CN102695800B - 用于生产重组多瘤病毒载体粒子的方法 - Google Patents

用于生产重组多瘤病毒载体粒子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于生产病毒粒子、病毒载体粒子和重组蛋白的改进方法。具体来说，本发明涉及用于生产重组多瘤病毒载体粒子和多瘤病毒载体生产细胞系的改进方法。更具体来说，本发明涉及用于生产猿猴多瘤病毒载体粒子例如猿猴病毒40(SV40)病毒载体粒子的方法。本发明还涉及包含病毒载体的组合物及其与病毒载体粒子在治疗遗传病症、移植排斥、自体免疫疾病、传染病、过敏症或癌症中的应用。本发明还涉及用于在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法以及增强哺乳动物细胞中重组蛋白的生产的方法。

Description

用于生产重组多瘤病毒载体粒子的方法
发明领域
本发明涉及用于生产病毒粒子、病毒载体、病毒载体粒子和重组蛋白的改进方法。具体来说，本发明涉及用于生产重组多瘤病毒载体粒子和多瘤病毒载体生产细胞系的改进方法。更具体来说，本发明涉及用于生产猿猴多瘤病毒载体例如猿猴病毒40(SV40)病毒载体的方法。本发明还涉及包含病毒载体的组合物及其与病毒载体粒子在治疗遗传病症、移植排斥、自体免疫疾病、传染病、过敏症或癌症中的应用。本发明还涉及用于在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法以及增强哺乳动物细胞中重组蛋白的生产的方法。
发明背景
在过去十年中，大量工作致力于开发用于将基因或核酸导入到靶细胞中并正确表达的有效的基因或核酸递送技术。治疗性基因或核酸可用于恢复功能失常的基因以治疗遗传病症，诱导免疫应答以治疗癌症和传染病，或抑制免疫应答例如诱导/恢复免疫耐受性以阻止移植排斥或治疗自体免疫疾病和过敏症。治疗性基因或核酸可以作为裸露分子或作为包装在脂类和/或蛋白质类化合物中的核酸给药。
因为病毒演化成将它们的遗传信息递送并表达在其宿主靶细胞中，因此已探索了将病毒载体作为基因递送介质，并发现它们是到目前为止将遗传信息递送到活细胞中的最有效的手段。已经开发了大量病毒载体基因递送系统，并在临床前和临床试验中对其进行测试。这些试验显示，目前使用的源自于腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、甲病毒、反转录病毒、细小病毒和多瘤病毒的载体，总体上说是使用安全的，并且能够有效将治疗性基因递送到靶细胞中。
目前使用的病毒基因递送载体的主要缺点，是它们不能以足以治疗非常大量患者的量生产这一事实。大部分病毒载体通过用编码载体和载体组分的质粒DNA转染生产细胞来生产。这一般在每毫升细胞培养物体积中产生1百万至1千万个载体粒子。在临床试验中，一般必须向患者给药1x1010至1x1012个载体粒子以便实现有益的临床效果。这意味着为了治疗1000个患者，需要超过1百万升细胞培养物来产生足够量的载体粒子。
此外，临床前和临床试验显示，大多数被测试的病毒基因递送载体例如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、甲病毒和反转录病毒载体，在患者中诱导针对病毒载体组分和治疗性基因产物的强免疫应答。结果，这些载体只能单次给药于患者，然而被导入的治疗性基因的表达水平快速降低。源自于腺相关病毒(AAV)的病毒载体不在动物中诱导免疫应答，并且是免疫惰性的。然而，大部分人群在遇到野生型AAV连同其辅助病毒例如腺病毒，由此发展出针对AAV衣壳蛋白的强CTL记忆。结果，AAV转导的细胞被快速移除，通过AAV载体导入的治疗性基因或核酸的表达水平快速降低。
尽管使用了强启动子和/或多拷贝转基因插入片段或其他方法来增强转录，但在哺乳动物细胞中生产的重组蛋白的产量与在原核细胞中生产的重组蛋白的产量相比，普遍较低。长期以来，病毒复制型载体或复制子已被用作在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的表达系统。这样的载体中的靶基因能够在病毒启动子的转录控制下表达，由此在转染后早期即可使所需mRNA在细胞质中积累至极高水平，产生大量靶蛋白。到目前为止，使用基于复制子的表达系统的成功还受到限制。基于RNA病毒的复制子系统一般只能在短时期内生产重组蛋白，而源自于DNA病毒的复制子系统一般在商用细胞系中不能良好复制。
据我们所知，仅有一种病毒基因递送载体在人类中是免疫惰性的并能够以足以治疗非常大量患者的量生产。此外，这种病毒基因递送载体可以作为复制子系统用于在哺乳动物细胞系中生产重组蛋白。这种病毒载体系统源自于一种猿猴多瘤病毒，即猿猴病毒40(SV40)。
多瘤病毒包括一组具有二十面体衣壳的无包膜DNA病毒。从各种动物物种中分离到它们，包括人类、猴、啮齿类和鸟类。已经描述了5种人类多瘤病毒，被称为BK、JC、WU、KI和梅克尔细胞多瘤病毒。已经描述了许多猴多瘤病毒，其中SV40是最广为人知的。SV40在人类细胞中复制不良，并罕见感染人类。偶然情况下，通过病毒从猴向与这些动物密切接触生活的人的传播，或通过使用被SV40污染的灭活脊髓灰质炎病毒粒子批次进行预防接种，发生SV40感染。
SV40具有5.25千碱基对长的环状双链DNA基因组。SV40基因组包含两个调控区——启动子/原点区和多腺苷化区。启动子/原点区长为500碱基对，并包含两个相反定向的启动子、即早期和晚期启动子(分别为SVEP和SVLP)、复制原点和包装信号。多腺苷化区长为100碱基对，并含有用于早期和晚期转录本两者的多腺苷化信号。SVEP驱动早期原始转录本的表达，所述转录本被宿主编码的拼接因子拼接成两个不同mRNA，编码小和大肿瘤(T)抗原。
大T抗原是DNA复制和SVLP活化所需的复制酶结合蛋白。尽管小T抗原在病毒复制中的准确作用仍不清楚，但小T抗原与大T抗原联合，为几种哺乳动物细胞类型的转化所需。小T抗原的主要效应通过它与丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶2A的相互作用来进行。小T抗原的磷酸酶2A结合结构域位于小T抗原独特的羧基末端处。
现有技术中已明确记载大T抗原和小T抗原为多瘤病毒有效复制所需(FahrbachK.M.等，Virology370(2)：255-263，2008)。
SVLP驱动晚期原始转录本的表达，所述转录本被宿主编码的拼接因子拼接成编码病毒衣壳蛋白VP1、2和3的不同mRNA。T抗原是多瘤病毒的主要免疫原性组分，衣壳蛋白是次要免疫原性组分，引发针对SV40感染的细胞的细胞和体液免疫应答。
SV40T抗原协同地使初级哺乳动物细胞永生化、转化已确立的哺乳动物细胞系并在免疫受损的幼年啮齿动物中诱导肿瘤。许多报道表明SV40感染与人类恶性肿瘤相关，其由长期表达的T抗原的致癌活性引起(ButelJ.S.和LednickyJ.A.JournaloftheNationalCancerInstitute91：119-134，1999)。
因为病毒衣壳蛋白的表达依赖于大T抗原的存在，因此在多瘤病毒载体中已经缺失了T抗原特异性序列，这不仅是为了使载体不能复制，而且为了完全消除它们在人类中的免疫原性。
已经制造并测试了源自SV40的T抗原缺失的多瘤病毒载体，其中将治疗性基因或核酸在病毒SVEP的转录控制下反式表达在靶细胞中。长期以来，已知所述载体可作为用于将基因转移到多种人类组织和细胞类型中的可能载体，所述组织和细胞类型例如骨髓(RundD.等，HumanGeneTherapy9：649-657，1998)、肝脏(StrayerD.S和ZernM.A.，SeminarsinLiverDisease19：71-81，1999)和树突状细胞(VeraM.等，MolecularTherapy12：950-959，2005)。
已知多瘤病毒载体例如SV40感染不分裂以及活跃分裂的细胞。因为载体缺少编码T抗原的区域并因而不表达病毒衣壳蛋白，因此它们无免疫原性(StrayerD.S.和ZernM.A.，SeminarsinLiverDisease19：71-81，1999)，允许重复给药于同一个体。此外，因为插入的治疗性基因构建物在AVEP这种弱但是组成型启动子的转录控制下表达，因此所述载体引起治疗性蛋白在体内的长期表达。因此，已知多瘤病毒载体例如源自于SV40的载体，是可用于上面提到的应用的治疗性基因或核酸转移的有希望的候选物。
因为它们的复制潜力，基于多瘤病毒的复制子对于在哺乳动物细胞中增加重组蛋白例如抗体、生长因子和激素的生产，也是极为重要的。
T抗原缺失的SV40粒子，已在允许SV40的裂解生长并反式提供T抗原的猿猴细胞中生产。目前使用的SV40载体包装细胞系是COS细胞系，特别是COS-1和COS-7(GluzmanY.，Cell23：175-182，1981)。COS细胞系通过用SV40DNA转化猴CV1细胞来产生。反式表达SV40T抗原的另一种细胞系是CMT4。源自于CV1的CMT细胞系，使用其中T抗原在小鼠金属硫蛋白启动子的转录控制下表达的SV40DNA来产生(GerardR.D.和GluzmanY.，MolecularandCellularBiology5：3231-3240，1985)。
然而，对于这样的细胞系的使用来说，存在重要缺点。在许多情况下，将T抗原缺失的SV40载体在构建的包装细胞系(COS或CMT)传代，导致出现了野生型可复制的SV40粒子(GluzmanY.，Cell23：175-182，1981；OppenheimA.和PelegA.，Gene77：79-86，1989；VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004)。
这最可能是通过染色体插入的SV40特异性序列与核SV40载体特异性序列之间的依赖于核苷酸序列同源性的重组来发生的。在这种常规包装细胞系中，可复制野生型病毒粒子的出现和T抗原癌蛋白的存在，使得将SV40载体用于医疗目的变得不切实际。
人类胚胎肾293(HEK293)细胞系部分允许SV40感染，这意味着只有少量百分率的感染细胞支持病毒复制。大部分细胞被持久感染，并显示出非常低的病毒复制水平。
HEK293细胞系的衍生株是HEK293T细胞系，其在劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子的转录控制下表达SV40早期区域。已经描述，由于拼接偏倚有利于SV40小T抗原mRNA，HEK293T细胞表达非常少量的大T抗原和大量的小T抗原。Vera等发现，HEK293T几乎不支持SV40病毒载体生产(VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004)。
因为在HEK293T细胞中存在T抗原癌蛋白，并且存在着可复制SV40病毒出现的风险，因此使用这种细胞系为医疗目的生产SV40载体是不理想和不现实的。
作为HEK293T的衍生株，已经开发了HEK293TT细胞系，其通过使用编码SV40大T抗原的基因构建物进行稳定转染来产生。HEK293TT细胞被用于生产重组人类乳头瘤病毒(HPV)假载体粒子。通过用带有SV40复制原点和HPV衣壳基因的质粒和带有SV40复制原点和HPV假基因组的质粒转染细胞，在HEK293TT中产生了重组HPV假载体粒子(BuckC.B.等，MethodsinMolecularMedicine119：445-462，2005)。
因为作为HEK293T衍生株的HEK293TT积累小T和大T抗原癌蛋白，并且几乎不支持SV40复制，因此使用该细胞系为医疗目的生产重组SV40载体也是不理想和不现实的。
WO03/025189描述了允许生产SV40载体粒子的包装互补性细胞系，其被宣称对于医疗应用来说是安全的。然而，其中描述的包装细胞系仍然积累显著量的小T和大T抗原癌蛋白。
VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004显示，在某些细胞系例如CMT4和HEK293T中，目标重组SV40载体粒子的生产能力可能非常低，并且陈述在WO03/025189中描述的细胞系例如COT-2，也不能有效作为重组SV40病毒粒子的生产细胞系，这可能是由于在这些细胞类型中拼接偏倚有利于小T抗原mRNA。
WO08/000779描述了使用RNA干扰(RNAi)的病毒抑制因子例如痘苗病毒E3L和甲型流感病毒NS1蛋白，来克服生产适合的SV40病毒载体的高滴度原株所伴随的问题的方法。在WO08/000779中描述的包装细胞系没有为上文所述现有技术的包装细胞系的缺点提供解决方案。
为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞提供小鼠多瘤病毒早期区域，产生了CHOP细胞系(Heffernan和Dennis，NucleicAcidsResearch19：85-92，1991)。许多CHOP细胞系支持质粒CDM8(invitrogen)的复制，所述质粒是带有小鼠多瘤病毒复制原点的哺乳动物表达载体。CHOP细胞系中的复制水平不足以使该系统对于商业应用具有吸引力，可能是由于在CHO细胞中拼接偏倚有利于小T抗原或中T抗原mRNA。
在本技术领域中，对于使用安全并产生高滴度病毒载体粒子的用于重组多瘤病毒粒子的有效生产系统，仍存在着需求。因此，本发明的目标是提供安全有效地生产多瘤病毒粒子的方法以及可以使用其获得的组合物。应该意识到，本发明的方法也可用于在哺乳动物细胞中生产大量重组蛋白。
发明概述
本发明满足了上面提出的目的，在本发明中提供了不能表达功能性小T抗原的重组多瘤病毒载体粒子的生产方法，所述方法包含下列步骤：a)提供可以被野生型多瘤病毒感染的细胞系，所述细胞系能够表达功能性大T抗原但是不能表达功能性多瘤病毒小T抗原，b)在所述细胞系中导入不能编码功能性小T抗原的多瘤病毒DNA，c)将所述细胞在生长培养基中，在允许重组多瘤病毒载体粒子形成的条件下进行培养，以及d)从细胞培养物收获重组多瘤病毒载体粒子。
通过这种方法生产的重组多瘤病毒载体粒子不能表达功能性小T抗原，并且不能回复成野生型多瘤病毒粒子。这可能是由于在多瘤病毒载体以及多瘤病毒载体生产细胞系中完全缺失了编码功能性小T抗原的基因。
这使得现在能够第一次制备包含显著量重组多瘤病毒载体粒子而没有一个野生型多瘤病毒粒子的组合物。在这种方法中产生的病毒载体粒子，不能在可以被野生型多瘤病毒感染并且不表达功能性大T抗原的细胞中复制。因此，这种组合物对于在医学治疗中使用来说是安全的。
到目前为止，还不能大量生产不含野生型多瘤病毒回复体或重组体的多瘤病毒载体粒子。使用本发明，现在能够获得大量一致的病毒载体粒子，而不存在单个野生型病毒。因此，本发明涉及一种组合物，其包含超过106个不能表达功能性小T抗原、因此不能在可以被野生型多瘤病毒感染的大T抗原缺陷型细胞中复制的多瘤病毒粒子。
本发明中使用的细胞系可以是允许被多瘤病毒感染的常规哺乳动物细胞系，它们经过遗传修饰以便表达功能性多瘤病毒大T抗原并且不表达功能性多瘤病毒小T抗原。本发明的细胞系可以有利地用于生产重组蛋白，因为它们能够复制带有多瘤病毒复制原点的环状DNA分子。
本发明还涉及上述组合物作为药物的使用。
发明详述
本发明人发现，多瘤病毒的大T抗原凭自身启动多瘤病毒衣壳蛋白的表达，并且为此目的不需要多瘤病毒小T抗原。这意味着在细胞中不存在多瘤病毒T抗原的情况下，SVEP是组成型启动子，但与其他病毒启动子例如细胞肥大病毒(CMV)立即早期启动子相比是弱的启动子，然而SVLP在转录或转录后水平上被关闭。令人吃惊的是，在SV40可感染细胞细胞中，发现SV40大T抗原凭自身能够维持SV40病毒载体DNA的增殖并能激活SVLP，引起衣壳蛋白的积累并导致SV40病毒载体粒子的高效生产。
在现有技术中，已经产生了小T抗原编码缺失的SV40毒株。Gauchat等(NucleicAcidsResearch14：9339-9351，1988)描述了SV40缺失突变株d1883，其缺失小T抗原但在被感染细胞中产生功能性大T抗原。当使用这种突变病毒毒株感染猴肾细胞和CV-1细胞培养物时，突变的病毒毒株与野生型SV40相比，诱导大T抗原介导的细胞分裂和随后的病毒复制的效率较低。作者得出结论，小T抗原具有辅助功能，协助大T抗原诱导细胞分裂和病毒复制。因此，该现有技术教导的内容与本发明相背离，因为它显示出与用野生型SV40感染的细胞相比，许多用d1883感染的细胞不分裂，并且不产生病毒粒子。在细胞中缺少小T抗原被教导为对病毒载体生产有害。
Gauchat等的文献对于病毒粒子是否产生没有说服力。他们仅仅测量了细胞中病毒DNA的产生，其不等同于完整病毒粒子的产生。
因此，本发明对于本领域技术人员来说是违反直觉的。此外，对于本领域技术人员来说，已知小T抗原是RNAi的有效抑制剂。因为已知RNAi用作抗病毒机制，因此可以预计减少细胞内小T抗原的量将引起基于RNAi的抗病毒活性的增加，导致病毒粒子生产降低。本发明人令人吃惊地发现真实情况与此相反。当以反式提供大T抗原，即细胞系产生大T抗原，其中细胞系和多瘤病毒毒株两者都缺少功能性小T抗原时，产生了大量多瘤病毒粒子。本发明与Gauchat等的结果之间的区别在于，在Gauchat等中描述的实验中，功能性大T抗原以顺式提供，即提供在被感染细胞中复制的多瘤病毒载体上。这明显导致部分细胞死亡和非常低效的病毒载体生产。
本发明提供了用于重组多瘤病毒载体粒子复制的方法和多瘤病毒载体包装细胞系以及支持多瘤病毒复制子复制的细胞系，所述多瘤病毒载体和复制子不能表达功能性多瘤病毒小T抗原。
在本发明中，所有细胞都有助于多瘤病毒载体生产，并且在本发明的方法中可以获得每毫升细胞培养物体积1x106或甚至1x1011个病毒载体粒子的产量和水平。
在本文中，表述“功能性大T抗原”或“其功能性部分”是指可以从多瘤病毒获得的大T抗原或其片段或类似物，其能够行使与执行本发明所需的、可归因于它们所源自的大T抗原的功能相同的功能，更具体为能够在可以被多瘤病毒感染的细胞中维持多瘤病毒载体DNA的繁殖并激活SVLP的功能。
可以通过将编码多瘤病毒大T抗原或其片段或类似物的表达质粒与缺失T抗原的多瘤病毒载体DNA一起在可以被野生型多瘤病毒感染的细胞中共表达，并确定多瘤病毒载体粒子是否产生，来测试大T抗原的功能。如果在该测定中产生了单个多瘤病毒粒子，则可以得出多瘤病毒大T抗原或其片段或类似物是功能性大T抗原的结论。这可以通过电子显微术或本技术领域已知的任何其他适合方法来确定。
在本文中，表述“功能性小T抗原”或“其功能性部分”是指可以从多瘤病毒获得的小T抗原或其片段或类似物，其能够行使与执行本发明所需的、可归因于它们所源自的小T抗原的功能相同的功能，更具体为能够与蛋白磷酸酶2A相互作用和/或抑制蛋白磷酸酶2A。可以如CHOU.S.等PLoSBiology5(8)：e202，2007所述，使用多瘤病毒小T抗原或其片段或类似物与蛋白磷酸酶2A之间的结合测定来测试小T抗原的功能。当在该测定中相互作用和/或抑制高于背景时，可以得出小T抗原或其片段或类似物是功能性小T抗原的结论。
可用于本发明的细胞系可以表达多瘤病毒大T抗原或其功能性部分，并且不能表达功能性多瘤病毒小T抗原。结果，本发明的细胞系不积累多瘤病毒编码的T抗原癌蛋白，并且能够复制的野生型多瘤病毒不能通过多瘤病毒载体与染色体插入的多瘤病毒大T抗原序列之间的重组而出现在本发明的细胞中。
用于本发明的细胞系可以由本领域技术人员使用其熟知的技术来获得。此外，本领域技术人员可以遵从实施例中提供的指导以便获得在本发明中使用的细胞系。
本发明的另一个目的是提供可以被多瘤病毒感染的细胞系，优选为灵长类细胞系，或更优选为猿猴细胞系例如Vero细胞系(参见非洲绿猴肾细胞系ECACC88020401，欧洲细胞培养物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures)，Salisbury，Wiltshire，UK)，其含有编码功能性多瘤病毒大T抗原或其功能性片段的基因，所述基因序列通过例如缺失小T抗原特异性序列而不能表达功能性多瘤病毒小T抗原。所述细胞系能够繁殖和包装T抗原缺失的多瘤病毒载体。
专业人员将会认识到，在本发明的细胞系中生产的重组多瘤病毒载体例如SV40载体可能不包含T抗原特异性序列，因此将不能在缺少大T抗原的哺乳动物细胞中复制。示例性的T抗原缺失的SV40复制子在本发明的生产细胞系中以高速率复制。
当在本文中使用时，术语“核苷酸序列同源性”是指在两个多核苷酸之间存在同源性。当以最大对应性比对时，当两个多核苷酸的核苷酸序列相同、或者当一个多核苷酸的正义序列与另一个多核苷酸的反义序列相同时，多核苷酸具有“同源的”序列。两个或多个多核苷酸之间的序列比较，一般通过将至少两个序列在比较窗口中的部分进行比较来进行，以鉴定和比较序列相似的局部区域。比较窗口的长度一般为约20至200个连续的核苷酸。对于本发明的多核苷酸序列来说，“序列同源性百分数”，例如50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同源性，可以通过将两个最适排列的序列在比较窗口内进行比较来确定，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分，与用于两个序列的最适排列的参比序列(其不含添加或缺失)相比，可能包括添加或缺失(即间隙)。百分数通过下列步骤来计算：(a)确定在两个序列中出现同一核酸碱基的位置的数量以获得匹配位置数；(b)用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数；并且(c)将结果乘以100以获得序列同源性百分数。用于比较的序列的最适排列可以通过已知算法的计算机化实施或通过目测检查来进行。可容易获得的序列比较和多序列比对算法分别为基本局域比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)(BLAST)(Altschul，S.F.，JournalofMolecularBiology215：403，1990；Altschul，S.F.等，NucleicAcidResearch25：3389-3402，1997)和ClustalW程序，二者可以在英特网上获得。其他适合的程序包括威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT和FASTA(GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI，USA)。
核酸序列之间的同源性可以参考核酸序列在变性后彼此杂交的能力来确定(例如在400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA条件下，在50℃至65℃温度下杂交12-16小时，然后清洗)(《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：aLaboratoryManual)第二版，Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989或《分子生物学现代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)第二版，Ausubel等主编，JohnWiley&Sons，1992)。
总的来说，本领域技术人员完全能够构建多瘤病毒载体并设计用于重组基因表达的方案。可以选择或构建适合的载体，其含有适合的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷化序列、增强子序列、标志物基因和其他序列，视情况而定。对于进一步的详细情况，参见例如《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：aLaboratoryManual)第二版，Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989。
术语“异源的”在整个申请中广泛使用，表示所指核酸序列、多核苷酸序列、基因或核苷酸序列，已使用遗传工程、即通过人类干预，导入到所述多瘤病毒载体产生细胞系中。异源基因在原则上可以代替内源等效基因，或者在宿主细胞或多瘤病毒的基因组的内源基因之外附加上去，即在宿主物种的细胞中或多瘤病毒中是非天然存在的。
“启动子”是指可操作连接在其下游(即在双链DNA正义链的3’方向上)的DNA的转录可以从其起始的DNA序列。“可操作连接”是指作为同一核酸分子的一部分而连接，被适合地定位和定向用于从启动子起始转录。与启动子可操作连接的DNA在启动子的“转录起始调控之下”。
启动子可以是组成性启动子、诱导性启动子或组织特异性启动子。术语“组成性”、“诱导性”和“组织特异性”当用于启动子时，其含义为本领域技术人员所公知。启动子优选源自于病毒，包括来自于反转录病毒和慢病毒的5’-长末端重复序列、细胞肥大病毒立即早期启动子(CMVie)、人类延伸因子1α启动子(EF-1α)等。这样的启动子容易获得，并在本技术领域中是公知的。
“聚腺苷化信号”是指可以从其终止转录并向转录本添加poly-A尾巴的核苷酸序列。作为聚腺苷化信号，可以使用在人类或动物细胞中适用的任何聚腺苷化信号。
本发明的细胞系可以源自于本技术领域中已知的任何适合细胞系，例如MDCK、PER.C6、HEK293、CV1等，但是优选为Vero或CHO细胞系。
本发明的适合细胞系是可以被多瘤病毒感染的、不能表达多瘤病毒小T抗原的细胞系，并优选包含下列遗传元件：
i)多瘤病毒大T抗原编码结构域或其部分，以及任选的
ii)选择性标志物，例如新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或其他标志物。
这样的细胞系可以不含带有小T抗原特异性DNA序列的多瘤病毒早期转录本的大内含子。
在优选实施方案中，细胞系可以包含稳定整合在细胞系的染色体DNA中的转录增强区域，使得可以在转录增强子活性的基础上对其进行进一步选择。这样的标志物和这样的选择程序在本技术领域中是公知的。
取决于系谱，可以通过用不同载体例如质粒转染细胞，来产生不同的多瘤病毒载体生产细胞系，例如SV40病毒载体生产细胞系。用于细胞系转染的方法在本技术领域中是公知的。例如，Vero细胞系被广泛用于生产用作疫苗的病毒粒子。这已经在病毒疾病的预防中发现了许多应用。
适合的细胞系可以通过用包含下列组件的第一种质粒转染来获得
i)多瘤病毒大T抗原编码结构域或其部分，不含带有小T抗原特异性序列的多瘤病毒早期转录本的大内含子，以及任选的
ii)选择性标志物，例如新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或其他标志物。
因此，单个载体或质粒可以携带多瘤病毒大T抗原编码结构域和选择性标志物序列两者。取决于设计，使用两个独立的携带DNA的载体或质粒，其中一个携带多瘤病毒大T抗原编码结构域而第二个携带选择性标志物，也是可能的。为了赋予生产细胞系以多瘤病毒载体生产能力而可能需要的任何其他遗传元件，也可以置于一个或多个DNA载体或质粒上，然后可以用其转染所选的生产细胞系。例如，Vero生产细胞系本身尚未包含多瘤病毒T抗原序列，因此可以将大T抗原编码结构域添加到其中，然后可以使用选择性标志物系统，选择由此得到的其中带有大T抗原编码结构域的原初生产细胞。
本发明现在第一次允许制备包含足以用于治疗目的量的重组多瘤病毒载体的组合物，而没有被从多瘤病毒载体DNA与宿主细胞DNA之间的重组产生的野生型多瘤病毒污染的风险。这种重组现象已在文献中明确描述(GluzmanY.，Cell23：175-182，1981；OppenheimA.和PelegA.，Gene77：79-86，1989；VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004)。
然而，关于这种重组发生的频率没有非常明确的记载。估算值变化极大。Shaul等估计重组可能以至少10-6的频率发生(Shaul等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3781-3784，1985)，然而更近的估算显示出高得多的重组率，在10-3量级上(Arad等，Virology304：155-159，2002)。
在重组频率的估算中难以处理的因素是野生型多瘤病毒复制得比缺少功能性T抗原编码基因的重组多瘤病毒载体更快。
由此，我们确定了按照现有技术，在常规细胞培养中，在不出现任何野生型回复体的情况下可能产生的重组SV40载体粒子的最大数量。
因此，我们按照标准程序(VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004)用重组SV40载体粒子感染COS-1细胞，并计算在通过非常灵敏的定量PCR测定法检测时不出现单个可检测的野生型病毒基因组的情况下，可能产生的病毒载体粒子的最大数量。
在大多数执行的实验中发现，在不出现可检测量的野生型回复体的情况下，能够安全地生产多达1x104个病毒载体粒子。然而，大量包含1x105个病毒载体粒子的制备物对野生型回复体呈阳性，而所有包含1x106个病毒载体粒子的制备物都被野生型病毒污染，因此对于医疗应用来说是不安全的。
现有技术的多瘤病毒载体制备物对于医疗应用不安全这一事实，被下述事实进一步强调，即包含超过1x106个重组SV40载体粒子的制备物中的野生型SV40粒子，当按照如KatzmanR.B.等所述的现有技术方法(JournalofVirologicalMethods150：7-13，2008)进行测试时，能够在体外感染可被SV40感染的细胞。
本发明现在第一次允许制备包含超过1x106个多瘤病毒载体粒子的组合物，并且在组合物中不存在任何野生型多瘤病毒粒子。因此，本发明涉及包含超过1x106个多瘤病毒载体粒子的组合物，所述载体粒子不能表达功能性多瘤病毒小T抗原并且不能在允许野生型多瘤病毒感染的细胞中复制。有利情况下，这样的制备物可以包含1x107个或更多载体粒子，例如多达1x108、1x109、1x1010或1x1011个或更多载体粒子。
表述“不能在允许野生型多瘤病毒感染的细胞中复制”是指组合物在至少1x106个多瘤病毒载体粒子中不含单个野生型回复体多瘤病毒粒子。这可以通过如VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004所述的定量PCR测定法，或通过对允许组合物中存在的野生型多瘤病毒感染的细胞进行感染来测量。在后一种情况下，在噬斑测定法(KatzmanR.B.等，JournalofVirologicalMethods150：7-13，2008)中不存在单个噬斑，表明不存在单个野生型多瘤病毒粒子。
在优选实施方案中，本发明的制备物涉及包含灵长类多瘤病毒，例如猿猴多瘤病毒、更具体为SV40、猿猴病毒12(SV12)嗜淋巴细胞多瘤病毒、非洲绿猴多瘤病毒或黑猩猩多瘤病毒的组合物。允许灵长类多瘤病毒感染的细胞系优选自Vero细胞、CV1细胞、PerC.6细胞、HEK293细胞等。
在另一个实施方案中，本发明的制备物涉及包含啮齿动物多瘤病毒，例如小鼠或仓鼠多瘤病毒、更具体为鼠类多瘤病毒或仓鼠多瘤病毒的组合物。允许小鼠或仓鼠多瘤病毒感染的细胞系优选自CHO细胞等。
本发明还公开了用于生产安全用于医疗应用的重组多瘤病毒载体粒子的载体生产细胞系的产生。
因此，本发明涉及允许多瘤病毒感染的细胞系，所述细胞系能够表达功能性大T抗原并且不能表达小T抗原。这样的细胞系足以支持重组多瘤病毒载体粒子的安全生产而没有获得野生型回复体多瘤病毒粒子的风险，因为细胞缺乏细胞的染色体DNA与重组多瘤病毒DNA之间的任何同源序列。编码大T抗原的基因优选被稳定地整合在细胞的基因组中。
在本文中，术语“重组多瘤病毒载体”应该被解释为不能表达功能性多瘤病毒大T抗原、优选不能表达功能性大T和小T抗原的多瘤病毒。这样的重组病毒载体可能例如缺少大T抗原或大T与小T抗原两者的编码序列。
在本文中，表述“允许多瘤病毒感染”是指细胞系在用多瘤病毒感染后，或在通过转染或将DNA递送到细胞中的其他手段导入多瘤病毒DNA后，支持多瘤病毒粒子的复制。
另一方面，本发明提供了用于生产不能表达功能性小T抗原的重组多瘤病毒粒子的方法，所述方法包含下列步骤：
a.提供允许野生型多瘤病毒感染的细胞系，所述细胞系能够表达功能性多瘤病毒大T抗原并且不能表达功能性小T抗原，
b.在所述细胞系中导入不能编码功能性小T抗原的多瘤病毒DNA，
c.将所述细胞在生长培养基中，在允许多瘤病毒粒子形成的条件下进行培养，以及
d.从细胞培养物收获重组多瘤病毒粒子。
在优选实施方案中，多瘤病毒DNA通过DNA转染导入细胞中。
在本发明的另一方面，提供了用于治疗患病个体的药物组合物。药物组合物可以包含治疗有效量的按照本发明的方法制备的一种或多种多瘤病毒载体例如SV40，以及可药用载体或稀释剂。本发明的药物组合物可以配制在用于向需要的个体给药的任何适合的形式中。这样的剂型可以采取任何给药形式，例如局部、口腔、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、淋巴内、皮下、眼内或甚至透皮给药。
本发明的药物组合物一般包含缓冲剂、调整其渗透性的试剂、本技术领域已知的一种或多种可药用载体、赋形剂和/或添加剂。也可以在本发明的组合物中掺入增补的活性成分。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油。通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体系的情况下通过维持所需的粒子尺寸，以及通过使用表面活性剂，可以维持正确的流动性。
现在，将参考下面的实施例对本发明进行进一步描述。
实施例
实施例1：源自SV40的基因递送载体的构建
设计了6个寡核苷酸：
WdV101：CCGCTCGAGTTGCGGCCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC(SEQIDNo.1)(含有Xhol和Notl限制性位点)，和
WdV102：GGTACCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCC(SEQIDNo.2)(含有Kpnl限制性位点)和
WdV103：GGCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT(SEQID.No.3)(从5’至3’相继含有Notl粘性限制性位点，PadI、Sbfl、Pmel和Ascl完整限制性位点和CIaI粘性限制性位点)，和
WdV104：CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC(SEQIDNo.4)(从3’至5’相继含有Notl粘性限制性位点，PadI、Sbfl、Pmel和Ascl完整限制性位点和CIaI粘性限制性位点)，和
WdV105：CGGGATCCAGACATGATAAGATACATTG(SEQIDNO.5)(含有BamHI限制性位点)，以及
WdV106：ATAGTTTAGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG(SEQIDNo.6)(含有Notl限制性位点)。
使用寡核苷酸WdV105和WdV106对SV40载体pSL-PL(DeLaLuna，S.等，JournalofGeneralVirology74：535-539，1993)的纯化的质粒DNA进行PCR。得到的扩增DNA片段包含SV40聚腺苷化信号，其两侧为5’端的BamHI限制性位点和3’端的Notl限制性位点。将该SV40聚腺苷化信号片段用BamHI和Notl消化，从琼脂糖凝胶分离得到的150bp长的DNA片段，并将其克隆到同样消化的pBluescriptSK-质粒(Promega)中，产生pAM002。
使用寡核苷酸WdV101和WdV102对纯化的pEF5/FRT/5-DEST(Invitrogen)质粒DNA进行PCR。得到的扩增DNA片段包含牛生长激素(BGH)聚腺苷化信号，其两侧为5’端的连续的Xhol和Notl限制性位点和3’端的Kpnl限制性位点。将该BGH聚腺苷化信号片段用Kpnl和Notl消化，从琼脂糖凝胶分离得到的250bp长的DNA片段，并连接到同样消化的pAM002质粒中。使用该连接混合物的转化在甲基化不敏感的大肠杆菌菌株中进行。这产生质粒pAM003。
将两个互补的寡核苷酸WdV103和WdV104通过在从沸点自主冷却到室温的水浴中温育进行退火，产生了相继含有Notl粘性限制性位点，PadI、Sbfl、Pmel和Ascl完整限制性位点和CIaI粘性限制性位点的DNA连接物。将该连接物连接到用Notl和CIaI消化并从琼脂糖凝胶分离的pAM002质粒中。连接混合物随后被用于转化甲基化不敏感的大肠杆菌菌株，产生pAM004。
将SV40载体pSL-PL的纯化的质粒DNA用CIaI和BamHI消化。从琼脂糖凝胶纯化由此得到的含有SV40复制原点和SV40晚期区域的2.6kbDNA片段，并将其克隆在同样消化的pAM004中。这产生了新的SV40载体质粒pAM005。
实施例2：SV40萤光素酶表达载体的分子克隆和重组重组SV40萤光素酶载体粒子的生产
使用表达质粒pGL3(Promega)作为模板，用于使用PCR克隆萤火虫萤光素酶。设计了两个寡核苷酸WdV389：5’-TTGGCGCGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC-3’(SEQIDNO：7)和WdV407：5’-CCCTTAATTAATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC-3’(SEQIDNO：8)，其分别含有限制性位点AscI和PacI。然后将PCR扩增的萤光素酶片段用AscI和PacI消化，并连接到pAM005中，产生pAM006。
设计了两个寡核苷酸WdV437：5’GGGATCCAGACATGATAAGATACATTG3’(SEQIDNO：9)和WdV442：ATAGTTTAGCGGCCGCAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTG(SEQIDNO：10)，其分别含有BamHI和NotI限制性位点。将pSL-PL载体用作模板，用于使用PCR克隆大T抗原尾序列。将得到的PCR片段用BamHI和NotI消化，并克隆到BamHI和NotI(部分消化的)pAM006中，产生pAM020。
编码萤火虫萤光素酶的重组SV40载体粒子(SV-Luc)按照VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004来产生。将COS-1细胞用Notl消化并重新环化的pAM020DNA转染，并在转染后三天通过反复冻融从细胞培养物制备粗裂解液。将SV-Luc载体粒子在生长在T175摇瓶中的COS-1细胞中扩增一轮。最后通过蔗糖梯度超离心将SV-Luc载体粒子浓缩并从粗裂解液中纯化，产生每毫升细胞培养物5x1011个SV-Luc基因组拷贝的载体储用物。
实施例3：编码SV40大T抗原的表达质粒的构建
设计了含有NotI、PacI、SbfI、PmeI、AscI和ClaI限制性位点的合成的多克隆位点(MCS)。设计了两个寡核苷酸WdV436：5’-GCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT-3’(SEQIDNO：11)和WdV437：3’-CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC-5’(SEQIDNO12)。将两个寡核苷酸WdV436和WdV437彼此退火并连接到pBluescriptSK-(Promega)中，产生重组质粒pAM007。
设计了两个寡核苷酸以导入附加的NotI限制性位点，WdV452：CGGCGGCCGCGTAC(SEQIDNO：13)和WdV453：GCGGCCGC。将两个寡核苷酸退火并连接到pAM007中，产生重组载体pAM008。
使用表达载体pLenti6.3/V5DEST_verA(Invitrogen)作为模板，用于使用PCR克隆细胞肥大病毒立即早期(CMVie)启动子。在CMV启动子两侧设计了两个寡核苷酸WdV286：5’-TTGGCGCGCCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGG-3’(SEQIDNO：14)和WdV220：3’-GACAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGCGGAGGCTGGATCG-5’(SEQIDNO：15)。寡核苷酸WdV286和WdV220分别含有限制性位点AscI和HindIII。随后，使用寡核苷酸WdV286和WdV220对纯化的pLenti6.3/V5DEST_verA进行PCR，产生CMV启动子DNA片段。将该片段用AscI和HindIII消化并连接到pBluescriptSK-中，产生pAM009。
使用表达载体pGL4.22(Promega)作为模板，用于使用PCR克隆嘌呤霉素N-乙酰转移酶抗生素抗性基因。在嘌呤霉素N-乙酰转移酶抗生素抗性基因两侧设计了两个寡核苷酸WdV454：5’-CCACCCAAGCTTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCG-3’(SEQIDNO：16)和WdV455：3’-TATCCGCTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGC-5’(SEQIDNO：17)，其分别含有限制性位点HindIII和XhoI。使用寡核苷酸WdV454和WdV455对质粒pGL4.22进行PCR，产生嘌呤霉素N-乙酰转移酶cDNA。将该片段用HindIII和XhoI消化并连接到pAM009中，产生pAM010。
使用表达载体pEF5/FRT/5-DEST(Invitrogen)作为模板，用于使用PCR克隆BGH聚腺苷化信号。在聚腺苷化信号两侧设计了两个寡核苷酸WdV456：5’-CAACCGCTCGAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3’(SEQIDNO：18)和WdV457：3’-CGGGGTACCCCATAGAGCCCACCGCATCCCC-5’(SEQIDNO：19)，其分别含有限制性位点XhoI和KpnI。使用寡核苷酸WdV456和WdV457对质粒pEF5/FRT/V5-DEST进行PCR，产生BGH聚腺苷化信号cDNA。将该片段用XhoI和KpnI消化并连接到pAM010中，产生pAM011。
将质粒pAM008用AscI和PmeI消化，从琼脂糖凝胶纯化包含嘌呤霉素N-乙酰转移酶编码结构域的DNA片段并将其连接到pAM008中，产生pAM012。
使用全长SV40DNA克隆(ATCC编号VRMC-2)的DNA作为模板，用于使用PCR克隆SV40T抗原编码区。设计了两个寡核苷酸，含有attB1限制性位点的WdV408：ACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC(SEQIDNO：20)和含有attB2限制性位点的WdV409：TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGG(SEQIDNO：21)。使用WdV408和WdV409通过PCR扩增基因组T抗原编码区。然后，从产生的DNA片段和pDONR221产生gateway入门克隆，得到pAM013。通过pAM013与pEF5/FRT/V5-DEST之间的gateway重组产生T抗原表达质粒，得到pAM014。
通过用NotI和PmeI消化pAM014然后用T4DNA聚合酶处理并重新连接，消除了质粒pAM014中的NotI和PmeI限制性位点，产生pAM015。随后通过SphI消化然后进行T4DNA聚合酶处理和NruI消化，分离到T抗原表达盒。
为了产生穿梭质粒，设计了两个寡核苷酸WdV448：TCCTGCAGGCGGGGTACCCTAGTCTAGACTAGCCGCGGGGAGTTTAAACAGCT(SEQIDNO：22)和WdV449：GTTTAAACTCCCCGCGGCTAGTCTAGACTAGGGTACCCCGCCTGCAGGAGTAC(SEQIDNO：23)。
将寡核苷酸WdV448和WdV449退火，产生含有KpnI、SbfI、KpnI、XbaI、SacII、PmeI和SacI限制性位点的DNA片段。将该DNA片段连接到KpnI和SacI消化的pBluescriptSK-(Promega)中，产生pAM016。将质粒pBluescriptSK-用KpnI和XbaI消化，并从琼脂糖凝胶分离MCSDNA片段。将MCSDNA片段连接到用KpnI和XbaI消化的pAM016中，得到pAM017。
通过用NruI和SphI消化然后进行T4DNA聚合酶处理，从pAM015分离到EF1α驱动的T抗原表达盒。将得到的DNA片段克隆到用EcoRV消化的pAM017中，得到pAM018。
将质粒pAM018用SbfI和PmeI消化，从琼脂糖凝胶分离包含T抗原表达盒的DNA片段，并将其克隆到用SbfI和PmeI消化的pAM012中，得到pAM019。
设计了4个寡核苷酸WdV487：5’-GCAGGCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’(SEQIDNO：24)和WdV490：3’-CCATTCATCAGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGCCTCCAAAG-5’(SEQIDNO：25)，WdV489：5’-CTTTGGAGGCTTCTGGGATGCAACTGAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGG-3’(SEQIDNO：26)和WdV488：5’-AGGAATGTTGTACACCATGCATTTTAAAAAGTC-3’(SEQIDNO：27)。
使用寡核苷酸WdV487与WdV490和寡核苷酸WdV489与WdV488分别扩增SV40大T抗原的第一和第二个外显子。然后使用寡核苷酸WdV487和WdV488对产生的两个DNA片段进行融合PCR。
将产生的含有SV40大T抗原编码区的DNA片段用NcoI和NsiI消化，并克隆到同样消化的pAM019中，得到pAM001。
概括来说，pAM001含有位于大T抗原编码区上游的EF1α启动子和位于嘌呤霉素N-乙酰基转移酶编码区上游的CMVie启动子。
实施例4：Vero生产细胞系的产生和重组SV40载体粒子的生产
使Vero细胞(Sigma-Aldrich订货号：88020401)繁殖并适应于无血清DMEM培养基(Invitrogen，产品编号：41966-052)。对无血清条件的适应通过每次传代时将培养基中的胎牛血清浓度从8、6、5、2和0％逐渐降低来进行。从那时起，将Vero-无血清(Vero-SF)细胞在37℃和5％CO2下培养在含有2％L-谷氨酰胺的OptiProSFM培养基(Invitrogen)中。
使用转染试剂Exgen500(Fermentas，产品编号：R0511)，按照供应商的指示将Vero-SF细胞用pAM001DNA转染。然后通过向细胞培养基添加2μg/ml嘌呤霉素，筛选SV40大T基因表达盒整合到染色体DNA中的转染的Vero-SF细胞。分离存活的集落，并在含有2μg/ml嘌呤霉素和2％L-谷氨酰胺的OptiProSFM培养基中繁殖。将嘌呤霉素抗性细胞转移到含有2％L-谷氨酰胺和10％DMSO的OptiProSFM培养基中，并储存在-156℃下。
实施例5：高产SV40的SuperVero亚克隆的筛选
将用pAM001转染的嘌呤霉素抗性Vero克隆和VERO-SF对照细胞进行培养，直到其达到50％铺满。将细胞培养物用含有约2.5x1010个载体基因组拷贝的50μlSV-Luc载体储液进行转导。
转导后4小时，将培养基用含有2μg/ml嘌呤霉素和2％L-谷氨酰胺的新鲜OptiProSFM培养基替换。转导后三天，通过冻融法(VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004)从转导的细胞制备粗裂解液。将在增补有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM中培养的COS-1细胞，用100微升每个嘌呤霉素抗性和pAM001转染的VeroSF细胞克隆的粗裂解液转导。随后在转导后两天，测试COS-1细胞的萤火虫萤光素酶表达，作为相应的嘌呤霉素抗性和pAM001转染的VeroSF细胞克隆中SV-Luc载体生产量的度量。选择表现出与COS-1细胞相当的萤光素酶表达水平的细胞克隆，对其进行繁殖和扩增，以产生细胞库。反复监测细胞克隆Vero-SF001-86的SV-Luc生产，该细胞克隆产生与COS-1相近量的重组SV40载体粒子。通过有限稀释法产生了Vero-SF001-86的被命名为Vero-SF001-86-01的细胞亚克隆，其重复地产生与亲代Vero-SF001-86细胞克隆相近量的重组SV40载体粒子。按照VeraM.等，MolecularTherapy10：780-791，2004的方法进行的定量PCR，显示出被称为SuperVero的细胞克隆Vero-SF001-86-01例行地产生每毫升细胞培养物1-10x1011个载体基因组拷贝。
实施例6：用于在SuperVero细胞中生产重组蛋白的载体的分子克隆
通过PCR从pTracer-SV40(Invitrogen)分离SV40复制原点，并将其克隆到萤火虫萤光素酶表达质粒pGL3(Promega)中，得到表达载体pAM006。然后用纯化的pAM006和对照pGL3表达载体DNA转染SuperVero细胞。转染后三天测量萤光素酶表达。用pAM6转染的SuperVero细胞与对照pGL3转染的细胞相比，产生显著更多的萤火虫萤光素酶。

Claims (10)

1.用于生产不能表达功能性多瘤病毒小T抗原的重组多瘤病毒载体粒子的方法，所述方法包含下列步骤：
a.提供能被野生型多瘤病毒感染的细胞系，所述细胞系含有被稳定地整合在细胞的基因组中的编码功能性多瘤病毒大T抗原的基因，但不含有编码功能性多瘤病毒小T抗原的基因，
b.在所述细胞系中导入不编码功能性多瘤病毒小T抗原并且不编码功能性多瘤病毒大T抗原的多瘤病毒DNA，
c.将所述细胞在生长培养基中，在其中细胞系生产大T抗原并允许重组多瘤病毒载体粒子形成的条件下进行培养，以及
d.从细胞培养物收获重组多瘤病毒载体粒子。
2.组合物，其包含超过一百万个不能表达功能性多瘤病毒小T抗原并且不表达功能性多瘤病毒大T抗原的重组多瘤病毒载体粒子，所述多瘤病毒粒子在能被野生型多瘤病毒感染的细胞中不能复制，其特征在于组合物不含能够在能被野生型多瘤病毒感染的细胞中复制的单个多瘤病毒粒子，其中所述细胞不表达功能性多瘤病毒大T抗原。
3.权利要求2的组合物，其中多瘤病毒是灵长类多瘤病毒。
4.权利要求3的组合物，其中多瘤病毒是猿猴多瘤病毒。
5.权利要求4的组合物，其中多瘤病毒选自SV40、SV12、嗜淋巴细胞多瘤病毒、非洲绿猴多瘤病毒和黑猩猩多瘤病毒。
6.权利要求5的组合物，其中多瘤病毒是SV40。
7.权利要求2至6任一项的组合物，其中能被野生型多瘤病毒感染的细胞选自Vero细胞、CHO细胞、MDCK、PerC.6、HEK293和CV1。
8.权利要求2至7任一项的组合物在制备用于治疗遗传病症、移植排斥、自体免疫疾病、传染病、过敏症或癌症的药物中的应用。
9.能被多瘤病毒感染的细胞系，所述细胞系含有被稳定地整合在细胞的基因组中的编码功能性多瘤病毒大T抗原的基因，但不含有编码功能性多瘤病毒小T抗原的基因，以及所述细胞系中的重组多瘤病毒载体粒子既不含有编码功能性多瘤病毒小T抗原的基因也不含有编码功能性多瘤病毒大T抗原的基因。
10.权利要求9的细胞系在生产重组蛋白中的应用。
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