MX2011010612A - Metodo para la produccion de particulas de vector poliomaviral recombinantes. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos mejorados para la producción de partículas virales, partículas de vector virales y proteínas recombinantes. En particular, la invención se refiere a métodos mejorados para la producción de partículas de vector poliomavirales recombinantes y líneas celulares de producción de vector poliomaviral celulares. Más en particular, la invención se refiere a métodos para la producción de partículas de vector poliomaviral de simio tal como partículas de vectores virales de virus de simio 40 (SV40). La invención se refiere también a composiciones que comprenden vectores virales y usos de los mismos y partículas de vectores virales para tratar trastornos genéticos, rechazo al trasplante, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, alergias o cáncer. La invención también se refiere a métodos para la producción de proteínas recombinantes en células de mamíferos y métodos para aumentar la producción de proteínas recombinantes en células de mamíferos.

Description

METODO PARA LA PRODUCCION DE PARTICULAS DE VECTOR POLIOMAVIRAL RECOMBINANTES Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos mejorados para la producción de partículas virales, vectores virales, partículas de vector viral y proteínas recombinantes . En particular, la invención se refiere a métodos mejorados para la producción de partículas de vector poliomaviral recombinantes y vector poliomaviral productor de líneas celulares. Más en particular, la invención se refiere a métodos para la producción de vectores poliomavirales de simio tal como vectores virales de virus 40 de simio (SV40) . La invención se refiere también a composiciones que comprenden vectores virales y usos de las mismas y partículas de vector viral para tratar trastornos genéticos, rechazo al trasplante, enfermedades autoinmunitarias , enfermedades infecciosas, alergias o cáncer. La invención también se refiere a métodos para la producción de proteínas recombinantes en células de mamíferos y métodos para aumentar la producción de proteínas recombinantes en células de mamíferos .

Antecedentes de la Invención Durante la última década, se han dedicado muchos REF. :224053 esfuerzos al desarrollo de tecnologías de suministro de ácido nucleico o genes eficiente para la introducción y expresión apropiada de genes o ácidos nucleicos en células objetivo. Los genes terapéuticos o ácidos nucleicos se pueden usar para restaurar genes defectuosos para tratar trastornos genéticos, para inducir una respuesta inmunitaria para tratar cáncer y enfermedades infecciosas o para suprimir una respuesta inmunitaria por ejemplo, para inducir/restaurar la tolerancia inmunitaria para prevenir el rechazo al trasplante o para tratar enfermedades autoinmunitarias y alergias . Los genes o ácidos nucleicos terapéuticos se pueden administrar como moléculas desnudas o como ácidos nucleicos empaquetados en lípidos y/o compuestos proteináceos .

Ya que los virus evolucionan para suministrar y expresar su información genética en sus células objetivo hospederas, se han explorado vectores virales como vehículos de suministro de genes y se encontraron que son por mucho los medios más efectivos de información genética suministrada en una célula viva. Un número de sistemas de suministro de gen del vector viral se han desarrollado y probado en ensayos preclínicos y clínicos. Estos ensayos revelaron que los vectores actualmente usados, los cuales se derivan de adenovirus, virus de sífilis, virus de herpes, alfavirus, retrovirus, parvovirus y poliomavirus , son generalmente seguros de usar y eficientes en el suministro de genes terapéuticos a células objetivo.

Una desventaja importante de los vectores de suministro de genes virales usados actualmente es el hecho de que no pueden ser producidos en cantidades suficientes para tratar números importantes de pacientes. La mayoría de los vectores virales se producen al transfectar células productoras con plásmido de ADN que codifica el vector y los componentes del vector. Esto generalmente proporciona de 1 hasta 10 millones de partículas de vectores por mililitro de volumen de cultivo celular. En ensayos clínicos, se han administrado generalmente partículas de vector 1 x 1010 hasta 1 x 1012 a un paciente con objeto de lograr los efectos clínicos benéficos. Esto significa que con objeto de tratar 1000 pacientes, se requieren más de 1 millón de litros de cultivo celular para proporcionar cantidades suficientes de partículas de vector.

Además, los ensayos preclínicos y clínicos revelan que la mayoría de los vectores de suministro de genes virales probados tal como vectores adenoviral, de virus de sífilis, de virus del herpes, alfaviral y retrovirales inducen una fuerte respuesta inmunitaria en pacientes, dirigida a componentes de vector viral y los productos de gen terapéuticos. Como una consecuencia de estos vectores sólo se pueden administrar una vez a un paciente, mientras que los niveles de expresión del gen terapéutico introducido disminuyen rápidamente. Los vectores virales derivados del virus asociado con adeno (AAV, por sus siglas en inglés) no inducen respuestas inmunitarias en animales y son inmunológicamente inertes. Sin embargo, la mayoría de la población humana encuentra AAV de tipo natural con su virus auxiliar, por ejemplo, adenovirus y como un resultado desarrolla una fuerte memoria CTL contra las proteínas de la cápsida AAV. Como consecuencia las células transducidas AAV se remueven rápidamente y los niveles de expresión del gen terapéutico o ácido nucleico introducidos por un vector viral AAV disminuyen rápidamente.

Los rendimientos de proteínas recombinantes producidos en células de mamíferos en comparación a aquellos producidos en células procariotas son en general bajos, a pesar del uso de promotores fuertes y/o inserciones de transgen de copia múltiple u otros medios para aumentar la transcripción. Los vectores competentes de replicación viral o replicones se han usado durante un largo tiempo como sistemas de expresión para la producción de proteínas recombinantes en células de mamíferos. El gen objetivo en tales vectores se puede expresar bajo control transcripcional de promotores virales por lo cual los mAR deseados pueden acumularse a niveles extremadamente altos en el citoplasma poco después de la transíección, proporcionando grandes cantidades de proteína objetivo. Hasta ahora los éxitos con los sistemas de expresión con base en replicón se han limitado. Los sistemas de replicón con base en virus de ARN en general producen proteínas recombinantes sólo por un corto periodo de tiempo, mientras que aquellos derivados de virus de ADN en general no replican bien en las líneas celulares coraercialmente usadas.

Por lo que se sabe, sólo hay un vector de suministro de gen viral que es inmunológicamente inerte en humanos y que se puede producir en cantidades suficientes para tratar un número importante de pacientes. Por otra parte, este vector de suministro de gen viral se puede emplear como un sistema de replicón para la producción de proteínas recombinantes en líneas celulares de mamíferos. Este sistema de vector viral se deriva del virus 40 de simio (SV40) , un poliomavirus de simio.

Los poliomavirus están comprendidos de una familia de virus de ADN no envueltos con cápsidas icosaédricas . Se aislan de una variedad de de especies de animales que incluyen humanos, monos, roedores y aves. Se han descrito cinco poliomavirus, denominados poliomavirus BK, JC, U, Kl y de células Merkel . Muchos poliomavirus de mono se han descrito de los cuales SV40 es el más conocido. El SV40 replica pobremente en células humanas y las infecciones en humanos son raras. Infecciones SV40 ocasionales ocurrieron a través de la transmisión del virus de monos a personas que viven en estrecho contacto con estos animales o a través de la vacunación con lotes de partículas de poliovirus inactivadas contaminadas con SV40.

El SV40 tiene un par de 5.25 kilo base de genoma de ADN de hebra doble. El genoma SV40 consiste de dos regiones regulatorias , la región de promotor/origen y la región de poliadenilación . La región de promotor/origen es de 500 pares bases de longitud y comprende dos promotores opuestamente dirigidos, el promotor temprano y tardío (SVEP y SVLP respectivamente) , el origen de replicación y la señal de empaquetamiento. La región de poliadenilación es de 100 pares bases de longitud y contienen las señales de poliadenilación de las transcripciones tanto temprana como tardía. SVEP dirige la expresión de la transcripción primaria temprana que se empalma por factores de empalme que codifican el hospedero en 2 diferentes mARN que codifican antígenos de tumor pequeño y grande (T) .

El antígeno T grande es la proteína asociada a la replicasa requerida para la replicación de ADN y para activación del SVLP. Aunque el papel preciso del antígeno T pequeño en la replicación del virus sigue sin estar claro, el antígeno T pequeño se requiere para la transformación de varios tipos de células de mamíferos, en conjunto con el antígeno T grande. Los efectos primarios del antígeno T pequeño ocurren a través de su interacción con fosfatasa 2A de proteína de serina-treonina . El dominio que enlaza la fosfatasa 2A del antígeno T pequeño se localiza en el único extremo carboxi terminal del antígeno T pequeño.

Está bien documentado en el arte previo que tanto el antígeno T grande como antígeno T pequeño se requieren para la replicación de poliomavirus eficiente (Fahrbach K. M. et al., Virology 370 (2): 255 - 263, 2008).

SVLP conduce la expresión de la transcripción primaria final que se empalma por factores de empalme que codifican el hospedero en diferentes mAR que codifican las proteínas de cápsida viral VP1, 2 y 3. Los antígenos T son los principales y las proteínas de cápsida, los menores componentes inmunogénicos de virus de polioma que provocan respuesta inmunitaria celular y humoral contra células infectadas con SV40.

Los antígenos T SV40 cooperativamente inmortalizan células de mamíferos primarias, transforman líneas celulares de mamíferos establecidas e inducen tumores en roedores portadores jóvenes inmuno-comprometidos. Un número de reportes sugiere que las infecciones de SV40 están asociadas con tumores malignos humanos, causados por la actividad oncogénica de los antígenos T crónicamente expresados (Butel J. S. y Lednicky J.A. Journal of the National Cáncer Institute 91:119 - 134, 1999).

Ya que la expresión de las proteínas de cápsida virales depende de la presencia del antígeno T grande, las secuencias de antígeno T específicas se han eliminado en vectores virales de polioma, no sólo para la interpretación de los vectores incapaces de replicarse, sino también para eliminar completamente su inmunogenicidad en humanos.

Se han hecho y probado los vectores virales de polioma que eliminan el antígeno T derivados de SV40, en los cuales los genes terapéuticos o ácidos nucleicos se expresan in trans en células objetivo bajo control transcripcional de la SVEP viral. Los vectores se conocen desde hace mucho tiempo como vectores potenciales para transferir gen en una pluralidad de tejidos humanos y tipos de célula, por ejemplo, médula ósea (Rund D. et al, Human Gene Therapy 9: 649 - 657, 1998) , el hígado (Strayer D. S. y Zern M.A., Seminars in Liver Disease 19: 71 - 81 , 1999) y células dendríticas (Vera M. et al., Molecular Therapy 12: 950 - 959, 2005).

Los vectores poliomavirales , tales como SV40, se conoce que infectan células que no se dividen así como activamente divididas. Ya que los vectores carecen de la región que codifica los antígenos T y como consecuencia no expresan las proteínas de cápsida virales, no son inmunogénicos (Strayer D. S. and Zern M.A. , Seminars in Liver Disease 19: 71 - 81, 1999) permitiendo administración repetida al mismo individuo. Por otra parte, ya que los constructos de gen terapéuticos insertados se expresan bajo control transcripcional de SVEP, un promotor débil pero constitutivo, los vectores inducen expresión a largo plazo de las proteínas terapéuticas in vivo. Así, se conoce que los vectores poliomavirales, tal como vectores derivados de SV40 son candidatos prometedores para transferir gen terapéutico o ácido nucleico que se puede usar para las aplicaciones antes mencionadas.

Debido a su potencial de replicación, los replicones con base de poliomavirus también son de gran interés para aumentar la producción de proteínas recombinantes tales como anticuerpos, factores de crecimiento y hormonas en células de mamíferos .

Las partículas SV40 que eliminan al antígeno T se han producido en células de simios que permiten el crecimiento lítico de SV40 y que suministran los antígenos T in trans . Las líneas celulares que empaquetan al vector SV40 que se usan actualmente son líneas celulares COS en particular COS-1 y COS-7 (Gluzman Y., Cell 23: 175 - 182, 1981). Las líneas celulares COS se generaron por transformación de células de mono CV1 con ADN SV40. Otra línea celular que expresa el antígeno T SV40 in trans es CMT4. Las líneas celulares CTM derivadas de CV1 se generaron usando ADN SV40 en el cual los antígenos T se expresaron bajo control transcripcional del promotor de la metalotioneína de ratón (Gerard R. D. y Gluzman Y., Molecular and Cellular Biology 5: 3231 - 3240, 1985) .

Hay una desventaja importante sin embargo para el uso de tales líneas celulares. El pasaje de los vectores SV40 que eliminan el antígeno T en las líneas celulares empaquetadas construidas (COS o CMT) en muchos casos resulta en la aparición de partículas SV40 que compiten- por* replicación de tipo natural (Gluzman Y., Cell 23: 175 - 182, 1981; Oppenheim A. y Peleg A., Gene 77: 79 - 86, 1989; Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004).

Esto ocurre con mayor probabilidad por recombinación que depende de la homología de secuencia de nucleótido entre las secuencias específicas SV40 cromosómicamente insertadas y secuencias específicas del vector SV40 nuclear. La aparición de las partículas de virus de tipo natural competentes de replicación y la presencia de las oncoproteínas del antígeno T en tales líneas celulares de empaquetamiento convencional ha hecho el uso de vectores SV40 para propósitos médicos poco práctico.

La línea celular de riñon de embrión humano 293 (HEK293) es semi -permisiva para infección SV40, lo cual significa que sólo un porcentaje pequeño de células infectadas apoyan la replicación del virus. La mayoría de las células son persistentemente infectadas y muestran niveles muy bajos de replicación de virus.

Un derivado de la línea celular HEK293 es la línea celular HEK293T, que expresa la región temprana SV40 bajo control transcripcional del promotor de repetición de terminal larga del virus del sarcoma Rous . Se ha descrito que las células HEK293T expresan cantidades muy bajas de antígeno T grande y cantidades muy grandes de antígeno T pequeño, debido a una tendencia de empalme a favor del mARN del antígeno T pequeño de SV40. Vera et al. encontró que HEK293T ayuda muy poco a la producción de vector viral SV40 (Vera M., et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791 , 2004).

Ya que las oncoproteínas del antígeno T se presentan en células HEK293T y hay un riesgo de que surjan virus SV40 competentes de replicación, el uso de esta línea celular para la producción de vectores SV40 para propósitos médicos es indeseable y poco práctica.

La línea celular HEK293TT se ha desarrollado como un derivado de HEK293T, generado por transfección estable con una construcción de gen que codifica el antígeno T grande SV40. Las células HEK293TT se usan para la producción de partículas de pseudo-vector de virus de papiloma humano (HPV) . Las partículas de pseudo-vector de HPV recombinante se producen en HEK293TT al transfectar las células con un plásmido que alberga el origen SV40 de replicación y los genes de cápsida HPV y uno que alberga el origen SV40 de replicación y un pseudo-genoma HPV (Buck CB . et al., Methods in Molecular Medicine 119: 445 - 462, 2005).

Ya que HEK293TT como un derivado de HEK293T acumula las oncoproteínas del antígeno T grande y pequeño y apoya pobremente la replicación SV40, el uso de este línea celular para producir vectores SV40 recombinantes para propósitos médicos también es indeseable y poco práctica.

WO 03/025189 describe líneas celulares de complementación de empaquetamiento que permiten la producción de partículas de vector SV40 que son al parecer seguras para uso médico. Sin embargo, las líneas celulares de empaquetamiento descritas en la presente acumulan todavía cantidades importantes de oncoproteínas de antígeno T grande y pequeño .

Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004 muestra que la capacidad de producción de las partículas de vector SV40 recombinante de interés en ciertas líneas celulares tal como CMT4 y HEK293T pueden ser muy bajas y establece que las líneas celulares descritas en WO 03/025189, tal como COT-2 tampoco son efectivas como líneas celulares productoras para las partículas del virus SV40 recombinante, posiblemente debido a la tendencia de empalme a favor del mARN del antígeno T pequeño en estos tipos de células.

WO 08/000779 describe un método para superar el problema con la producción de poblaciones de alta titulación de vectores virales SV40 adecuados usando supresores virales de interferencia de AR (ARNi) , tal como el virus E3L de vacuna y proteínas NS1 del virus de influenza A. Las líneas celulares de empaquetamiento descritas en WO 08/000779 no proporcionan una solución a las desventajas de las líneas celulares de empaquetamiento del arte previo descritas en la presente anteriormente.

Se han proporcionado células de ovario de hámster Chino (CHO) con la región temprana de poliomavirus de ratón, resultando en líneas celulares CHOP (Heffernan y Dennis, Nucleic Acids Research 19: 85-92, 1991). Un número de líneas celulares CHOP ayudan a la replicación del plásmido CDM8 ( invitrogen) , un vector de expresión de mamífero que transporta el origen de replicación del poliomavirus de ratón. El nivel de replicación en las líneas celulares CHOP no fue suficiente para hacer este sistema atractivo para aplicación comercial, debido posiblemente a una tendencia de empalme a favor del mARN de antígeno T pequeño o antígeno T medio en células CHO.

Permanece una necesidad en la técnica de sistemas de producción eficientes para partículas de poliomavirus recombinante que son seguras de usar y proporcionan altas titulaciones de partículas de vector virales. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar métodos para la producción segura y eficiente de partículas y composiciones obtenibles de la misma. Se aprecia que los métodos de la presente invención también se pueden usar para la producción de grandes cantidades de proteínas recombinantes en células de mamíferos.

Breve Descripción de la Invención Los objetivos anteriores se han cumplido por la presente invención en que se proporciona un método para producir partículas de vector poliomavirales recombinantes incapaces de expresar un antígeno T pequeño funcional que comprende las etapas de a) proporcionar una línea celular que permite el poliomavirus de tipo natural, la línea celular es capaz de expresar un antígeno T grande funcional pero incapaz de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional, b) introducir en la línea celular un ADN de poliomavirus incapaz de codificar un antígeno T pequeño funcional, c) cultivar las células en un medio de crecimiento bajo condiciones que permiten la formación de partículas de vector poliomavirales recombinantes y d) recolectar las partículas de vector poliomavirales recombinantes del cultivo celular.

Las partículas de vector poliomavirales recombinantes producidas por este método son incapaces de expresar antígeno T pequeño funcional y no pueden revertirse en partículas poliomavirus de tipo natural. Esto puede deberse a una falta completa de genes que codifican un antígeno T pequeño funcional, en el vector poliomaviral así como en la línea celular productora de vector poliomaviral.

Esto permite ahora por primera vez la preparación de una composición que comprende un número importante de partículas de vector poliomaviral recombinante sin una partícula de poliomavirus de tipo natural. Las partículas de vector virales producidas en este método son incapaces de replicar en células las cuales son permisivas para el poliomavirus de tipo natural y las cuales no expresan un antígeno T grande funcional. Por consiguiente esta composición es segura para usar en tratamientos médicos.

A la fecha, no ha sido posible producir grandes cantidades de partículas de vector poliomavirales , libres de recombinantes que revierten el poliomavirus de tipo natural. Con el uso de la invención, ahora es posible obtener grandes cantidades de partículas de vector virales uniformes sin que un virus de tipo natural esté presente. En consecuencia, la invención se refiere a una composición que comprende más de 106 partículas de poliomavirus incapaces de expresar un antígeno T pequeño funcional y por lo tanto incapaces de replicar en células deficientes de antígeno T grandes las cuales son permisivas para el poliomavirus de tipo natural.

Las líneas celulares para uso en esta invención pueden ser líneas celulares de mamíferos convencionales permisivas para un poliomavirus que se modifican genéticamente para que expresen un antígeno T grande poliomaviral funcional y no expresen un antígeno T pequeño poliomaviral funcional. Las líneas celulares de acuerdo a la invención se pueden usar ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes ya que son capaces de replicar moléculas de ADN circular albergando el origen de replicación del poliomavirus .

La invención se refiere también a una composición como se describe anteriormente para uso como un medicamento.

Descripción Detallada de la Invención El inventor actual ha encontrado que el antígeno T grande de un poliomavirus promueve por sí mismo la expresión de las proteínas de cápsida poliomaviral y que el antígeno T pequeño poliomaviral no se requiere para ese propósito. Esto significa que en la ausencia de antígenos T poliomavirales en células, el SVEP es un promotor constitutivo pero débil, en comparación a otros promotores virales tal como el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) , mientras que el SVLP se cierra en el nivel transcripcional o post-transcripcional. Sorprendentemente, en células permisivas SV40, el antígeno T grande SV40 por su cuenta se encontró que es capaz de sostener la multiplicación del ADN de vector viral SV40 y de activar SVLP, llevando a la acumulación de proteínas de cápsida y resultando en la producción eficiente de partículas de vector virales SV40.

En el arte previo, se han generado cepas SV40 que son deficientes en codificar el antígeno T pequeño. Gauchat et al. (Nucleic Acids Research 14: 9339-9351, 1988) describe un mutante dl883 de eliminación SV40 que carece del antígeno T pequeño pero produce un antígeno T grande funcional en células infectadas. Cuando esta cepa de virus mutante se usó para infectar células de riñon de mono y cultivos celulares CV-1, la cepa de virus mutante fue menos eficiente en introducir división celular mediada por el antígeno T grande y la replicación del virus subsecuente que el SV40 de tipo natural. Los autores concluyen que el antígeno T pequeño tiene una función auxiliar, ayudar al antígeno T grande en inducir división celular y replicación de virus. Este arte previo se enseña de esta manera fuera de la presente invención, ya que muestra que al comparar las células infectadas con SV40 de tipo natural, muchas células infectadas con dl883 no se dividen y no producen partículas de virus. La ausencia de antígeno T pequeño en una célula se enseña que es perjudicial para la producción de vector viral.

La publicación de Gauchat et al., no define si las partículas del virus se producen o no. Se limitan a medir la producción de virus ADN en células, lo cual no es equivalente a la producción de partículas de virus intactas.

La presente invención por lo tanto es contra- intuitiva para una persona experta. Por otra parte, es conocido por una persona experta que el antígeno T pequeño es un inhibidor efectivo de AR i . Ya que el AR i se conoce para servir como un mecanismo antiviral, se esperaría que una disminución en la cantidad de antígeno T pequeño intracelular lleve a un incremento en la actividad antiviral basada en ARNi, resultando en una producción reducida de partículas de virus. Los inventores sorprendentemente encontraron que lo contrario es cierto. Cuando el antígeno T grande se proporciona in trans, es decir, la línea celular produce el antígeno T grande, en donde tanto la línea celular como la cepa de poliomavirus carecen de un antígeno T pequeño funcional, las partículas de poliomavirus se producen en altas cantidades. La diferencia entre la presente invención y los resultados de Gauchat et al . es que en los experimentos descritos en Gauchat et al. un antígeno T grande funcional se proporciona in cis, es decir, en el vector poliomaviral que replica en la célula infectada. Esto lleva obviamente a la muerte celular parcial y a una producción de vector viral muy ineficiente.

La presente invención proporciona métodos para la replicación de partículas de vector poliomavirales recombinantes y líneas celulares de empaquetamiento de vector poliomaviral y líneas celulares que apoyan a la replicación de replicones poliomavirales, los vectores y replicones poliomavirales son incapaces de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional.

En la presente invención todas las células contribuyen a la producción de vector poliomaviral y se pueden obtener niveles de lx 106 o incluso 1 x 1011 de partículas de vector virales por mililitro de volumen de cultivo celular en un método de acuerdo a la invención.

La expresión "antígeno T grande funcional" o "partes funcionales de los mismos" en este contexto significa un antígeno T grande o un fragmento o análogo obtenido de un poliomavirus que es capaz de realizar la misma función que se requiere para realizar la invención como es atribuible al antígeno T grande de los cuales se derivan, más en particular, capaz de sostener la multiplicación de ADN de vector viral poliomaviral y de activar el SVLP en células permisivas para el poliomavirus.

La funcionalidad del antígeno T grande se puede probar al co-expresar una codificación de plásmido de expresión para antígeno T grande de poliomavirus o un fragmento o análogo del mismo junto con ADN de vector de poliomaviral que elimina el antígeno T en células permisivas para el poliomavirus de tipo natural y determinar si se producen las partículas de vector poliomavirus. Se puede concluir que el antígeno T grande de poliomavirus o un fragmento o análogo del mismo es un antígeno T grande funcional si una sola partícula de poliomavirus se produce en este ensayo. Como se puede determinar por microscopía electrónica o cualquier otro método adecuado conocido en el arte.

La expresión "antígeno T pequeño funcional" o "partes funcionales de los mismos" en este contexto significa un antígeno T pequeño o un fragmento o análogo del mismo obtenido de un poliomavirus que es capaz de realizar la misma función que se requiere para realizar la invención como atribuye al antígeno T grande de los cuales se derivan, más en particular, capaz de interactuar con e/o inhibir la fosfatasa 2A de la proteína. La funcionalidad del antígeno T pequeño se puede probar usando un ensayo de enlace entre un antígeno T pequeño poliomaviral o un fragmento o análogo del mismo y la fosfatasa 2A de la proteína como se describe por CHO U.S. et al., PLoS Biology 5(8): e202, 2007. Se puede concluir que el antígeno T pequeño o un fragmento o análogo del mismo es un antígeno T pequeño funcional cuando la interacción y/o inhibición en este ensayo está por encima del respaldo .

Las líneas celulares útiles en la presente invención pueden expresar antígeno T grande poliomaviral o partes funcionales de los mismos y son incapaces de expresar antígeno T pequeño poliomaviral funcional. Como una consecuencia las líneas celulares de la invención no acumulan las oncoproteínas del antígeno T que codifica el poliomavirus y la replicación del poliomavirus de tipo natural competente no puede surgir de células de la invención por recombinación entre el vector poliomaviral y las secuencias de antígeno T grande poliomaviral cromosómicamente insertados.

Una línea celular para usar en la presente invención se puede obtener por la persona experta en el arte usando sus habilidades ordinarias. Además, se puede seguir la guía proporcionada en los ejemplos con objeto de llegar a una línea celular para usar en la invención.

Es también un objetivo de la presente invención proporcionar una línea celular permisiva de poliomavirus , preferiblemente una línea celular de primates o incluso más preferible una línea celular de simios tal como una línea celular Vero (ref línea celular de riñon de Mono Verde Africano ECACC 88020401 Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, iltshire, RU) que comprende un gen que codifica al antígeno T grande poliomaviral funcional o un fragmento funcional del mismo, la secuencia del gen es incapaz de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional, por ejemplo al eliminar las secuencias específicas del antígeno T pequeño. La línea celular es capaz de multiplicar y empaquetar los vectores de poliomavirus que eliminan el antígeno T.

El destinatario experto apreciará que los vectores poliomavirales recombinantes , tal como vectores SV40, los cuales se producen en las líneas celulares de la invención no pueden comprender secuencias del gen específicas del antígeno T y así serán incapaces de replicar en una célula de mamífero que carece del antígeno T grande. El antígeno T ejemplificado elimina replicones SV40 que parecen replicar en una tasa alta en la producción de líneas celulares de la invención.

El término "homología de secuencia de nucleótidos" como se usa en la presente indica la presencia de homología entre dos polinucleótidos . Los polinucleótidos tienen secuencias "homologas" cuando ya sea una secuencia de nucleótidos en los dos polinucleótidos es la misma o cuando una secuencia sentido de uno y una secuencia antisentido del otro polinucleótido es la misma cuando se alinean para la correspondencia máxima. La comparación de secuencias entre dos o más polinucleótidos se realiza generalmente al comparar porciones de al menos dos secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. La ventana de comparación es generalmente desde alrededor de 20 a 200 nucleótidos contiguos de longitud. El "porcentaje de homología de secuencia" para secuencias de polinucleótidos de la invención, tal como 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento de homología de secuencia se puede determinar al comparar dos secuencias óptimamente alineadas de más de una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede incluir adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al: (a) determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica ocurre en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones compensadas; (b) dividir el número de posiciones compensadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación; y (c) multiplicar el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de homología de secuencia. La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo por implementaciones computarizadas de algoritmos conocidos, o por inspección. La comparación de secuencia fácilmente disponible y algoritmos de alineación de secuencias múltiples son, respectivamente, la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) (Altschul, S. F., Journal of Molecular Biology 215: 403, 1990; Altschul, S. F. et al., Nucleic Acid Research 25: 3389 - 3402, 1997) y programas Clustal ambos disponibles en el internet. Otros programas disponibles incluyen GAP, BESTFIT y FASTA en el Paquete del Software Genéticos de Wisconsin (Genetics Computer Group (GCG) , Madison, Wl, USA) .

La homología entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar con referencia a la capacidad de las secuencias de ácido nucleico para hibridar a cada uno durante la desnaturalización (por ejemplo, bajo condiciones de NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6.4, EDTA 1 mM, a una temperatura de 50 grados Celsius hasta 65 grados Celsius e hibridación durante 12-16 horas, seguido por el lavado) (Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edición, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 o Current Protocole in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds . , John iley & Sons, 1992) .

En términos generales, aquellos habilidosos en el arte capaces de construir vectores de polioraavirus y diseñar protocolos para expresión de gen recombinante . Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, conteniendo secuencias regulatorias apropiadas, que incluyen secuencias del promotor, fragmentos de terminador, secuencias de poliadenilación, secuencias aumentadoras , genes marcadores y otras secuencias como sea apropiadas. Para más detalles ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edición, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

El término "heteróloga" se usa ampliamente en todo para indicar que la secuencia de ácido nucleico, secuencia de polinucleótidos , gen o secuencia de nucleótidos en cuestión que se ha introducido en la línea celular productora del vector viral de polioma, usando ingeniería genética, es decir, por intervención humana. Un gen heterologo puede en principio remplazar un gen equivalente endógeno, o ser adicional a los genes endógenos del genoma de la célula hospedera o virus de polioma es decir, no ocurre naturalmente en células de las especies hospederas o en virus de polioma.

Por "promotor" se entiende una secuencia de ADN de la cual se puede iniciar la transcripción de ADN operablemente ligado en dirección 3' (es decir, en la dirección 3' en la hebra sentido de ADN de hebra doble) . "Ligado operablemente" significa unir como parte de la misma molécula de ácido nucleico, posicionado y orientado adecuadamente para transcripción iniciada del promotor. ADN ligado operablemente a un promotor es "bajo la regulación de inicio de transcripción" del promotor.

El promotor puede ser un promotor constitutivo, un promotor inducible o promotor específico del tejido. Los términos "constitutivo", "inducible" y "específico del tejido" como se aplica a un promotor es bien entendido por aquellos de experiencia en el arte. El promotor se deriva preferiblemente de los virus, incluyendo repeticiones de terminales 5' larga de retrovirus y lentivirus, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMVie) , el promotor alfa de factor 1 de elongación humano (alfa EF-1) y similares. Tales promotores están fácilmente disponibles y se conocen bien en el arte.

Por "señal de poliadenilación" se entiende una secuencia de nucleótidos de la cual la transcripción se puede terminar y un extremo poly-A se agrega al transcrito. Se puede usar como señal de poliadenilación cualquier señal de poliadenilación aplicable en células de humana o animal.

Una línea celular de acuerdo a la invención se puede derivar de cualquier línea celular adecuada conocida en el arte tal como MDCK, PER.C6, HEK293, CV1 y similares, pero es preferiblemente una línea celular Vero o CHO.

Una línea celular adecuada de acuerdo a la invención es una línea celular permisiva de poliomavirus incapaz de expresar el antígeno T pequeño poliomaviral y preferiblemente comprende los siguientes elementos genéticos: i) el antígeno T grande poliomaviral que codifica el dominio o parte del mismo, y opcionalmente ii) un marcador de selección tal como un gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a ' la puromicina, gen de resistencia a la higromicina u otro marcador .

Tal línea celular puede que no tenga el intrón grande del transcrito de poliomavirus temprano que alberga secuencias de ADN específico del antígeno T pequeño.

La línea celular en una modalidad preferida puede incluir una secuencia aumentadora transcripcional integrada establemente en el ADN cromosómico de la línea celular, de tal manera que puede seleccionarse adicionalmente con base en la actividad del aumentador de la transcripción. Tales marcadores y tales procedimientos de selección son bien conocidos en el arte.

Las diferentes líneas celulares de producción de vector poliomaviral, por ejemplo líneas celulares productoras del vector viral SV40, se pueden generar al transfectar las células con diferentes vectores, tales como plásmidos, dependiendo de su genealogía. La metodología para transfección de líneas celulares es bien conocida en el arte. Por ejemplo, la línea celular Vero se usa ampliamente para la producción de partículas de virus para vacunas. Esto ha encontrado muchas aplicaciones en profilaxis de enfermedades virales .

Se puede obtener una línea celular adecuada por transfección con un primer plásmido que comprende los siguientes componentes i) el antígeno T grande poliomaviral que codifica el dominio o parte del mismo, desprovisto del intrón grande de la transcripción de poliomavirus temprano que alberga secuencias específicas del antígeno T pequeño y opcionalmente ii) un marcador de selección tal como un gen de resistencia a la neomicina, gen de resistencia a la puromicina, gen de resistencia a la higromicina u otro marcador .

Así un vector o plásmido sencillo podría transportar tanto el antígeno T grande poliomaviral que codifica el dominio como una secuencia de marcador de selección. También es posible que dos vectores o plásmidos que portan ADN separados se utilicen, uno llevando el dominio que codifica el antígeno T grande poliomaviral y otro llevando al marcador de selección, dependiendo del diseño. Cualquiera de los elementos genéticos adicionales que se pueden necesitarse para conferir una capacidad de producción de vector poliomaviral en una línea celular productora también se puede colocar en uno o más vectores o plásmidos de ADN que puede entonces usar para transferir la línea celular de producción elegida. Por ejemplo, la línea celular de producción Vero ya no contiene secuencias de antígeno T poliomaviral en ella, por lo que el dominio que codifica el antígeno T grande se puede agregar en él, y las células productoras nacientes resultantes que albergan al dominio que codifica el antígeno T grande en ellos puede entonces seleccionarse, al usar un sistema de marcador de selección.

La invención ahora permite por primera vez la preparación de composiciones que comprenden vectores poliomavirales recombinantes en cantidades suficientes para propósitos terapéuticos, sin el riesgo de contaminación con poliomavirus de tipo natural que ocurren de la recombinación entre ADN de vector poliomaviral y ADN de célula hospedera. Este fenómeno está bien descrito en la literatura (Gluzman Y., Cell 23: 175 - 182, 1981; Oppenheim A. y Peleg A., Gene 77: 79 - 86, 1989; Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004) .

Sin embargo la frecuencia con la cual esta recombinación ocurre no está tan bien documentada. Los estimados varían enormemente. Shaul et al estiman que la recombinación pudiera ocurrir con una frecuencia de al menos 10"6 (Shaul et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3781-3784, 1985), mientras estimados más recientes muestran una tasa de recombinación mucho mayor, en la clasificación de 10"3 (Arad et al., Virology 304: 155-159, 2002).

Un factor que complica la estimación de la frecuencia de recombinación es que el poliomavirus de tipo natural replica más rápido que el vector poliomaviral recombinante que carece de los genes que codifican los antígenos T funcionales.

Por lo tanto se ha establecido el número máximo de partículas de vector SV40 recombinante que pudieran producirse en un cultivo celular convencional de acuerdo al arte previo, sin la aparición de cualquier revertiente de tipo natural .

Por lo tanto, se infectaron células COS-1 con partículas de vector SV40 recombinante de acuerdo a un protocolo estándar (Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004) y se calcula el número máximo de partículas de vector virales que podrían producirse sin que ocurra un genoma detectable sencillo del virus de tipo natural detectado por un ensayo PCR cuantitativo muy sensible.

Se encontró que hasta 1 x 104 partículas de vector virales se podrían producir con seguridad sin que se presente una cantidad detectable de revertientes de tipo natural en la mayoría de los experimentos realizados. Un número importante de preparaciones que comprenden 1 x 105 partículas de vector virales sin embargo, fue positiva para revertientes de tipo natural, mientras todas las preparaciones que comprenden 1 x 106 partículas de vector virales se contaminaron con virus de tipo natural y así no seguras para uso médico.

El hecho de que las preparaciones de vector poliomaviral de acuerdo al arte previo no sean seguras para uso médico se subraya por el hecho de que las partículas SV40 de tipo natural en las preparaciones que comprenden más de 1 x 106 partículas de vector SV40 recombinante fueron capaces de infectar células permisivas SV40 in vitro cuando se prueba de acuerdo a un método del arte previo como describe por Katzman R.B. et al., (Journal of Virological Methods 150: 7 - 13, 2008) .

La invención ahora permite por primera vez la preparación de una composición que comprende más de 1 x 106 partículas de vector poliomaviral sin ninguna de las partículas de poliomavirus de tipo natural estando presente en la composición. La invención por lo tanto se refiere a una composición que comprende más de 1 x 106 partículas de vector poliomaviral incapaz de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional e incapaz de replicar en células las cuales son permisivas para el poliomavirus de tipo natural. Tales preparaciones pueden contener ventajosamente 1 x 107 partículas de vector o más, como hasta 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, o 1 x 1011 partículas de vector o más.

La expresión "incapaz de replicar en células las cuales son permisivas para poliomavirus de tipo natural" significa que la composición no contiene una sola partícula de poliomaviral revertiente de tipo natural entre al menos 1 x 106 partículas de vector poliomaviral. Esto se puede medir ya sea por el ensayo PCR cuantitativo descrito por Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004, o al infectar una línea celular permisiva para el poliomavirus de tipo natural presente en la composición. En este último caso la ausencia de una sola placa en el ensayo de placa (Katzman R. B. et al., Journal of Virological Methods 150: 7 13, 2008) indica la ausencia de una sola partícula de poliomavirus de tipo natural .

En una modalidad preferida, la preparación de acuerdo con la invención se refiere a una composición que comprende un poliomavirus de primate, tal como una poliomavirus de simio, más en particular un SV40, virus de simio 12 (SV12), poliomavirus linfotrópico, poliomavirus de mono verde Africano o poliomavirus de chimpancé. Las líneas celulares permisivas para el poliomavirus de primate se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de células Vero, células CV1, células PerC.6, células HEK293 y similares.

En otra modalidad, la preparación de acuerdo a la invención se refiere a una composición que comprende un poliomavirus de roedor tal como poliomavirus de ratón o hámster, más en particular un virus de polioma de murino o poliomavirus de Hámster. Las líneas celulares permisivas para el poliomavirus de ratón o hámster se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de células CHO y similares .

La presente invención describe también la generación de vector de producción de líneas celulares para la producción de partículas de vector virales de polioma recombinante que son seguros para uso médico.

En consecuencia, la invención se refiere a una línea celular permisiva para un poliomavirus, la línea celular es capaz de expresar un antígeno T grande funcional e incapaz de expresar un antígeno T pequeño. Tal línea celular apoya adecuadamente la producción segura de partículas de vector poliomavirales recombinantes sin el riesgo de obtener partículas de poliomavirus revertientes de tipo natural ya que las células carecen de cualquiera de las secuencias homologas entre el ADN cromosómico de la célula y el ADN del poliomavirus recombinante. El gen que codifica el antígeno T grande está integrado preferiblemente de forma estable en el genoma de la célula.

El término "vector poliomaviral recombinante" en este contexto se interpreta como un poliomavirus incapaz de expresar un antígeno T grande poliomaviral funcional, preferiblemente incapaz de expresar un antígeno T grande y pequeño funcional. Tal vector viral recombinante puede por ejemplo, carecer de la secuencia de codificación para ya sea el antígeno T grande o el antígeno T tanto grande como pequeño .

La expresión "permisiva para un poliomavirus" en este contexto significa que la línea celular apoya la replicación de partículas de poliomavirus tras la infección con el poliomavirus o tras la introducción del ADN de poliomavirus por transfección u otros medios de suministro de ADN en una célula .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir partículas de poliomavirus recombinante incapaces de expresar un antígeno T pequeño funcional que comprende las etapas de a. Proporcionar una línea celular permisiva para un poliomavirus de tipo natural, la línea celular es capaz de expresar un antígeno T grande poliomaviral funcional e incapaz de expresar un antígeno T pequeño funcional, b. Introducir en la línea celular un ADN de poliomavirus incapaz de codificar un antígeno T pequeño funcional, c. Cultivar las células en un medio de crecimiento bajo condiciones que permiten la formación de partículas de poliomavirus y d. Recolectar las partículas de poliomavirus recombinante del cultivo celular.

En una modalidad preferida, el ADN de poliomavirus se introduce en la célula por transfección del ADN.

En aspectos adicionales de la invención se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de un individuo que padece de una enfermedad. La composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más vectores de poliomavirus tal como SV40, preparado de acuerdo a un proceso de la invención y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en cualquier forma adecuada para administración al individuo que necesita de las mismas. Tales formulaciones pueden estar en cualquier forma para administración tal como administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, intralinfática, subcutánea, intraocular o incluso transdérmica .

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden generalmente un agente amortiguador, un agente que ajusta la osmolaridad de las mismas, opcionalmente , uno o más aditivos, excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables conocidos en el arte. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones de la invención. El portador puede ser un medio solvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez correcta se puede mantener por el uso de un revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos .

La invención se describirá más a detalle con referencia a los siguientes ejemplos.

Ej emplos Ejemplo 1: construcción del vector que suminsitra el gen derivado de SV40 Se diseñaron seis oligonucleótidos : WdVIOl: CCGCTCGAGTTGCGGCCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC (SEQ ID No. 1) (que contiene un sitio de restricción Xhol y Notl) y WdV102: GGTACCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCC (SEQ ID No.2) (que contiene un sitio de restricción Kpnl) y dV103: GGCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGC GCCTTAT (SEQ ID. No.3) (contiene desde 5' hasta 3' subsecuentemente un sitio de restricción pegajoso Notl, un sitio de restricción intacto Padl , Sbfl, Pmel y Ascl y un sitio de restricción pegajoso Clal) y WdV104 : CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAAT AAAGC (SEQ ID No.4) (contiene desde 3' hasta 5' subsecuentemente un sitio de restricción pegajoso Notl, un sitio de restricción intacto Padl, Sbfl, Pmel y Ascl y un Sitio de restricción pegajoso Clal) y WdV105: CGGGATCCAGACATGATAAGATACATTG (SEQ ID NO.5) (que contiene un sitio de restricción BamHI) y WdV106: ATAGTTTAGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG (SEQ ID No.6) (que contiene un sitio de restricción Notl) .

El ADN de plásmido purificado del vector SV40 pSL-PL (De La Luna, S. et al., Journal of General Virology 74: 535 - 539, 1993) se sometió a PCR usando oligonucleótidos dV105 y WdV106. El fragmento de ADN amplificado resultante comprende la señal de poliadenilación SV40 flanqueado por un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' y un sitio de restricción Notl en el extremo 3' . Este fragmento de señal de poliadenilación SV40 fue digerido con BamHI y Notl y el fragmento de ADN largo de 150 bp resultante se aisló de un gel de agarosa y clonó en un plásmido SK pBluescript similarmente diferido (Promega), proporcionando pAM002.

El ADN de plásmido pEF5/FRT/5-DEST purificado (Invitrogen) se sometió a PCR usando oligonucleótidos WdVlOl y WdV102. El fragmento de ADN amplificado resultante comprende la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH) flanqueada subsecuentemente por un sitio de restricción Xhol y Notl en el extremo 5' y un sitio de restricción Kpnl en el extremo 3' . Este fragmento de señal de poliadenilación BGH fue digerido con Kpnl y Notl, y el fragmento de ADN de 250 bp de largo resultante se aisló de un gel de agarosa y se ligó en el plásmido pAM002 similarmente digerido. La transformación con esta mezcla de ligación se realizó en una cepa de E. coli insensible a la metilación. Esto resulta en el plásmido pAM003.

Los dos oligonucleótidos complementarios dV103 y WdV104 se alinearon en sus pares base por incubación en un baño de agua que se enfrío de manera autónoma desde su temperatura de ebullición hasta temperatura ambiente, proporcionando un ligador de ADN que subsecuentemente contiene un sitio de restricción pegajoso Notl, un sitio de restricción intacto Padl , Sbfl, Pmel y Ascl y un sitio de restricción pegajoso Clal . Este ligador se ligó en el plásmido pAM002 que fue digerido con Notl y Clal y aisló a partir de un gel de agarosa. La mezcla de ligación se usó subsecuentemente para transformar una cepa E. coli de metilación insensible, proporcionando pAM004.

El ADN de plásmido purificado del vector SV40 pSL-PL fue digerido con Clal y BamHI . El fragmento de ADN 2.6 kb resultante que contiene el SV40 de origen y la región final de SV40 se purifica de- agarosa y se clona en pAM004 también digerido. Esto resulta en el plásmido pAM005 de vector SV40 nuevo .

Ejemplo 2: Clonación molecular de un vector de expresión de luciferasa SV40 y la producción de partículas de vector de luciferasa SV40 recombinante .

El plásmido de expresión pGL3 (Promega) se usó como plantilla para clonar la luciferasa de luciérnaga usando PCR. Dos oligonucleótidos se diseñaron WdV389: 5'-TTGGCGCGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC-3 ' (SEQ ID NO : 7) y dV407 : 5 ' -CCCTTAATTAATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC-3 ' (SEQ ID NO: 8) que contienen respectivamente sitios de restricción Ascl y Pad. El fragmento de luciferasa amplificado PCR subsecuentemente Ascl y Pad se digieren y ligan en pAM005, resultando en pAM006.

Dos oligonucleótidos se diseñaron WdV437 5' GGGATCCAGACATGATAAGATACATTG 3' (SEQ ID NO : 9) y dV442 : ATAGTTTAGCGGCCGCAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTG (SEQ ID NO : 10) que contienen respectivamente sitio de restricción BamHI y Notl. El vector pSL-PL se usó como plantilla para clonar la secuencia de remolque del antígeno T grande usando PCR. El fragmento PCR resultante fue digerido con BamHI y Notl y se clonó en el pAM006 BamHI y Notl (digeridos parcialmente) , resultando en pAM020.

Las partículas de vector SV40 recombinante que codifican la luciferasa de de luciérnaga (SV-Luc) se produjeron de acuerdo a Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004. Las células COS-1 se transíectaron con Notl digerido y recirculan ADN pAM020 y tres días después de la transfección los Usados crudos se prepararon a partir del cultivo celular por congelación-descongelación repetida. Las partículas de vector SV-Luc se amplificaron en una ronda en células COS-1 creciendo en un matraz T175. Las partículas del vector SV-Luc finalmente se concentraron y purificaron del lisado crudo por ultracentrif gación de gradiente de sacarosa, proporcionando una población de vector con 5 x 1011 SV-Luc de copias de genoma por mililitro de cultivo celular.

Ejemplo 3: Construcción de un plásmido de expresión que codifica el antígeno T grande SV40 Un sitio de clonación múltiple sintético (MCS) se diseño para contener sitios de restricción para Notl, Pací, Sbfl, Pmel, Ascl y Clal. Dos oligonucleótidos se diseñaron WdV436 : 5 ' -GCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT-3' (SEQ ID NO: 11) y WdV437: 3 ' -CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC- 5' . (SEQ ID NO 12) . Ambos oligonucleótidos dV436 y WdV437 se separaron en sus pares base uno al otro y se ligaron en SK- (Promega) pBluescript, proporcionando el plásmido recombinante pAM007.

Dos oligonucleótidos se diseñaron para introducir un sitio de restricción Notl adicional dV452 : CGGCGGCCGCGTAC (SEQ ID NO: 13) y WdV453: GCGGCCGC . Ambos oligonucleótidos fueron separados en sus pares base y ligados en pAM007, proporcionando el vector recombinante pAM008.

El vector de expresión pLenti6.3/V5DEST_verA (Invitrogen) se usó como una plantilla para clonar el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMVie) usando PCR. Dos oligonucleótidos se diseñaron dV286: 5'-TTGGCGCGCCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGG-3 ' (SEQ ID NO: 14) y dV220 : 3 ' -GACAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGCGGAGGCTGGATCG- 5 ' (SEQ ID NO: 15) flanqueando al promotor CMV. Los oligonucleótidos WdV286 y WdV220 contienen sitios de restricción Ascl y HindIII respectivamente. Subsecuentemente, el pLenti6.3/V5DEST_verA purificado se sometió a PCR usando oligonucleótidos WdV286 y WdV220, proporcionando un fragmento de ADN promotor de CMV. Este fragmento fue Ascl y Hindlll digeridos y ligados en SK pBluescript, proporcionando pAM009.

El vector de expresión pGL4.22 (Promega) se usó como una plantilla para clonar el gen de resistencia antibiótico N-acetiltransferasa de puromicina usando PCR. Dos oligonucleótidos se diseñaron WdV454: 5'- CCACCCAAGCTTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCG-3 ' (SEQ ID NO : 16) y WdV455: 3 ' -TATCCGCTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGC-5 ' (SEQ ID NO: 17) flanqueando el gen de resistencia antibiótico N-acetiltransferasa de puromicina y conteniendo sitios de restricción HindIII y Xhol , respectivamente. El plásmido pGL4.22 se sometió a PCR usando oligonucleótidos dV454 y WdV455, proporcionando el cADN N-acetiltransferasa de puromicina. Este fragmento fue Hindlll y Xhol digerido y ligado en pAM009, proporcionando pAMOlO.

El vector de expresión pEF5/FRT/5 -DEST (Invitrogen) se usó como una plantilla para clonar la señal de poliadenilación BGH usando PCR. Dos oligonucleótidos se diseñaron WdV456 : 5 ' -CAACCGCTCGAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3 ' (SEQ ID NO: 18) y WdV457 : 3 ' -CGGGGTACCCCATAGAGCCCACCGCATCCCC-5' (SEQ ID NO: 19) flanqueando la señal de poliadenilación y conteniendo sitios de restricción Xhol y Kpnl respectivamente. El plásmido pEF5/FRTA/5-DEST se sometió a PCR usando oligonucleótidos WdV456 y WdV457, proporcionando el cADN de señal poliadenilación BGH. Este fragmento fue Xhol y Kpnl digerido y ligado en pAMOlO, proporcionando pAMOll.

Los plásmidos pAM008 se digirieron Ascl y Pmel y el fragmento de ADN comprende la N-acetiltransferasa de puromicina que codifica el dominio se purificó de un gel de agarosa y ligó en pAM008, proporcionando pAM012.

El ADN de un clon de ADN SV40 de longitud completa (ATCC número VRMC-2) se usó como plantilla para clonar el antígeno T SV40 que codifica la región usando PCR. Dos oligonucleótidos se diseñaron dV408: ACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC (SEQ ID NO : 20) que contiene un sitio de recombinación attBl y WdV409: TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGG (SEQ ID NO: 21) que contiene un sitio de recombinación attB2. WdV408 y dV409 usaron PCR para amplificar la región que codifica el antígeno T genómico. Subsecuentemente, un clon de entrada de puerta de enlace se generó a partir del fragmento de ADN generado y pDONR221, resultando en pAM013. Un plásmido de expresión del antígeno T se generó por recombinación de puerta de enlace entre pAM013 y pEF5/FRTA/5 -DEST, resultando en pAM014.

Los sitios de restricción Notl y Pmel en el plásmido pAM014 se eliminaron por digestión Notl y Pmel de pAM014 seguido por un tratamiento de polimerasa de ADN T4 y vuelto a ligar, proporcionando pAM015. El cásete de expresión del antígeno T subsecuentemente se asiló por una digestión Sphl seguida por un tratamiento de polimerasa de ADN T4 y una digestión Nrul .

Con objeto de generar un plásmido de transporte dos oligonucleótidos se diseñaron WdV448: TCCTGCAGGCGGGGTACCCTAGTCTAGACTAGCCGCGGGGAGTTTAAACAGCT (SEQ ID NO: 22) y WdV449 : GTTTAAACTCCCCGCGGCTAGTCTAGACTAGGGTACCCCGCCTGCAGGAGTAC (SEQ ID NO: 23) .

Los oligonucleótidos WdV448 y WdV449 fueron separados en sus pares base generando un fragmento de ADN que contiene los sitios de restricción Kpnl, Sbfl, Kpnl, Xbal, Sacll, Pmel y Sacl. Este fragmento de ADN se ligó en Kpnl y Sacl digeridos pBluescript SK- (Promega) , proporcionando pAM016. El plásmido SK pBluescript fue digerido con Kpnl y Xbal y el fragmento de ADN MCS se aisló de un gel de agarosa. El fragmento de ADN MCS se ligó en pAM016 digerido con Kpnl y Xbal, resultando en pAM017.

El cásete de expresión del antígeno T que maneja alfa EF1 de pAM015 se aisló por un Nrul y Sphl digerido seguido por un tratamiento de polimerasa de ADN T4. El fragmento de ADN resultante se clonó en pAM017 digerido con EcoRV, resultando en pAM018.

El plásmido pAM018 fue digerido con Sbfl y Pmel y el fragmento de ADN que comprende el cásete de expresión del antígeno T se aisló de un gel de agarosa y clonó en pAM012 digerido con Sbfl y Pmel, resultando en pAM019.

Cuatro oligonucleótidos se diseñaron dV487: 5'-GCAGGCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3 ' (SEQ ID NO: 24) y WdV490: 3'-CCATTCATCAGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGCCTCCAAAG- 5 ' (SEQ ID NO: 25) WdV:489 5' CTTTGGAGGCTTCTGGGATGCAACTGAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGG-3 ' (SEQ ID NO: 26) y WdV488: 5'- AGGAATGTTGTACACCATGCATTTTAAAAAGTC-3 ' (SEQ ID NO : 27) .

Los oligonucleótidos WdV487 y WdV490 y oligonucleótidos WdV489 y WdV488 se usaron para amplificar el primer y segundo exón del antígeno T grande SV40 respectivamente. Ambos fragmentos de ADN generado subsecuentemente se someten a una fusión PCR usando oligonucleótidos dV487 y WdV488. El fragmento de ADN generado que comprende el antígeno T grande SV40 que codifica la región fue digerido con Ncol y Nsil y clonado en pAM019 similarmente digerido, resultando en pAMOOl .

En resumen, pAMOOl contiene un promotor alfa EF1 corriente arriba del antígeno T grande que codifica la región y un promotor CMVie corriente arriba de la N-acetiltransferasa de puromicina que codifica la región.

Ejemplo 4: Generación de una línea celular productora Vero y producción de partículas de vector SV40 recombinante .

Las células Vero (Sigma-Aldrich número de orden: 88020401) se propagaron y adaptaron para medio DMEM de cultivo libre de suero (Invitrogen, código de producto: 41966-052) . La adaptación a condiciones libres de suero se realizó al reducir gradualmente el suero de bovino fetal de 8, 6, 4, 2 y 0 por ciento en el medio cada pasaje. Luego las células libres de suero Vero (Vero-SF) se cultivaron en medio SFM OptiPro (Invitrogen) que contienen 2 por ciento de L-glutamina a 37 grados Celsius y C02 al 5 por ciento.

Las células Vero-SF se transíectaron con ADN de pAMOOl usando el agente de transfección Exgen 500 (Fermentas, código de producto: R0511) de acuerdo a las prescripciones del proveedor. Las células Vero-SF transfectadas se seleccionan subsecuentemente para integración del cásete de gen de expresión T grande SV40 en el ADN cromosómico al agregar 2 g/ml de puromicina al medio de cultivo celular. Las colonias supervivientes se aislaron y propagaron en medio SFM OptiPro que contienen 2 pg/ml de puromicina y 2 por ciento de L-glutamina. Las células resistentes de puromicina se transfirieron al medio SFM OptiPro que contiene 2 por ciento de L-glutamina y 10 por ciento de DMSO y almacenaron a -156 grados Celsius.

Ejemplo 5: Selección de subclones SuperVero que producen SV40 superior .

Los clones Vero resistentes a puromicina transfectados con pAMOOl y las células de control VERO-SF se cultivaron hasta llegar a una confluencia del 50 por ciento. Los cultivos celulares fueron transducidas con 50 µ? de la población del vector SV-Luc que contiene aproximadamente 2.5 x 101C copias de genoma del vector.

Cuatro horas después de la transducción el medio de cultivo se reemplazó por medio SFM OptiPro fresco que contiene 2 g/ml de puromicina y 2 por ciento de L-glutamina. Tres días después de la transducción los lisados crudos se preparan de las células transducidas por congelación-descongelación (Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 -791, 2004) . Las células COS-1 cultivadas en DMEM suplementado con 10 por ciento de suero bovino fetal (Invitrogen) fueron transducidos con 100 microlitros de lisado crudo de cada clon de célula resistente a puromicina y Vero SF transfectado con pAMOOl. Dos días después de la transducción las células COS-1 subsecuentemente se probaron por expresión de luciferasa de luciérnaga como una medida para la cantidad de producción del vector SV-Luc en el clon de célula resistente a puromicina correspondiente y Vero SF transfectado con pAMOOl. Se seleccionaron los clones de células que exhiben un nivel de expresión de luciferasa comparable a células COS-1, propagadas y expandidas para crear un banco de células. El clon celular Vero-SF001-86 se monitoreo repetidamente para la producción SV-Luc y produce cantidades similares de partículas de vector SV40 recombinante como COS-1. Un subclon celular de Vero-SF001-86 indica que Vero-SF001-86-01 se generó por dilución limitada que produce repetidamente cantidades similares de partículas de vector SV40 recombinante como el clon celular Vero-SF001-86 precursor. El PCR cuantitativo de acuerdo a Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780 - 791, 2004, reveló que al clon celular Vero-SF001-86-01 indica SuperVero que produce rutinariamente 1 -10 x 1011 copias del genoma de vector por mililitro de cultivo celular.

Ejemplo 6: Clonación molecular de un vector usado para la producción de proteínas recombinantes en células SuperVero El SV40 origen de replicación fue PCR aislado de pTracer-SV40 (Invitrogen) y clonado en el plásmido de expresión de luciferasa de luciérnaga pGL3 (Promega resultante en el vector de expresión pAM006. Subsecuentemente, las células SuperVero se transfectaron con pAM006 purificado y el control del ADN de vector de expresión pGL3. Tres días después de la transfección se midió la expresión de luciferasa. Las células SuperVero transfectadas con pAM6 significativamente producen más luciferasa de luciérnaga en comparación con las células transfectadas de control pGL3.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la producción de partículas de vector poliomavirales recombinantes incapaces de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional, caracterizado porque comprende las etapas de a. Proporcionar una línea celular permisiva para poliomavirus de tipo natural, la línea celular es capaz de expresar un antígeno T grande poliomaviral funcional e incapaz de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional , b. Introducir en la línea celular un ADN de poliomavirus incapaz de codificar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional , c. Cultivar las células en un medio de crecimiento bajo condiciones que permiten la formación de partículas de vector poliomavirales recombinantes, y d. Recolectar las partículas de vector poliomavirales recombinantes del cultivo celular.

2. La composición caracterizada porque comprende partículas de vector poliomavirales recombinantes incapaces de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional obtenible por el método de conformidad con la reivindicación 1.

3. Una composición que comprende más de un millón de partículas de vector poliomavirales recombinantes incapaces de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional, las partículas de poliomavirus son incapaces de replicar en células las cuales son permisivas para el poliomavirus de tipo natural, caracterizada porque la composición no contiene una sola partícula de poliomavirus capaz de replicar en células las cuales son permisivas para el poliomavirus de tipo natural en donde las células no expresan un antígeno T grande poliomaviral funcional.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el poliomavirus es un poliomavirus de primate.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el poliomavirus es un poliomavirus de simio.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el poliomavirus se selecciona del grupo que consiste de SV40, SV12, Poliomavirus linfotrópico, poliomavirus de mono verde Africano y poliomavirus de chimpancé .

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el poliomavirus es SV40.

8. La composición de conformidad con las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada porque las células permisivas para el poliomavirus de tipo natural se seleccionan del grupo que consiste de de células Vero, células CHO, MDCK, PerC.6, HEK293 y CV1.

9. Una línea celular permisiva para un poliomavirus, caracterizada porque la línea celular es capaz de expresar un antígeno T grande poliomaviral funcional e incapaz de expresar un antígeno T pequeño poliomaviral funcional.

10. Uso de línea celular de conformidad con la reivindicación 9 para la producción de proteínas recombinantes .

11. La composición de conformidad con las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada porque es para uso como un medicamento.