KR20230110812A - 바이러스 생성 페이로드에 대해 독성이 낮은 변형된ec7 세포 - Google Patents

바이러스 생성 페이로드에 대해 독성이 낮은 변형된ec7 세포 Download PDF

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와엘 타드로스
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Abstract

재조합 바이러스, 특히 복제 결함 Ad5 바이러스의 빠르고 높은 역가 생성을 가능하게 하는 재조합 세포 및 그에 대한 방법이 고려된다. 일부 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 바이러스에 인코딩된 치료 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하는 저해제를 생성하도록 변형되는 한편, 다른 양태에서, 바이러스는 바이러스에 인코딩된 치료 단백질의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 제거하는 유전자를 포함한다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인코딩되는 shRNA는 재조합 바이러스에 인코딩된 페이로드(payload) 유전자의 발현을 감소시키거나 억제할 것이다.

Description

바이러스 생성 페이로드에 대해 독성이 낮은 변형된 EC7 세포 {MODIFIED EC7 CELLS HAVING LOW TOXICITY TO VIRAL PRODUCTION PAYLOADS}
본 출원은 공동 계류 중인 본 발명자들의 미국 가출원 제62/570,508호(2017년 10월 10일 출원), 및 제62/633,412호(2108년 2월 21일 출원)에 대해 우선권을 주장하며, 둘 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명의 분야는 재조합 세포, 특히 암 백신에 사용되는 치료 재조합 바이러스의 생성에 사용되는 변형된 포유류 세포이다.
배경기술의 기재내용은 본 발명의 이해에 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본 명세서에 제공된 임의의 정보가 선행기술이거나, 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 명시적으로 또는 암묵적으로 참조된 임의의 공개문헌이 선행기술임을 인정하는 것은 아니다.
본 명세서의 모든 공개문헌은 각각의 개별 공개문헌 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 포함된 참조문헌 내의 용어의 정의 또는 사용이 본 명세서에 제공된 용어의 정의와 일치하지 않거나 모순되는 경우, 본 명세서에 제공된 용어의 정의가 적용되며, 참조문헌 내의 그 용어의 정의는 적용되지 않는다.
재조합 치료 단백질을 위한 전달 시스템으로서 바이러스를 사용하는 유전자 요법, 및 포유류 세포에서의 단백질 생성이 당업계에서 점점 더 인정되고 있다. 적어도 개념적으로는 비교적 간단하지만 다양한 어려움에 부딪혔으며, 대부분의 문제는 바이러스-숙주 상호작용과 연관이 있었다.
예를 들어, 아데노바이러스는 잘 특성화된 dsDNA 바이러스이며, 종종, 많은 대상 세포 유형으로 전달하기 위한 다양한 전이유전자를 함유하는 아데노바이러스 입자의 생성을 가능하게 한다. 아데노바이러스 유형 5는 이와 관련하여 가장 많이 연구된 플랫폼 중 하나이며, 상업 공간에서 사용자 지정 바이러스를 생성할 수 있는 수많은 키트가 이용 가능하다. 이러한 방식으로 생성된 아데노바이러스 유형 5는 세포 배양, 동물 및 심지어 임상 시험에 사용되어 왔으며, 추가로 과학 및 임상 실무자들이 이러한 시스템에 정통하도록 돕는다. 세포 내로의 바이러스의 진입은 콕사키(Coxsackie) 및 아데노바이러스 수용체(CXADR)를 통해 매개되는 것으로 생각된다. 따라서, CXADR을 생성하지 못하는 세포 또는 조직은 이러한 세포에서 아데노바이러스 유형 5 기술의 사용을 제한하여, 줄기 세포 및 면역 세포를 포함하는 많은 임상적으로 관련된 세포 및 조직의 형질도입을 방지한다.
CXADR(Swiss-Prot 수탁 번호: P78310)은 유형 I 막 수용체이고, 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다(Science(1997) 275; 1320-1323). CXADR은 통상적으로 200개 초과의 아미노산 크기인 세포외 도메인을 가지며, 밀접한 접합 완전성에 필수적인 상피 첨단 접합 복합체(epithelial apical junction complex)의 구성요소인 것으로 여겨진다(J Biol Chem(1999) 274; 10219-10226). CXADR은 숙주 세포에서 과발현되어 AD5 바이러스에 대한 진입 경로를 획득할 수 있다. 이러한 재조합 세포는 Ad5 형질감염에 감응성이고, 개선된 단백질 생성을 가능하게 하지만, 이러한 시스템은 여전히 다양한 단점을 가질 것이다. 가장 주목할만한 것은, 바이러스가 치료 엔티티로서 사용되는 경우, 충분한 양의 재조합 바이러스(예를 들어, 1010개 내지 1012개의 바이러스 입자)의 생성이 종종 일관되지 않고, 일부 경우에는 달성조차 불가능하다는 점이다.
바이러스 역가의 개선은 예를 들어 US6548286호, WO98/46728호, 또는 US2004/0043490호에 보고된 바와 같이 아데노-연관 바이러스의 REP 및 CAP 단백질의 발현의 조절에 의한 일부 아데노-연관 바이러스에 관하여 이전에 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 시스템은 일반적으로 아데노-연관 바이러스의 REP 및 CAP 단백질의 특이성 및 이러한 바이러스의 수명 주기로 인해 다른 바이러스 시스템으로 번역되지 않을 것이다. 생성 세포에서의 재조합 핵산으로부터의 단백질 생성이 CHO 세포에서 발현된 재조합 유전자로부터 유도되는 또 다른 접근법에서, 세포는 US8273722호에 개시된 바와 같이, 재조합 단백질의 발현을 억제하기 위해 합성 siRNA의 존재 하에, 그리고 이후에는 바람직한 재조합 단백질의 생성을 가능하게 하기 위해 siRNA의 부재 하에 배양된다. 그러나, 이러한 시스템은 바람직한 재조합 단백질의 적어도 일정 정도의 양으로 증가하지만, 고역가의 재조합 바이러스의 생성은 고려되지 않았고, 심지어 기재된 CHO 세포에서도 실현 불가능하다.
따라서, 수많은 세포 생성 시스템 및 바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있지만, 간단하고 효과적인 방식으로 고역가의 재조합 바이러스, 특히 치료 바이러스를 생성하기 위한 시스템 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.
본 발명의 대상은 치료 단백질(예를 들어, 종양 연관 항원, 종양 네오에피토프, 폴리토프 등)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 절편을 함유하는 고역가의 재조합 바이러스, 특히 재조합 아데노바이러스 유형 5를 생성하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 대상의 일 양태에서, 본 발명자들은 (예를 들어, 재조합 핵산 서열로부터) CXADR을 발현시키는 재조합 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 EC7 세포)를 제공하고, 재조합 숙주 세포에서 바이러스 페이로드(payload) 유전자의 발현을 감소시키는 재조합 엔티티를 발현시키도록 유전자 변형시키는 단계; 및 바이러스 페이로드 유전자(예를 들어, 사이토카인, 키메라 단백질, 종양 연관 항원, 네오에피토프 등)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스로 재조합 숙주 세포를 형질감염시키는 추가 단계를 포함하는 복수의 재조합 치료 바이러스를 생성하는 방법을 고려한다. 더 추가적인 단계에서, 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고 적어도 소정의 바이러스 역가를 생성하는 조건 하에서, 형질감염된 숙주 세포를 배양한다. 반드시 그러한 것은 아니지만 가장 통상적으로, 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 및 특히 E2b-결실 아데노바이러스 유형 5이다.
일부 양태에서, 재조합 엔티티는 단백질(예를 들어, 인핸서/프로모터 서열, 5'UTR 서열, IRES 서열, 또는 3'-UTR 서열에 존재하는 재조합 바이러스 상의 결합 부위에 결합하는 전사 리프레서)이며, 재조합 엔티티는 또한 핵산(예컨대 5'UTR 서열, IRES 서열, 또는 3'-UTR 서열에서와 같은 재조합 바이러스의 RNA 상의 결합 부위에 결합하는 siRNA, shRNA, 안티센스-RNA, 또는 catRNA)일 수 있다.
소정의 바이러스 역가는 적어도 108 또는 109 바이러스 입자/ml이고/이거나, 상이한 바이러스 페이로드 유전자를 갖는 상이한 재조합 바이러스 사이에서 20% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하의 가변성을 갖는 기간 내에 소정의 바이러스 역가에 이르는 것이 추가로 고려된다.
본 발명의 대상의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 엔티티를 발현시키는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 바이러스 페이로드 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 엔티티에 결합하거나 재조합 바이러스의 RNA 상에 엔티티에 대한 결합 부위를 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 형질감염시키는 추가 단계를 포함하는 복수의 재조합 치료 바이러스를 생성하는 방법을 고려한다. 더 추가적인 단계에서, 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고 적어도 소정의 바이러스 역가를 생성하는 조건 하에서, 형질감염된 숙주 세포를 배양한다. 반드시 그러한 것은 아니지만 가장 통상적으로, 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 특히 E2b-결실 아데노바이러스 유형 5이고, 숙주 세포는 선택적으로 재조합 핵산 서열로부터 CXADR을 발현시킬 수 있는 CHO 세포 또는 EC7 세포(아데노바이러스 중합효소를 발현시키는 HEK293 세포)이다.
바람직한 경우, 숙주 세포는 재조합 핵산으로부터 엔티티를 발현시키거나, 엔티티는 숙주 세포에 대해 나이브(naive)한 엔티티(예를 들어, 단백질 또는 RNA)이다. 마찬가지로, 재조합 바이러스의 서열이 재조합 바이러스에 대해 나이브해야 하는 것은 아닌 것으로 여겨진다.
본 발명의 대상의 추가의 양태에서, 본 발명자들은 또한 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 엔티티를 조건부로 발현시키도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 바이러스 페이로드 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 숙주 세포에서 엔티티의 조건부 발현을 촉발하는 신호전달 서열을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 형질감염시키는 또 다른 단계를 포함하는 복수의 재조합 치료 바이러스를 생성하는 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고 적어도 소정의 바이러스 역가를 생성하는 조건 하에서, 형질감염된 숙주 세포를 배양한다.
전술한 바와 같이, 숙주 세포는 선택적으로 재조합 핵산으로부터 CXADR을 발현시킬 수 있고, 엔티티는 DNA 또는 RNA 결합 단백질, 또는 RNA인 것으로 고려된다. 더욱이, 조건부 발현을 촉발하는 신호전달 서열이 전사 인자를 인코딩하는 것을 고려한다.
본 발명 대상의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 공동 리프레서의 제1 부분을 발현시키도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 바이러스 페이로드 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 공동 리프레서의 제2 부분을 추가로 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 형질감염시키는 또 다른 단계로서, 바이러스 페이로드 유전자를 인코딩하는 핵산 서열이 공동 리프레서의 제어 하에 있는 단계를 포함하는 복수의 재조합 치료 바이러스를 생성하는 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고 적어도 소정의 바이러스 역가를 생성하는 조건 하에서, 형질감염된 숙주 세포를 배양한다.
추가로, 본 발명자들은 또한 바이러스 감염시 인터페론 감마의 발현이 결여되도록 선택적으로 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 바이러스 페이로드 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 형질감염시키는 추가의 단계로서, 바이러스 페이로드 유전자를 인코딩하는 핵산 서열이 (예를 들어, IFN-자극 반응 요소를 통한) 인터페론 조절 인자의 제어 하에 있는 단계를 포함하는 복수의 재조합 치료 바이러스를 생성하는 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 적어도 소정의 바이러스 역가를 생성하는 조건 하에서, 형질감염된 숙주 세포를 배양한다.
결과적으로, 본 발명자들은 또한 재조합 바이러스로 형질감염된 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 엔티티를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 유전자 조작 세포를 고려하며, 엔티티는 재조합 바이러스의 RNA 상의 결합 부위에 결합한다.
고려되는 유전자 조작 세포는 또한 재조합 바이러스로 형질감염된 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 엔티티를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함할 수 있으며, 재조합 핵산은 재조합 바이러스에 의해 인코딩되는 단백질 또는 핵산의 제어 하에 있다.
유사하게, 고려되는 유전자 조작 세포는 세포가 페이로드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스로 형질감염되는 경우, 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 공동 리프레서의 제1 부분을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명자들은 바이러스 감염시 인터페론 감마의 발현이 결여되도록 변형된 유전자 조작 세포를 추가로 고려한다.
본 발명의 대상의 다양한 목적, 특징, 양태 및 이점은 유사한 참조번호가 유사한 구성요소를 나타내는 첨부 도면과 함께 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명의 대상에 따른 예시적인 제1 발현 시스템을 도시한다.
도 2는 본 발명의 대상에 따른 예시적인 제2 발현 시스템을 도시한다.
도 3은 본 발명의 대상에 따른 예시적인 제3 발현 시스템을 도시한다.
도 4는 본 발명의 대상에 따른 예시적인 제4 발현 시스템을 도시한다.
도 5는 본 발명의 대상에 따른 예시적인 제5 발현 시스템을 도시한다.
도 6은 본 발명의 대상에 따른 예시적인 제6 발현 시스템을 도시한다.
도 7은 재조합 바이러스에서 재조합 페이로드의 발현을 억제하기 위한 예시적인 옵션을 도시한다.
도 8은 핵 위치화된 람다 리프레서를 생성하기 위한 숙주 세포의 예시적인 유전자 변형을 도시한다.
도 9는 람다 리프레서에 결합할 수 있는 오퍼레이터 서열을 포함하는 재조합 바이러스의 예시적인 유전자 변형을 도시한다.
도 10은 람다 리프레서에 결합할 수 있는 오퍼레이터 서열을 갖는 재조합 바이러스의 추가의 예시적인 유전자 변형을 도시한다.
도 11은 람다 리프레서에 결합할 수 있는 오퍼레이터 서열을 갖는 재조합 바이러스로부터 리포터 유전자의 발현 억제에 대한 예시적인 결과를 도시한다.
도 12는 shRNA에 대한 결합 서열이 람다 리프레서에 결합할 수 있는 오퍼레이터 서열을 포함하는 재조합 바이러스의 예시적인 유전자 변형을 도시한다.
도 13은 도 12의 발현 시스템을 사용한 예시적인 결과를 도시한다.
도 14는 도 12의 발현 시스템을 사용한 추가의 예시적인 결과를 도시한다.
도 15는 전사를 억제하기 위해 프로모터의 하류에 IE86 반응성 시스 억제 서열(crs)을 갖는 예시적인 작제물을 도시한다.
도 16은 바이러스 생성에 사용되는 EC7 숙주 세포에서 IE86 및 그의 변이체의 발현을 나타내는 겔에 대한 예시적인 결과를 도시한다.
도 17은 EC7 숙주 세포에서 재조합 IE86 및 그의 변이체를 사용하여 프로모터의 하류에 IE86 반응성 시스 억제 서열(crs)을 함유하는 벡터 작제물로부터 GFP의 발현을 나타내는 겔에 대한 예시적인 결과를 도시한다.
도 18은 EC7 숙주 세포에서 재조합 IE86 및 그의 변이체를 사용한 GFP 발현 억제에 대한 예시적인 결과를 도시한 그래프이다.
본 발명의 대상은 재조합 바이러스 치료제를 생성하고, 특히, 그의 재조합 페이로드(예를 들어, 종양 연관 항원, 네오에피토프(폴리토프 내에 배열될 수 있음), 면역 조절 분자, 공자극 분자 등)에 의해 구별되는 매우 다양한 바이러스에 걸쳐, 일관된 성능 엔벨로프(performance envelope)를 제공하는 방식으로 고역가의 재조합 Ad5 바이러스를 생성하기 위한 재조합 세포, 시스템 및 방법을 제공한다. 이러한 재조합 세포, 시스템 및 방법에 의해, 유리하게는 재조합 페이로드에 관계없이, 통상적으로 재현 가능하고 예측 가능한 시간대에서 바람직한 고역가의 바이러스를 생성할 수 있다. 또 다른 관점에서 볼 때, 고려되는 재조합 세포, 시스템 및 방법은, 재조합 페이로드에 관계없이 치료 바이러스의 신뢰할 수 있는 생성을 가능하게 하고, 공통 생성 일정 및 생성 환경 하에서 다수의 별개의 치료 바이러스의 대량 병행 생성을 추가로 가능하게 한다.
따라서, 본 명세서에 제공된 시스템 및 방법은 재조합 치료 바이러스의 고 수율 다중복합 생성(multiplexed production)에 특히 적합할 것이다. 이러한 장점은 다양한 접근법을 사용하여 숙주 세포(바이러스 생성 세포)에서 재조합 페이로드의 발현을 감소시키거나 심지어 완전히 제거함으로써 달성된다. 본 발명의 대상으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 생성에 사용되는 숙주 세포는, 사전 제조된 '일반적인' 치료 바이러스 벡터로의 환자 특이적 바이러스 페이로드의 '드롭-인 대체(drop-in replacement)"를 가능하게 하기 위해 숙주 세포에서 재조합 페이로드의 발현이 감소되거나 심지어 완전히 제거되도록 유전자 조작되는 것이 일반적으로 바람직하다.
쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 당업계에는 수많은 치료 바이러스가 공지되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 고려되는 치료 바이러스는 외피 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 HSV-1뿐만 아니라, 비외피 바이러스, 예컨대 아데노-연관 바이러스 및 아데노바이러스(다양한 혈청형을 갖는 인간 또는 비인간 유래일 수 있음)를 포함한다. 결과적으로, 다양한 숙주 세포가 또한 적합한 것으로 여겨지고, 치료 바이러스의 선택에 의해 적어도 일정 정도는 숙주 세포의 선택이 결정될 것이다. 추가로, 숙주 세포는 또한, 유전자 변형이 없는 이러한 세포에는 적합하지 않은 바이러스의 감염 및/또는 증식에 맞추어 유전자 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 특히 바람직한 치료 바이러스는 인간 및 비인간(예를 들어, 영장류) 유래의 아데노바이러스를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 대상의 하나의 바람직한 양태에서, 치료 바이러스는 환자 및 종양 특이적 네오에피토프 서열, 종양 연관 항원, 사이토카인, 수퍼킨(예를 들어, ALT803), 키메라 단백질(예를 들어, 표적 결합 부분으로서 scFv 도메인 및 바람직한 생물학적 효과를 제공하는 효과기 부분을 가짐), 공자극 분자, 체크포인트 저해제(checkpoint inhibitor) 및 케모카인 중 적어도 하나를 페이로드로서 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5이다. 추가의 바람직한 예에서, CHO 또는 HEK293 세포는 바이러스 증식을 위한 숙주 세포로서 이용된다. 그러나, CHO 및 HEK293 세포는 정상적으로는 검출 가능한 양의 콕사키/아데노바이러스 수용체(CXADR)를 발현시키지 않으므로, 일반적으로 아데노바이러스 유형 5에 의해 비효율적으로 형질도입된다. 따라서, 그러한 세포(그리고 CXADR 발현이 결여된 다른 세포)는 재조합 CXADR을 발현시키도록 유전자 변형될 수 있음에 유의해야 한다. 더욱이, CHO 및 HEK293 세포는 또한 Ad5의 E1 유전자를 정상적으로는 발현시키지 않으므로, 복제 결함 Ad5 바이러스가 이용되는 경우 E1 단백질 기능을 트랜스형으로 발현시키고 제공하도록 추가로 유전자 변형될 것이다. 이러한 보체는 아데노바이러스가 E2b 유전자에 추가의 결실을 갖는 경우에 특히 바람직하고(예를 들어, 문헌[J Virol. 1998 Feb;72(2):926-33] 참조), 이러한 아데노바이러스가 특히 바람직하다.
이렇게 변형된 숙주 세포는 숙주 세포 내로의 바이러스 진입 및 바이러스 발현 벡터의 전달을 위한 창을 제공할 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명자들은 CHO 세포가 CXADR을 발현시키도록 변형될 수 있고, 따라서 유형 5 아데노바이러스에 의한 바이러스 감염에 민감해진다는 것을 발견하였다. 실제로, 본 발명자들은 또한 CXADR(CAR-CHO 세포)을 발현시키는 CHO 세포 내에 도입된 생물학적 카고(cargo)를 지니는 E2b-결실 아데노바이러스가 자손 바이러스의 강력하고 장기적인 생성을 유발한다는 것을 발견하였다. 이 결과는 CAR-CHO 세포가 치료 바이러스를 위한 보편적 생성 시스템으로서 작용할 수 있으며, 이는 생성 시간 및 비용을 상당히 감소시킬 것임을 시사한다. 이 시스템은 또한 상업적 생성을 위한 장기적인 연속 배양 시스템과 양립 가능할 것으로 예상된다. 더욱이, 본 명세서에서 고려되는 시스템 및 방법은 심지어 중간체의 최소 조작으로 다양한 별개의 생물학적 제제의 연속 생성에 적용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 대상의 일 양태에서, CXADR을 인코딩하는 cDNA는 적합한 발현 플라스미드(예를 들어, 피크8-퓨로마이신 플라스미드)로 클로닝될 수 있고, 유전자 발현은 강한 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)로부터 유도된다. 물론, (유도성 또는 항시적일 수 있는) 다양한 다른 프로모터 요소가 또한 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다. 전이유전자 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인될 수 있고, 예를 들어 참조 데이터 세트(NP_001329.1)에서 CXADR 이소형 1에 대해 공개된 서열과 정렬될 수 있다. 이어서, 발현 플라스미드를 당업계에 공지된 표준 형질감염 프로토콜을 사용하여 CHO 세포로 형질감염시킨다. 이어서, 세포 스톡의 제조를 위한 형질감염 세포의 선택을 퓨로마이신을 사용하여 수행할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 대상은 특정 발현 벡터에 제한되지 않으며, 실제로 세포에서 핵산으로부터의 모든 발현 방식이 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 일시적 발현이 바람직한 경우, 핵산은 진핵생물 복제 서열이 없는 RNA 또는 원형 염색체외 DNA로서 전달될 수 있다. 반면에, 영구 발현이 바람직하거나, 다수의 별개의 배치의 치료 바이러스의 대규모 생성을 위한 세포주가 필요한 경우, 핵산은 세포의 게놈 내로 혼입되도록 전달될 수 있거나, 세포는 발현 카세트를 숙주 세포의 게놈 내로 설치하기 위한 게놈 편집(예를 들어, CRISPR/Cas9 기술을 사용함)을 거칠 수 있다.
마찬가지로, CXADR 유전자의 전사 및 번역 제어는 상당히 다양할 수 있으며, 적합한 제어 요소의 적절한 선택은 당업자에게 명백할 것임을 이해해야 한다. 따라서, 발현은 항시적 활성 프로모터, 상응하는 유도제를 사용한 유도성 프로모터, 또는 선택된 조직 또는 배양 조건 하에서 활성화되는 프로모터로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 발현은 온도 감응성 프로모터(예를 들어, 문헌[BMC Biotechnol. 2011; 12;11:51])의 제어 하에 또는 저산소 및 금속 감응성 프로모터(예를 들어, 문헌[Gene Ther. 2006; 13(10):857-68] 참조)의 제어 하에 유도될 수 있다. 따라서, 아데노바이러스 형질감염에 민감하지 않은 치료 바이러스의 생성에 적합한 세포가 감염 및 그와 함께 치료 바이러스의 전달의 대규모 생성에 감응성이 되도록 할 수 있음을 이해해야 한다. 물론, 복제 결함 바이러스가 사용되는 경우, 효소의 결여를 보완하기 위해 바이러스 중합효소의 재조합 발현(필요한 경우)에 동일한 고려 사항이 또한 적용됨을 이해해야 한다. 예시적인 바람직한 재조합 아데노바이러스, 및 바이러스 중합효소를 갖는 세포가 다른 곳에 기재되어 있다.
적합한 바이러스 발현 벡터와 관련하여, 수많은 바이러스 발현 벡터가 적절한 것으로 고려된다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 바이러스 발현 벡터는 아데노바이러스 발현 벡터이고, 특히 E1, E2b 및 E3 유전자가 결실된 것이 특히 바람직하다(예를 들어, 문헌[J. Virol. 1998; Vol.72(2): p926-933]). 특히, 본 발명자들은 특히 치료량의 재조합 바이러스의 생성이 바람직한 경우, 상기 기재된 바와 같은 재조합 세포에서 바이러스 페이로드의 효율적인 단백질 발현이 고역가의 바이러스 입자의 생성을 방해할 수 있음을 관찰하였다. 예를 들어, 적어도 일부 실험에서, 일부 재조합 페이로드로 107 바이러스 입자/ml 미만, 또는 심지어 106 바이러스 입자/ml 미만, 또는 심지어 105 바이러스 입자/ml 미만의 바이러스 역가가 관찰되었지만(또는 임의의 유의한 바이러스 역가를 전혀 생성하지 못했지만), 동일한 바이러스 시스템은 다른 재조합 페이로드로 107 바이러스 입자/ml 초과, 또는 108 바이러스 입자/ml 초과의(이보다 더 높은) 바이러스 역가를 생성하였다. 더욱이, 다수의 상이한 환자를 위한 다수의 상이한 바이러스 제조물이 제조되는 경우, 바람직한 양의 바이러스 입자(예를 들어, 1011개의 총 바이러스 입자)에 도달하기 위해 제조 사이에 상당한 시간 지연이 관찰되었으며, 이는 상이한 제조 사이에 동시성이 필요한 많은 치료 바이러스 생성 체계를 방해할 것이다.
본 발명자들은 이제 이러한 고역가의 바이러스 생성 문제가, 바이러스 페이로드의 유형 및/또는 길이에 관계없이 치료량의 바이러스를 생성하기 위한 전체 수율 및/또는 시간으로 바이러스 페이로드의 단백질 생성의 방해가 감소되거나 심지어 제거되도록 숙주 세포 및 바이러스 게놈 중 적어도 하나를 변형시킴으로써 극복될 수 있음을 발견하였다. 가장 통상적으로, 숙주 세포는 바이러스 핵산 상에 인코딩된 유전자의 전사 및/또는 번역 및/또는 mRNA 안정성을 직접적으로 또는 간접적으로 방해하는 엔티티를 생성하도록 변형될 수 있다. 이러한 접근법은 숙주 세포의 단일 배치가 바이러스를 재조작할 필요 없이, 광범위한 재조합 치료 바이러스에 대한 바이러스 생성 플랫폼으로서 작용할 수 있는 적어도 일부 구현예(여기서, 일부 엔티티는 상이한 바이러스에 공통된 서열을 표적화함)에서와 같이 특히 바람직할 수 있다. 반면에, 숙주 세포 및 바이러스 벡터 둘 모두는 유전자 전사 및/또는 번역 저해 및/또는 mRNA 안정성에 기여할 수 있으며, 이는 이들의 (특정) 조합에 대해 배타적이다. 다른 예에서, 숙주 세포는 페이로드 유전자를 발현시키기 위해 필요한 전사 인자가 결여되도록 유전자 조작될 수 있다. 가장 바람직하게는, 재조합 바이러스는 재조합 페이로드의 발현 억제가 환자 세포가 아니라 숙주 세포에서만 발생하도록 조작될 것이다.
예를 들어, 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, 바이러스 벡터 상에 존재하는 바이러스 페이로드의 발현을 직접 방해하는 엔티티를 인코딩하는 유전자(예를 들어, 요법에 사용되는 재조합 유전자, 예컨대 네오에피토프, 공자극 분자, 체크포인트 저해제, 사이토카인 등)를 포함하도록 숙주 세포를 선택하고/하거나 유전자 조작할 수 있다. 숙주 세포(및 특히 숙주 게놈)에 인코딩된 다른 적합한 엔티티 중에서, 특히 고려되는 엔티티는 선택된 단백질 및 RNA를 포함한다. 예를 들어, 엔티티가 단백질인 경우, 단백질은 바이러스 페이로드의 전사를 제어하는 바이러스 벡터 상의 결합 부위에 결합할 수 있거나, 단백질은 페이로드를 인코딩하는 RNA의 번역 개시 부위 또는 리보솜 결합 부위 또는 IRES에 결합할 수 있다. 유사하게, 단백질은 또한 페이로드 서열에 선행하는 서열의 전사 개시 부위에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔티티는 페이로드 유전자에 의해 인코딩된 펩타이드에 대한 상호작용 단백질일 수 있고, 엔티티와 펩타이드 사이의 상호작용은 펩타이드의 분해 또는 불활성화를 유도한다. 또 다른 예에서, 하기에 더욱 상세히 추가로 제시되는 바와 같이, 엔티티가 핵산인 경우, 특히 바람직한 핵산은 페이로드를 인코딩하는 mRNA에 결합하여 번역을 억제하고/하거나 페이로드의 mRNA를 불안정화하는 siRNA, shRNA, 안티센스-RNA 및/또는 catRNA를 포함한다. 물론, 엔티티는 또한 (예를 들어, 형질감염, 리포펙션(lipofection), 전기천공 등과 같은 다양한 방법을 통해) 숙주 세포에 외부에서 공급될 수 있다.
페이로드를 인코딩하는 mRNA 상에 결합 부위가 이용 가능하지 않은 경우, 도 2에 예시적으로 도시된 바와 같이, 바람직하게는 페이로드의 코딩 영역(예를 들어, 5'-UTR 영역 내, 또는 번역 개시 영역 내)의 바로 상류의 페이로드를 인코딩하는 mRNA 내로의 결합 서열을 조작함으로써 간접적으로 저해를 수행할 수 있다. 그러나, 대안적인 양태에서, 엔티티의 결합 부위는 mRNA의 IRES 또는 2A 부위 또는 그 부근, 및/또는 3'-UTR에 존재할 수 있다. 전술한 바와 같이, 적합한 엔티티는 단백질뿐만 아니라 핵산을 포함할 것이다. 이러한 접근법은 바이러스 벡터 상의 표적 서열이, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA(하기에 더 상세히 제시되는 바와 같이 숙주 세포 게놈으로부터 전사되거나, 숙주 세포로 형질감염될 수 있음)를 사용하여 RNA 불안정화를 통한 번역 저해를 달성하기 위해 목적에 따라 선택되고 적절한 상황에 배치될 수 있기 때문에 특히 유리할 수 있다.
본 발명의 대상의 또 다른 예시적인 양태에서, 도 3에 개략적으로 도시된 바와 같이, 바이러스 벡터는 숙주 세포 게놈(또는 숙주 세포 내의 재조합 핵산) 상의 유전자의 발현을 유도하여, 그 결과 직접적으로 또는 간접적으로 바이러스 페이로드의 전사 및/또는 번역 및/또는 mRNA 안정성을 저해하거나, 감소시킬 상기 기재된 바와 같은 엔티티의 생성을 야기하는 조절 단백질(예를 들어, 전사 인자)을 인코딩할 수 있다(도 1 및 도 2에 도시된 바와 같음). 따라서, 이러한 예에서, 엔티티의 발현은 재조합 바이러스 핵산의 존재에 따라 조건부라는 것을 이해해야 한다. 이러한 조건부 발현은 숙주 세포가, 도 1 및 도 2의 시스템에서 그럴 수 있는 것처럼 저해 시스템의 방해 없이 상당한 밀도로 성장할 수 있기 때문에 특히 유리한 것으로 여겨진다. 유사하게, 도 4는 공동-리프레서의 하나의 부분이 숙주 세포의 게놈(또는 세포 내의 다른 재조합 핵산)에 의해 인코딩되는 한편, 다른 부분은 재조합 바이러스 핵산 상에 인코딩되는 숙주 세포와 바이러스 핵산 사이의 또 다른 협력적 접근법을 개략적으로 도시한다. 따라서, 이러한 시스템에서, 페이로드의 발현 저해는 숙주 세포에서 조절 유전자의 존재 하에 다시 조건부로 이루어진다.
도 5는 숙주 세포에서 존재하지 않거나 제거된 인자의 존재에 따라, 재조합 바이러스 핵산에서 페이로드의 발현이 조건부로 이루어지는 또 다른 시스템을 개략적으로 도시한다. 도 5의 예에서, 숙주 세포는 바이러스 감염에 반응하여 인터페론 감마를 생성하지 않도록 (예를 들어, 표적화된 결실, 부위 지정 돌연변이유발, 게놈 편집 등을 통해) 유전자 변형되고, 바이러스의 핵산은 페이로드가 인터페론 감마의 존재 하에서만 발현되도록 구성되며, 이는 페이로드 상류의 IFN-자극 반응 요소를 사용함으로써 달성될 수 있다. 반면에, 도 6에 개략적으로 도시된 바와 같이, 숙주 세포는 숙주 세포의 세포 프로세스를 방해하지 않지만, 바이러스 벡터로부터 생성되는 재조합 RNA의 번역을 억제하는 shRNA를 생성하도록 유전자 변형된다. 이러한 shRNA는 변형된 숙주 세포 게놈 또는 숙주 세포 내의 재조합 플라스미드로부터 제공될 수 있다.
추가로, 저해에 관련된 서열은 숙주 게놈에 존재하는 서열(나이브하거나 유전자 조작을 통함)에 제한될 필요는 없으나, 페이로드를 갖는 재조합 바이러스가 아데노바이러스인 경우, 세포를 공동 감염시키는 아데노-연관 바이러스 또는 재조합 플라스미드 상의 서열에 의해 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 결과적으로, 숙주 세포는 재조합 바이러스로 형질감염된 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 엔티티를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 유전자 조작 세포일 수 있으며, 엔티티는 재조합 바이러스의 RNA 상의 결합 부위에 결합한다. 유사하게, 고려되는 세포는 또한 재조합 바이러스로 형질감염된 숙주 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 엔티티를 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하도록 조작될 수 있으며, 재조합 핵산은 재조합 바이러스에 의해 인코딩되는 단백질 또는 핵산의 제어 하에 있다. 또한 추가로 고려되는 양태에서, 유전자 조작 세포는 또한 세포가 페이로드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스로 형질감염되는 경우, 세포에서 바이러스 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는 공동 리프레서의 제1 부분을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함할 수 있거나, 바이러스 감염시 인터페론 감마의 발현이 결여되도록 변형될 수 있다.
재조합 바이러스의 페이로드의 발현을 억제하는 방식에 관계없이, 적합한 시스템은 페이로드의 내용물 및/또는 크기에 관계없이, 소정량의 치료 바이러스 입자에 도달하기 위해 필요한 수율 및/또는 생성 시간의 관점에서 유의하게 개선된 균일성을 제공할 것으로 고려된다. 예를 들어, 바이러스 입자의 소정의 표적 역가 또는 총량(예를 들어, 표적 역가는 적어도 109 바이러스 입자/ml이거나, 표적 총량은 적어도 1011개의 바이러스 입자임)에 도달하기 위해 상이한 바이러스 제조 사이에 필요한 시간 가변성은 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 또는 10% 이하, 또는 5% 이하로 고려된다. 마찬가지로, 소정의 생성 시간(예를 들어, 6시간 후, 또는 8시간 후, 또는 12시간 후, 또는 18시간 후, 또는 24시간 후, 또는 36시간 후 등)에 바이러스 입자의 역가 또는 총수는 통상적으로 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 또는 10% 이하, 또는 5% 이하만큼 달라질 것이다.
따라서, 고려되는 시스템 및 방법은, 예를 들어 바이러스 스톡 또는 세포 스톡 첨가, 배지 첨가, 냉각, 원심분리 또는 여과, 패키징 등과 같은 조정된 처리 단계가 필요한 다중복합 또는 동시 프로세스에서 다수의 별개의 바이러스 제조물이 제조되는 바이러스 생성 환경에서 특히 유리할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 기재하고 청구하기 위해 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대 농도, 반응 조건 등을 나타내는 수치는 일부 경우에 용어 "약(about)"에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 기재된 설명 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 특정 구현예에 의해 획득하고자 하는 바람직한 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치 매개변수는 보고된 유효 자릿수의 수치에 비추어 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 기록된 것이다. 본 발명의 일부 구현예에 제시된 수치는 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함할 수 있다.
실시예
도 7은 예를 들어 TRiP 시스템(예를 들어, NATURE COMMUNICATIONS | 8:14834 | DOI: 10.1038/ncomms14834 참조)을 사용하여 mRNA의 번역이 억제될 수 있거나, 또는 하기에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이 mRNA의 안정성이 감소될 수 있거나, 또는 또한 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이 페이로드를 인코딩하는 DNA 절편의 전사가 감소되거나 차단되는, 재조합 바이러스에서 재조합 페이로드의 발현 억제를 위한 예시적인 옵션을 도시한다.
예를 들어, 전사를 억제하기 위한 하나의 예시적인 접근법에서, 본 발명자들은 도 8의 상부 패널에 개략적으로 도시된 바와 같이 대상 유전자와 조합하여 람다 리프레서 및 상응하는 오퍼레이터 서열을 사용하였다. 여기서, 재조합 핵산은 이량체 람다 리프레서가 결합된 2개의 오퍼레이터(리프레서 결합) 서열 부분 OL1 및 OL2를 갖는다. 리프레서가 결합되면, x자 표시된 점선 화살표로 표시된 바와 같이 프로모터 PL로부터의 전사가 억제된다. 오퍼레이터/리프레서가 박테리아에서 작동 가능하기 때문에, 진핵생물 시스템에서의 사용은 통상적으로 람다 리프레서를 핵으로 전달 가능하게 하기 위해 핵 위치 서열을 필요로 한다. 본 실시예에서, 핵 위치 서열은 도 8의 2개의 하부 도식에 개략적으로 도시된 바와 같이, 람다 리프레서를 위한 ORF의 상류 또는 하류에 개재된 가요성 링커(여기서는 GS 링커)와 함께 프레임으로 인코딩되었으며, 여기서 NLS는 핵 위치 서열이고, GS12는 가요성 링커이고, 람다 rep는 람다 리프레서이다. 융합 단백질의 발현은 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 다양한 프로모터로부터 유도될 수 있다. 본 실시예에서, eF1α 프로모터가 이용되었고, 람다 리프레서는 EC7 세포 내의 발현 벡터로부터 발현되었다.
도 9에 예시적으로 도시된 바와 같이 개시 코돈 ATG가 후행하는, 전사 개시의 상류의 TATA 박스 및 전사 개시의 하류의 Kozak 서열을 또한 포함하는 전사 개시의 바로 상류(+1로 표시됨)에 오퍼레이터 서열 요소 OL1 및 OL2를 배치함으로써 대상 유전자(여기서는 GFP)의 제어를 실현하였다. 여기서, 양성 대조군 서열은 오퍼레이터 서열 요소 OL1 및 OL2를 갖지 않으며, CMV 프로모터, TATA 박스, 전사 개시 부위, Kozak 서열 및 개시 코돈을 포함하였다. 이어서, 오퍼레이터 서열 요소 OL1 및 OL2의 배치는 다음 2개의 위치에서, 즉 CMV 프로모터 서열의 말단과 전사 개시(TATA 박스를 가로지름) 사이에 OL1 및 OL2의 삽입, 또는 CMV 프로모터 서열의 말단 부분(TATA 박스를 가로지름)의 대체에 의해 시험되었다. 도 10은 오퍼레이터 서열 요소 OL1 및 OL2의 대안적 배치를 추가로 도시하고, 5'- 및 3'-비번역 서열을 추가로 나타내며, 여기서 CDS는 대상 유전자의 코딩 서열을 나타낸다.
도 11은 발현 플라스미드로부터 발현된 선행(NLS-LR) 또는 후행(LR-NLS) 핵 위치 서열을 갖는 람다 리프레서를 발현시키는 형질감염된 EC7 숙주 세포에 대한 예시적인 결과를 도시한다. 재조합 EC7 세포를 또한 (a) GFP 유전자가 부재하고, (b) 오퍼레이터 서열 요소가 없는 GFP 유전자, (c) 도 9에 도시된 바와 같이 CMV 프로모터 서열의 말단의 일부를 대체하는 오퍼레이터 서열 요소를 갖는 GFP 유전자, 및 (d) 도 9에 도시된 바와 같이 CMV 프로모터 서열 후에 삽입된 오퍼레이터 서열 요소를 갖는 GFP 유전자를 보유하는, 제2 재조합 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 도 11에서 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 오퍼레이터 서열 요소의 삽입은 동일한 규모의 대조군에 대비하여 감소된 발현을 야기한다. 특히, EC7 세포가 또한 람다 리프레서를 발현시키는 경우, 전사는 실질적으로 완전히 없어졌다. 따라서, 핵 위치 서열을 포함하는 람다 리프레서와 함께 람다 오퍼레이터 서열 요소를 사용하여 전사 제어가 효과적으로 구현될 수 있음에 유의해야 한다.
전사를 억제하기 위한 또 다른 예시적인 접근법에서, 본 발명자들은 바이러스 벡터 또는 다른 발현 작제물에서 발견되는 서열에 결합하도록 설계된 shRNA를 인코딩하는 생성 세포에서 작제물을 갖는 유전자 변형된 세포를 생성함으로써 도 12에 개략적으로 도시된 시스템을 시험하였다. 도 12의 우측 부분은 표시된 바와 같이 shRNA를 생성하는 코딩 영역을 갖는 게놈 DNA를 도시하는 한편, 도 12의 좌측 부분은 3'-UTR에서 shRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 갖는 대상 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 시스템의 일부분을 도시한다. 예를 들어, 적합한 shRNA는 루시퍼라제(luciferase) 유전자, 베타-락타마제(beta-lactamase) 유전자, 및/또는 lacZ 유전자로부터 발췌될 수 있고, 발현 시스템은 각각 루시퍼라제, LacZ 및/또는 β-락타마제로부터의 3'UTR 함유 서열을 갖는 대상 유전자(예를 들어, GFP)를 인코딩하는 바이러스(예를 들어, AdV) 또는 플라스미드 DNA일 수 있다.
예시적인 시험 시스템에 대한 결과가 도 13에 도시되어 있다. 여기서 본 발명자들은 3개의 상이한 이종 유전자인 루시퍼라제, LacZ 또는 β-락타마제 중 하나로부터 발췌된 3'UTR 함유 shRNA 표적 부위를 갖는 GFP 전이유전자로 EC7 생성 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 이들 부위를 표적화하거나 표적화하지 않는(음성 대조군) shRNA를 인코딩하는 DNA를 또한 공동-형질감염시키고, 이들 세포에서의 GFP 강도를 전이유전자 발현에 접근하는 방법으로서 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 모든 경우에, 3'UTR을 표적화하는 shRNA가 존재하는 경우, GFP 발현은 비-표적화 shRNA와 비교하여, 유의하게 하향조절되었다. 마찬가지로, 도 14는 luc shRNA를 인코딩하는 서열로 형질감염된 EC7 생성 세포 및 형질감염되지 않은 대조군 세포로부터 얻은 결과를 도시한다. 이어서, 도면의 상부 패널에 제시된 바와 같이 GFP 유전자 및 shRNA 결합 부위를 보유하는 발현 벡터에 의한 형질감염에 대해 GFP 발현을 모니터링한다. 결과로부터 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이 GFP에 대한 특이적인 하향조절은, luc shRNA를 발현시키고, luc shRNA 결합 부위를 갖는 GFP를 인코딩하는 작제물로 형질감염된 세포에서만 관찰되었다. 따라서, shRNA는 트랜스제닉(transgenic) 카고의 발현을 효과적으로 하향조절할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
따라서, 본 발명자들은 염색체외 단위로 유지/제공되거나 게놈 내로 혼입될 수 있는 재조합 DNA의 절편으로부터의 하나 이상의 shRNA 종을 일시적으로, 더욱 바람직하게는 영구적으로 생성하도록 숙주 세포가 유전자 변형되는 예시적인 시스템을 고려한다. 이들 종의 후속 처리에 의해 RNA 유도 침묵화 복합체(RISC)가 상보적인 표적 서열을 보유하는 전사체를 분해하도록 유도할 수 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, AdV5 게놈에 보유되는 전이유전자의 3'UTR에 이러한 상보적인 표적 서열을 수용함으로써, 생겨난 전사체가 분해되어, 생성될 유전자 산물의 임의의 독성 효과를 방지할 수 있다. 가장 바람직하게는, shRNA는 이들이 생성 세포에서 내인성 유전자를 인식하지 않도록 선택될 것이다. 더욱이, 침묵화 가능성을 증대시키기 위해, 각각의 shRNA에 대한 표적 부위를 보유하는 3'UTR과 함께 다수의(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개의) 상이한 shRNA를 발현시키는 재조합 작제물/숙주 세포가 생성될 수 있음이 추가로 고려된다.
전사를 제어하기 위한 또 다른 접근법에서, 본 발명자들은 재조합 IE86(및 그의 변이체)이 EC7 생성 세포에서 발현되는 시스템을 사용하였다. 여기서, IE86은 crs(시스-억제 서열) 서열 요소에 특이적으로 결합하고, 여기서 프로모터 서열의 일부인 crs 서열 요소, 전사가 감소되거나 억제될 수 있다. 도 15는 발현 유전자(여기서는 GFP)가 배치될 수 있는 다중-클로닝 부위의 상류에 crs 서열 요소가 후행하는 CMV 프로모터를 갖는 예시적인 프로모터 서열을 도시한다. 재조합 DNA를 IE86에 의한 억제에 감응성이 되도록 하기 위해서는, 재조합에 의해 세포가 IE86을 발현시키도록 해야 한다. 도 16은 EC7 세포에서 발현 플라스미드(pEAK8)로부터의 IE86 및 그의 변이체의 재조합 발현에 대한 예시적인 결과를 도시한다. 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 모든 재조합 형태는 생성 세포에서 잘 발현되었다. 이렇게 생성된 IE86 및 변이체 형태의 기능적 영향을 시험하기 위해, IE86 발현 세포를 GFP 유전자의 발현을 제어하기 위해 프로모터에 crs 서열 요소를 포함하는 발현 작제물로 추가로 형질감염시켰다. 도 17의 결과로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 프로모터(crs-셔틀-GFP)에 crs 서열 요소를 포함하는 발현 작제물은 또한 IE86을 발현시키는 세포에서 GFP 유전자의 발현을 하향조절하였다. 도 18은 그래프에 나타낸 바와 같이 형질감염된 세포에 대한 유세포 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다: 형질감염되지 않은 모든 세포의 경우 유의한 형광이 관찰되지 않았지만, 프로모터(crs-셔틀-GFP)에 crs 서열 요소를 포함하는 발현 작제물로 형질감염되었으나 IE86 또는 그의 변이체를 인코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염되지 않은 세포의 경우, 고형광이 측정되었다. 프로모터(crs-셔틀-GFP)에 crs 서열 요소를 포함하는 발현 작제물로 형질감염되고 IE86 또는 그의 변이체를 인코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염된 세포에서 감소된 형광이 관찰되었다.
추가의 예: 잠재성 막 단백질 1(LMP1)은 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스(EBV)의 내재성 막 단백질이며, CD40 모방체로서 수지상 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하여 이러한 세포에서 발현시 면역 적격 세포의 다양한 변화를 유도한다. 유사하게, IPS-1(인터페론-β 프로모터 자극인자 1)은 유형 I 인터페론 및 인터페론-유도성 유전자를 유도함으로써 수지상 세포를 활성화시킨다. 따라서, LMP-1 및 IPS-1 둘 모두는 면역요법, 더욱 구체적으로 종양 연관 항원을 발현시키는 DNA 백신을 위한 효과적인 공자극 분자로서 제안되었다. 그러나, 바이러스 복제 동안 숙주 세포에서 LMP-1 및/또는 IPS-1의 발현은 숙주 세포에서 바이러스 생성 수준에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 1: 본 발명자들은 우성 음성 돌연변이체 인터페론 조절 전사 인자 3(예를 들어, IRF3-ΔN 등)을 발현시키도록 숙주 세포를 유전자 변형시킴으로써, LMP-1, IPS-1, 또는 융합 단백질 LMP-IPS-1(LMP1 및 IPS-1의 N-말단 응집 도메인)의 발현이 숙주 세포에서 억제될 수 있음을 고려한다. 이 실시예에서, 페이로드(종양 연관 항원과 연결되거나 연결되지 않은 LMP-1, IPS-1, LMP-IPS-1)를 인코딩하는 재조합 핵산은 또한, 페이로드 유전자에 작동 가능하게 연결된 IRF3에 반응성인 프로모터(예를 들어, IFN-α 프로모터, IFN-β 프로모터 등)를 포함한다. 우성 음성 돌연변이체 IRF3은 숙주 세포에서 페이로드 단백질의 발현을 감소시키거나 제거할 수 있도록 페이로드 유전자의 전사를 저해하는 것으로 고려된다.
실시예 2: 본 발명자들은 코딩 서열에 측접하는 LMP-1, IPS-1, 또는 5'- 또는 3'- UTR에 특이적인 조절/저해 RNA(예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA 등)를 발현시키도록 숙주 세포를 유전자 변형함으로써, LMP-1, IPS-1 또는 융합 단백질 LMP-IPS-1의 발현이 숙주 세포에서 억제될 수 있음을 고려한다. 조절/저해 RNA는 페이로드 유전자의 발현이 숙주 세포에서 실질적으로 감소되거나 제거될 수 있도록 페이로드 유전자의 전사체를 불안정화할 수 있고/있거나 이들의 번역을 억제하는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 조절/저해 RNA를 항시적으로 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 조절/저해 RNA를 조건부로 생성하도록 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 페이로드는 또한 다른 페이로드 유전자(LMP-1, IPS-1 또는 LMP-IPS-1)와 동일한 프로모터 하에 오픈 리딩 프레임에 엑디손(ecdysone)(곤충 스테로이드 호르몬)을 인코딩하는 핵산 단편을 포함할 수 있다. 숙주 세포는 엑디손 반응성 프로모터 하에 조절/저해 RNA를 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다. 이러한 실시예에서, 조절/저해 RNA는 LMP-1, IPS-1, 또는 LMP-IPS-1에 특이적인 것들, 및 적어도 페이로드 유전자가 전사 개시되는 경우에만 페이로드가 발현되도록 엑디손에 특이적인 것을 포함한다. 따라서, 조절/저해 RNA의 발현은 페이로드 단백질의 발현에 대해 조건부이고, 조절/저해 RNA는 페이로드의 발현이 부재하는 숙주 세포에서 불필요하게 발현되지 않을 수 있다.
실시예 3: 본 발명자들은 페이로드로부터 숙주 세포로 발생하는 임의의 독성이 감소하거나 제거될 수 있도록 하고/하거나 페이로드의 임의의 기능이 약화될 수 있도록, 페이로드를 불활성화시키거나 분해하는 결합 분자를 발현시키도록 숙주 세포를 유전자 변형함으로써 숙주 세포에서 IPS-1 또는 융합 단백질 LMP-IPS-1의 발현을 억제할 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 숙주 세포는 IPS-1을 특이적으로 절단하는 C형 간염 NS3-4a 프로테아제를 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 항시적 C형 간염 NS3-4a 프로테아제로 유전자 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 C형 간염 NS3-4a 프로테아제를 조건부로 생성하도록 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 IPS-1 신호전달의 하류의 전사 인자에 반응하는 IRF3 프로모터 하에서 C형 간염 NS3-4a 프로테아제를 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다. 이러한 실시예에서, C형 간염 NS3-4a 프로테아제는 페이로드 유전자가 전사 개시되고 발현되어, IPS-1 신호전달 경로가 개시되는 경우에만 발현된다. 따라서, C형 간염 NS3-4a 프로테아제의 발현은 페이로드 단백질의 발현에 대해 조건부이고, C형 간염 NS3-4a 프로테아제는 페이로드의 발현이 부재하는 숙주 세포에서 불필요하게 발현되지 않을 수 있다.
실시예 4: 본 발명자들은 mRNA의 분해를 야기하기 위해, IPS-1 또는 융합 단백질의 mRNA 전사체에 결합할 하나 이상의 shRNA 분자를 발현시키도록 숙주 세포를 유전자 변형시킴으로써, 숙주 세포에서 IPS-1 또는 융합 단백질 LMP-IPS-1의 발현을 억제할 수 있음을 고려한다. 이를 위해, 본 발명자들은 생성 세포(예를 들어, EC7 세포, CHO 세포 등)에 의해 안정적으로 생성되는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)에 의해 트랜스제닉 카고 발현이 억제됨으로써, 방해받지 않는 바이러스 증폭이 가능한 시험 시스템을 생성하였다.
본 명세서의 기재내용 및 뒤따르는 청구범위 전체에 사용된 바와 같이, 단수형의 의미는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 복수의 참조물을 포함한다. 또한, 본 명세서의 기재내용에 사용된 바와 같이, 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, "에서(in)"의 의미는 "에서" 및 "상에(on)"을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 용어 "에 연결된(coupled to)"은 직접 연결(서로 연결된 2개의 요소가 서로 접촉됨) 및 간접 연결(적어도 하나의 추가 요소가 2개의 요소 사이에 위치함) 둘 모두를 포함하도록 하고자 한다. 따라서, 용어 "에 연결된" 및 "와 연결된(coupled with)"은 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 값의 범위의 언급은 단지, 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 기재 방법으로서 기능하는 것으로 하고자 한다. 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥상 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서의 특정 구현예와 관련하여 제공된 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하는 것을 목적으로 하며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 명세서의 표현은 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 본 발명의 개념을 벗어나지 않고, 앞서 기재된 것 이외의 더 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백해야 한다. 따라서, 본 발명의 대상은 첨부된 청구범위의 범위를 제외하고는 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 본 명세서 및 청구범위 둘 모두의 해석에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가장 넓은 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급되는 요소, 구성요소 또는 단계가 명시적으로 언급되지 않는 다른 요소, 구성요소 또는 단계와 함께 존재하거나 이용되거나 조합될 수 있음을 나타내는 비-배타적인 방식으로 요소, 구성요소 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서의 청구범위에 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 적어도 하나가 언급된 경우, 문자는 A + N, 또는 B + N 등이 아니라 군으로부터의 하나의 요소만을 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. 복수의 재조합 치료 아데노바이러스를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    CHO 세포와 EC7 세포에서 선택된 숙주 세포를 제공하는 단계 - 상기 숙주 세포는 람다 리프레서, 및 콕사키(Coxsackie) 및 아데노바이러스 수용체(CXADR)를 발현함 -;
    E2b-결실 아데노바이러스 유형 5를 상기 숙주 세포에 형질감염시키는 단계 - 상기 바이러스는 바이러스 페이로드 유전자 및 람다 오퍼레이터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 숙주 세포의 람다 리프레서 단백질은 상기 람다 오퍼레이터와 결합할 수 있고, 그리고 이에 따라 재조합 숙주 세포에서 상기 바이러스 페이로드의 발현을 감소시킴 -;
    적어도 108 바이러스 입자/mL인 바이러스 역가를 생성하기 위하여 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 EC7 세포인, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 재조합 핵산으로부터 CXADR을 발현하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스 페이로드 유전자는 치료에 사용되는 재조합 유전자인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포를 배양할 때 생성되는 상기 바이러스 역가는 적어도 109 바이러스 입자/mL인, 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 공자극 분자, 체크포인트 저해제, 사이토카인 또는 네오에피토프를 인코딩하는, 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3694988A4 (en) 2017-10-10 2021-07-14 NantBio, Inc. MODIFIED EC7 CELLS WITH LOW TOXICITY TO VIRAL PRODUCTION LOADS
US20220228129A1 (en) * 2019-04-26 2022-07-21 The Regents Of The University Of California Cells for enhanced production of adeno-associated virus
CN115103917A (zh) * 2019-08-09 2022-09-23 南托米克斯有限责任公司 测定新表位有效负载毒性的机器方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991013979A1 (en) 1990-03-05 1991-09-19 President And Fellows Of Harvard College Transgenic mouse overexpressing il-4 and method of use
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US6025192A (en) 1996-09-20 2000-02-15 Cold Spring Harbor Laboratory Modified retroviral vectors
AU728220B2 (en) 1997-04-14 2001-01-04 Cell Genesys, Inc. Methods for increasing the efficiency of recombinant AAV product
AU4924199A (en) * 1998-07-30 2000-02-21 Advec, Inc. Repressor proteins producing cell lines for the propagation of vectors
TWI262948B (en) * 1998-10-15 2006-10-01 Canji Inc Selectively replicating viral vectors
US20020045250A1 (en) * 2000-07-25 2002-04-18 Wadsworth Samuel C. Methods for purified AAV vector production
JP2002153278A (ja) * 2000-11-22 2002-05-28 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc ウイルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウイルスベクターの製造方法
JPWO2005063984A1 (ja) 2003-12-30 2007-07-19 澁谷　正史 遺伝子発現を抑制する二本鎖ｒｎａ
US8138327B2 (en) 2004-11-23 2012-03-20 City Of Hope Inducible systems and methods for controlling siRNA expression
KR20130114758A (ko) * 2005-05-27 2013-10-17 오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘. Ｍｉ-ｒｎａ를 포함하는 유전자 벡터
WO2008069663A1 (en) * 2006-12-07 2008-06-12 Publiekrechtelijke Rechtspersoon Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Leids Universitair Medisch Centrum Use of a varicellovirus tap-inhibitor for the induction of tumor- or virus-specific immunity against teipp
US8273722B2 (en) 2007-07-13 2012-09-25 Dharmacon, Inc. Enhanced biotherapeutic production using inhibitory RNA
CN101787373B (zh) 2009-01-23 2013-06-19 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途
CN102917709B (zh) 2009-12-23 2018-04-24 格兰达利斯有限公司 弗林蛋白酶敲减和gm-csf增强的（fang）癌症疫苗
US20120083035A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Dharmacon, Inc. Modified Cell Lines for Increasing Lentiviral Titers
EP2892930B1 (en) 2012-09-07 2019-08-14 University Of Miami Fusion proteins for promoting an immune response, nucleic acids encoding same, and methods of making and use thereof
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
EP3359675B1 (en) 2015-10-07 2024-01-03 Nant Holdings IP, LLC Activation of immune-related signalling pathways in cells via optofection
US11560418B2 (en) * 2015-10-20 2023-01-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor IX fusion proteins
TWI733719B (zh) 2015-12-07 2021-07-21 美商河谷控股Ｉｐ有限責任公司 改善的組合物及用於新表位之病毒遞送的方法及其應用
CA3099990A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 University Of Massachusetts Viral vector production
EP3694988A4 (en) 2017-10-10 2021-07-14 NantBio, Inc. MODIFIED EC7 CELLS WITH LOW TOXICITY TO VIRAL PRODUCTION LOADS

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