CN110628730B - 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用 - Google Patents

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用。本发明利用Crispr/Cas9基因编辑技术和Cre/lox重组系统快速编辑PRV病毒株基因组，将其毒力基因gE、gI和TK定点缺失，并在gG位置定点插入NADC30‑like株的抗原基因。本发明首次选用流行PRRSV毒株PRRSV NADC30‑like的GP3、GP4、GP5和GP6蛋白的非跨膜区域编码序列作为抗原基因，抗原种类更加全面，对当前PRRSV疫情有更强的针对性，且免疫保护效果更强。本发明提供的活疫苗能够更有针对性地保护靶动物不受PRV和PRRSV的侵害，为我国猪伪狂犬病和蓝耳病的疫情防控提供有力工具。

Description

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒 及应用
技术领域
本发明属于生物技术和预防兽医领域，具体地说，涉及一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用。
背景技术
伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PrV)是引起多种动物共患的伪狂犬病的病原。猪是PRV的自然宿主，其它多种动物也可被感染。该病对猪呈爆发流行，可导致母猪繁殖障碍和新生仔猪大量死亡。目前防治伪狂犬病主要靠疫苗接种。PRV Bartha-K61株是二十世纪六十年代由Bartha等人将分离得到的PRV野毒株通过鸡胚成纤维细胞传代获得的一个人工致弱疫苗株，其毒力大大减弱，且免疫原性好，在国内外已应用数十年，在防制伪狂犬病中发挥了重要作用。然而，病毒具有变异的特性，利用Bartha-K61构建的重组病毒疫苗株已不能够很好地预防现行变异PRV病毒引起的疫情。
猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的一种传染病，以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及猪的呼吸系统疾病和高死亡率为主要特征。该病危害严重，并且目前缺少有效的防治措施。
因此，亟需开发利用重组病毒制备的弱毒疫苗，以更好地防御现行流行PRV和PRRSV引起的疫病。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒，其为重组猪伪狂犬病病毒PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V201960，保藏日期2019年8月22日。
第二方面，本发明提供一种组合物，其包含所述的重组猪伪狂犬病病毒和药学上可接受的载体。
第三方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。
第四方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含上述免疫原性组合物。
第五方面，本发明提供一种包含所述重组猪伪狂犬病病毒的基因工程疫苗。
第六方面，本发明提供所述基因工程疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述重组猪伪狂犬病病毒接种至易感细胞进行培养，得到病毒液；
(2)收获步骤(1)得到的重组猪伪狂犬病病毒。
第七方面，本发明提供以所述重组猪伪狂犬病病毒或上述组合物为免疫原制备的特异性抗体。
第八方面，本发明提供所述重组猪伪狂犬病病毒的以下任一应用：
1)用于制备治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪伪狂犬病毒感染以及由其感染所致相关疾病的疫苗或药物；
2)用作疫苗载体。
可选用其它PRRSV病毒毒株的GP3、GP4、GP5和GP6蛋白的非跨膜区域编码序列作为抗原基因插入PRV毒力基因缺失载体上。
可选用其它PRV毒株，插入PRRSV NADC30-like株的GP3、GP4、GP5和GP6蛋白的非跨膜区域编码序列，制备重组载体疫苗。
上述基于本发明方法做出的改进/变化均落入本发明保护范围。
本发明使用PRV变异毒株SDN8为亲本株，缺失毒力基因gE、gI和TK后，在其gG基因位置插入流行PRRSV NADC30-like株的抗原基因，制备的活疫苗能够更有针对性地保护靶动物不受PRV和PRRSV的侵害。为我国猪伪狂犬病和蓝耳病的疫情防控提供有力工具。
本发明首次选用流行PRRSV毒株PRRSV NADC30-like的GP3、GP4、GP5和GP6蛋白的非跨膜区域编码序列作为抗原基因，既含T细胞表位又含B细胞表位，抗原种类更加全面，对当前PRRSV疫情有更强的针对性，且免疫保护效果更强。
本发明利用Crispr/Cas9基因编辑技术和Cre/lox重组系统快速编辑变异毒株PRVSDN8病毒基因组，将其毒力基因gE、gI和TK定点缺失，并在gG位置定点插入NADC30-like株的抗原基因。该方法相较传统同源重组更加高效、迅速。
附图说明
图1为本发明实施例1中pSK-gEgI-LR-EGFP同源臂载体的结构示意图。
图2为本发明实施例1中重组质粒pSK-TK-LR-mCherry的结构示意图。
图3为本发明实施例1中PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP基因缺失毒株空斑纯化结果。左、右图分别表示在荧光显微镜下观察到的PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP基因缺失毒株在PK-15细胞上形成的两个独立的噬斑。
图4为本发明实施例1中PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+基因缺失毒株空斑纯化结果。左图表示在倒置显微镜的白光下观察到的噬斑，右图表示该噬斑在荧光显微镜下观察无绿色荧光，由此可以判断PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP毒株基因组中的EGFP荧光基因成功去除。
图5为本发明实施例1中间接免疫荧光对PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+基因重组毒株GP蛋白检测结果。DAPI：细胞核染色；GP：用GP5单克隆抗体作为一抗，AlexaFluor647作为荧光二抗对感染细胞进行染色，在荧光显微镜下观察到的红色荧光噬斑即为表达GP蛋白的PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+重组病毒；Merge：细胞核染色和GP蛋白染色视野相融合，由该视野可见，GP蛋白表达后主要分布在细胞质中和细胞膜上。
图6为本发明实施例1中毒株PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+空斑纯化结果。左、右图表示在荧光显微镜下观察到的PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+基因缺失毒株在PK-15细胞上形成的独立噬斑。
图7为本发明实施例1中无荧光PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+毒株空斑纯化结果。左图表示在倒置显微镜的白光下观察到的细胞病变，右图表示该噬斑在荧光显微镜下观察无红色荧光，由此可以判断PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+毒株基因组中的mCherry荧光基因成功去除。
图8为本发明实施例3中ELISA检测抗体gB(A)和GP5(B)水平结果。
图9为本发明实施例3中PRV(A)、PRRSV(B)中和抗体水平结果。
图10为本发明实施例4中PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+毒株对PRV(A)和PRRSV(B)的交叉保护作用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的PRRSV NADC30-like株可参见NADC30-Like PorcineReproductive and Respiratory Syndrome in China；Kegong Tian；The Open VirologyJournal，2017。PRV变异毒株SDN8由武汉科前生物股份有限公司提供。
实施例1表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒的构建
本发明利用Crispr/Cas9基因编辑系统、Cre/lox重组酶系统快速编辑病毒基因组的优势，缺失PRV SDN8毒力基因TK、gI和gE，并以该基因缺失毒株为载体，在其gG基因中插入PRRSV NADC30-like的抗原基因(包含GP3、GP4、GP5和GP6蛋白的非跨膜区域编码序列)，以此为基础研发猪伪狂犬病毒重组猪蓝耳病毒GP基因的活疫苗。
1.sgRNA序列设计及重组载体构建
根据TK、gE、gI和gG毒力基因序列，在线(http://crispr.mit.edu/)设计靶向缺失序列的single guide RNA(sgRNA)序列，合成单链DNA引物，经退火、连接和转化连至px335-Cas9n载体(px335-Cas9n载体购自Addgene公司)，分别命名为px335-Cas9n-gEsgRNA(切割靶点序列为5′-GGGCAGGAACGTCCAGATCC-3′)、px335-Cas9n-gIsgRNA(切割靶点序列为5′-GTCGTCGGATCGTGGCACGA-3′)、px335-Cas9n-gG1sgRNA(切割靶点序列为5′-GCCGCGAGAGTAGTCCGTCC-3′)、px335-Cas9n-gG2sgRNA(切割靶点序列为5′-ACCCCGTCCACGACGACCGG-3′)、px335-Cas9n-TK1sgRNA(切割靶点序列为5′-CCCGCTCGAGGTGCACGCGT-3′)、px335-Cas9n-TK2sgRNA(切割靶点序列为5′-CGCCTTGTACGCGCCGAAGA-3′)。
2.同源臂载体构建
(1)pSK-gEgI-LR-EGFP的构建：
根据gE、gI缺失序列(1248bp)设计引物分别扩增两端各1200bp左右的基因序列，分别连入pSK载体(pSK载体购自Addgene公司)。命名为pSK-gEgI-LR同源臂载体。最后，通过无缝克隆技术将LoxP-CMV-EGFP-PolyA-LoxP序列连入pSK-gEgI-LR同源臂载体，构建得到重组质粒pSK-gEgI-LR-EGFP(图1)。
(2)pCI-neo-GP的构建：
将人工合成的NADC30-like抗原基因GP蛋白的基因序列(SEQ ID NO:1，GP蛋白序列见SEQ ID NO:2)用EcoRI和NotI双酶切连入真核表达载体pCI-neo上，构建得到重组质粒pCI-neo-GP。
(3)pSK-gG-LR-GP的构建：
根据gG缺失序列(240bp)设计引物分别扩增两端各1000bp左右的基因序列，分别连入pSK载体；设计引物将pCI-neo-GP重组质粒上的NADC30-like抗原基因和其上、下游表达元件(pCI-neo载体自带的CMV启动子、SV40 poly(A))PCR扩增出来；最后，将CMV-GP-PolyA序列通无缝克隆技术连入pSK-gG-LR同源臂载体，构建得到重组质粒pSK-gG-LR-GP。
(4)pSK-TK-LR-mCherry的构建：
根据TK缺失序列(253bp)设计引物分别扩增两端各1200bp左右的基因序列，分别连入pSK载体，构建得到pSK-TK-LR同源臂载体。最后，通过无缝克隆技术将LoxP-CMV-mCherry-PolyA-LoxP序列连入pSK-TK-LR同源臂载体，构建得到重组质粒pSK-TK-LR-mCherry(图2)。
3.构建RV SDN8-gE-/gI--EGFP缺失毒株
(1)转染：将构建的pSK-gEgI-LR-EGFP同源臂载体、PRV SDN8基因组、pX335-Cas9n-gEsgRNA和pX335-Cas9n-gIsgRNA用脂质体转染的方法共转入PK-15细胞中，观察绿色荧光。
(2)空斑纯化：转染产物再接PK-15细胞，筛选有绿色荧光的细胞病变，收获含PRVSDN8-gE-/gI--EGFP缺失毒株的病变细胞，用低熔点琼脂糖进行空斑纯化，得到100％的PRVSDN8-gE-/gI--EGFP缺失毒株。
4.PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+毒株构建
(1)转染：将pSK-gG-LR-GP同源臂质粒、sgRNA质粒px335-Cas9n-gG1sgRNA和px335-Cas9n-gG2sgRNA、PRV SDN8-gE-/gI--EGFP缺失毒株基因组共转入PK-15细胞中，48-72h收获转染产物，反复冻融2次后再次接种PK-15细胞。
(2)空斑纯化：收获含PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP重组病毒的病变细胞，用低熔点琼脂糖进行空斑纯化，并进行PCR鉴定扩增GP序列，得到100％的PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP重组病毒。SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP毒株空斑纯化结果见图3。
(3)去荧光并纯化无荧光重组病毒：将PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+-EGFP重组病毒基因组和pCre(Cre重组酶表达质粒)用脂质体转染的方法共转入PK-15细胞中，观察绿色荧光，并用低熔点琼脂糖法纯化出无荧光的细胞病变，得到100％的PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+重组病毒。无荧光PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+毒株空斑纯化结果见图4，GP蛋白检测结果见图5。
5.PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+毒株的构建
(1)转染：将pSK-TK-LR-mCherry同源臂质粒、sgRNA质粒px335-Cas9n-TK1sgRNA和px335-Cas9n-TK2sgRNA、PRV SDN8-gE-/gI-/gG--GP+缺失毒株基因组共转入PK-15细胞中，48-72h收获转染产物，反复冻融2次后再次接种PK-15细胞。
(2)空斑纯化：收获含PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+重组病毒的病变细胞，用低熔点琼脂糖进行空斑纯化，挑取带红色荧光的重组病毒，得到100％的PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+重组病毒。毒株PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+空斑纯化结果见图6。
(3)去荧光并纯化无荧光重组病毒：将PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+-mCherry+重组病毒基因组和pCre(Cre重组酶表达质粒)用脂质体转染的方法共转入PK-15细胞中，观察红色荧光，并用低熔点琼脂糖法纯化出无荧光的细胞病变，得到100％的PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+重组病毒(其所含GP基因序列及其表达元件序列见SEQ ID NO:3，TK基因缺失后序列、gI/gE基因缺失后序列以及gG基因缺失并插入GP基因后序列分别见SEQ ID NO:4-6)。无荧光PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+毒株空斑纯化结果见图7。重组猪伪狂犬病病毒PRVSDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V201960。
转染后的PK-15细胞于DMEM培养液中培养。培养条件为：37℃，5％CO2，且具有一定湿度的孵育箱中培养。
实施例2重组猪伪狂犬病病毒PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+在小鼠上的安全性试验
选购30只6-8周龄的昆明鼠(gB、gE抗体和GP5抗体均为阴性)，随机分为A、B、C 3组，A组背部皮下注射106TCID50的PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+重组病毒；B组背部皮下注射106TCID50的PRV JS2012野生型毒株，C组背部皮下注射约等体积无血清DMEM培养基。连续观察7日。
结果显示，A、C组小鼠未出现发病状况，精神和食欲良好；B组小鼠注射后第三天全部死亡。表明PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+重组病毒的安全性好，可用作活疫苗。
实施例3重组猪伪狂犬病病毒PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+对仔猪的疫原性试验
选取21日龄伪狂犬病和猪蓝耳病阴性仔猪20头(gB、gE抗体和GP5抗体均为阴性)，随机分为A、B、C和D组，每组5头，隔离饲养。A、B组肌注PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+株(1.0×10 6.0TCID 50/头份)，C、D组注射1mL DMEM，作为未免疫对照。免疫后仔猪没有任何临床症状。免疫后第21天，四组都进行前腔静脉采血，A、C组用anti-gB ELISA(购自IDEXX公司)检测gB抗体水平、B、D组用anti-GP5 ELISA(购自IDEXX公司)检测GP5抗体水平；并分别用PRVJS2012株和PRRSV NADC30-like株在细胞上进行中和试验检测中和抗体水平。结果显示，免疫后第21天PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+免疫组仔猪产生了较高的中和抗体水平。ELISA检测抗体gB和GP5水平结果见图8(A和B)。PRV、PRRSV中和抗体水平结果见图9(A和B)。
在免疫后第21天，A和C组使用PRV JS2012株滴鼻攻毒，攻毒剂量为1.0×107.0TCID50/头，攻毒后观察21天，测量体温，记录症状，每周称重两次，记录体重变化。结果攻毒后对照组出现典型的猪伪狂犬病临床表现：包括高热、精神沉郁、食欲废绝、攻毒后体温变化。在攻毒后48h出现共济失调，至第4天，出现1头猪死亡，至第7天对照组全部死亡。PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+免疫组在攻毒后仅出现轻微发热，没有超过41.0℃，至第五天开始恢复体温和采食。免疫组没有死亡，获得100％保护。
B和D组使用PRRSV NADC30-like株肌肉注射攻毒，攻毒剂量为2×105.0TCID50/头，每日进行体温测定和临床观察，直至攻毒后21日。结果显示免疫组仔猪无发病无死亡，精神和采食状况良好；对照组仔猪全部发病，5头均出现体温升高的症状(≥40℃)，2头出现呼吸急促、食欲不振，1头死亡。
以上实验结果表明，PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+株弱毒疫苗免疫仔猪后，对PRRSV NADC30-like株的感染能够起到良好的保护效果。
实施例4重组猪伪狂犬病病毒PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+对PRV、PRRSV的交叉保护试验
选取21日龄伪狂犬病和猪蓝耳病阴性仔猪20头(gB、gE抗体和GP5抗体均为阴性)，随机分为A、B、C和D组，每组5头，隔离饲养。A、B组肌注PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+株(1.0×10 6.0TCID 50/头份)，C、D组注射1mL DMEM，作为未免疫对照。免疫后仔猪没有任何临床症状。免疫后第21天，四组都进行前腔静脉采血，A、C组用anti-gB ELISA(购自IDEXX公司)检测gB抗体水平、B、D组用anti-GP5 ELISA(购自IDEXX公司)检测GP5抗体水平；结果显示，免疫后第21天PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+免疫组仔猪产生了较高的中和抗体水平。在免疫后第21天，A和C组使用PRV Ea株滴鼻攻毒，攻毒剂量为1.0×107.0TCID50/头，攻毒后观察21天，测量体温，记录症状，每周称重两次，记录体重变化。结果攻毒后对照组出现典型的猪伪狂犬病临床表现：包括高热、精神沉郁、食欲废绝、攻毒后体温变化等，在攻毒后48h出现共济失调，至第5天，出现2头猪死亡，至第7天对照组全部死亡；PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+免疫组4头在攻毒后第3天出现轻微发热，没有超过41.0℃，1头无任何发病症状，至第5天皆恢复体温和采食，免疫组没有死亡，获得100％保护。
B和D组使用PRRSV TJ株肌肉注射攻毒，攻毒剂量为2×105.0TCID50/头，每日进行体温测定和临床观察，直至攻毒后21日。结果显示免疫组仔猪无发病无死亡，精神和采食状况良好；对照组仔猪全部发病，5头均出现体温升高的症状(≥40℃)，2头出现呼吸急促、食欲不振，1头死亡。
各组抗体变化如图10(A和B)所示，因此，本发明提供的PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+重组基因缺失疫苗对不同的PRV和PRRSV毒株的感染均具有良好的保护效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒及应用
<130> KHP191114310.1
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcaaca gcagctccca tctacagttg atttataacc tgacgatatg tgagctgaat 60
ggcacagatt ggctgaacga aagattttac tgggcaggat cgggctctgt cggcctgatc 120
actgtgtcca ccgccggata ttatcacagg cggtatgtag gatcgggctc taattgcatg 180
tcctggcgct actcatgcac cagatatacc aattttcttc tggatactaa gggcaaactc 240
taccgctggc ggtcacccgt catcatagag aaggggggta aagttgatgt tgggggtcat 300
ttaatcgacc tcaaaagagt tgtgcttgat ggttccgcgg caacccctgt aaccaagatt 360
tcagcggaac aatggggtcg tccaggatcg ggctctatgg ggtcgtccat agacgacttc 420
tgcaatgaca gcacggctgt acaaaaggtg cttttggcgt tttctatcac cggaggcgga 480
ggctcgggcg gaggcggatc taagccgtgt ttcagttcga gtctttcaga cattaagacc 540
aacaccacca gcgcagcaag ttccgttgtc ctccaagaca tcagctgtct taggcatagc 600
aacccgtccc ctgcggcgtt tcgcaaaatc cctcaatgcc gcacggcgat aggaacaccc 660
gtctacatca ctgtcacagc caacgtgacg gatgagaatt atttgcattc ctctgacctt 720
ctcatgctct cttcttgcct tttctacgct tctgagatga gtgaaaaggg atttaaggtg 780
atatttggca atgtgtcagg cattgtggct gtgtgtgtca actttaccag ctatgtccaa 840
catgtcaagg agttcaccca gcgatcctta gtggttgacc atgtgcggct gcttcacttc 900
atgacacctg agactatgcg gtgggcgacc gttttagcct gtctttttgc cattctgttg 960
gcaattggat cgggctctag acatcacttt acccctagtg agcgacaatt gtgtctgtcg 1020
tcaatccgga ctgcctttaa ccaaggcgct ggaacttgca ccctgtcaga ctcagggaga 1080
ataagttaca ctgtggagtt tagtttgcct actcatcata ctgtgcgcct gattcgcgtc 1140
acagcgtcac cctcagcata a 1161
<210> 2
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile
1 5 10 15
Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Glu Arg Phe Tyr Trp Ala
20 25 30
Gly Ser Gly Ser Val Gly Leu Ile Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr
35 40 45
His Arg Arg Tyr Val Gly Ser Gly Ser Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr
50 55 60
Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Asp
85 90 95
Val Gly Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser
100 105 110
Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Ile Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Ser Met Gly Ser Ser Ile Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser
130 135 140
Thr Ala Val Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro Cys Phe Ser Ser Ser Leu Ser
165 170 175
Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Val Val Leu Gln
180 185 190
Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Ser Asn Pro Ser Pro Ala Ala Phe Arg
195 200 205
Lys Ile Pro Gln Cys Arg Thr Ala Ile Gly Thr Pro Val Tyr Ile Thr
210 215 220
Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu
225 230 235 240
Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys
245 250 255
Gly Phe Lys Val Ile Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val Cys
260 265 270
Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gln His Val Lys Glu Phe Thr Gln Arg
275 280 285
Ser Leu Val Val Asp His Val Arg Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu
290 295 300
Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu
305 310 315 320
Ala Ile Gly Ser Gly Ser Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln
325 330 335
Leu Cys Leu Ser Ser Ile Arg Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr
340 345 350
Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser
355 360 365
Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro
370 375 380
Ser Ala
385
<210> 3
<211> 2299
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctgcgatcgc ccgccccgtt 540
gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt 600
gaaccgtcag atcactagaa gctttattgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc 660
agtcagtgct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc agtgactctc ttaaggtagc 720
cttgcagaag ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt 780
aaggagacca atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg 840
cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt 900
tcaattacag ctcttaaggc tagagtactt aatacgactc actataggct agcctcgaga 960
attcgccacc atgagcaaca gcagctccca tctacagttg atttataacc tgacgatatg 1020
tgagctgaat ggcacagatt ggctgaacga aagattttac tgggcaggat cgggctctgt 1080
cggcctgatc actgtgtcca ccgccggata ttatcacagg cggtatgtag gatcgggctc 1140
taattgcatg tcctggcgct actcatgcac cagatatacc aattttcttc tggatactaa 1200
gggcaaactc taccgctggc ggtcacccgt catcatagag aaggggggta aagttgatgt 1260
tgggggtcat ttaatcgacc tcaaaagagt tgtgcttgat ggttccgcgg caacccctgt 1320
aaccaagatt tcagcggaac aatggggtcg tccaggatcg ggctctatgg ggtcgtccat 1380
agacgacttc tgcaatgaca gcacggctgt acaaaaggtg cttttggcgt tttctatcac 1440
cggaggcgga ggctcgggcg gaggcggatc taagccgtgt ttcagttcga gtctttcaga 1500
cattaagacc aacaccacca gcgcagcaag ttccgttgtc ctccaagaca tcagctgtct 1560
taggcatagc aacccgtccc ctgcggcgtt tcgcaaaatc cctcaatgcc gcacggcgat 1620
aggaacaccc gtctacatca ctgtcacagc caacgtgacg gatgagaatt atttgcattc 1680
ctctgacctt ctcatgctct cttcttgcct tttctacgct tctgagatga gtgaaaaggg 1740
atttaaggtg atatttggca atgtgtcagg cattgtggct gtgtgtgtca actttaccag 1800
ctatgtccaa catgtcaagg agttcaccca gcgatcctta gtggttgacc atgtgcggct 1860
gcttcacttc atgacacctg agactatgcg gtgggcgacc gttttagcct gtctttttgc 1920
cattctgttg gcaattggat cgggctctag acatcacttt acccctagtg agcgacaatt 1980
gtgtctgtcg tcaatccgga ctgcctttaa ccaaggcgct ggaacttgca ccctgtcaga 2040
ctcagggaga ataagttaca ctgtggagtt tagtttgcct actcatcata ctgtgcgcct 2100
gattcgcgtc acagcgtcac cctcagcata agcggccgct tccctttagt gagggttaat 2160
gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 2220
gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 2280
aagctgcaat aaacaagtt 2299
<210> 4
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcgcatcc tccggatcta cctcgacggc gcctacggca ccggcaagag caccacggcc 60
cgggtgatgg cgctcggcgg ggcgctgtac gtgcccgagc cgatggcgta ctggcgcact 120
ctgttcgaca cggacacggt ggccggtatt tacgatgcgc agacccggaa gcagaacggc 180
agcctgagcg aggaggacgc ggccctcgtc acggcgcagc accaggccgc cttcgcgacg 240
ccgtacctgc tgctgcacac gcgcctggtc ccgctcttcg ggcccgcggt cgagggcccg 300
cccgagatga cggtcgtctt tgaccgccac ccggtggccg cgacggtgtg cttcccgctg 360
gcgcgcttca tcgtcgggga catcagcgcg gcggccttcg tgggcctggc ggccacgctg 420
cccggggagc cccccggcgg caacctggtg gtggcctcgc tggacccgga cgagcacctg 480
cggcgcctgc gcgcccgcgc gcgcgccggg gagcacgtgg acgcgcgcct gctcacggcc 540
ctgcgcaacg tctacgccat gctggtcaac acgtcgcgct acctgagctc ggggcgccgc 600
tggcgcgacg actgggggcg cgcgccgcgc ttaagcttgc atgcctgcag gtcgacgata 660
tattaattaa ggcggcggct ccatgataac ttcgtatagt ataccttata cgaagttatc 720
gtgattaatt aaataatctc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt cggcatggag 780
gtgacggagt ccgcgtacgg cgaccacatc cggcagtgcg tgtgcgcctt cacgtcggag 840
atgggggtgt ga 852
<210> 5
<211> 1862
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgatgatgg tggcgcgcga cgtgacccgg ctccccgcgg ggctcctcct cgccgccctg 60
accctggccg ccctgacccc gcgcgtcggg ggcgtcctct tcaggggcgc cggcgtcagc 120
gtgcacgtcg ccggcagcgc cgtcctcgtg cccggcgacg cgcccaacct gacgatagac 180
gggacgctgc tgtttctgga ggggccctcg ccgagcaact acagcgggcg cgtggagctg 240
ctgcgcctcg accccaagcg cgcctgctac acgcgcgagt acgccgccga gtacgacctc 300
tgcccccgcg tgcaccacga aatcgataag cttgcatgcc tgcaggtcga gtatttaatt 360
aatcaataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc atggatcctc ctcctcctta 420
attaatatta agtatctcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcc tgcagcccgg 480
gggatccggt gaccacggtg tgcttcgaga ccgcgtgcca cccggacctg gtgctgggcc 540
gcgcctgcgt ccccgaggcc ccggagatgg gcatcggcga ctacctgccg cccgaggtgc 600
cgcggctccg gcgcgagccg cccatcgtca ccccggagcg gtggtcgccg cacctgagcg 660
tcctgcgggc cacgcccaac gacacgggcc tctacacgct gcacgacgcc tcggggccgc 720
gggccgtgtt ctttgtggcg gtgggcgacc ggccgcccgc gccggcggac ccggtgggcc 780
ccgcgcgcca cgagccccgc ttccacgcgc tcggcttcca ctcgcagctc ttctcgcccg 840
gggacacgtt cgacctgatg ccgcgcgtgg tctcggacat gggcgactcg cgcgagaact 900
ttaccgccac gctggactgg tactacgcgc gcgcgccccc gcggtgcctg ctgtactacg 960
tgtacgagcc ctgcatctac cacccgcgcg cgcccgagtg cctgcgcccg gtggacccgg 1020
cgtgcagctt cacctcgccg gcgcgcgcgc ggctggtggc gcgccgcgcg tacgcctcgt 1080
gcagcccgct gctcggggac cggtggctga ccgcctgccc cttcgacgcc ttcggcgagg 1140
aggtgcacac gaacgccacc gcggacgagt cggggctgta cgtgctcgtg atgacccaca 1200
acggccacgt cgccacctgg gactacacgc tcgtcgccac cgcggccgag tacgtcacgg 1260
tcatcaagga gctgacggcc ccggcccggg ccccgggcac cccgtggggc cccggcggcg 1320
gcgacgacgc gatctacgtg gacggcgtca cgacgccggc gccgcccgcg cgcccgtgga 1380
acccgtacgg ccggacgacg cccgggcggc tgtttgtgct ggcgctgggc tccttcgtga 1440
tgacgtgcgt cgtcgggggg gccatctggc tctgcgtgct gtgctcccgg cgccgggcgg 1500
cctcgcggcc gttccgggtg ccgacgcggg cgcggacgca catgctctct ccggtgtaca 1560
ccagcctgcc cacgcacgag gactactacg acggcgacga cgacgacgac gaggaggcgg 1620
gcgtcatccg ccggcggccc gcctccccca gcggagacag cggctacgag gggccgtacg 1680
cgagcctgga ccccgaggac gagttcagca gcgacgagga cgacgggctg tacgtgcgcc 1740
ccgaggaggc gccccgctcc ggcttcgacg tctggttccg cgatccggag aaaccggaag 1800
tgacgaatgg acccaactat ggcgtgaccg ccaaccgcct gttgatgtcc cgccccgctt 1860
aa 1862
<210> 6
<211> 3577
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaagtggg caacgtggca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 60
tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 120
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 180
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 240
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac 300
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg 360
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc 420
aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 480
aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactgc 540
gatcgcccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 600
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatca ctagaagctt tattgcggta gtttatcaca 660
gttaaattgc taacgcagtc agtgcttctg acacaacagt ctcgaactta agctgcagtg 720
actctcttaa ggtagccttg cagaagttgg tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcaag 780
gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct tgtcgagaca gagaagactc 840
ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt actgacatcc actttgcctt tctctccaca 900
ggtgtccact cccagttcaa ttacagctct taaggctaga gtacttaata cgactcacta 960
taggctagcc tcgagaattc gccaccatga gcaacagcag ctcccatcta cagttgattt 1020
ataacctgac gatatgtgag ctgaatggca cagattggct gaacgaaaga ttttactggg 1080
caggatcggg ctctgtcggc ctgatcactg tgtccaccgc cggatattat cacaggcggt 1140
atgtaggatc gggctctaat tgcatgtcct ggcgctactc atgcaccaga tataccaatt 1200
ttcttctgga tactaagggc aaactctacc gctggcggtc acccgtcatc atagagaagg 1260
ggggtaaagt tgatgttggg ggtcatttaa tcgacctcaa aagagttgtg cttgatggtt 1320
ccgcggcaac ccctgtaacc aagatttcag cggaacaatg gggtcgtcca ggatcgggct 1380
ctatggggtc gtccatagac gacttctgca atgacagcac ggctgtacaa aaggtgcttt 1440
tggcgttttc tatcaccgga ggcggaggct cgggcggagg cggatctaag ccgtgtttca 1500
gttcgagtct ttcagacatt aagaccaaca ccaccagcgc agcaagttcc gttgtcctcc 1560
aagacatcag ctgtcttagg catagcaacc cgtcccctgc ggcgtttcgc aaaatccctc 1620
aatgccgcac ggcgatagga acacccgtct acatcactgt cacagccaac gtgacggatg 1680
agaattattt gcattcctct gaccttctca tgctctcttc ttgccttttc tacgcttctg 1740
agatgagtga aaagggattt aaggtgatat ttggcaatgt gtcaggcatt gtggctgtgt 1800
gtgtcaactt taccagctat gtccaacatg tcaaggagtt cacccagcga tccttagtgg 1860
ttgaccatgt gcggctgctt cacttcatga cacctgagac tatgcggtgg gcgaccgttt 1920
tagcctgtct ttttgccatt ctgttggcaa ttggatcggg ctctagacat cactttaccc 1980
ctagtgagcg acaattgtgt ctgtcgtcaa tccggactgc ctttaaccaa ggcgctggaa 2040
cttgcaccct gtcagactca gggagaataa gttacactgt ggagtttagt ttgcctactc 2100
atcatactgt gcgcctgatt cgcgtcacag cgtcaccctc agcacatcat caccatcacc 2160
attaagcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg ataagataca 2220
ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa 2280
tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttacgtgac 2340
cgtcgcctgg ttctttgacg gcggccactg caaggtgccc ctcgtccacc gcgagtacta 2400
cggctgcccc ggggacgcca tgccctccgt cgagacgtgc accggcgggt actcgtacac 2460
ccgcacgcgc atcgacaccc tgatggagta cgccctcgtg aacgccagcc tcgtgctgca 2520
gcccgggctg tacgacgccg gcctgtacat cgtcgtgctc gtctttggcg acgacgccta 2580
cctcggcacc gtctccctgt cggtggaggc caacctggac tacccctgcg gcatgaagca 2640
cgggctcacg atcacccgcc ccggggccac cctcccgccc atcgccccca cggccggcga 2700
ccaccagcgc tggcgcgggt gcttcccctc gaccgacgag ggcgcctggg agaacgtgac 2760
cgccgccgag aagggcctgt ccgacgacta cgccgactac tacgacgtgc acatcttccg 2820
cctggagtct gacgacgagg tcgtccacgg cgatgccccc gaggcccccg agggcgagga 2880
ggtgaccgag gaggaggccg agctgacctc cagcgacctc gacaacatcg agatcgaggt 2940
cgtgggctcg cccgccgctc ccgtcgaggg cgccggcgac ggcgaggagg ggcacgggga 3000
cgaggaggac gaggagctga cctccagcga cctcgacaac atcgagatcg aggtcgtggg 3060
ctcgcccgcg gccgcccgct tcttcgccgc ctccaccacc ccccgcgccc ccacccgcgc 3120
ggccgagatc acgaccatga ccacggtcac caccgtgcgg acgaccgagg accccagcgg 3180
catcaccgac tgccgccgga gcgacttcgt ctcgccctct gacatcttcg tgacccccac 3240
cggcagcccc gccctgctcc tgggcttcct gggcagcgcg ctcgcctcgc gccccctgca 3300
cctgacggcc ggggagacgg cccagcacgt gcgcgaggcc cagcagaaga gccgccacgt 3360
ccgctccctc ggcggcctcc agctctcggt cgagaccgag accaccaaca ccaccaccac 3420
ccagacgggc ctgtcgggcg acatccgcac ctcgatctac atctgcgtcg ccctcgccgg 3480
cctggtcgtc gtgggcatcg tcatcatgtg cctccacatg gcgatcatca gggcccgggc 3540
ccggaacgac ggctaccgcc acgtggcctc cgcctga 3577

Claims (7)

1.表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP蛋白的重组猪伪狂犬病病毒，其特征在于，其为重组猪伪狂犬病病毒PRV SDN8-TK-/gE-/gI-/gG--GP+，保藏号为CCTCC NO:V201960。
2.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述的重组猪伪狂犬病病毒和药学上可接受的载体。
3.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求2所述的组合物。
4.一种疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求3所述的免疫原性组合物。
5.包含权利要求1所述重组猪伪狂犬病病毒的基因工程疫苗。
6.权利要求1所述重组猪伪狂犬病病毒在制备治疗或预防猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪伪狂犬病毒感染以及由其感染所致相关疾病的疫苗或药物中的应用。
7.权利要求5所述基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述重组猪伪狂犬病病毒接种至易感细胞进行培养，得到病毒液；
(2)收获步骤(1)得到的重组猪伪狂犬病病毒。
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