TW201923074A - 具有對病毒生產有效負載低毒性之修飾的ec7細胞 - Google Patents

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Abstract

考慮了重組細胞及其方法，其允許重組病毒，特別是複製缺陷型Ad5病毒的快速及高力價產生。於一些較佳的方面，修飾宿主細胞以產生抑制劑，其減少或消除在該病毒中編碼的治療性蛋白質之表現，而於其他方面，該病毒包括一基因，該基因直接或間接減少或消除在該病毒中編碼的一治療性蛋白質之表現。最佳地，由宿主細胞編碼的shRNA將減少或抑制在該重組病毒中編碼的有效負載基因之表現。

Description

具有對病毒生產有效負載低毒性之修飾的EC7細胞
本發明之領域為重組細胞，特別是用於生產治療性重組病毒的經修飾的哺乳動物細胞，而該治療性重組病毒係用於癌症疫苗。
背景描述包括可用於理解本發明之資訊。這並非承認本文提供的任何資訊為現有技術或與在此主張的發明相關，或者具體或隱含地引用的任何出版物為現有技術。
本文中的所有出版物均以引用方式併入，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請被具體並單獨地指出透過引用併入。如果併入的參考文獻中術語的定義或用法與本文提供的術語的定義不一致或相反，則適用該術語的定義，且該術語在該參考文獻中的定義不適用。
使用病毒作為重組治療性蛋白質的遞送系統，以及在哺乳動物細胞中的蛋白質產生的基因療法在本領域中變得越來越被接受。雖然至少在概念上相對簡單，但仍遇到各種困難，且大多數的問題與病毒-宿主相互作用有關。
例如，腺病毒是充分具有特徵的dsDNA病毒，且通常能夠產生含有各種轉基因的腺病毒顆粒，以遞送至許多感興趣的細胞類型。腺病毒第5型代表這方面研究中最好的平台之一，在商業上有許多套組可用於產生使用者確定的病毒。以這種方式產生的腺病毒第5型已用於細胞培養、動物，甚至臨床試驗，進一步支援科學及臨床實踐者對該系統的熟悉。該病毒進入細胞被認為是透過柯薩奇病毒及腺病毒受體 (Coxsackie and Adenovirus receptor, CXADR)調節的。因此，限制了在不能產生CXADR的細胞或組織中使用腺病毒第5型的技術，因此阻礙了許多臨床相關細胞及組織的轉導，包括幹細胞及免疫細胞。
柯薩奇病毒及腺病毒受體 (CXADR)(Swiss-Prot登錄號：P78310)為第I型膜受體及免疫球蛋白超級家族的成員 (SScience (1997) 275; 1320 - 1323)。CXADR具有通常大於200個胺基酸的細胞外結構域，並且被認為是緊密連接完整性所必需的上皮頂端連接複合物的組成分 (J Biol Chem (1999) 274; 10219-10226)。CXADR可在宿主細胞中過度表現，從而獲得AD5病毒的入口通道。雖然這種重組細胞對Ad5轉染敏感，並且可能改善蛋白質產生，但是這樣的系統仍然存在各種缺點。最值得注意的是，在病毒作為治療實體的情況下，產生足夠量的重組病毒 (例如，1010 -1012 個病毒顆粒)通常是不一致的，且在某些情況下甚至是無法實現的。
例如，透過調節腺相關病毒的REP及CAP蛋白的表現以改善病毒力價已在先前被報導了，如在美國專利US 6548286、PCT申請案WO 98/46728，或美國專利申請US 2004/0043490中所報導的。 然而，由於腺相關病毒的REP及CAP蛋白的特異性以及這種病毒的生命週期，這種系統通常不會轉化為其他病毒系統。於另一種方法中，其中來自一重組核酸的一生產細胞中的蛋白質產生是由在一CHO細胞中表現的一重組基因所驅動的，該細胞在合成siRNA的存在下培養以抑制該重組蛋白的表現，且隨後在沒有siRNA的情況下允許產生所需的重組蛋白，如美國專利US 8273722中所公開的。然而，雖然這種系統增加到至少一定程度的所需重組蛋白質，但在該CHO細胞中既不被認為也不可能產生高力價的重組病毒。
因此，儘管本領域已知許多細胞生產系統及病毒載體，但仍需要以簡單有效的方式生產高力價重組病毒，特別是治療性病毒的系統及方法。
本發明之主題涉及產生高力價重組病毒之組合物及方法，特別是含有一個或多個編碼一治療性蛋白質(例如，腫瘤相關抗原、腫瘤新表位、多表位等)的核酸區段之重組腺病毒第5型。
於本發明主題之一方面，本案發明人考慮了一種產生一複數個重組治療性病毒之方法，其包括提供表現柯薩奇病毒及腺病毒受體 (CXADR)的一重組宿主細胞 (例如，CHO細胞或EC7細胞)(例如，來自一重組核酸序列)的步驟，且該重組宿主細胞經遺傳修飾以表現降低在該重組宿主細胞中一病毒有效負載基因表現的一重組實體；以及以一重組病毒轉染該重組宿主細胞的另一步驟，該重組病毒包含一編碼該病毒有效負載基因的核酸序列 (例如，細胞激素、嵌合蛋白、腫瘤相關抗原、新表位等)。於一更進一步的步驟中，該轉染的宿主細胞在減少在宿主細胞中病毒有效負載基因的表現並產生至少一預定的病毒力價的條件下培養。最典型，但非必要的是，該重組病毒為一腺病毒，尤其是E2b缺失的腺病毒第5型。
雖然在某些方面，該重組實體為一蛋白質 (例如，與該重組病毒上的一結合位點結合的轉錄抑制物，其中結合位點在一增強子/啟動子序列、5’UTR序列、一IRES序列，或一 3’-UTR序列)，該重組實體也可以是一核酸 (例如，siRNA、shRNA、反義RNA，或catRNA，其結合於該重組病毒的一RNA上的結合位點，例如一5’UTR序列、一IRES序列，或一3’-UTR序列)。
進一步考慮預定的病毒力價為至少108 或109 個病毒顆粒/ml，及/或在具有不同病毒有效負載基因的不同重組病毒中，在具有等於或小於20%，更佳為等於或小於10%，的可變性的時間段內達到該預定的病毒力價。
於本發明主題之另一方面，本案發明人考慮一種產生一複數個重組治療性病毒之方法，該方法包括一提供一宿主細胞的步驟，其表現在該宿主細胞中降低一病毒有效負載基因之表現的一實體，以及以一重組病毒轉染該宿主細胞的另一步驟，該重組病毒包含編碼該病毒有效負載基因的一核酸序列，並且還包括一結合該實體的序列或一編碼在該實體的重組病毒的一RNA上具有一結合位點的序列。於更進一步的步驟中，該轉染的宿主細胞在減少在該宿主細胞中病毒有效負載基因表現並產生至少一預定的病毒力價的條件下培養。最典型，但非必要的是，該重組病毒為一腺病毒，特別是E2b缺失的腺病毒第5型，該宿主細胞為一CHO細胞或一EC7細胞 (表現腺病毒聚合酶的HEK293細胞)，其可以任選地自一重組核酸序列表現CXADR。
在有需要時，該宿主細胞自一重組核酸表現該實體，或者該實體為未接觸過該宿主細胞的一實體 (例如，蛋白質或RNA)。同樣地，預期該重組病毒中的序列不需要是未接觸過該重組病毒的。
於本發明主題之另一方面，本案發明人還考慮一種產生一複數個重組治療性病毒之方法，其包括一提供一宿主細胞的步驟，該宿主細胞經遺傳工程改造以有條件地表現降低在該宿主細胞中一病毒有效負載基因表現的一實體；以及以包含編碼該病毒有效負載基因的一核酸序列的一重組病毒轉染該宿主細胞的另一步驟，並且還包括編碼一訊息序列的序列，該訊息序列觸發在該宿主細胞中該實體的條件表現。於又一步驟中，在減少在該宿主細胞中該病毒有效負載基因表現並產生至少一預定的病毒力價的條件下培養該轉染的宿主細胞。
如前所述，預期該宿主細胞可任選地自一重組核酸表現CXADR，且該實體為一DNA或RNA結合蛋白，或一RNA。此外，預期觸發條件表現的訊息序列編碼一轉錄因子。
在本發明主題的另一個方面，發明人考慮了一種產生一複數個重組治療性病毒之方法，其包括提供一宿主細胞的步驟，該宿主細胞經遺傳工程改造以表現一共同抑制物的一第一部分，該共同抑制因子減少在該宿主細胞中的一病毒有效負載基因的表現；以及以一重組病毒轉染該宿主細胞的另一步驟，該重組病毒包含編碼該病毒有效負載基因的一核酸序列，並且其進一步包含該共同抑制物的一第二部分，以及其中編碼該病毒有效負載基因的該核酸序列受該共同抑制物的控制。於又一步驟中，在減少在該宿主細胞中該病毒有效負載基因的表現並產生至少一預定的病毒力價的條件下培養該轉染的宿主細胞。
另外，本案本發明人還考慮了一種產生一複數個重組治療性病毒之方法，其包括提供一宿主細胞的步驟，該宿主細胞任選地被改造為在感染一病毒時缺乏干擾素γ的表現；以及以一重組病毒轉染該宿主細胞的另一步驟，該重組病毒包含編碼該病毒有效負載基因的一核酸序列，其中該編碼該病毒有效負載基因的核酸序列受一干擾素調節因子的控制 (例如，透過一IFN-刺激反應元素)。於又一步驟中，在產生至少一預定的病毒力價的條件下培養一轉染的宿主細胞。
因此，本案發明人還考慮了一種遺傳工程細胞，其包含編碼一實體的一重組核酸，該實體在以一重組病毒轉染的一宿主細胞中降低一病毒有效負載基因的表現，其中該實體結合該重組病毒的一RNA上的一結合位點。
預期的遺傳工程細胞還可以包含編碼一實體的一重組核酸，該實體降低在以一重組病毒轉染的一宿主細胞中一病毒有效負載基因的表現，其中該重組核酸受到該重組病毒編碼的一蛋白質或核酸的控制。
類似地，預期的遺傳工程細胞可包含編碼一共同抑制物的一第一部分的一重組核酸，當以一包含編碼該有效負載的一核酸的一重組病毒轉染該細胞時，該共同抑制物降低在該細胞中一病毒有效負載基因的表現。
此外，本案發明人進一步考慮了一遺傳工程細胞，其被修飾為在感染一病毒時缺乏干擾素γ的表現。
從以下較佳具體實施例的詳細描述以及附圖中，本發明主題的各種目的、特徵、方面，以及優點將變得更加明顯，附圖中相同的數字表示相同的部件。
本發明之主題提供了用於生產重組病毒治療劑的重組細胞、系統，及方法，特別是用於生產高力價的重組Ad5病毒，以一種跨越多種病毒套膜一致性表現的方式提供，該些病毒可以透過其重組有效負載 (例如，腫瘤相關抗原、新表位 (可以一多表位排列)、免疫調節分子、共刺激分子等)來區分。這種重組細胞、系統，以及方法將有利於允許產生理想的高力價的病毒，而不需依賴於重組有效負載，通常在可重現級可預測的時間範圍內。從另一個角度來看，預期的重組細胞、系統，以及方法使得能夠可靠地生產治療性病毒而不管該重組的有效負載，並且還允許在共同的生產計劃及生產環境下大量平行生產多種不同的治療性病毒。
因此，本文提供的系統及方法因此特別適合以高產率多重生產重組治療性病毒。通過使用各種方法減少或甚至完全消除在該宿主細胞 (病毒生產細胞)中該重組有效負載的表現而實現這些優點。雖然不限制本發明之主題，但通常較佳用於生產的宿主細胞經遺傳工程改造以減少或甚至完全消除重組有效負載在宿主細胞中的表現，從而實現“直接替換” 患者特異性病毒有效負載進入預製的“通用”治療性病毒載體。
如將容易理解的是，存在本領域已知的許多治療性病毒，而且所有這些病毒都被認為適用於本文。例如，預期的治療性病毒包括包膜病毒，如反轉錄病毒、慢病毒，或HSV-1，以及無包膜病毒，如腺-相關病毒與腺病毒 (可能是人類或非人類來源的，具有各種血清型)。因此，各種宿主細胞也被認為是合適的，而且治療性病毒的選擇將至少在某種程度上決定宿主細胞的選擇。此外，應當理解的是，宿主細胞也可進行遺傳修飾，以適應病毒的感染及/或繁殖，否則這些病毒不適用於沒有遺傳修飾的細胞。然而，特別較佳的治療性病毒包括人類及非人類 (例如，靈長類)來源的腺病毒。
例如，於本發明主題之一較佳方面，該治療性病毒為一複製缺陷型腺病毒第5型，其包括作為一有效負載的至少一種患者與腫瘤特異性新表位序列、一腫瘤相關抗原、一細胞激素、一超級因子 (例如，ALT803)、一嵌合蛋白 (例如，具有作為一目標結合部分的一scFv結構域以及提供所需生物效應的一效應子部分)、一共刺激分子、一檢查點抑制劑，以及一化學激活素。在進一步較佳的實施例中，CHO細胞或HEK293細胞作為病毒繁殖的宿主細胞。然而，CHO細胞與HEK293細胞通常不表現可檢測量的柯薩奇/腺病毒受體 (CXADR)的含量，因此通常以腺病毒第5型轉導是無效的。因此，應該注意的是，可以對這種 (以及缺乏CXADR表現的其他細胞)進行遺傳修飾以表現重組CXADR。此外，CHO細胞以及HEK293細胞通常也不表現Ad5的E1基因，因此將進一步進行遺傳修飾以在反式中表現並提供E1蛋白功能，其中使用複製缺陷型Ad5病毒。當腺病毒在E2b基因中具有進一步缺失時，這種互補是特別理想的 (參見例如，J Virol . 1998 Feb;72(2):926-33)，而且這種腺病毒是特別較佳的。
如此修飾的宿主細胞將為病毒進入以及將病毒表現載體遞送到宿主細胞中提供一個窗口。更具體而言，本案發明人發現可以修飾CHO細胞以表現CXADR，因此變得易受腺病毒第5型的病毒感染。實際上，本案發明人還發現攜帶導入表現CXADR的CHO細胞(CAR-CHO細胞)中的生物載體的E2b缺失的腺病毒導致後代病毒強烈、長期的產生。該結果表示CAR-CHO細胞可以作為治療性病毒的通用生產系統，這將顯著減少其生產的時間及成本。還預測該系統與用於商業生產的長期連續培養系統兼容。此外，本文考慮的系統及方法甚至可以適用於以最小的中間體操作連續生產各種不同的生物製劑。
例如，於本發明主題之一方面，可以將編碼CXADR的cDNA選殖到合適的表現質體 (例如，峰8-嘌呤黴素質體)中，其中基因表現來自強啟動子 (例如，EF-1α啟動子)。 當然，各種其他啟動子元件 (可以是可誘導的或組成型的)也被認為適用於本文。轉基因序列可以透過DNA定序驗證，並與例如參考數據集 (NP_001329.1)中CXADR同功型1的公開序列比對。然後使用本領域熟知的標準轉染方法將表現質體轉染到CHO細胞中。然後可以使用嘌呤黴素進行選擇用於製備細胞原液的轉染細胞。同樣地，應當理解的是，本發明之主題不限於特定的表現載體，而且實際上認為來自細胞中的核酸的所有表現方式都適用於本文。例如，在需要暫時表現的情況下，該核酸可以作為RNA或作為環狀染色體外DNA遞送而不具真核複製序列。另一方面，在需要永久表現的情況下，或需要用於大規模生產多種不同批次的治療性病毒的細胞株時，可以遞送該核酸用於整合到該細胞的基因組中，或者可以對該細胞進行基因組編輯 (例如，使用CRISPR/Cas9技術)以將表現匣插入至該宿主細胞的基因組中。
同樣地，應當理解的是，該CXADR基因的轉錄及轉譯控制可以顯著變化，而且合適的控制元件的適當選擇對於技術人員來說是顯而易見的。因此，表現可以來自組成型活性啟動子、來自使用相應誘導劑的誘導型啟動子，或來自在選定組織或培養條件下活化的啟動子。例如，表現可以在溫度敏感性啟動子的控制下驅動 (例如，BMC Biotechnol . 2011; 12;11:51)或在缺氧及金屬敏感啟動子的控制下 (參見例如，Gene Ther . 2006; 13(10):857-68)。因此，應當理解的是，適合於產生對腺病毒轉染不敏感的治療性病毒的細胞可以對感染敏感，並且對於大規模生產治療性病毒的遞送也是如此。當然，應當理解的是，相同的考慮也適用於病毒聚合酶的重組表現 (如果需要)以補償缺乏使用複製缺陷型病毒的酵素。示例性較佳的重組腺病毒及具有病毒聚合酶的細胞在其他地方被描述。
關於合適的病毒表現載體，預期許多病毒表現載體都是合適的。然而，如上所述，特別較佳的病毒表現載體為腺病毒表現載體，特別是E1、E2b，以及E3基因已被剔除(例如，J. Virol. 1998; Vol.72(2): p926-933)。值得注意的是，本案發明人已經觀察到如上所述的重組細胞中病毒有效負載的有效蛋白質表現可能干擾高力價的病毒顆粒的產生，特別是在需要產生治療量的重組病毒的情況下。例如，在至少一些實驗中，具有一些重組有效負載觀察到小於107 個病毒顆粒/ml，或甚至小於106 個病毒顆粒/ml，或甚至小於105 個病毒顆粒/ml的病毒力價 (或完全未能產生任何有意義的病毒力價)，而相同的病毒系統具有其他重組有效負載時，確實產生超過107 個病毒顆粒/ml的病毒力價，或超過108 個病毒顆粒/ml (和更高)。此外，在製備用於多個不同患者的多種不同病毒製劑的情況下，觀察到該製劑達到所需量的病毒顆粒 (例如，1011 個總病毒顆粒)之間的顯著時間延遲，這將阻礙許多需要在不同製劑之間同步的治療性病毒生產方案。
本案發明人現已發現，透過修飾宿主細胞及病毒基因組中的至少一種可以克服這種高力價的病毒生產問題，以減少甚至消除病毒有效負載的蛋白質產生對總產量及/或時間的干擾，以產生治療量的病毒，無論該病毒有效負載的類型及/或長度如何。最典型地，可修飾該宿主細胞以產生直接或間接干擾病毒核酸上編碼的基因的轉錄及/或轉譯及/或mRNA穩定性的實體。這種方法在至少一些具體實施例中是特別理想的 (其中該實體將不同病毒共有的序列作為目標)單批宿主細胞可以作為多種重組治療病毒的病毒生產平台而無需重新設計病毒。於另一方面，宿主細胞及病毒載體均可有助於一基因轉錄及/或轉譯抑制及/或mRNA穩定性，這是其 (特定)組合所獨有的。於其他實施例中，可以對宿主細胞進行遺傳工程改造以使其缺乏表現有效負載基因所需的轉錄因子。最佳地，將重組病毒進行工程改造，使得重組有效負載的表現抑制僅發生在宿主細胞中，而不發生在患者細胞中。
例如，如圖 1 中示意性所示，可以選擇及/或遺傳工程改造宿主細胞以包括編碼直接干擾一病毒有效負載表現的一實體的一基因 (例如，用於治療的重組基因，例如，作為一新表位、一共刺激分子、一檢查點抑制劑、一細胞激素等)存在於該病毒載體上。在宿主細胞 (尤其是在宿主基因組)中編碼的其他合適的實體中，特別考慮的實體包括選擇的蛋白質及RNA。例如，當該實體為一蛋白質時，該蛋白質可以結合該病毒載體上的一結合位點，其控制該病毒有效負載的轉錄，或者該蛋白質可以結合轉譯起始位點或核醣體結合位點或編碼該有效負載的一RNA的IRES。 類似地，該蛋白質也可以與該有效負載序列之前的序列的轉錄起始位點結合。於一些具體實施例中，該實體可以為與由該有效負載基因編碼的一胜肽相互作用的一蛋白質，而且該實體與該胜肽之間的相互作用誘導該胜肽的降解或不活化。於另一實施例中，當該實體為一核酸時，特別較佳的核酸包括與編碼該有效負載的mRNA結合的siRNA、shRNA、反義RNA，及/或catRNA，進而防止該有效負載的mRNA轉譯及/或不穩定，如以下進一步所詳細說明者。當然，該實體也可以從外部提供給該宿主細胞 (例如，透過各種方法，例如轉染、脂質轉染、電穿孔等)。
當編碼該有效負載的mRNA上沒有結合位點時，可以透過將一結合序列工程化至編碼該有效負載的mRNA以間接進行抑制，該有效負載較佳緊鄰該有效負載的編碼區的上游 (例如，在5’-UTR區域，或在轉譯起始區域內)，如圖 2 中示例性地描繪的那樣。然而，在替代方面，該實體的結合位點也可以在一IRES或2A位點處或附近，及/或在該mRNA的3’-UTR中。如前所述，合適的實體將包括核酸以及蛋白質。這種方法可能是特別有益的，因為該病毒載體上的目標序列可以被具有目的的選擇並置於適當的背景中以透過RNA去穩定化來實現對轉譯的抑制，例如，使用siRNA或shRNA (其可以從該宿主細胞基因組轉錄，如以下更詳細地進一步顯示或轉染至該宿主細胞中)。
在本發明主題之又一示例性方面，如圖 3 中示意性所示，該病毒載體可編碼一調節蛋白 (例如，轉錄因子)，其誘導一基因在該宿主細胞基因組中的表現 (或在該宿主細胞中的重組核酸)這反過來導致產生如上所述的實體，該實體將直接或間接地抑制或降低該有效負載的轉錄及/或轉譯及/或mRNA穩定性 (如圖1和2所示)。因此，在這樣的實施例中，應當理解的是，該實體的表現以該重組病毒核酸的存在為條件。這種條件表現被認為是特別有利的，因為該宿主細胞可以生長到相當大的密度而不受抑制系統的干擾，這可能是圖1及圖2的系統中的情況。類似地，圖 4 示意性地說明該宿主細胞與該病毒核酸之間的另一種合作方法，其中一共同抑制物的一部分由該宿主細胞的基因組編碼 (或在該細胞中的其他重組核酸)而另一部分在該重組病毒核酸上編碼。因此，在這樣的系統中，抑制該有效負載的表現再次取決於該宿主細胞中調節基因的存在。
圖 5 示意性地說明了另一種系統，其中該重組病毒核酸中該有效負載的表現以一因子的存在為條件，該因子不存在或消除於該宿主細胞中。在圖5的實施例中，該宿主細胞經遺傳修飾 (例如，經過目標的缺失、定點導向的誘變、基因組編輯等)以對病毒感染產生反應而不產生干擾素γ，而且配置該病毒的核酸使得該有效負載僅在存在干擾素γ的情況下表現，這可以透過使用該有效負載的上游的IFN刺激的反應元素來實現。於另一方面，如圖 6 中示意性所示，對該宿主細胞進行遺傳修飾以產生不會干擾該宿主細胞的細胞過程的shRNA，但是這抑制了由該病毒載體產生的重組RNA的轉譯。這種shRNA可以從修飾的宿主細胞基因組或該宿主細胞中的重組質體提供。
此外，應當理解的是，與抑制相關的序列不必限於該宿​​主基因組中存在的序列 (未接觸過的或透過遺傳工程)，但也可以由一重組質體或腺相關病毒上的序列提供，所述重組質體或腺相關病毒共感染該細胞，其中具有該有效負載的重組病毒為一腺病毒。因此，宿主細胞可以是一遺傳工程細胞，其包含編碼一實體的重組核酸，該實體在以一重組病毒轉染的一宿主細胞中降低一病毒有效負載基因的表現，其中該實體結合該重組病毒的一RNA上的結合位點。同樣地，所設想的細胞也可以被改造為包括編碼一實體的一重組核酸，該實體在以一重組病毒轉染的一宿主細胞中降低一病毒有效負載基因的表現，其中該重組核酸受該重組病毒編碼的蛋白質或核酸的控制。於進一步考慮的方面，該遺傳工程細胞還可以包含編碼共同抑制物的一第一部分的重組核酸，其減少在該細胞中一病毒有效負載基因的表現，當該細胞以包含一編碼該有效負載的核酸的一重組病毒轉染時，或在被一病毒感染後被修飾為缺乏干擾素γ的表現。
無論該重組病毒的有效負載的抑制表現方式如何，預期合適的系統將在達到一預定量的治療性病毒顆粒所需的產量及/或生產時間方面提供顯著改善的均勻性，而與該有效負載的含量及/或大小無關。例如，不同病毒製劑達到一預定目標力價或病毒顆粒總量之間所需的時間變化 (例如，目標力價為至少109 個病毒顆粒/ml，或一目標總量至少為1011 個病毒顆粒)被預期為等於或小於20%，更佳等於或小於15%，或等於或小於10%，或等於或小於5%。同樣地，在預定生產時間 (例如，6小時後，或8小時後，或12小時後，或18小時後，或24小時後，或36小時後等)的病毒顆粒的力價或總數通常變化不超過20%，更佳不超過​​15%，或不超過10%，或不超過5%。
因此，預期的系統及方法在病毒生產環境中將是特別有利的，其中多個及不同的病毒製劑在需要的多重或同步過程中製備，例如，協調處理步驟，例如病毒原料或細胞原液添加、培養基添加、冷卻、離心或過濾、包裝等。
於一些具體實施例中，用於描述及請求保護本發明某些具體實施例的表示成分的量、性質如濃度、反應條件等的數字應理解為在某些情況下由術語“約”修飾。因此，於某些具體實施例中，書面描述及所附之申請專利範圍中列出的數值參數為近似值，其可以根據特定具體實施例尋求獲得的所需性質而變化。於某些具體實施例中，數值參數應根據報告的有效數字的數量並透過應用普通的捨入技術來解釋。儘管闡述本發明的一些具體實施例的寬範圍的數值範圍及參數為近似值，但具體實施例中列出的數值盡可能精確地報告。在本發明的一些實施例中呈現的數值可能包含必然由其各自的測試測量中發現的標準偏差引起的某些誤差。
實施例
圖 7 描繪了抑制在一重組病毒中該重組有效負載表現的示例性選擇，其中可以抑制該mRNA的轉譯，例如，使用一TRiP系統 (參見例如，NATURE COMMUNICATIONS | 8:14834 | DOI: 10.1038/ncomms14834)，或者其中該mRNA的穩定性可以降低，如以下更詳細描述的，或者，其中編碼該有效負載的DNA區段的轉錄被減少或阻斷，這也在以下更詳細地描述。
例如，在一種抑制轉錄的示例性方法中，本案發明人使用λ抑制物和相應的操縱子序列與感興趣的基因組合，如圖 8 的上圖所示。於此，該重組核酸具有二個與二聚體λ抑制物結合的操縱子 (抑制物結合)序列部分OL 1以及OL 2。一旦該抑制物被結合，來自該啟動子PL 的轉錄被抑制，如劃線的虛線箭頭所示。由於該操縱子/抑制物可在細菌中操作，因此在真核系統中的使用通常需要一核定位序列以允許該λ抑制物轉移到該細胞核中。於本實施例中，該核定位序列在框架內編碼，其中插入的柔性連接子 (此處為：GS連接子)位於該λ抑制物的ORF的上游或下游，如圖8的兩個下部草圖中示意性所顯示，其中NLS為核定位序列，GS12為該柔性連接子，且λ rep為該λ抑制物。如將容易理解的是，該融合蛋白的表現可以從各種啟動子驅動。在本實施例中，使用該eF1α啟動子，並且從EC7細胞中的一表現載體表現該λ抑制物。
透過將操縱子序列元件OL1及OL2放置在該轉錄起始(以+1表示)的上游，以實現對目標基因 (此處為：GFP)的控制，該轉錄起始還包括轉錄起始上游的TATA盒以及轉錄起始下游的Kozak序列，接續為起始密碼子ATG，如圖 9 所示。此處，陽性對照組序列不具有操縱子序列元件OL1及OL2，並且包含該CMV啟動子、該TATA盒、該轉錄起始位點、一Kozak序列，以及該起始密碼子。然後在兩個位置測試操縱子序列元件OL1及OL2的放置：通過在該CMV啟動子序列的末端與轉錄起始 (跨越該TATA盒)之間插入OL1及OL2，或者透過替換該CMV啟動子序列的末端部分 (跨越該TATA盒)。圖 10 進一步描繪了該操縱子序列元件OL1及OL2的替代放置，進一步指示5’-及3’-非轉譯序列，其中CDS表示目標基因的編碼序列。
圖 11 描繪了表現λ抑制物的轉染的EC7宿主細胞的示例性結果，該λ抑制物具有自一表現質體表現的前導 (NLS-LR)或尾部 (LR-NLS)核定位序列。還以一第二重組表現質體轉染該重組EC7細胞，該第二重組表現質體攜帶 (a)未攜帶GFP基因， (b)不具有操縱子元件的GFP基因， (c)具有操縱子元件的GFP基因，其取代了該CMV啟動子序列末端的一部分，如圖9所示， (d) 該GFP基因，其具有在該CMV啟動子序列之後插入的操縱子序列元件，如圖9所示。從圖11中可以容易地看出，該操縱子序列元件的插入導致相對於對照組相等幅度的減少表現。值得注意的是，在該EC7細胞也表現該λ抑制物的情況下，轉錄基本上完全被廢除。因此，應當注意的是，可以使用該λ操縱子序列元件結合包括一核定位序列的一λ抑制物來有效地實施轉錄控制。
於另一種抑制轉錄的示例性方法中，本案發明人透過產生遺傳修飾的細胞測試如圖 12 中示意性顯示的系統，該遺傳修飾的細胞具有編碼shRNAs的生產細胞中的構築，該shRNAs被設計為結合該病毒載體或其他表現構築中發現的序列。圖12的右側部分顯示了具有編碼區的基因組DNA，該編碼區產生如所示的shRNAs，而圖12的左側部分描繪了一腺病毒表現系統的一部分，該系統包括具有在該3’-UTR中該shRNA的一個或多個結合位點的目標基因。例如，合適的shRNAs可以取自螢光素酶基因、b-內醯胺酶基因，及/或lacZ基因，而且該表現系統可以是病毒 (例如，AdV)或編碼一目標基因(例如，GFP)的質體DNA，具有一3’UTR分別含有來自螢光素酶、LacZ，及/或b-內醯胺酶的序列。
示例性測試系統的結果顯示於圖 13 中。於此處，本案發明人以具有一3’UTR的GFP轉基因瞬時轉染EC7生產細胞，該3’UTR含有取自三種不同異源基因之一的shRNA目標位點：螢光素酶、LacZ或b-內醯胺酶。編碼目標或非目標(陰性對照組)這些位點的shRNAs的DNA也被共轉染，並且透過流式細胞儀測量這些細胞中的GFP強度作為獲得轉基因表現的方式。在每種情況下，相較於非目標shRNAs，當存在以其3’UTR為目標的shRNAs時，GFP表現顯著下調。同樣地，圖 14 描繪了以編碼luc shRNA以及未轉染的對照組細胞的序列轉染的EC7生產細胞的結果。然後以攜帶該GFP基因以及一shRNA結合位點的表現載體監測GFP表現的轉染，如該圖的上圖所示。從結果中可以容易地看出，僅在表現luc shRNA，以及以一編碼具有luc shRNA結合位點的GFP的構築轉染的細胞中觀察到GFP的特異性下調。因此，應當理解的是，shRNA可以有效地下調轉基因貨物的表現。
因此，本案發明人考慮了一種示例性系統，其中該宿主細胞被遺傳修飾為從重組DNA的一片段暫時，更佳為永久地，產生一種或多種shRNA物種，該重組DNA的片段可以整合到該基因組中或作為染色體外單元被維持/提供。 隨後對這些物種的處理允許它們指向RNA誘導的沉默複合物 (RNA induced silencing complex, RISC)以降解攜帶互補目標序列的轉錄物。可以理解的是，透過將這些互補目標序列容納於該AdV5基因組中攜帶的轉基因的3'UTR中，出現的轉錄物被降解，從而防止了潛在基因產物的任何毒性作用。最佳地，選擇shRNAs使其不識別在該生產細胞中的內源基因。此外，還預期可以產生表現多種 (例如，至少兩種，或至少三種)不同shRNAs的重組構築/宿主細胞以及攜帶這些shRNAs中的每個目標位點的3’UTR以增強沉默的潛力。
於另一種控制轉錄的方法中，本案發明人使用了一種系統，其中重組IE86 (及其變體)在EC7生產細胞中表現。此處，IE86特異性結合一crs (順式抑制序列)序列元件，且其中該crs序列元件在一啟動子序列的一部分中，可以減少或抑制轉錄。圖15描繪了具有一CMV啟動子的一示例性啟動子序列，其後為多重選殖位點上游的一crs序列元件，其中可以放置一表現基因 (此處為：GFP)。為了使重組DNA對IE86的抑制敏感，細胞需要重組表現IE86。圖 16 描繪了在EC7細胞中從一表現質體 (pEAK8)重組表現IE86及其變體的示例性結果。可以容易地看出，所有重組形式在該生產細胞中表現良好。為了測試如此產生的IE86與變體形式的功能影響，以表現構築進一步轉染IE86表現細胞，該表現構築包括啟動子中的crs序列元件以控制GFP基因的表現。由圖 17 的結果可以看出，在該啟動子中包含crs序列元件的表現構築 (crs-shuttle-GFP)下調了也表現IE86的細胞中GFP基因的表現。圖 18 描繪了由流式細胞儀對轉染細胞的結果圖，如圖中所示：對於未轉染的所有細胞，未觀察到明顯的螢光，而對於以表現構築轉染的細胞則測量到高螢光，該表現構築包括在該啟動子中的crs序列元件 (crs-shuttle-GFP)，但未以編碼IE86或其變體的表現質體轉染。以表現構築轉染的細胞觀察到螢光減少，該表現構築包括在該啟動子中的crs序列元件 (crs-shuttle-GFP)並且以編碼IE86或其變體的表現質體轉染。
其他實施例：潛伏性膜蛋白1 (Latent membrane protein 1, LMP1)為艾伯斯坦-巴爾病毒 (Epstein Barr Virus, EBV)的完整膜蛋白，且在這些細胞中表現後誘導免疫活性細胞的各種變化，包括作為CD40模擬物激活樹突細胞與巨噬細胞。類似地，IPS-1 (干擾素-b啟動子刺激物1)透過誘導第I型干擾素與干擾素誘導型基因來活化樹突細胞。因此，LMP-1與IPS-1都被認為是用於免疫療法的有效共刺激分子，更具體地是表現腫瘤相關抗原的DNA疫苗。然而，在病毒複製期間LMP-1及/或IPS-1在宿主細胞中的表現可能影響宿主細胞中的病毒生產含量。
實施例 1 ：本案發明人考慮透過遺傳修飾該宿主細胞可以在宿主細胞中抑制LMP-1、IPS-1，或一融合蛋白LMP-IPS-1 (LMP1與IPS-1的N-端聚集結構域)的表現，以表現顯性負突變體干擾素調節轉錄因子3 (例如，IRF3-ΔN等)。於本實施例中，編碼該有效負載(LMP-1、IPS-1、LMP-IPS-1，有或沒有與腫瘤相關抗原偶聯) 的重組核酸還包括對IRF3有反應的啟動子 (例如，IFN-α啟動子、IFN-b啟動子等)，其可操作地偶聯於該有效負載基因。預期顯性負突變體IRF3抑制該有效負載基因的轉錄，使得該有效負載蛋白的表現可在宿主細胞中減少或消除。
實施例 2 ：本案發明人考慮透過遺傳修飾宿主細胞以在該宿主細胞抑制LMP-1、IPS-1，或一融合蛋白LMP-IPS-1的表現，以表現調節/抑制對於那些編碼序列側翼的LMP-1、IPS-1或5'-或3'-UTR特異的RNA (例如，shRNA、siRNA、miRNA等)。預期調節/抑制RNA可使有效負載基因的轉錄物不穩定及/或抑制其轉譯，使得該有效負載基因的表現可在宿主細胞中顯著減少或消除。於一些具體實施例中，可以對宿主細胞進行遺傳修飾以組成型表現調節/抑制RNA。在其他具體實施例中，可以對宿主細胞進行遺傳修飾以有條件地產生調節/抑制RNA。例如，該有效負載還可以包括在與其他有效負載基因 (LMP-1、IPS-1，或LMP-IPS-1)相同的啟動子下的開放閱讀框架中編碼蛻皮激素 (昆蟲類固醇激素)的核酸片段。 可以對該宿主細胞進行遺傳修飾以在一蛻皮激素反應性啟動子下表現調節/抑制RNA。於這樣的實施例中，調節/抑制RNA包括對LMP-1、IPS-1或LMP-IPS-1特異的RNA，以及至少一種對蛻皮激素特異的RNA，使得該有效負載僅在該有效負載基因開始轉錄時表現。 因此，調節/抑制RNA的表現以有效負載蛋白的表現為條件，且調節/抑制RNA可能不會在宿主細胞缺乏有效負載表現的情況下不必要地表現。
實施例 3 ：本案發明人考慮透過遺傳修飾宿主細胞，可以在該宿主細胞中抑制IPS-1或一融合蛋白LMP-IPS-1的表現，以表現使該有效負載不活化或分解的一結合分子，如此可以減少或消除源自該有效負載的對該宿主細胞的毒性及/或可以減弱該有效負載的任何功能。例如，該宿主細胞可以表現C型肝炎NS3-4a蛋白酶，其特異性切割IPS-1。於一些具體實施例中，該宿主細胞可以被遺傳修飾為組成型C型肝炎NS3-4a蛋白酶。在其他具體實施例中，可以對該宿主細胞進行遺傳修飾以有條件地產生C型肝炎NS3-4a蛋白酶。例如，可以對該宿主細胞進行遺傳修飾以在IRF3啟動子下表現C型肝炎NS3-4a蛋白酶，其對IPS-1訊息傳導下游的轉錄因子產生反應。於這樣的實施例中，僅當該有效負載基因開始轉錄並表現以啟動IPS-1訊息傳導途徑時，才表現C型肝炎NS3-4a蛋白酶。因此，C型肝炎NS3-4a蛋白酶的表現以該有效負載蛋白的表現為條件，並且在該宿主細胞不存在該有效負載表現時可能不會不必要地表現C型肝炎NS3-4a蛋白酶。
實施例 4 ：本案發明人考慮透過遺傳修飾宿主細胞，可以在宿主細胞中抑制IPS-1或一融合蛋白LMP-IPS-1的表現，以表現一種或多種shRNA分子，該shRNA分子將與IPS-1或融合蛋白的mRNA轉錄物結合，從而導致該mRNA的降解。為此，本案發明人產生了一種測試系統，其中透過由生產細胞 (例如，EC7細胞、CHO細胞等)穩定產生的短髮夾RNA (short hairpin RNAs, shRNAs)抑制轉基因貨物表現，從而允許無阻礙的病毒擴增。
如本文之描述及隨後的申請專利範圍中所使用的，“一”、“一個”以及“該”的含義包括複數指示物，除非上下文另有明確說明。此外，如在本文的描述中所使用的，除非上下文另有明確規定，否則“在...中”的含義包括“在…中”以及“在…上”。
如本文所用，且除非上下文另有指示，否則術語“耦合到”目的在包括直接耦合(其中兩個彼此耦合的元件彼此接觸)以及間接耦合(其中至少一個附加元件位於兩個元件之間)。因此，術語“耦合到”以及“與…耦合”為同義使用。
本文中對數值範圍的描述目的僅在於作為單獨提及落入該範圍內的每個單獨數值的簡寫方法。除非本文另有說明，否則將各個單獨的數值併入本說明書中，如同其在本文中單獨引用一樣。除非本文另有說明或上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何合適的順序進行。關於本文的某些實施例提供的任何及所有實施例或示例性語言 (例如“諸如”)的使用目的僅在於更好地說明本發明，而非對要求保護的本發明之範圍構成限制。說明書中的任何語言都不應被解釋為表示對於實施本發明為必要的任何未要求保護的元件。
對於本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本文的發明構思之情況下，除了已經描述的那些以外的更多修改是可能的。因此，除了所附之申請專利範圍的範圍之外，本發明的主題不受限制。此外，在解釋說明書及申請專利範圍時，所有術語應以與上下文一致的最廣泛之方式解釋。特別是，術語“包括”以及“包含”應被解釋為以非排他的方式指代元件、組件或步驟，指示所引用的元件、組件或步驟可以存在，或者被利用，或者與未明確引用的其他元件、組件或步驟組合。當說明書申請專利範圍涉及選自由A、B、C…以及N所組成之群組中的至少一種時，該文字應解釋為只需要該群組中的一個元件，而非A加N，或B加N等。
圖 1 描繪了根據本發明主題的一第一示例性表現系統。
圖 2 描繪了根據本發明主題的一第二示例性表現系統。
圖 3 描繪了根據本發明主題的一第三示例性表現系統。
圖 4 描繪了根據本發明主題的一第四示例性表現系統。
圖 5 描繪了根據本發明主題的一第五示例性表現系統。
圖 6 描繪了根據本發明主題的一第六示例性表現系統。
圖 7 描繪了用於抑制在一重組病毒中重組有效負載表現的示例性選擇。
圖 8 描繪了一宿主細胞的示例性遺傳修飾以產生一核定位的λ抑制物。
圖 9 描繪了一重組病毒的示例性遺傳修飾，其包括能夠結合該λ抑制物的操縱子序列。
圖 10 描繪了一重組病毒的進一步示例性遺傳修飾，該重組病毒具有能夠結合該λ抑制物的操縱子序列。
圖 11 描繪了抑制來自一重組病毒的報導基因表現的示例性結果，該重組病毒具有能夠結合該λ抑制物的操縱子序列。
圖 12 描繪了一重組病毒的示例性遺傳修飾，其中shRNA的結合序列包括能夠結合該λ抑制物的操縱子序列。
圖 13 描繪了使用圖12的表現系統的示例性結果。
圖 14 描繪了使用圖12的表現系統的進一步的示例性結果。
圖 15 描繪了在一啟動子下游具有一IE86反應性順式抑制序列 (cis repression sequence, crs)以抑制轉錄的一示例性構築。
圖 16 描繪了一凝膠的示例性結果，其說明了IE86及其變體在用於病毒生產的EC7宿主細胞中的表現。
圖 17 描繪了一凝膠的示例性結果，其說明了來自一載體構築的GFP的表現，該載體構築在EC7宿主細胞中使用重組IE86及其變體在一啟動子下游含有一IE86反應性順式抑制序列 (crs)。
圖 18 為一描繪在EC7宿主細胞中使用重組IE86及其變體抑制GFP表現的示例性結果的圖。

Claims (20)

  1. 一種產生一複數個重組治療性病毒之方法，包括： 提供一經遺傳修飾以產生一shRNA的重組宿主細胞，該shRNA降低在該重組宿主細胞中一病毒有效負載mRNA之表現，且其中該病毒有效負載mRNA在該shRNA的3’-UTR中具有一結合位點； 以一包含一編碼該病毒有效負載mRNA的核酸序列之重組病毒轉染該重組宿主細胞；以及 在減少在該宿主細胞中該病毒有效負載mRNA表現以及產生至少一預定的病毒力價之條件下培養該轉染的宿主細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該宿主細胞為一CHO細胞或一EC7細胞。
  3. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該宿主細胞進一步自一重組核酸中表現柯薩奇病毒及腺病毒受體 (Coxsackie and Adenovirus receptor, CXADR)。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該宿主細胞經遺傳修飾以產生至少一第二shRNA，該第二shRNA降低在該重組宿主細胞中病毒有效負載mRNA之表現，且其中該病毒有效負載mRNA在該第二shRNA的3’-UTR中具有一結合位點。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該宿主細胞經遺傳修飾以產生至少一第二shRNA，該第二shRNA降低在該重組宿主細胞中該第二有效負載mRNA之表現，且其中該第二病毒有效負載mRNA在該第二shRNA的3’-UTR中具有一結合位點。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該shRNA的產生在一誘導型啟動子的控制下。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該重組病毒為一腺病毒。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該腺病毒為一E2b缺失之腺病毒。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該病毒有效負載基因編碼一細胞激素、一嵌合蛋白、一腫瘤相關抗原，以及一新表位中的至少一種。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該預定的病毒力價為至少109 個病毒顆粒/ml。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中在具有不同病毒有效負載基因的不同重組病毒中具有等於或小於20%的可變性的時間段內達到該預定的病毒力價。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中在具有不同病毒有效負載基因的不同重組病毒中具有等於或小於10%的可變性的時間段內達到該預定的病毒力價。
  13. 一種重組病毒，包含一編碼一用於重組有效負載的mRNA之序列，並具有一3'-UTR區段，該3'-UTR區段具有至少一個一shRNA的結合位點，該shRNA在施用該病毒的患者細胞中不存在。
  14. 如申請專利範圍第13項之重組病毒，其中該病毒為一腺病毒。
  15. 如申請專利範圍第13-14項中任一項之重組病毒，其中該有效負載為一細胞激素、一嵌合蛋白、一腫瘤相關抗原，以及一新表位中的至少一種。
  16. 如申請專利範圍第13-15項中任一項之重組病毒，其中該結合位點係針對一螢光素酶shRNA、lacZ shRNA，或b-內醯胺酶shRNA。
  17. 如申請專利範圍第13-16項中任一項之重組病毒，其具有至少一個針對一第二shRNA的第二結合位點，該第二結合位點在施用該病毒的該患者細胞中不存在。
  18. 一種遺傳工程細胞，其包含一編碼一shRNA的重組核酸，當該遺傳工程細胞以一重組病毒轉染時，該shRNA降低在該遺傳工程細胞中一病毒有效負載基因之表現，且其中該shRNA結合於在由該重組病毒編碼的一mRNA上的一結合位點。
  19. 如申請專利範圍第42項之遺傳工程細胞，其中該重組核酸編碼至少一第二shRNA。
  20. 如申請專利範圍第42項之遺傳工程細胞，其中該遺傳工程細胞在由該遺傳工程細胞表現的一mRNA中不具有針對該shRNA的一結合位點。
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