JP6134324B2 - 感染性喉頭気管炎ウイルスおよびニューカッスル病ウイルス抗原をコードする組換え非病原性マレック病ウイルス構築物 - Google Patents

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１１年１０月２１日付け出願の米国仮特許出願第６１／５４９，８４４号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。

発明の分野
本発明は、感染性喉頭気管炎ウイルスおよびニューカッスル病ウイルスタンパク質抗原をコードし発現する新規組換え多価非病原性マレック病ウイルス構築物ならびに家禽ワクチンにおけるそれらの使用方法に関する。

病原性家禽ウイルスはニワトリを衰弱させるだけでなく、生じる疾患のほとんどは感染性であり、家禽業は大規模監禁飼育施設に大きく依存しているので、養鶏業者に大きな損害を及ぼす。若いニワトリに対するワクチン接種は、しばしば、これらのウイルスと闘うための唯一の実用的な手段である。弱毒化または不活化家禽ウイルスワクチンが市場において依然として重要であるが、近年、病原性ウイルスタンパク質抗原を発現する組換えウイルス構築物を含有するワクチンにかなりの資源が費やされてきている。更に、多価ウイルス病原体から外来遺伝子を発現する安定かつ効果的な多価組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶ_ｎｐ）ベクターを構築するために、相当な努力がなされている。そのような多価ワクチンは、ニワトリに対して行われる注射の回数を最小にするのに役立ち、それにより、ワクチン接種されるニワトリの不快感およびストレスを軽減し、労働および原料のコストを減少させるであろう。そのような単一の多価構築物でのワクチン接種は、複数の組換え一価ｒＭＤＶ_ｎｐ構築物を含有する代替的多価ｒＭＤＶ_ｎｐワクチンよりも好ましいであろう。なぜなら、これらの代替的ワクチンは、少なくとも現時点では、単一ウイルス病原体にしか防御をもたらしていないからである。そのような代替的ワクチンの失敗は、おそらく、一価ｒＭＤＶ_ｎｐ構築物の１つがその他の一価ｒＭＤＶ_ｎｐ構築物より増殖しすぎて、有意な免疫応答をこれらの他の一価ｒＭＤＶ_ｎｐ構築物が誘導するのを妨げることによるものであろう。いずれの場合にも、多価ウイルス病原体から外来遺伝子を発現する安定かつ効果的な多価組換えｒＭＤＶ_ｎｐベクターを構築するための過去の相当な努力にもかかわらず、これまでのところそのような努力は成功していない。

ワクチン接種により制御されうる１つの家禽ウイルス疾患として、マレック病が挙げられる。マレック病は、世界中でニワトリに悪影響を及ぼす病原性疾患である。マレック病は、主に、２〜５月齢の若いニワトリにおいて生じる。臨床徴候には、体肢の１以上の進行性麻痺、脚の麻痺による協調障害、翼が冒されることによる体肢の垂下、および頚筋が冒されることによる頭位低下が含まれる。急性の場合には、重篤な機能低下が生じる。嚢および胸腺萎縮も生じうる。

マレック病の病原体は、二本鎖ＤＮＡゲノムを有する細胞結合ウイルスであるマレック病ウイルス血清型１（ＭＤＶ１）である。ＭＤＶ１は、（ｉ）細胞溶解を引き起こしうるＢ細胞への感染、および（ｉｉ）Ｔ細胞リンパ腫を誘発しうるＴ細胞への潜伏感染、の両方を引き起こすリンパ親和性トリアルファヘルペスウイルスである。ビルレントＭＤＶ１株に密接に関連しているマレック病ウイルス血清型２（ＭＤＶ２）は、ニワトリヘルペスウイルス３として従来から公知のものであり、ニワトリにおいて病原性をほとんど又は全く有さないことが示されている自然弱毒化ＭＤＶ株である［Ｐｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５８：１１−１７（２００９）］。
ＳＢ−１は、ＭＤＶ１に対するワクチンにおいて有用であることが示されている特異的ＭＤＶ２株である［例えば、ＭｕｒｔｈｙおよびＣａｌｎｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６（２）５４７−５５３（１９７９）を参照されたい］。

もう１つの密接に関連しているアルファヘルペスウイルスであるマレック病ウイルス血清型３（ＭＤＶ３）は、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）としてより広く知られており、家禽シチメンチョウの非病原性ウイルスである［例えば、Ｋｉｎｇｈａｍら，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：１１２３−１１３５（２００１）を参照されたい］。一般に使用されている２つのＨＶＴ株は、ＰＢ１株およびＦＣ１２６株である。ＨＶＴもニワトリにおいて非病原性であるが、それはＭＤＶ１に対する長く持続する防御免疫応答をニワトリにおいて誘導する。したがって、ＨＶＴは、ＨＶＴよりウイルス血症性であるがより安全だとみなされているＳＢ−１と一般に組み合わされて、ビルレントＭＤＶ１に対する家禽ワクチンにおいて長年使用されている。あるいは、特にビルレントなＭＤＶ１株でトリ集団をチャレンジする場合には、ＨＶＴはリスペン（Ｒｉｓｐｅｎ’ｓ）ワクチンと組み合わされうる。リスペンワクチンは、低ビルレントＭＤＶ１株から誘導され次いで細胞継代により更に弱毒化された分離体である。しかし、リスペン株はニワトリの高感受性系統に対して幾らかのビルレンスを保有している。

ＨＶＴの完全ゲノムの配列は既に記載されており［Ａｆｏｎｓｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（２）：９７１−９７８（２００１）］、ほとんどのアルファヘルペスウイルスと同様に、ＨＶＴは相当数の潜在的非必須挿入部位を有する［例えば、Ｕ．Ｓ．５，１８７，０８７；Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５；Ｕ．Ｓ．５，８３４，３０５；Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３；Ｕ．Ｓ．５，９２８，６４８；Ｕ．Ｓ．５，９６１，９８２；Ｕ．Ｓ．６，１２１，０４３；Ｕ．Ｓ．６，２９９，８８２ Ｂ１を参照されたい］。ＨＶＴは遺伝的修飾を受けやすいことも示されており、したがって、組換えベクターとして長年使用されている［ＷＯ ８７／０４４６３］。したがって、組換えＨＶＴベクターは、例えばニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）［Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：３４９−３５８（１９９３）；Ｒｅｄｄｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：４６９−４７７（１９９６）］、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）［Ｄａｒｔｅｉｌら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：４８１−４９０（１９９５）；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１１）：５６３７−５６４５（２００２）］、および感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）［Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，５４（４）：１２５１−１２５９（２０１０）；ＷＯ ９２／０３５５４；Ｕ．Ｓ．６，８７５，８５６］に由来する抗原をコードする外来遺伝子を発現することが報告されている。ＭＤＶ２の全ゲノム配列も公知である［ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．ｎｒ：ＡＢ０４９７３５．１およびＰｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅら，前掲］。ＭＤＶ２のゲノム構成はＨＶＴのものに非常に類似しており、特にＵＳ領域はＨＶＴのものと同一である［Ｋｉｎｇｈａｍら，前掲］。

また、ＨＶＴゲノムの特異的領域がＭＤＶ１ゲノムの対応領域により置換されている、新規トリヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）として知られている組換えキメラウイルスが構築されている。ＮＡＨＶは、他の家禽ウイルスに由来する抗原をコードする外来遺伝子を発現させるために使用されている［Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８；Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１］。

ＭＤＶと同様に、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）は、世界中でニワトリに悪影響を及ぼすアルファヘルペスウイルスである［Ｆｕｃｈｓら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８：２６１−２７９（２００７）］。ＩＬＴＶは、ニワトリにおいて呼吸機能低下、息切れ、および血の混じった滲出物の喀出により特徴づけられる急性呼吸疾患を引き起こす。ウイルス複製は気道の細胞に限定され、ここで、感染は気管内で組織びらん及び出血を引き起こす。

ニューカッスル病は、ニワトリのもう１つの高感染性かつ衰弱性疾患である。ニューカッスル病の病原体はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ＮＤＶは、モノネガウイルス目に属し、パラミクソウイルス科に含まれる。ニューカッスル病ウイルスは、非セグメント化マイナス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＮＤＶは、それらのビルレンスに従い３つの異なる病理型に分類されている。ＮＤＶの非病原性長潜伏期性株による家禽の感染は、実質的に無症候性である。これとは全く対照的に、亜病原性（中病原性）および短潜伏期性（高病原性）ＮＤＶ株は、致死的となりうる重篤な疾患を引き起こす。ＮＤＶのほとんどの型は呼吸系および／または神経系に感染し、息切れ及び斜頚を引き起こしうる。

感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）はガンボロ病ウイルスとも称され、感染性ファブリキウス嚢病の原因因子である。ＩＢＤＶはニワトリのリンパ系組織の急性高感染性ウイルス感染を引き起こし、その主要標的は、トリの必須免疫器官であるファブリキウス嚢である。感受性トリ集団における罹患率は高く、急速な体重減少および中等度ないし高度の死亡率を示す。疾患から回復したニワトリは、ファブリキウス嚢（の一部）の破壊のため免疫不全を示しうる。これはそれらを二次感染症に特に罹りやすくする。

ＩＢＤＶはビルナウイルス科のメンバーである。この科のウイルスは、二本鎖ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）からなるゲノムを有する。２つのＩＢＤＶ血清型（血清型１および２）が存在し、これらはウイルス中和（ＶＮ）試験により区別されうる。血清型１ウイルスはニワトリに対して病原性であることが示されており、血清型２ウイルスはシチメンチョウにおいて亜急性疾患を引き起こすに過ぎない。歴史的には、ＩＢＤＶ血清型１ウイルスは、現在は「古典的」ＩＢＤウイルスとして公知であるただ１つの型からなるものであった。その後、いわゆる「変異」ＩＢＤＶ株が出現した。ＩＢＤＶの古典的および変異株は、モノクローナル抗体のパネルを使用するウイルス中和試験により、またはＲＴ−ＰＣＲにより同定され、区別されうる［Ｗｕら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５１：５１５−５２６（２００７）］。よく知られている古典的ＩＢＤＶ株には、Ｄ７８、ファラガー（Ｆａｒａｇｈｅｒ）５２／７０およびＳＴＣが含まれ、一方、８９／０３は、よく知られた変異株である。多数の生または不活化ＩＢＤＶワクチン、例えば生ワクチン、例えばＮＯＢＩＬＩＳ（登録商標）Ｇｕｍｂｏｒｏ Ｄ７８（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）が商業的に入手可能である。

前記のとおり、ＨＶＴは、マレック病に対する有意な防御をもたらす抗原および組換えベクターの両方として作用しうるため、それは現在、ＩＬＴＶを防ぐＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴ（Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈにより販売されている）、ならびに共にＮＤＶを防ぐＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＮＤ−ＳＢ （Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈにより販売されている）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（登録商標）ＨＶＴ−ＮＤＶ（Ｃｅｖａにより販売されている）のような多価ワクチンのためのプラットフォームベクターとして使用されている。しかし、注目すべきことに、２以上の病原体に由来する抗原をコードする組換えＨＶＴを含む多価ワクチンは、そのようなワクチンが１５年以上前に示唆されていたとしても、これまでのところ、安定かつ効果的であると示されたことはない［例えば、Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８を参照されたい］。実際、Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴは、２つの外来遺伝子、すなわち、ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＬＴＶ ｇＩを含む唯一の組換えＨＶＴを含有し、これは、安全で有効で安定であることが証明されている。しかし、これらの２つの外来遺伝子は同一病原体に由来し、更に、それらは本来、重複しており、ＩＬＴＶに対する適切な免疫化を可能にするためには共発現される必要がある。

したがって、２以上の異なる病原体から外来抗原を有効に発現しうる安定な多価組換えＭＤＶ_ｎｐ構築物の明らかな利点、およびそれらを設計するための相当な努力にもかかわらず、これまでのところ、何も得られていない。したがって、２以上の異なる非ＭＤＶ１家禽ウイルス病原体に対して防御するための唯一の有効成分として多価ワクチンにおいて使用されうる安定な新規組換えＭＤＶ_ｎｐベクターを構築することにより、積み重なった産業上の失敗を克服することが明らかに必要とされている。

本明細書中のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であると自認するものと解釈されるべきではない。

発明の概括
したがって、本発明は、複数のウイルス病原体に由来する外来遺伝子を発現するベクターとして使用するための、安定かつ有効な新規多価組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶ_ｎｐ）を提供する。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは組換えマレック病ウイルス血清型２（ｒＭＤＶ２）である。ｒＭＤＶ_ｎｐ、例えばｒＨＶＴまたはｒＭＤＶ２は、病原性家禽ウイルスに対するワクチンにおいて使用されうる。

特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、ｒＭＤＶ_ｎｐゲノム内の第１非必須部位内に挿入された第１核酸、およびｒＭＤＶ_ｎｐゲノム内の第２非必須部位内に挿入された第２核酸を含む。第１核酸は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列と感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列との両方を含む。第２核酸は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、第１核酸は配列番号１６のヌクレオチド配列を含み、第２核酸は配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

ある実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位以外のｒＭＤＶ_ｎｐの非必須部位である。関連実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶ_ｎｐの第２非必須部位はＵＬ７／８部位である。更に他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶ_ｎｐの第２非必須部位はＵＳ１０部位である。更に他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶ_ｎｐの第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位および第２非必須部位は同一である。このタイプの特定の実施形態においては、第１核酸および第２核酸は実際には同一ＤＮＡ分子の一部として構築され、これはｒＭＤＶ_ｎｐの非必須部位内に挿入される。
そのようなＤＮＡ分子は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤタンパク質、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＩタンパク質およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆタンパク質をコードする発現カセットでありうる。このタイプの特定の実施形態においては、ＤＮＡ分子は配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

したがって、特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位および第２非必須部位はＵＳ２部位である。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位および第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。更に他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位および第２非必須部位はＵＬ７／８部位である。更に他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの第１非必須部位および第２非必須部位はＵＳ１０部位である。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質およびＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、外因性プロモーター、すなわち、ＭＤＶ_ｎｐにおいて天然で見出されないプロモーターの機能的制御下にありうる。ある実施形態においては、これらの３つのヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの機能的制御下にあり、すなわち、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列は第１プロモーターの機能的制御下にあり、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は第２プロモーターの機能的制御下にあり、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列は第３プロモーターの機能的制御下にあり、ここで、第１プロモーター、第２プロモーターおよび第３プロモーターは異なる。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターは内因性ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターである。ある実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターは内因性ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。このタイプの特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターは内因性ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターは内因性ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

ある実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質またはＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターの少なくとも１つは、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーターである。このタイプの特定の実施形態においては、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターはｈＣＭＶ ＩＥプロモーターである。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質またはＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターの少なくとも１つは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーターである。関連実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質またはＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターの少なくとも１つは、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーターである。特定の実施形態においては、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターはｈＣＭＶ ＩＥプロモーターであり、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターは内因性ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のプロモーターは内因性ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。

ある実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質およびＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入を含む本発明のｒＭＤＶ_ｎｐは、１以上の外因性転写ターミネーター配列をも含む。このタイプの特定の実施形態においては、転写ターミネーター配列は、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置する。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は１つの転写ターミネーター配列を共有しており、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、別の転写ターミネーターを有する。特定の実施形態においては、転写ターミネーター配列の少なくとも１つは合成ポリアデニル化配列を含む。関連実施形態においては、転写ターミネーター配列の少なくとも１つは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ）ポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

本発明はまた、５’から３’の方向に以下の順序で（ｉ）感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質のコード配列、（ｖ）ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、（ｖｉ）ＮＤＶ Ｆタンパク質のコード配列、および（ｖｉｉｉ）転写ターミネーター配列を含む組換え核酸を提供する。このタイプの特定の実施形態においては、組換え核酸は配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。

本発明は更に、本発明の組換え核酸がｒＭＤＶ_ｎｐの非必須挿入部位内に挿入されているｒＭＤＶ_ｎｐを提供する。このタイプの或る実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、５’から３’の方向に以下の順序で（ｉ）感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質のコード配列、（ｖ）ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、（ｖｉ）ＮＤＶ Ｆタンパク質のコード配列、および（ｖｉｉ）転写ターミネーター配列を含む組換え核酸を含む、非必須部位内のインサートを含む。特定の実施形態においては、介在ヌクレオチド配列、例えばリンカー、スペーサー配列および／または外来性コード配列も含まれうる。後記実施例１を参照されたい。特定の実施形態においては、ｒＨＶＴは、非必須部位内に挿入された配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。これらのタイプの特定の実施形態においては、非必須部位はＵＳ２部位である。他のそのような実施形態においては、非必須部位はＵＬ５４．５部位である。更に他のそのような実施形態においては、非必須部位はＵＬ７／８部位である。更に他のそのような実施形態においては、非必須部位はＵＳ１０部位である。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

本発明はまた、本発明のｒＭＤＶ_ｎｐの製造方法を提供する。ある実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を構築する。ついで異種核酸を本発明のｒＭＤＶ_ｎｐの非必須部位内に挿入する。ある実施形態においては、異種核酸は発現カセットである。このタイプの特定の実施形態においては、発現カセットは配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列とＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む第１異種核酸を構築し、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２異種核酸を構築する。第１異種核酸はｒＭＤＶ_ｎｐのＵＳ２部位内に挿入され、第２異種核酸はｒＭＤＶ_ｎｐの別の非必須部位内に挿入される。ある実施形態においては、そのような異種核酸は発現カセットである。このタイプの特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号１６のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの製造方法はｒＨＶＴの製造方法である。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐの製造方法はｒＭＤＶ２の製造方法である。

本発明は更に、本発明のいずれかのｒＭＤＶ_ｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。また、本発明は、本発明のそのようなワクチンおよび／または免疫原性組成物を投与することによる、ＩＬＴＶおよび／またはＮＤＶおよび／またはＭＤＶ１により引き起こされる疾患に対する家禽の防御を補助するための方法を提供する。特定の実施形態においては、そのような方法はニワトリの防御を補助する。このタイプの特定の実施形態においては、本発明のワクチンは皮下投与される。他の実施形態においては、本発明のワクチンは卵内投与される。

したがって、１つの態様においては、本発明は、本発明のｒＭＤＶ_ｎｐを含む安定で安全で有効な免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。本発明はまた、付与される免疫原性を改善し増大させるための追加的なＮＤＶ、ＩＬＴＶおよび／またはＭＤＶ抗原と更に組合された本発明の任意のｒＭＤＶ_ｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。また、本発明は、ＭＤＶ、ＩＬＴＶまたはＮＤＶ以外の病原体に関する抗原と更に組合された本発明の任意のｒＭＤＶ_ｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンをも提供する。このタイプの特定の実施形態においては、抗原は感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）抗原である。より詳細な実施形態においては、ＩＢＤＶ抗原は穏やかな生ＩＢＤＶである。ある実施形態においては、前記の穏やかな生ＩＢＤＶは変異ＩＢＤＶである。本発明はまた、そのようなワクチンおよび／または免疫原性組成物を家禽（例えば、ニワトリ）に投与することによる、ＩＬＴＶおよび／またはＮＤＶおよび／またはＭＤＶ１および／またはＩＢＤＶにより引き起こされる疾患に対する家禽の防御を補助するための方法を提供する。このタイプの特定の実施形態においては、本発明のワクチンは皮下投与される。他の実施形態においては、本発明のワクチンは卵内投与される。

ある実施形態においては、本発明の免疫原性および／またはワクチンは、組換え核酸のそのＵＳ２部位内への挿入として、５’から３’方向に、（ｉ）感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質のコード配列、（ｖ）ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、（ｖｉ）ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ Ｆ）のコード配列、および（ｖｉｉ）転写ターミネーター配列を含むｒＨＶＴを含む。このタイプの特定の実施形態においては、免疫原性組成物および／またはワクチンは、穏やかな生感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）を更に含む。ある実施形態においては、前記の穏やかな生ＩＢＤＶは変異ＩＢＤＶである。より詳細な実施形態においては、ＩＢＤＶは８９／０３である。このタイプの、より一層詳細な実施形態においては、組換え核酸は配列番号１７のヌクレオチド配列を有する。

本発明は、追加的ＮＤＶ、ＩＬＴＶおよび／またはＭＤＶ抗原ならびにＭＤＶ、ＩＬＴＶまたはＮＤＶ以外の病原体と組合された本発明の任意のｒＭＤＶ_ｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを更に提供する。

本発明のこれらの及び他の態様は、後記の図面および詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるであろう。

発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬＴＶおよびＮＤＶに由来する抗原をコードし発現する、特有の組換えＭＤＶ_ｎｐベクターを提供することにより、２以上の異なる家禽ウイルス病原体に対して防御しうる、そして、マレック病、ニューカッスル病および感染性喉頭気管炎ウイルスに対して防御しうる、外来抗原を含有するＭＤＶ_ｎｐベクターを構築可能とすることにより、過去の産業上の失敗を克服するものである。特定の実施形態においては、本発明のＭＤＶ_ｎｐは、ＩＬＴＶおよびＮＤＶのみに由来する外来抗原をコードし、発現し、そして、マレック病、ニューカッスル病および感染性喉頭気管炎ウイルスに対する防御を補助しうる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

本発明前には、ＵＳ１０領域内に挿入されたＨＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴベクターが既に構築されていた。このＨＶＴ−ＮＤＶベクターは、安定であること、十分なレベルの対応ＮＤＶ遺伝子産物、ＮＤＶ Ｆタンパク質を発現すること、ワクチン接種されたニワトリをビルレントＮＤＶチャレンジに対して防御することが示された。また、ＨＶＴ ＵＬ５４．５領域内に挿入されたＩＬＴＶ遺伝子のペアを含有するＨＶＴベクターが既に構築されていた。このＨＶＴ−ＩＬＴＶベクターは、安定であること、十分なレベルの対応ＩＬＴＶ遺伝子産物、ＩＬＴＶ ｇＩおよびｇＤタンパク質を発現すること、ワクチン接種されたニワトリをビルレントＩＬＴＶチャレンジウイルスに対して防御することが示された。

したがって、ＮＤＶおよびＩＬＴＶの両方に対して防御するための多価ＨＶＴ構築物は、前記の構築物の成功に基づいて、すなわち、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子をＵＳ１０部位内に挿入し、ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＩ遺伝子をＵＬ５４．５部位内に挿入することに基づいて設計された［図２における１３４８−３４Ｃを参照されたい］。しかし、意外なことに、組織培養におけるこの構築物の継代の後、組換えウイルスは、ＩＬＴＶｇＤ ＩＬＴＶｇＩおよびＮＤＶ Ｆタンパク質を発現するその能力を喪失した。これは幾つかの二重組換えｒＨＶＴ構築物に当てはまることが判明した。実際、これらの組換えウイルスは不安定であり、ワクチンとしての更なる開発に不適当であった。これらの知見は、ＮＤＶ Ｆタンパク質ならびにＩＬＴＶｇＤおよびＩＬＴＶｇＩタンパク質の両方を安定に発現しうる単一多価ｒＨＶＴベクターの設計が、既存情報から推定されうる簡単なプロセスではないことを示している。実際、そのような安定かつ有効な多価ｒＨＶＴベクターが仮にも可能であったならば、それらの設計は、用いられる挿入部位と挿入されるべき外来遺伝子との関係を少なくとも含む、予想不可能な複雑な相互作用を前提とする必要があった。これまでに、ｒＨＶＴ構築物のそのような設計は公知技術から容易に予測可能ではなかった。

したがって、本発明は、ＩＬＴＶ由来の２つの遺伝子とＮＤＶ由来の１つの遺伝子とが挿入されている組換えｒＭＤＶ_ｎｐベクターを提供する。本発明の特定の実施形態においては、３つの全ての遺伝子はＨＶＴゲノムのＵＳ２領域内に挿入された。このｒＨＶＴをニワトリまたはニワトリ卵にワクチン接種した際に、免疫化宿主の細胞は、挿入遺伝子によりコードされるタンパク質を発現した。更に、ｒＨＶＴにより発現されたＮＤＶおよびＩＬＴＶタンパク質は、ＮＤＶおよびＩＬＴＶにより引き起こされる疾患に対してワクチン接種ニワトリを防御する免疫応答を刺激した。したがって、そのようなｒＭＤＶ_ｎｐベクターは、ＮＤＶおよびＩＬＴＶの両方の感染に対する防御を付与するために使用されうる。これまでは、これらの２つのウイルスに対する防御のためには２つの別々のｒＨＶＴベクター（すなわち、一方はＩＬＴＶに対する防御のためのもの、そして他方はＮＤＶに対する防御のためのもの）が必要であった。

したがって、本発明は、ただひとつの組換えｒＭＤＶ_ｎｐを家禽および／または家禽卵に接種することによりＩＬＴＶおよびＮＤＶに対する同時防御をもたらすため、現在の方法と比較して有利である。特に、卵内に注射されうる体積には制限があるため、本発明は、追加的ワクチンが卵内経路で投与されることを可能にし、更に、２つのベクターではなくただ１つのみしか必要とされないため、本発明は製造コストを削減する。更に、これは、生ＩＢＤＶ、例えば株８９／０３のような追加的抗原がワクチンに配合されることを可能にし得る。

更に、本発明は、同一のワクチンおよび／または免疫原性組成物中に異なるｒＭＤ
Ｖ_ｎｐ構築物を含む実施形態を含む。このタイプの或る実施形態においては、ワクチンおよび／または免疫原性組成物は、ｒＭＤＶ２およびｒＨＶＴの両方を含み、それらのそれぞれは１以上の外来抗原をコードしている。実際、一方の構築物が他方の構築物と比べて有意に増殖し過ぎることを必然的に招く、２つのｒＨＶＴの組合せとは異なり、ｒＨＶＴとｒＭＤＶ２との組合せはそのような有意な過剰増殖を招かない。したがって、特定の実施形態においては、本発明のワクチンは、ＩＬＴＶｇＤタンパク質、ＩＬＴＶｇＩタンパク質およびＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするｒＨＶＴを、更にもう１つの家禽ウイルス抗原をコードするｒＭＤＶ２と共に含む。

本発明をより十分に理解するために、以下の定義を記載する。

説明の便宜を図るための単数形の用語の使用は、そのように限定されることを何ら意図するものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド」を含む組成物に対する言及は、そのようなポリペプチドの１以上に対する言及を含む。

本明細書中で用いる「非病原性マレック病ウイルス」または「ＭＤＶ_ｎｐ」または「ｎｐＭＤＶ」は、家禽における病原性をほとんど又は全く示さないＭＤＶ科ウイルスである。「ＭＤＶ_ｎｐ」なる語は、継代されている又は同様に操作されている天然に存在するＭＤＶを含むが、キメラウイルス、例えば新規トリヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）を生成するような、１つのＭＤＶ血清型のゲノムの特定の領域が異なるＭＤＶ血清型の対応領域により置換されているウイルス構築物を含まない。ある実施形態においては、ＭＤＶ_ｎｐはＨＶＴである。他の実施形態においては、ＭＤＶ_ｎｐはＭＤＶ２である。このタイプの特定の実施形態においては、ＭＤＶ２はＳＢ１である。

本明細書中で用いる、異種ヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）をコードするように遺伝的に修飾されているＭＤＶ_ｎｐは、「組換えＭＤＶ_ｎｐ」または「ｒＭＤＶ_ｎｐ」として定義される。

本明細書中で用いる「非必須部位」は、その部位内への異種ヌクレオチド配列の挿入が宿主細胞内でＭＤＶ_ｎｐが複製することを妨げない、ＭＤＶ_ｎｐゲノム内の部位である。
非必須部位は、それが存在する遺伝子により一般に特定される（例えば、ＵＳ２部位、または２つの遺伝子の間の領域、例えばＵＬ７／８部位）。

本明細書中で用いる「家禽」なる語は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを含みうる。

本明細書中で用いる「ワクチン」は、動物に投与されると野生型微生物の感染から生
じる臨床疾患からの防御を少なくとも補助するのに十分な程度の強力な免疫応答、すなわち、臨床疾患の予防を補助、および／または臨床疾患を予防、改善若しくは治療するのに十分な程度に強力な免疫応答を誘導する、典型的には例えば水含有液のような医薬上許容される担体と組合された１以上の抗原を含む、動物（ある実施形態においてはヒトを含むが、他の実施形態は特にヒト以外に対するものである）への適用に適した組成物である。

本明細書中で用いる「多価ワクチン」は、２以上の異なる抗原を含むワクチンである。
このタイプの特定の実施形態においては、多価ワクチンは２以上の異なる病原体に対して被投与者の免疫系を刺激する。

本明細書中で用いる「防御を補助（する）」なる語は、いずれかの感染徴候からの完全な防御を要するわけではない。例えば、「防御を補助（する）」は、防御が、チャレンジ後に根本的感染の症状が少なくとも軽減され、および／または症状を引き起こす根本的な細胞的、生理的もしくは生化学的な原因もしくはメカニズムの１以上が軽減および／もしくは排除されるのに十分であることを意味しうる。この文脈において用いる「軽減」は、感染の生理的状態だけでなく感染の分子的状態をも含む感染状態に関するものであると理解される。

本明細書中で用いる「アジュバント」なる語は、免疫事象のカスケードを促進または増強して、最終的に、より良好な免疫応答、すなわち、抗原に対する統合された身体的応答を招きうる物質である。アジュバントは、一般に、免疫応答が生じるのに要求されないが、この応答を促進または増強する。

本明細書中で用いる「医薬上許容される」なる語は、修飾される名詞が医薬品における使用に適していることを表すために形容詞的に用いられる。それが、例えば医薬ワクチンにおける賦形剤を示すために用いられる場合、それは、組成物のその他の成分と適合性であり意図される被投与者に不利な害を与えないものとして、賦形剤を特徴づける。

本明細書中で用いる「全身投与」は、特定の部位、例えば胃腸管（例えば、経口または直腸投与によるもの）および呼吸系（例えば、鼻腔内投与によるもの）に対してではなく体全体に影響を及ぼす、体の循環系（心血管およびリンパ系を含む）内への投与である。
全身投与は、例えば、筋組織内（筋肉内）、皮膚（皮内または経皮）、皮膚の下（皮下）、粘膜の下（粘膜下）、静脈の中（静脈内）などへの投与により行われうる。

本明細書中で用いる「非経口投与」なる語は、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入を含む。

「およそ」なる語は「約」なる語と互換的に用いられ、値が、示されている値の２５％以内であることを意味し、すなわち、「およそ」１００アミノ酸残基を含有するペプチドは７５〜１２５アミノ酸残基を含有しうる。

本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる語は「タンパク質」および「ペプチド」なる語と互換的に用いられ、ペプチド結合により連結された２以上のアミノ酸を含む重合体を意味する。本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる語は有意な断片またはセグメントを含み、少なくとも約８アミノ酸、一般には少なくとも約１２アミノ酸、典型的には少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、そして特に好ましい実施形態においては、少なくとも約３０アミノ酸またはそれ以上（例えば、３５、４０、４５、５０アミノ酸など）のアミノ酸残基の伸長を含む。そのような断片は、全ての実用的な組合せにおける実質的に全ての位置で出発および／または終止する末端、例えば残基１、２、３などで出発し、例えば１５５、１５４、１５３などで終止する末端を有しうる。

所望により、ポリペプチドは、遺伝子により又はｍＲＮＡによりコードされる或るアミノ酸残基を欠くことが可能である。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、タンパク質から切断され最終的タンパク質の一部とはなり得ないポリペプチドのＮ末端上におけるアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードしうる。

特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する本明細書中で用いる「抗原断片」なる語は、抗原性であり、すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用しうる、そのタンパク質の断片（完全長タンパク質から単一アミノ酸を欠いているに過ぎない大きな断片を含む）である。例えば、ＮＤＶ融合タンパク質の抗原断片は、抗原性の、その融合タンパク質の断片であ
る。好ましくは、本発明の抗原断片は抗体および／またはＴ細胞受容体認識に関して免疫優性である。

本明細書中で用いるアミノ酸配列がもう１つのアミノ酸配列に対して１００％「相同」であるのは、それらの２つのアミノ酸配列が同一であり、および／または後記の中性もしくは保存的置換のみにより異なる場合である。したがって、アミノ酸配列がもう１つのアミノ酸配列に対して約８０％「相同」であるのは、それらの２つのアミノ酸配列の約８０％が同一であり、および／または中性もしくは保存的置換のみにより異なる場合である。

配列内の残基が、しばしば、機能的に等価なアミノ酸残基により置換されて、保存的アミノ酸置換が生じうる。そのような変化は、本明細書中で用いる「保存的置換」なる語が意味するものである。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基は、類似した極性のもう１つのアミノ酸により置換されて、機能的等価体として作用し、サイレント変化が生じうる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により決定される見掛け分子量に影響を及ぼさないと予想されるであろう。

特に好ましい保存的置換としては、正電荷が維持されうる、ＡｒｇからＬｙｓへの置換およびその逆の置換；負電荷が維持されうる、ＡｓｐからＧｌｕへの置換およびその逆の置換；遊離−ＯＨが維持されうる、ＴｈｒからＳｅｒへの置換；ならびに遊離ＮＨ_２が維持されうる、ＡｓｎからＧｌｎへの置換が挙げられる。アミノ酸は以下の類似基においても置換可能である：（１）プロリン、アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニン；（２）グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸；（３）ヒスチジン、リジンおよびアルギニン；（４）システイン；（５）バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン；ならびに（６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。

関連実施形態においては、２つの高度に相同なＤＮＡ配列は、それら自身の相同性により又はそれらがコードするアミノ酸の相同性により特定されうる。そのような配列比較は、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウェアを使用して行われうる。特定の実施形態においては、２つの高度に相同なＤＮＡ配列は、約８０％の同一性、より好ましくは約９０％の同一性、より一層好ましくは約９５％の同一性を有するアミノ酸をコードしている。より詳細には、２つの高度に相同なアミノ酸配列は約８０％の同一性、より一層好ましくは約９０％の同一性、より一層好ましくは約９５％の同一性を有する。

本明細書中で用いる、タンパク質およびＤＮＡ配列の同一性（％）は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から商業的に入手可能なＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖ９およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムのようなソフトウェアをアライメントデフォルトパラメータおよび同一性用デフォルトパラメータで使用して決定されうる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣｌｕｓｔａｌＷは例えばＥＭＢＬＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からＤｏｓ、ＭａｃｉｎｔｏｓｈおよびＵｎｉｘプラットフォームに無料でダウンロード可能である。このダウンロードリンクはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において見出される。これらの及び他の入手可能なプログラムは、同じ又は類似デフォルトパラメータを使用して、配列類似性を決定するためにも使用されうる。

本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」または「核酸」または「核酸分子」なる語は互換的に用いられ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび更には合成ＤＮＡ配列（これらに限定されるものではない）を含むヌクレオチドを含む分子を示す。これらの語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの当技術分野で公知の塩基類似体のいずれかを含む核酸分子をも含むことが意図される。

核酸「（を）コード（する）配列」または特定のタンパク質もしくはペプチドを「コードする配列」は、適当な調節要素の制御下に配置された場合にインビトロまたはインビボでポリペプチドに転写および翻訳されるヌクレオチド配列である。

コード配列の境界は５’末端の開始コドンおよび３’末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、トリ）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列および更には合成ＤＮＡ配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。転写終結配列はコード配列の３’側に位置しうる。

「機能的に連結」は、そのように記載されている成分がそれらの通常の機能を果たすように配置されている、要素の配置を意味する。したがって、コード配列に機能的に連結されている制御要素は、コード配列の発現を引き起こしうる。制御要素は、それがコード配列の発現を導くように機能する限り、コード配列に連続している必要はない。したがって、例えば、介在している翻訳されないが転写される配列がプロモーターとコード配列との間に存在することが可能であり、プロモーターはコード配列に「機能的に連結」されていると尚もみなされうる。

本明細書中で用いる「転写ターミネーター配列」なる語は「ポリアデニル化調節要素」と互換的に用いられ、一般にＤＮＡコード領域の下流に存在し、そのＤＮＡコード配列の転写の完全な終結に要求されうる配列である。

本明細書中で用いる「発現カセット」は、プロモーターおよびそのプロモーターに機能的に連結された異種コード配列を少なくとも含む組換え核酸である。多数のそのような実施形態においては、発現カセットは転写終結配列を更に含む。したがって、ｒＭＤＶ_ｎｐゲノムの非必須部位内への発現カセットの挿入は、ｒＭＤＶ_ｎｐによる異種コード配列の発現をもたらしうる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

本明細書中で用いる「異種ヌクレオチド配列」は、天然では形成されない核酸を得るために組換え法により本発明のヌクレオチド配列に付加されるヌクレオチド配列である。特定の実施形態においては、本発明の「異種ヌクレオチド配列」は、タンパク質抗原、例えばＮＤＶ Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質またはＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードしうる。異種ヌクレオチド配列は、融合タンパク質（例えばキメラ）をもコードしうる。また、異種ヌクレオチド配列は、調節および／または構造特性を含有するペプチドおよび／またはタンパク質をコードしうる。他のそのような実施形態においては、異種ヌクレオチド配列は、組換え核酸が発現された後、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードしうる。更にもう１つの実施形態においては、異種ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能しうる。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード配列を含みうる。

本発明の抗原をコードする核酸の、ｒＭＤＶ_ｎｐベクター内への挿入は、核酸とベクターとの両方の末端が互換性の制限部位を含む場合に容易に達成される。これが行われ得ない場合には、制限エンドヌクレアーゼ切断により生じる一本鎖核酸突出（例えば、ＤＮＡ突出）を再消化して平滑末端を得ることによりヌクレオチド配列および／またはベクターの末端を修飾すること、あるいは一本鎖末端を適当なポリメラーゼで埋めることにより同じ結果を得ること、が必要かもしれない。あるいは、所望の部位は、例えば、ヌクレオチド配列（リンカー）を末端上に連結することにより生じうる。そのようなリンカーは、所望の制限部位を定める特異的オリゴヌクレオチド配列を含みうる。制限部位は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによっても生成されうる［例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８）を参照されたい］。切断ベクターおよびＤＮＡ断片は、必要に応じてホモポリマー尾部接合によっても修飾されうる。

タンパク質抗原およびタンパク質抗原をコードする核酸
ＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子は、４８，４７７ダルトンの分子量を有する４３４アミノ酸長の糖タンパク質をコードしているようだが、３７７アミノ酸残基のみを含むＩＬＴＶ ｇＤタンパク質を与える下流開始コドンが実際の開始コドンであると示唆している者もいる［Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １２：１０４−１１６（１９９６）］。ＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子は、３９，７５３ダルトンの分子量を有する３６２アミノ酸長の糖タンパク質をコードしている［参照により本明細書に組み入れるＵ．Ｓ．６，８７５，８５６］。
ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＬＴＶ ｇＩの天然および／または実験室由来変異体をコードする核酸が、ここに例示されているものの代わりに使用されうる。

本発明の特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号２のアミノ酸配列またはその抗原断片を含むＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

本発明の或る実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号４のアミノ酸配列またはその抗原断片を含むＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質は、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

ＮＤＶ Ｆタンパク質遺伝子は、いわゆる「融合」タンパク質をコードしている。本発明により例示される１つのＮＤＶ Ｆタンパク質遺伝子は、一般的な長潜伏期性ＮＤＶワクチン株であるＮＤＶクローン３０から誘導された。Ｆタンパク質遺伝子配列自体は、これらの種々のＮＤＶ病理型において高度に保存されているので、Ｆタンパク質遺伝子の天然および／または実験室由来変異体をコードする核酸は、長潜伏期性、亜病原性または短潜伏期性ＮＤＶのいずれからも同等に適用可能であろう。本発明の特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号６のアミノ酸配列またはその抗原断片を含むＮＤＶ融合タンパク質をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＮＤＦ Ｆタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＮＤＶ融合タンパク質は、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる。本発明の或る実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号８のアミノ酸配列またはその抗原断片を含むＮＤＶ融合タンパク質をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐは、配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＮＤＦ Ｆタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＮＤＶ融合タンパク質は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶ_ｎｐはｒＭＤＶ２である。

プロモーターおよびポリアデニル化調節要素
本発明のｒＭＤＶ_ｎｐにおけるタンパク質抗原またはその抗原断片をコードする異種遺伝子の発現を導くために、多数の代替的プロモーターが使用されうる。具体例には、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーター［ＷＯ ８７／０４４６３を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター、ＩＬＴＶ ｇＤプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター［例えば、Ｕ．Ｓ．６，１８３，７５３ Ｂ１を参照されたい］、ヒトサイトメガロウイルス最初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）遺伝子プロモーター［Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５；Ｕ．Ｓ．５，９８０，９０６］、およびニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター［ＥＰ １ ２９８ １３９ Ｂ１］が含まれる。本明細書中で例示される、より具体的な例には、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むタウネ（Ｔｏｗｎｅ）株ｈＣＭＶ ＩＥプロモーター、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むトランケート化ｈＣＭＶ ＩＥプロモーター、配列番号９のヌクレオチド配列を含むＩＬＴＶ ｇＤプロモーター、および配列番号１０のヌクレオチド配列を含むＩＬＴＶ ｇＩプロモーターが含まれる。

ＤＮＡコード領域の下流のポリアデニル化調節要素の含有は、しばしば、コードＤＮＡ配列の転写を終結させるために必要である。したがって、多数の遺伝子は、それらのコード配列の下流末端にポリアデニル化調節要素を含む。多数のそのような調節要素が特定されており、本発明のｒＭＤＶ_ｎｐにおいて使用されうる。本明細書中で例示されるポリアデニル化調節要素の具体例には、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む合成ポリアデニル化シグナル、および配列番号１４のヌクレオチド配列を含むＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルが含まれる。

ワクチンおよび免疫原性組成物
本発明は、組換えＭＤＶ_ｎｐの使用、ＭＤＶ_ｎｐを構築するために使用される核酸分子、もしくはそれを増殖させるための宿主細胞、またはそれらのいずれかの組合せに関するものであり、それらは全て、本発明においては、家禽用ワクチンの製造のためのものである。したがって、本発明は、本発明の多価組換えＭＤＶ_ｎｐを含むワクチンおよび／または免疫原性組成物を提供する。そのようなワクチンは、ニューカッスル病および／またはマレック病および／またはＩＬＴＶ感染に関連した疾患の予防を補助するために、および／または予防するために使用されうる。本発明のワクチンは予防的および／または治療的治療のために使用されることが可能であり、したがって、感染および／またはその臨床疾患症状の定着および／または進行を妨げうる。

本発明の組換えＭＤＶ_ｎｐは、当分野において現在実施されている多数の手段により増殖されうる。例えば、本発明の組換えＭＤＶ_ｎｐは、初代ニワトリ細胞のインビトロ培養の使用により増殖されうる。例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を使用した後記実施例を参照されたい。ＣＥＦはニワトリ胚のトリプシン処理により調製されうる。また、ＣＥＦを単層内でプレーティングし、ついでＭＤＶ_ｎｐに感染させることが可能である。
この特定の方法は工業規模の製造に容易に大規模化されうる。

したがって、本発明のもう１つの態様は、本発明の組換えＭＤＶ_ｎｐを宿主細胞に感染させ、感染宿主細胞を回収し、ついで回収感染宿主細胞を医薬上許容される担体と混合する工程を含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。感染、培養および回収のための適当な方法は当技術分野でよく知られており、本明細書に記載および例示されている。

典型的には、感染宿主細胞を無傷なままで回収して、組換えＭＤＶ_ｎｐをその細胞結合形態で得る。これらの細胞を適当な担体組成物中に取り込ませて、貯蔵および凍結のための安定化をもたらすことが可能である。感染細胞をガラスアンプル内に充填することが可能であり、アンプルを密封し、凍結させ、液体窒素中で貯蔵する。したがって、本発明の或る実施形態においては、本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物は凍結保存され、したがって、凍結感染細胞を保護するための凍結保護剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。

あるいは、組換えＭＤＶ_ｎｐが組換えＨＶＴである場合には、それを、例えば、培養終了時の超音波処理によりその宿主細胞から単離し、ついで安定剤中に取り込ませ、安定な貯蔵のために凍結乾燥させ、あるいは貯蔵のために液体体積の減少に付し、ついで投与前または投与時に液体希釈剤中で再構成することが可能である。そのような再構成は、例えば、ワクチン等級の水を使用して達成されうる。ある実施形態においては、多価ワクチンの凍結乾燥部分は１以上の抗原を含むことが可能であり、希釈剤は１以上の他の抗原を含むことが可能である。

特定の実施形態においては、本発明のワクチン（またはその一部）は、例えば、ＷＯ ２０１０／１２５０８４（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている方法により製造される錠剤および／またはスフェアとしての凍結乾燥形態でありうる。特に、そのような急速崩壊性錠剤／スフェアの製造方法を記載している、ＷＯ２０１０／１２５０８４の１５ページ２８行〜２７ページ９行の実施例を参照されたい。
ワクチンの全身投与を可能にするために、そのような凍結乾燥形態は希釈剤に容易に溶解されうる。

ワクチンおよび免疫原性組成物は、生理的に許容されるバッファーおよび生理食塩水など、ならびに医薬上許容されるアジュバントを含みうるが、必ずしも含む必要はない。アジュバントは、免疫応答を改善し、および／またはワクチン製剤の安定性を増強するのに有用でありうる。アジュバントは典型的には免疫系の非特異的刺激因子として記載されているが、免疫系の特異的部分を標的化するためにも有用でありうる。この活性を有する１以上の化合物がワクチンに加えられうる。したがって、本発明の個々のワクチンは、アジュバントを更に含みうる。アジュバントとして使用されうる化合物の例には、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム）、代謝可能なおよび代謝不可能な油、鉱油、例えば鉱油溶液中のマンニドオレアート誘導体（例えば、Ｓｅｐｐｉｃ ＳＡ，ＦｒａｎｃｅのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ７０）、および軽油、例えばＤＲＡＫＥＯＬ ６ＶＲ、ブロック重合体、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、ビタミン類およびミネラル類（限定されるものではないが、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２を含む）ならびにＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

免疫刺激物質と称されることもある他の適当なアジュバントには、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、単球、リンパ球の細胞培養からの上清、リンパ器官からの細胞、植物、細菌または寄生生物からの細胞調製物および／または抽出物（スタフィロコッカス・アウレウスまたはリポ多糖調製物）またはマイトジェンが含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、アジュバントは本発明の抗原と同時に投与される。しかし、それに加えて又はその代わりに、アジュバントはワクチン接種前の２週間以内および／またはワクチン接種後の或る期間にわたって（すなわち、該抗原、例えば本発明の組換えＭＤＶ_ｎｐが組織内に存続する限り）投与されうる。

本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物は、任意の経路により、例えば、卵内、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射を含む非経口投与により、切皮投与により、経口投与により、またはそれらのいずれかの組合せにより投与されうる。更に、本発明の多価組換えＭＤＶ_ｎｐは、付与される免疫原性を改善し増強するために追加的なＮＤＶ、ＩＬＴＶおよび／またはＭＤＶ抗原と、および／または他の病原体に対する免疫防御を得るために他の病原体の抗原と、用いられ、及び／または組み合されうる。これらの追加的抗原は、本発明のワクチンの安全性、安定性および有効性に負の影響を及ぼさないかぎり、生もしくは不活化全微生物、他の組換えベクター、細胞ホモジネート、抽出物、タンパク質またはいずれかの他のそのような誘導体でありうる。

本発明の多価組換えＭＤＶ_ｎｐと追加的ＭＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶ抗原との組合せは、ＭＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの非常にビルレントな野外株が例えば特定の地理的領域内に広がっている場合に有利でありうる。これに関して、本発明の多価組換えＭＤＶ_ｎｐとＭＤＶ１、ＭＤＶ２またはＨＶＴとの組合せは、リスペンス（Ｒｉｓｐｅｎｓ）（ＭＤＶ１）株、ＳＢ１（ＭＤＶ２）株、ＦＣ−１２６（ＨＶＴ）株および／またはＰＢ１（ＨＶＴ）株を含む。ＮＤＶに対する応答を改善するために、多価組換えＭＤＶ_ｎｐは、ＮＤＶワクチン株、例えば穏やかな生ＮＤＶワクチン株Ｃ２と組合されうる。

本発明の多価組換えＭＤＶ_ｎｐと共に抗原として使用されうる他の微生物の例には、以下のものが含まれる：（ｉ）ウイルス、例えば感染性気管支炎ウイルス、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、鳩痘ウイルス、禽類白血症ウイルス、トリニューモウイルスおよびレオウイルス、（ｉｉ）細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃ．）、オルニトバクテリウム・リノトラケアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレカ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペロスリックス・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス属種（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ ｓｐｅｃ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃ．）およびクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃ．）（ｉｉｉ）寄生生物、例えばエイメリア属種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｅｃ．）、ならびに（ｉｖ）真菌、例えばアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）。本発明の特定の実施形態においては、本発明の組換えＭＤＶ_ｎｐは、穏やかな生ＩＢＤＶワクチン株、例えばＤ７８（クローン化中間株）、ＰＢＧ９８、Ｃｕ−１、ＳＴ−１２（中間株）または８９−０３（生デラウェア変異株）と多価ワクチンにおいて組合されうる。そのような株の多くは市販ワクチンにおいて使用されている。

組合せワクチン（混合ワクチン）は、本発明の組換えＭＤＶ_ｎｐをウイルスまたは細菌または真菌または寄生生物または宿主細胞あるいはこれらのいずれか及び／又は全ての混合物の調製物と組み合わせることを含む種々の方法で製造されうる。特定の実施形態においては、そのような組合せワクチンの成分は、別々に簡便に製造され、ついで組み合わされ、同一ワクチン容器内に充填される。

前記のとおり、本発明のワクチンは、非常に若い齢での又は卵内での１回の接種により、家禽における複数の疾患に対する安全かつ有効な免疫防御をもたらすために有利に使用されうる。あるいは、家禽ワクチンのいずれの当業者にも明らかなとおり、前記の組合せは、本発明の多価組換えＭＤＶ_ｎｐおよび追加的抗原が同時に適用されないワクチン接種計画をも含みうるであろう。例えば、組換えＭＤＶ_ｎｐは卵内に適用可能であり、ＮＤＶ Ｃ２および／またはＩＢＤＶ株（例えば、８９／０３）は、後の時間／日に適用可能であろう。

したがって、本発明のワクチンは単一用量または複数用量でトリ対象に投与されうる。
例えば、本発明のワクチンは、孵化日および／または第１６〜１８日（胚日）ＥＤの卵内に適用されうる。複数用量が適用される場合、それらは、免疫学的に有効な量で、ワクチンの製剤に適した方法および時間で、同時または連続的に投与されうる。したがって、本発明のワクチンは初回ワクチン接種として有効に働くことが可能であり、初回ワクチン接種の後、同一ワクチンの又は異なるワクチン製剤（例えば、古典的な不活化アジュバント化全ウイルスワクチン）での促進ワクチン接種が行われ、免疫増強がもたらされうる。

本発明のワクチンの体積／用量は、意図される適用経路に従い最適化され；卵内接種は一般に０．０５〜０．５ｍｌ／卵の体積で適用され、非経口注射は一般に０．１〜１ｍｌ／トリの体積で行われる。いずれの場合にも、ワクチン用量体積の最適化は当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。

図１は、それぞれ直線により示され、反復領域により側面が接するユニーク長（ＵＬ）領域およびユニーク短（ＵＳ）領域からなるＨＶＴ（ＦＣ１２６）ゲノムの概要図である。ゲノム概要図の下には、ＢａｍＨＩ制限酵素消化断片の位置をそれらのゲノム位置に対して示す棒線、および各断片に関連した名称が示されている（最大断片は文字「Ａ」で示されており、次に大きな断片は文字「Ｂ」で示されている、などである）。ＨＶＴ（ＦＣ１２６）またはｒＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴウイルスを再構築するために用いられる各クローン化サブゲノム断片の位置（およびそれらの名称）がＢａｍＨＩ制限地図の下に示されている。アステリスク（^＊）は以下の挿入部位の位置を示す：１１９６−０５．１におけるＵＬ７／ＵＬ８；１３３２−２９．４におけるＵＬ５４．５；１３３２−４７．Ａ２または１３１７−１５．１−１におけるＵＳ２。 図２は、ＨＶＴバックボーン内に挿入された遺伝子およびそれらの挿入の部位を示す６つの異なる組換えＨＶＴの概要図である。Ｉｎｎｏｖａｘ−ＬＴは、ｒＨＶＴのＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子をコードする発現カセットを含むｒＨＶＴである。Ｉｎｎｏｖａｘ−ＮＤは、ｒＨＶＴのＵＳ１０部位内に挿入されたＮＤＶ融合遺伝子をコードする発現カセットを含むｒＨＶＴである。１３４８−３４Ｃは、ｒＨＶＴのＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子をコードする発現カセット、ならびにｒＨＶＴのＵＳ１０部位内に挿入されたＮＤＶ融合遺伝子をコードする発現カセットの両方を含むｒＨＶＴである。１３３２−６２Ｅは、ｒＨＶＴのＵＳ２部位内に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤ、ＩＬＴＶ ｇＩおよびＮＤＶ融合遺伝子をコードする発現カセットを含むｒＨＶＴである。１３１７−４６は、ＵＳ２部位内に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＬＴＶ ｇＩ遺伝子をコードする発現カセット、ならびにｒＨＶＴのＵＬ７とＵＬ８との間（すなわち、ＵＬ７／８部位）に挿入されたＮＤＶ融合遺伝子をコードする発現カセットの両方を含むｒＨＶＴである。１３３２−７０Ｂは、ｒＨＶＴのＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤ、ＩＬＴＶ ｇＩおよびＮＤＶ融合遺伝子をコードする発現カセットを含むｒＨＶＴである。

本発明は、本発明の典型例として記載されている以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解されうる。以下の実施例は、本発明の実施形態をより十分に例示するために記載されており、いかなる点においても、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例
実施例１
組換えＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶウイルスベクターの構築
クローン化重複サブゲノム断片のコトランスフェクションによりヘルペスウイルスが生じうることは仮性狂犬病ウイルスに関して最初に示された［ｖａｎ Ｚｉｊｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２：２１９１−２１９５（１９８８）］。この方法は後に、組換えＨＶＴベクターを構築するために用いられ［組換えＨＶＴベクターの構築について開示されている方法に関して参照により本明細書に組み入れるＵ．Ｓ．５，８５３，７３３を参照されたい］、本発明の組換えＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶベクターを構築するために用いられた。この方法においては、全ＨＶＴゲノムを、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて構築された幾つかの大きな重複サブゲノム断片として、細菌ベクター内にクローニングする［Ｍａｎｉａｔｉｓら，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）］。ＨＶＴ株ＦＣ１２６コスミドライブラリーは、コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；現在は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））内にクローニングされた、せん断されたウイルスＤＮＡから誘導した。加えて、幾つかの大きなゲノムＤＮＡ断片を酵素ＢａｍＨＩでの制限消化により単離し、ｐＷＥ１５またはプラスミドベクターｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングした。Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３に記載されているとおり、これらの断片のニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞内へのコトランスフェクションは、断片の重複領域にわたる相同組換えにより生じるＨＶＴゲノムの再生をもたらす。コトランスフェクション前にサブゲノム断片の１以上への挿入を直接的に操作すると、この方法は、挿入を含有する高頻度のウイルスを与える。５個の重複サブゲノムクローンが、ＦＣ１２６ ＨＶＴを得るために必要であり、全てのＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ組換えウイルスの作製の基礎となった。

ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−６２．Ｅ１の構築：ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−６２．Ｅ１に関するコスミド再生を、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３に記載されているのと実質的に同じ方法で行った［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本出願において、図１に、少なくとも部分的に再描写されている］。ＦＣ１２６ ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によりカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、およびこれらの２つと重複しておりＵＳ２遺伝子座内にＩＬＴＶ／ＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３３２−４７．Ａ２）］から得た。

７個の線状化構築物（３個のコスミドおよび４個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ_２トランスフェクション法を用いてＣＥＦ内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを一度にプラーク精製した。

ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−７０．Ｂ１の構築：ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−７０．Ｂ１に関するコスミド再生を、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３に記載されているのと実質的に同じ方法で行った［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本出願において、図１に、少なくとも部分的に再描写されている］。ＦＣ１２６ ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号４０７−３２．１Ｃ１によりカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、およびこれらの２つと重複しておりＵＬ５４．５遺伝子座内にＩＬＴＶ／ＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３３２−２９．４）］から得た。

７個の線状化構築物（４個のコスミドおよび３個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ_２トランスフェクション法を用いてＣＥＦ内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを一度にプラーク精製した。

ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３１７−４６．Ａ１−１の構築：ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３１７−４６．Ａ１−１に関するコスミド再生を、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３に記載されているのと実質的に同じ方法で行った［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本出願において、図１に、少なくとも部分的に再描写されている］。ＦＣ１２６ ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によりカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、およびこれらの２つと重複しており、ＵＳ２遺伝子座内に挿入されたＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３１７−１５．１−１）］から得た。ＦＣ１２６ ＨＶＴゲノム内の第２の部位内への挿入は、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるＵＬ領域コスミド番号４０７−３２．２Ｃ３を、ＨＶＴ ＵＬ７およびＵＬ８遺伝子間に挿入されたＮＤＶ発現カセットを含有する導入コスミド（１１９６−０５．１）で置換することにより達成された。

７個の構築物（１個の未切断コスミド（１１９６−０５．１）、残りの２個の線状化コスミドおよび４個の線状化プラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ_２トランスフェクション法を用いてＣＥＦ内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを一度にプラーク精製した。

ＦＣ１２６ ＨＶＴを作製するためのサブゲノム断片の説明：
サブゲノムクローン４０７−３２．２Ｃ３
コスミド４０７−３２．２Ｃ３は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約４０，１７０塩基対の領域を含有する［左末端−ｐｏｓ．３９，７５４；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］。この領域は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｆ’、Ｌ、Ｐ、Ｎ１、Ｅ、Ｄ、および２，０９２塩基対の断片Ｂを含む。

サブゲノムクローン１７２−０７．ＢＡ２
プラスミド１７２−０７．ＢＡ２は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの２５，９３１塩基対の領域を含有する。それは、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ Ｂ断片［３７，６６３−６３，５９３位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングすることにより構築された。

サブゲノムクローン４０７−３２．５Ｇ６
コスミド４０７−３２．５Ｇ６は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの３９，４０４塩基対の領域を含有する［６１，８５２−１０１，２５５位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］。この領域は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｋ１、Ｍ、Ｋ２、および１，７４２塩基対の断片Ｂ、および３，８８０塩基対の断片Ｊを含む。

サブゲノムクローン４０７−３２．１Ｃ１
コスミド４０７−３２．１Ｃ１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの３７，４４４塩基対の領域を含有する［９６，０９５−１３３，５３８位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］。この領域は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｊ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｏ、および１，２８１塩基対の断片Ｋ２、および６，６９１塩基対の断片Ａを含む。

サブゲノムクローン３７８−５０
プラスミド３７８−５０は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの２８，８９７塩基対の領域を含有する［Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８を参照されたい；本出願において、図１に、少なくとも部分的に再描写されている］。それは、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ Ａ断片［１２６８４８−１５５７４４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］をコスミドｐＷＥ１５内にクローニングすることにより構築された。

ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−６２．Ｅ１を作製するための追加的な挿入断片：サブゲノムクローン１３３２−４７．Ａ２
挿入プラスミド１３３２−４７．Ａ２は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングされたＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１３６８８０−１４４１９０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲； Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４および１２５の間］内に以下の２つの要素が挿入されている：糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１−１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４−９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２−１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］；ならびにＨＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＮＤＶ、クローン３０株、融合遺伝子（Ｆ）およびそれに続く合成ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット。ＩＬＴＶ ｇＤ、ＩＬＴＶ ｇＩおよびＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。

サブゲノムクローンｐＳＹ６４０
プラスミドｐＳＹ６４０は、ＢａｍＨＩ断片Ａから誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１３，６００塩基対の領域［１２６８４８−１４０５４０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作製するために、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から開始しＢａｍＨＩ Ａ断片の末端まで続くＵＳ２遺伝子の上流に位置するＤＮＡの領域を、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングした。

サブゲノムクローン５５６−６０．６
プラスミド５５６−６０．６は、ＢａｍＨＩ断片Ａから誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１２，５００塩基対の領域［約１４３３００−１５５７４４位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作製するために、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から開始しＢａｍＨＩ Ａ断片の末端まで続くＵＳ２遺伝子の下流に位置するＤＮＡの領域をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングし、ついでエキソヌクレアーゼで処理して、Ｓｔｕ部位から〜１５０ｂｐを「破砕」し、ｐＢＲ３２２プラスミドベクター内に再クローニングした。

ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−７０．Ｂ１を作製するための追加的な挿入断片：サブゲノムクローン１３３２−２９．４
プラスミド１３３２−２９．４は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩ欠失体）内にクローニングされた、ユニーク長領域から誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの８，６３６塩基対の領域［１０９４８９−１１８１２４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。それはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、および１３３７塩基対の断片Ｇ、および１１７７塩基対の断片Ｆを含む。ＨＶＴ ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１および２２の間］内に、以下の２つの要素が挿入されている：糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１−１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４−９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２−１４０９４位；Ｗｉｌｄら，前掲；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］；ならびにＨＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＮＤＶ、クローン３０株、融合遺伝子（Ｆ）およびそれに続く合成ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット。ＩＬＴＶ ｇＤ、ＩＬＴＶ ｇＩおよびＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＶＴ ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆方向に転写される。

サブゲノムクローン６７２−０１．Ａ４０
プラスミド６７２−０１．Ａ４０は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体内にクローニングされた、ユニーク長領域から誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの１４，７３１塩基対の領域［９６０９５−１１０８２５；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｇ、Ｊ、および１２８１塩基対のＫ２を含む。

サブゲノムクローン６７２−０７．Ｃ４０
プラスミド６７２−０７．Ｃ４０は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体内にクローニングされた、ユニーク長領域から誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの１２，５２０塩基対の領域［１１６９４８−１２９４６７位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｆ、Ｏおよび２６２０塩基対のＡを含む。

ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３１７−４６．Ａ１−１を作製するための追加的な挿入断片：
サブゲノムクローン１１９６−０５．１
コスミド１１９６−０５．１は、コスミドｐＷＥ１５内にクローニングされた、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約４０，１７０塩基対の領域［左末端−３９，７５４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ断片Ｆ’、Ｌ、Ｐ、Ｎ１、Ｅ、Ｄおよび２，０９２塩基対の断片Ｂを含む。また、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびＨＳＶ ＴＫポリアデニル化調節要素を含む、ＮＤＶ融合（Ｆ）遺伝子をコードする発現カセットを、ＢａｍＨｉ断片Ｅ［２００３０−２００３５；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］内のＨＶＴ ＵＬ７およびＵＬ８遺伝子間の非コード領域内に挿入した。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＶＴ ＵＬ７と同じ方向に転写される。

サブゲノムクローン１３１７−１５．１−１
プラスミド１３１７−１５．１−１は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングされた、ＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１３６８８０−１４４１９０；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。また、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１−１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４−９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２−１４０９４位；Ｗｉｌｄら，前掲；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］を、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４および１２５の間］内にクローニングした。ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＩ遺伝子は、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。

サブゲノムクローンｐＳＹ６４０
プラスミドｐＳＹ６４０は、ＢａｍＨＩ断片Ａから誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１３，６００塩基対の領域［約１２６８４８−１４０５４０；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作製するために、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から開始しＢａｍＨＩ Ａ断片の末端まで続くＵＳ２遺伝子の上流に位置するＤＮＡの領域をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングした。

サブゲノムクローン５５６−６０．６
プラスミド５５６−６０．６は、ＢａｍＨＩ断片Ａから誘導されたゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１２，５００塩基対の領域［約１４３３００−１５５７４４位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作製するために、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から開始しＢａｍＨＩ Ａ断片の末端まで続くＵＳ２遺伝子の下流に位置するＤＮＡの領域をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内にクローニングし、ついでエキソヌクレアーゼで処理して、Ｓｔｕ部位から〜１５０ｂｐを「破砕」し、ｐＢＲ３２２プラスミドベクター内に再クローニングした。

標準的なＣａＣｌ _２ トランスフェクション法：二次ＣＥＦを６ウェル培養プレート上に播き、３８℃、５％ ＣＯ_２で２４時間インキュベートし、コンフルエントな単層が形成する。各ウェルに関して、総量０．２５μｇ ＤＮＡのコスミドおよびプラスミドをヘペスバッファー中で混合し、沈殿が今にも生じようとするまで１２５ｍＭ ＣａＣｌ_２を滴下した。この混合物を該ＣＥＦ細胞単層に加え、２〜３時間インキュベートした。上清を除去し、１５％ グリセロールの上層を加え、細胞上で１分間維持した。ついでこれを取り出し、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を５日間インキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収し、個々のプレートからの細胞をそれぞれ、１０ｃｍプレート内のＣＥＦ細胞の新鮮な単層上に播き、５０〜９０％ ＣＰＥが得られるまでインキュベートした。次に増幅トランスフェクト化細胞をトリプシン処理により回収し、１０^−２〜１０^−４の希釈液を１０ｃｍプレート上でＣＥＦ単層と共にプレーティングし、インキュベートした。翌日、該プレートを寒天で覆い、ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶの幾つかの個々のプラークを単離し、ＣＥＦ上で増幅した。

実施例２
組換えＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴＶワクチンは感染性喉頭気管炎ウイルスのチャレンジに対して日齢ニワトリを防御する
２つのワクチン（一方はＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−６２Ｅ１を含み、他方は１３３２−７０Ｂ１を含む）を、感染性喉頭気管炎ウイルスのチャレンジからニワトリを防御する効力に関して評価した。ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−６２Ｅ１は、ＦＣ１２６ ＨＶＴバックボーンがＵＳ２部位内に挿入された配列番号１７の核酸配列を含むｒＨＶＴである（前記実施例１を参照されたい）。ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−７０Ｂ１は、ＦＣ１２６ ＨＶＴバックボーンがＵＬ５４．５部位内に挿入された配列番号１７の核酸配列を含むｒＨＶＴである（前記実施例１を参照されたい）。

ウイルスの両ストックのワクチン調製物を、ニワトリ胚繊維芽組織培養細胞で少なくとも８回継代されたストックから得、１１組織培養継代の追加的調製物を得、１３３２−６２Ｅ１に関して試験した。

ワクチンを、新たに孵化した特異的抗原非含有（ＳＰＦ）ニワトリに皮下経路により投与した。ついでトリを４週齢でビルレントＩＬＴＶチャレンジウイルスで気管内経路によりチャレンジし、疾患の臨床徴候に関して１０日間観察した。これらのニワトリにおける疾患の発生を、市販組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶワクチン（Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴ，Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）が投与されたまたはワクチンが何も投与されていない対照と比較した。Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（９ＣＦＲ）は、試験が妥当であるためには、未ワクチン接種対照トリの少なくとも８０％が臨床徴候を示さなければならないこと、および満足しうる防御をもたらすとみなされるためには、ワクチン接種トリの少なくとも９０％が臨床徴候を示さないままでなければならないことを要求している。この研究の結果を以下の表１に示す。二重組換えワクチンは共に、ビルレントＩＬＴＶチャレンジに対して満足しうる防御をもたらした。

実施例３
組換えＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴＶワクチンはニューカッスル病ウイルスのチャレンジに対して日齢ニワトリを防御する
日齢特異的抗原非含有（ＳＰＦ）ニワトリまたは１９日齢胚を、組換えワクチンＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−６２Ｅ１，組織培養継代レベル１１、または市販組換えＨＶＴ／ＮＤＶワクチン（Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＮＤ，Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈにより販売されているもの）でワクチン接種し、ついで４週齢でビルレントニューカッスル病（ＮＤ）チャレンジウイルス，Ｔｅｘａｓ−ＧＢ株で筋肉内経路によりチャレンジした。ニューカッスル病の臨床徴候に関してトリをスコア化した１４日間の観察期間の後、ニワトリの各群における疾患の発生を未ワクチン接種対照と比較した。
Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（９ＣＦＲ）は、試験が妥当であるためには、未ワクチン接種対照トリの少なくとも８０％が臨床徴候を示さなければならないこと、および満足しうる防御をもたらすとみなされるためには、ワクチン接種トリの少なくとも９０％が臨床徴候を示さないままでなければならないことを要求している。この研究の結果は、組換えＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ １３３２−６２Ｅ１ワクチンが、両投与経路により満足しうるＮＤ防御をもたらしたことを示している。

実施例４
組換えＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴＶワクチンは感染性喉頭気管炎ウイルスのチャレンジおよびニューカッスル病ウイルスのチャレンジに対して日齢ニワトリを防御する
ワクチンＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴ−１３１７−４６．１−１を、感染性喉頭気管炎ウイルスのチャレンジまたはニューカッスル病ウイルスのチャレンジからニワトリを防御する効力に関して評価した。ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３１７−４６．１−１は、ＦＣ１２６ ＨＶＴバックボーンがＵＳ２部位内に挿入された配列番号１６の核酸配列およびＵＬ７／８部位内（すなわち、ＨＶＴのＵＬ７およびＵＬ８遺伝子間）に挿入された配列番号１５の核酸配列を含むｒＨＶＴである（前記実施例１を参照されたい）。ワクチン調製物は、ニワトリ胚繊維芽組織培養細胞で１５回継代されたストックから得た。

ワクチンを、新たに孵化した特異的抗原非含有（ＳＰＦ）ニワトリに皮下経路により投与した。ついでトリを４週齢でビルレント感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）チャレンジウイルスで気管内経路によりチャレンジし、疾患の臨床徴候に関して１０日間観察し、あるいはビルレントニューカッスル病（ＮＤ）チャレンジウイルス，Ｔｅｘａｓ−ＧＢ株で筋肉内経路によりチャレンジし、１４日間観察した。これらのニワトリにおける疾患の発生を、市販組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶワクチン、ＨＶＴ／ＮＤワクチンが投与されたまたはワクチンが何も投与されていない対照と比較した。Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（９ＣＦＲ）は、試験が妥当であるためには、未ワクチン接種対照トリの少なくとも８０％が臨床徴候を示さなければならないこと、および満足しうる防御をもたらすとみなされるためには、ワクチン接種トリの少なくとも９０％が臨床徴候を示さないままでなければならないことを要求している。この研究の結果を以下の表３に示す。ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴワクチンはＮＤＶチャレンジに対して満足しうる防御をもたらした。この予備的研究においては、ビルレントＩＬＴＶチャレンジに対してこの構築物により得られた防御は政府の要件を僅かに満たさなかったが、それは相当な防御をもたらした。

実施例５
感染性ファブリキウス嚢疾患ウイルスに対するワクチンにおいて８９／０３ファブリキウス嚢疾患と組合わされた組換えＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴＶ
１日齢のニワトリ（ＳＰＦ Ｌｅｇｈｏｒｎ）の群を、使用時にＩＢＤＶ ８９／０３ワクチンと組合わされたＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−６２Ｅ１でワクチン接種した。別の群のニワトリを３．５ ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／用量でＩＢＤＶワクチンのみでワクチン接種した。ニワトリを４週齢で変異Ｅ ＩＢＤＶチャレンジでチャレンジした。チャレンジの１０日後、トリを安楽死させ、体重／ファブリキウス嚢重量、およびファブリキウス嚢疾患に合致した肉眼的病変に関して検査した。結果を、適用可能な９ＣＦＲ １１３．３３１要件に従い、許容性に関して分析した。

ＩＢＤＶ ８９／０３は、感染性ファブリキウス嚢疾患ウイルスの古典的株および変異株の両方に対してトリを防御するために家禽業において使用されている認可製品である。
ＩＢＤＶ８９／０３ワクチンの目標用量は３．５ ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／０．２ｍＬ用量であった。ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴの目標用量は３０００ＰＦＵ／０．２ｍＬ用量であった。最終ワクチン希釈体積中の目標用量を得るために、ＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−６２Ｅ１ワクチンを、０．２ｍＬ中に６０００ＰＦＵ（これは標的用量の２倍である）を含有するように希釈した。８９／０３ワクチンを、３．８ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ_５０（これは標的用量の２倍である）を含有するように希釈した。群１に関しては、等しい体積のＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ−１３３２−６２Ｅ１ワクチンおよび８９／０３ワクチンを組み合わせて、組み合わせワクチンを製造した。８９／０３ワクチンのみが投与された群２に関しては、等しい体積の希釈剤を加えた。各処理群における１日齢のニワトリに０．２ｍＬのそれぞれのワクチンまたはプラセボを皮下（ＳＣ）経路により投与した（表４を参照されたい）。

孵化時に、ワクチン処理群のそれぞれにおけるニワトリを、ＥＸＣＥＬのランダム化プログラムを使用して割り当てられた１組のランダム化標識番号で標識した。また、嚢の組織検査のためにチャレンジの７日後に各檻から取り出したトリは、ＥＸＣＥＬのランダム化プログラムを用いて決定された。

ニワトリを４週齢でＩＢＤＶ変異体Ｅチャレンジウイルスでチャレンジした。約１０^２．２ ＥＩＤ_５０／用量を含有する０．０６ｍＬを点眼経路により各ニワトリに投与した。チャレンジの７日後、個々の嚢の組織学的評価のために各群からの６〜９羽のトリを取り出した（表５を参照されたい）。鉗子により破壊または圧搾されていない組織を集めるように留意して、各チャレンジ化ニワトリから嚢サンプルを集めた。組織サンプルを、１０％ ホルマリンの個々の容器内に配置した。

ＩＢＤ−Ｖａｒ Ｅウイルスでチャレンジされた各ニワトリからの嚢を、組織検査により判定された嚢萎縮、全体的な肉眼的病変および／またはリンパ球減少に関して陰性または陽性として記録した。嚢病変には、肉眼的出血、浮腫／滲出液、クリーム／黄色、線紋、または肉眼的萎縮が含まれた。嚢萎縮は、各ニワトリを最も近いグラム値まで個々に秤量することにより測定した。嚢を最も近い１００分の１グラムの値まで個々に秤量した。
ＢＷ比：（嚢重量÷体重）×１０００の式を用いて、嚢重量／体重比を各トリに関して計算した。チャレンジ化対照からの２標準偏差を超える嚢重量対体重比が、感染性ファブリキウス嚢疾患に関して陰性および感染性ファブリキウス嚢疾患に対して防御的であるとみなされる。この研究の結果は、ワクチン処理群１および２がＩＢＤに関して陰性であった（すなわち、プラセボ未チャレンジ化対照と統計的に異ならない）ことを示しており、このことは、両方のワクチンが有効であったことを示しており、更に、多価ワクチン中に同様に存在する組換えＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴ構築物による、ＩＢＤＶチャレンジに対するワクチンの８９／０３株によりもたらされる防御の干渉が存在しなかったことを示している（表５を参照されたい）。

実施例６
配列
以下の配列が典型的ｒＨＶＴ構築物において使用されている。以下に示すコード配列は個々の終止コドンを含み、これは、コード配列がコードしているタンパク質抗原の特性を改変することなく代替的終止コドンで容易に置換されうる。

本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態による範囲において限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。

更に、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズならびに全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために示されていると理解されるべきである。

Claims (13)

1. 組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶ_ｎｐ）ゲノム内の第１非必須部位内に挿入された第１核酸、およびｒＭＤＶ_ｎｐゲノム内の第２非必須部位内に挿入された第２核酸を含む組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶ_ｎｐ）であって、
   ここで、第１核酸は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列と感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列との両方を含み、
   ここで、第２核酸は、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ Ｆ）をコードするヌクレオチド配列を含み、そしてここで、
   第１非必須部位および第２非必須部位は、同一であり、且つ、それらはＵＳ２部位もしくはＵＬ５４．５部位であるか、または
   第１非必須部位がＵＳ２部位であり、第２非必須部位がＵＬ７／８部位である、組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶ_ｎｐ）。
2. 第１非必須部位および第２非必須部位がＵＳ２部位である、請求項１記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
3. 第１非必須部位および第２非必須部位がＵＬ５４．５部位である、請求項１記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
4. 第１非必須部位がＵＳ２部位であり、第２非必須部位がＵＬ７／８部位である、請求項１記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
5. ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列が第１プロモーターの機能的制御下にあり、ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列が第２プロモーターの機能的制御下にあり、そして、ＮＤＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列が第３プロモーターの機能的制御下にある、請求項１〜４のいずれか１項記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
6. 第１プロモーターが内因性ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターであり、第２プロモーターが内因性ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターであり、そして、第３プロモーターがヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーターである、請求項５記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
7. 組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、請求項１〜６のいずれかに記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
8. 組換え核酸を含む請求項１に記載のｒＭＤＶ_ｎｐであって、
   該組換え核酸は、
   ５’から３’の方向に以下の順序で、
   （ｉ）感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤプロモーター、
   （ｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＤタンパク質のコード配列、
   （ｉｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター、
   （ｉｖ）ＩＬＴＶ ｇＩタンパク質のコード配列、
   （ｖ）ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、
   （ｖｉ）ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ Ｆ）のコード配列、および
   （ｖｉｉ）転写ターミネーター配列
   を含み、
   該組換え核酸は、ＵＳ２およびＵＬ５４．５からなる群より選択される非必須部位内に挿入されている、ｒＭＤＶ_ｎｐ。
9. 組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、請求項８記載のｒＭＤＶ_ｎｐ。
10. 請求項１〜９のいずれか１項記載のｒＭＤＶ_ｎｐと医薬上許容される担体とを含むワクチン。
11. 穏やかな（マイルド）生感染性ファブリキウス嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）を更に含む、請求項１０記載のワクチン。
12. 穏やかな生ＩＢＤＶが株８９／０３である、請求項１１記載のワクチン。
13. 請求項１０、１１または１２記載のワクチンをニワトリに投与することを含む、ＩＬＴＶに対するニワトリの防御を補助するための方法。

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