CN111433356A - 对病毒生产有效载荷具有低毒性的经修饰的ec7细胞 - Google Patents

Abstract

设想了允许快速和高滴度产生重组病毒、尤其是复制缺陷型Ad5病毒的重组细胞及其方法。在一些优选的方面，宿主细胞经修饰以产生降低或消除在病毒中所编码的治疗性蛋白质的表达的抑制剂，而在其他方面，该病毒包括直接或间接降低或消除在该病毒中所编码的治疗性蛋白质的表达的基因。最优选地，由该宿主细胞编码的shRNA将降低或抑制在重组病毒中所编码的有效载荷基因的表达。

Description

对病毒生产有效载荷具有低毒性的经修饰的EC7细胞

本申请要求2017年10月10日提交的序列号为62/570,508和2108年2月21日提交的序列号为62/633,412的我们的共同未决的美国临时专利申请的优先权，将二者均通过引用并入本文。

技术领域

本发明的领域是重组细胞，并且尤其是用于产生用于癌症疫苗的治疗性重组病毒的经修饰的哺乳动物细胞。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指示通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

使用病毒作为重组治疗性蛋白质的递送系统以及在哺乳动物细胞中产生蛋白质的基因疗法在本领域中已变得越来越被接受。尽管至少在概念上相对简单，但仍遇到各种困难，并且大多数问题与病毒-宿主相互作用有关。

例如，腺病毒是充分表征的dsDNA病毒，并且通常允许产生含有各种转基因的腺病毒粒子，以递送至许多目的细胞类型。在这方面，5型腺病毒代表了研究最深入的平台之一，其中在商业领域有大量试剂盒可用于产生经使用者确定的病毒。以这种方式产生的5型腺病毒已用于细胞培养、动物试验以及甚至临床试验中，这进一步支持科学及临床实践者对此系统的熟悉。认为病毒进入细胞是经由柯萨奇病毒及腺病毒受体(CXADR)介导的。因此，在未能产生CXADR的细胞或组织的此类细胞中使用5型腺病毒技术受到限制，并因此阻碍了许多临床相关细胞和组织(包括干细胞和免疫细胞)的转导。

CXADR(Swiss-Prot登录号：P78310)是I型膜受体，并且是免疫球蛋白超家族的成员(Science[科学](1997)275；1320-1323)。CXADR具有通常大于200个氨基酸大小的细胞外结构域，并且被认为是对于紧密连接完整性必不可少的上皮顶部连接复合物的组分(JBiol Chem[生物化学杂志](1999)274；10219-10226)。CXADR可以在宿主细胞中过表达，从而获得AD5病毒的进入途径。尽管此类重组细胞对Ad5转染敏感并可能提高蛋白质的产生，但此类系统仍将存在各种缺陷。最值得注意的是，如果将病毒用作治疗性实体，则足够数量的重组病毒(例如，10¹⁰-10¹²个病毒粒子)的产生通常是不一致的，并且在一些情况下甚至是无法实现的。

例如，先前已经报道了对于一些腺相关病毒，通过调节腺相关病毒的REP和CAP蛋白的表达提高病毒滴度，如US 6548286、WO 98/46728或US 2004/0043490中所报道的。然而，由于腺相关病毒的REP和CAP蛋白的特异性以及这种病毒的生命周期，此类系统通常不会转化到其他病毒系统。在另一种方法中，如果在生产细胞中从重组核酸产生蛋白质是由在CHO细胞中表达的重组基因驱动的，则在合成siRNA的存在下培养细胞以抑制重组蛋白的表达，并且之后在不存在siRNA的情况下培养细胞以允许产生所需重组蛋白，如US 8273722中所披露的。然而，尽管此类系统至少在一定程度上增加了所需重组蛋白的数量，但是在所述CHO细胞中产生高滴度的重组病毒既无法设想又甚至不可行。

因此，尽管在本领域中已知许多细胞生产系统和病毒载体，但仍需要以简单有效的方式产生高滴度重组病毒并且尤其是治疗性病毒的系统和方法。

发明内容

本发明的主题涉及产生高滴度重组病毒并且尤其是5型重组腺病毒的组合物和方法，这些重组病毒含有编码治疗性蛋白质(例如，肿瘤相关抗原、肿瘤新表位、多表位等)的一个或多个核酸区段。

在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种产生多个重组治疗性病毒的方法，该方法包括：提供重组宿主细胞(例如，CHO细胞或EC7细胞)的步骤，该重组宿主细胞表达CXADR(例如，从重组核酸序列)并且经基因修饰以表达降低病毒有效载荷(payload)基因在该重组宿主细胞中的表达的重组实体；以及用重组病毒转染该重组宿主细胞的另一个步骤，该重组病毒包含编码该病毒有效载荷基因(例如，细胞因子、嵌合蛋白、肿瘤相关抗原、新表位等)的核酸序列。在再另一个步骤中，在降低该病毒有效载荷基因在该宿主细胞中的表达并产生至少一个预定病毒滴度的条件下培养所转染的宿主细胞。最典型地，但非必需地，该重组病毒是腺病毒，并且尤其是E2b缺失型5型腺病毒。

尽管在一些方面，该重组实体是蛋白质(例如，与重组病毒上的结合位点结合的转录阻遏物，其中该结合位点位于增强子/启动子序列、5’UTR序列、IRES序列或3’-UTR序列中)，该重组实体还可以是核酸(例如，与重组病毒的RNA上的结合位点(例如，该结合位点位于5’UTR序列、IRES序列或3’-UTR序列中)结合的siRNA、shRNA、反义RNA或catRNA)。

进一步设想该预定病毒滴度为至少10⁸或10⁹个病毒粒子/ml，和/或在具有不同病毒有效载荷基因的不同重组病毒之间变异性等于或小于20％、并且更优选等于或小于10％的时间段内达到该预定病毒滴度。

在本发明主题的另一个方面，诸位发明人设想了一种产生多个重组治疗性病毒的方法，该方法包括：提供宿主细胞的步骤，该宿主细胞表达降低病毒有效载荷基因在宿主细胞中的表达的实体；以及用重组病毒转染该宿主细胞的另一个步骤，该重组病毒包含编码病毒有效载荷基因的核酸序列并且进一步包含如下序列，该序列结合实体或编码在重组病毒RNA上具有针对实体的结合位点的序列。在再另一个步骤中，在降低该病毒有效载荷基因在该宿主细胞中的表达并产生至少一个预定病毒滴度的条件下培养所转染的宿主细胞。最典型地，但非必需地，该重组病毒是腺病毒，并且尤其是E2b缺失型5型腺病毒，并且该宿主细胞是可任选地从重组核酸序列表达CXADR的CHO细胞或EC7细胞(表达腺病毒聚合酶的HEK293细胞)。

在需要时，宿主细胞从重组核酸表达实体，或实体是对宿主细胞而言天然的实体(例如，蛋白质或RNA)。同样，设想重组病毒中的序列对重组病毒而言不必是天然的。

在本发明主题的另外一方面，诸位发明人还设想了产生多个重组治疗性病毒的方法，该方法包括：提供宿主细胞的步骤，该宿主细胞经基因工程改造以有条件地表达降低病毒有效载荷基因在该宿主细胞中的表达的实体；以及用重组病毒转染该宿主细胞的另一个步骤，该重组病毒包含编码该病毒有效载荷基因的核酸序列，并且进一步包含如下序列，该序列编码触发该实体在该宿主细胞中有条件的表达的信号传导序列。在又另一个步骤中，在降低该病毒有效载荷基因在该宿主细胞中的表达并产生至少一个预定病毒滴度的条件下培养所转染的宿主细胞。

如前所述，设想该宿主细胞可任选地从重组核酸表达CXADR，并且该实体是DNA结合蛋白或RNA结合蛋白、或RNA。此外，设想触发有条件的表达的信号传导序列编码转录因子。

在本发明主题的再另一个方面，诸位发明人设想了一种产生多个重组治疗性病毒的方法，该方法包括：提供宿主细胞的步骤，该宿主细胞经基因工程改造以表达降低病毒有效载荷基因在该宿主细胞中的表达的共阻遏物的第一部分；以及用重组病毒转染该宿主细胞的另一个步骤，该重组病毒包含编码该病毒有效载荷基因的核酸序列，并且进一步包含该共阻遏物的第二部分，并且其中编码该病毒有效载荷基因的核酸序列处于该共阻遏物的控制下。在又另一个步骤中，在降低该病毒有效载荷基因在该宿主细胞中的表达并产生至少一个预定病毒滴度的条件下培养所转染的宿主细胞。

另外，诸位发明人还设想了一种产生多个重组治疗性病毒的方法，该方法包括：提供宿主细胞的步骤，该宿主细胞任选地经工程改造以在感染病毒后缺乏干扰素γ的表达；以及用重组病毒转染该宿主细胞的另一个步骤，该重组病毒包含编码该病毒有效载荷基因的核酸序列，其中编码该病毒有效载荷基因的核酸序列处于干扰素调节因子的控制下(例如，经由IFN刺激的应答元件)。在又另一个步骤中，在产生至少一个预定病毒滴度的条件下培养所转染的宿主细胞。

因此，诸位发明人还设想了一种经基因工程改造的细胞，该经基因工程改造的细胞包含编码实体的重组核酸，该实体降低病毒有效载荷基因在用重组病毒转染的宿主细胞中的表达，其中该实体与该重组病毒的RNA上的结合位点结合。

设想的经基因工程改造的细胞还可以包含编码实体的重组核酸，该实体降低病毒有效载荷基因在用重组病毒转染的宿主细胞中的表达，其中该重组核酸处于由该重组病毒编码的蛋白质或核酸的控制下。

相似地，设想的经基因工程改造的细胞可以包含对共阻遏物的第一部分进行编码的重组核酸，当用包含编码有效载荷的核酸的重组病毒转染细胞时，该共阻遏物降低病毒有效载荷基因在该细胞中的表达。

另外，诸位发明人进一步设想了一种经基因工程改造的细胞，该经基因工程改造的细胞经修饰以在感染病毒后缺乏干扰素γ的表达。

从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。

附图说明

图1描绘了根据本发明主题的第一示例性表达系统。

图2描绘了根据本发明主题的第二示例性表达系统。

图3描绘了根据本发明主题的第三示例性表达系统。

图4描绘了根据本发明主题的第四示例性表达系统。

图5描绘了根据本发明主题的第五示例性表达系统。

图6描绘了根据本发明主题的第六示例性表达系统。

图7描绘了用于抑制重组有效载荷在重组病毒中的表达的示例性选择。

图8描绘了宿主细胞的示例性基因修饰，以产生核定位的λ阻遏物。

图9描绘了重组病毒的示例性基因修饰，该重组病毒包括能够结合λ阻遏物的操纵子序列。

图10描绘了重组病毒的另外的示例性基因修饰，该重组病毒具有能够结合λ阻遏物的操纵子序列。

图11描绘了用于抑制报告基因从重组病毒表达的示例性结果，该重组病毒具有能够结合λ阻遏物的操纵子序列。

图12描绘了重组病毒的示例性基因修饰，针对shRNA的结合序列包括能够结合λ阻遏物的操纵子序列。

图13描绘了使用图12的表达系统的示例性结果。

图14描绘了使用图12的表达系统的另外的示例性结果。

图15描绘了示例性构建体，其在启动子下游具有IE86应答性顺式阻遏序列(crs)以抑制转录。

图16描绘了凝胶的示例性结果，其展示了IE86及其变体在用于病毒生产的EC7宿主细胞中的表达。

图17描绘了凝胶的示例性结果，其展示了在EC7宿主细胞中使用重组IE86及其变体从载体构建体表达GFP，该载体构建体包含在启动子下游的IE86应答性顺式阻遏序列(crs)。

图18是描绘了在EC7宿主细胞中使用重组IE86及其变体抑制GFP表达的示例性结果的图。

具体实施方式

本发明的主题提供了用于产生重组病毒治疗剂，以及尤其是用于以提供多种病毒之间的一致包膜性能的方式产生高滴度重组Ad5病毒的重组细胞、系统和方法，这些病毒通过它们的重组有效载荷(例如，肿瘤相关抗原、新表位(其可布置在多表位中)、免疫调节分子、共刺激分子等)进行区分。此类重组细胞、系统和方法将有利地允许通常在可再现和可预测的时间范围内产生与重组有效载荷无关的所需高滴度病毒。从另一个角度来看，设想的重组细胞、系统和方法实现可靠地产生治疗性病毒而不管重组有效载荷如何，并且进一步允许在共同的生产计划和生产环境下大规模并行地产生多种不同的治疗性病毒。

因此，本文提供的系统和方法将因此特别适合以高产率多重产生重组治疗性病毒。通过使用各种方法降低或甚至完全消除重组有效载荷在宿主细胞(病毒生产细胞)中的表达，可以实现此类优势。尽管不限于本发明的主题，但是通常优选的是，用于生产的宿主细胞经基因工程改造以降低或甚至完全消除重组有效载荷在宿主细胞中的表达，从而使得能够将患者特异性病毒有效载荷“直接替换(drop-in replacement)”至预先制造的“通用(generic)”治疗性病毒载体中。

如将容易理解的，本领域中已知许多治疗性病毒，并且所有这些治疗性病毒被认为适用于本文。例如，设想的治疗性病毒包括包膜病毒(例如逆转录病毒)、慢病毒、或HSV-1、以及非包膜病毒，例如腺相关病毒和腺病毒(其可以是人源或非人源的，具有多种血清型)。因此，多种宿主细胞也被认为是合适的，并且治疗性病毒的选择将在至少一定程度上决定宿主细胞的选择。此外，应理解的是，宿主细胞还可以经基因修饰以适应病毒的感染和/或繁殖，原本该病毒不适用于未经基因修饰的此类细胞。然而，尤其优选的治疗性病毒包括人源和非人源(例如，灵长类动物源)的腺病毒。

例如，在本发明主题的一个优选方面，治疗性病毒是复制缺陷型5型腺病毒，其包含作为有效载荷的以下中的至少一种：患者和肿瘤特异性新表位序列、肿瘤相关抗原、细胞因子、超级因子(例如，ALT803)、嵌合蛋白(例如，具有scFv结构域(作为靶结合部分)和效应子部分以提供所需的生物学效应)、共刺激分子、检查点抑制剂和趋化因子。在进一步优选的实例中，将CHO或HEK293细胞用作用于病毒繁殖的宿主细胞。然而，CHO和HEK293细胞通常不表达可检测的量水平的柯萨奇病毒/腺病毒受体(CXADR)，并因此通常无法高效地被5型腺病毒转导。因此，应指出的是，此类细胞(以及其他缺乏CXADR表达的细胞)可以经基因修饰以表达重组CXADR。此外，CHO和HEK293细胞通常也不表达Ad5的E1基因，并因此将进一步经基因修饰以在使用复制缺陷型Ad5病毒的情况下反式表达并提供E1蛋白功能。当腺病毒在E2b基因中具有另一个缺失时，这种互补是特别理想的(参见，例如，J Virol.[病毒学杂志]1998年2月；72(2):926-33)，并且此类腺病毒是特别优选的。

因此，经修饰的宿主细胞将为病毒进入和将病毒表达载体递送至宿主细胞提供窗口。更具体地，诸位发明人发现CHO细胞可以经修饰以表达CXADR，并因此变得对5型腺病毒导致的病毒感染易感。实际上，诸位发明人还发现，将携带生物货物(cargo)的E2b缺失型腺病毒引入表达CXADR的CHO细胞(CAR-CHO细胞)中，导致子代病毒长期稳健的产生。此结果表明CAR-CHO细胞可以充当治疗性病毒的通用生产系统，这将显著减少其产生时间和成本。还预期此系统与用于商业生产的长期连续培养系统相容。此外，本文设想的系统和方法甚至可以适用于以最少的中间体操作而连续生产各种不同的生物制剂。

例如，在本发明主题的一个方面，可以将编码CXADR的cDNA克隆至合适的表达质粒(例如，peak8-嘌呤霉素质粒)中，其中基因表达由强启动子(例如，EF-1α启动子)驱动。当然，多种其他启动子元件(可以是诱导型或组成型的)也被认为适用于本文。转基因序列可以通过DNA测序验证，并且可以与例如参考数据集(NP_001329.1)中CXADR同种型1的已公开序列进行比对。然后使用如本领域熟知的标准转染方案将表达质粒转染到CHO细胞中。然后可以使用嘌呤霉素选择经转染的细胞以用于制备细胞储液。同样，应理解的是，本发明的主题不限于特定的表达载体，并且实际上在细胞中从核酸表达的所有方式均被认为适用于本文。例如，在需要瞬时表达的情况下，可以将核酸在没有真核复制序列的情况下作为RNA或作为环状染色体外DNA递送。另一方面，在需要永久表达的情况下，或在需要用于大规模生产多个不同批次的治疗性病毒的细胞系的情况下，可以递送核酸以整合至细胞的基因组中，或者可以对细胞进行基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9技术)，从而将表达盒安装到宿主细胞的基因组中。

同样，应理解的是，CXADR基因的转录和翻译控制可以变化很大，并且合适的控制元件的适当选择对于本领域技术人员将是易于清楚的。因此，表达可以由组成型活性启动子、由诱导型启动子使用相应诱导剂、或由在所选组织或培养条件下活化的启动子驱动。例如，可以在温度敏感性启动子的控制下(例如，BMC Biotechnol.[BMC生物技术]2011；12；11:51)或在缺氧和金属敏感性启动子的控制下(参见，例如，Gene Ther.[基因疗法]2006；13(10):857-68)驱动表达。因此，应理解的是，可以使适于产生治疗性病毒的细胞(原本不易受腺病毒转染)对感染敏感，并对递送治疗性病毒的大规模生产具有敏感性。当然，应理解的是，相同的考虑也适用于病毒聚合酶的重组表达(需要时)，以补偿在使用复制缺陷型病毒的情况下该酶的缺乏。在其他地方描述了示例性优选的重组腺病毒和具有病毒聚合酶的细胞。

关于合适的病毒表达载体，设想许多病毒表达载体是适当的。然而，并且如上所述，尤其优选的是，病毒表达载体是腺病毒表达载体，并且特别地E1、E2b和E3基因已从腺病毒表达载体缺失(例如，J.Virol.[病毒学杂志]1998；72卷(2):926-933页)。值得注意的是，诸位发明人已经观察到如上所述的病毒有效载荷在重组细胞中的高效蛋白表达可干扰高滴度病毒粒子的产生，尤其是在希望产生治疗数量的重组病毒的情况下如此。例如，在至少一些实验中，使用一些重组有效载荷观察到小于10⁷个病毒粒子/ml、或甚至小于10⁶个病毒粒子/ml、或甚至小于10⁵个病毒粒子/ml的病毒滴度(或完全无法产生任何有意义的病毒滴度)，而相同的病毒系统使用其他重组有效载荷确实产生了超过10⁷个病毒粒子/ml、或超过10⁸个病毒粒子/ml(及更高)的病毒滴度。此外，在为多个不同患者制备了多种不同病毒制剂的情况下，观察到制剂之间达到所需数量的病毒粒子(例如，10¹¹个总病毒粒子)的显著时间延迟，这将妨碍需要不同制剂之间的同步性的许多治疗性病毒生产方案。

诸位发明人现已发现，通过修饰宿主细胞和病毒基因组中的至少一种以降低或甚至消除病毒有效载荷的蛋白质生产对总产量和/或用以产生治疗量的病毒的时间的干扰(不论病毒有效载荷的类型和/或长度如何)，可以克服此类高滴度病毒生产问题。最典型地，可以修饰宿主细胞以产生直接或间接干扰在病毒核酸上编码的基因的转录和/或翻译和/或mRNA稳定性的实体。这种方法是尤其理想的，因为在至少一些实施例中(其中实体靶向不同病毒共有的序列)，单批次的宿主细胞可以充当多种重组治疗性病毒的病毒生产平台，而无需对病毒进行重新工程改造。另一方面，宿主细胞和病毒载体均可促成它们的(特异性)组合特有的基因转录和/或翻译抑制和/或mRNA稳定性。在再其他实例中，可以对宿主细胞进行基因工程改造以使其缺乏表达有效载荷基因所需的转录因子。最优选地，将对重组病毒进行工程改造，使得重组有效载荷表达的抑制仅在宿主细胞中发生而不在患者细胞中发生。

例如，如图1中示意性所展示，可以对宿主细胞选择和/或基因工程改造以使其包括编码实体的基因，该实体直接干扰存在于病毒载体上的病毒有效载荷(例如，用于疗法的重组基因，例如新表位、共刺激分子、检查点抑制剂、细胞因子等)的表达。在宿主细胞中(并且尤其在宿主基因组中)编码的其他合适的实体中，尤其设想的实体包括所选择的蛋白质和RNA。例如，在实体是蛋白质的情况下，蛋白质可以与控制病毒有效载荷转录的病毒载体上的结合位点结合，或者蛋白质可以与编码有效载荷的RNA的翻译起始位点或核糖体结合位点或IRES结合。相似地，蛋白质还可以与有效载荷序列之前的序列的转录起始位点结合。在一些实施例中，实体可以是与由有效载荷基因编码的肽相互作用的蛋白质，并且该实体与该肽之间的相互作用诱导该肽的降解或失活。在另一个实例中，当实体是核酸时，尤其优选的核酸包括与编码有效载荷的mRNA结合的siRNA、shRNA、反义RNA和/或catRNA，从而防止翻译和/或使有效载荷的mRNA不稳定，如更详细地在下文中进一步显示的。当然，实体也可以从外部提供给宿主细胞(例如，通过各种方法如转染、脂质转染、电穿孔等)。

如果在编码有效载荷的mRNA上没有可用的结合位点，则可以通过将结合序列工程改造到编码有效载荷的mRNA中来间接进行抑制，该结合序列优选紧邻有效载荷的编码区的上游(例如，在5’-UTR区或在翻译起始区)，如图2中示例性所描绘的。然而，在替代性的方面，针对实体的结合位点还可以在mRNA的IRES或2A位点处或附近，和/或在3’-UTR中。如前所述，合适的实体将包括核酸以及蛋白质。这种方法可能是特别有益的，因为可以有目的地选择病毒载体上的靶序列并将该靶序列置于适当的背景中，以通过RNA不稳定化，例如使用siRNA或shRNA(其可以从宿主细胞基因组中转录(如更详细地在下文中进一步显示的)或转染至宿主细胞中)来实现对翻译的抑制。

在本发明主题的再另一个示例性方面，如图3中示意性所示，病毒载体可以编码调节蛋白(例如，转录因子)，该调节蛋白诱导基因在宿主细胞基因组(或宿主细胞中的重组核酸)上的表达，进而导致上述实体的产生，该实体将直接或间接抑制或降低病毒有效载荷的转录和/或翻译和/或mRNA稳定性(如图1和2中所示)。因此，在这样的实例中，应理解的是，实体的表达以重组病毒核酸的存在为条件。认为这种有条件的表达是尤其有利的，因为宿主细胞可以生长至相当大的密度而不干扰抑制系统，如在图1和图2的系统中可能是这种情况。相似地，图4示意性地展示了宿主细胞与病毒核酸之间的又另一种协作方法，其中共阻遏物的一部分由宿主细胞的基因组(或细胞中的其他重组核酸)编码，而另一部分在重组病毒核酸上编码。因此，在此类系统中，有效载荷表达的抑制又以宿主细胞中调节基因的存在为条件。

图5示意性地展示了又另一种系统，其中有效载荷在重组病毒核酸中的表达以宿主细胞中不存在或消除的因子的存在为条件。在图5的实例中，对宿主细胞进行基因修饰(例如，通过靶向缺失、定点诱变、基因组编辑等)从而不产生响应于病毒感染的干扰素γ，并且对病毒的核酸进行配置使得仅在干扰素γ的存在下表达有效载荷，这可以通过使用有效载荷上游的IFN刺激的应答元件来实现。另一方面，如图6中示意性所展示，宿主细胞经基因修饰以产生shRNA，该shRNA将不干扰宿主细胞的细胞过程但抑制由病毒载体产生的重组RNA的翻译。这种shRNA可以从经修饰的宿主细胞基因组或从宿主细胞中的重组质粒提供。

另外，应理解的是，与抑制有关的序列不必限于在宿主基因组中存在的序列(天然序列或通过基因工程改造的序列)，还可以通过共同感染细胞的重组质粒或腺相关病毒上的序列来提供，其中具有有效载荷的重组病毒是腺病毒。因此，宿主细胞可以是经基因工程改造的细胞，该经基因工程改造的细胞包含编码实体的重组核酸，该实体降低病毒有效载荷基因在用重组病毒转染的宿主细胞中的表达，其中该实体与该重组病毒的RNA上的结合位点结合。同样，设想的细胞也可以经工程改造以包括编码实体的重组核酸，该实体降低病毒有效载荷基因在用重组病毒转染的宿主细胞中的表达，其中该重组核酸处于由该重组病毒编码的蛋白质或核酸的控制下。在又另外设想的方面，经基因工程改造的细胞还可以包含对共阻遏物的第一部分进行编码的重组核酸，当用包含编码该有效载荷的核酸的重组病毒转染该细胞时，或者该细胞经修饰为在感染病毒后缺乏干扰素γ的表达时，该共阻遏物降低病毒有效载荷基因在该细胞中的表达

无论抑制重组病毒的有效载荷表达的方式如何，设想合适的系统将在产量和/或达到预定数量的治疗性病毒粒子所需的生产时间方面提供显著改善的一致性，而与有效载荷的内容物和/或大小无关。例如，设想不同病毒制剂之间达到病毒粒子的预定目标滴度或总数量(例如，目标滴度为10⁹个病毒粒子/ml，或目标总量为至少10¹¹个病毒粒子)所需的时间的变异性等于或小于20％、更优选等于或小于15％、或者等于或小于10％、或者等于或小于5％。同样，在预定生产时间(例如，6小时后、或8小时后、或12小时后、或18小时后、或24小时后、或36小时后等)病毒粒子的滴度或总数通常变化不超过20％、更优选不超过15％、或不超过10％、或不超过5％。

因此，设想的系统和方法在病毒生产环境中将是特别有利的，在该环境中，以多重或同步过程制备多种不同的病毒制剂，这些过程需要例如协调的处理步骤，如添加病毒储液或细胞储液、添加培养基、冷却、离心或过滤、包装等。

在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表示成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施例中，书面说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例试图获得的所需特性而变化。在一些实施例中，数值参数应按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本发明一些实施例的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可实行地精确地报告。在本发明的一些实施例中呈现的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。

实例

图7描绘了用于抑制重组有效载荷在重组病毒中的表达的示例性选择，其中可以例如使用TRiP系统抑制mRNA的翻译(参见，例如，NATURE COMMUNICATIONS[自然通讯]|8:14834|DOI:10.1038/ncomms14834)，或者其中mRNA的稳定性可以被降低(如更详细地在下文中描述的)，或者其中编码有效载荷的DNA区段的转录被降低或阻断(如更详细地也在下文中描述的)。

例如，在抑制转录的一个示例性方法中，诸位发明人将λ阻遏物和相应的操纵子序列与目的基因组合使用，如图8的上图示意性所描绘。在此，重组核酸具有与二聚体λ阻遏物结合的两个操纵子(阻遏物结合)序列部分O_L1和O_L2。一旦结合阻遏物，如划掉的虚线箭头所指示，抑制从启动子P_L的转录。由于操纵子/阻遏物在细菌中是可操作的，在真核系统中使用通常需要核定位序列以允许将λ阻遏物转移到核中。在本实例中，核定位序列与中间柔性接头(在此为GS接头)被同框编码，位于λ阻遏物的ORF的上游或下游，如图8的两个下部略图示意性所示，其中NLS是核定位序列，GS12是柔性接头，λrep是λ阻遏物。如将容易理解的，融合蛋白的表达可以由多种启动子驱动。在本实例中，采用eF1α启动子，并且在EC7细胞中从表达载体表达λ阻遏物。

通过将操纵子序列元件OL1和OL2恰好置于转录起始处(用+1表示)的上游实现对目的基因(在此为GFP)的控制，该转录起始处还包括转录起始处上游的TATA框和转录起始处下游的Kozak序列，随后是起始密码子ATG，如图9中示例性所示。在此，阳性对照序列不具有操纵子序列元件OL1和OL2，并且包含CMV启动子、TATA框、转录起始位点、Kozak序列和起始密码子。然后在两个位置测试了操纵子序列元件OL1和OL2的布置：通过在CMV启动子序列的末端与转录起始处之间插入OL1和OL2(跨越TATA框)，或者通过替换CMV启动子序列的末端部分(跨越TATA框)。图10进一步描绘了操纵子序列元件OL1和OL2的替代性布置，其中进一步指示了5’-和3’-非翻译序列，其中CDS表示目的基因的编码序列。

图11描绘了表达λ阻遏物的经转染的EC7宿主细胞的示例性结果，该λ阻遏物具有从表达质粒表达的前导(NLS-LR)或尾部(LR-NLS)核定位序列。还用第二重组表达质粒转染重组EC7细胞，该第二重组表达质粒携带(a)无GFP基因，(b)不含操纵子序列元件的GFP基因，(c)其中操纵子序列元件替换了部分CMV启动子序列末端的GFP基因，如图9中所示，和(d)其中在CMV启动子序列之后插入了操纵子序列元件的GFP基因，如图9中所示。从图11可以容易地看出，操纵子序列元件的插入导致与对照相比表达降低(以相等幅度)。值得注意的是，在EC7细胞还表达λ阻遏物的情况下，转录基本上被完全消除。因此，应注意的是，可以使用λ操纵子序列元件结合包括核定位序列的λ阻遏物来有效地实施转录控制。

在抑制转录的另一种示例性方法中，诸位发明人通过在编码shRNA的生产细胞中生成具有构建体的经基因修饰的细胞测试了如图12中示意性所示的系统，这些shRNA被设计为结合病毒载体或其他表达构建体中发现的序列。图12的右侧部分显示了具有产生所示shRNA的编码区的基因组DNA，而图12的左侧部分描绘了腺病毒表达系统的一部分，该部分包括目的基因，该目的基因在3’-UTR中具有针对shRNA的一个或多个结合位点。例如，合适的shRNA可以取自萤光素酶基因、β-内酰胺酶基因和/或lacZ基因，并且表达系统可以是编码目的基因(例如GFP)的病毒(例如AdV)或质粒DNA，该目的基因具有包含分别来自萤光素酶、LacZ和/或β-内酰胺酶的序列的3’UTR。

图13示出了示例性测试系统的结果。在此，诸位发明人用具有3’UTR的GFP转基因瞬时转染EC7生产细胞，该3’UTR包含取自以下三个不同异源基因之一的shRNA靶位点：萤光素酶、LacZ或β-内酰胺酶。靶向或不靶向(阴性对照)这些位点的编码shRNA的DNA也被共转染，并且通过流式细胞术测量这些细胞中的GFP强度，作为获得转基因表达的一种方式。在每种情况下，与非靶向shRNA相比，当靶向3’UTR的shRNA存在时，GFP表达显著下调。同样，图14描绘了用编码luc shRNA的序列转染的EC7生产细胞和未转染的对照细胞的结果。然后监测用携带GFP基因和shRNA结合位点的表达载体进行转染的GFP表达，如该图的上图所示。从结果中可以容易地看出，仅在表达luc shRNA并用编码具有luc shRNA结合位点的GFP的构建体转染的细胞中观察到GFP的特异性下调。因此，应理解的是，shRNA可以有效地下调转基因货物的表达。

因此，诸位发明人设想了一种示例性系统，其中宿主细胞经基因修饰以从重组DNA的区段中瞬时地以及更优选永久地产生一种或多种shRNA种类，该重组DNA的区段可以整合到基因组中或作为染色体外单元维持/提供。这些种类的后续加工使它们能够引导RNA诱导的沉默复合物(RISC)降解携带互补靶序列的转录物。将理解的是，通过将这些互补靶序列容纳在AdV5基因组中携带的转基因的3’UTR中，新出现的转录物被降解，从而防止了未来的基因产物的任何毒性作用。最优选地，选择shRNA使得它们不识别生产细胞中的内源基因。此外，进一步设想可以产生表达多个(例如，至少两个或至少三个)不同shRNA以及携带针对这些shRNA每个的靶位点的3’UTR的重组构建体/宿主细胞，从而增强沉默潜力。

在又另一种控制转录的方法中，诸位发明人使用了在EC7生产细胞中表达重组IE86(及其变体)的系统。在此，IE86特异性地结合至crs(顺式阻遏序列)序列元件，并且在启动子序列的一部分中的crs序列元件的情况下，转录可以被降低或抑制。图15描绘了示例性启动子序列，其具有CMV启动子，随后是多克隆位点(可将表达基因(在此为GFP)置于其中)上游的crs序列元件。为了使重组DNA对IE86的抑制敏感，细胞需要重组地表达IE86。图16描绘了在EC7细胞中从表达质粒(pEAK8)重组表达IE86及其变体的示例性结果。可以容易地看出，所有重组形式在生产细胞中表达良好。为了测试如此产生的IE86及变体形式的功能影响，用表达构建体进一步转染表达IE86的细胞，这些表达构建体在启动子中包括crs序列元件以控制GFP基因的表达。从图17中的结果可以看出，在启动子中包括crs序列元件的表达构建体(crs-穿梭(shuttle)-GFP)下调GFP基因在还表达IE86的细胞中的表达。图18描绘了针对如图中所指示的经转染的细胞的流式细胞术结果的图：对于所有未转染的细胞均未观察到显著的荧光，而对于用在启动子中包括crs序列元件的表达构建体(crs-穿梭-GFP)转染但未用编码IE86或其变体的表达质粒转染的细胞，则检测到高荧光。对于用在启动子中包括crs序列元件的表达构建体(crs-穿梭-GFP)转染并用编码IE86或其变体的表达质粒转染的细胞观察到降低的荧光。

其他实例：潜伏膜蛋白1(LMP1)是爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV)的膜内在蛋白，并且在此类细胞中表达后会诱导免疫感受态细胞发生各种变化，包括作为CD40模拟物活化树突细胞和巨噬细胞。相似地，IPS-1(干扰素-β启动子刺激物1)通过诱导I型干扰素和干扰素诱导型基因来活化树突细胞。因此，已经提出LMP-1和IPS-1都是用于免疫疗法的有效共刺激分子，更具体地说是表达肿瘤相关抗原的DNA疫苗。然而，病毒复制期间宿主细胞中LMP-1和/或IPS-1的表达可能影响宿主细胞中的病毒生产水平。

实例1：诸位发明人设想可以通过对宿主细胞进行基因修饰以表达显性阴性突变体干扰素调节转录因子3(例如，IRF3-ΔN等)来抑制LMP-1、IPS-1或融合蛋白LMP-IPS-1(LMP1和IPS-1的N末端聚集结构域)在宿主细胞中的表达。在此实例中，编码有效载荷(与或不与肿瘤相关抗原偶联的LMP-1、IPS-1、LMP-IPS-1)的重组核酸还包括可操作地偶联至有效载荷基因的对IRF3有应答的启动子(例如，IFN-α启动子、IFN-β启动子等)。设想显性阴性突变体IRF3抑制有效载荷基因的转录，使得有效载荷蛋白的表达可以在宿主细胞中降低或消除。

实例2：诸位发明人设想可以通过对宿主细胞进行基因修饰以表达对LMP-1、IPS-1或位于这些编码序列侧翼的5’-或3’-UTR特异的调节性/抑制性RNA(例如，shRNA、siRNA、miRNA等)来抑制LMP-1、IPS-1或融合蛋白LMP-IPS-1在宿主细胞中的表达。设想调节性/抑制性RNA可以使有效载荷基因的转录物不稳定和/或抑制其翻译，使得有效载荷基因的表达可以在宿主细胞中基本上被降低或消除。在一些实施例中，宿主细胞可以经基因修饰以组成型地表达调节性/抑制性RNA。在其他实施例中，宿主细胞可以经基因修饰以有条件地产生调节性/抑制性RNA。例如，有效载荷还可以在与其他有效载荷基因(LMP-1、IPS-1或LMP-IPS-1)相同的启动子下的开放阅读框中包括编码蜕皮激素(昆虫类固醇激素)的核酸片段。宿主细胞可以经基因修饰以在蜕皮激素应答性启动子下表达调节性/抑制性RNA。在这样的实例中，调节性/抑制性RNA包括对LMP-1、IPS-1或LMP-IPS-1特异的那些调节性/抑制性RNA，以及对蜕皮激素特异的至少一种调节性/抑制性RNA，使得仅当有效载荷基因开始被转录时才表达有效载荷。因此，调节性/抑制性RNA的表达以有效载荷蛋白的表达为条件，并且调节性/抑制性RNA可能不会在缺乏有效载荷表达的宿主细胞中不必要地表达。

实例3：诸位发明人设想，可以通过对宿主细胞进行基因修饰以表达使有效载荷失活或分解的结合分子来抑制IPS-1或融合蛋白LMP-IPS-1在宿主细胞中的表达，使得可以降低或消除源自有效载荷的对宿主细胞的任何毒性和/或可以减弱有效载荷的任何功能。例如，宿主细胞可以表达特异性地切割IPS-1的丙型肝炎NS3-4a蛋白酶。在一些实施例中，宿主细胞可以经基因修饰为组成型丙型肝炎NS3-4a蛋白酶。在其他实施例中，宿主细胞可以经基因修饰以有条件地产生丙型肝炎NS3-4a蛋白酶。例如，宿主细胞可以经基因修饰以在IRF3启动子下表达丙型肝炎病毒NS3-4a蛋白酶，其响应于在IPS-1信号传导下游的转录因子。在这样的实例中，仅当有效载荷基因开始被转录和表达以启动IPS-1信号传导途径时，才表达丙型肝炎NS3-4a蛋白酶。因此，丙型肝炎NS3-4a蛋白酶的表达以有效载荷蛋白的表达为条件，并且丙型肝炎NS3-4a蛋白酶可能不会在缺乏有效载荷表达的宿主细胞中不必要地表达。

实例4：诸位发明人设想，可以通过对宿主细胞进行基因修饰以表达将与IPS-1或融合蛋白的mRNA转录物结合的一种或多种shRNA分子，从而导致mRNA的降解来抑制IPS-1或融合蛋白LMP-IPS-1的表达。为此，诸位发明人构建了一种测试系统，其中通过短发夹RNA(shRNA)抑制转基因货物表达，这些短发夹RNA由生产细胞(例如，EC7细胞、CHO细胞等)稳定地产生，允许无阻碍的病毒扩增。

如本文的说明书和贯穿随后的整个权利要求中所使用，“一个”、“一种”以及“该”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确说明。

如本文中使用的，并且除非上下文另有指示，否则术语“偶联至”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的要素彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的要素位于两个要素之间)。因此，术语“偶联至”和“与……偶联”同义使用。

本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。本文所述的所有方法都能够以任何合适的顺序进行，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。

对于本领域技术人员应清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题不受限制，只是要在所附权利要求的范围中。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”(“comprises”和“comprising”)应被解释为以非排他性方式指代要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求涉及选自由A、B、C……和N组成的组中的至少一种的情况下，该文字应被解释为只需要该组中的一个元素，而不是A加N、或B加N等。

Claims (20)

1.一种产生多个重组治疗性病毒的方法，该方法包括：

提供重组宿主细胞，该重组宿主细胞经基因修饰以产生降低病毒有效载荷mRNA在该重组宿主细胞中的表达的shRNA，并且其中该病毒有效载荷mRNA在3’-UTR中具有针对该shRNA的结合位点；

用重组病毒转染该重组宿主细胞，该重组病毒包含编码该病毒有效载荷mRNA的核酸序列；以及

在降低该病毒有效载荷mRNA在该宿主细胞中的表达并产生至少一个预定病毒滴度的条件下培养所转染的宿主细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中该宿主细胞是CHO细胞或EC7细胞。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该宿主细胞进一步从重组核酸表达CXADR。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该宿主细胞经基因修饰以产生至少一种第二shRNA，该至少一种第二shRNA降低该病毒有效载荷mRNA在该重组宿主细胞中的表达，并且其中该病毒有效载荷mRNA在3’-UTR中具有针对该第二shRNA的结合位点。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该宿主细胞经基因修饰以产生至少一种第二shRNA，该至少一种第二shRNA降低第二有效载荷mRNA在该重组宿主细胞中的表达，并且其中第二病毒有效载荷mRNA在3’-UTR中具有针对该第二shRNA的结合位点。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该shRNA的产生处于诱导型启动子的控制下。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该重组病毒是腺病毒。

8.如权利要求7所述的方法，其中该腺病毒是E2b缺失型腺病毒。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该病毒有效载荷基因编码细胞因子、嵌合蛋白、肿瘤相关抗原和新表位中的至少一种。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该预定病毒滴度为至少10⁹个病毒粒子/ml。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在具有不同病毒有效载荷基因的不同重组病毒之间变异性等于或小于20％的时间段内达到该预定病毒滴度。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在具有不同病毒有效载荷基因的不同重组病毒之间变异性等于或小于10％的时间段内达到该预定病毒滴度。

13.一种重组病毒，该重组病毒包含序列，该序列编码重组有效载荷的mRNA且具有3’-UTR区段，该3’-UTR区段具有针对shRNA的至少一个结合位点，该shRNA在施用该病毒的患者细胞中不存在。

14.如权利要求13所述的重组病毒，其中该病毒是腺病毒。

15.如权利要求13-14中任一项所述的重组病毒，其中该有效载荷是细胞因子、嵌合蛋白、肿瘤相关抗原和新表位中的至少一种。

16.如权利要求13-15中任一项所述的重组病毒，其中该结合位点针对萤光素酶shRNA、lacZ shRNA或β-内酰胺酶shRNA。

17.如权利要求13-16中任一项所述的重组病毒，该重组病毒具有至少一个针对第二shRNA的第二结合位点，该第二shRNA在施用该病毒的该患者细胞中不存在。

18.一种经基因工程改造的细胞，该经基因工程改造的细胞包含编码shRNA的重组核酸，当用重组病毒转染该经基因工程改造的细胞时，该shRNA降低病毒有效载荷基因在该经基因工程改造的细胞中的表达，并且其中该shRNA与在由该重组病毒编码的mRNA上的结合位点结合。

19.如权利要求42所述的经基因工程改造的细胞，其中该重组核酸编码至少一种第二shRNA。

20.如权利要求42所述的经基因工程改造的细胞，其中该经基因工程改造的细胞在由该经基因工程改造的细胞表达的mRNA中不具有针对该shRNA的结合位点。

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