에 존재하는 야생형 폴리오마바이러스에 허용되는 세포주를 감염시킴으로써 측정될 수 있다. 후자의 경우, 플라크 분석[Katzman R.B. et al., Journal of Virological Methods 150:7-13 (2008)]에서 단일 플라크의 부재는 단일 야생형 폴리오마바이러스 입자의 부재를 나타낸다.

바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 제제는 영장류 폴리오마바이러스, 예를 들면, 시미안 폴리오마바이러스, 보다 특히, SV40, 시미안 바이러스 12(SV12), 림프영양성(Lymphotropic) 폴리오마바이러스, 아프리카 녹색 원숭이 폴리오마바이러스 또는 침팬지 폴리오마바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 영장류 폴리오마바이러스에 허용되는 세포주는 바람직하게는 베로 세포, CV1 세포, PerC.6 세포, HEK293 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 제제는 설치류 폴리오마바이러스, 예를 들면, 마우스 또는 햄스터 폴리오마바이러스, 보다 특히 뮤린 폴리오마바이러스 또는 햄스터 폴리오마바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 마우스 또는 햄스터 폴리오마바이러스에 허용되는 세포주는 바람직하게는 CHO 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명은 또한 의학적 용도에 안전한 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 생성하기 위한 벡터 생산 세포주의 제조를 개시하고 있다.

따라서, 본 발명은 작용성 대형 T 항원을 발현할 수 있고 소형 T 항원은 발현할 수 없는, 폴리오마바이러스에 허용되는 세포주에 관한 것이다. 상기 세포주는, 세포가 세포의 염색체 DNA와 재조합 폴리오마바이러스 DNA 사이에 임의의 상동성 서열이 결여되어 있기 때문에, 야생형 복귀돌연변이체 폴리오마바이러스 입자를 수득할 위험없이 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자의 안전한 생성을 충분히 뒷받침한다. 대형 T 항원을 암호화하는 유전자는 바람직하게는 세포의 게놈에 안정하게 통합된다.

이와 관련하여 "재조합 폴리오마바이러스 벡터"란 용어는 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 발현할 수 없고, 바람직하게는 작용성 대형 및 소형 T 항원을 발현할 수 없는 폴리오마바이러스로 해석되어야 한다. 상기 재조합 바이러스 벡터는, 예를 들면, 대형 T 항원 또는 대형 T 및 소형 T 항원 둘 다에 대한 암호화 서열이 결여될 수 있다.

이와 관련하여, "폴리오마바이러스에 허용되는"이란 표현은 세포주가 폴리오마바이러스로 감염시에, 또는 형질감염 또는 세포내로 DNA를 전달하는 다른 수단에 의한 폴리오마바이러스 DNA의 도입시에 폴리오마바이러스 입자의 복제를 조장하는 것을 의미한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 작용성 소형 T 항원을 발현할 수 없는 재조합 폴리오마바이러스 입자를 생성하는 방법을 제공한다:

(a) 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 발현할 수 있고 작용성 소형 T 항원은 발현할 수 없는, 야생형 폴리오마바이러스에 허용되는 세포주를 제공하는 단계;

(b) 상기 세포주에 작용성 소형 T 항원을 암호화할 수 없는 폴리오마바이러스 DNA를 도입하는 단계;

(c) 상기 세포를 폴리오마바이러스 입자의 생성을 가능케하는 조건하에 성장 배지중에서 배양하는 단계; 및

(d) 재조합 폴리오마바이러스 입자를 세포 배양물로부터 수확하는 단계.

바람직한 태양에서, 폴리오마바이러스 DNA는 DNA의 형질감염에 의해 상기 세포내에 도입된다.

본 발명의 또 다른 태양으로, 질환을 앓고 있는 개인의 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다. 상기 약학 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된, 치료 효과량의 하나 이상의 폴리오마바이러스 벡터, 예를 들면, SV40 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 그를 필요로 하는 개인에게 임의의 적합한 투여형으로 제형화될 수 있다. 상기 제형은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 림프관내, 피하, 안구내 또는 심지어 경피 투여와 같은 투여를 위한 임의의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 완충제, 그의 삼투압을 조정하기 위한 약제, 선택적으로 당해 분야에 공지된 바와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 첨가제를 포함한다. 추가의 활성 성분도 또한 본 발명의 조성물내에 혼입될 수 있다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 그의 적절한 혼합물, 및 식물성유를 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적절한 유동성은 코팅, 예를 들면, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

본 발명은 이제 하기 실시예와 관련하여 더 기술된다.

실시예

실시예 1: SV40 유래 유전자 전달 벡터의 제작

6개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다:

WdV101: CCGCTCGAGTTGCGGCCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC(서열번호 1)(XhoI 및 NotI 제한효소 부위 함유) 및

WdV102: GGTACCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCC(서열번호 2)(KpnI 제한효소 부위 함유) 및

WdV103: GGCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT(서열번호 3)(5'에서 3'로 연속적으로 NotI 점착성 제한효소 부위, PadI, SbfI, PmeI 및 AsdI 비손상 제한효소 부위 및 GlaI 점착성 제한효소 부위 함유) 및

WdV104: CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC(서열번호 4)(3'에서 5'로 연속적으로 NotI 점착성 제한효소 부위, PadI, SbfI, PmeI 및 AsdI 비손상 제한효소 부위 및 GlaI 점착성 제한효소 부위 함유) 및

WdV105: CGGGATCCAGACATGATAAGATACATTG(서열번호 5)(BamHI 제한효소 부위 함유) 및

WdV106: ATAGTTTAGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG(서열번호 6)(NotI 제한효소 부위 함유).

SV40 벡터 pSL-PL[De La Luna, S. et al., Journal of General Virology 74:535-539 (1993)]의 정제된 플라스미드 DNA를 올리고뉴클레오티드 WdV105 및 WdV106을 사용하여 PCR에 적용하였다. 생성된 증폭된 DNA 단편은 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위에 인접한 SV40-폴리아데닐화 신호 및 3' 말단에 NotI 제한효소 부위를 포함하였다. 상기 SV40 폴리아데닐화 신호 단편을 BamHI 및 NotI으로 절단하고, 생성된 150 bp 길이의 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고 유사하게 절단된 pBluescript SK-플라스미드(프로메가(Promega)) 내에 클로닝하여 pAM002를 수득하였다.

정제된 pEF5/FRT/5-DEST(인비트로겐(Invitrogen)) 플라스미드 DNA는 올리고뉴클레오티드 WdV101 및 WdV102를 사용하여 PCR에 적용하였다. 생성된 증폭된 DNA 단편은 5' 말단에 연속적으로 XhoI 및 NotI 제한효소 부위가 인접한 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 및 3' 말단에 KpnI 제한효소 부위를 포함하였다. 상기 BGH 폴리아데닐화 신호 단편을 KpnI 및 NotI으로 절단하고, 생성된 250 bp 길이의 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고 유사하게 절단된 pAM002 플라스미드 내에 접합시켰다. 상기 접합 혼합물에 의한 형질전환은 메틸화 둔감성 이. 콜라이 균주에서 수행하였다. 이것은 플라스미드 pAM003을 생성하였다.

2개의 상보성 올리고뉴클레오티드 WdV103 및 WdV104를 비점에서 실온으로 자체적으로 냉각되는 수조에서 배양하여 어닐링시켜 연속적으로 NotI 점착성 제한효소 부위, PadI, SbfI, PmeI 및 Asci 미손상 제한효소 부위 및 ClaI 점착성 제한효소 부위를 함유하는 DNA 링커를 수득하였다. 상기 링커를, NotI 및 ClaIdmfh 절단하고 아가로스 겔로부터 분리한 pAM002 플라스미드 내에 접합하였다. 접합 혼합물을 계속 사용하여 메틸화 둔감성 이. 콜라이 균주를 형질전환시켜 pAM004를 수득하였다.

SV40 벡터 pSL-PL의 정제된 플라스미드 DNA를 ClaI 및 BamHI으로 절단하였다. SV40 기점 및 SV40 후기 영역을 함유하는 생성된 2.6 kb의 DNA 단편을 아가로스로부터 정제하고 유사하게 절단된 pAM004내에 클로닝하였다. 이에 의해 새로운 SV40 벡터 플라스미드 pAM005가 생성되었다.

실시예 2: SV40 루시퍼라제 발현 벡터의 분자 클로닝 및 재조합 SV40 루시퍼 라제 벡터 입자의 생성

발현 플라스미드 pGL3(프로메가)을 PCR을 사용하여 개똥벌레 루시퍼라제의 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. 각각 제한효소 부위 AscI 및 PacI을 함유하는 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV389: 5'-TTGGCGCGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC-3'(서열번호 7) 및 WdV407: 5'-CCCTTAATTAATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC-3'(서열번호 8). PCR 증폭된 루시퍼라제 단편을 계속하여 AscI 및 PacI으로 절단하고 pAM005 내에 접합하여 pAM006을 수득하였다.

각각 BamHI 및 NotI 제한효소 부위를 함유하는 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV437; 5'-GGGATCCAGACATGATAAGATACATTG-3'(서열번호 9) 및 WdV442: ATAGTTTAGCGGCCGCAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTG(서열번호 10). pSL-PL 벡터를 PCR을 사용하여 대형 T 항원 비번역(trailer) 서열의 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. 생성된 PCR 단편을 BamHI 및 NotI로 절단하고 BamHI 및 NotI(부분 절단된) pAM006 내에 클로닝하여 pAM020을 수득하였다.

개똥벌레 루시퍼라제를 암호화하는 재조합 SV40 벡터 입자(SV-Luc)를 문헌 [Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)]에 따라 제조하였다. COS-1 세포를 Not1-절단되고 재환상화된 pAM020 DNA로 형질감염시키고 형질감염 3일후에 조 용해물을 반복된 냉동-해동에 의해 세포 배양물로부터 제조하였다. SV-Luc 벡터 입자를 T715 플라스크중에서 COS-세포 성장에서 1 주기동안 증폭시켰다. SV-Luc 벡터 입자를 최종적으로 농축하고 슈크로스 구배 초원심분리에 의해 조 용해물로부터 정제하여 세포 배양물 ml 당 5 x 10¹¹ SV-Luc 게놈 복사체를 갖는 벡터 저장액을 수득하였다.

실시예 3: SV40 대형 T 항원을 암호화하는 발현 플라스미드의 제작

NotI, PacI, SbfI, PmeI, AscI 및 ClaI에 대한 제한효소 부위를 함유하는 합성 다중 클로닝 부위(MCS)를 설계하였다. 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV436: 5'-GCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT-3'(서열번호 11) 및 WdV437: 3'-CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC-5'(서열번호 12). 두 올리고뉴클레오티드 WdV436 및 WdV437 둘 다 서로에 어닐링시키고 pBluescript SK-(프로메가) 내에 접합시켜 재조합 플라스미드 pAM007을 수득하였다.

추가의 NotI 제한효소 부위를 도입하기 위해 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV452: CGGCGGCCGCGTAC(서열번호 13) 및 WdV453: GCGGCCGC. 두 올리고뉴클레오티드 모두 어닐링시키고 pAM007 내에 접합시켜 재조합 벡터 pAM008을 수득하였다.

발현 벡터 pLenti6.3/V5DEST_verA(인비트로겐)을 PCR을 사용하여 사이토메갈로바이러스 속발성 초기(CMVie) 프로모터의 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. CMV 프로모터에 인접한 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV286: 5'-TTGGCGCGCCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGG-3'(서열번호 14) 및 WdV220: 3'-GACAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGCGGAGGCTGGATCG-5'(서열번호 15). 올리고뉴클레오티드 WdV286 및 WdV220은 각각 제한효소 부위 AscI 및 HindIII를 함유하였다. 이어서, 정제된 pLenti6.3/V5DEST_verA를 올리고뉴클레오티드 WdV286 및 WdV220을 사용한 PCR에 적용하여 CMV 프로모터 DNA 단편을 수득하였다. 상기 단편을 AscI 및 HindIII로 절단하고 pBluescript SK- 내에 접합시켜 pAM009를 수득하였다.

발현 벡터 pGL4.22(프로메가)를 PCR을 사용하여 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제 항생물질 내성 유전자의 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제 항생물질 내성 유전자에 인접하고 제한효소 부위 HindIII 및 XhoI을 각각 함유하는 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV454: 5'-CCACCCAAGCTTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCG-3'(서열번호 16) 및 WdV455: 3'-TATCCGCTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGC-5'(서열번호 17). 플라스미드 pGL4.22를 올리고뉴클레오티드 WdV454 및 WdV455를 사용한 PCR에 적용하여 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제 cDNA를 수득하였다. 상기 단편을 HindIII 및 XhoI으로 절단하고 pAM009 내에 접합시켜 pAM010을 수득하였다.

발현 벡터 pEF5/FRT/5-DEST(인비트로겐)를 PCR을 사용한 BGH 폴리아데닐화 신호의 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. 폴리아데닐화 신호에 인접하고 제한효소 부위 XhoI 및 KpnI를 각각 함유하는 다음 2개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV456: 5'-CAACCGCTCGAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3'(서열번호 18) 및 WdV457: 3'-CGGGGTACCCCATAGAGCCCACCGCATCCCC-5'(서열번호 19). 플라스미드 pEF/FRT/5-DEST를 올리고뉴클레오티드 WdV456 및 WdV457을 사용한 PCR에 적용하여 BGH 폴리아데닐화 신호 cDNA를 수득하였다. 상기 단편을 XhoI 및 KpnI로 절단하고 pAM010 내에 접합시켜 pAM011을 수득하였다.

플라스미드 pAM008을 AscI 및 PmeIdmfh 절단하고, 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제 암호화 영역을 포함하는 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 정제하고 pAM008 내에 접합시켜 pAM012를 수득하였다. 전장 SV40 DNA 클론의 DNA(ATCC 번호 VRMC-2)를 PCR을 사용한 SV40 T 항원 암호화 영역의 클로닝을 위한 주형으로 사용하였다. attB1 재조합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 WdV408: ACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC(서열번호 20), 및 attB2 재조합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 WdV409: TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGG(서열번호 21)을 설계하였다. WdV408 및 WdV409를사용하여 게놈성 T 항원 암호화 영역을 PCR 증폭시켰다. 이어서, 생성된 DNA 단편 및 pDONR221로부터 게이트웨이 엔트리 클론을 생성하였다. pAM013 및 pEF5/FRT/V5-DEST 사이의 게이트웨이 재조합에 의해 T 항원 발현 플라스미드를 생성하여 pAM014를 수득하였다.

pAM014의 NotI 및 PmeI 절단 후 T4 DNA 폴리머라제 처리 및 재-접합에 의해 플라스미드 pAM014 중 NotI 및 PmeI 제한효소 부위를 제거하여 pAM015를 수득하였다. 이어서, T 항원 발현 카세트를 SphI 절단 후 T4 DNA 폴리머라제 처리 및 NruI 절단에 의해 분리하였다.

셔틀 플라스미드를 생성하기 위해, 다음의 2개 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV448: TCCTGCAGGCGGGGTACCCTAGTCTAGACTAGCCGCGGGGAGTTTAAACAGCT(서열번호 22) 및 WdV449: GTTTAAACTCCCCGCGGCTAGTCTAGACTAGGGTACCCCGCCTGCAGGAGTAC(서열번호 23). 올리고뉴클레오티드 WdV448 및 WdV449를 어닐링하여, KpnI, SbfI, KpnI, XbaI, SacII, PmeI 및 SacI 제한효소 부위를 함유하는 DNA 단편을 생성하였다. 상기 DNA 단편을 KpnI 및 SacI 절단된 pBluescript SK-(프로메가) 내에 접합시켜 pAM016을 수득하였다. 플라스미드 pBluescript SK-를 KpnI 및 XbaI으로 절단하고 MCS DNA 단편을 아가로스 겔로부터 분리하였다. MCS DNA 단편을 KpnI 및 XbaI으로 절단된 pAM016 내에 접합시켜 pAM017을 생성하였다.

pAM015로부터 EF1 알파 유도된 T 항원 발현 카세트를 NruI 및 SphI 절단 후 T4 DNA 폴리머라제 처리에 의해 분리하였다. 생성된 DNA 단편을 EcoRVfh 절단된 pAM017 내에 클로닝하여 pAM018을 수득하였다.

플라스미드 pAM018을 SbfI 및 PmeI으로 절단하고, T 항원 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고 SbfI 및 PmeI으로 절단된 pAM012 내에 클로닝하여 pAM019를 수득하였다.

다음 4개의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다: WdV487: 5'-GCAGGCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3'(서열번호 24), 및 WdV490: 3'-CCATTCATCAGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGCCTCCAAAG-5'(서열번호 25), 및 WdV489: 5'-CTTTGGAGGCTTCTGGGATGCAACTGAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGG-3'(서열번호 26), 및 WdV488: 5'-AGGAATGTTGTACACCATGCATTTTAAAAAGTC-3'(서열번호 27).

올리고뉴클레오티드 WdV487 및 WdV490, 및 올리고뉴클레오티드 WdV489 및 WdV488을 사용하여 SV40 대형 T 항원의 첫번째 및 두번째 엑손을 각각 증폭시켰다. 이어서 생성된 DNA 단편을 둘 다 올리고뉴클레오티드 WdV487 및 WdV488을 사용한 융합 PCR에 적용하였다.

SV40 대형 T 항원 암호화 영역을 포함하는 생성된 DNA 단편을 NcoI 및 NsiI으로 절단하고 유사하게 절단된 pAM019 내에 클로닝하여 pAM001을 수득하였다.

요약하면, pAM001은 대형 T 항원 암호화 영역의 상위에 EF1 알파 프로모터를 함유하고 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제 암호화 영역의 상위에 CMVie 프로모터를 함유한다.

실시예 4: 베로 생산자 세포주의 생성 및 재조합 SV40 벡터 입자의 생산

베로 세포(시그마-앨드리치(Sigma-Aldrich) 주문 번호: 88020401)를 증식시키고 혈청 비함유 배양 DMEM 배지(인비트로겐, 제품 코드: 41966-052)에 적응시켰다. 혈청 비함유 조건에 적응시키는 것은 태아 소 혈청을 각각의 계대시에 배지중에 8, 6, 4, 2 및 0%로 점차 감소시킴으로써 수행하였다. 그때부터 베로-혈청 비함유(Vero-SF) 세포를 37 ℃ 및 5% CO₂에서 2% L-글루타민을 함유하는 옵티프로(OptiPro) SFM 배지(인비트로겐) 중에서 배양하였다.

공급자의 지시에 따라 형질감염 약제 엑스겐(Exgen) 500(퍼멘타스(Fermentas), 제품 코드: R0511)을 사용하여 pAM001 DNA로 베로-SF 세포를 형질감염시켰다. 이어서 형질감염된 베로-SF 세포를, 2 ㎍/ml 퓨로마이신을 세포 배양 배지에 첨가함으로써 SV40 대형 T 발현 유전자 카세트를 염색체 DNA 내에 통합시키기 위해 선택하였다. 생존하는 콜로니를 분리하고, 2 ㎍/ml의 퓨로마이신 및 2% L-글루타민을 함유하는 옵티프로 SFM 배지에서 증식시켰다. 퓨로마이신-내성 세포를 2% L-글루타민 및 10% DMSO를 함유하는 옵티프로 SFM 배지로 옮기고 -156 ℃에서 저장하였다.

실시예 5: SV40 고생성 슈퍼베로 ( SuperVero ) 서브클론의 선별

pAM001 및 베로-SF 대조군 세포로 형질감염된 퓨로마이신-내성 베로 클론을, 이들이 50%의 포화상태(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. 세포 배양물을 약 2.5 x 10¹⁰ 벡터 게놈 복사체를 함유하는 50 ㎕의 SV-Luc 벡터 저장액으로 형질도입시켰다.

형질도입 4시간 후에 배양 배지를 2 ㎍/ml의 퓨로마이신 및 2% L-글루타민을 함유하는 새로운 옵티프로 SFM 배지로 교체하였다. 형질도입 3일후에, 형질도입된 세포로부터 냉동-해동에 의해 조 용해물을 제조하였다[Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)]. 10% 태아 소 혈청(인비트로겐)으로 보충된 DMEM에서 배양된 COS-1 세포를 각각의 퓨로마이신-내성 및 pAM001-형질감염된 베로 SF 세포 클론의 조 용해물 100 ㎕로 형질도입하였다. 형질도입 2일후에, COS-1 세포를 계속해서 상응하는 퓨로마이신-내성 및 pAM001-형질감염된 베로 SF 세포 클론 중 SV-Luc 벡터 생성량의 척도로서 개똥벌레 루시퍼라제 발현에 대해 검사하였다. COS-1 세포에 필적할만한 루시퍼라제 발현 수준을 나타낸 세포 클론을 선택하고 증식시키고 확장시켜 세포 은행을 제조하였다. 세포 클론 베로-SF001-86은 SV-Luc 생성에 대해 반복적으로 모니터되었으며 COS-1과 유사한 양의 재조합 SV40 벡터 입자를 생성하였다. 베로-SF001-86-01로 나타낸 베로-SF001-86 의 세포 서브클론은 모 베로-SF001-86 세포 클론과 유사한 양의 재조합 SV40 벡터 입자를 반복적으로 생성하는 제한 희석에 의해 생성하였다. 문헌 [Vera M. et al., Molecular Therapy 10:780-791 (2004)]에 따른 정량적 PCR 결과 슈퍼베로로 나타낸 세포 클론 베로-SF001-86-01이 통상적으로 세포 배양물 ml 당 1 내지 10 x 10¹¹ 벡터 게놈 복사체를 생성하는 것으로 나타났다.

실시예 6: 슈퍼베로 세포에서 재조합 단백질의 생성에 사용되는 벡터의 분자 클로닝

SV40 복제 기점을 pTracer-SV40(인비트로겐)으로부터 PCR 분리하고 개똥벌레 루시퍼라제 발현 플라스미드 pGL3(프로메가) 내에 클로닝하여 발현 벡터 pAM006을 수득하였다. 이어서, 슈퍼베로 세포를 정제된 pAM006 및 대조군 pGL3 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 3일후에 루시퍼라제 발현을 측정하였다. pAM6으로 형질감염된 슈퍼베로 세포는 대조군 pGL3 형질감염 세포에 비해 훨씬 더 많은 개똥벌레 루시퍼라제를 생성하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Amarna Holding B.V. <120> METHOD FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYOMAVIRAL VECTOR PARTICLES <130> 085 WO <140> PCT/EP2010/055330 <141> 2010-04-22 <150> EP 09158498.7 <151> 2009-04-22 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and primers <400> 1 ccgctcgagt tgcggccgct gtgccttcta gttgccagcc atc 43 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 2 ggtaccatag agcccaccgc atccccagca tgcc 34 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 3 ggccgcttta ttaattaagc cctgcaggtt gtttaaactt ggcgcgcctt at 52 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 4 cgataaggcg cgccaagttt aaacaacctg cagggcttaa ttaataaagc 50 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 5 cgggatccag acatgataag atacattg 28 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 6 atagtttagc ggccgcaact tgtttattgc agcttataat gg 42 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 7 ttggcgcgcc atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc 40 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 8 cccttaatta attacacggc gatctttccg cccttc 36 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 9 gggatccaga catgataaga tacattg 27 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 10 atagtttagc ggccgcaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttg 44 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 11 gccgctttat taattaagcc ctgcaggttg tttaaacttg gcgcgcctta t 51 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 12 cgaaataatt aattcgggac gtccaacaaa tttgaaccgc gcggaatagc 50 <210> 13 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 13 cggcggccgc gtac 14 <210> 14 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 14 ttggcgcgcc tcaatattgg ccattagcca tattattcat tgg 43 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 15 gctaggtcgg aggcgccggc ccttgccacg taaccttcga acag 44 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 16 ccacccaagc ttatgaccga gtacaagccc acggtgcg 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 17 cgtactgggc gttcgggcca cggactgagc tcgcctat 38 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 18 caaccgctcg agctgtgcct tctagttgcc agccatc 37 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 19 cccctacgcc acccgagata ccccatgggg c 31 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 20 accatggata aagttttaaa cagagaggaa tctttgcagc 40 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 21 ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg agg 33 <210> 22 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 22 tcctgcaggc ggggtaccct agtctagact agccgcgggg agtttaaaca gct 53 <210> 23 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 23 gtttaaactc cccgcggcta gtctagacta gggtaccccg cctgcaggag tac 53 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 24 gcaggctacc atggataaag ttttaaacag agag 34 <210> 25 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 25 gaaacctccg aagaccctac gttgactcta aggttggata ccttgactac ttacc 55 <210> 26 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 26 ctttggaggc ttctgggatg caactgagat tccaacctat ggaactgatg aatggg 56 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probes and Primers <400> 27 aggaatgttg tacaccatgc attttaaaaa gtc 33

Claims

(a) 비-인간 영장류 SV40 허용 세포 또는 세포주를 제공하는 단계로서,
상기 SV40 허용 세포 또는 세포주는 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 암호화하는 유전자를 포함하고, 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하는 유전자는 포함하지 않는, 단계;
(b) 상기 SV40 허용 세포 또는 세포주 내에 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하지 않는 폴리오마바이러스 DNA를 도입하는 단계;
(c) 상기 세포 또는 세포주를 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자의 제조를 가능하게 하는 조건하에 성장 배지중에서 배양하는 단계; 및
(d) 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 세포 배양물로부터 수확하는 단계
를 포함하는, 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하지 않는 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자의 제조 방법.
제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 수득되는, 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하지 않는 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 포함하는, 유전자 질환, 이식 거부반응, 자가면역 질환, 감염성 질환, 알레르기 또는 암을 치료하기 위한 조성물.
제 2 항에 있어서,
작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하지 않는, 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 백만개 이상 포함하는 조성물로서, 상기 폴리오마바이러스 벡터 입자는, 야생형 폴리오마바이러스에 허용되며 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 세포에서 복제되지 않고,
상기 조성물은, 야생형 폴리오마바이러스에 허용되며 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 세포에서 복제되는 단일 폴리오마바이러스 입자를 함유하지 않는, 조성물.
제 3 항에 있어서,
폴리오마바이러스가 영장류 폴리오마바이러스인, 조성물.
제 4 항에 있어서,
폴리오마바이러스가 유인원의(simian) 폴리오마바이러스인, 조성물.
제 5 항에 있어서,
폴리오마바이러스가 SV40, SV12, 림프영양성 폴리오마바이러스, 아프리카 녹색 원숭이 폴리오마바이러스 및 침팬지 폴리오마바이러스로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
제 6 항에 있어서,
폴리오마바이러스가 SV40인, 조성물.
제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
야생형 폴리오마바이러스에 허용되며 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 암호화하는 유전자를 포함하지 않는 세포가 베로 세포 및 CV1로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
비-인간 영장류 SV40 허용 세포 또는 세포주를 포함하는 조성물로서,
상기 세포 또는 세포주는, 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 포함하고, 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 암호화하는 유전자를 포함하고, 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하는 유전자는 포함하지 않는, 조성물.
세포주를 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
상기 세포주가, 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 재조합 폴리오마바이러스 벡터 입자를 포함하고, 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 작용성 폴리오마바이러스 대형 T 항원을 암호화하는 유전자를 포함하고, 작용성 폴리오마바이러스 소형 T 항원을 암호화하는 유전자는 포함하지 않는, 재조합 단백질을 생산하는 방법.
제 9 항에 있어서,
SV40 허용 세포 또는 세포주가 베로 세포 및 CV1로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
치료 효과량의 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 질환, 이식 거부반응, 자가면역 질환, 감염성 질환, 알레르기 또는 암을 치료하는 방법.