CN107805631B

CN107805631B - 编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体

Info

Publication number: CN107805631B
Application number: CN201711146339.2A
Authority: CN
Inventors: S.库克; M.莫塞; G.彼得森; P.J.A.索德梅杰
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2032-10-19
Also published as: EP2768964B1; RU2624037C2; CN107805631A; AR088401A1; EP2768964A1; CA3206983A1; CA3146727A1; PL2768964T3; SA112330950B1; MX352206B; MY173856A; MX2014004739A; US20130101619A1; HUS2100002I1; JP2015500631A; MY191634A; US8932604B2; IN2014CN02681A; WO2013057236A1; CN103890183A

Abstract

本发明公开了新型的重组多价非致病性马立克氏病病毒构建体，其编码并表达传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒蛋白二者的抗原，及其在家禽疫苗中使用的方法。

Description

编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体

本申请是申请日为2012年10月19日，申请号为201280051147.2，发明名称为“编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体”的发明专利申请的分案申请。本申请要求于2011年10月21日提交的美国临时申请序号No. 61/549,844在35 U.S.C. § 119(e)下的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本申请涉及编码并表达传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒蛋白抗原的新型重组多价非致病性马立克氏病病毒构建体，及其在家禽疫苗中使用的方法。

背景技术

致病性家禽病毒不仅使鸡变得虚弱，而且还使鸡养殖者损失惨重，因为大多数的所致疾病是传染性的，并且家禽工业严重依赖于封闭的大规模饲养设备。接种幼鸡通常是对抗这些病毒的唯一可行方式。尽管减毒或灭活的家禽病毒疫苗仍是市场中的重点，近年来，已花费大量资源用于开发包含表达致病性病毒蛋白抗原的重组病毒构建体的疫苗。此外，已进行大量努力以构建稳定且有效的表达来自多种病毒病原体的外源基因的多价重组非致病性马立克氏病病毒(rMDV_np)载体。这样的多价疫苗将用于使给予小鸡的注射次数最小化，并且由此减少对接种小鸡的不适和胁迫，并且显著降低人工和材料的费用。使用这样的单个多价构建体接种还将优于包含多个重组单价rMDV_np构建体的可选的多价rMDV_np疫苗，因为至少迄今为止，这些可选疫苗产生仅针对单一病毒病原体的保护作用。这些可选疫苗的失利可能是由于单价rMDV_np构建体之一生长超过其他单价rMDV_np构建体，从而抑制这些其他单价rMDV_np构建体诱导显著的免疫反应。在任何情况下，尽管迄今为止的过去曾大量努力以构建稳定且有效的表达来自多种病毒病原体的外源基因的多价重组rMDV_np载体，但已证实这些努力没有成功。

可通过疫苗接种控制的一种家禽病毒疾病是马立克氏病(Marek's disease)。马立克氏病是在全世界不利地影响鸡的致病性疾病。马立克氏病主要发生在2至5月龄之间的幼鸡中。临床症状包括：一个或多个肢的进行性麻痹，由于腿的麻痹导致的动作失调，由于累及翅膀而导致的翼下垂，以及由于累及颈部肌肉而导致的头位置降低。在急性情况下，可产生严重的机能降低。还可发生法氏囊和胸腺萎缩。

马立克氏病的病原体是马立克氏病病毒血清型1 (MDV1)，一种具有双链DNA基因组的细胞相关病毒。MDV1是嗜淋巴细胞的鸟类α疱疹病毒，其：(i) 感染B细胞，这可导致细胞溶解，和(ii) 潜伏地感染T细胞，这可诱导T细胞淋巴瘤。与毒性MDV1株密切相关的马立克氏病病毒血清型2 (MDV2)，此前称作原鸡属疱疹病毒3，是天然的减毒MDV株，其已显示具有极低或没有在鸡中的致病性[Petherbridge等人，J. Virological Methods 158:11-17(2009)]。SB-1是特异的MDV2株，其已显示可用于针对MDV1的疫苗中[参见例如，Murthy和Calnek，Infection and Immunity 26(2) 547-553 (1979)]。

另一个密切相关的α疱疹病毒，马立克氏病病毒血清型3 (MDV3)，更广泛地称作火鸡疱疹病毒(HVT)，是驯养火鸡的非致病性病毒[参见例如，Kingham等人，J. of General Virology 82:1123-1135 (2001)]。两种通常使用的HVT株是PB1株和FC126株。同时，HVT在鸡中也是非致病性的，它确实在鸡中诱导针对MDV1的长期持续的保护性免疫反应。因此，HVT已多年用于针对毒性MDV1的家禽疫苗，通常与SB-1组合，SB-1比HVT病毒性更高，但认为其安全性较低。或者，当禽群受到特别毒性的MDV1株的攻击(challenge)时，HVT可以与Rispens疫苗(Rispen's vaccine)组合。Rispens疫苗是源自温和毒性MDV1株，随后通过细胞继代进一步弱化的分离物。然而，Rispens株保留了对高易感性鸡品系的某些毒力。

已公开HVT的完整基因组序列[Afonso等人，J. Virology 75(2):971-978(2001)]，并且如同大多数α疱疹病毒，HVT具有显著数量的潜在的非必需的插入位点[参见例如，U.S. 5,187,087；U.S. 5,830,745；U.S. 5,834,305；U.S. 5,853,733；U.S. 5,928,648；U.S. 5,961,982；U.S. 6,121,043；U.S. 6,299,882 B1]。还已显示HVT服从基因修饰，并且因此已用作重组载体很多年[WO 87/04463]。因此，已报道重组HVT载体表达编码抗原的外源基因，所述抗原来自，例如，新城疫病毒(NDV) [Sondermeijer等人，Vaccine, 11:349-358 (1993)；Reddy等人，Vaccine, 14:469-477 (1996)]、传染性法氏囊病病毒(IBDV)[Darteil等人，Virology, 211:481-490 (1995)；Tsukamoto等人，J. of Virology 76(11):5637-5645 (2002)]，和传染性喉气管炎病毒(ILTV) [Johnson等人，Avian Disease,54(4):1251-1259 (2010)；WO 92/03554；U.S. 6,875,856]。MDV2的完整基因组序列也是已知的[参见GenBank登录号：AB049735.1，和Petherbridge等人，如上]。MDV2的基因组结构非常类似于HVT，并且特别地，US区域与HVT的US区域相同[参见Kingham等人，如上]。

此外，已构建了称作新型鸟类疱疹病毒(NAHV)的重组嵌合病毒，其中已将HVT基因组的特异性区域替换成MDV1基因组的相应区域。NAHV还已用于表达编码来自其他家禽病毒的抗原的外源基因[U.S. 5,965,138；U.S. 6,913,751]。

如同MDV，传染性喉气管炎病毒(ILTV)是在全世界不利地影响鸡的α疱疹病毒[Fuchs等人，Veterinary Research 38:261-279 (2007)]。ILTV在鸡中导致急性呼吸道疾病，其特征在于呼吸抑制、喘息和血性渗出物的痰。病毒复制局限于呼吸道的细胞，在此，感染在气管中导致组织糜烂和出血。

新城疫是鸡的另一种高度传染性且导致衰弱的疾病。新城疫的病原体是新城疫病毒(NDV)。NDV属于单股反链病毒目(Mononegavirales)，并且在副粘病毒科(Paramyxoviridae)。新城疫病毒具有不分段的，反义，单链RNA基因组。已根据其毒力，将NDV分类成3个不同的致病型。NDV的非致病性弱毒株感染的家禽基本是无症状的。与此直接相比，中等毒力(中等致病性)和强毒(高致病性) NDV株导致可致命的广泛疾病。大多数类型的NDV感染呼吸系统和/或神经系统，并可导致喘息和斜颈。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)，也称作甘保罗病病毒(Gumboro disease virus)，是传染性法氏囊病的病原体。IBDV导致鸡淋巴组织的急性、高度传染性的病毒感染，且其主要靶标是鸟的基本免疫器官：法氏囊。易感禽群中的发病率高，具有快速的体重损失和中等至高的死亡率。因为法氏囊(或部分的)破坏，从该疾病康复的小鸡可具有免疫缺陷。这使它们特别易受二次感染的攻击。

IBDV是双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)的成员。这个科的病毒具有由两段(A和B)的双链RNA组成的基因组。存在IBDV的两种血清型，血清型1和2，其可通过病毒中和(VN)测试而区分。血清型1病毒已显示对鸡具有致病性，而血清型2病毒仅在火鸡中导致亚急性疾病。在历史上，IBDV血清型1病毒仅由一个种类组成，其现称为“典型”IBD病毒。新近，已出现了所谓“变体”IBDV株。IBDV的典型和变体株可通过使用一组单克隆抗体的病毒中和测试，或通过RT-PCR而鉴定和区分[Wu等人，Avian Diseases, 51:515-526(2007)]。熟知的典型IBDV株包括D78、Faragher 52/70，和STC，而89/03是熟知的变体株。很多活的或灭活IBDV疫苗是商购可得的，例如活疫苗，如NOBILIS^R Gumboro D78 (MSD Animal Health)。

如上所示，因为HVT能够充当提供抵御马立克氏病的显著保护作用的抗原和充当重组载体，目前将其用作平台载体用于这种多价疫苗，例如Innovax^®-ILT (Merck AnimalHealth销售)，提供抵御ILTV的保护作用；和Innovax^®-ND-SB (Merck Animal Health销售)和Vectormune^®HVT-NDV (Ceva销售)，二者均提供抵御NDV的保护作用。然而，值得注意地，迄今为止没有包含编码来自多于一种病原体的抗原的重组HVT的多价疫苗显示为稳定且有效的，即便这样的疫苗已在大于15年前提出[参见例如，U.S. 5,965,138]。实际上，Innovax^®-ILT含有的唯一的重组HVT包含两个外源基因，即ILTV gD和ILTV gI，其已证实为安全、有效且稳定的。然而，这两个外源基因来自相同的病原体，并且此外，它们天然重叠且需要共表达以允许针对ILTV的正确免疫作用。

因此，尽管能够有效表达来自两种或更多不同病原体的稳定、多价、重组MDV_np构建体具有清楚的优点，以及用于设计它们的大量努力，但迄今为止，没有任何进展。因此，显然需要通过构建新型、稳定的重组MDV_np载体克服集体工业失败，其可作为单个活性剂用于多价疫苗中以提供抵御两种或更多不同的非-MDV1家禽病毒病原体的保护作用。

本文中引用的任何文献不应解释为承认这样的文献可用做本申请的“现有技术”。

发明内容

因此，本发明提供了新型、稳定且有效的多价重组非致病性马立克氏病病毒(rMDV_np)，其作为载体使用以表达来自不同病毒病原体的外源基因。在具体实施方式中，所述rMDV_np是重组的火鸡疱疹病毒(rHVT)。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是重组的马立克氏病病毒血清型2 (rMDV2)。rMDV_np，例如rHVT或rMDV2，可用于针对致病性家禽病毒的疫苗中。

在具体实施方式中，rMDV_np包含插入到rMDV_np基因组中的第一非必需位点的第一核酸，和插入到rMDV_np基因组中的第二非必需位点的第二核酸。所述第一核酸包含编码传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD蛋白的核苷酸序列，和编码传染性喉气管炎病毒(ILTV) gI蛋白的核苷酸序列二者。所述第二核酸包含编码新城疫病毒(NDV) F蛋白的核苷酸序列。在这个类型的具体实施方式中，所述第一核酸包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列，且所述第二核酸包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

在某些实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点是US2位点，而第二非必需位点是除US2位点之外的rMDV_np的非必需位点。在相关实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点是US2位点，且所述rMDV_np的第二非必需位点是UL7/8位点。在又其他的实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点是US2位点，且所述rMDV_np的第二非必需位点是US10位点。在仍其他的实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点是US2位点，且所述rMDV_np的第二非必需位点是UL 54.5位点。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

在其他实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点和第二非必需位点是相同的。在这个类型的具体实施方式中，所述第一核酸和第二核酸实际上构建成插入到rMDV_np的非必需位点中的相同DNA分子的一部分。这样的DNA分子可以是编码传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD蛋白、传染性喉气管炎病毒(ILTV) gI蛋白，和新城疫病毒(NDV) F蛋白的表达盒。在这个类型的具体实施方式中，所述DNA分子包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

因此，在具体实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点和第二非必需位点是US2位点。在其他实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点和第二非必需位点是UL54.5位点。在又其他的实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点和第二非必需位点是UL7/8位点。在仍其他的实施方式中，所述rMDV_np的第一非必需位点和第二非必需位点是US10位点。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白，和NDV F蛋白的核苷酸序列可以可操作地在外源启动子的控制下，即不是天然见于MDV_np中的启动子。在某些实施方式中，这三个核苷酸序列可操作地在不同启动子的控制下，即编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列可操作地在第一启动子的控制下，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列可操作地在第二启动子的控制下，且编码NDVF蛋白的核苷酸序列可操作地在第三启动子的控制下，并且所述第一启动子、第二启动子和第三启动子都是不同的。在具体实施方式中，用于编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源ILTV gD启动子。在某些实施方式中，用于编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源ILTV gI启动子。在这种类型的具体实施方式中，用于编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源ILTV gD启动子，且用于编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源ILTV gI启动子。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

在某些实施方式中，可操作地连接到编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或NDV F蛋白的核苷酸序列的至少一个启动子是人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子。在这种类型的具体实施方式中，用于编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是hCMV IE启动子。在具体实施方式中，可操作地连接到编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或NDV F蛋白的核苷酸序列的至少一个启动子是假狂犬病毒(PRV) gpX启动子。在相关实施方式中，可操作地连接到编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或NDV F蛋白的核苷酸序列的至少一个启动子是鸡β-肌动蛋白基因启动子。在具体实施方式中，用于编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是hCMV IE启动子，用于编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源ILTV gD启动子，且用于编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源ILTV gI启动子。

在某些实施方式中，包括编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白和NDV F蛋白的核苷酸序列的插入物的本发明的rMDV_np还包括一个或多个外源转录终止子序列。在这种类型的具体实施方式中，转录终止子序列是在编码NDV F蛋白的核苷酸序列的下游。在具体实施方式中，编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的核苷酸序列共享一个转录终止子序列，并且编码NDVF蛋白的核苷酸序列具有另一个转录终止子序列。在具体实施方式中，至少一个所述转录终止子序列包含合成的多腺苷酸化序列。在相关实施方式中，至少一个所述转录终止子序列包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)多腺苷酸化序列。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

本发明还提供了重组核酸，其从5'至3'方向按以下顺序包含：(i) 传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，(iv)ILTV gI蛋白的编码序列，(v) 人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子，(vi) NDV F蛋白的编码序列，和(vii) 转录终止子序列。在这种类型的具体实施方式中，所述重组核酸包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。

本发明进一步提供了rMDV_np，其中本发明的重组核酸已插入到所述rMDV_np的非必需的插入位点。在这种类型的某些实施方式中，所述rMDV_np包含在非必需位点的包含重组核酸的插入物，所述重组核酸从5'至3'方向按以下顺序包含：(i) 传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，(iv) ILTV gI蛋白的编码序列，(v) 人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子，(vi) NDV F蛋白的编码序列，和(vii) 转录终止子序列。在具体实施方式中，还可以包括插入核苷酸序列，例如接头、间隔子序列和/或外源编码序列，参见下文实施例1。在具体实施方式中，所述rHVT包含插入在非必需位点中的SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。在这些类型的具体实施方式中，所述非必需位点是US2位点。在其他这样的实施方式中，所述非必需位点是UL54.5位点。在仍其他这样的实施方式中，所述非必需位点是UL7/8位点。在又其他这样的实施方式中，所述非必需位点是US10位点。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

本发明还提供了制备本发明的rMDV_np的方法。在某些实施方式中，构建包含编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列，和编码NDV F蛋白的核苷酸序列的异源核酸。随后，将所述异源核酸插入到本发明的rMDV_np的非必需位点中。在某些实施方式中，所述异源核酸是表达盒。在这种类型的具体实施方式中，所述表达盒包含SEQ IDNO: 17的核苷酸序列。在其他实施方式中，构建包含编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列和编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的第一异源核酸；且构建包含编码NDV F蛋白的核苷酸序列的第二异源核酸。将所述第一异源核酸插入到rMDV_np的US2位点，并将所述第二异源核酸插入到rMDV_np的可选非必需位点中。在某些实施方式中，这样的异源核酸是表达盒。在这个类型的具体实施方式中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。在具体实施方式中，所述制备rMDV_np的方法是制备rHVT的方法。在可选的实施方式中，所述制备rMDV_np的方法是制备rMDV2的方法。

本发明进一步提供了包含本发明的任何rMDV_np的免疫原性组合物和/或疫苗。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。此外，本发明提供了通过施用本发明的此类疫苗和/或免疫原性组合物，而有助于抵御由ILTV和/或NDV和/或MDV1导致的疾病的家禽保护的方法。在具体实施方式中，此类方法有助于鸡的保护。在这种类型的具体实施方式中，本发明的疫苗皮下施用。在其他实施方式中，本发明的疫苗卵内(in ovo)施用。

因此，一方面，本发明提供了包含本发明的rMDV_np的稳定、安全且有效的免疫原性组合物和/或疫苗。本发明还提供了包含本发明的任何rMDV_np的免疫原性组合物和/或疫苗，其进一步组合另外的NDV、ILTV，和/或MDV抗原以改进和扩展所提供的免疫原性。此外，本发明还提供了包含本发明的任何rMDV_np的免疫原性组合物和/或疫苗，其进一步组合MDV、ILTV或NDV之外的病原体的抗原。在这种类型的具体实施方式中，所述抗原是传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原。在更具体的实施方式中，所述IBDV可以是温和的活IBDV。在某些实施方式中，所述温和的活IBDV是变体IBDV。本发明还提供了通过向家禽(例如，鸡)施用此类疫苗和/或免疫原性组合物，而有助于抵御由ILTV和/或NDV和/或MDV1和/或IBDV导致的疾病的家禽保护的方法。在这种类型的具体实施方式中，本发明的疫苗皮下施用。在其他实施方式中，本发明的疫苗卵内施用。

在某些实施方式中，本发明的免疫原性组合物和/或疫苗包含在其US2位点中包含作为插入物的重组核酸的rHVT，所述重组核酸从5'到3'包含：(i) 传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，(iv) ILTV gI蛋白的编码序列，(v) 人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子，(vi) 新城疫病毒融合蛋白(NDV F)的编码序列，和(vii) 转录终止子序列。在这种类型的具体实施方式中，所述免疫原性组合物和/或疫苗进一步包含温和的活的传染性法氏囊病病毒(IBDV)。在某些实施方式中，所述温和的活IBDV是变体IBDV。在更具体的实施方式中，所述IBDV是89/03。在这种类型的甚至更具体的实施方式中，所述重组核酸具有SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。

本发明进一步提供了包含本发明的任何rMDV_np的免疫原性组合物和/或疫苗，其组合另外的NDV、ILTV，和/或MDV抗原，和MDV、ILTV或NDV之外的病原体。

具体地，本发明提供了以下实施方案：

1. 重组的非致病性马立克氏病病毒(rMDV_np)，其包含插入到所述rMDV_np基因组中的第一非必需位点的第一核酸，和插入到所述rMDV_np基因组中的第二非必需位点的第二核酸，

其中，所述第一核酸包含编码传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD蛋白的核苷酸序列，和编码传染性喉气管炎病毒(ILTV) gI蛋白的核苷酸序列；

其中，所述第二核酸包含编码新城疫病毒融合蛋白(NDV F)的核苷酸序列；和

其中，所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是相同的，或者仅所述第一非必需位点是US2位点。

2. 项目1的rMDV_np，其中所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是US2位点。

3. 项目1的rMDV_np，其中所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是UL54.5位点。

4. 项目1的rMDV_np，其中所述第一非必需位点是US2位点，且所述第二非必需位点是UL7/8位点。

5. 项目1的rMDV_np，其中所述编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列可操作地在第一启动子的控制下，所述编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列可操作地在第二启动子的控制下，且所述编码NDV F蛋白的核苷酸序列可操作地在第三启动子的控制下。

6. 项目5的rMDV_np，其中所述第一启动子、第二启动子和第三启动子都是不同的。

7. 项目6的rMDV_np，其中所述第一启动子是内源ILTV gD启动子且所述第二启动子是内源ILTV gI启动子。

8. 项目7的rMDV_np，其中所述第三启动子是人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子。

9. 项目8的rMDV_np，其为重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。

10. 重组核酸，其从5'至3'方向按以下顺序包含：

(i) 传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD启动子；

(ii) ILTV gD蛋白的编码序列；

(iii) ILTV gI启动子；

(iv) ILTV gI蛋白的编码序列；

(v) 人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子；

(vi) 新城疫病毒融合蛋白(NDV F)的编码序列；和

(vii) 转录终止子序列。

11. 项目10的重组核酸，其包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。

12. 重组的非致病性马立克氏病病毒(rMDV_np)，其包含插入到非必需位点中的项目11的重组核酸。

13. 项目12的rMDV_np，其中所述非必需插入位点选自US2和UL54.5。

14. 项目13的rMDV_np，其为重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。

15. rMDV_np，其包含插入到非必需位点中的项目10的重组核酸。

16. 项目15的rMDV_np，其为重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。

17. 疫苗，其包含项目1的rMDV_np。

18. 项目17的疫苗，其中所述rMDV_np是重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。

19. 项目18的疫苗，其进一步包含温和的活传染性法氏囊病病毒(IBDV)。

20. 项目19的疫苗，其中所述温和的活IBDV是89/03株。

21. 疫苗，其包含项目14的rHVT。

22. 项目21的疫苗，其进一步包含温和的活IBDV。

23. 项目22的疫苗，其中所述温和的活IBDV是89/03株。

24. 有助于鸡抵御ILTV的保护作用的方法，包括使用施用项目23的疫苗。

25. 有助于鸡抵御ILTV的保护作用的方法，包括使用施用项目17的疫苗。

本发明的这些和其他方面将参照以下附图和详细说明而得到更好的理解。

附图说明

图1是HVT (FC126)基因组的示意图，由各自以直线表示的长独特(UL)区域和短独特(US)区域，和由框表示的侧翼重复区域组成。在该示意图下方，是表示BamHI限制酶切片段相对于其基因组位置的定位的条状物，以及与每个片段相关的字母命名。(最大的片段给予字母“A”，次大的给予字母“B”，以此类推等)。用于重组HVT (FC126)或rHVT/NDV/ILT病毒的每个克隆的亚基因组片段的位置(及其名称)标示在BamHI限制性图的下方。星号(*)标示插入位点的位置：UL7/UL8在1196-05.1中；UL54.5在1332-29.4中；US2在1332-47.A2或1317-15.1-1中。

图2是六个不同的重组HVT的示意图，其描述了插入到HVT骨架中的基因及其插入位点。Innovax-LT是rHVT，其包括插入到所述rHVT的UL54.5位点中的编码ILTV gD和ILTVgI基因的表达盒。Innovax-ND是rHVT，其包括插入到所述rHVT的US10位点中的编码NDV融合基因的表达盒。1348-34C是rHVT，其包括插入到所述rHVT的UL54.5位点中的编码ILTV gD和ILTV gI基因的表达盒，和插入到所述rHVT的US10位点中的编码NDV融合基因的表达盒。1332-62E是rHVT，其包括插入到所述rHVT的US2位点中的编码ILTV gD、ILTV gI和NDV融合基因的表达盒。1317-46是rHVT，其包括插入到US2位点中的编码ILTV gD和ILTV gI基因的表达盒，和插入到所述rHVT的UL7和UL8之间(即，UL7/8位点)的编码NDV融合基因的表达盒。1332-70B是rHVT，其包括插入到所述rHVT的UL54.5位点中的编码ILTV gD、ILTV gI和NDV融合基因的表达盒。

发明详述

本发明通过提供编码且表达来自ILTV和NDV的抗原并且提供抵御马立克氏病、新城疫和传染性喉气管炎病毒的保护作用的独特重组rMDV_np载体克服了现有工业的失利，从而能够构建既包含外源抗原又能够提供抵御两种或更多不同家禽病毒病原体的保护作用的rMDV_np载体。在具体实施方式中，本发明的rMDV_np编码且表达仅来自ILTV和NDV的外源抗原，并且可有助于抵御马立克氏病、新城疫和传染性喉气管炎病毒的保护作用。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

在本发明之前，已构建出包含插入到US10区域中的NDV基因的HVT载体。这种HVT-NDV载体显示是稳定的并且表达足够水平的对应的NDV基因产物，即NDV F蛋白，以保护接种的鸡抵御毒性NDV的攻击。此外，已构建包含插入到HVT UL54.5区域中的一对ILTV基因的HVT载体。这种HVT-ILTV载体显示是稳定的并且表达足够水平的对应的ILTV基因产物，即ILTV gI和gG蛋白，以保护接种的鸡抵御毒性ILTV攻击病毒。

因此，在上述成功构建体的基础上设计用于提供抵御NDV和ILTV二者的保护作用的多价HVT构建体，即将NDV-F基因插入到US10位点并将ILTV gD和gI基因插入到UL54.5位点[参见，图2中的1348-34C]。然而，预想不到地，此构建体在组织培养中继代后，所述重组病毒丧失了其表达ILTVgD、ILTVgI和NDV F蛋白的能力。使用多个重复的重组rHVT构建体证实确实如此。实际上，这些重组病毒是不稳定的且不适合用于作为疫苗的进一步开发。这些发现证实设计能够稳定表达NDV F蛋白以及ILTVgD和ILTVgI蛋白二者的单个多价rHVT载体不是可以从现有信息推导的简单过程。实际上，如果这样稳定且有效的多价rHVT载体是完全可能的，它们的设计需要下述前提，即最小限度地涉及所使用的插入位点和待插入的外源基因之间的关系的预想不到的一组复杂相互作用。迄今为止，这样的rHVT构建体的设计不是易于从现有技术预期的。

因此，本发明提供了重组的rMDV_np载体，其中已插入了来自ILTV的两个基因和来自NDV的一个基因。在本发明的具体实施方式中，所有三个基因都插入到HVT基因组的US2区域中。在使用这种rHVT接种鸡或鸡蛋后，免疫宿主的细胞表达由插入基因编码的蛋白。此外，通过rHVT表达的NDV和ILTV蛋白激发保护接种的鸡抵御由NDV和ILTV导致的疾病的免疫反应。因此，这样的rMDV_np载体能够用于提供抵御NDV和ILTV感染的保护作用。此前，必需由两个单独的rHVT载体来提供抵御这两种病毒的保护作用，即一种用于针对ILTV的保护作用且另一种用于针对NDV的保护作用。

因此，本发明具有优于现有方法的优点，因为本发明通过仅使用单一的重组MDV_np接种家禽和/或家禽蛋而提供了同时抵御ILTV和NDV的保护作用。具体地，这允许通过卵内途径施用额外的疫苗，因为可注射到卵内的体积数量有限，并且进一步节约了制造成本，因为只需要一个而不是两个载体。此外，这允许在疫苗中包含额外的抗原，例如活IBDV，如89/03株。

此外，本发明进一步包括在相同疫苗和/或免疫原性组合物中包含不同rMDV_np构建体的实施方式。在这种类型的某些实施方式中，所述疫苗和/或免疫原性组合物包含rMDV2和rHVT，其中每个编码一种或多种外源抗原。实际上，不同于最终导致一个构建体生长显著超出另一种构建体的两种rHVTs的组合，将rHVT与rMDV2组合没有导致这样显著的生长过度。因此，在具体实施方式中，本发明的疫苗包含编码ILTVgD蛋白、ILTVgI蛋白和NDV F蛋白的rHVT，和编码又另一种家禽病毒抗原的rMDV2。

为了更完整地理解本发明，提供以下定义。

为了便于描述而使用的单数术语决非用于如此限定。因此，例如，引用包含“多肽”的组合物包括引用一种或多种这样的多肽。

如本文使用的“非致病性马立克氏病病毒”或“MDV_np”或“npMDV”是显示在家禽中几乎没有或没有致病性的MDV家族中的病毒。术语“MDV_np”包括已经继代或另外的类似操作的天然发生的MDVs，但不包括其中的一种MDV血清型的基因组的特异区域被替换成不同MDV血清型的对应区域，从而形成嵌合病毒的病毒构建体，例如新型鸟类疱疹病毒(NAHV)。在某些实施方式中，所述MDV_np是HVT。在其他实施方式中，所述MDV_np是MDV2。在这种类型的具体实施方式中，所述MDV2是SB1。

如本文使用，已经遗传修饰以编码异源核苷酸序列(例如外源基因)的MDV_np定义为“重组MDV_np”或“rMDV_np”。

如本文使用，“非必需位点”是MDV_np基因组中的位点，其中在该位点中插入异源核苷酸序列不抑制MDV_np在宿主细胞中复制。非必需位点通常通过其所在的基因确定，例如，US2位点，或两个基因之间的区域，例如UL7/8位点。

如本文使用的术语“家禽”可包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉。

如本文使用的，“疫苗”是适合应用于动物(在某些实施方式中，包括人；而在其他实施方式中特异性地不用于人)的组合物，其包含通常与药学可接受的载体，例如含水液体组合的一种或多种抗原，其在施用给所述动物后诱导强度足以最小程度地有助于保护免于由野生型微生物感染导致的临床疾病的免疫反应，即强度足以有助于预防临床疾病，和/或预防、改善或治愈所述临床疾病。

如本文使用的，“多价疫苗”是包含两种或更多不同抗原的疫苗。在这种类型的具体实施方式中，所述多价疫苗激发受体的免疫系统抵御两种或更多不同的病原体。

如本文使用的术语“有助于保护”不需要免于任何感染指征的完全保护。例如，“有助于保护”可以是指保护是充足的，这样在攻击后，至少减少基本感染症状，和/或减少和/或消除导致所述症状的一种或多种的基本的细胞、生理或生化原因或机理。可理解，如本文中使用的“减少”是指相对于感染的状态，包括感染的分子状态，不仅是感染的生理状态。

如本文使用的，“佐剂”是能够有利于或扩增免疫事件的级联，最终导致更好的免疫反应(即对抗原的完整身体反应)的物质。佐剂通常不是免疫反应发生所需的，但有利于或扩增这种反应。

如本文使用的术语“药学可接受的”是作为形容词使用，是指所修饰的名词适合用于药物产品中。当使用该术语，例如描述药用疫苗中的赋形剂时，它表征了该赋形剂与组合物中的其他成分相容，并且没有不利地毒害预期的受体。

如本文使用的“系统施用”是施用到身体的循环系统(包括心血管和淋巴系统)中，因此影响全身，而不是特定的部位，例如胃肠道(通过，例如口服或直肠施用)和呼吸系统(通过例如鼻内施用)。系统施用可以通过，例如，施用到肌肉组织(肌肉内)，真皮中(皮内或透皮)，到皮肤下面(皮下)，粘膜下面(粘膜下)，静脉中(静脉内)等进行。

如本文使用术语“胃肠外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌肉内注射、皮内注射，和输注。

术语“大约”与术语“约”交换使用，并且表示数值在指示数值的25%之内，即包含“大约”100个氨基酸残基的肽可包含75和125个之间的氨基酸残基。

如本文使用的术语“多肽”与术语“蛋白”和“肽”交换使用，并且表示包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。如本文使用的术语“多肽”包括重要的片段或部分，并且涵盖至少约8个氨基酸的氨基酸残基的延伸段，通常至少约12个氨基酸，通常至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，并且，在特别优选的实施方式中，至少约30或更多个氨基酸，例如35、40、45、50个等。这样的片段可具有末端，其开始和/或终止于几乎所有的位置，例如起始于残基1、2、3等，并且终止于例如155、154、153等，所有可行的组合。

任选地，多肽可缺少由基因或由mRNA编码的某些氨基酸残基。例如，基因或mRNA分子可编码从最终蛋白切除，并因此不是最终蛋白一部分的N-末端的多肽(即，信号肽)上的氨基酸残基序列。

如本文使用的关于具体蛋白(例如，蛋白抗原)的术语“抗原性片段”是指该蛋白的具有抗原性的片段(包括从全长蛋白缺失少至单个氨基酸的大片段)，即能够特异性地与免疫系统的抗原识别分子相互作用，例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体。例如，NDV融合蛋白的抗原性片段是该融合蛋白的具有抗原性的片段。优选地，本发明的抗原性片段对于抗体和/或T细胞受体识别是免疫优势的。

如本文使用的，如果两条氨基酸序列是相同的，和/或区别仅在于如下文定义的中性或保守取代，则氨基酸序列与第二氨基酸序列是100%“同源的”。因此，如果两条氨基酸序列是约80%相同的，和/或区别仅在于中性或保守取代，则氨基酸序列与第二氨基酸序列是80%“同源的”。

常常可以用功能上等价的氨基酸残基取代序列中的残基，产生保守的氨基酸取代。这样的改变定义如本文使用的术语“保守取代”。例如，在序列中的一个或多个氨基酸残基可以由具有类似极性的另一种氨基酸取代，其作为功能等价物发挥作用，导致沉默的改变。序列内氨基酸的取代物可以选自所述氨基酸所属类型的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。包含芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这样的改变不影响通过聚丙酰胺凝胶电泳测定的表观分子量，或等电点。

特别优选的保守取代是：用Lys取代Arg或反之，从而可维持正电荷；用Glu取代Asp或反之，从而可维持负电荷；用Ser取代Thr，从而可维持游离-OH；和用Gln取代Asn，从而可维持游离NH₂。氨基酸还可以归入以下类似性组中：(1) 脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；(2) 谷酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；(3)组氨酸、赖氨酸和精氨酸；(4) 半胱氨酸；(5) 缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸；和(6) 苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。

在相关实施方式中，可通过其本身的同源性鉴定两个高度同源的DNA序列，或它们编码的氨基酸的同源性。可使用在序列数据库中可得的标准软件进行这样的序列比较。在具体实施方式中，两条高度同源的DNA序列编码具有约80%同一性的氨基酸序列，更优选约90%同一性，且甚至更优选约95%同一性。更具体地，两条高度同源的氨基酸序列具有约80%同一性，甚至更优选约90%同一性，且甚至更优选约95%同一性。

如本文使用的，可使用软件，例如商购可得自Accelrys (Burlington,Massachusetts)的MacVector v9，和Clustal W算法和比对默认参数，以及用于同一性的默认参数，测定蛋白和DNA序列同一性百分比。参见例如，Thompson等人，1994. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680。可从，例如EMBLI，欧洲生物信息研究所，自由下载用于Dos、Macintosh和Unix平台的ClustalW。本下载链接可见于http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。这些和其他可用程序也可用于使用相同或类似的默认参数测定序列类似性。

如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”交换使用，并且表示包含核苷酸的分子，包括但不限于，RNA、cDNA、基因组DNA和甚至合成DNA序列。预期该术语还涵盖包括任何本领域已知的DNA和RNA的碱基类似物的核酸分子。

核酸“编码序列”或具体蛋白或肽的“编码序列”是在置于适当的调控元件控制下时，在体外或体内转录并翻译成多肽的核苷酸序列。

通过在5'-末端的起始密码子和在3'-末端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。编码序列可包括但不限于，原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如鸟类) DNA的基因组DNA序列，和甚至合成DNA序列。转录终止序列可定位于编码序列的3'。

“可操作地连接”是指元件的排列，其中所述组分经配置以发挥其正常功能。因此，可操作地连接到编码序列的控制元件能够影响所述编码序列的表达。所述控制元件不需要与编码序列连续，只要它们发挥指导其表达的功能。因此，例如，在启动子和编码序列之间可存在插入的非翻译但转录的序列，并且所述启动子仍能够被视为与所述编码序列“可操作地连接”。

如本文使用的术语“转录终止子序列”与“多腺苷酸化调控元件”交换使用，并且通常是在DNA编码区域下游，并且是该DNA编码序列的转录的完全终止所需的序列。

如本文使用的“表达盒”是最低限度地包含启动子和与该启动子可操作地连接的异源编码序列的重组核酸。在很多这样的实施方式中，所述表达盒进一步包含转录终止子序列。因此，将表达盒插入到rMDV_np基因组的非必需位点将导致由所述rMDV_np表达所述异源编码序列。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

如本文使用的“异源核苷酸序列”是通过重组方法添加到本发明的核苷酸序列，以形成在自然界中没有天然形成的核酸的核苷酸序列。在具体实施方式中，本发明的“异源核苷酸序列”可以编码蛋白抗原，例如NDV F蛋白、ILTV gI蛋白或ILTV gD蛋白。异源核苷酸序列还可以编码融合(例如，嵌合)蛋白。此外，异源核苷酸序列可编码包含调控和/或结构性质的肽和/或蛋白。在其他此类的实施方式中，异源核苷酸序列可编码蛋白或肽，其作为在表达所述重组核酸后检测由本发明的核苷酸序列编码的蛋白或多肽的工具而发挥作用。在仍另一个实施方式中，所述异源核苷酸序列可作为检测本发明的核苷酸序列的工具发挥作用。异源核苷酸序列可包含非编码序列，包括限制性位点、调控位点、启动子等。

当核酸和载体二者的末端包含相容的限制性位点时，易于完成编码本发明抗原的核酸向rMDV_np载体中的插入。如果这不能完成，则有必要修饰核苷酸序列和/或载体的末端，通过向后降解由限制性内切酶切割产生的单链核酸悬端(例如，DNA悬端)以产生平末端，或通过使用适合的聚合酶填充单链末端达到相同的结果。可选地，可通过例如将核苷酸序列(接头)连接到末端上而产生期望的位点。这样的接头可包含限定期望的限制性位点的特异性寡核苷酸序列。还可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)产生限制性位点。[参见例如，Saiki等人，Science 239:487-491 (1988)]。如果需要，还可以通过同聚物加尾修饰切割的载体和DNA片段。

蛋白抗原和编码蛋白抗原的核酸

ILTV gD基因看起来编码长度为434个氨基酸，具有48,477道尔顿的分子量的糖蛋白，尽管也已提出导致仅包含377个氨基酸残基的ILTV gD蛋白的下游起始密码子才是真正的起始密码子[Wild等人，Virus Genes 12:104-116 (1996)]。ILTV gI基因编码长度为362个氨基酸，具有39,753道尔顿的分子量的糖蛋白[U.S. 6,875,856，通过引用并入本文]。可由编码ILTV gD和ILTV gI的天然和/或实验室衍生变体的核酸取代本发明示例的那些。

在本发明的具体实施方式中，rMDV_np包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQID NO: 2的氨基酸序列的ILTV gD蛋白，或其抗原性片段。在相关的实施方式中，所述rMDV_np包含编码ILTV gD蛋白的重组核酸，所述ILTV gD蛋白包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有大于90%，和/或大于95%，和/或大于98%，和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方式中，所述ILTV gD蛋白由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

在本发明的某些实施方式中，rMDV_np包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQID NO: 4的氨基酸序列的ILTV gI蛋白，或其抗原性片段。在相关的实施方式中，所述rMDV_np包含编码ILTV gI蛋白的重组核酸，所述ILTV gI蛋白包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有大于90%，和/或大于95%，和/或大于98%，和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方式中，所述ILTV gI蛋白由SEQ ID NO: 3的核苷酸序列编码。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

NDV F蛋白基因编码所谓“融合”蛋白。本发明示例的一个NDV F蛋白基因源自NDV克隆30，这是一种常见的弱毒NDV疫苗株。可同等地应用编码F蛋白基因的天然和/或实验室衍生的变体的核酸，其来自弱毒，中等毒力或强毒NDV，因为F蛋白基因序列本身在这些不同NDV致病型中是高度保守的。在本发明的具体实施方式中，rMDV_np包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的NDV融合蛋白，或其抗原性片段。在相关的实施方式中，所述rMDV_np包含编码NDF F蛋白的重组核酸，所述NDF F蛋白包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有大于90%，和/或大于95%，和/或大于98%，和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方式中，所述NDV融合蛋白由SEQ ID NO: 5的核苷酸序列编码。在本发明的某些实施方式中，rMDV_np包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的NDV融合蛋白，或其抗原性片段。在相关的实施方式中，所述rMDV_np包含编码NDF F蛋白的重组核酸，所述NDF F蛋白包含与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有大于90%，和/或大于95%，和/或大于98%，和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方式中，所述NDV融合蛋白由SEQ ID NO: 7的核苷酸序列编码。在具体实施方式中，所述rMDV_np是rHVT。在可选的实施方式中，所述rMDV_np是rMDV2。

启动子和多腺苷酸化调控元件

很多可选的启动子可用于驱动本发明的rMDV_np中的编码蛋白抗原或其抗原性片段的异源基因的表达。实例包括假狂犬病毒(PRV) gpX启动子[参见，WO 87/04463]、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子、ILTV gD启动子、ILTV gI启动子[参见例如，U.S. 6,183,753 B1]、人巨细胞病毒即刻早期1 (hCMV IE1)基因启动子[U.S. 5,830,745；U.S. 5,980,906]，和鸡β-肌动蛋白基因启动子[EP 1 298 139 B1]。如本文示例的更具体的实例包括：包含SEQ ID NO: 12的核苷酸序列的Towne株hCMV IE启动子、包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的截短的hCMV IE启动子，包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列的ILTV gD启动子，和包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的ILTV gI启动子。

时常需要在DNA编码区域下游包含多腺苷酸化调控元件，以终止所述编码DNA序列的转录。因此，很多基因在其编码序列的下游末端包含多腺苷酸化调控元件。已鉴定很多这样的调控元件，并且可用于本发明的rMDV_np中。如本发明示例的多腺苷酸化调控元件的具体实例包括：包含SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的合成的多腺苷酸化信号，和包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列的HSV胸苷激酶多腺苷酸化信号。

疫苗和免疫原性组合物

本发明涉及重组MDV_np，用于构建MDV_np的核酸分子，或用于培养它们的宿主细胞，或其任意组合的用途，根据本发明所有均用于制造用于家禽的疫苗。因此，本发明提供了包含本发明的多价重组MDV_np的疫苗和/或免疫原性组合物。这样的疫苗可用于辅助预防和/或防止新城疫，和/或马立克氏病，和/或与ILTV感染相关的疾病。根据本发明的疫苗可用于预防和/或治疗性处理，并且因此可干扰感染的建立和/或进展和/或其临床疾病症状。

本发明的重组MDV_np可通过本领域中目前实施的任何多种方式培养。例如，本发明的重组MDV_np可通过使用原代鸡细胞的体外培养物培养，参见，例如下文中使用鸡胚成纤维细胞(CEFs)的实施例。CEFs可通过鸡胚的胰蛋白酶处理而制备。CEFs还可以平铺在单层中，并且随后由MDV_np感染。这种具体方法可容易地放大至工业级别生产。

因此，本发明的进一步方面涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，包括以下步骤：使用本发明的重组MDV_np感染宿主细胞，收获感染的宿主细胞，和随后将收获的感染宿主细胞与药学可接受的载体混合。用于感染、培养和收获的适合的方法是本领域中熟知的，并且描述并示例在本文中。

通常，感染的宿主细胞在仍完整时收获，以获得其细胞结合形式的重组MDV_np。可将这些细胞放入适合的载体组合物中以提供用于贮存和冷冻的稳定化。感染的细胞可填充到玻璃安瓿中，将其密封、冷冻并贮存在液氮中。因此，在本发明的某些实施方式中，本发明的疫苗和/或免疫原性组合物是冷冻贮存的，并且，因此包含冷冻保护剂，例如二甲亚砜(DMSO)，以保存冷冻的感染细胞。

可选地，当重组MDV_np是重组HVT时，可将它从其宿主细胞分离，例如通过在培养结束时的超声处理，并且随后放入稳定剂中，并且冷冻干燥(冻干)用于稳定贮存或另外的减少液体体积用于贮存，并且随后在施用前或施用时在液体稀释剂中复原。这样的复原可以使用，例如疫苗级水实现。在某些实施方式中，多价疫苗的冻干部分可包含一种或多种抗原，且稀释剂可包含一种或多种其他抗原。

在具体实施方式中，本发明的疫苗(或其部分)可以是冷冻干燥的形式，例如，作为片剂和/或球体，其通过WO 2010/125084中所述的方法生产，该文献通过引用整体并入本文。具体地，参考WO 2010/125084，从第15页第28行至第27页第9行的实施例，其描述了生产这样的快速崩解片剂/球体的方法。这样的冷冻干燥形式可容易地溶解在稀释剂中，从而使疫苗能够系统施用。

疫苗和免疫原性组合物可包括，但不必需包括生理相容的缓冲剂和盐水等，以及药学可接受的佐剂。佐剂可用于改进免疫反应和/或提高疫苗制品的稳定性。佐剂通常被描述为免疫系统的非特异性刺激剂，但也可用于靶向免疫系统的特异性部分(specificarm)。可向疫苗中添加具有这种活性的一种或多种化合物。因此，本发明的具体疫苗可进一步包含佐剂。可用作佐剂的化学化合物的实例包括，但不限于铝化合物(例如氢氧化铝)，可代谢和不可代谢的油，矿物油，包括矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯衍生物(例如，来自法国Seppic SA的MONTANIDE ISA 70)，和轻矿物油，例如DRAKEOL 6VR，嵌段聚合物，ISCOM's (免疫刺激复合物)，维生素和矿物质(包括但不限于：维生素E，维生素A，硒和维生素B12)和CARBOPOL®。

其他适合的佐剂，其时常称作免疫刺激物，包括但不限于：细胞因子、生长因子、趋化因子、来自淋巴细胞的细胞培养物的上清、单核细胞、来自淋巴器官的细胞、来自植物、细菌或寄生虫的细胞制品和/或提取物(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脂多糖制品)或有丝分裂原。通常，佐剂与本发明的抗原同时施用。然而，也可以或可选地在疫苗接种前2周的时期内和/或在疫苗接种后的一段时间施用佐剂，即，只要抗原，例如本发明的重组MDV_np存留在组织中。

本发明的疫苗和/或免疫原性组合物可通过任何途径施用，例如卵内，通过胃肠外施用，包括肌内注射、皮下注射、静脉注射、皮内注射，通过划痕法(scarification)，通过口服施用，或者通过它们的任意组合。此外，本发明的多价重组MDV_np可用于和/或与额外的NDV、ILTV和/或MDV抗原组合用于改进和扩展所提供的免疫原性，和/或与其他病原体的抗原组合以提供抵御这样的其他病原体的免疫保护。这些额外的抗原可以是活的或灭活的完整微生物、其他重组载体、细胞匀浆、提取物、蛋白，或任何其他这样的衍生物，只要它们没有不利地干扰本发明的疫苗的安全性、稳定性和功效。

在流行MDV、NDV或ILTV的毒性非常高的野生株，例如在特定地理区域中流行的情况下，本发明的多价重组MDV_np与额外的MDV、NDV和/或ILTV抗原的组合可以是有利的。在此方面，本发明的多价重组MDV_np与MDV1、MDV2或HVT的组合包括Rispens (MDV1)株、SB1(MDV2)株、FC-126 (HVT)株和/或PB1 (HVT)株。为了改进针对NDV的反应，可将多价重组MDV_np与NDV疫苗株组合，例如温和的活NDV疫苗株C2。

可作为抗原与本发明的多价重组MDV_np一起使用的其他微生物的实例包括：(i) 病毒，例如传染性支气管炎病毒、腺病毒、减蛋综合征病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡贫血病毒，鸟类脑-脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、禽白血病病毒、禽肺炎病毒，和呼肠孤病毒，(ii) 细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属种(Salmonella spec.)、鼻气管炎鸟疫杆菌(Ornitobacterium rhinotracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilis paragallinarum)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒杆菌属种(Erysipelas spec.)、支原体属种(Mycoplasma spec.)和梭菌属种(Clostridium spec.)，(iii) 寄生虫，例如艾美虫属种(Eimeria spec.)，和(iv) 真菌，如曲霉属种(Aspergillus spec.)。在本发明的具体实施方式中，本发明的重组MDV_np抗原与温和的活IBDV疫苗株，例如D78 (克隆的中等毒性株)、PBG98、Cu-1、ST-12 (中等毒性株)，或89-03(活的Delaware变体株)，组合在多价疫苗中。很多这些毒株用在商业疫苗中。

组合疫苗可以通过多种途径制备，包括将本发明的重组MDV_np与病毒，或细菌，或真菌，或寄生虫，或宿主细胞，或任何和/或所有这些的混合物的制品组合。在具体实施方式中，用于这样的组合疫苗的组分通常分离地生产，并且随后组合并填充到相同的疫苗容器中。

如上所述，本发明的疫苗可有利地通过在非常幼龄或卵内的单次接种，在家禽中提供针对多种疾病的安全且有效的免疫保护。可选地，如将对家禽疫苗领域任何技术人员显而易见地，上述组合也可包括疫苗接种方案，其中本发明的多价重组MDV_np与其他抗原不同时应用；例如，重组MDV_np可在卵内应用，且NDV C2和/或IBDV株(例如，89/03)可在后续的时间/日期应用。

因此，本发明的疫苗可在单个剂量或多个剂量中施用至鸟类对象。例如，本发明的疫苗可在孵化日应用和/或在第16-18 (胚胎日) ED在卵内应用。当施用多个剂量时，它们可以同时或顺次地，在方式和时间上与疫苗制剂相容的，并且以将在免疫上有效的量给予。因此，本发明的疫苗可有效地用作初次疫苗接种，其之后可继之以相同疫苗或使用不同的疫苗制品(例如，典型的灭活的、含佐剂的全病毒疫苗)的强化疫苗接种，并由其放大。

本发明的疫苗的每剂体积可以根据预期的应用途径而优化：卵内接种通常应用0.05和0.5 ml/卵之间的体积，且胃肠外注射通产使用0.1和1 ml/鸟的体积完成。在任何情况下，疫苗剂量体积的优化都完全在本领域技术人员的能力之内。

序列表

<u>SEQ ID NO:</u>	<u>描述</u>	<u>类型</u>
			1	ILTV gD糖蛋白	核酸
2	ILTV gD糖蛋白	氨基酸
			3	ILTV gI糖蛋白	核酸
4	ILTV gI糖蛋白	氨基酸
			5	NDV F蛋白(克隆30)	核酸
6	NDV F蛋白(克隆30)	氨基酸
			7	NDV F蛋白(B1 Hitchner)	核酸
8	NDV F蛋白(B1 Hitchner)	氨基酸
			9	ILTV gD启动子	核酸
10	ILTV gI启动子	核酸
			11	hCMV IE启动子(截短的)	核酸
12	hCMV IE启动子(Towne株)	核酸
			13	合成的多腺苷酸化信号	核酸
14	HSV TK多腺苷酸化信号	核酸
			15	IE-NDV F插入物	核酸
16	ILTV插入物	核酸
			17	ILTV /IE-NDV F插入物	核酸

通过参考以下非限定性实施例，可更好地理解本发明，提供所述非限定性实施例作为本发明的示例。介绍以下实施例以更充分地说明本发明的实施方式，且决不应解释为对本发明广泛范围的限制。

具体实施方式

实施例1

重组HVT/NDV/ILTV病毒载体的构建

首先对假狂犬病病毒证实了通过克隆的重叠亚基因组片段的共转染产生疱疹病毒的能力[van Zijl等人，J.Virology 62:2191-2195 (1988)]。随后，采用这种方法构建重组HVT载体[参见U.S. 5,853,733，关于重组HVT载体的构建所公开的方法通过引用并入本文]，并且用于构建本发明的重组HVT/NDV/ILTV载体。在此方法中，将完整的HVT基因组，作为利用标准重组DNA技术构建的多个大的重叠亚基因组片段克隆到细菌载体中[Maniatis等人，(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York (1982)；和Sambrook等人，Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]。HVT株FC126粘粒文库来源于克隆到粘粒载体pWE15 (Stratagene，现Agilent Technologies of SantaClara, CA)中的剪切的病毒DNA。此外，通过使用酶BamHI进行限制性酶切并克隆到pWE15或质粒载体pSP64 (Promega, Madison WI)中，分离多个大的基因组DNA片段。如U.S. 5,853,733中所述，将这些片段共转染到鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞导致通过跨越所述片段的重叠区域的同源重组介导的HVT基因组的重建。如果在共转染前将插入物直接工程化到一个或多个亚基因组片段中，此方法导致高频率的包含所述插入物的病毒。需要5个重叠亚基因组克隆以产生FC126 HVT，并且充当产生所有HVT/NDV/ILTV重组病毒的基础。

HVT/NDV/ILTV 1332-62.E1的构建 ：用于HVT/NDV/ILTV 1332-62.E1的粘粒重建基本按照U.S. 5,853,733 [例如U.S. 5,853,733的图8；至少部分重新绘制在本文的图1中]中所述进行。为了允许整合到FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6，以及与这两个重叠并且在US2基因座中包含ILTV/NDV表达盒的一个穿梭质粒(1332-47.A2)提供由U.S. 5,853,733中粘粒nr. 378-50所包含的区域。

使用标准的CaCl₂转染方案，将一组7个线性化构建体：3个粘粒和4个质粒都一起转染到CEF中，并将所得病毒原液进行空斑纯化一次。

HVT/NDV/ILTV 1332-70.B1的构建 ：用于HVT/NDV/ILTV 1332-70.B1的粘粒重建基本按照U.S. 5,853,733 [例如U.S. 5,853,733的图8；至少部分重新绘制在本文的图1中]中所述进行。为了允许整合到FC126 HVT基因组的UL54.5区域中，现在从三个较小的质粒：672-01.A40和672-07.C40，以及与这两个重叠并且在UL54.5基因座中包含ILTV/NDV表达盒的一个穿梭质粒(1332-29.4)提供由U.S. 5,853,733中粘粒nr. 407-32.1C1所包含的区域。

使用标准的CaCl₂转染方案，将一组7个线性化构建体：4个粘粒和3个质粒都一起转染到CEF中，并将所得病毒原液进行空斑纯化一次。

HVT/NDV/ILTV 1317-46.A1-1的构建 ：用于HVT/NDV/ILTV 1317-46.A1-1的粘粒重建基本按照U.S. 5,853,733 [例如U.S. 5,853,733的图8；至少部分重新绘制在本文的图1中]中所述进行。为了允许整合到FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6，以及与这两个重叠并且在US2基因座中包含ILTV表达盒的一个穿梭质粒(1317-15.1-1)提供由U.S. 5,853,733中粘粒nr. 378-50所包含的区域。在FC126 HVT基因组内第二位点的插入，通过将U.S. 5,853,733中的UL区域粘粒nr. 407-32.2C3替换成包含插入在HVT UL7和UL8基因之间的NDV表达盒的穿梭质粒(1196-05.1)而完成。

使用标准的CaCl₂转染方案，将一组7个构建体：1个未切割的粘粒(1196-05.1)，其他2个线性化的粘粒和4个线性化的质粒都一起转染到CEF中，并将所得病毒原液进行空斑纯化一次。

用于产生FC126 HVT的亚基因片段的描述 ：

亚基因组克隆407-32.2C3：粘粒407-32.2C3包含基因组HVT DNA的大约40,170个碱基对的区域[左侧末端 - 39,754位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。这个区域包括HVT BamHI片段F’、L、P、N1、E、D和片段B的2,092个碱基对。

亚基因组克隆172-07.BA2：质粒172-07.BA2包含基因组HVT DNA的25,931个碱基对的区域。它通过将HVT BamHI B片段[37,663至63,593位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]克隆到质粒pSP64 (Promega, Madison WI)中而构建。

亚基因组克隆407-32.5G6：粘粒407-32.5G6包含基因组HVT DNA的39,404个碱基对的区域[61,852-101,255位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。这个区域包括HVT BamHI片段H、C、Q、K1、M、K2，以及片段B的1,742个碱基对和片段J的3,880个碱基对。

亚基因组克隆407-32.1C1：粘粒407-32.1C1包含基因组HVT DNA的37,444个碱基对的区域[96,095-133,538位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。这个区域包括HVT BamHI片段J、G、I、F、O，以及片段K2的1,281个碱基对和片段A的6,691个碱基对。

亚基因组克隆378-50：粘粒378-50包含基因组HVT DNA的28,897个碱基对的区域[例如U.S. 5,853,733的图8；至少部分重新绘制在本文的图1中]。它通过将HVT BamHI A片段[126848-155744位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]克隆到粘粒pWE15中而构建。

用于产生HVT/NDV/ILTV 1332-62.E1的其他插入片段 ：

亚基因组克隆1332-47.A2：插入质粒1332-47.A2包含克隆到质粒pSP64(Promega, Madison WI)中的，HVT短独特区域的7311个碱基对的EcoRI片段[136880-144190位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。插入到HVT US2基因内的独特StuI位点[140540/140541位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间]的是2个元件：来自ILTV，NVSL攻击毒株，Lot # 83-2的3563个碱基对的SalI – HindIII片段[10532-14094位；Wild等人，VirusGenes 12:104-16 (1996)；Acc.# U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，和来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)；和由HCMV IE启动子、NDV，克隆30株，融合基因(F)，随后的合成多-腺苷酸化信号组成的表达盒。ILTV gD、ILTV gI和NDV F基因以相对于HVT US2基因相反的方向转录。

亚基因组克隆pSY640：质粒pSY640包含源自BamHI片段A的，基因组HVT DNA的大约13,600个碱基对的区域[126848-140540位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866]。为了产生这个质粒，将位于US2基因上游的DNA区域，起始于定位于US2基因内的StuI位点并连续到BamHI A片段末端，克隆到质粒pSP64 (Promega, Madison WI)中。

亚基因组克隆556-60.6：质粒556-60.6包含源自BamHI片段A的，基因组HVT DNA的大约12,500个碱基对的区域[约143300位至155744位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。为了产生这个质粒，将定位于US2基因下游的DNA区域，起始于定位在US2基因内的StuI位点并连续到BamHI A片段末端，克隆到质粒pSP64 (Promega, Madison WI)中，并且随后使用核酸外切酶从StuI位点“向后降解”~150 bp，并重新克隆到pBR322质粒载体中。

用于产生HVT/NDV/ILTV 1332-70.B1的其他插入片段 ：

亚基因组克隆1332-29.4：质粒1332-29.4包含克隆到质粒pNEB193的衍生物(缺失AatII-PvuII)中的，源自长独特区域的基因组HVT DNA的8,636个碱基对的区域[109489-118124位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866]。它的侧翼是AscI位点，并且包括HVTBamHI片段I、S，和片段G的1337个碱基对，和片段F的1177个碱基对。插入到HVT UL54.5开放读码框内的XhoI位点[111240/111241位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866，在氨基酸21和22之间]的是2个元件：来自ILTV，NVSL攻击毒株，Lot # 83-2的3563个碱基对的SalI-HindIII片段[10532-14094位；Wild等人，VirusGenes 12:104-116 (1996)；Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，和来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)；和由HCMV IE启动子、NDV，克隆30株，融合基因(F)，随后的合成多-腺苷酸化信号组成的表达盒。ILTV gD、ILTV gI和NDV F基因以相对于HVT UL54.5基因相反的方向转录。

亚基因组克隆672-01.A40：质粒672-01.A40包含克隆到质粒pNEB193的衍生物中的，源自长独特区域的基因组HVT DNA的14,731个碱基对的区域[96095-110825位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866]。这个区域包括HVT BamHI片段G、J，和K2的1281个碱基对。

亚基因组克隆672-07.C40：质粒672-07.C40包含克隆到质粒pNEB193的衍生物中的，源自长独特区域的基因组HVT DNA的12,520个碱基对的区域[116948-129467位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866]。这个区域包括HVT BamHI片段F、O，和A的2620个碱基对。

用于产生HVT/NDV/ILTV 1317-46.A1-1的其他插入片段：

亚基因组克隆1196-05.1：粘粒1196-05.1包含克隆到粘粒pWE15中的基因组HVTDNA的大约40,170个碱基对的区域[左侧末端 - 39,754位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。这个区域包括HVT BamHI片段F’、L、P、N1、E、D，和片段B的2,092个碱基对。此外，将编码NDV 融合(F)基因，包括HCMV IE启动子和HSV TK多腺苷酸化调控元件的表达盒插入到BamHI片段E内HVT UL7和UL8基因之间的非编码区域[20030-20035位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]中。NDV F以与HVT UL7相同的方向转录。

亚基因组克隆1317-15.1-1：质粒1317-15.1-1包含克隆到质粒pSP64 (Promega,Madison WI)中的，HVT短独特区域的7311个碱基对的EcoRI片段[136880-144190位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。此外，将编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，和来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)的来自ILTV，NVSL攻击毒株，Lot # 83-2的3563个碱基对的SalI – HindIII片段[10532-14094位；Wild等人，VirusGenes 12:104-116 (1996)；Acc.# U28832]克隆到HVT US2基因内独特的StuI位点[140540/140541位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866，在氨基酸124和125之间]中。ILTV gD和gI基因以相对于HVT US2基因相反的方向转录。

亚基因组克隆pSY640：质粒pSY640包含源自BamHI片段A的基因组HVT DNA的大约13,600个碱基对的区域[126848-140540位；Afonso等人，2001，如上，Acc. #AF291866]。为了产生这个质粒，将位于US2基因上游的DNA区域，起始于定位于US2基因内的StuI位点并连续到BamHI A片段末端，克隆到质粒pSP64 (Promega, Madison WI)中。

亚基因组克隆556-60.6：质粒556-60.6包含源自BamHI片段A的基因组HVT DNA的大约12,500个碱基对的区域[约143300位至155744位；Afonso等人，2001，如上；Acc. #AF291866]。为了产生这个质粒，将定位于US2基因下游的DNA区域，起始于定位在US2基因内的StuI位点并连续到BamHI A片段末端，克隆到质粒pSP64 (Promega, Madison WI)中，并且随后使用核酸外切酶从StuI位点“向后降解”~150 bp，并重新克隆到pBR322质粒载体中。

标准CaCl ₂ 转染方案 ：将继代的CEF接种在6孔培养平板上，并在38℃和5% CO₂下温育24小时，并形成汇合单层。对于每个孔，将总量0.25 µg的粘粒和质粒DNA在Hepes缓冲液中混合，并滴加125 mM CaCl₂直到即将出现沉淀。将此混合物添加到CEF细胞单层，并温育2-3小时。除去上清，并添加15%甘油的覆盖物，并将细胞静置1分钟。随后将其除去，用PBS清洗，并添加新鲜的培养基，并且将细胞温育5天。随后，通过胰蛋白酶处理收集细胞，并将来自单个平板的细胞各自接种到10 cm平板中的CEF细胞的新鲜单层上，并温育直至达到50-90% CPE。随后，通过胰蛋白酶处理收获扩增的转染细胞，并将10^-2至10^-4的稀释物平铺到带有CEF单层的10 cm平板上，并温育。次日，将平板用琼脂覆盖，并分离多个HVT/NDV/ILTV的单个空斑，并在CEF上扩增。

实施例2

重组HVT/ND/ILTV疫苗保护日龄小鸡抵御传染性喉气管炎病毒攻击

评估了两种疫苗，一种包含HVT/NDV/ILTV-1332-62E1且另一种包含1332-70B1，用于保护鸡免于传染性喉气管炎病毒攻击的功效。HVT/NDV/ILTV-1332-62E1是rHVT，其中FC126 HVT骨架包含插入到US2位点的 SEQ ID NO: 17的核酸序列(参见，上文实施例1)。HVT/NDV/ILTV-1332-70B1是rHVT，其中FC126 HVT骨架包含插入到UL54.5位点的SEQ IDNO: 17的核酸序列(参见，上文实施例1)。

对于两种病毒原液，从经过鸡胚成纤维细胞组织培养细胞继代至少8次的原液制备疫苗制品，并且对1332-62E1，制备并测试11次组织培养继代的额外制品。

通过皮下途径将疫苗施用于新孵化的，无特异抗原(SPF)的小鸡。随后，通过气管内途径，使用毒性ILTV攻击病毒对4周龄的鸟进行攻击，并对疾病的临床症状观察10天。将这些小鸡中的疾病发生率与接受商业重组HVT/ILTV疫苗(Innovax^®-ILT，来自MerckAnimal Health)或没有接受疫苗的对照进行比较。联邦行政法典(9CFR)要求对于待生效的测试，至少80%的未接种的对照鸟必须显示临床症状，并且至少90%的接种的鸟必须保持没有临床症状，以视为提供符合要求的保护作用。这个研究的结果提供在下表1中。两种双重组疫苗都提供了抵御毒性ILTV攻击的符合要求的保护作用。

实施例3

重组HVT/ND/ILTV疫苗保护日龄小鸡抵御新城疫病毒攻击

使用重组疫苗HVT/NDV/ILTV-1332-62E1，组织培养继代水平11，或商业重组HVT/NDV疫苗(Innovax^®-ND，Merck Animal Health销售)对日龄的无特异性抗原(SPF)小鸡或19日龄胚胎进行疫苗接种，并且随后，在4周龄时使用毒性新城疫(ND)攻击病毒，Texas-GB株，通过肌肉内途径攻击。在14天的观察期中，对鸟的新城疫临床症状计分，随后将每组小鸡的疾病发生率与没有接种的对照进行比较。联邦行政法典(9CFR)要求对于待生效的测试，至少80%的未接种的对照鸟必须显示临床症状，并且至少90%的接种的鸟必须保持没有临床症状，以视为疫苗提供符合要求的保护作用。这个研究的结果表明，重组HVT/NDV/ILTV 1332-62E1疫苗通过两种使用途径都提供了符合要求的ND保护作用。

实施例4

重组HVT/ND/ILTV疫苗保护日龄小鸡抵御传染性喉气管炎病毒攻击和新城疫病毒攻击

评估疫苗HVT/NDV/ILT-1317-46.1-1，在保护小鸡免于传染性喉气管炎病毒攻击或新城疫病毒攻击中的功效。HVT/NDV/ILTV-1317-46.1-1是rHVT，其中FC126 HVT骨架包含插入到US2位点中的SEQ ID NO: 16的核酸序列，和插入到UL7/8位点(即，在HVT的UL7和UL8基因之间)中的SEQ ID NO: 15的核酸序列(参见上文实施例1)。从通过鸡胚成纤维细胞组织培养细胞继代15次的原液制备疫苗制品。

通过皮下途径将疫苗施用于新孵化的，无特异抗原的小鸡。随后，在4周龄时，通过气管内途径使用毒性传染性喉气管炎(ILT)攻击病毒攻击鸟，并对疾病的临床症状观察10天，或通过肌肉内途径使用毒性新城疫病毒攻击，并观察14天。将这些小鸡中的疾病发生率与接受商业重组HVT/ILTV疫苗、HVT/ND疫苗或没有接受疫苗的对照进行比较。联邦行政法典(9CFR)要求对于待生效的测试，至少80%的未接种疫苗的对照鸟必须显示临床症状，并且至少90%的接种疫苗的鸟必须保持没有临床症状，以视为提供符合要求的保护作用。这个研究的结果提供在下表3中。HVT/NDV/ILT疫苗提供了符合要求的抵御NDV攻击的保护作用。尽管在这个初步研究中，由这种构建体提供的抵御毒性ILTV攻击的保护作用只差一点达不到联邦要求，但确实提供了实质的保护作用。

实施例5

在抵御传染性法氏囊病病毒的疫苗中重组HVT/ND/ILTV与89/03法氏囊病的组合

使用HVT/NDV/ILTV-1332-62E1接种1日龄小鸡(SPF Leghorn)组，在使用同时与IBDV 89/03疫苗组合。仅使用3.5 log₁₀ TCID₅₀/剂的IBDV疫苗接种单独的一组小鸡。在4周龄时使用变体E IBDV攻击株攻击小鸡。在攻击后10天，使鸟安乐死，并检查体重/法氏囊重量和与法氏囊病相符的总体损伤。依照适用的9CFR 113.331规定，分析结果的可接受性。

IBDV 89/03是用于家禽工业的许可产品，用于保护禽群抵御传染性法氏囊病病毒的典型和变体株。IBDV 89/03疫苗的目标剂量是3.5 log₁₀ TCID₅₀/0.2 mL剂。HVT/NDV/ILT的的目标剂量是3000 PFU/0.2 mL剂。为了在最终疫苗稀释体积中达到目标剂量，HVT/NDV/ILTV-1332-62E1疫苗经稀释在0.2 mL中包含6000 PFU，这是目标剂量的两倍。89/03疫苗经稀释以包含3.8 log₁₀ TCID₅₀，这是目标剂量的两倍。对于组1，通过将等体积的HVT/NDV/ILTV-1332-62E1疫苗和89/03疫苗组合，制备组合疫苗。对于仅接受89/03疫苗的组2，添加等体积的稀释剂。每个处理组中的1日龄鸡通过皮下(SC)途径接受0.2 mL的各自的疫苗或安慰剂(参见表4)。

在孵化时，由一组使用EXCEL的随机程序分配的随机化标签号标记每个疫苗处理组中的小鸡。此外，使用EXCEL的随机程序，随机确定在攻击后7天从每个畜栏取出用于法氏囊组织学检查的鸟。

在4周龄，使用IBDV变体E攻击病毒攻击小鸡。每只小鸡通过滴眼剂途径接受0.06mL，包含大约10^2.2 EID₅₀/剂。攻击后7天，从每组取出6-9只鸟用于个体法氏囊的组织学评价(参见表5)。小心地从每只受攻击的小鸡收集法氏囊样品以收集没有被镊子压碎或挤压的组织。将组织样品放置在包含10%福尔马林的单个容器中。

通过组织学检查，将来自受到IBD-Var E病毒攻击的每只小鸡的法氏囊记录为对于法氏囊萎缩、总体宏观损伤和/或淋巴细胞衰竭阴性或阳性。法氏囊损伤包括宏观出血、水肿/渗出物、奶油/黄色、条纹，或总体萎缩。通过单独地称量每只小鸡至最接近的克数，测量法氏囊萎缩。将法氏囊单独地称量至最接近的百分之一克数。采用公式计算每只鸟的法氏囊/体重比例，BW比例：(法氏囊重量 ÷ 体重) X 1000。法氏囊/体重比例与受攻击的对照相差多于2的标准偏差被视为阴性，并且保护免于传染性法氏囊病。这个研究的结果显示疫苗处理组1和2对IBD为阴性(即，没有显著不同于安慰剂未受攻击的对照)，表明两种疫苗有效，并且进一步证实没有由于在多价疫苗中也存在重组HVT/NDV/ILT构建体而干扰由抵御IBDV攻击的疫苗的89/03株提供的保护作用(参见，表5)。

实施例6

序列

以下序列用于示例性rHVT构建体。以下提供的编码序列包括单独的终止密码子，其可以容易地替换为可选的终止密码子，而不改变编码序列所编码的蛋白抗原的性质。

ILTV gD糖蛋白，编码序列(SEQ ID NO:1)

ILTV gD糖蛋白(SEQ ID NO:2)

ILTV gI糖蛋白，编码序列(SEQ ID NO:3)

ILTV gI糖蛋白(SEQ ID NO:4)

NDV F蛋白，编码序列(SEQ ID NO:5)：克隆30

NDV F蛋白(SEQ ID NO: 6)：克隆30

NDV F蛋白，编码序列(SEQ ID NO: 7)：(B1 Hitchner)

NDV F蛋白(SEQ ID NO: 8)：(B1 Hitchner)

ILTV gD启动子(SEQ ID NO: 9)

ILTV gI启动子(SEQ ID NO: 10)

hCMV IE启动子(SEQ ID NO: 11)：(截短的)

hCMV IE启动子(SEQ ID NO: 12)：(Towne株)

合成的多腺苷酸化信号(SEQ ID NO: 13)

HSV TK多腺苷酸化信号(SEQ ID NO: 14)

IE-NDV F盒插入物(1317-46病毒) (SEQ ID NO: 15): (3593 bp)

ILTV插入序列(SEQ ID NO: 16)(3563 bp SalI –HindIII片段)：

双表达盒插入物(SEQ ID NO: 17)：5920 bp

。

本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围。实际上，除本文所述那些之外的本发明的各种变式对于参阅上述说明书的本领域技术人员将是显而易见的。这些变式应落入后附权利要求书的范围之内。

还应理解，对于核酸或多肽所给出的所有碱基大小或氨基酸大小，和所有的分子量或分子质量数值都是近似值，并且提供以用于说明。

序列表

<110> 英特维特国际股份有限公司

<120> 编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体

<130> 2011.029-US-PCT

<150> 61/549,844

<151> 2011-10-21

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 传染性喉气管炎病毒

<400> 1

atgcaccgtc ctcatctcag acggcactcg cgttactacg cgaaaggaga ggtgcttaac 60

aaacacatgg attgcggtgg aaaacggtgc tgctcaggcg cagctgtatt cactcttttc 120

tggacttgtg tcaggattat gcgggagcat atctgctttg tacgcaacgc tatggaccgc 180

catttatttt tgaggaatgc tttttggact atcgtactgc tttcttcctt cgctagccag 240

agcaccgccg ccgtcacgta cgactacatt ttaggccgtc gcgcgctcga cgcgctaacc 300

ataccggcgg ttggcccgta taacagatac ctcactaggg tatcaagagg ctgcgacgtt 360

gtcgagctca acccgatttc taacgtggac gacatgatat cggcggccaa agaaaaagag 420

aaggggggcc ctttcgaggc ctccgtcgtc tggttctacg tgattaaggg cgacgacggc 480

gaggacaagt actgtccaat ctatagaaaa gagtacaggg aatgtggcga cgtacaactg 540

ctatctgaat gcgccgttca atctgcacag atgtgggcag tggactatgt tcctagcacc 600

cttgtatcgc gaaatggcgc gggactgact atattctccc ccactgctgc gctctctggc 660

caatacttgc tgaccctgaa aatcgggaga tttgcgcaaa cagctctcgt aactctagaa 720

gttaacgatc gctgtttaaa gatcgggtcg cagcttaact ttttaccgtc gaaatgctgg 780

acaacagaac agtatcagac tggatttcaa ggcgaacacc tttatccgat cgcagacacc 840

aatacacgac acgcggacga cgtatatcgg ggatacgaag atattctgca gcgctggaat 900

aatttgctga ggaaaaagaa tcctagcgcg ccagaccctc gtccagatag cgtcccgcaa 960

gaaattcccg ctgtaaccaa gaaagcggaa gggcgcaccc cggacgcaga aagcagcgaa 1020

aagaaggccc ctccagaaga ctcggaggac gacatgcagg cagaggcttc tggagaaaat 1080

cctgccgccc tccccgaaga cgacgaagtc cccgaggaca ccgagcacga tgatccaaac 1140

tcggatcctg actattacaa tgacatgccc gccgtgatcc cggtggagga gactactaaa 1200

agttctaatg ccgtctccat gcccatattc gcggcgttcg tagcctgcgc ggtcgcgctc 1260

gtggggctac tggtttggag catcgtaaaa tgcgcgcgta gctaa 1305

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 传染性喉气管炎病毒

<400> 2

Met His Arg Pro His Leu Arg Arg His Ser Arg Tyr Tyr Ala Lys Gly

1 5 10 15

Glu Val Leu Asn Lys His Met Asp Cys Gly Gly Lys Arg Cys Cys Ser

20 25 30

Gly Ala Ala Val Phe Thr Leu Phe Trp Thr Cys Val Arg Ile Met Arg

35 40 45

Glu His Ile Cys Phe Val Arg Asn Ala Met Asp Arg His Leu Phe Leu

50 55 60

Arg Asn Ala Phe Trp Thr Ile Val Leu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Gln

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ala Val Thr Tyr Asp Tyr Ile Leu Gly Arg Arg Ala Leu

85 90 95

Asp Ala Leu Thr Ile Pro Ala Val Gly Pro Tyr Asn Arg Tyr Leu Thr

100 105 110

Arg Val Ser Arg Gly Cys Asp Val Val Glu Leu Asn Pro Ile Ser Asn

115 120 125

Val Asp Asp Met Ile Ser Ala Ala Lys Glu Lys Glu Lys Gly Gly Pro

130 135 140

Phe Glu Ala Ser Val Val Trp Phe Tyr Val Ile Lys Gly Asp Asp Gly

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Glu Asp Lys Tyr Cys Pro Ile Tyr Arg Lys Glu Tyr Arg Glu Cys Gly

165 170 175

Asp Val Gln Leu Leu Ser Glu Cys Ala Val Gln Ser Ala Gln Met Trp

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Ala Val Asp Tyr Val Pro Ser Thr Leu Val Ser Arg Asn Gly Ala Gly

195 200 205

Leu Thr Ile Phe Ser Pro Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln Tyr Leu Leu

210 215 220

Thr Leu Lys Ile Gly Arg Phe Ala Gln Thr Ala Leu Val Thr Leu Glu

225 230 235 240

Val Asn Asp Arg Cys Leu Lys Ile Gly Ser Gln Leu Asn Phe Leu Pro

245 250 255

Ser Lys Cys Trp Thr Thr Glu Gln Tyr Gln Thr Gly Phe Gln Gly Glu

260 265 270

His Leu Tyr Pro Ile Ala Asp Thr Asn Thr Arg His Ala Asp Asp Val

275 280 285

Tyr Arg Gly Tyr Glu Asp Ile Leu Gln Arg Trp Asn Asn Leu Leu Arg

290 295 300

Lys Lys Asn Pro Ser Ala Pro Asp Pro Arg Pro Asp Ser Val Pro Gln

305 310 315 320

Glu Ile Pro Ala Val Thr Lys Lys Ala Glu Gly Arg Thr Pro Asp Ala

325 330 335

Glu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Pro Pro Glu Asp Ser Glu Asp Asp Met

340 345 350

Gln Ala Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Ala Ala Leu Pro Glu Asp Asp

355 360 365

Glu Val Pro Glu Asp Thr Glu His Asp Asp Pro Asn Ser Asp Pro Asp

370 375 380

Tyr Tyr Asn Asp Met Pro Ala Val Ile Pro Val Glu Glu Thr Thr Lys

385 390 395 400

Ser Ser Asn Ala Val Ser Met Pro Ile Phe Ala Ala Phe Val Ala Cys

405 410 415

Ala Val Ala Leu Val Gly Leu Leu Val Trp Ser Ile Val Lys Cys Ala

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Arg Ser

<210> 3

<211> 1089

<212> DNA

<213> 传染性喉气管炎病毒

<400> 3

atggcatcgc tacttggaac tctggctctc cttgccgcga cgctcgcacc cttcggcgcg 60

atgggaatcg tgatcactgg aaatcacgtc tccgccagga ttgacgacga tcacatcgtg 120

atcgtcgcgc ctcgccccga agctacaatt caactgcagc tatttttcat gcctggccag 180

agaccccaca aaccctactc aggaaccgtc cgcgtcgcgt ttcggtctga tataacaaac 240

cagtgctacc aggaacttag cgaggagcgc tttgaaaatt gcactcatcg atcgtcttct 300

gtttttgtcg gctgtaaagt gaccgagtac acgttctccg cctcgaacag actaaccgga 360

cctccacacc cgtttaagct cactatacga aatcctcgtc cgaacgacag cgggatgttc 420

tacgtaattg ttcggctaga cgacaccaaa gaacccattg acgtcttcgc gatccaacta 480

tcggtgtatc aattcgcgaa caccgccgcg actcgcggac tctattccaa ggcttcgtgt 540

cgcaccttcg gattacctac cgtccaactt gaggcctatc tcaggaccga ggaaagttgg 600

cgcaactggc aagcgtacgt tgccacggag gccacgacga ccagcgccga ggcgacaacc 660

ccgacgcccg tcactgcaac cagcgcctcc gaacttgaag cggaacactt tacctttccc 720

tggctagaaa atggcgtgga tcattacgaa ccgacacccg caaacgaaaa ttcaaacgtt 780

actgtccgtc tcgggacaat gagccctacg ctaattgggg taaccgtggc tgccgtcgtg 840

agcgcaacga tcggcctcgt cattgtaatt tccatcgtca ccagaaacat gtgcaccccg 900

caccgaaaat tagacacggt ctcgcaagac gacgaagaac gttcccaaac tagaagggaa 960

tcgcgaaaat ttggacccat ggttgcgtgc gaaataaaca agggggctga ccaggatagt 1020

gaacttgtgg aactggttgc gattgttaac ccgtctgcgc taagctcgcc cgactcaata 1080

aaaatgtga 1089

<210> 4

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<212> PRT

<213> 传染性喉气管炎病毒

<400> 4

Met Ala Ser Leu Leu Gly Thr Leu Ala Leu Leu Ala Ala Thr Leu Ala

1 5 10 15

Pro Phe Gly Ala Met Gly Ile Val Ile Thr Gly Asn His Val Ser Ala

20 25 30

Arg Ile Asp Asp Asp His Ile Val Ile Val Ala Pro Arg Pro Glu Ala

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Thr Ile Gln Leu Gln Leu Phe Phe Met Pro Gly Gln Arg Pro His Lys

50 55 60

Pro Tyr Ser Gly Thr Val Arg Val Ala Phe Arg Ser Asp Ile Thr Asn

65 70 75 80

Gln Cys Tyr Gln Glu Leu Ser Glu Glu Arg Phe Glu Asn Cys Thr His

85 90 95

Arg Ser Ser Ser Val Phe Val Gly Cys Lys Val Thr Glu Tyr Thr Phe

100 105 110

Ser Ala Ser Asn Arg Leu Thr Gly Pro Pro His Pro Phe Lys Leu Thr

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Ile Arg Asn Pro Arg Pro Asn Asp Ser Gly Met Phe Tyr Val Ile Val

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Arg Leu Asp Asp Thr Lys Glu Pro Ile Asp Val Phe Ala Ile Gln Leu

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Ser Val Tyr Gln Phe Ala Asn Thr Ala Ala Thr Arg Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Lys Ala Ser Cys Arg Thr Phe Gly Leu Pro Thr Val Gln Leu Glu Ala

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Tyr Leu Arg Thr Glu Glu Ser Trp Arg Asn Trp Gln Ala Tyr Val Ala

195 200 205

Thr Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Val

210 215 220

Thr Ala Thr Ser Ala Ser Glu Leu Glu Ala Glu His Phe Thr Phe Pro

225 230 235 240

Trp Leu Glu Asn Gly Val Asp His Tyr Glu Pro Thr Pro Ala Asn Glu

245 250 255

Asn Ser Asn Val Thr Val Arg Leu Gly Thr Met Ser Pro Thr Leu Ile

260 265 270

Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val Ser Ala Thr Ile Gly Leu Val Ile

275 280 285

Val Ile Ser Ile Val Thr Arg Asn Met Cys Thr Pro His Arg Lys Leu

290 295 300

Asp Thr Val Ser Gln Asp Asp Glu Glu Arg Ser Gln Thr Arg Arg Glu

305 310 315 320

Ser Arg Lys Phe Gly Pro Met Val Ala Cys Glu Ile Asn Lys Gly Ala

325 330 335

Asp Gln Asp Ser Glu Leu Val Glu Leu Val Ala Ile Val Asn Pro Ser

340 345 350

Ala Leu Ser Ser Pro Asp Ser Ile Lys Met

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<210> 5

<211> 1662

<212> DNA

<213> 新城疫病毒

<400> 5

atgggcccca gaccttctac caagaaccca gtacctatga tgctgactgt ccgagtcgcg 60

ctggtactga gttgcatctg tccggcaaac tccattgatg gcaggcctct tgcggctgca 120

ggaattgtgg ttacaggaga caaagccgtc aacatataca cctcatccca gacaggatca 180

atcatagtta agctcctccc gaatctgccc aaggataagg aggcatgtgc gaaagccccc 240

ttggatgcat acaacaggac attgaccact ttgctcaccc cccttggtga ctctatccgt 300

aggatacaag agtctgtgac tacatctgga ggggggagac aggggcgcct tataggcgcc 360

attattggcg gtgtggctct tggggttgca actgccgcac aaataacagc ggccgcagct 420

ctgatacaag ccaaacaaaa tgctgccaac atcctccgac ttaaagagag cattgccgca 480

accaatgagg ctgtgcatga ggtcactgac ggattatcgc aactagcagt ggcagttggg 540

aagatgcagc agtttgttaa tgaccaattt aataaaacag ctcaggaatt agactgcatc 600

aaaattgcac agcaagttgg tgtagagctc aacctgtacc taaccgaatt gactacagta 660

ttcggaccac aaatcacttc acctgcttta aacaagctga ctattcaggc actttacaat 720

ctagctggtg gaaatatgga ttacttattg actaagttag gtgtagggaa caatcaactc 780

agctcattaa tcggtagcgg cttaatcacc ggtaacccta ttctatacga ctcacagact 840

caactcttgg gtatacaggt aactctacct tcagtcggga agctaaataa tatgcgtgcc 900

acctacttgg aaaccttatc cgtaagcaca accaggggat ttgcctcggc acttgtccca 960

aaagtggtga cacaggtcgg ttctgtgata gaagaacttg acacctcata ctgtatagaa 1020

actgacttac atttatattg tacaagaata gtaacgttcc ctatgtcccc tggtatttat 1080

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<210> 6

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<212> PRT

<213> 新城疫病毒

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Met Gly Pro Arg Pro Ser Thr Lys Asn Pro Val Pro Met Met Leu Thr

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Val Arg Val Ala Leu Val Leu Ser Cys Ile Cys Pro Ala Asn Ser Ile

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Leu Leu Pro Asn Leu Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

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Leu Asp Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

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Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly

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Arg Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly

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Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

130 135 140

Lys Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

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Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala

165 170 175

Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Lys

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Thr Ala Gln Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Ala Gln Gln Val Gly Val

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Ile Thr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

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Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Gly

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Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn

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Leu Pro Ser Val Gly Lys Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

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Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Arg Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro

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Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

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Thr Ile Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg

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gcaaactcca ttgatggcag gcctcttgca gctgcaggaa ttgtggttac aggagacaaa 180

gcagtcaaca tatacacctc atcccagaca ggatcaatca tagttaagct cctcccgaat 240

ctgccaaagg ataaggaggc atgtgcgaaa gcccccttgg atgcatacaa caggacattg 300

accactttgc tcacccccct tggtgactct atccgtagga tacaagagtc tgtgactaca 360

tctggagggg ggagacaggg gcgccttata ggcgccatta ttggcggtgt ggctcttggg 420

gttgcaactg ccgcacaaat aacagcggcc gcagctctga tacaagccaa acaaaatgct 480

gccaacatcc tccgacttaa agagagcatt gccgcaacca atgaggctgt gcatgaggtc 540

actgacggat tatcgcaact agcagtggca gttgggaaga tgcagcagtt cgttaatgac 600

caatttaata aaacagctca ggaattagac tgcatcaaaa ttgcacagca agttggtgta 660

gagctcaacc tgtacctaac cgaatcgact acagtattcg gaccacaaat cacttcacct 720

gccttaaaca agctgactat tcaggcactt tacaatctag ctggtgggaa tatggattac 780

ttattgacta agttaggtat agggaacaat caactcagct cattaatcgg tagcggctta 840

atcaccggta accctattct atacgactca cagactcaac tcttgggtat acaggtaact 900

ctaccttcag tcgggaacct aaataatatg cgtgccacct acttggaaac cttatccgta 960

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agaatagtaa cgttccctat gtcccctggt atttactcct gcttgagcgg caatacatcg 1140

gcctgtatgt actcaaagac cgaaggcgca cttactacac catatatgac tatcaaaggc 1200

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tcaatacaag attctcaagt aataataaca ggcaatcttg atatctcaac tgagcttggg 1440

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gacaaagtca atgtcaaact gaccagcaca tctgctctca ttacctatat cgttttgact 1560

atcatatctc ttgtttttgg tatacttagc ctgattctag catgctacct aatgtacaag 1620

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<400> 8

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Pro Ser Thr Lys Asn Pro Ala Pro Met Met Leu Thr Ile Arg Val Ala

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Leu Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro Leu Asp Ala Tyr

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115 120 125

Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala

130 135 140

Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala Lys Gln Asn Ala

145 150 155 160

Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala

165 170 175

Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Ala Val Gly

180 185 190

Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Lys Thr Ala Gln Glu

195 200 205

Leu Asp Cys Ile Lys Ile Ala Gln Gln Val Gly Val Glu Leu Asn Leu

210 215 220

Tyr Leu Thr Glu Ser Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln Ile Thr Ser Pro

225 230 235 240

Ala Leu Asn Lys Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Gly

245 250 255

Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly Asn Asn Gln Leu

260 265 270

Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn Pro Ile Leu Tyr

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Ser Thr Thr Arg Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro Lys Val Val Thr

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Arg Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Glu

340 345 350

Thr Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr Phe Pro Met Ser

355 360 365

Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser Ala Cys Met Tyr

370 375 380

Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met Thr Ile Lys Gly

385 390 395 400

Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg Cys Val Asn Pro

405 410 415

Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val Ser Leu Ile Asp

420 425 430

Lys Gln Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Gly Gly Ile Thr Leu Arg Leu

435 440 445

Ser Gly Glu Phe Asp Val Thr Tyr Gln Lys Asn Ile Ser Ile Gln Asp

450 455 460

Ser Gln Val Ile Ile Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser Thr Glu Leu Gly

465 470 475 480

Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asn Lys Leu Glu Glu Ser

485 490 495

Asn Arg Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Lys Leu Thr Ser Thr Ser Ala

500 505 510

Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile

515 520 525

Leu Ser Leu Ile Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys Gln Lys Ala Gln

530 535 540

Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu Asp Gln Met Arg

545 550 555 560

Ala Thr Thr Lys Met

565

<210> 9

<211> 527

<212> DNA

<213> 传染性喉气管炎病毒

<400> 9

aaacagctgt actacagagt aaccgatgga agaacatcgg tccagctaat gtgcctgtcg 60

tgcacgagcc attctccgga accttactgt cttttcgaca cgtctcttat agcgagggaa 120

aaagatatcg cgccagagtt atactttacc tctgatccgc aaacggcata ctgcacaata 180

actctgccgt ccggcgttgt tccgagattc gaatggagcc ttaataatgt ttcactgccg 240

gaatatttga cggccacgac cgttgtttcg cataccgctg gccaaagtac agtgtggaag 300

agcagcgcga gagcaggcga ggcgtggatt tctggccggg gaggcaatat atacgaatgc 360

accgtcctca tctcagacgg cactcgcgtt actacgcgaa aggagaggtg cttaacaaac 420

acatggattg cggtggaaaa cggtgctgct caggcgcagc tgtattcact cttttctgga 480

cttgtgtcag gattatgcgg gagcatatct gctttgtacg caacgct 527

<210> 10

<211> 264

<212> DNA

<213> 传染性喉气管炎病毒

<400> 10

tgactattac aatgacatgc ccgccgtgat cccggtggag gagactacta aaagttctaa 60

tgccgtctcc atgcccatat tcgcggcgtt cgtagcctgc gcggtcgcgc tcgtggggct 120

actggtttgg agcatcgtaa aatgcgcgcg tagctaatcg agcctagaat aggtggtttc 180

ttcctacatg ccacgcctca cgctcataat ataaatcaca tggaatagca taccaatgcc 240

tattcattgg gacgttcgaa aagc 264

<210> 11

<211> 360

<212> DNA

<213> 人巨细胞病毒

<400> 11

cgcgccaggt caattccctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 60

tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac 120

atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac 180

gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac 240

tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 300

ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata 360

<210> 12

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人巨细胞病毒

<400> 12

gtgaataata aaatgtgtgt ttgtccgaaa tacgcgtttg agatttctgt cccgactaaa 60

ttcatgtcgc gcgatagtgg tgtttatcgc cgatagagat ggcgatattg gaaaaatcga 120

tatttgaaaa tatggcatat tgaaaatgtc gccgatgtga gtttctgtgt aactgatatc 180

gccatttttc caaaagttga tttttgggca tacgcgatat ctggcgatac gcttatatcg 240

tttacggggg atggcgatag acgcctttgg tgacttgggc gattctgtgt gtcgcaaata 300

tcgcagtttc gatataggtg acagacgata tgaggctata tcgccgatag aggcgacatc 360

aagctggcac atggccaatg catatcgatc tatacattga atcaatattg gccattagcc 420

atattattca ttggttatat agcataaatc aatattggct attggccatt gcatacgttg 480

tatccatatc ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga 540

cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 600

tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 660

gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 720

ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 780

gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 840

cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 900

gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 960

tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 1020

caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 1080

ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 1140

atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg g 1191

<210> 13

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

ggaattctag atcccacgtc actattgtat actctatatt atactctatg ttatactctg 60

taatcctact caataaacgt gtcacgcctg tgaaaccgta ctaagtctcc cgtgtcttct 120

tatcaccatc aggtgacatc ctcgcccagg ctgtcaatca tgccggtatc gattccagta 180

gcaccggccc cacgctgaca acccactctt gcagcgttag cagcgcccct cttaacaagc 240

cgacccccac cagcgtcgcg gttactaaca ctcctctccc c 281

<210> 14

<211> 523

<212> DNA

<213> 单纯疱疹病毒

<400> 14

gggagatggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct 60

atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacgggtgtt gggtcgtttg ttcataaacg 120

cggggttcgg tcccagggct ggcactctgt cgatacccca ccgagacccc attgggacca 180

atacgcccgc gtttcttcct tttccccacc ccaaccccca agttcgggtg aaggcccagg 240

gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaagccc tgccatagcc acgggccccg tgggttaggg 300

acggggtccc ccatggggaa tggtttatgg ttcgtggggg ttattatttt gggcgttgcg 360

tggggtcagg tccacgactg gactgagcag acagacccat ggtttttgga tggcctgggc 420

atggaccgca tgtactggcg cgacacgaac accgggcgtc tgtggctgcc aaacaccccc 480

gacccccaaa aaccaccgcg cggatttctg gcgccgccgg acg 523

<210> 15

<211> 3593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达盒插入物

<400> 15

taattaaccc gggaagcttg catgcctgca gtgaataata aaatgtgtgt ttgtccgaaa 60

tacgcgtttg agatttctgt cccgactaaa ttcatgtcgc gcgatagtgg tgtttatcgc 120

cgatagagat ggcgatattg gaaaaatcga tatttgaaaa tatggcatat tgaaaatgtc 180

gccgatgtga gtttctgtgt aactgatatc gccatttttc caaaagttga tttttgggca 240

tacgcgatat ctggcgatac gcttatatcg tttacggggg atggcgatag acgcctttgg 300

tgacttgggc gattctgtgt gtcgcaaata tcgcagtttc gatataggtg acagacgata 360

tgaggctata tcgccgatag aggcgacatc aagctggcac atggccaatg catatcgatc 420

tatacattga atcaatattg gccattagcc atattattca ttggttatat agcataaatc 480

aatattggct attggccatt gcatacgttg tatccatatc ataatatgta catttatatt 540

ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 600

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 660

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 720

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 780

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 840

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 900

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 960

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 1020

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 1080

cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 1140

ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt 1200

gacctccata gaagacaccg ggaccatgga tcgatcccgg ttggcgccct ccaggtgcag 1260

gatgggctcc agaccttcta ccaagaaccc agcacctatg atgctgacta tccgggtcgc 1320

gctggtactg agttgcatct gtccggcaaa ctccattgat ggcaggcctc ttgcagctgc 1380

aggaattgtg gttacaggag acaaagcagt caacatatac acctcatccc agacaggatc 1440

aatcatagtt aagctcctcc cgaatctgcc aaaggataag gaggcatgtg cgaaagcccc 1500

cttggatgca tacaacagga cattgaccac tttgctcacc ccccttggtg actctatccg 1560

taggatacaa gagtctgtga ctacatctgg aggggggaga caggggcgcc ttataggcgc 1620

cattattggc ggtgtggctc ttggggttgc aactgccgca caaataacag cggccgcagc 1680

tctgatacaa gccaaacaaa atgctgccaa catcctccga cttaaagaga gcattgccgc 1740

aaccaatgag gctgtgcatg aggtcactga cggattatcg caactagcag tggcagttgg 1800

gaagatgcag cagttcgtta atgaccaatt taataaaaca gctcaggaat tagactgcat 1860

caaaattgca cagcaagttg gtgtagagct caacctgtac ctaaccgaat cgactacagt 1920

attcggacca caaatcactt cacctgcctt aaacaagctg actattcagg cactttacaa 1980

tctagctggt gggaatatgg attacttatt gactaagtta ggtataggga acaatcaact 2040

cagctcatta atcggtagcg gcttaatcac cggtaaccct attctatacg actcacagac 2100

tcaactcttg ggtatacagg taactctacc ttcagtcggg aacctaaata atatgcgtgc 2160

cacctacttg gaaaccttat ccgtaagcac aaccagggga tttgcctcgg cacttgtccc 2220

aaaagtggtg acacgggtcg gttctgtgat agaagaactt gacacctcat actgtataga 2280

aactgactta gatttatatt gtacaagaat agtaacgttc cctatgtccc ctggtattta 2340

ctcctgcttg agcggcaata catcggcctg tatgtactca aagaccgaag gcgcacttac 2400

tacaccatat atgactatca aaggctcagt catcgctaac tgcaagatga caacatgtag 2460

atgtgtaaac cccccgggta tcatatcgca aaactatgga gaagccgtgt ctctaataga 2520

taaacaatca tgcaatgttt tatccttagg cgggataact ttaaggctca gtggggaatt 2580

cgatgtaact tatcagaaga atatctcaat acaagattct caagtaataa taacaggcaa 2640

tcttgatatc tcaactgagc ttgggaatgt caacaactcg atcagtaatg ccttgaataa 2700

gttagaggaa agcaacagaa aactagacaa agtcaatgtc aaactgacca gcacatctgc 2760

tctcattacc tatatcgttt tgactatcat atctcttgtt tttggtatac ttagcctgat 2820

tctagcatgc tacctaatgt acaagcaaaa ggcgcaacaa aagaccttat tatggcttgg 2880

gaataatacc ctagatcaga tgagagccac tacaaaaatg tgaacacaga tgaggaacga 2940

aggtttccct aatagtaatt tgtgtgaaag ttctggtagt ctgtcagttc ggagagttaa 3000

gaaaaaaaaa aaaccccccc cccccccccc ccccccccct gggtacgatc ctctagagtc 3060

gggagatggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct 3120

atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacgggtgtt gggtcgtttg ttcataaacg 3180

cggggttcgg tcccagggct ggcactctgt cgatacccca ccgagacccc attgggacca 3240

atacgcccgc gtttcttcct tttccccacc ccaaccccca agttcgggtg aaggcccagg 3300

gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaagccc tgccatagcc acgggccccg tgggttaggg 3360

acggggtccc ccatggggaa tggtttatgg ttcgtggggg ttattatttt gggcgttgcg 3420

tggggtcagg tccacgactg gactgagcag acagacccat ggtttttgga tggcctgggc 3480

atggaccgca tgtactggcg cgacacgaac accgggcgtc tgtggctgcc aaacaccccc 3540

gacccccaaa aaccaccgcg cggatttctg gcgccgccgg acgtcgactt aat 3593

<210> 16

<211> 3569

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达盒插入物

<400> 16

gtcgacggca gagtcgcaga cgcccctatt ggacgtcaaa attgtagagg tgaagttttc 60

aaacgatggc gaagtaacgg cgacttgcgt ttccaccgtc aaatctccct atagggtaga 120

aactaattgg aaagtagacc tcgtagatgt aatggatgaa atttctggga acagtcccgc 180

cggggttttt aacagtaatg agaaatggca gaaacagctg tactacagag taaccgatgg 240

aagaacatcg gtccagctaa tgtgcctgtc gtgcacgagc cattctccgg aaccttactg 300

tcttttcgac acgtctctta tagcgaggga aaaagatatc gcgccagagt tatactttac 360

ctctgatccg caaacggcat actgcacaat aactctgccg tccggcgttg ttccgagatt 420

cgaatggagc cttaataatg tttcactgcc ggaatatttg acggccacga ccgttgtttc 480

gcataccgct ggccaaagta cagtgtggaa gagcagcgcg agagcaggcg aggcgtggat 540

ttctggccgg ggaggcaata tatacgaatg caccgtcctc atctcagacg gcactcgcgt 600

tactacgcga aaggagaggt gcttaacaaa cacatggatt gcggtggaaa acggtgctgc 660

tcaggcgcag ctgtattcac tcttttctgg acttgtgtca ggattatgcg ggagcatatc 720

tgctttgtac gcaacgctat ggaccgccat ttatttttga ggaatgcttt ttggactatc 780

gtactgcttt cttccttcgc tagccagagc accgccgccg tcacgtacga ctacatttta 840

ggccgtcgcg cgctcgacgc gctaaccata ccggcggttg gcccgtataa cagatacctc 900

actagggtat caagaggctg cgacgttgtc gagctcaacc cgatttctaa cgtggacgac 960

atgatatcgg cggccaaaga aaaagagaag gggggccctt tcgaggcctc cgtcgtctgg 1020

ttctacgtga ttaagggcga cgacggcgag gacaagtact gtccaatcta tagaaaagag 1080

tacagggaat gtggcgacgt acaactgcta tctgaatgcg ccgttcaatc tgcacagatg 1140

tgggcagtgg actatgttcc tagcaccctt gtatcgcgaa atggcgcggg actgactata 1200

ttctccccca ctgctgcgct ctctggccaa tacttgctga ccctgaaaat cgggagattt 1260

gcgcaaacag ctctcgtaac tctagaagtt aacgatcgct gtttaaagat cgggtcgcag 1320

cttaactttt taccgtcgaa atgctggaca acagaacagt atcagactgg atttcaaggc 1380

gaacaccttt atccgatcgc agacaccaat acacgacacg cggacgacgt atatcgggga 1440

tacgaagata ttctgcagcg ctggaataat ttgctgagga aaaagaatcc tagcgcgcca 1500

gaccctcgtc cagatagcgt cccgcaagaa attcccgctg taaccaagaa agcggaaggg 1560

cgcaccccgg acgcagaaag cagcgaaaag aaggcccctc cagaagactc ggaggacgac 1620

atgcaggcag aggcttctgg agaaaatcct gccgccctcc ccgaagacga cgaagtcccc 1680

gaggacaccg agcacgatga tccaaactcg gatcctgact attacaatga catgcccgcc 1740

gtgatcccgg tggaggagac tactaaaagt tctaatgccg tctccatgcc catattcgcg 1800

gcgttcgtag cctgcgcggt cgcgctcgtg gggctactgg tttggagcat cgtaaaatgc 1860

gcgcgtagct aatcgagcct agaataggtg gtttcttcct acatgccacg cctcacgctc 1920

ataatataaa tcacatggaa tagcatacca atgcctattc attgggacgt tcgaaaagca 1980

tggcatcgct acttggaact ctggctctcc ttgccgcgac gctcgcaccc ttcggcgcga 2040

tgggaatcgt gatcactgga aatcacgtct ccgccaggat tgacgacgat cacatcgtga 2100

tcgtcgcgcc tcgccccgaa gctacaattc aactgcagct atttttcatg cctggccaga 2160

gaccccacaa accctactca ggaaccgtcc gcgtcgcgtt tcggtctgat ataacaaacc 2220

agtgctacca ggaacttagc gaggagcgct ttgaaaattg cactcatcga tcgtcttctg 2280

tttttgtcgg ctgtaaagtg accgagtaca cgttctccgc ctcgaacaga ctaaccggac 2340

ctccacaccc gtttaagctc actatacgaa atcctcgtcc gaacgacagc gggatgttct 2400

acgtaattgt tcggctagac gacaccaaag aacccattga cgtcttcgcg atccaactat 2460

cggtgtatca attcgcgaac accgccgcga ctcgcggact ctattccaag gcttcgtgtc 2520

gcaccttcgg attacctacc gtccaacttg aggcctatct caggaccgag gaaagttggc 2580

gcaactggca agcgtacgtt gccacggagg ccacgacgac cagcgccgag gcgacaaccc 2640

cgacgcccgt cactgcaacc agcgcctccg aacttgaagc ggaacacttt acctttccct 2700

ggctagaaaa tggcgtggat cattacgaac cgacacccgc aaacgaaaat tcaaacgtta 2760

ctgtccgtct cgggacaatg agccctacgc taattggggt aaccgtggct gccgtcgtga 2820

gcgcaacgat cggcctcgtc attgtaattt ccatcgtcac cagaaacatg tgcaccccgc 2880

accgaaaatt agacacggtc tcgcaagacg acgaagaacg ttcccaaact agaagggaat 2940

cgcgaaaatt tggacccatg gttgcgtgcg aaataaacaa gggggctgac caggatagtg 3000

aacttgtgga actggttgcg attgttaacc cgtctgcgct aagctcgccc gactcaataa 3060

aaatgtgatt aagtctgaat gtggctctcc aatcatttcg attctctaat ctcccaatcc 3120

tctcaaaagg ggcagtatcg gacacggact gggaggggcg tacacgatag ttatatggta 3180

cagcagaggc ctctgaacac ttaggaggag aattcagccg gggagagccc ctgttgagta 3240

ggcttgggag catattgcag gatgaacatg ttagtgatag ttctcgcctc ttgtcttgcg 3300

cgcctaactt ttgcgacgcg acacgtcctc tttttggaag gcactcaggc tgtcctcggg 3360

gaagatgatc ccagaaacgt tccggaaggg actgtaatca aatggacaaa agtcctgcgg 3420

aacgcgtgca agatgaaggc ggccgatgtc tgctcttcgc ctaactattg ctttcatgat 3480

ttaatttacg acggaggaaa gaaagactgc ccgcccgcgg gacccctgtc tgcaaacctg 3540

gtaattttac taaagcgcgg cgaaagctt 3569

<210> 17

<211> 5921

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达盒插入物

<400> 17

gtcgacggca gagtcgcaga cgcccctatt ggacgtcaaa attgtagagg tgaagttttc 60

aaacgatggc gaagtaacgg cgacttgcgt ttccaccgtc aaatctccct atagggtaga 120

aactaattgg aaagtagacc tcgtagatgt aatggatgaa atttctggga acagtcccgc 180

cggggttttt aacagtaatg agaaatggca gaaacagctg tactacagag taaccgatgg 240

aagaacatcg gtccagctaa tgtgcctgtc gtgcacgagc cattctccgg aaccttactg 300

tcttttcgac acgtctctta tagcgaggga aaaagatatc gcgccagagt tatactttac 360

ctctgatccg caaacggcat actgcacaat aactctgccg tccggcgttg ttccgagatt 420

cgaatggagc cttaataatg tttcactgcc ggaatatttg acggccacga ccgttgtttc 480

gcataccgct ggccaaagta cagtgtggaa gagcagcgcg agagcaggcg aggcgtggat 540

ttctggccgg ggaggcaata tatacgaatg caccgtcctc atctcagacg gcactcgcgt 600

tactacgcga aaggagaggt gcttaacaaa cacatggatt gcggtggaaa acggtgctgc 660

tcaggcgcag ctgtattcac tcttttctgg acttgtgtca ggattatgcg ggagcatatc 720

tgctttgtac gcaacgctat ggaccgccat ttatttttga ggaatgcttt ttggactatc 780

gtactgcttt cttccttcgc tagccagagc accgccgccg tcacgtacga ctacatttta 840

ggccgtcgcg cgctcgacgc gctaaccata ccggcggttg gcccgtataa cagatacctc 900

actagggtat caagaggctg cgacgttgtc gagctcaacc cgatttctaa cgtggacgac 960

atgatatcgg cggccaaaga aaaagagaag gggggccctt tcgaggcctc cgtcgtctgg 1020

ttctacgtga ttaagggcga cgacggcgag gacaagtact gtccaatcta tagaaaagag 1080

tacagggaat gtggcgacgt acaactgcta tctgaatgcg ccgttcaatc tgcacagatg 1140

tgggcagtgg actatgttcc tagcaccctt gtatcgcgaa atggcgcggg actgactata 1200

ttctccccca ctgctgcgct ctctggccaa tacttgctga ccctgaaaat cgggagattt 1260

gcgcaaacag ctctcgtaac tctagaagtt aacgatcgct gtttaaagat cgggtcgcag 1320

cttaactttt taccgtcgaa atgctggaca acagaacagt atcagactgg atttcaaggc 1380

gaacaccttt atccgatcgc agacaccaat acacgacacg cggacgacgt atatcgggga 1440

tacgaagata ttctgcagcg ctggaataat ttgctgagga aaaagaatcc tagcgcgcca 1500

gaccctcgtc cagatagcgt cccgcaagaa attcccgctg taaccaagaa agcggaaggg 1560

cgcaccccgg acgcagaaag cagcgaaaag aaggcccctc cagaagactc ggaggacgac 1620

atgcaggcag aggcttctgg agaaaatcct gccgccctcc ccgaagacga cgaagtcccc 1680

gaggacaccg agcacgatga tccaaactcg gatcctgact attacaatga catgcccgcc 1740

gtgatcccgg tggaggagac tactaaaagt tctaatgccg tctccatgcc catattcgcg 1800

gcgttcgtag cctgcgcggt cgcgctcgtg gggctactgg tttggagcat cgtaaaatgc 1860

gcgcgtagct aatcgagcct agaataggtg gtttcttcct acatgccacg cctcacgctc 1920

ataatataaa tcacatggaa tagcatacca atgcctattc attgggacgt tcgaaaagca 1980

tggcatcgct acttggaact ctggctctcc ttgccgcgac gctcgcaccc ttcggcgcga 2040

tgggaatcgt gatcactgga aatcacgtct ccgccaggat tgacgacgat cacatcgtga 2100

tcgtcgcgcc tcgccccgaa gctacaattc aactgcagct atttttcatg cctggccaga 2160

gaccccacaa accctactca ggaaccgtcc gcgtcgcgtt tcggtctgat ataacaaacc 2220

agtgctacca ggaacttagc gaggagcgct ttgaaaattg cactcatcga tcgtcttctg 2280

tttttgtcgg ctgtaaagtg accgagtaca cgttctccgc ctcgaacaga ctaaccggac 2340

ctccacaccc gtttaagctc actatacgaa atcctcgtcc gaacgacagc gggatgttct 2400

acgtaattgt tcggctagac gacaccaaag aacccattga cgtcttcgcg atccaactat 2460

cggtgtatca attcgcgaac accgccgcga ctcgcggact ctattccaag gcttcgtgtc 2520

gcaccttcgg attacctacc gtccaacttg aggcctatct caggaccgag gaaagttggc 2580

gcaactggca agcgtacgtt gccacggagg ccacgacgac cagcgccgag gcgacaaccc 2640

cgacgcccgt cactgcaacc agcgcctccg aacttgaagc ggaacacttt acctttccct 2700

ggctagaaaa tggcgtggat cattacgaac cgacacccgc aaacgaaaat tcaaacgtta 2760

ctgtccgtct cgggacaatg agccctacgc taattggggt aaccgtggct gccgtcgtga 2820

gcgcaacgat cggcctcgtc attgtaattt ccatcgtcac cagaaacatg tgcaccccgc 2880

accgaaaatt agacacggtc tcgcaagacg acgaagaacg ttcccaaact agaagggaat 2940

cgcgaaaatt tggacccatg gttgcgtgcg aaataaacaa gggggctgac caggatagtg 3000

aacttgtgga actggttgcg attgttaacc cgtctgcgct aagctcgccc gactcaataa 3060

aaatgtgatt aagtctgaat gtggctctcc aatcatttcg attctctaat ctcccaatcc 3120

tctcaaaagg ggcagtatcg gacacggact gggaggggcg tacacgatag ttatatggta 3180

cagcagaggc ctctgaacac ttaggaggag aattcagccg gggagagccc ctgttgagta 3240

ggcttgggag catattgcag gatgaacatg ttagtgatag ttctcgcctc ttgtcttgcg 3300

cgcctaactt ttgcgacgcg acacgtcctc tttttggaag gcactcaggc tgtcctcggg 3360

gaagatgatc ccagaaacgt tccggaaggg actgtaatca aatggacaaa agtcctgcgg 3420

aacgcgtgca agatgaaggc ggccgatgtc tgctcttcgc ctaactattg ctttcatgat 3480

ttaatttacg acggaggaaa gaaagactgc ccgcccgcgg gacccctgtc tgcaaacctg 3540

gtaattttac taaagcgcgg cgaaagcttc gcgccaggtc aattccctgg cattatgccc 3600

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 3660

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 3720

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 3780

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtagcg 3840

tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag 3900

acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg ttgcgccgcc accatgggcc 3960

ccagaccttc taccaagaac ccagtaccta tgatgctgac tgtccgagtc gcgctggtac 4020

tgagttgcat ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcggct gcaggaattg 4080

tggttacagg agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag 4140

ttaagctcct cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg 4200

catacaacag gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac 4260

aagagtctgt gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg 4320

gcggtgtggc tcttggggtt gcaactgccg cacaaataac agcggccgca gctctgatac 4380

aagccaaaca aaatgctgcc aacatcctcc gacttaaaga gagcattgcc gcaaccaatg 4440

aggctgtgca tgaggtcact gacggattat cgcaactagc agtggcagtt gggaagatgc 4500

agcagtttgt taatgaccaa tttaataaaa cagctcagga attagactgc atcaaaattg 4560

cacagcaagt tggtgtagag ctcaacctgt acctaaccga attgactaca gtattcggac 4620

cacaaatcac ttcacctgct ttaaacaagc tgactattca ggcactttac aatctagctg 4680

gtggaaatat ggattactta ttgactaagt taggtgtagg gaacaatcaa ctcagctcat 4740

taatcggtag cggcttaatc accggtaacc ctattctata cgactcacag actcaactct 4800

tgggtataca ggtaactcta ccttcagtcg ggaagctaaa taatatgcgt gccacctact 4860

tggaaacctt atccgtaagc acaaccaggg gatttgcctc ggcacttgtc ccaaaagtgg 4920

tgacacaggt cggttctgtg atagaagaac ttgacacctc atactgtata gaaactgact 4980

tacatttata ttgtacaaga atagtaacgt tccctatgtc ccctggtatt tattcctgct 5040

tgagcggcaa tacgtcggcc tgtatgtact caaagaccga aggcgcactt actacaccat 5100

acatgactat caaaggttca gtcatcgcca actgcaagat gacaacatgt agatgtgtaa 5160

accccccggg tatcatatcg caaaactatg gagaagccgt gtctctaata gataaacaat 5220

catgcaatgt tttatcctta ggcgggataa ctttaaggct cagtggggaa ttcgatgtaa 5280

cttatcagaa gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat aataacaggc aatcttgata 5340

tctcaactga gcttgggaat gtcaacaact cgatcagtaa tgctttgaat aagttagagg 5400

aaagcaacag aaaactagac aaagtcaatg tcaaactgac tagcacatct gctctcatta 5460

cctatatcgt gttgactatc atatctcttg tttttggtat acttagcctg attctagcat 5520

gctacctaat gtacaagcaa aaggcgcaac aaaagacctt attatggctt gggaataata 5580

ctctagatca gatgagagcc actacaaaaa tgtgaggatc tctcgaggaa ttctagatcc 5640

cacgtcacta ttgtatactc tatattatac tctatgttat actctgtaat cctactcaat 5700

aaacgtgtca cgcctgtgaa accgtactaa gtctcccgtg tcttcttatc accatcaggt 5760

gacatcctcg cccaggctgt caatcatgcc ggtatcgatt ccagtagcac cggccccacg 5820

ctgacaaccc actcttgcag cgttagcagc gcccctctta acaagccgac ccccaccagc 5880

gtcgcggtta ctaacactcc tctccccgac ctgcaactag t 5921

Claims

1.重组的非致病性马立克氏病病毒(rMDV_np)，其包含插入到所述rMDV_np基因组中的第一非必需位点的第一核酸，和插入到所述rMDV_np基因组中的第二非必需位点的第二核酸，

其中，所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是US2位点，或者所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是UL54.5位点，或者所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL7/8位点，

其中所述rMDV_np为重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。

2.权利要求1的rMDV_np，其包括插入到US2位点中的编码ILTV gD、ILTV gI和NDV融合基因的表达盒。

3.权利要求1的rMDV_np，其包括插入到UL54.5位点中的编码ILTV gD、ILTV gI和NDV融合基因的表达盒。

4.权利要求1的rMDV_np，其包括插入到US2位点中的编码ILTV gD和ILTV gI基因的表达盒，和插入到UL7/8位点的编码NDV融合基因的表达盒。

5.权利要求1-4中任一项的rMDV_np，其中所述编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列可操作地在第一启动子的控制下，所述编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列可操作地在第二启动子的控制下，且所述编码NDV F蛋白的核苷酸序列可操作地在第三启动子的控制下。

6.权利要求5的rMDV_np，其中所述第一启动子是内源ILTV gD启动子且所述第二启动子是内源ILTV gI启动子，且所述第三启动子是人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子。

7.重组的非致病性马立克氏病病毒(rMDV_np)，其包含插入到非必需位点中的重组核酸，所述非必需插入位点选自US2和UL54.5，其中所述重组核酸从5'至3'方向按以下顺序包含：

(i) 传染性喉气管炎病毒(ILTV) gD启动子；

(ii) ILTV gD蛋白的编码序列；

(iii) ILTV gI启动子；

(iv) ILTV gI蛋白的编码序列；

(v) 人巨细胞病毒即刻早期(hCMV IE)启动子；

(vi) 新城疫病毒融合蛋白(NDV F)的编码序列；和

(vii) 转录终止子序列；且

其中所述rMDV_np为重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。

8.权利要求7的重组rMDV_np，其包含插入到所述非必需位点中的SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。

9.疫苗，其包含权利要求1-8中任一项的rMDV_np。

10.权利要求9的疫苗，其进一步包含温和的活传染性法氏囊病病毒(IBDV)。

11.权利要求10的疫苗，其中所述温和的活IBDV是89/03株。

12.权利要求1-8中任一项的rMDV_np用于制备疫苗的用途，所述疫苗有助于鸡抵御ILTV的保护作用。