CN115103917A - 测定新表位有效负载毒性的机器方法 - Google Patents

Abstract

提供了允许测定和预测治疗性病毒中的有效负载毒性的系统和方法。本文披露了测定细胞中所表达的多肽的有效负载毒性的方法，这些方法包括：产生或获得多个表达载体，每个表达载体包含编码对应重组多肽的不同重组核酸序列；在培养多个宿主细胞的同时在这些宿主细胞中表达该重组核酸序列；在培养这些宿主细胞后对该多个表达载体进行测序；以及将该重组核酸序列的至少部分与毒性量度相关联。

Description

测定新表位有效负载毒性的机器方法

本申请要求2019年8月9日提交的序列号为62/885,089的我们共同未决的美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请通过援引以其全文并入本文。

序列表

名称为102402.0071PCT_ST25、大小为2KB的序列表的ASCII文本文件的内容创建于2019年7月23日，并通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，且通过援引以其全文并入。

技术领域

本披露涉及测定和/或避免重组病毒有效负载在宿主生物体中的毒性的各种系统和方法，特别是当其涉及新表位在用于生产治疗性病毒的宿主细胞中的毒性时。

背景技术

背景技术描述包括在理解本披露中可能有用的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请都通过援引并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过援引并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

重组治疗性病毒疫苗的产生已经成为治疗各种疾病，特别是对于用于制备癌症疫苗的病毒而言越来越有吸引力的策略。不幸的是，尽管对潜在免疫原性新表位序列的鉴定和选择已经取得了快速进展，但在大多数情况下，一个或多个所表达的新表位的毒性仅在产生治疗性重组病毒和开始大规模病毒生产后才变得明显。为了避免与潜在有效负载毒性相关的至少一些缺点，重组有效负载的表达可以按各种方式在生产细胞中被抑制，如PCT/US 2018/054982中所述。这种方法将有利地在生产环境中实现适当高的病毒滴度。然而，一旦患者细胞被重组治疗性病毒感染，患者细胞中的有效负载毒性作用可降低一个或多个新表位的表达。在其他已知方法中，蛋白质的毒性可使用预测算法来确定，该预测算法基于已知蛋白质的已知毒性来鉴定蛋白质中的潜在毒性序列(参见PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]8(9)：e73957)。虽然在概念上有吸引力，但这种方法基于天然存在的多肽，并且通常不适用于人工序列构建体(例如，编码通过接头序列连接并任选地含有运输信号的多个新表位序列)。

因此，即使本领域已知降低重组病毒有效负载的毒性作用的各种方法，但它们中的全部或几乎全部都具有各种缺点。因此，需要提供允许生产毒性降低的重组治疗性病毒的改进的组合物和方法。

发明内容

提供了允许测定重组治疗性病毒中的有效负载毒性的各种系统和方法。在本发明主题的一个方面，本发明人考虑了测定细胞中所表达的多肽的有效负载毒性的方法，该方法包括产生或获得多个表达载体的步骤，每个表达载体包含编码对应重组多肽的不同重组核酸序列，在培养多个宿主细胞的同时在这些宿主细胞中表达该重组核酸序列的又一步骤，在培养这些宿主细胞后对该多个表达载体进行测序的另一步骤，以及将该重组核酸序列的至少部分与毒性量度相关联的步骤。

在至少一些实施例中，表达载体是病毒表达载体，特别是相应治疗性病毒的重组基因组。进一步考虑了该重组多肽是包含多个新抗原的多表位(polytope)，通常这些新抗原被接头肽分开。优选地，这些新抗原具有8至50个氨基酸的长度，和/或该多表位包含至少200个氨基酸。

还应当理解，该重组核酸序列可以在该多个宿主细胞中单克隆或多克隆表达。因此，该多个表达载体可以单独测序，或在表达载体的混合物中测序。在所考虑的方法的另外方面，在宿主细胞中观测毒性量度(例如，作为细胞死亡、细胞应激、细胞分裂减少和/或病毒产量降低)，而在其他方面，在病毒的重组核酸序列中观测毒性量度(例如，作为无义突变、错义突变和/或缺失)。

另外，考虑了关联步骤使用机器学习，该机器学习可采用各种分类器，诸如线性分类器、基于NMF的分类器、基于图形的分类器、基于树的分类器、基于贝叶斯(Bayesian)的分类器、基于规则的分类器、基于网的分类器或kNN分类器。替代性地，该机器学习也可以使用自动编码器。如果需要，该机器学习可以进一步使用该重组多肽的次要方面，诸如该多肽的折叠模式、该多肽的二级结构、极性结构域、带电荷的结构域、疏水结构域、亲水结构域和/或该多肽的聚集。

从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。

附图说明

图1描绘了通过qPCR测定的对各种有效负载产生的细胞应激的示例性测定结果。

图2描绘了通过XBP1切割测定的对各种有效负载产生的细胞应激的示例性测定结果。

图3描绘了通过蛋白质印迹(Western Blot)测定的对各种有效负载产生的细胞应激的示例性测定结果。

具体实施方式

本发明人现已发现，可以采用测定有效负载毒性的基于合理性的方法，其中将相应病毒的多个有效负载序列与生产该病毒的宿主细胞中的一个或多个毒性量度相关联，优选地使用机器学习方法。

为此，并且在本发明主题的更一般的方面，本发明人考虑了在相同的宿主细胞系(其相应的培养物)中表达多个病毒有效负载以至少在一定程度上产生病毒子代。然后根据毒性量度的类型(例如细胞应激、细胞凋亡、宿主细胞生长停滞、有效负载中的突变(例如无义、错义)、在预定培养时间病毒滴度的降低、目标滴度的生产时间增加等)来分析细胞和/或病毒培养物。当然，应当理解，分析可以在个体/克隆基础上进行，或使用混合(病毒和/或宿主细胞)克隆群体大规模平行进行。然后使用将一个或多个毒性量度与一个或多个有效负载序列参数(例如，电荷和/或疏水性模式、特定氨基酸使用或模式、结构基序或折叠模式等)相关联的机器学习来处理有效负载序列的分析结果。最典型地，在单个有效负载内的多于一个新表位(诸如多表位或单个翻译单位)上分析有效负载序列参数。

具有相应有效负载的多个病毒的克隆多样性的获得或产生可以基于各种材料，并且特别地包括可以从各种可公开获得的来源(例如，Genomics ProteomicsBioinformatics[基因组蛋白质组与生物信息学]16(2018)276-282；或WO 2016/172722)获得的患者新表位序列，或使用本领域已知的各种方法(参见例如Science[科学].2015；348：69-74；或J Clin Invest.[临床研究杂志]2015；125：3413-3421；或R Soc Open Sci.[皇家学会开放科学]2017；4：170050；或R Soc Open Sci.[皇家学会开放科学]2017；4：170050)从未公开的患者或TCGA数据得出的从头测定的新抗原序列。可以使用各种生物信息学工具进一步细化此类数据以预测MHC结合，特别熟知的工具是NetMHC 4.0。

最典型地，所考虑的方法中的新抗原(也称为新表位)排列在重组多表位序列中，优选地具有居间的柔性接头序列。此外，所考虑的多表位序列可以进一步包括运输序列以将重组蛋白质导向特定的亚细胞位置(例如细胞质、溶酶体、核内体等)。如果需要，也可以包括泛素化信号。示例性的合适序列排列描述于WO 2017/222619中。在此上下文中，应当理解的是，当新抗原存在并在多表位中表达时，毒性量度可涉及单独的新抗原，或涉及包含多于一种新抗原的多肽。从不同的角度来看，考虑了两种或更多种原本无毒性的新抗原可能在此类新抗原形成多表位的情况下对宿主细胞具有毒性作用。当分析单独的抗原本身时，这种化合物毒性是不可检测的。如将容易理解的，新抗原，并且更优选地含有新抗原的多表位将从表达载体表达，该表达载体可以进一步包括另外的功能性(例如，共刺激分子、细胞因子、ALT-803、TxM型分子、检查点抑制剂等)。

尽管大多数表达载体被认为适用于本文，但特别优选的是，新抗原或多表位使用本领域已知的合适控制元件从重组病毒基因组表达。在本文提供的方法中使用此类重组病毒将提供至少两个优点，包括在治疗性病毒的生产中在下游使用此类病毒，以及在病毒繁殖的情况下评估潜在毒性。因此，用于评估毒性的宿主细胞将具有允许病毒感染的合适构型。例如，当重组病毒是缺失E2b蛋白质的AdV腺病毒时，所考虑的宿主细胞将(天然地或从重组核酸)表达CXADR(柯萨奇病毒和腺病毒受体)。用于基于腺病毒的系统的示例性宿主细胞包括E.C7细胞(可从依图比克斯公司(Etubics)商购获得)以及WO 2009/006479和WO2017/136748中所述的那些。进一步考虑的适合用作治疗性抗原的重组表达载体的病毒包括各种腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，腺病毒是特别优选的。此外，进一步优选的是，病毒是复制缺陷的非免疫原性病毒，其典型地通过靶向缺失选择的病毒蛋白(例如，E1、E3蛋白)来实现。此类希望的特性可以通过缺失E2b基因功能来进一步增强，并且如最近报道的(例如，J Virol.[病毒学杂志]1998年2月；72(2)：926-933)，可以使用经基因修饰的人293细胞来获得高滴度的重组病毒。

关于有效负载的毒性，应了解毒性可以多种方式影响宿主(即，感染或以其他方式转染)细胞以及病毒。例如，所表达的多表位或其部分(例如，一种或多种新抗原或新抗原-接头部分)可能直接对细胞有毒并且干扰代谢、细胞分裂或细胞信号传导。另一方面，所表达的多表位或其部分也可以是间接有毒的，并且可以影响各种细胞内过程和结构，诸如转录、翻译、蛋白质转换、能量产生，以及各种细胞器的膜完整性、核和/或线粒体稳定性等。此外，应当注意，所表达的多表位或其部分可以对细胞施加不利的选择性压力，并且因此可以间接地导致编码所表达的多表位或其部分的核酸中的突变。因此，毒性也可能导致产生突变的重组(病毒)核酸，其中突变的核酸将具有降低不利的选择压力的提前终止密码子和/或错义突变。因此，从不同的角度来看，毒性可导致细胞死亡(通常通过细胞凋亡或坏死)、细胞分裂减少或以其他方式受损、细胞应激(和通常相关的代谢和(病毒)复制减少)、重组有效负载突变、在预定培养时间病毒滴度的降低，和/或预定目标滴度的生产时间增加。

在进一步考虑的方面，还可以使用可以直接或间接观测到的宿主细胞中的各种替代量度在体内测定毒性。例如，可以定量宿主细胞中与细胞凋亡或细胞应激相关联的一种或多种生物标志物。如下文更详细所示，可测量ER应激标志物(例如BiP/Grp78、XBP-1裂解)的上调，以及抑制与宿主细胞存活相关联的CHOP诱导的凋亡。另外，应当认识到，细胞应激也可以使用计算机组学方法来鉴定甚至量化，其中应激相关转录因子(例如，XBP-1)激活重组标志物分子(例如，GFP)的表达。

因此，根据观测到的毒性类型，有效负载在宿主细胞中的表达可以通过单克隆方式或在混合培养物中进行。例如，在有效负载是包括实际患者新抗原的多表位并且有效负载已经存在于治疗性病毒中的情况下，有效负载的表达通常以单克隆方式进行(即，用治疗性病毒的单个克隆(基因型)感染宿主细胞并且将如此感染的细胞培养至期望的细胞密度和/或病毒滴度)。另一方面，在有效负载是探索性有效负载(即，不用于治疗性病毒)的情况下，具有基于相同多表位的多样性文库的多个重组病毒可用于转染多克隆病毒培养物中的多个宿主细胞，如下文更详细描述的那样。

不考虑有效负载的毒性类型，病毒的重组核酸(或其他表达载体)的序列分析可以按本领域熟知的多种方式进行，并且有效负载的类型和/或观测到的毒性将至少部分地决定所用测序的类型。例如，在有效负载存在于治疗性病毒中并且病毒以单克隆方式增殖的情况下，可从病毒分离株进行序列分析。另一方面，在多个病毒在多克隆病毒培养物中繁殖的情况下，可以使用集体核酸整体进行测序，而无需事先对单独的病毒进行克隆选择。当然，应当理解，所有测序方法优选地是允许高数据吞吐量的自动化测序方法，诸如NextGen/Illumina测序和其他大规模平行测序方法。在此上下文中，应当认识到，在对混合病毒核酸(例如，诸如从多克隆病毒培养物获得的那些)进行测序的情况下，序列分析将采用可提供编码新抗原和/或新表位的核酸中特定碱基位置的“等位基因分数”或“纯度/突变体分数”的方法。在序列号为62/714,570(PANBAM：BAMBAM Across Multiple Organisms InParallel[PANBAM：并行跨多个生物体的BAMBAM])和62/681,800(Difference-BasedGenomic Identity Scores[基于差异的基因组身份评分])的我们共同未决的美国临时申请中描述了示例性的合适方法，两篇美国临时申请均通过援引并入。

此外，应当注意的是，可以在细胞培养过程中的多个时间进行序列分析，从而有助于鉴定突变(在一个或所有病毒基因组中)随时间的发生率和分数。因此，应当理解，序列分析将不仅提供病毒或病毒群体中突变的定性信息，而且还提供病毒或病毒群体中突变的定量和时间信息。例如，在细胞培养物用于繁殖单克隆病毒群体(例如，用于治疗性病毒)的情况下，可以按预定的间隔取出病毒样品以在测序后揭示病毒突变体随时间的发生和分数。另一方面，在细胞培养物用于繁殖多克隆病毒群体(例如，基于突变体序列的文库)的情况下，可以以预定的间隔取出病毒样品以在测序后揭示所选的病毒突变体随时间的动态机会。

取决于观测到的毒性量度和突变类型，可以采用各种机器学习算法来使有效负载序列中的一个或多个基序(例如，结构域、特定位置中的一个或多个氨基酸、序列长度、氨基酸组成、预测的折叠等)与观测到的毒性相关联。将容易理解的是，可以选择多种类型的分类器，并且合适的分类器包括线性分类器、基于NMF的分类器、基于图形的分类器、基于树的分类器、基于贝叶斯的分类器、基于规则的分类器、基于网的分类器、kNN分类器或其他类型的分类器中的一个或多个。更具体的实例包括NMF预测器(线性)、SVMlight(线性)、SVMlight一阶多项式核(d次多项式)、SVMlight二阶多项式核(d次多项式)、WEKA SMO(线性)、WEKA i48树(基于树)、WEKA hyper pipe(基于分布)、WEKA随机森林(基于树)、WEKA朴素贝叶斯(概率/贝叶斯)、WEKA JRip(基于规则)、glmnet lasso(稀疏线性)、glmnet岭回归(稀疏线性)、glmnet弹性网(稀疏线性)、人工神经网络(例如，ANN、RNN、CNN等)等等。预测模型模板140的另外来源包括Microsoft的CNTK(参见URL github.com/Microsoft/cntk)、TensorFlow(参见URL www.tensorflow.com)、PyBrain(参见URL pybrain.org)或其他来源。

替代性地，特别是在可获得的毒性实例数量相对较少的情况下，本发明人考虑使用在MHC-肽结合问题上经过训练的编码器来获得示例新表位的表示，并从那里训练特定于生产细胞系的毒性分类器。虽然至少在最初这种方法可能无法很好地推广并且会出错误，但是可以采用人工监督来标记那些预测的毒性证明是不正确的实例，并将它们添加到训练集中。使用这样的干预，系统精度应快速地提高并且最终很好地推广。

一旦达到数据阈值，机器学习也可以使用其中采用自动编码器的方法(参见例如arXiv：1610.02415v3)，该自动编码器允许将多表位转换成连续的潜在空间，然后从潜在空间回到多表位。为了约束潜在表示的结构，可以联合训练各种分子特性的预测器。任何编码器/解码器对所允许的一个好处是能够扰动潜在空间中的点或在点之间进行内插，随后通过解码器传递新的表示，在这种情况下，对可能的所得多表位进行采样。但是因为潜在表示是与预测多表位特性的任务联合学习的，所以应当注意，潜在空间也变得更适合于针对期望特性对多表位进行优化。换句话说，可以使用来自经过训练的预测器的梯度来移动潜在空间中的点，使得其将导致或多或少的期望特性。

关于毒性和MHC结合工作，应当注意，如果从肽的潜在表示预测的联合训练的特性之一对某一生产细胞是有毒性的，那么，一旦具有候选新表位，就可以遵循潜在空间中的梯度以最小化毒性，同时试图保持对原始候选物的保真度。如果从表示肽的相同潜在空间也预测了与不同MHC等位基因的结合，那么在理论上，将能够平行地进行优化以最大化所关注等位基因中的预测结合并最小化毒性以选择生产方法。

注意，可以对多个细胞系或生产过程中的毒性进行多个并行预测(假设各自有足够的数据进行训练)。此外，当考虑毒性而优化时，可将一种或多种生产方法毒性用作约束条件。此外，应当注意，允许的肽修饰的类型仅受用于编码器/解码器的模型的设计选择的限制。因此，可以处理输入和输出中的可变长度的模型(诸如完全卷积网或RNN)可以允许肽长度以及氨基酸取代的变化。

因此，应当理解，基于观测到的毒性和对有效负载序列的了解，可以获知毒性参数(尤其是毒性阈值)。一旦建立，已知的有效负载便可被消除或重构以降低或完全避免对宿主细胞的毒性。

实例

对病毒有效负载中毒性和相关观测到的突变的测定：在以下实施例中，构建有效负载并克隆到缺失E2b基因的AdV病毒中，并将该病毒在E.C7细胞中繁殖。观测毒性并如所述检测病毒有效负载的遗传变化。多表位的长度在约1.1Kb与11.2Kb之间变化，并且进一步包括泛素化信号、共刺激分子和运输信号，如下表中所示。

从表中可以看出，毒性有效负载导致病毒有效负载中的缺失、点突变和无义突变，以及病毒颗粒达到预定滴度的生产较慢。此外，应当注意，毒性可以与有效负载序列和有效负载序列中的伴随变化相关联。

检测有效负载毒性的模型生物标志物：在此示例性系统中，将E.C7细胞用1μM毒胡萝卜素(Thapsigargin)处理或使用Lipofectamine 3000用pShuttle质粒转染。使用RNeasy(凯杰公司(Qiagen))和高容量cDNA合成试剂盒(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))根据制造商的方案进行逆转录和cDNA合成。通过将样品归一化为内部对照RPL19来计算相对mRNA表达。使用以下引物在rtPCR后使用qPCR对表达进行定量：

图1-3描绘了这种模型系统的示例性结果。更具体地，图1显示了用毒胡萝卜素作为阳性对照处理细胞时的所选生物标志物(上图)和携带所示有效负载的表达载体的示例性毒性结果(下图)。图2描绘了XBP1切割的示例性结果，并且图3描述了蛋白质印迹的结果。在此，将E.C7细胞用1μg/mL的衣霉素(Tunicamycin)处理或使用Lipofectamine 3000用pShuttle质粒转染。使用补充有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1mM Na₂EDTA、1mM EGTA、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠)提取总蛋白质裂解物。以1∶1000稀释度用BiP(CST#3177)、CHOP(CST#2895)和GAPDH(CST#2118)抗体探测裂解物。

多克隆病毒培养和测序：从具有编码由柔性间隔区分隔的20个新抗原的多表位的治疗性病毒的单个克隆开始，在AdV病毒中构建多样性文库，其中每个克隆将在至少一个氨基酸位置具有至少一个随机突变。保留文库的第一个样品用于测序。然后在E.C7细胞中繁殖病毒表达文库，并在不同的时间点(例如，6小时、12小时、18小时、24小时等)取出病毒样品，并且在病毒生产结束时，取出最终的病毒样品。然后从每个样品中分离核酸，从而产生代表文库成员的混合核酸群体。然后对如此制备的核酸进行测序并对测序数据进行分析，优选地使用同步增量比对，例如，如在公开号为WO 2020/028862(PANBAM：BAMBAM AcrossMultiple Organisms In Parallel[PANBAM：并行跨多个生物体的BAMBAM])和WO 2019/236842(Difference-Based Genomic Identity Scores[基于差异的基因组身份评分])的我们共同未决的专利申请中所述。然后确定每个碱基位置的碱基调用分数，并且可以识别群体的变化。例如，在单个病毒克隆由于特定位置的特定碱基而具有较低的复制速率的情况下，该碱基的等位基因分数将随时间降低。同样地，在单个病毒克隆由于特定位置的特定碱基而具有较高的复制速率(例如，导致毒性降低)的情况下，该碱基的等位基因分数将随时间增加。

当然，应当理解，分析不一定限于对特定碱基和直接毒性的观测，而是还可以包括二次分析。例如，单个氨基酸的变化可导致不同的空间构象(折叠)、净电荷的变化、二级结构的变化、亲脂性的变化等，并且所有此类变化都可以包括在任何机器学习算法中。因此，从不同的角度来看，应当理解，一个或多个毒性参数(例如，宿主细胞生长减少、宿主细胞中应激反应增加、宿主细胞死亡、宿主细胞中病毒生产降低或减缓、病毒核酸中的突变尤其是重组有效负载中的突变(例如，缺失、无义或错义突变)、病毒滴度降低等)不仅可以与线性肽序列相关联，而且还可以与该线性肽序列的次要方面相关联。最典型地，此类次要方面包括所表达的多肽的折叠模式和/或错误折叠、所表达的多肽的特定二级结构、所表达的多肽的极性结构域、电荷、疏水性、亲水性和/或聚集、所表达的多肽的特定长度等。

如本文所使用的，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物通常通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物的步骤，以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)。最优选地，经由皮下或真皮下注射施用细胞或外泌体。然而，在其他考虑的方面，施用还可以是静脉内注射。可替代地或另外地，可以从患者的细胞中分离抗原呈递细胞或使其生长，在体外感染，并然后输注给患者。因此，应理解，可以将考虑到的系统和方法视为用于高度个性化癌症治疗的完整药物发现系统(例如，药物发现、治疗方案、验证等)。

本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本披露的全部范围，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践要求保护的发明所必需的。

本领域技术人员应当清楚的是，在不背离本文所披露的概念的全部范围的情况下，除了已经描述的那些以外，还可以进行许多其他修改。因此，本披露主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。

Claims (20)

1.一种测定细胞中所表达的多肽的有效负载毒性的方法，该方法包括：

产生或获得多个表达载体，每个表达载体包含编码对应重组多肽的不同重组核酸序列；

在培养多个宿主细胞的同时在这些宿主细胞中表达该重组核酸序列；

在培养这些宿主细胞后对该多个表达载体进行测序；

将该重组核酸序列的至少部分与毒性量度相关联。

2.如权利要求1所述的方法，其中这些表达载体是病毒表达载体。

3.如权利要求1所述的方法，其中这些表达载体是相应治疗性病毒的重组基因组。

4.如权利要求1所述的方法，其中该重组多肽是包含多个新抗原的多表位。

5.如权利要求4所述的方法，其中这些新抗原中的至少两个被接头肽分开。

6.如权利要求4所述的方法，其中这些新抗原具有8至50个氨基酸的长度。

7.如权利要求4所述的方法，其中该多表位具有至少200个氨基酸。

8.如权利要求1所述的方法，其中该重组核酸序列在该多个宿主细胞中单克隆表达。

9.如权利要求1所述的方法，其中该重组核酸序列在该多个宿主细胞中多克隆表达。

10.如权利要求1所述的方法，其中对该多个表达载体单独测序。

11.如权利要求1所述的方法，其中该多个表达载体在表达载体的混合物中测序。

12.如权利要求1所述的方法，其中在这些宿主细胞中观测该毒性量度。

13.如权利要求12所述的方法，其中在这些宿主细胞中的该毒性量度是细胞死亡、细胞应激、细胞分裂减少和病毒产量降低。

14.如权利要求1所述的方法，其中在该病毒的该重组核酸序列中观测该毒性量度。

15.如权利要求14所述的方法，其中该病毒的该重组核酸序列中的该毒性量度是无义突变、错义突变和缺失。

16.如权利要求1所述的方法，其中关联步骤使用机器学习。

17.如权利要求16所述的方法，其中该机器学习使用选自由以下组成的组的分类器：线性分类器、基于NMF的分类器、基于图形的分类器、基于树的分类器、基于贝叶斯的分类器、基于规则的分类器、基于网的分类器和kNN分类器。

18.如权利要求16所述的方法，其中该机器学习使用自动编码器。

19.如权利要求16所述的方法，其中该机器学习使用该重组多肽的次要方面。

20.如权利要求19所述的方法，其中该次要方面是该多肽的折叠模式、该多肽的二级结构、极性结构域、带电荷的结构域、疏水结构域、亲水结构域和/或该多肽的聚集。

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