EA022206B1 - Способ получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к улучшенным способам получения вирусных частиц, вирусных векторов, частиц вирусных векторов и рекомбинантных белков. В частности, изобретение относится к улучшенным способам получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора и клеточных линий-продуцентов полиомавирусных векторов. Конкретнее, изобретение относится к способам получения частиц вектора на основе обезьяньего полиомарвируса, таких как частицы вектора на основе обезьяньего вируса 40 (SV40). Изобретение также относится к композициям, содержащим вирусные векторы, к их применениям и к частицам вирусного вектора для лечения генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований. Изобретение также относится к способам получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих и к способам повышения производства рекомбинантных белков в клетках млекопитающих.

Description

Настоящее изобретение относится к улучшенным способам получения вирусных частиц, вирусных векторов, частиц вирусных векторов и рекомбинантных белков. В частности, изобретение относится к улучшенным способам получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора и клеточных линий-продуцентов полиомавирусных векторов. Конкретнее, изобретение относится к способам для получения обезьяньих полиомавирусных векторов, таких как вирусные векторы обезьяньего вируса 40 (англ. 81Ш1аи У1ти8 40, §У40). Изобретение относится к композициям, содержащим вирусные векторы, к их применениям и к частицам вирусного вектора для лечения генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований. Изобретение также относится к способам получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих и к способам повышения производства рекомбинантных белков в клетках млекопитающих.

Предшествующий уровень техники

За последние 10 лет много усилий было потрачено на разработку эффективных технологий доставки генов и нуклеиновых кислот для внедрения и надлежащей экспрессии генов и нуклеиновых кислот в клетках-мишенях. Терапевтические гены или нуклеиновые кислоты могут быть использованы при восстановлении неправильно работающих генов для лечения генетических заболеваний, для индукции иммунного ответа при лечении онкологических и инфекционных заболеваний или для подавления иммунного ответа, например для индукции/восстановления иммунной толерантности при предотвращении отторжения трансплантата или для лечения аутоиммунных заболеваний и аллергий. Терапевтические гены или нуклеиновые кислоты могут быть введены в виде оголенных молекул или в виде нуклеиновых кислот, упакованных в липидные и/или белковые соединения. В связи с эволюцией вирусов в направлении доставки и экспрессии своей генетической информации в хозяев, в клетки-мишени вирусные векторы исследовали в качестве носителей для доставки генов, и они оказались наиболее эффективными средствами доставки генетической информации в живую клетку. Множество вирусных векторных систем доставки генов были разработаны и протестированы в преклинических и клинических исследованиях. Эти исследования показали, что используемые в настоящее в настоящее время векторы, которые получены из аденовирусов, поксвирусов, герпесвирусов, альфавирусов, ретровирусов, парвовирусов, полиомавирусов, как правило, безопасны для применения и эффективны при доставке терапевтических генов к клеткам-мишеням.

Основной недостаток применяемых в нестоящее время вирусных векторов для доставки генов заключается в том, что они не могут быть получены в достаточных количествах для лечения значительного количества пациентов. Большинство вирусных векторов получают трансфекцией клеток-продуцентов плазмидной ДНК, кодирующей вектор и компоненты вектора. Как правило, это дает от 1 до 10 млн векторных частиц на 1 мл объема клеточной культуры. В клинических исследованиях, как правило, пациенту вводят от 1х10¹⁰ до 1х10¹² векторных частиц в целях достижения полезных клинических эффектов. Это означает, что для лечения 1000 пациентов требуется более 1 млн л клеточной культуры для получения достаточных количеств векторных частиц. Кроме того, преклинические и клинические исследования показали, что большинство протестированных вирусных векторов для доставки генов, таких как аденовирусные, поксвирусные, герпесвирусные, альфавирусные и ретровирусные векторы, индуцируют в пациентах сильный иммунный ответ, направленный на компоненты вирусного вектора и продукты терапевтического гена. Вследствие этого данные векторы могут быть введены пациенту только однократно, несмотря на то, что уровни экспрессии введенного терапевтического гена быстро снижаются. Вирусные векторы, полученные из аденоассоциированного вируса (ААУ), не индуцируют иммунные ответы в животных и являются иммунологически инертными. Однако большая часть человеческой популяции встречала АЛУ дикого типа вместе с его вирусом-помощником, например аденовирусом, и в результате в ней развилась сильная память ЦТЛ против капсидных белков АЛУ. Как следствие, трансдуцированные АЛУ клетки быстро удаляются и уровни экспрессии терапевтического гена или нуклеиновой кислоты, введенной вирусным вектором ААУ, быстро снижаются.

Выход рекомбинантных белков, полученных в клетках млекопитающих, по сравнению с выходом, полученным в прокариотических клетках, в целом является низким, несмотря на применение сильных промоторов и/или многокопийных трансгенных вставок или других путей усиления транскрипции. Вирусные репликативно-компетентные векторы или репликоны применяли в течение длительного периода времени в качестве систем экспрессии для получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Целевой ген в таких векторах может экспрессироваться под транскрипционным контролем вирусных промоторов, в результате чего требуемые мРНК могут накапливаться до очень высоких уровней в цитоплазме сразу после трансфекции, что дает большие количества целевого белка. До настоящего времени успехи с системами экспрессии на основе репликонов были ограничены. Репликоновые системы, основанные на РНК-вирусах, в целом производят рекомбинантные белки только в течение короткого периода времени, тогда как те, что получены из ДНК-вирусов, в целом плохо реплицируются в коммерческих клеточных линиях.

- 1 022206

Насколько известно, существует только один вирусный вектор доставки генов, который иммунологически инертен в людях и который может быть получен в значительных количествах для лечения значительного числа пациентов. Более того, этот вирусный вектор доставки генов может быть использован в качестве репликоновой системы для получения рекомбинантных белков в клеточных линиях млекопитающих. Данная вирусная векторная система получена из обезьяньего вируса 40 (8У40), обезьяньего полиомавируса.

Полиомавирусы относятся к семейству безоболочечных ДНК-вирусов с икосаэдрическими капсидами. Они выделены из различных видов животных, включая людей, обезьян, грызунов и птиц. Было описано пять человеческих полиомавирусов, которые назвали ВК, 1С. ^И, ΚΙ и полиомавирус клеток Меркеля. Было описано множество обезьяньих полиомавирусов, среди которых 8У40 является наиболее известным. 8У40 плохо реплицируется в человеческих клетках, и инфекции среди людей очень редки. Случайные инфекции 8У40 происходят при передаче вируса от обезьян людям, живущим в тесном контакте с этими животными, или посредством вакцинации партиями инактивированных полиовирусных частиц, контаминированных 8У40. 8У40 имеет геном в виде кольцевой двухцепочечной ДНК длиной 5,25 тыс. пар оснований. Геном 8У40 состоит из двух регуляторных областей, промотора/точки начала репликации и области полиаденилирования. Промотор/точка начала репликации имеет длину 500 пар оснований и содержит два противоположно направленных промотора: ранний и поздний промоторы (8УЕР и 8УЪР соответственно), точку начала репликации и сигнал упаковки. Область полиаденилирования имеет 100 пар оснований в длину и содержит сигналы полиаденилирования как для ранних, так и для поздних транскриптов. 8УЕР управляет экспрессией раннего первичного транскрипта, который сплайсируется кодируемыми хозяином факторами сплайсирования в 2 различных мРНК, которые кодируют малый и большой опухолевые (Т-1итот) антигены.

Большой Т-антиген является белком, ассоциированным с репликазой, который необходим для репликации ДНК и для активации 8УЪР. Хотя точная роль малого Т-антигена в репликации вируса остается неясной, малый Т-антиген в сочетании с большим Т-антигеном требуется для трансформации нескольких типов клеток млекопитающих. Первичные эффекты малого Т-антигена проявляются через его взаимодействие с серин/треониновой протеинфосфатазой 2А. Домен малого Т-антигена, связывающий фосфатазу 2А, расположен в уникальном С-конце малого Т-антигена.

В предшествующем уровне техники хорошо описано, что для эффективной репликации полиомавируса требуются как большой, так и малый Т-антигены (РайтЬасй К.М. с1 а1., У1то1о§у, 370 (2): 255-263, 2008).

8УЪР управляет экспрессией позднего первичного транскрипта, который сплайсируется кодируемыми хозяином факторами сплайсирования в две различные мРНК, кодирующие белки вирусного капсида УР1, 2 и 3. Т-антигены являются основными, а капсидные белки - второстепенными иммуногенными компонентами полиомавирусов, стимулирующими клеточный и гуморальный иммунные ответы на клетки, инфицированные 8У40.

Т-антигены 8У40 совместно иммортализуют первичные клетки млекопитающих, трансформируют стабильные клеточные линии и стимулируют образование опухолей у новорожденных грызунов с ослабленным иммунитетом. Множество сообщений подтверждают факт того, что инфекции 8У40 ассоциированы с неоплазиями у человека, вызванными онкогенной активностью постоянно экспрессируемых Т-антигенов (Ви1е1 1.8. апб Ьейшску РА. 1оитпа1 о£ 1йе №0опа1 Сапсег 1и51йи1е, 91: 119-134, 1999).

Поскольку экспрессия вирусных капсидных белков зависит от присутствия большого Т-антигена, специфичные для Т-антигена последовательности были удалены из полиомавирусных векторов не только для того, чтобы сделать векторы репликативно некомпетентными, но также для того, чтобы полностью исключить иммуногенность в людях.

Были изготовлены и проверены полученные из 8У40 полиомавирусные векторы с удаленным Т -антигеном, в которых терапевтические гены и нуклеиновые кислоты экспрессируются ίη 1тап8 в клетках-мишенях в условиях транскрипционного контроля вирусным 8УЕР. Указанные векторы известны в течение длительного периода времени в качестве потенциальных векторов для переноса генов во множество типов человеческих тканей и клеток, например в костный мозг (Ριιηά Ό. е1 а1., Нитап Оепе Тйетару, 9: 649-657, 1998), печень (§1таует Ό.δ. апй 2етп М.А., 8ет1пат8 ш Пует Н18еа8е, 19: 71-81, 1999) и дендритные клетки (Уега М. е! а1., Мо1еси1аг Тйетару, 12: 950-959, 2005).

Полиомавирусные векторы, например, на основе 8У40, как известно, инфицируют неделящиеся клетки, а также активно делящиеся клетки. Поскольку в векторах отсутствует область, кодирующая Т-антигены и, как следствие, они не экспрессируют вирусные капсидные белки, они не являются иммуногенными (81таует Ό.δ. апб 2етп М.А., 8етшат8 ш Ыует Н18еа8е, 19: 71-81, 1999), что позволяет проводить повторное введение тому же самому индивидууму. Более того, поскольку экспрессия конструктов с вставленным терапевтическим геном находится под транскрипционным контролем 8УЕР, слабого, но конститутивного промотора, указанные векторы индуцируют длительную экспрессию терапевтических белков ш утуо. Таким образом, известно, что полиомавирусные векторы, такие как векторы, полученные из 8У40, являются перспективными кандидатами для переноса терапевтических генов и нуклеиновых кислот, которые могут применяться в вышеупомянутых приложениях.

- 2 022206

Из-за своего репликативного потенциала репликоны на основе полиомавируса также представляют большой интерес при усилении продуцирования в клетках млекопитающих рекомбинантных белков, таких как антитела, факторы роста и гормоны.

Частицы 8У40 с удаленным Т-антигеном были получены в обезьяньих клетках, которые являются пермиссивными для литического роста 8У40 и которые предоставляют Т-антигены ίη 1таик. В настоящее время для упаковки §У40-векторов применяются клеточные линии СО8, в частности СО8-1 и СО8-7 (С1и/таи Υ., Се11, 23: 175-182, 1981). Клеточные линии СО8 были получены трансформацией ДНК 8У40 обезьяньих клеток СУ1. Другой клеточной линией, экспрессирующей Т-антиген 8У40 ίη 1гаик. является СМТ4. Полученные из СУ1 клеточные линии СМТ были образованы с помощью ДНК 8У40, в которой экспрессия Т-атигенов находится под транскрипционным контролем промотора мышиного металлотионеина (Оетатй Κ.Ό. аий С1н/тан Υ., Мо1еси1аг аий Се11и1аг Вю1оду, 5: 3231-3240, 1985).

Однако существует серьезный недостаток применения таких клеточных линий. Пассирование 8У40-векторов с удаленными Т-антигенами в сконструированных упаковывающих клеточных линиях (СО8 или СМТ) во многих случаях приводит к появлению репликативно-компетентных частиц 8У40 дикого типа (С1н/тан Υ., Се11, 23: 175-182, 1981; Орренйепп А. аий Ре1ед А., Оеие, 77: 79-86, 1989; Уега М. е! а1., Мо1еси1аг Тйегару, 10: 780-791, 2004).

Наиболее вероятно это происходит из-за гомологичной рекомбинации нуклеотидных последовательностей между встроенной в хромосому последовательностью, специфичной для 8У40, и ядерными последовательностями, специфичными для 8У40-вектора. Появление репликативно-компетентных вирусных частиц дикого типа и присутствие онкобелков Т-антигенов в таких обычных упаковывающих клеточных линиях делает применение 8У40-векторов непригодным для медицинских целей.

Клеточная линия человеческих эмбриональных клеток почки 293 (НЕК-293) является полупермиссивной для инфекции 8У40, это означает, что только малый процент инфицированных клеток поддерживает репликацию вируса. Основная часть клеток является персистентно инфицированными и демонстрирует очень низкие уровни репликации вируса.

Производным клеточной линии НЕК-293 является клеточная линия НЕК-293Т, в которой экспрессия ранней области 8У40 находится под транскрипционным контролем промотора длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса. Было показано, что из-за ошибки сплайсирования в пользу мРНК малого Т-антигена 8У40 клетки НЕК-293Т экспрессируют весьма незначительные количества большого Т-антигена и большие количества малого Т-антигена. Уега е! а1. обнаружили, что НЕК-293Т плохо поддерживают продуцирование вектора на основе вируса 8У40 (Уега М., е! а1., Мо1еси1аг Тйегару, 10: 780791, 2004).

Поскольку онкобелки Т-антигенов присутствуют в клетках НЕК-293Т и существует риск появления репликативно-компетентных вирусов 8У40, применение этой клеточной линии для получения 8У40векторов для медицинских целей является нежелательным и непрактичным.

Клеточную линию НЕК-293ТТ, разработанную как производное НЕК-293Т, получали стабильной трансфекцией генным конструктом, который кодирует большой Т-антиген 8У40. Клетки НЕК-293ТТ применяют для получения псевдовирусных частиц рекомбинантного человеческого вируса папилломы (НРУ). Частицы рекомбинантного псевдовектора НРУ получают в НЕК-293ТТ трансфекцией клеток плазмидой, которая несет точку начала репликации 8У40 и капсидные гены НРУ, и плазмидой, которая несет точку начала репликации 8У40 и псевдогеном НРУ (Виск С.В. е! а1., Ме1йойк ш Мо1еси1аг Мейюше, 119: 445-462, 2005).

Поскольку НЕК-293ТТ, как производное НЕК-293Т, накапливают онкобелки малого и большого Т-антигенов и плохо поддерживают репликацию 8У40, применение данной клеточной линии для продуцирования рекомбинантных векторов 8У40 в медицинских целях также является нежелательным и практически нецелесообразным.

В \УО 03/025189 описаны упаковывающие комплементирующие клеточные линии, в которых возможно продуцирование частиц вектора 8У40, которое якобы безопасно для медицинского применения. Однако описанные в данном документе упаковывающие клеточные линии по-прежнему накапливают значительные количества онкобелков малого и большого Т-антигенов.

Уега М. е! а1., Мо1еси1аг Тйегару, 10: 780-791, 2004 показали, что способность к продуцированию частиц представляющего интерес рекомбинантного 8У40-вектора в некоторых клеточных линиях, таких как СМТ4 и НЕК-293Т, может быть очень низкой, и утверждают, что клеточные линии, описанные в \УО 03/025189, такие как СОТ-2, также не являются эффективными клеточными линиями-продуцентами для частиц рекомбинантного 8У40-вируса возможно из-за ошибки сплайсирования в пользу мРНК малого Т-антигена 8У40 в данных типах клеток.

В \УО 08/000779 описан способ преодоления проблемы путем получения стоков подходящих векторов на основе вируса 8У40 с высоким титром при помощи вирусных супрессоров РНК интерференции (РНКи), таких как белки Е3Ь вируса осповакцины и N81 вируса гриппа А. Упаковывающие клеточные линии, описанные в \УО 08/000779, не обеспечивают решение недостатков упаковывающих клеточных линий предшествующего уровня техники, описанных в данном документе выше.

- 3 022206

В клетки яичника китайского хомяка (СНО) встраивали раннюю область мышиного полиомавируса, что привело к получению клеточных линий СНОР (Нейегиаи апб Оепшз, Νιιοίοίο Аа6з КезеагсЬ, 19: 8592, 1991). Несколько клеточных линий СНОР поддерживают репликацию плазмиды СОМ8 (1пуЬгодеп), экспрессирующего в млекопитающих вектора, который несет точку начала репликации мышиного полиомавируса. Уровень репликации в клеточных линиях СНОР был недостаточен для того, чтобы сделать данную систему привлекательной для коммерческого применения, возможно из-за ошибки сплайсирования в пользу мРНК малого или среднего Т-антигена в клетках СНО.

В данной области существует потребность в эффективных системах продуцирования частиц рекомбинантного полиомавируса, которые безопасны при использовании и дают высокие титры частиц вирусного вектора. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении способов безопасного и эффективного получения частиц полиомавируса и композиций, получаемых из них. Следует понимать, что способы настоящего изобретения также могут быть применены для получения больших количеств рекомбинантных белков в клетках млекопитающих.

Сущность изобретения

Вышеуказанные задачи решены настоящим изобретением путем обеспечения способа продуцирования частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не способного экспрессировать функциональный малый Т-антиген, который включает следующие стадии:

a) обеспечение пермиссивной для полиомавируса дикого типа клеточной линии, способной экспрессировать функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не способной экспрессировать функциональный малый Т-антиген полиомавируса;

b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не способной кодировать функциональный малый Т-антиген;

c) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, позволяющих образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; и

6) сбор частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора из клеточной культуры.

Частицы рекомбинантного полиомавирусного вектора, полученные данным способом, не способны экспрессировать функциональный малый Т-антиген и не могут ревертировать в частицы полиомавируса дикого типа. Это может происходить из-за полной утраты генов, кодирующих функциональный малый Т-антиген в полиомавирусном векторе, а также в клеточной линии-продуценте полиомавирусного вектора.

Это впервые позволило получить композицию, содержащую значительное количество частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора без единичных частиц полиомавируса дикого типа. Полученные данным способом частицы вирусного вектора не способны реплицироваться в клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа и которые не экспрессируют функциональный большой Т-антиген. Следовательно, эта композиция является безопасной при применении в медицине.

До сих пор было невозможно получить большие количества частиц полиомавирусного вектора, свободные от полиомавирусных ревертантов к дикому типу, полученных в результате рекомбинации. При применении данного изобретения можно получить большие количества однообразных частиц вирусного вектора в отсутствие единичных вирусов дикого типа. Соответственно, изобретение относится к композиции, содержащей больше чем 10⁶ полиомавирусных частиц, не способных экспрессировать функциональный малый Т-антиген и, следовательно, не способных реплицироваться в дефицитных по большому Т-антигену клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа.

Клеточные линии для применения в данном изобретении могут быть обычными клеточными линиями, пермиссивными для полиомавируса млекопитающих, которые генетически модифицированы так, чтобы они экспрессировали функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не экспрессировали функциональный малый Т-антиген полиомавируса. Клеточные линии по изобретению могут преимущественно использоваться для получения рекомбинантных белков, поскольку они способны реплицировать молекулы кольцевой ДНК, несущие точку начала репликации полиомавируса. Изобретение также относится к описанной выше композиции для применения в качестве лекарственного средства.

Подробное описание изобретения

Автор обнаружил, что большой Т-антиген полиомавируса сам по себе промотирует экспрессию полиомавирусных капсидных белков и что для этих целей не требуется малый Т-антиген полиомавируса. Это означает, что при отсутствии полиомавирусных Т-антигенов в клетке 8УЕР является конститутивным, но слабым промотором, по сравнению с другими вирусными промоторами, такими как цитомегаловирусный (СМУ) немедленно-ранний промотор, при этом 8УЬР выключен на транскрипционном или посттранскрипционном уровне. Неожиданно было обнаружено, что в пермиссивных для 8У40 клетках большой Т-антиген 8У40 сам по себе способен поддерживать мультиплицирование ДНК вектора на основе вируса 8У40 и активировать 8УЬР, что ведет к накоплению капсидных белков и приводит к эффективному продуцированию частиц вектора на основе вируса 8У40.

На предшествующем уровне техники были получены штаммы 8У40, которые являются дефицитными по кодированию малого Т-антигена. СаисЬа! е1 а1. (№с1ею Аш6з КезеагсЬ, 14: 9339-9351, 1988) описывают делеционный мутант 8У40, 61883, который потерял малый Т-антиген, но продуцирует в ин- 4 022206 фицированных клетках функциональный большой Т-антиген. Впоследствии данный мутантный вирусный штамм применяли для инфекции клеток почек обезьяны и клеточных культур СУ-1, и штамм мутантного вируса оказался менее эффективным при индукции клеточного деления, опосредованного большим Т-антигеном, и последующей вирусной репликации, чем §У40 дикого типа. Авторы пришли к выводу, что малый Т-антиген имеет вспомогательную функцию, помогая большому Т-антигену индуцировать клеточное деление и вирусную репликацию. Предшествующий уровень техники, таким образом, уводит в сторону от настоящего изобретения, поскольку демонстрирует, что по сравнению с клетками, инфицированными §У40 дикого типа, многие клетки, инфицированные 61883, не делятся и не продуцируют вирусные частицы. Указывается, что отсутствие малого Т-антигена в клетке неблагоприятно для продуцирования вирусного вектора.

Саисйа! с1 а1. неубедительны в ответе на вопрос, продуцируются вирусные частицы или нет. Они всего лишь измеряют продуцирование вирусной ДНК в клетках, что не является эквивалентным продуцированию интактных вирусных частиц.

Настоящее изобретение, следовательно, не является интуитивным для специалиста.

Более того, специалистам известно, что малый Т-антиген является эффективным ингибитором РНКи. Поскольку, как известно, РНКи выполняет функцию антивирусного механизма, то можно было бы ожидать, что снижение количества внутриклеточного малого Т-антигена приводит к увеличению антивирусной активности, основанной на РНКи, что приводит к сниженному продуцированию вирусных частиц. Авторы с удивлением обнаружили, что верно обратное. Если большой Т-антиген представлен ίη 1гаик, т.е. клеточная линия продуцирует большой Т-антиген, то в случае, если клеточная линия и полиомавирусный штамм потеряли функциональный малый Т-антиген, частицы полиомавируса продуцируются в больших количествах. Различия между настоящим изобретением и результатами Саисйа! е! а1. заключаются в том, что в экспериментах, описанных в работе Саисйа! е! а1., функциональный большой Т-антиген представлен ίη сй. т.е. на полиомавирусном векторе, который реплицируется в инфицированной клетке. Очевидно это приводит к частичной клеточной смерти и к очень неэффективному продуцированию вирусного вектора.

Настоящее изобретение обеспечивает способы репликации частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, упаковывающие клеточные линии для полиомавирусного вектора и клеточные линии, поддерживающие репликацию полиомавирусных репликонов, где указанные полиомавирусные вектора и репликоны неспособны экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген.

В настоящем изобретении в продуцирование полиомавирусного вектора вносят вклад все клетки и в способе по изобретению могут быть получены уровни от 1 χ 10⁶ или даже 1 χ 10¹¹ частиц вирусного вектора на 1 мл клеточной культуры.

Выражение функциональный большой Т-антиген или его функциональные части в данном контексте означает большой Т-антиген или его фрагмент или аналог, полученный из полиомавируса, который способен осуществлять такую же функцию, что и та, которая требуется для осуществления изобретения как присущая большому Т-антигену, из которого они получены, более конкретно, который способен поддерживать мультиплицирование полиомавирусной векторной ДНК и активировать §УЪР в клетках пермиссивных для полиомавируса.

Функциональность большого Т-антигена может быть проверена коэкспрессией экспрессирующей плазмиды, кодирующей большой Т-антиген полиомавируса или его фрагмент или аналог вместе с ДНК полиомавирусного вектора с удаленным Т-антигеном в клетках, пермиссивных для полиомавируса дикого типа и определением факта продуцирования частиц полиомавирусного вектора. Вывод о том, что полиомавирусный большой Т-антиген или его фрагмент или аналог является функциональным большим Т-антигеном в данном анализе, можно сделать на основании продуцирования индивидуальных полиомавирусных частиц. Факт продуцирования может быть определен электронной микроскопией или любым другим подходящим способом, известным в данной области.

Выражение функциональный малый Т-антиген или его функциональные части в данном контексте означает, что малый Т-антиген или его фрагмент или аналог, полученный из полиомавируса, который способен осуществлять ту же функцию, что и та, которая требуется для осуществления изобретения как присущая малому Т-антигену, из которого они получены, более конкретно, который способен взаимодействовать с протеинфосфатазой 2А и/или ингибировать её. Функциональность малого Т-антигена может быть проверена с помощью анализа связывания между полиомавирусным малым Т-антигеном или его фрагментом или аналогом и протеинфосфатазой 2А, как описано СНО И.8. е! а1., РЬо8 Вю1оду, 5(8): е202, 2007. Вывод о том, что малый Т-антиген или его фрагмент или аналог является функциональным малым Т-антигеном, можно сделать, если в данном анализе взаимодействие и/или ингибирование выше фона.

Полезные для настоящего изобретения клеточные линии могут экспрессировать полиомавирусный большой Т-антиген или его функциональные части и не способны экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген. Как следствие, клеточные линии по изобретению не накапливают кодируемые полиомавирусом онкобелки Т-антигенов, и репликативно-компетентные полиомавирусы дикого типа не могут выйти из клеток по изобретению вследствие рекомбинации между полиомавирусным

- 5 022206 вектором и хромосомно вставленными последовательностями полиомавирусного большого Т-антигена.

Клеточные линии для применения в настоящем изобретении могут быть получены специалистом в данной области с помощью обычных навыков. Кроме того, для того чтобы получить клеточную линию для применения по изобретению специалист может следовать руководству, предоставленному в примерах.

Также задача настоящего изобретения заключается в обеспечении пермиссивной по отношению к полиомавирусу клеточной линией, предпочтительно клеточной линии из приматов или даже более предпочтительно обезьяньей клеточной линией, такой как клеточная линия Уего (клеточная линия из почек африканской зеленой мартышки, ЕСАСС 88020401 из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, Уилтшир, Великобритания), содержащей ген, который кодирует функциональный полиомавирусный большой Т-антиген или его функциональный фрагмент, и генную последовательность, не способную экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген, полученную, например, делецией последовательностей, специфичных для малого Т-антигена. Указанная клеточная линия способна мультиплицировать и упаковывать полиомавирусные векторы с удаленным Т-антигеном.

Квалифицированному читателю понятно, что рекомбинантные полиомавирусные векторы, такие как §У40-векторы, которые продуцируются в клеточных линиях изобретения, могут не содержать специфичные последовательности для гена Т-антигена и, таким образом, не будут способны реплицироваться в клетках млекопитающих, утративших большой Т-антиген. Примерные репликоны с удаленным Т-антигеном §У40 оказались способными к репликации с высокой скоростью при продуцировании в клеточных линиях по изобретению.

Термин гомология нуклеотидных последовательностей при использовании в данном документе служит для обозначения наличия гомологии между двумя полинуклеотидами. Полинуклеотиды имеют гомологичные последовательности, либо если последовательности нуклеотидов в двух полинуклеотидах являются одинаковыми, либо если смысловая последовательность одного полинуклеотида и антисмысловая последовательность другого являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнение последовательностей между двумя или большим количеством полинуклеотидов, как правило, осуществляют путем сравнения части, по меньшей мере двух, последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. Длина окна сравнения, как правило, равна от 20 до 200 смежных нуклеотидов. Процент гомологии последовательностей для полинуклеотидных последовательностей по изобретению, такой как 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологии последовательностей, может быть определен путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения для оптимального выравнивания двух последовательностей может включать вставки или делеции (т.е. разрывы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит вставки или делеции). Процент рассчитывается следующим образом: (а) определением количества позиций, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты встречается в обеих последовательностях для получения количества совпадающих позиций; (Ь) делением количества совпадающих позиций на общее количество позиций в окне сравнения и (с) умножением результата на 100 для получения % гомологии последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено компьютерными реализациями известных алгоритмов или визуальным осмотром. Общедоступными алгоритмами сравнения последовательностей и выравнивания нескольких последовательностей являются, соответственно, Вазю Ьоеа1 АЬдптеп! §еагсЬ Тоо1 (ВЬА§Т) (А1!зсЬи1, 8.Р., 1оигпа1 о£ Мо1еси1аг Вю1о§у, 215: 403, 1990; А1!зсЬи1, 8.Р. е! а1., Мис1е1с АсМ КезеагсЬ 25: 3389-3402, 1997) и программы ОизййХУ, которые доступны в сети интернет. Другие подходящие программы включают ОАР, ΒΕδΤΡΙΤ и РА8ТА в пакете программ Мзсопзш Оепейсз (Оепейсз Сотри1ег Огоир (ОСО), Мэдисон, Висконсин, США).

Гомология между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определена со ссылкой на способность последовательностей нуклеиновых кислот гибридизоваться друг с другом после денатурации (например, в условиях 400 мМ ЫаС1, 40 мМ ПИПЕС рН 6.4, 1 мМ ЭДТА, при температуре от 50 до 65°С и при гибридизации в течение 12-16 ч с последующей отмывкой) (Мо1еси1аг С1отпд: а ЬаЬога!огу Мапиа1: 2'¹ ебШоп, §атЬгоок е! а1., СоМ 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1989 ог Сиггеп! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, 8есопб ЕбШоп, АизиЬе1 е! а1. ебз., 1оЬп \УНеу & §опз, 1992).

Вообще говоря, специалист в данной области вполне способен сконструировать полиомавирусные векторы и спроектировать протоколы для экспрессии рекомбинантных генов. Подходящие векторы могут быть выбраны или сконструированы с тем, чтобы содержать подходящие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминирующие фрагменты, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности по мере необходимости. Более подробную информацию см., например, в Мо1еси1аг С1ошпд: а ЬаЬога!огу Мапиа1: 2¹¹'¹ ебШоп, 8атЬгоок е! а1., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1989.

Термин гетерологичный применяется в широком смысле на протяжении всего документа для указания того, что рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты, полинуклеотидная последовательность, ген или последовательность нуклеотидов были введены в указанную клеточную линию- 6 022206 продуцент полиомавирусного вектора с помощью генной инженерии, т.е. посредством вмешательства человека. Гетерологичный ген, в принципе, может заменять эндогенный эквивалентный ген или может быть дополнительным к эндогенным генам генома клетки-хозяина или полиомавируса, т.е. не встречаться в естественных условиях в виде хозяина или в полиомавирусах.

Под промотором понимается последовательность ДНК, с которой может инициироваться транскрипция функционально связанной ДНК, расположенной ниже (т.е. в направлении 3' на смысловой цепи двухцепочечной ДНК). Функционально связанный означает присоединение в виде части к той же молекуле нуклеиновой кислоты, соответствующим образом позиционированной и ориентированной для транскрипции, которая будет инициироваться с промотора. Регуляция инициации транскрипции функционально связанной с промотором ДНК находится под контролем промотора.

Промотор может быть конститутивным, индуцибельным или тканеспецифичным промотором. Термины конститутивный, индуцибельный и тканеспецифичный применительно к промотору вполне понятны специалистам. Промоторы предпочтительно получают из вирусов, включая длинные 5'-концевые повторы ретровирусов и лентивирусов, немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (СМУ1е), промотор человеческого фактора элонгации альфа (ЕР-1 а1рйа) и т.п. Такие промоторы легкодоступны и хорошо известны в данной области.

Сигналы полиаденилирования означают последовательности нуклеотидов, на которых может быть терминирована транскрипция и на которых к транскрипту добавляется поли-А хвост. В качестве сигнала полиаденилирования может быть использован любой сигнал полиаденилирования, применяемый в человеческих и животных клетках.

Клеточная линия по изобретению может быть получена из любой подходящей клеточной линии, известной в данной области, такой как МЭСК, РЕК.С6, НЕК-293, СУ1 и т.п., но предпочтительно из клеточных линий Уето или СНО.

Подходящей клеточной линией по изобретению является пермиссивная для полиомавируса клеточная линия, не способная экспрессировать полиомавирусный малый Т-антиген и предпочтительно содержащая следующие генетические элементы:

ί) домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген или его часть; и необязательно ίί) селективный маркер, такой как ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к гигромицину, или другие маркеры.

Такая клеточная линия может быть лишена большого интрона полиомавирусного раннего транскрипта, несущего последовательности, специфичные для малого Т-антигена.

Клеточная линия в предпочтительном воплощении может включать транскрипционную энхансерную последовательность, стабильно интегрированную в хромосомную ДНК клеточной линии, так чтобы она могла быть дополнительно отобрана на основе активности транскрипционного энхансера. Такие маркеры и такие процедуры отбора хорошо известны в данной области.

Различные клеточные линии для продуцирования полиомавирусных векторов, например клеточные линии-продуценты вектора на основе вируса 8У40, могут быть получены трансфекцией клеток различными векторами, такими как плазмиды, в зависимости от их происхождения. Методология трансфекции клеточных линий хорошо известна в данной области. Например, клеточная линия Уего широко используется для продуцирования вирусных частиц для вакцин. Это нашло широкое применение при профилактике вирусных заболеваний.

Подходящая клеточная линия может быть получена трансфекцией первой плазмидой, содержащей следующие компоненты:

ί) домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген или его часть, лишенный большого интрона раннего транскрипта полиомавируса, охватывающего последовательности, специфичные для малого Т-антигена; и необязательно ίί) селективный маркер, такой как ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к гигромицину, и другие маркеры.

Таким образом, одиночный вектор или плазмида могут нести как домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген, так и последовательность селективного маркера. Также возможно применение двух отдельных ДНК-векторов или плазмид, одна из которых несет домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген, а другая несет селективный маркер, в зависимости от дизайна. Любые дополнительные генетические элементы, которые могут быть необходимы для придания клеточной линиипродуценту способности производить полиомавирусные векторы, также могут быть помещены на один или на несколько ДНК-векторов или плазмид, которые затем могут применяться для трансфекции выбранной клеточной линии-продуцента. Например, клеточная линия-продуцент Уего не содержит последовательности полиомавирусного Т-антигена, так что в нее может быть добавлен домен, кодирующий большой Т-антиген, и полученные в результате клетки-продуценты, несущие в себе домен, кодирующий большой Т-антиген, могут быть отобраны в системе с селективным маркером.

Изобретение впервые обеспечивает получение в достаточных количествах композиций, содержащих рекомбинантные полиомавирусные векторы, для терапевтических целей, без риска контаминации полиомавирусом дикого типа, который появляется в результате рекомбинации между полиомавирусной

- 7 022206 векторной ДНК и ДНК клетки-хозяина. Данный феномен хорошо описан в литературе (С1и/тап Υ., Се11, 23: 175-182, 1981; Оррепйеип А. аиб Ре1ед А., Сеие, 77: 79-86, 1989; Уега М. е1 а1., Мо1еси1аг Тйегару, 10: 780-791, 2004). Частота, с которой данная рекомбинация происходит, менее хорошо документирована. Оценки сильно разнятся. 8йаи1 е1 а1. подсчитали, что рекомбинация происходит с частотой по меньшей мере 10^-6 (8йаи1 е1 а1., Ргос. Ыаб. Асаб. δα. ИЗА, 82: 3781-3784, 1985), в то время как более недавние оценки демонстрируют более высокую величину рекомбинации, порядка 10^-3 (Агаб е1 а1., Упо1о§у, 304: 155-159, 2002).

Осложняющий фактор в оценке частоты рекомбинации заключается в том, что полиомавирус дикого типа реплицируется быстрее, чем рекомбинантный полиомавирусный вектор, потерявший гены, кодирующие функциональные Т-антигены.

В силу вышесказанного было установлено максимальное количество частиц рекомбинатного ЗУ40вектора, которое может быть произведено в обычной клеточной культуре в соответствии с предшествующим уровнем техники, без проявления каких-либо ревертантов к дикому типу.

В силу вышесказанного авторы инфицировали клетки СОЗ-1 частицами рекомбинантного ЗУ40вектора в соответствии со стандартным протоколом (Уега М. е1 а1., Мо1еси1аг Тйегару, 10: 780-791, 2004) и подсчитали максимальное число частиц вирусного вектора, которое может быть получено без появления индивидуального детектируемого генома вируса дикого типа, который можно обнаружить с помощью очень чувствительного количественного ПЦР-анализа.

Было установлено, что в большинстве проведенных экспериментов вплоть до 1х 10⁴ частиц вирусного вектора может быть получено безопасно без появления детектируемого количества ревертантов дикого типа. Значимое количество препаратов, содержащих 1х10⁵ частиц вирусного вектора, однако, было положительно по ревертантам дикого типа, тогда как все препараты, содержащие 1 х 10⁶ частиц вирусного вектора были контаминированы вирусами дикого типа и, таким образом, являлись небезопасными для применения в медицине.

Факт того, что препараты полиомавирусного вектора в соответствии с предшествующим уровнем техники являются небезопасными для применения в медицине, подчеркивается тем, что частицы ЗУ40 дикого типа в препаратах, содержащих больше чем 1х10⁶ частиц рекомбинантного вектора ЗУ40, были способны инфицировать пермиссивные к ЗУ40 клетки ίη νίΐΐΌ при проверке в соответствии со способом предшествующего уровня техники, описанным Кайтап К.В. е1 а1. (1оита1 о£ Уйо1ощса1 Ме1йобк, 150: 713, 2008).

Изобретение впервые делает возможным получение композиции, содержащей больше чем 1 х 10⁶ частиц полиомавирусного вектора без какого-либо присутствия в композиции полиомавирусных частиц дикого типа. Следовательно, изобретение относится к композиции, содержащей больше чем 1х10⁶ полиомавирусных частиц, не способных экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген и не способных реплицироваться в клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа. Такие препараты преимущественно могут содержать 1х10⁷ векторных частиц или больше, например, вплоть до 1х10⁸, 1х10⁹, 1х10¹⁰ или 1 х 10¹¹ векторных частиц или больше.

Выражение не способные реплицироваться в клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа означает, что в композиции по меньшей мере среди 1 х 10⁶ частиц полиомавирусного вектора нет одиночных частиц полиомавируса-ревертанта к дикому типу. Это может быть измерено либо количественным ПЦР-анализом, как описано Уега М. е1 а1., Мо1еси1аг Тйегару, 10: 780-791, 2004, либо инфекцией клеточной линии, пермиссивной для полиомавируса дикого типа, присутствующего в композиции. В последнем случае отсутствие одиночной бляшки в анализе бляшкообразования (Ка1хтап К.В. е1 а1., 1оигпа1 о£ Уйо1ощса1 Ме1йоб8, 150: 7-13, 2008) указывает на отсутствие одиночной частицы полиомавируса дикого типа.

В предпочтительном воплощении препарат по изобретению относится к композиции, содержащей полиомавирус приматов, такой как обезьяний полиомавирус, более конкретно ЗУ40, обезьяний вирус 12 (ЗУ12), лимфотропный полиомавирус, полиомавирус африканской зеленой мартышки или полиомавирус шимпанзе. Клеточные линии, пермиссивные для приматного полиомавируса, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток Уега, СУ1, РегС.6, НЕК-293 и т.п.

В другом воплощении препарат по изобретению относится к композиции, содержащей полиомавирус грызунов, такой как полиомавирус мышей или хомяков, более конкретно мышиный полиомавирус или хомячий полиомавирус. Клеточные линии, пермиссивные для полиомавируса мышей или хомяков, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток СНО и т.п.

Настоящее изобретение также раскрывает получение вектор-продуцирующих клеточных линий для продуцирования частиц вирусного вектора рекомбинантной полиомы, являющихся безопасными при применении в медицине.

Соответственно, изобретение относится к пермиссивной для полиомавируса клеточной линии, способной экспрессировать функциональный полиомавирусный большой Т-антиген и не способной экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген. Такая клеточная линия адекватно поддерживает безопасное продуцирование частиц рекомбинатного полиомавирусного вектора без риска

- 8 022206 получения частиц полиомавируса, ревертировавших к дикому типу, поскольку хромосомная ДНК данных клеток утратила какие-либо последовательности, имеющие гомологию с ДНК рекомбинатного полиомавируса. Ген, кодирующий большой Т-антиген, предпочтительно является стабильно интегрированным в геном клетки.

Термин рекомбинантный полиомавирусный вектор в данном контексте интерпретируется как полиомавирус, не способный экспрессировать функциональный полиомавирусный большой Т-антиген, предпочтительно не способный экспрессировать функциональные большой и малый Т-антигены. Такой рекомбинантный вирусный вектор может, например, утратить кодирующую последовательность либо для большого Т-антигена, либо и для большого, и для малого Т-антигенов.

Выражение пермиссивная для полиомавирусов в данном контексте означает, что клеточная линия поддерживает репликацию полиомавирусных частиц при инфекции полиомавирусом или при внедрении полиомавирусной ДНК трансфекцией или другими средствами доставки ДНК в клетку.

В другом аспекте изобретение обеспечивает способ продуцирования рекомбинтных полиомавирусных частиц, не способных экспрессировать функциональный малый Т-антиген, включающий следующие стадии:

a) обеспечение пермиссивной для полиомавируса клеточной линии, способной экспрессировать функциональный полиомавирусный большой Т-антиген и не способной экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген;

b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не способной кодировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген;

c) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, позволяющих образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; и

б) сбор частиц рекомбинантного полиомавируса из клеточной культуры.

В предпочтительном воплощении полиомавирусную ДНК вводят в клетку трансфекцией ДНК. В дополнительных аспектах изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения индивидуума, страдающего от заболевания. Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество одного или нескольких полиомавирусных векторов, таких как §У40-вектора, приготовленных в соответствии со способом изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть составлены в любой подходящей форме для введения индивидууму, нуждающемуся в этом. Такие составы могут быть в форме для любого введения, например для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, внутрилимфатического, подкожного, внутриглазного или даже для чрескожного введения.

Фармацевтические композиции изобретения, как правило, содержат буферный агент, который корректирует их осмолярность и, необязательно, один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и/или добавок, известных в данной области. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции по изобретению. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси и растительные масла. Правильная текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных веществ.

Далее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на следующие примеры.

Примеры

Пример 1. Конструирование 5У40-вектора для доставки генов.

Разработали шесть олигонуклеотидов:

№бУ101: ССОСТСОАОТТОСООССОСТОТОССТТСТАОТТОССАОССАТС (5ЕО ГО N0: 1) (содержащий сайты рестрикции Χ1οΙ и ΝοΐΙ);

У6У102: ООТАССАТАОАОСССАССОСАТССССАОСАТОСС (5ЕО ГО N0: 2) (содержащий сайт рестрикции ΚρηΙ);

У6У103: ООССОСТТТАТТААТТААОСССТОСАООТТОТТТАААСТТООСОС СССТТАТ (5ЕЦ ГО N0: 3) (содержит последовательно от 5'- к З'-концу липкий сайт рестрикции для ΝοίΙ, интактные сайты рестрикции для Раб1, 5ЬП. Рте1 и А§с1 и липкий сайт рестрикции для С1а1);

У6У104: СОАТААООСОСОССААОТТТАААСААССТОСАОООСТТААТТААТАААОС (5ЕЦ ГО N0: 4) (содержит последовательно от 5'- к З'-концу липкий сайт рестрикции для ΝοίΙ, интактные сайты рестрикции для Раб1, 5ЬП, Рте1 и А§с1 и липкий сайт рестрикции для С1а1);

\\'бУ105: СОООАТССАОАСАТОАТААОАТАСАТТО (5ЕС ГО N0: 5) (содержащий сайт рестрикции для ВатН1) и

УбУ106: АТАОТТТАОСООССОСААСТТОТТТАТТОСАОСТТАТААТОО (5ЕС ГО N0: 6) (содержащий сайт рестрикции для N0(1).

Очищенную плазмидную ДНК 5У40-вектора рЗЬ-РЬ (Эе Ьа Ьипа, 5. е( а1., ίουτηηΐ οί Сепета1 У1то1о§у, 74: 535-539, 1993) подвергали ПЦР с олигонуклеотидами \УбУ105 и \УбУ106. Полученный ам- 9 022206 плифицированный фрагмент ДНК, содержащий сигнал полиаденилирования 8У40, фланкирован сайтом рестрикции ВатШ на 5'-конце и сайтом рестрикции ΝοΐΙ на З'-конце. Данный фрагмент с сигналом полиаденилирования 8У40 расщепляли с помощью ВатН1 и ΝοΐΙ, полученный фрагмент ДНК длиной 150 п.н. выделяли из агарозного геля и клонировали в плазмиду рВ1ие8спр1 §К-(Рготеда), расщепленную таким же образом, для получения рАМ002.

Очищенную ДНК плазмиды рЕР5/РКТ/5-ЭЕ8Т Дпуйгодеп) подвергали ПЦР с олигонуклеотидами \йУ101 и \йУ102. Полученный амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (БГР), фланкирован последовательно сайтами рестрикции Хйо1 и ΝοΐΙ на 5'-конце и сайтом рестрикции ΚρηΙ на З'-конце. Данный фрагмент с сигналом полиаденилирования БГР расщепляли с помощью ΚρηΙ и ΝοΐΙ, полученный фрагмент ДНК длиной 250 п.н. выделяли из агарозного геля и клонировали в плазмиду рАМ002, расщепленную таким же образом. Осуществляли трансформацию данной лигазной смесью чувствительного к метилированию штамма Εχο1ί. Это привело к получению плазмиды рАМ003.

Два комплементарных олигонуклеотида \\йУ103 и \йУ104 гибридизовали инкубацией в водяной бане, которая автономно охлаждалась от температуры кипения до комнатной температуры, с получением ДНК-линкера, последовательно содержащего липкий сайт рестрикции ΝοΐΙ, интактные сайты рестрикции Райф 8ΜΙ, РтеI и АЫ и липкий сайт рестрикции С1аЕ Данный линкер лигировали в плазмиду рАМ002, которую расщепляли с помощью ΝοΐΙ и СЫ и выделяли из агарозного геля. Лигазную смесь затем использовали для трансформации чувствительного к метилированию штамма Εχοΐί. для получения рАМ004.

Очищенную плазмидную ДНК 8У40-вектора, рБЬ-РЬ, расщепляли с помощью СЫ и ВатНЕ Полученный в результате фрагмент ДНК длиной 2,6 тыс. п.о., содержащий точку начала репликации 8У40 и позднюю область 8У40, выделяли из агарозного геля и клонировали в рАМ004, расщепленную таким же образом. Это привело к получению нового 8У40-вектора плазмиды рАМ005.

Пример 2. Молекулярное клонирование экспрессирующего люциферазу 8У40-вектора и получение частиц рекомбинантного 8У40-вектора с люциферазой.

Экспрессирующую плазмиду рОЬЗ (Рготеда) использовали в качестве матрицы для клонирования люциферазы светлячка с помощью ПЦР. Разработали два олигонуклеотида:

\йУ389: 5'-ТТООСОСОССАТООААОАСОССАААААСАТАААОАААООС-3' (81Е) ГО ΝΟ: 7) и \йУ407: 5'-СССТТААТТААТТАСАСООСОАТСТТТССОСССТТС-3' (81Е) ГО ΝΟ: 8), содержащие соответственно сайты рестрикции АЫ и РасЕ

Амплифицированный ПЦР фрагмент с люциферазой последовательно расщепляли АЫ и РаЛ и лигировали в рАМ005 для получения рАМ006.

Разработали два олигонуклеотида:

\йУ437: 5'-ОООАТССАОАСАТОАТААОАТАСАТТО-3' (81Е) ГО ΝΟ: 9) и \йУ442: АТАОТТТАОСООССОСААТОААТОСААТТОТТОТТОТТААСТТО (81Е) ГО ΝΟ: 10), содержащие соответственно сайты рестрикции ВатШ и ΝοΐΙ.

Вектор р8Е-РЬ использовали в качестве матрицы для клонирования трейлерной последовательности большого Т-антигена с помощью ПЦР. Полученный фрагмент ПЦР расщепляли с ВатШ и ΝοΐΙ и клонировали по ВатШ и ΝοΐΙ в (частично расщепленную) рАМ006 для получения рАМ020.

Частицы рекомбинантного 8У40-вектора, кодирующие люциферазу (8У-Ьис), получали по Уега М. еΐ а1., ΜοΚαιΕίΓ Тйегару, 10: 780-791, 2004. Клетки ΕΌ8-1 трансфицировали расщепленной по ΝοΐΙ и рециркуляризованной ДНК рАМ020 и через три дня после трансфекции неочищенные лизаты получали из клеточной культуры после многократного проведения замораживания-оттаивания. Частицы вектора 8УЬис амплифицировали в один раунд в клетках СΟ8-1, растущих во флаконе Т175. Окончательно частицы вектора 8У-Ьис концентрировали и очищали из неочищенного лизата ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы, с получением стока вектора с 5х 10¹¹ копий генома 8У-Ьис на 1 мл клеточной культуры.

Пример 3. Конструирование экспрессирующей плазмиды, кодирующей большой Т-антиген 8У40.

Синтетический участок множественного клонирования (англ. ти1йр1е сЫипд Ще, МС8) сконструировали так, чтобы он содержал сайты для ΝοΐΙ, РасЕ 8ΜΕΙ, РтеЕ А$Л и С1аЕ Разработали два олигонуклеотида:

\йУ436: 5'-ОССОСТТТАТТААТТААОСССТОСАООТТОТТТАААСТТООСОСОССТТАТ-3' (81Е) ГО ΝΟ: 11) и \йУ437: 3'-СОАТААООСОСОССААОТТТАААСААССТОСАОООСТТААТТААТАААОС-5' (81Е) ГО ΝΟ: 12).

Оба олигонуклеотида \йУ436 и \йУ437 гибридизовали друг с другом и лигировали в рВ1ие5спр1 8К-(Рготеда) для получения рекомбинантной плазмиды рАМ007.

Разработали два олигонуклеотида для введения дополнительного сайта рестрикции ΝοΐΙ:

\йУ452: СООСООССОСОТАС (81 Ε) ГО ΝΟ: 13) и \йУ453: ОСООССОС.

Оба олигонуклеотида гибридизовали и лигировали в рАМ007 для получения рекомбинантного вектора рАМ008.

- 10 022206

Экспрессирующий вектор рЬепйб.3Л/5ПЕ§Т - уетА (1иуйтодеи) применяли в качестве матрицы для клонирования цитомегаловирусного немедленно раннего (СМУ1е) промотора с помощью ПЦР. Разработали два олигонуклеотида:

\\'с1У28б: 5'-ТТООСОСОССТСЛЛТЛТТООССЛТТЛОССЛТЛТТЛТТСЛТТОО-3' (8ЕО ГО N0: 14), \άΥ220: 3 '-0ЛСЛЛ0СТТССЛЛТ0СЛСС0ТТССС00СС0С00Л00СТ00ЛТС0-5' (8ЕО ГО N0: 15), фланкирующие промотор СМУ.

Олигонуклеотиды \бУ28б и \бУ220 содержат сайты рестрикции для ΆδοΙ и ΗίηάΙΙΙ соответственно. Далее очищенную рЬеийб.3Л/5ПЕ§Т уетЛ подвергали ПЦР с олигонуклеотидами \бУ28б и \бУ220 для получения фрагмента ДНК с промотором СМУ. Этот фрагмент расщепляли по ΆδοΙ и ΗίηάΙΙΙ и лигировали в рВ1ие8СТ1р1 8К- для получения рАМ009.

Экспрессирующий вектор рОЬ4.22 (Рготеда) применяли в качестве матрицы для клонирования с помощью ПЦР гена устойчивости к антибиотику, пуромицин Ν-ацетилтрансферазы. Разработали два олигонуклеотида:

\6У454: 5'-ССЛСССЛЛОСТТЛТОЛССОЛОТЛСЛЛОСССЛСООТОСО-3' (8ЕО ГО N0: 1б) и \6У455: 3'-ТЛТССОСТСОЛОТСЛООСЛССОООСТТОСОООТСЛТОС-5' (8ЕО ГО N0: 17), фланкирующие ген устойчивости к антибиотику, пуромицин ^ацетилтрансферазу и содержащие сайты рестрикции для ΗίηάΙΙΙ и ΧΙιοΙ соответственно.

Плазмиду рОЬ4.22 подвергали ПЦР с олигонуклеотидами \6У454 и \6У455 для получения кДНК пуромицин ^ацетилтрансферазы. Данный фрагмент расщепляли по ΗίηάΙΙΙ и ΧΙιοΙ и лигировали в рАМ009 для получения рАМ010.

Экспрессирующий вектор рЕЕ5/ЕКТ/5ГОЕ8Т Диуйтодеи) применяли в качестве матрицы для клонирования с помощью ПЦР сигнала полиаденилирования БГР. Разработали два олигонуклеотида:

^У45б: 5'-СЛЛССОСТСОЛОСТОТОССТТСТЛОТТОССЛОССЛТС-3' (8ЕО ГО N0: 18) и ^У457: 3'-СООООТЛССССЛТЛОЛОСССЛССОСЛТСССС-5' (8ЕО ГО N0: 19), фланкирующие сигнал полиаденилирования и содержащие сайты рестрикции для ΧΙιοΙ и Кри! соответственно.

Плазмиду рЕЕ5/ЕВТА/5-ЭЕ8Т подвергали ПЦР с олигонуклеотидами \VάУ45б и \VάУ457 для получения кДНК сигнала полиаденилирования БГР. Данный фрагмент расщепляли по ΧΙιοΙ и Кри1 и лигировали в рАМ010 для получения рАМ011.

Плазмиду рАМ008 расщепляли по ΑδΟ и РтеЕ фрагмент ДНК, содержащий домен, кодирующий пуромицин ^ацетилтрансферазу, выделяли из агарозного геля и лигировали в рАМ008 для получения рАМ012.

ДНК полноразмерного клона 8У40 (номер АТСС: УКМС-2) применяли в качестве матрицы для клонирования с помощью ПЦР области, кодирующей Т-антиген 8У40. Разработали два олигонуклеотида:

\\'άΥ408: АССАТООАТАААОТТТТАААСАОАОАООААТСТТТОСАОС (8ЕО ГО N0: 20), содержащий сайт рекомбинации айВ1, и \\'άΥ409: ТТАТОТТТСАООТТСАОООООАООТОТОООАОО (8ЕО ГО N0: 21), содержащий сайт рекомбинации айВ2.

\VάУ408 и \VάУ409 применяли для амплификации с помощью ПЦР области генома, кодирующей Тантиген. Затем из образованного фрагмента ДНК и р^0NΚ221 создавали внедряющийся клон Са1е\\ау еШгу с1оие, рАМ013. Плазмиду для экспрессии Т-антигена, рАМ014, получали рекомбинацией по технологии Са1е\\ау между рАМ013 и рЕЕ5/ЕРТА/5-ЭЕ8Т.

Сайты рестрикции и РтеI в плазмиде рАМ014 удаляли расщеплением рАМ014 по и РтеI с последующей обработкой Т4 ДНК-полимеразой и повторным лигированием для получения рАМ015. После этого экспрессирующую Т-антиген кассету выделяли расщеплением по 8рЫ с последующей обработкой Т4 ДНК-полимеразой и расщеплением по №иТ

Для создания шаттл-плазмиды сконструировали два олигонуклеотида:

\\'άΥ448: ТССТОСАООСООООТАСССТАОТСТАОАСТАОССОСООООАОТТТАААСАОСТ (8ЕО ГО N0: 22) и \\'άΥ449: ОТТТАААСТССССОСООСТАОТСТАОАСТАОООТАССССОССТОСАООАОТАС (8ЕО ГО N0: 23).

Олигонуклеотиды \VάУ448 и \VάУ449 гибридизовали с получением фрагмента ДНК, который содержит сайты рестрикции для КриЕ 8ΜΙ, КриЕ ХЬаЕ 8асП, РтеI и 8асТ Данный фрагмент ДНК лигировали в рВИ^спр! 8К-(Рготеда), расщепленную по сайтам Крй и 8ай для получения рАМ01б. Плазмиду рВй^спр! 8К- расщепляли по Крй и ΧΜηΙ и выделяли из агарозного геля фрагмент ДНК с МС8. Фрагмент ДНК с МС8 лигировали в рАМ01б по сайтам Крй и XΜаI для получения рАМ017.

Кассету из рАМ015, экспрессирующую Т-антиген под управлением ЕЕ1-альфа, выделяли расщеплением по №н1 и 8рЫ с последующей обработкой Т4 ДНК-полимеразой. Полученный в результате фрагмент ДНК клонировали в рАМ017, расщепленную по ЕсоКУ для получения рАМ018.

Плазмиду рАМ018 расщепляли по 8Μ1Ι и РтеЕ фрагмент ДНК, содержащий кассету, экспрессирующую Т-антиген, выделяли из агарозного геля и клонировали в рАМ012, расщепленную по 8ΜΤΙ и

- 11 022206

Рте1, для получения рАМ019.

Разработали четыре олигонуклеотида:

\\'с!У487: 5'-ОСАООСТАССАТООАТАААОТТТТАААСАОАОАО-3' (§ЕО ГО N0: 24);

\\'с!У490: 5'-ССАТТСАТСАОТТССАТАООТТООААТСТСАОТТОСАТСССАОААОССТССАААО3' (§ЕО ГО N0: 25);

\ϋν: 489 5'-СТТТООАООСТТСТОООАТОСААСТОАОАТТССААССТАТООААСТОАТОААТООО-3' (§ЕО ГО N0: 26) и \УйУ488: 5'-АООААТОТТОТАСАССАТОСАТТТТАААААОТС-3' (§ЕО ГО N0: 27).

Олигонуклеотиды \άν487 и \άν490 и олигонуклеотиды \άν489 и \άν488 использовали для амплификации первого и второго экзонов большого Т-антигена §ν40 соответственно. Оба образованных фрагмента ДНК далее подвергали ПЦР со слиянием, используя олигонуклеотиды \УйУ487 и ^^488. Полученный фрагмент ДНК, содержащий область, которая кодирует большой Т-антиген §ν40, расщепляли по №о1 и N511 и клонировали в расщепленную таким же образом рАМ019 для получения рАМ001.

Таким образом, рАМ001 содержит промотор ЕР1-альфа выше области, кодирующей большой Т-антиген, и промотор СМУ1е выше области, кодирующей пуромицин ^ацетилтрансферазу.

Пример 4. Получение клеточной линии-продуцента Vе^ο и продуцирование частиц рекомбинантного §V40-вектора.

Клетки Vе^ο (§щта-А1бпсЬ номер для заказа: 88020401) наращивали и адаптировали к бессывороточной культуральной среде ЭМЕМ (1иуйгодеи, код продукта: 41966-052).

Адаптацию к бессывороточным условиям осуществляли постепенным уменьшением эмбриональной бычьей сыворотки до 8, 6, 4, 2 и 0% в среде каждого пассажа. После этого Vе^о §егит Ргее ^его §Р) (бессывороточные Vе^о) культивировали в среде 0рЬРго §РМ (1иуйгодеи), содержащей 2% Ьглутамина при 37°С и 5% СО₂.

Клетки Vе^о §Р трансфицировали ДНК рАМ001 с помощью агента для трансфекции Ехдеп 500 (Еегтеп1а$. код продукта: К0511) в соответствии с предписаниями поставщика. После этого трансфицированные клетки Vе^о §Р отбирали по интеграции генной кассеты, экспрессирующей большой Т-антиген §ν40, в хромосомной ДНК путем добавления 2 мкг/мл пуромицина к культуральной клеточной среде.

Выжившие колонии выделяли и наращивали в среде 0рЬРго §РМ, содержащей 2 мкг/мл пуромицина и 2% Ь-глутамина. Устойчивые к пуромицину клетки переносили в среду 0рЬРго §РМ, содержащую 2% Ь-глутамина и 10% ДМСО, и хранили при -156°С.

Пример 5. Отбор субклонов §ире^Vе^о, высокопродуктивных по §ν40.

Трансфицированные рАМ001, устойчивые к пуромицину клоны Уе^о. и контрольные клетки Vе^о §Р культивировали до достижения ими 50%-ной конфлюэнтности. Клеточные культуры трансдуцировали 50 мкл векторного стока §У-Еис, содержащего примерно 2,5 х10¹⁰ копий векторного генома.

Через 4 ч после трансдукции культуральную среду заменяли свежей средой 0рЬРго §РМ, содержащей 2 мкг/мл пуромицина и 2% Ь-глутамина. Через три дня после трансдукции из трансдуцированных клеток замораживанием-оттаиванием получали неочищенные лизаты ^ега М. е1 а1., Мо1еси1аг ТЬегару, 10: 780-791, 2004). Клетки С0§-1, культивируемые в среде ЭМЕМ, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (1пуйгодеп), трансдуцировали 100 мкл неочищенного лизата каждого устойчивого к пуромицину и трансфицированного рАМ001 клона клеток Vе^о §Р. После этого через два дня после трансдукции в клетках С0§-1 проверяли экспрессию люциферазы светлячка, которую использовали в качестве количественной меры продуцирования вектора §У-Ьис в соответствующем устойчивом к пуромицину и трансфицированном рАМ001 клоне клеток Vе^о §Р. Клеточные клоны, продемонстрировавшие уровень экспрессии люциферазы, сопоставимый уровням клеток С0§-1, отбирали, размножали и наращивали для образования банка клеток. Клеточный клон Vе^о §Р001-86 неоднократно проверяли на продуцирование §У-Ьис и данный клон производит количества частиц рекомбинатного §V40-вектора, сравнимые с количествами в С0§-1. Полученный методом серийных разведений клеточный субклон Vе^о §Р001-86, обозначенный как Vе^о §Р001-86-01, постоянно продуцирует количества частиц рекомбинантного §V40-вектора, сравнимые с количеством частиц родительского клона клеток, Vе^о §Р001-86. Количественный ПЦР по Vе^а М. е1 а1., Мо1еси1аг ТЬегару, 10: 780-791, 2004, показал, что клеточный клон Vе^о §Р001-86-01, обозначенный как §ире^Vе^о, как правило, продуцирует 1-10х 10¹¹ копий генома вектора на 1 мл клеточной культуры.

Пример 6. Молекулярное клонирование вектора, используемого для получения рекомбинантных белков в клетках §ире^Vе^о.

Точку начала репликации §ν40 выделяли с помощью ПЦР из рТ^асе^-§V40 (1пуйгодеп) и клонировали в плазмиду рОЬ3, экспрессирующую люцефиразу светлячка (Рготеда), для получения экспрессирующего вектора рАМ006. Затем клетки §ире^Vе^о трансфицировали очищенным рАМ006 и ДНК контрольного экспрессирующего вектора рОЬ3. Экспрессию люциферазы измеряли через три дня после трансфекции. Клетки §ире^Vе^о, трансфицированные рАМ6, продуцируют значительно больше люциферазы светлячка по сравнению с клетками, которые были трансфицированы контрольной рОЬ3.

- 12 022206

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген полиомавируса, включающий следующие стадии:

   a) обеспечение пермиссивной для полиомавируса дикого типа клеточной линии, кодирующей функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не кодирующей функциональный малый Тантиген полиомавируса;

   b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не кодирующей функциональный малый Т-антиген полиомавируса;

   c) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, в которых клеточная линия продуцирует большой Т-антиген ίη 1гаи8 и позволяет образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; и

   б) сбор частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора из клеточной культуры.
2. 2. Композиция, содержащая частицы рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген и не кодирующего большой Т-антиген полиомавируса, полученные способом по п.1.
3. 3. Композиция, содержащая больше 1 млн частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген полиомавируса и не кодирующего большой Т-антиген полиомавируса, указанные полиомавирусные частицы не способны реплицироваться в пермиссивных для полиомавируса дикого типа клетках, отличающаяся тем, что не содержит ни одной полиомавирусной частицы, способной реплицироваться в пермиссивных для полиомавируса дикого типа клетках, не экспрессирующих функциональный большой Т-антиген полиомавируса.
4. 4. Композиция по п.3, в которой полиомавирус является полиомавирусом приматов.
5. 5. Композиция по п.4, в которой полиомавирус является обезьяньим полиомавирусом.
6. 6. Композиция по п.5, в которой полиомавирус выбирают из группы, состоящей из 8У40, §У12, лимфотропного полиомавируса, полиомавируса африканской зеленой мартышки и полиомавируса шимпанзе.
7. 7. Композиция по п.6, в которой полиомавирус является полиомавирусом §У40.
8. 8. Пермиссивная для полиомавируса клеточная линия, кодирующая полиомавирусный большой Тантиген и не кодирующая функциональный полиомавирусный малый Т-антиген, где указанный ген, кодирующий большой Т-антиген полиомавируса, стабильно интегрирован в геном клетки.
9. 9. Применение клеточной линии по п.8 для получения рекомбинантных белков.
10. 10. Применение композиции по любому из пп.2-7 для получения лекарственного средства для лечения заболевания.
11. 11. Применение по п.10, где заболевание выбрано из генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований.

    - 13 022206

    Список последовательностей <110> Атагпа ТНегареиТтС5 БУ <120> МЕТНОО РОК ТНЕ ΡΚΟϋυΟΤΙΟΝ ΟΡ КЕСОМВ1МАМТ РОЬУОМАУГКАЬ УЕСТОК РАКТТСЬЕ <130> 085 ио <150> ЕРОЭ158498,7 <151> 2009-04-22 <160> 27 <170> Ратептт уегзтоп 3,5 <210> 1 <211> 43 <212> ΟΝΑ <213> А1~сИтста1 Бедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апс! ргттегБ <400> 1 ссдсисдадт Гдсддссдст дГдссССста дРТдссадсс атс 43 <210> 2 <211> 34 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓΐϊίϊσϊβΐ Бедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апб ргттегз <400> 2 ддгассарад адсссассдс агссссадса гдсс 34 <210> 3 <211> 52 <212> ϋΝΑ <213> АггтГтста! Бедиепсе <220>

    <223> РгоЬеэ апб Ргттегз <400> 3 ддссдсесса ххаатеаадс сстдсаддгг дбссааасгс ддедсдсстт аг 52 <210> 4 <211> 50 <212> ома <213> ΑΓΐιίίста1 Бедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апб Ргттегз <400> 4 сдагааддсд сдссаадРТТ ааасаассгд садддсгсаа гсаагааадс 50 <210> 5 <211> 28 <212> ΟΝΑ <213> АгстЬтста! Бедиепсе

    - 14 022206 <22О>

    <223> РгоЬез апб Ргтшегз <400> 5 сдддаГссад асаГдаГаад агасаггд <210> 6 <211> 42 <212> 0ΝΑ <213> АгГтйтста! Зедиепсе <220>

    <223> РгоЬе5 апб Ргтшегз <400> 6 агадгггадс ддссдсаасг гдгпаггдс адсмагааг дд 42 <210> 7 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> АггтЙ1С1а1 Бедиепсе <22О>

    <223> ргоЬез апб ргттегз <400> 7 ггддсдсдсс агддаадасд ссааааасаг ааадаааддс <210> 8 <211> 36 <212> ϋΝΑ <213> Агп'Й1С1а1 Бечиепсе <220>

    <223> РгоЬез апс1 Ргттегз <400> 8 сссГНааГСа аггасасддс дагсгггссд сссггс 36 <210> 9 <211> 27 <212> 0ΝΑ <213> АгГ1Й1ста1 Зедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апб Ргттегз <400>

    <400> 9 дддагссада сагдаГаада гасаггд <210> 10 <211> 44 <212> 0ΝΑ <213> АПтНста! Зедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апб Рп’тегз <400> 10 агадгпадс ддссдсаагд ааГдсааТГд ггдсгдггаа сггд 44 <210> 11 <211> 51

    - 15 022206 <212> ΟΝΑ <213> АгЕтбтста! Бециепсе <220>

    <223> РгоЬе5 апс! Рпгяегз <400> 11 дссдсЕЕЕаЕ ЕааЕЕаадсс сЕдсаддЕЕд ЕЕЕааасЕЕд дсдсдссЕЕа ΐ 51 <210> 12 <211> 50 <212> ΟΝΑ <213> άγει ίί ¢1 а1 зедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апО рптегь <400> 12 сдаааЕааЕЕ ааЕЕсдддас дЕссаасааа ЕЕЕдаассдс дсддаагадс 50 <210> 13 <211> 14 <212> ϋΝΑ <213> АгЕ1бтста1 Зечиепсе <220>

    <223> РгоЬеэ апс1 Ргттегз <400> 13 сддсддссдс дЕас 14 <210> 14 <211> 43 <212> ϋΝΑ <213> агет Тлела! Зедиепсе <220>

    <223> РгоЬез апб Рп'шегз <400> 14

    ЕЕддсдсдсс ЕсаагаЕЕдд ссаЕЕадсса таЕЕаЕЕсаЕ Едд 43 <210> 15 <211> 44 <212> ΟΝΑ <213> АгЕПнста! Зедиепсе <22О>

    <223> РгоЬез апб Рп'шегз <400> 15 дсЕаддЕсдд аддсдссддс ссЕЕдссасд ЕаассЕЕсда асад 44 <210> 16 <211> 38 <212> ΟΝΑ <213> ΑΓΕίίίείΗΐ Зедиепсе <22О>

    <223> РгоЬез апО рглтегь <400> 16 ссасссаадс ЕЕатдассда дтасаадссс асддЕдсд 38

    - 16 022206

    <210> <211> <212> <213> 22 53 ϋΝΑ АгГт£тста1 Зеяиепсе <22О> <223> РгоЬез апб ργί теге

    - 17 022206 <400= 22

    ХссХдсаддс ддддхасссх адхсгадасх адссдсдддд адхххаааса дсх 53 <210= 23 <211= 53 <212= ΟΝΑ <213= Агхтр1ста1 Бедиепсе <220= <223= РгоЬез апб Ргтшегз <400> 23 дхххааасхс сссдсддсга дгсгадасга дддхассссд ссхдсаддад Хас 53 <210= 24 <211= 34 <212= ΟΝΑ <213= ΑΠζίίι С1а1 Бедиепсе <220= <223=- РгоЬез апб Ргттегз <400= 24 дсаддсхасс ахддахааад ххххааасад адад 34 <210= 25 <211> 55 <212> 0ΝΑ <213=- ΑΓΐι Н ел а! Бедиепсе <220= <223= РгоЬез апб Ргттегз <400> 25 дааассхссд аадасссхас дххдасхсха аддххддаха ссххдасхас тхас.с 55 <210= 26 <211> 56 <212= 0ΝΑ <213= АгхтРтста! Бедиепсе <220= <223= РгоЬез апб Рп'тегз <400= 26 схххддаддс ххсхдддахд саасхдадах хссаассхах ддаасхдахд аахддд 56 <210= 27 <211= 33 <212= 0ΝΑ <213= Аггтр1С1а1 Бедиепсе <220= <223= РгоЬеэ апб ргттегз <400= 27 аддаахдххд ХасассаХдс аххххааааа дхс 33