JP5756795B2

JP5756795B2 - 組換えポリオーマウイルスベクター粒子の製造方法

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Publication number: JP5756795B2
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Description

本発明は、ウイルス粒子、ウイルスベクター、ウイルスベクター粒子、および組換えタンパク質の改良された製造方法に関する。特に、本発明は、組換えポリオーマウイルスベクター粒子およびポリオーマウイルス生産細胞株の改良された製造方法に関する。より詳細には、本発明は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ウイルスベクターのようなシミアンポリオーマウイルスベクターの製造方法に関する。また、本発明は、遺伝性疾患、移植拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、または癌を治療するための、ウイルスベクターを含む組成物およびそれらの使用、ならびにウイルスベクター粒子に関する。また、本発明は、哺乳類細胞における組換えタンパク質の製造方法、および哺乳類細胞における組換えタンパク質の製造を向上させる方法に関する。

過去１０年間、標的細胞中への遺伝子または核酸の、導入および適切な発現のための、効率的な遺伝子または核酸のデリバリー技術の開発について多くの努力が導入された。治療遺伝子または核酸は、機能不全遺伝子を回復させて遺伝性疾患を治療するため使用することができ、免疫応答を誘導して癌および感染症を治療するために使用することができ、または、たとえば免疫寛容を誘導／回復して、移植拒絶反応を防ぐような、もしくは自己免疫疾患およびアレルギーを治療するような免疫応答を抑制するために使用することができる。治療遺伝子または核酸は、裸の分子として、または脂質および／もしくはタンパク質性化合物に包まれた核酸として投与することができる。

ウイルスは、それらの遺伝情報をそれらの宿主標的細胞に送達するため、および発現させるために進化したので、ウイルスベクターは、遺伝子送達ビヒクルとして調べられ、生細胞に遺伝情報を送達する最も効率的な手段であることが見出された。多くのウイルスベクター遺伝子送達システムが開発され、前臨床試験および臨床試験で検証された。これらの試験は、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、パルボウイルス、およびポリオーマウイルスに由来する現在使用されているベクターが、一般的に使用しても安全であり、標的細胞への治療遺伝子の送達において効率的であることを明らかにした。

現在使用されているウイルス遺伝子送達ベクターの主な欠点は、多数の患者を治療するために十分な量を生産することができないという事実である。ウイルスベクターの大部分は、ベクターとベクターの成分とをコードするプラスミドＤＮＡによって生産細胞をトランスフェクションすることによって製造される。これは、１ミリリットルの細胞培養体積あたり１万個〜１０万個のベクター粒子を産生する。臨床試験では、有益な臨床効果を達成するために、一般的に１×１０^１０〜１×１０^１２個のベクター粒子を患者に投与する必要がある。このことは、１０００人の患者を治療するためには、ベクター粒子の十分な量を得るために１００万リットル以上の細胞培養が必要であることを意味する。

また、前臨床試験および臨床試験は、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、およびレトロウイルスのベクターのような試験されたウイルス遺伝子送達ベクターの大部分は、ウイルスベクター成分および治療遺伝子産物に向けられた強い免疫反応を患者において誘導することを明らかにした。結果として、これらのベクターは、単回投与することができるのみであるが、導入された治療遺伝子の発現レベルは急速に減少する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するウイルスベクターは、動物において免疫応答を誘導せず、免疫学的に不活性である。しかし、人口の大部分は、野生型ＡＡＶとともに、たとえばアデノウイルスのような、そのヘルパーウイルスと接触し、その結果ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する強力なＣＴＬメモリーを発達させた。結果として、ＡＡＶ形質導入細胞は、急速に除去され、ＡＡＶウイルスベクターによって導入された治療用遺伝子または核酸の発現レベルは急速に減少する。

原核生物細胞で製造される組換えタンパク質の収量と比較した哺乳動物細胞で製造された組換えタンパク質の収量は、強力なプロモータおよび／もしくはマルチコピー導入遺伝子の挿入、または転写を増強する他の方法の使用にもかかわらず、一般的に低い。ウイルス複製コンピテントベクターまたはレプリコンは、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の製造のための発現系として長い間使用されている。このようなベクターにおける標的遺伝子は、ウイルス性プロモータの転写制御下で発現させることができ、それによって所望のｍＲＮＡが、トランスフェクション後、早期に細胞質において非常に高レベルで蓄積し、標的タンパク質を大量にもたらし得る。これまで、レプリコンベースの発現システムの成功は限られたものであった。ＲＮＡウイルスベースのレプリコンシステムは、一般的に短期間のみ組換えタンパク質を製造するのに対して、ＤＮＡウイルスに由来するレプリコンシステムは、商業的に使用される細胞株では一般的にうまく複製されない。

本発明者の知見によれば、ヒトにおいて免疫学的に不活性であり、非常に多くの数の患者を治療するために十分な量を製造することができる唯一のウイルス遺伝子送達ベクターが存在する。さらに、このウイルス遺伝子送達ベクターは、哺乳動物細胞株における組換えタンパク質の製造のためのレプリコンシステムとして採用することができる。このウイルスベクターシステムは、シミアンポリオーマウイルスであるシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。

ポリオーマウイルスは、正二十面体キャプシドを有する非エンベロープＤＮＡウイルスのファミリーで構成される。それらは、ヒト、サル、げっ歯類、および鳥類を含む、多様な動物種から分離される。５種のヒトポリオーマウイルスが記載されており、ＢＫ、ＪＣ、ＷＵ、ＫＩ、およびメルケル細胞ポリオーマウイルスと名付けられた。多くのサルポリオーマウイルスが記載され、そのうちＳＶ４０が最もよく知られている。ＳＶ４０は、ヒト細胞において複製されにくく、ヒトへの感染は滅多にない。時折起こるＳＶ４０の感染は、サルからこれらの動物と密接して居住する人々へのウイルスの感染によって、またはＳＶ４０で汚染された不活化ポリオウイルス粒子のバッチでのワクチン接種を介して起こった。

ＳＶ４０は、５．２５キロ塩基対の長さの環状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ＳＶ４０のゲノムは２つの調節領域、プロモータ／開始領域、およびポリアデニル化領域からなる。プロモータ／開始領域は、５００塩基対の長さであり、２つの逆方向を向いたプロモータ、初期および後期プロモータ（それぞれ、ＳＶＥＰおよびＳＶＬＰ）、複製起点、ならびにパッケージングシグナルを含む。ポリアデニル化領域は、１００塩基対の長さであり、初期転写および後期転写の両者のポリアデニル化シグナルを含む。ＳＶＥＰは、宿主にコードされたスプライシング因子によって、スモールおよびラージ腫瘍（Ｔ）抗原をコードする２種類のｍＲＮＡにスプライシングされる、初期一次転写産物の発現を駆動する。

ラージＴ抗原は、ＤＮＡ複製とＳＶＬＰの活性化とのために必要なレプリカーゼ関連タンパク質である。ウイルス複製におけるスモールＴ抗原の正確な役割は不明なままであるが、スモールＴ抗原は、ラージＴ抗原とともに、数種の哺乳類細胞の形質変換のために必要である。スモールＴ抗原の主な効果は、セリン−スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａとの相互作用によって生じる。スモールＴ抗原のホスファターゼ２Ａ結合ドメインは、スモールＴ抗原の唯一のカルボキシ末端に位置する。

ラージＴ抗原およびスモールＴ抗原の両者が効率的なポリオーマウイルスの複製のために必要であることが先行技術に詳細に記載されている（Fahrbach K. M. et al., Virology 370(2): 255-263, 2008）。

ＳＶＬＰは、宿主にコードされたスプライシング因子によって、ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、２、および３をコードする異なるｍＲＮＡにスプライシングされる、後期一次転写産物の発現を駆動する。Ｔ抗原は、ＳＶ４０感染細胞に対する細胞性免疫応答および液性免疫応答を誘発する、ポリオーマウイルスの主要な免疫原性成分であり、キャプシドタンパク質は、当該ポリオーマウイルスの副次的な免疫原性成分である。

ＳＶ４０Ｔ抗原は、主要な哺乳類細胞を協働して不死化し、確立された哺乳類細胞株を形質変換し、免疫力が低下した若年のげっ歯類に腫瘍を誘発する。ＳＶ４０感染症が、慢性的に発現したＴ抗原の発癌活性によって生じるヒト悪性腫瘍に関連することを多くの報告が示唆している（Butel J.S. and Lednicky J.A. Journal of the National Cancer Institute 91: 119 - 134, 1999）。

ウイルスキャプシドタンパク質の発現は、ラージＴ抗原の存在に依存しているので、ベクターの複製能力を無くすためだけではなく、ヒトにおけるそれらの免疫原性を完全に排除するために、Ｔ抗原特異的配列はポリオーマウイルスベクターにおいて削除された。

ＳＶ４０由来のＴ抗原が削除されたポリオーマウイルスベクターが作製され、試験され、治療遺伝子または核酸は、ウイルスＳＶＥＰの転写制御下の標的細胞においてトランスに発現されている。前記ベクターは、複数のヒト組織および細胞種、たとえば、骨髄（Rund D. et al, Human Gene Therapy 9: 649-657, 1998）、肝臓（Strayer D.S. and Zern M.A., Seminars in Liver Disease 19: 71-81, 1999）、および樹状細胞（Vera M. et al., Molecular Therapy 12: 950-959, 2005）への遺伝子導入のための潜在的なベクターとして長い間知られている。

ＳＶ４０のようなポリオーマウイルスベクターは、活発に分裂している細胞だけでなく、非分裂細胞にも感染することが知られている。このベクターは、Ｔ抗原をコードする領域を欠いており、結果としてウイルスキャプシドタンパク質を発現しないので、非免疫原性であり（Strayer D.S. and Zern M.A., Seminars in Liver Disease 19: 71-81, 1999）、それらは同一の個体に繰り返し投与することができる。さらに、挿入された治療用遺伝子のコンストラクトは、弱いが恒常的なプロモータであるＳＶＥＰの転写制御下で発現するので、前記ベクターはin vivoにおいて治療用タンパク質の長期的な発現を誘導する。したがって、ＳＶ４０に由来するベクターのようなポリオーマウイルスベクターは、上述したような用途に使用することができる、治療遺伝子または核酸のトランスファーのための有望な候補であることが知られている。

それらの複製についての潜在的能力のために、ポリオーマウイルスベースのレプリコンも、抗体、成長因子、およびホルモンのような組換えタンパク質の製造を哺乳類細胞において増強するために大きな関心が寄せられている。

Ｔ抗原が削除されたＳＶ４０粒子は、ＳＶ４０の溶菌成長を許容し、トランスＴ抗原を供給するシミアン細胞において製造された。現在使用されているＳＶ４０ベクターパッケージング細胞株は、特にＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７のＣＯＳ細胞株である（Gluzman Y., Cell 23: 175-182, 1981）。ＣＯＳ細胞株は、ＳＶ４０ＤＮＡを有するサルＣＶ１細胞の形質転換によって生成される。トランスにＳＶ４０Ｔ抗原を発現する別の細胞株はＣＭＴ４である。ＣＶ１由来のＣＭＴ細胞株は、Ｔ抗原がマウスメタロチオネインプロモータの転写制御下において発現されるＳＶ４０ＤＮＡを用いて生成された（Gerard R.D. and Gluzman Y., Molecular and Cellular Biology 5: 3231-3240, 1985）。

しかし、そのような細胞株の使用には重要な欠点がある。構築されたパッケージング細胞株（ＣＯＳまたはＣＭＴ）におけるＴ抗原を削除されたＳＶ４０ベクターの継代は、多くの場合、野生型の複製コンピテントＳＶ４０粒子の出現をもたらす（Gluzman Y., Cell 23: 175-182, 1981; Oppenheim A. and Peleg A., Gene 77: 79-86, 1989; Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004）。

このことは、多くの場合、染色体に挿入されたＳＶ４０特異的配列と、核のＳＶ４０ベクター特異的配列との間の塩基配列の相同性に依存する組換えによって発生する。通常のパッケージング細胞株における、複製コンピテント野生型ウイルス粒子の出現と、Ｔ抗原腫瘍性タンパク質の存在とは、医療目的のためのＳＶ４０ベクターの使用を非現実的なものとしている。

ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞株は、ＳＶ４０感染に半許容性であり、このことは、感染細胞の少ない割合のみがウイルスの複製をサポートしていることを意味する。細胞の大多数は、永続的に感染し、非常に低いレベルのウイルス複製を示す。

ＨＥＫ２９３細胞株の派生体は、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモータの転写制御下においてＳＶ４０初期領域を発現する、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＳＶ４０スモールＴ抗原ｍＲＮＡに有利なスプライシング傾向によって、非常に少量のラージＴ抗原と、大量のスモールＴ抗原とを発現することが記載された。Vera et al.は、ＨＥＫ２９３ＴがＳＶ４０ウイルスベクター製造をサポートしにくいことを見出した（Vera M., et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004）。

Ｔ抗原腫瘍タンパク質がＨＥＫ２９３Ｔ細胞に存在し、複製コンピテントＳＶ４０ウイルスが出現するリスクがあるので、医療目的のためのＳＶ４０ベクターの製造のためのこの細胞株の使用は、望ましくなく、非現実的である。

ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする遺伝子コンストラクトによる安定したトランスフェクションによって生成される、ＨＥＫ２９３Ｔの派生体として開発された。ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞は、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）擬似ベクター粒子の製造のために使用される。組換えＨＰＶ擬似ベクター粒子は、ＳＶ４０の複製開始点およびＨＰＶキャプシド遺伝子を含むプラスミドと、ＳＶ４０の複製開始点およびＨＰＶ擬似ゲノムを含むプラスミドとによって細胞をトランスフェクションすることによってＨＥＫ２９３ＴＴにおいて製造される（Buck C.B. et al., Methods in Molecular Medicine 119: 445-462, 2005）。

ＨＥＫ２９３Ｔの派生体としてのＨＥＫ２９３ＴＴは、スモールＴ抗原およびラージＴ抗原の腫瘍タンパク質を蓄積し、ＳＶ４０複製をサポートしにくいので、医療目的のための組換えＳＶ４０ベクターを製造するためにこの細胞株を使用することは望ましくなく、非現実的である。

国際公開第０３／０２５１８９号明細書は、医療用として安全であるとされるＳＶ４０ベクター粒子の製造を可能にするパッケージング相補細胞株を記載している。しかし、それでも、本明細書に記載された前記パッケージング細胞株は、スモールＴ抗原およびラージＴ抗原の腫瘍タンパク質を大量に蓄積する。

Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004は、ＣＭＴ４およびＨＥＫ２９３Ｔのような特定の細胞株における標的の組換えＳＶ４０ベクター粒子の製造能力は、非常に低いことを示し、ＣＯＴ−２のような国際公開第０３／０２５１８９号明細書に記載された細胞株も、おそらくこれらの細胞腫におけるスモールＴ抗原ｍＲＮＡに有利なスプライシング傾向のために、組換えＳＶ４０ウイルス粒子の生産細胞株として効果的ではないことを指摘した。

国際公開第０８／０００７７９号明細書は、ワクシニアウイルスＥ３Ｌタンパク質およびインフルエンザＡウイルスＮＳ１タンパク質のようなＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のウイルス抑制を使用する適切なＳＶ４０ウイルスベクターの高力価の製造についての問題を克服する方法を記載している。国際公開第０８／０００７７９号明細書に記載されたパッケージング細胞株は、上述したような本明細書に記載された先行技術のパッケージング細胞株の欠点に対する解決策を提供していない。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＣＨＯＰ細胞株をもたらすマウスポリオーマウイルス初期領域を提供した（Heffernan and Dennis, Nucleic Acids Research 19: 85 - 92, 1991）。多くのＣＨＯＰ細胞株は、マウスポリオーマウイルスの複製開始点を有する哺乳類発現ベクターである、プラスミドＣＤＭ８（Invitrogen）の複製をサポートした。ＣＨＯＰ細胞株における複製のレベルは、おそらくＣＨＯ細胞におけるスモールＴ抗原またはミドルＴ抗原ｍＲＮＡに有利なスプライシング傾向のために、このシステムを商業的応用のために魅力的なものとするには十分ではなかった。

使用するために安全であり、高力価のウイルスベクター粒子をもたらす組換えポリオーマウイルス粒子の効率的な製造システムのための従来技術における要望が依然として存在する。したがって、本発明の目的は、ポリオーマウイルス粒子およびそれとともに得ることができる組成物の安全かつ効率的な製造方法を提供することである。なお、本発明の方法は、哺乳動物細胞における大量の組換えタンパク質の製造のために使用することができることが理解される。

上記の目的は、ａ）機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができ、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができない、野生型ポリオーマウイルスを許容する細胞株を提供する工程、ｂ）機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原をコードすることができないポリオーマウイルスＤＮＡを前記細胞株に導入する工程、ｃ）組換えポリオーマウイルスベクター粒子の形成を可能にする条件下において、前記細胞を増殖培地中で培養する工程、およびｄ）組換えポリオーマウイルスベクター粒子を細胞培養から回収する工程を含む、機能的スモールＴ抗原を発現することができない、組換えポリオーマウイルスベクター粒子の製造のために提供される方法である本発明によって満たされた。

この方法により製造された組換えポリオーマウイルスベクター粒子は、機能的なスモールＴ抗原を発現することができず、野生型ポリオーマウイルス粒子に戻すことはできない。このことは、ポリオーマウイルスベクターだけでなくポリオーマウイルスベクター生産細胞株における、機能的なスモールＴ抗原をコードする遺伝子の完全な欠如によるものであってもよい。

このことは、単一の野生型ポリオーマウイルス粒子なしで膨大な数の組換えポリオーマウイルスベクターのベクター粒子を含む組成物の調製を初めて可能にする。本発明の方法において製造されたウイルスベクター粒子は、機能的なラージＴ抗原を発現しない野生型ポリオーマウイルスを許容する細胞において複製することができない。しかし、この組成物は、治療に使用しても安全である。

今まで、野生型ポリオーマウイルスの復帰変異組換え体のない、大量のポリオーマウイルスベクター粒子を製造することは不可能であった。本発明の使用によって、単一の野生型ウイルスが存在することのない、大量の均一なウイルスベクターを得ることが可能となった。したがって、本発明は、機能的なスモールＴ抗原を発現することができず、このため野生型ポリオーマウイルスを許容するラージＴ抗原欠損細胞において複製することができない、１０^６個以上のポリオーマウイルス粒子を含む組成物に関する。

本発明において使用するための細胞株は、機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現し、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現しないように遺伝的に改変されている、ポリオーマイウルスを許容する従来の哺乳類細胞株であってもよい。本発明に係る細胞株は、組換えタンパク質の製造のために有利に使用されてもよい。なぜなら、それらはポリオーマウイルスの複製開始点を含む環状ＤＮＡ分子を複製することができるためである。
また、本発明は、医薬として使用するための上述したような組成物に関する。

本発明者は、ポリオーマウイルスのラージＴ抗原は、ポリオーマウイルスキャプシドタンパク質の発現を独自に促進し、ポリオーマウイルススモールＴ抗原は、その目的のために必要とされないことを見出した。このことは、細胞内のポリオーマウイルスＴ抗原の欠損において、ＳＶＬＰが、恒常的であるが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモータのような他のウイルスプロモータに比較して弱いプロモータである一方で、ＳＶＬＰは、転写レベルおよび転写後レベルでオフされることを意味する。驚くべきことに、ＳＶ４０許容細胞では、ＳＶ４０ラージＴ抗原それ自身が、ＳＶ４０ウイルスベクターＤＮＡの増殖を維持することを可能とすること、およびＳＶＬＰを活性化し、キャプシドタンパク質の蓄積を誘導し、ＳＶ４０ウイルス粒子の効率的な製造をもたらすことを可能とすることが見出された。

従来技術では、スモールＴ抗原をコードしていないＳＶ４０株が生成されている。Gauchat et al.（Nucleic Acids Research 14: 9339-9351, 1988）は、ＳＶ４０欠損変異体ｄｌ８８３が、スモールＴ抗原を欠くが、感染細胞において機能的なラージＴ抗原を製造することを記載している。この変異ウイルス株がサル腎臓細胞およびＣＶ−１細胞培養を感染させるために使用された場合、変異ウイルス株は、野生型ＳＶ４０よりもラージＴ抗原介在性の細胞分裂およびその後のウイルスの複製を誘導する点において非効率であった。著者らは、スモールＴ抗原は、細胞分裂とウイルスの複製とを誘導する点においてラージＴ抗原を支援する、ヘルパー機能を有すると結論づけた。野生型ＳＶ４０によって感染された細胞と比較して、ｄｌ８８３によって感染した多くの細胞は、分裂せず、ウイルス粒子を製造しないので、この先行技術は、本発明とは逆の教示をしている。細胞内におけるスモールＴ抗原の欠損は、ウイルスベクターの製造に有害であることが教示されている。

Gauchat et al.の刊行物は、ウイルス粒子が生産されているか否かについて結論に到達していない。彼らは、単に無傷のウイルス粒子の製造に等価ではない細胞において、ウイルスＤＮＡの製造を測定しているにすぎない。

したがって、本発明は、当業者にとって直感に反するものである。さらに、スモールＴ抗原は、ＲＮＡｉの効果的な阻害剤であることが当業者に知られている。ＲＮＡｉは、抗ウイルス機構として働くことが知られているので、細胞内のスモールＴ抗原の量の減少は、ＲＮＡｉに基づく抗ウイルス活性の増加を導き、ウイルス粒子製造の減少をもたらすことが予測される。驚くべきことに、本発明者らは、事実がその逆であることを見出した。ラージＴ抗原がトランスで提供される場合、すなわち細胞株およびポリオーマウイルス株が機能的なスモールＴ抗原を欠き、細胞株がラージＴ抗原を製造する場合、ポリオーマウイルス粒子は多量に製造される。本発明と、Gauchat et al.の結果との差異は、Gauchat et al.に記載された実験において、機能的なラージＴ抗原はシスで提供される、すなわち機能的なラージＴ抗原は感染した細胞において複製するポリオーマウイルスにおいて提供される。このことは、明らかに部分的な細胞死、および非常に非効率的なウイルスベクターの製造を導く。

本発明は、組換えポリオーマウイルスベクター粒子と、ポリオーマウイルスパッケージング細胞株と、前記ポリオーマウイルスベクターのポリオーマウイルスレプリコンの複製をサポートする細胞株と、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができないレプリコンとを複製するための方法を提供する。

本発明において、全ての細胞は、ポリオーマウイルスベクターの製造に寄与し、１ミリリットルの細胞培養体積当たり１×１０^６個、または１×１０^１１個までのポリオーマウイルス粒子が、本発明に係る方法で得ることができる。

本明細書において、「機能的なラージＴ抗原」または「機能的なそれらの部分」との表現は、ラージＴ抗原またはそれらの断片もしくは類似体であって、それらに由来するラージＴ抗原に寄与することができるような、より詳細には、ポリオーマウイルスベクターＤＮＡの増殖を維持することができ、ポリオーマウイルスを許容する細胞におけるＳＶＬＰを活性化することができるような本発明を実行するために要求されるのと同じ機能を実行することができるポリオーマウイルスから得ることができる、ラージＴ抗原またはそれらの断片もしくは類似体を意味する。

ラージＴ抗原の機能は、ポリオーマウイルスラージＴ抗原またはその断片もしくは類似体をコードする発現プラスミドと、Ｔ抗原を削除したポリオーマウイルスベクターＤＮＡとを野生型ポリオーマウイルを許容する細胞において共発現させ、ポリオーマウイルスベクター粒子が製造されるか否かを決定することによって試験することができる。この分析において単一のポリオーマウイルス粒子が製造された場合、ポリオーマウイルスラージＴ抗原またはそれらの断片もしくは類似体は、機能的ラージＴ抗原であると結論づけられてもよい。そのような分析は、電子顕微鏡または当該分野で公知の任意の他の適した方法によって決定されてもよい。

本明細書における「機能的なスモールＴ抗原」または「その機能的部分」という表現は、スモールＴ抗原またはその断片もしくは類似体であって、それらに由来するラージＴ抗原に寄与することができるような本発明を実行するために要求されるのと同じ機能を実行することができるポリオーマウイルスから得ることができるような、より詳細には、プロテインホスファターゼ２Ａと相互作用する、および／またはプロテインホスファターゼ２Ａを抑制することができるような、スモールＴ抗原またはその断片もしくは類似体を意味する。スモールＴ抗原の機能性は、CHO U.S. et al., PLoS Biology 5(8): e202, 2007に記載されたように、スモールＴ抗原またはその断片もしくは類似体と、プロテインホスファターゼ２Ａとの間の結合分析を用いて試験することができる。この分析における相互作用および／または抑制が上記の背景においてである場合、スモールＴ抗原またはそれらの断片もしくは類似体は、機能的なスモールＴ抗原であると結論づけてもよい。

本発明において有用な細胞株は、ポリオーマウイルスラージＴ抗原またはその機能的部分を発現してもよく、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができない。結果として、本発明の細胞株は、ポリオーマウイルスにコードされたＴ抗原の腫瘍タンパク質を蓄積せず、複製コンピテント野生型ポリオーマウイルスは、ポリオーマウイルスベクターと、染色体に挿入されたポリオーマウイルスラージＴ抗原の配列との間の組換えによって、本発明の細胞から出現することはできない。

本発明における使用のための細胞株は、当業者の通常の能力を用いて得られてもよい。また、当業者は、実施例において提供される手引きに従って、発明において使用するための細胞株に到達してもよい。

また、本発明の目的は、機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原またはその機能的な断片をコードする遺伝子を含み、たとえばスモールＴ抗原特異的配列を削除することによって、前記遺伝子配列は機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができない、好ましくは霊長類細胞株、またはさらに好ましくはＶｅｒｏ細胞株（African Green Monkey kidney cell line ECACC 88020401 European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UKを参照）のようなシミアン細胞株を提供することである。前記細胞株は、Ｔ抗原を削除されたポリオーマウイルスベクターの増殖およびパッケージングが可能である。

当業者は、本発明の細胞株において製造されるＳＶ４０ベクターのような組換えポリオーマウイルスベクターは、Ｔ抗原特異的な遺伝子配列を含まなくてもよく、このためラージＴ抗原を欠く哺乳動物細胞において複製することができないことを理解するであろう。例示されたＴ抗原を削除されたＳＶ４０レプリコンは、本発明の生産細胞株において高い割合で複製するようである。

本明細書において用いられる用語「塩基配列の相同性」は、２つのポリヌクレオチド間の相同性の存在を示す。ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列が同じ場合、または最大に対応するように位置を合わせた場合において１つのセンス配列と、他のポリヌクレオチドのアンチセンス配列とが同じである場合のどちらも「相同」の配列を有する。２つ以上のポリヌクレオチドの間の配列の比較は、配列類似性の局所領域を特定および比較するための比較ウィンドウ上で少なくとも２つの配列の部分を比較することによって一般的に行われる。比較ウィンドウは、一般的に約２０〜２００個の連続するヌクレオチドの長さである。本発明のポリヌクレオチド配列についての、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列相同性のような「配列相同性の割合」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に位置合わせした配列を比較することによって決定されてもよく、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（付加または削除を含まない）と比較して付加または削除（すなわち、相違）を含んでいてもよい。割合は、（ａ）両方の配列において、同一の核酸塩基に現れる位置の数を決定し、一致する位置の数を得る工程と、（ｂ）比較ウィンドウにおける全ての位置の数によって、一致した位置の数を除算する工程と、（ｃ）１００を乗算し、配列相同性の割合を得る工程とによって計算される。比較のための配列の最適な位置合わせは、既知のアルゴリズムのコンピュータ実装によって、または観察によって実行されてもよい。容易に利用できる配列比較および多重配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul, S. F., Journal of Molecular Biology 215: 403, 1990; Altschul, S. F. et al., Nucleic Acid Research 25: 3389-3402, 1997）およびClustalWプログラムであり、両方ともインターネットで入手できる。他の適切なプログラムは、Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA)におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＦＡＳＴＡを含む。

核酸配列間の相同性は、変性によってお互いにハイブリダイズするための核酸配列の能力を参照して決定され得る（たとえば、摂氏５０℃〜摂氏６５℃の温度で４００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭＰＩＰＥＳｐＨ６．４、１ｍＭＥＤＴＡの条件下において、１２〜１６時間ハイブリダイズし、続いて洗浄する）（Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992）。

一般的に言えば、当業者は、ポリオーマウイルスベクターを構築することができ、組換え遺伝子発現のためのプロトコールを設計することができる。当業者は、プロモータ配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含有する適切な調節配列を含む適切なベクターを選択し、構築することができる。より詳細には、たとえば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。

用語「異種」は、問題となる、核酸配列、ポリヌクレオチド配列、遺伝子、またはヌクレオチド配列が、たとえば、ヒトの介入のような遺伝子工学を用いて前記ポリオーマウイルスベクター生産細胞株に導入されたことを示すために広く使用されている。異種遺伝子は、原理上は、内因性の等価遺伝子に置き換えてもよく、または宿主細胞もしくはポリオーマウイルスのゲノムの内因性遺伝子に付加されてもよい。すなわち、異種遺伝子は、宿主の細胞内またはポリオーマウイルスにおいて非天然に発生する。

「プロモータ」とは、作動可能に結合したＤＮＡの下流（すなわち、２本鎖ＤＮＡのセンス鎖における３’末端において）から転写が開始してもよいＤＮＡ配列を意味する。「作動可能に連結」は、同じ核酸分子の一部として結合すること、好ましくは、プロモータから開始される転写のために位置し適応することを意味する。プロモータに作業可能に連結したＤＮＡは、プロモータの「転写開始制御下」である。

プロモータは、恒常性プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータであってもよい。プロモータに適用されるような用語「恒常性」、「誘導性」、または「組織特異的」は、当業者によって理解される。プロモータは、好ましくは、レトロウイルスおよびレンチウイルスに由来する５’長端反復配列、サイトメガロウイルス即時型初期プロモータ（ＣＭＶｉｅ）、ヒト伸長因子１αプロモータ（ＥＦ−１α）などを含むウイルスに由来する。このようなプロモータは、容易に入手可能であり、当技術分野で周知である。

「ポリアデニル化シグナル」は、転写を終了することができ、ポリＡテイルが転写産物に付加される、ヌクレオチド配列を意味する。ポリアデニル化シグナルとして、ヒト細胞または動物細胞において利用可能な任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。

本発明に係る細胞株は、ＭＤＣＫ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥＫ２９３、ＣＶ１などのような当該分野で既知の任意の適切な細胞株に由来してもよいが、好ましくはＶｅｒｏ細胞株またはＣＨＯ細胞株である。

本発明に係る適切な細胞株は、ポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができないポリオーマウイルス許容細胞株であり、好ましくは、以下の遺伝的要素を含む。
ｉ）ポリオーマウイルスラージＴ抗原をコードするドメインまたはその部分、および任意に
ｉｉ）ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子または他のマーカーのような選択可能なマーカー。

このような細胞株は、スモールＴ抗原特異的ＤＮＡ配列を含むポリオーマウイルス初期転写産物の多数のイントロンを欠いていてもよい。

好ましい実施形態における細胞株は、転写エンハンサーの活性に基づいてさらに選択されてもよいような、細胞株の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれた転写エンハンサー配列を含んでもよい。このようなマーカーおよびそのような選択手順は、当業者に周知である。

異なるポリオーマウイルスベクター産生細胞株、たとえばＳＶ４０ウイルスベクター生産細胞株は、その系統に応じて、プラスミドのような異なるベクターによって細胞をトランスフェクションすることにより生成されてもよい。細胞株のトランスフェクションのための方法論は、当技術分野において周知である。たとえば、Ｖｅｒｏ細胞株は、ワクチンのためのウイルス粒子の製造に広く使用されている。このことは、ウイルス性疾患の予防において多くの応用法を見出した。

適切な細胞株は、以下の成分を含む第１のプラスミドでトランスフェクションすることによって得ることができる。
ｉ）スモールＴ抗原特異的配列を含むポリオーマウイルス初期転写産物の多くのイントロンを欠く、ポリオーマウイルスラージＴ抗原をコードするドメインまたはその部分、および任意に
ｉｉ）ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、または他のマーカーのような選択可能なマーカー。

したがって、単一ベクターまたはプラスミドは、ドメインをコードするポリオーマウイルスラージＴ抗原と、選択可能なマーカー配列との両者を保有することができる。また、２つの分離したＤＮＡを保有するベクターまたはプラスミドであって、第１のＤＮＡはポリオーマウイルスラージＴ抗原をコードするドメインを保有し、第２のＤＮＡは設計に応じて選択できるマーカーを保有する、ベクターまたはプラスミドを利用することができる。生産細胞株においてポリオーマウイルスベクターの製造能力を付与するために必要である可能性のある、任意のさらなる遺伝的要素を、選択された生産細胞株をトランスフェクトするために使用されてもよい１以上のＤＮＡベクターまたはプラスミドに付与してもよい。たとえば、Ｖｅｒｏ生産細胞株は、自身にポリオーマウイルスＴ抗原配列を含んでいないので、ラージＴ抗原をコードするドメインは、Ｖｅｒｏ生産細胞株に追加されてもよく、それらにラージＴ抗原をコードするドメインを含む得られた初期生産細胞は、選択可能なマーカーシステムを使用して選択されてもよい。

本発明は、ポリオーマウイルスベクターＤＮＡと宿主細胞ＤＮＡとの間の組み換えから生じる野生型ポリオーマウイルスによる汚染のリスクなしに、治療目的のために十分な量の組換えポリオーマウイルスベクターを含む組成物の調製を初めて可能とする。この現象は、文献に詳細に記載されている（Gluzman Y., Cell 23: 175-182, 1981; Oppenheim A. and Peleg A., Gene 77: 79-86, 1989; Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004）。

しかし、この組換えが生じる頻度はあまり文書化されていない。その推定値は大きく異なる。Shaulらは、組換えは、少なくとも１０^−６の頻度で生じると推定した（Shaul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3781-3784, 1985）が、より最近の推定値は、１０^−３の程度でさらに高い組換え率を示す (Arad et al., Virology 304: 155-159, 2002）。

組換えの頻度を推定することを複雑にする要因は、野生型ポリオーマウイルスは、機能的なＴ抗原をコードする遺伝子を欠損した組換えポリオーマウイルスベクターよりも高速で複製することである。

したがって、我々は全ての野生型復帰変異体の出現なしに、先行技術に従って、従来の細胞培養で製造することができる組換えＳＶ４０ベクター粒子の最大数を確立した。

したがって、我々は、標準的なプロトコール（Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004）に従って、組換えＳＶ４０ベクター粒子によってＣＯＳ−１細胞を感染させ、非常に感度の高い定量的ＰＣＲ分析によって検出されたような野生型ウイルスの単一の検出可能なゲノムの出現なしに製造することができる、ウイルス粒子の最大数を計算した。

実施した大部分の実験において検出可能な量の野生型復帰変異体の出現なしに、最大で１×１０^４個のウイルスベクター粒子が、安全に製造されることが見出された。しかし、１×１０^５個のウイルスベクター粒子を含むかなりの数の調製物が、野生型復帰変異体に陽性であり、一方、１×１０^６個のウイルス粒子を含むすべての調製物が野生型ウイルスに汚染され、このため医療用途のために妥当ではなかった。

従来技術に係るポリオーマウイルスベクター調製物が、医療用に妥当ではないという事実は、Katzman R.B. et al. （Journal of Virological Methods 150: 7 - 13, 2008）によって記載されたような先行技術の方法に従って試験された場合に、１×１０^６個以上の組換えＳＶ４０ベクター粒子を含む調製物における野生型ＳＶ４０粒子が、in vitroにおいてＳＶ４０許容細胞に感染することができたという事実によって強調される。

本発明は、組成物中に全ての野生型ポリオーマウイルス粒子が存在することなく、１×１０^６個以上のポリオーマウイルスベクター粒子を含む組成物の調製を初めて可能にする。したがって、本発明は、機能的なポリオーマウイルスＴ抗原を発現することができず、野生型ポリオーマウイルスを許容する細胞において複製することができない、１×１０^６個以上のポリオーマウイルスベクター粒子を含む組成物に関する。そのような調製物は、最大で、１×１０^８個、１×１０^９個、１×１０^１０個、または１×１０^１１個のような、１×１０^７個以上のウイルス粒子を有利に含んでいてもよい。

「野生型ポリオーマウイルスを許容する細胞において複製することはできない」という表現は、組成物が、少なくとも１×１０^６個のポリオーマウイルスベクター粒子中に単一の野生型復帰変異体ポリオーマウイルス粒子を含んでいないことを意味する。このことは、Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004によって記載されたような定量的ＰＣＲ分析、または組成物中に存在する野生型ポリオーマウイルスを許容する細胞株を感染させることのどちらによって測定されてもよい。後者の場合、プラークアッセイ（Katzman R.B. et al., Journal of Virological Methods 150: 7-13, 2008）におけるシングルプラークの欠如は、単一の野生型ポリオーマウイルス粒子が存在しないことを示す。

好ましい実施態様において、本発明に係る調製物は、シミアンポリオーマウイルス、特にＳＶ４０、シミアンウイルス１２（ＳＶ１２）、リンパ球ポリオーマウイルス、アフリカミドリザルポリオーマウイルス、またはチンパンジーポリオーマウイルスのような霊長類ポリオーマウイルスを含む組成物に関する。霊長類ポリオーマウイルスを許容する細胞株は、好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、ＰｅｒＣ.６細胞、およびＨＥＫ２９３細胞などからなる群から選択される。

別の実施形態において、本発明に係る調製物は、マウスまたはハムスターポリオーマウイルス、特にネズミポリオーマウイルスまたはハムスターポリオーマウイルスのような齧歯類のポリオーマウイルスを含む組成物に関する。マウスまたはハムスターポリオーマウイルスを許容する細胞株は、好ましくはＣＨＯ細胞などからなる群から選択される。

また、本発明は、医療用途のために安全である組換えポリオーマウイルスベクター粒子の製造のためのベクター生産細胞株の生成を開示している。

したがって、本発明は、ポリオーマウイルスを許容する細胞株であって、前記細胞株は、機能的なラージＴ抗原を発現することができ、スモールＴ抗原を発現することができない細胞株に関する。そのような細胞株は、野生型復帰変異体ポリオーマウイルス粒子を得るリスクなしで、組換えポリオーマウイル粒子の安全な製造を充分にサポートする。なぜなら、このような細胞は、細胞の染色体ＤＮＡと、組換えポリオーマウイルスＤＮＡとの間の任意の相同配列を欠くためである。ラージＴ抗原をコードする遺伝子は、好ましくは、安定的に細胞のゲノムに組み込まれる。

本明細書における用語「組換えポリオーマウイルスベクター」は、機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができず、好ましくは、機能的なラージＴ抗原およびスモールＴ抗原を発現することができないポリオーマウイルスとして解釈される。そのような組換えウイルスベクターは、たとえば、ラージＴ抗原をコードする配列を欠いているか、またはラージＴ抗原およびスモールＴ抗原の両者をコードする配列を欠いていてもよい。

本明細書において「ポリオーマウイルスを許容する」という表現は、細胞株が、ポリオーマウイルスの感染時、またはトランスフェクションもしくは細胞にＤＮＡを送達する他の手段によるポリオーマウイルスＤＮＡの導入時に、ポリオーマウイルス粒子の複製をサポートすることを意味する。

別の態様において、本発明は、以下の工程を含む機能的なスモールＴ抗原を発現することができない組換えポリオーマウイルス粒子の製造方法を提供する。
ａ．機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができ、機能的なスモールＴ抗原を発現することができない、野生型ポリオーマウイルスを許容する細胞株を提供する工程、
ｂ．機能的なスモールＴ抗原をコードすることができないポリオーマウイルスＤＮＡを前記細胞株に導入する工程、
ｃ．ポリオーマウイルス粒子の形成を可能にする条件下において、前記細胞を増殖培地中で培養する工程、および
ｄ．組換えポリオーマウイルス粒子を細胞培養から回収する工程。

好ましい実施形態では、ポリオーマウイルスＤＮＡは、ＤＮＡのトランスフェクションによって細胞に導入される。

本発明のさらなる態様では、病気に由来する個人の苦しみの治療のための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本発明の方法に従って調製されたＳＶ４０のような１以上のポリオーマウイルスの治療有効量、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、それを必要とする個体に投与するため、任意の適切な形態で処方することができる。そのような製剤は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、リンパ内、皮下、眼内、または経皮投与などの投与のためのいずれの形態であってもよい。

本発明の医薬組成物は、当該分野で知られているように、緩衝剤、その浸透圧を調整する薬剤、必要に応じて、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または添加剤を一般的に含む。また、補助的な活性成分は、本発明の組成物に組み込むことができる。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されてもよい。
以下の実施例を参照して本発明についてさらに詳細に説明する。

実施例１：ＳＶ４０由来の遺伝子送達ベクターの構築
以下の６個のオリゴヌクレオチドを設計した。

ＷｄＶ１０１：CCGCTCGAGTTGCGGCCGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC（SEQ ID NO:1）（ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を含む）と、
ＷｄＶ１０２：GGTACCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCC（SEQ ID NO:2）（ＫｐｎＩ制限酵素部位を含む）と、
ＷｄＶ１０３：GGCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGC GCCTTAT（SEQ ID NO:3）（５’から３’までに、続いてＮｏｔＩ末端制限酵素部位、ＰａｄＩ、ＳｂｆＩ、ＰｍｅＩ、およびＡｓｃＩの無傷の制限酵素部位、ならびにＣＩａＩ末端制限酵素部位を含む）と、
ＷｄＶ１０４：CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAAT AAAGC（SEQ ID NO:4）（３’から５’までに、続いてＮｏｔＩ末端制限酵素部位、ＰａｄＩ、ＳｂｆＩ、ＰｍｅＩ、およびＡｓｃＩの無傷の制限酵素部位、ならびにＣＩａＩ末端制限酵素部位を含む）と、
ＷｄＶ１０５：CGGGATCCAGACATGATAAGATACATTG（SEQ ID NO:5）（ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む）と、
ＷｄＶ１０６：ATAGTTTAGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG（SEQ ID NO:6）（ＮｏｔＩ制限酵素部位を含む）。

ＳＶ４０ベクターｐＳＬ−ＰＬの精製されたプラスミドＤＮＡ（De La Luna, S. et al., Journal of General Virology 74: 535-539, 1993）について、オリゴヌクレオチドＷｄＶ１０５およびＷｄＶ１０６を使用してＰＣＲを行った。結果として得られる増幅されたＤＮＡ断片は、５’末端におけるＢａｍＨＩ制限酵素部位および３’末端におけるＮｏｔＩ制限酵素部位によって隣接されるＳＶ４０−ポリアデニル化シグナルを含んでいた。このＳＶ４０ポリアデニル化シグナル断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた１５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離し、同様に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−プラスミド（Promega）にクローニングし、ｐＡＭ００２を得た。

精製されたｐＥＦ５／ＦＲＴ／５−ＤＥＳＴ（Invitrogen）プラスミドＤＮＡについて、オリゴヌクレオチドＷｄＶ１０１およびＷｄＶ１０２を用いてＰＣＲを行った。結果として得られる増幅されたＤＮＡ断片は、５’末端におけるＸｈｏＩに続くＮｏｔＩの制限酵素部位と、３’末端におけるＫｐｎＩ制限酵素部位とによって隣接されたウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含む。このＢＧＨのポリアデニル化シグナル断片を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、結果として得られる２５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離し、同様に消化したｐＡＭ００２プラスミドにライゲーションした。このライゲーション混合物によるトランスフォーメーションは、メチル化に非感受性の大腸菌株において行った。この結果、プラスミドｐＡＭ００３を得た。

２つの相補的なオリゴヌクレオチドＷｄＶ１０３およびＷｄＶ１０４は、沸騰温度から室温に独立して冷却されたウォーターバスにおいてそれらをインキュベートすることによってアニールし、ＮｏｔＩの末端制限酵素部位、ＰａｄＩ、ＳｂｆＩ、ＰｍｅＩおよびＡｓｃＩの無傷の制限酵素部位、ならびにＣＩａＩの末端制限酵素部位を続けて含むＤＮＡリンカを得た。このリンカを、ＮｏｔＩおよびＣＩａＩで消化し、アガロースゲルから単離されたｐＡＭ００２プラスミドにライゲーションした。続いて、メチル化非感受性の大腸菌株をトランスフォームするために、ライゲーション混合物を使用し、ｐＡＭ００４を得た。

ＳＶ４０ベクターＰＳＬ−ＰＬの精製されたプラスミドＤＮＡをＣＩａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。結果として得られた、ＳＶ４０開始点およびＳＶ４０後期領域を含む２．６ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースから精製し、同様に消化されたｐＡＭ００４にクローニングした。このことによって新規のＳＶ４０ベクタープラスミドｐＡＭ００５を得た。

実施例２：ＳＶ４０ルシフェラーゼ発現ベクターの分子クローニング、および組換えＳＶ４０ルシフェラーゼベクター粒子の製造。

発現プラスミドｐＧＬ３（Promega）を、ＰＣＲを用いてホタルルシフェラーゼのクローニングをするための鋳型として使用した。それぞれＡｓｃＩおよびＰａｃＩの制限部位を含む、ＷｄＶ３８９：5’-TTGGCGCGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC-3’（SEQ ID NO:7）およびＷｄＶ４０７：5'-CCCTTAATTAATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC-3'（SEQ ID NO:8）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。ＰＣＲ増幅されたルシフェラーゼ断片を、その後、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化し、ｐＡＭ００５にライゲーションし、ｐＡＭ００６を得た。

それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を含む、ＷｄＶ４３７：5’ GGGATCCAGACATGATAAGATACATTG 3’（SEQ ID NO:9）およびＷｄＶ４４２：ATAGTTTAGCGGCCGCAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTG（SEQ ID NO:10）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。ＰＳＬ−ＰＬベクターを、ＰＣＲを用いるラージＴ抗原のトレーラー配列のクローニングのための鋳型として使用した。結果として得られたＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（部分消化された）ｐＭＡ００６にクローニングし、ｐＭＡ０２０を得た。

ホタルルシフェラーゼ（ＳＶ−Ｌｕｃ）をコードする組換えＳＶ４０ベクター粒子は、Vera et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004に従って製造された。Ｎｏｔ１消化され、再度環状化されたｐＡＭ０２０ＤＮＡによって、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションの３日後、凍結融解を繰り返すことによって、細胞培養液から未精製のライセートを調製した。Ｔ１７５フラスコにおいて増殖するＣＯＳ−１細胞において、ＳＶ−Ｌｕｃベクター粒子を１回増幅した。ＳＶ−Ｌｕｃベクター粒子を、最終的に濃縮し、ショ糖密度勾配超遠心分離によって未精製のライセートから精製し、細胞培養液の１ミリリットルあたり５×１０^１１個のＳＶ−Ｌｕｃゲノムコピーのベクターストックを得た。

実施例３：ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする発現プラスミドの構築
合成マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＳｂｆＩ、ＰｍｅＩ、ＡｓｃＩ、およびＣＩａＩの制限酵素部位を含むように設計した。ＷｄＶ４３６：5'-GCCGCTTTATTAATTAAGCCCTGCAGGTTGTTTAAACTTGGCGCGCCTTAT-3'（SEQ ID NO:11）およびＷｄＶ４３７：3'-CGATAAGGCGCGCCAAGTTTAAACAACCTGCAGGGCTTAATTAATAAAGC-5'（SEQ ID NO:12）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドＷｄＶ４３６およびＷｄＶ４３７を、互いにアニールし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Promega）にライゲーションし、組換えプラスミドｐＡＭ００７を得た。

追加のＮｏｔＩ制限酵素部位であるＷｄＶ４５２：CGGCGGCCGCGTAC（SEQ ID NO:13）およびＷｄＶ４５３：GCGGCCGCの２つのオリゴヌクレオチドを導入するために設計した。両方のオリゴヌクレオチドをアニールし、ｐＡＭ００７にライゲートし、組換えベクターｐＡＭ００８を得た。

発現ベクターｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ＤＥＳＴ＿ｖｅｒＡ（Invitrogen）を、ＰＣＲを用いてサイトメガロウイルス即時型初期（ＣＭＶｉｅ）プロモータのクローニングのための鋳型として使用した。ＣＭＶプロモータに隣接する、ＷｄＶ２８６：5'-TTGGCGCGCCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGG-3'（SEQ ID NO:14）およびＷｄＶ２２０：3'-GACAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGCGGAGGCTGGATCG-5'（SEQ ID NO:15）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドＷｄＶ２８６およびＷｄＶ２２０は、それぞれ制限酵素部位ＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含ものであった。その後、精製されたｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５ＤＥＳＴ＿ｖｅｒＡについて、オリゴヌクレオチドＷｄＶ２８６およびＷｄＶ２２０を用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータのＤＮＡ断片を得た。この断片を、ＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−にライゲーションし、ｐＡＭ００９を得た。

発現ベクターｐＧＬ４．２２（Promega）を、ＰＣＲを用いてピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ抗生物質耐性遺伝子のクローニングのための鋳型として使用した。それぞれ、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ抗生物質耐性遺伝子に隣接し、制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを含む、ＷｄＶ４５４：5'-CCACCCAAGCTTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCG-3'（SEQ ID NO:16）、およびＷｄＶ４５５：3'-TATCCGCTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGC-5'（SEQ ID NO:17）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。プラスミドｐＧＬ４．２２について、オリゴヌクレオチドＷｄＶ４５４およびＷｄＶ４５５を使用してＰＣＲを行い、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼのｃＤＮＡを得た。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩによって消化し、ｐＡＭ００９にライゲーションし、ｐＡＭ０１０を得た。

発現ベクターｐＥＦ５／ＦＲＴ／５−ＤＥＳＴ（Invitrogen）を、ＰＣＲを用いてＢＧＨポリアデニル化シグナルのクローニングのための鋳型として使用した。ポリアデニル化シグナルに隣接し、それぞれを制限酵素部位ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩを含む、ＷｄＶ４５６：5'-CAACCGCTCGAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATC-3'（SEQ ID NO:18）およびＷｄＶ４５７：3'-CGGGGTACCCCATAGAGCCCACCGCATCCCC-5'（SEQ ID NO:19）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。プラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴについて、オリゴヌクレオチドＷｄＶ４５６およびＷｄＶ４５７を使用してＰＣＲを行い、ＢＧＨポリアデニル化シグナルｃＤＮＡ得た。この断片を、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩによって消化し、ｐＡＭ０１０にライゲーションし、ｐＡＭ０１１を得た。

プラスミドｐＡＭ００８をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩによって消化し、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼのコーディングドメインを含むＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、ｐＡＭ００８にライゲートし、ｐＡＭ０１２を得た。

全長のＳＶ４０ＤＮＡクローン（ＡＴＣＣ番号ＶＲＭＣ−２）のＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＳＶ４０Ｔ抗原をコードする領域のクローニングのための鋳型として使用した。ａｔｔＢ１組換え部位を含むＷｄＶ４０８：ACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC（SEQ ID NO:20）、およびａｔｔＢ２組換え部位を含むＷｄＶ４０９：TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGG（SEQ ID NO:21）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。ＷｄＶ４０８およびＷｄＶ４０９を、ゲノムＴ抗原をコードする領域をＰＣＲ増幅するために使用した。続いて、Gatewayエントリークローンを、生成されたＤＮＡ断片およびｐＤＯＮＲ２２１から生成し、ｐＡＭ０１３を得た。Ｔ抗原発現プラスミドを、ｐＡＭ０１３と、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴとの間のGateway組換えによって生成した。

プラスミドｐＡＭ０１４におけるＮｏｔＩおよびＰｍｅＩ制限酵素部位を、ｐＡＭ０１４のＮｏｔＩおよびＰｍｅＩ消化によって除去し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理および再ライゲーションを行い、ｐＡＭ０１５を得た。Ｔ抗原の発現カセットを、ＳｐｈＩ消化、その後のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理およびＮｒｕＩ消化によって単離した。

シャトルプラスミドを生成するために、ＷｄＶ４４８：
TCCTGCAGGCGGGGTACCCTAGTCTAGACTAGCCGCGGGGAGTTTAAACAGCT（SEQ ID NO:22）、およびＷｄＶ４４９：
GTTTAAACTCCCCGCGGCTAGTCTAGACTAGGGTACCCCGCCTGCAGGAGTAC（SEQ ID NO:23）の２つのオリゴヌクレオチドを設計した。
オリゴヌクレオチドＷｄＶ４４８およびＷｄＶ４４９を、ＫｐｎＩ、ＳｂｆＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＳａｃＩＩ、ＰｍｅＩ、およびＳａｃＩ制限酵素部位を含むＤＮＡ断片を生成するためにアニールした。このＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Promega）にライゲーションし、ｐＡＭ０１６を得た。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−を、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、ＭＣＳＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離した。ＭＣＳＤＮＡ断片は、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩによって消化し、ｐＡＭ０１６にライゲーションし、ｐＡＭ０１７を得た。

ｐＡＭ０１５からＴ抗原の発現カセットを駆動するＥＦ１αを、ＮｒｕＩおよびＳｐｈＩ消化によって単離し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行った。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐＡＭ０１７にクローニングし、ｐＡＭ０１８を得た。

プラスミドｐＡＭ０１８を、ＳｂｆＩおよびＰｍｅＩで消化し、Ｔ抗原の発現カセットを含むＤＮＡ断片を、アガロースゲルから単離し、ＳｂｆＩおよびＰｍｅＩで消化したｐＡＭ０１２にクローニングし、ｐＡＭ０１９を得た。

ＷｄＶ４８７：5'-GCAGGCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3'（SEQ ID NO:24）と、ＷｄＶ４９０：3'-CCATTCATCAGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGCCTCCAAAG-5'（SEQ ID NO:25）と、ＷｄＶ４８９：5'CTTTGGAGGCTTCTGGGATGCAACTGAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGG-3'（SEQ ID NO:26）と、ＷｄＶ４８８：5'-AGGAATGTTGTACACCATGCATTTTAAAAAGTC-3'（SEQ ID NO:27）との４つのオリゴヌクレオチドを設計した。

オリゴヌクレオチドＷｄＶ４８７およびＷｄＶ４９０、ならびにオリゴヌクレオチドＷｄＶ４８９およびＷｄＶ４８８を、それぞれ、ＳＶ４０ラージＴ抗原の第１および第２エキソンを増幅するために使用した。続いて、生成されたＤＮＡ断片の両者について、オリゴヌクレオチドＷｄＶ４８７およびＷｄＶ４８８を使用して融合ＰＣＲを行った。

ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする領域を含む生成されたＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩで消化し、同様に消化したｐＡＭ０１９にクローニングし、ｐＡＭ０１９を得た。

要約すると、ｐＡＭ００１は、ラージＴ抗原をコードする領域の上流、およびピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする領域の上流にＥＦ１αプロモータを含む。

実施例４：Ｖｅｒｏ生産細胞株の生成、および組換えＳＶ４０ベクター粒子の製造。
Vero細胞（Sigma-Aldrichの注文番号：88020401）を増殖させ、無血清培養ＤＭＥＭ培地（Invitrogen、製品コード：41966-052）に適応させた。無血清条件への適応は、ウシ胎児血清を、それぞれの継代の培地において、８、６、４、２、および０％に徐々に減少させることによって行った。その後、Ｖｅｒｏ−血清フリー（Ｖｅｒｏ−ＳＦ）細胞を、摂氏３７度および５％ＣＯ_２において、２パーセントＬ−グルタミンを含むＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ培地（Invitrogen）において培養した。

供給者の規定に従って、トランスフェクション試薬Exgen 500（Fermentas、製品コード：R0511）を用いて、Ｖｅｒｏ−ＳＦ細胞をｐＡＭ００１ＤＮＡによってトランスフェクトした。その後、細胞培養培地に２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを追加することによって、トランスフェクトしたＶｅｒｏ−ＳＦ細胞を、染色体ＤＮＡにＳＶ４０ラージＴ発現遺伝子カセットを統合するために選択した。生存コロニーを単離し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび２％のＬ−グルタミンを含むＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ培地において増殖させた。ピューロマイシン耐性細胞を２％のＬ−グルタミン、および１０％ＤＭＳＯを含むＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ培地に移し、摂氏−１５６度で保存した。

実施例５：ＳｕｐｅｒＶｅｒｏサブクローンを高生産するＳＶ４０の選択。
ｐＡＭ００１およびＶＥＲＯ−ＳＦ細胞によってトランスフェクトされたピューロマイシン耐性Ｖｅｒｏクローンを５０％コンフルエンスに達するまで培養した。細胞培養を、約２．５×１０^１０個のベクターゲノムコピーを含む、保存されたＳＶ−Ｌｕｃベクターの５０μｌによって形質導入した。

形質導入の４時間後、培養液を２μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび２％のＬ−グルタミンを含む新鮮なＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ培地に交換した。形質導入の３日後、未精製溶解液を凍結融解によって形質導入細胞から調整した（Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004）。１０％ウシ胎児血清（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭにおいて培養されたＣＯＳ−１細胞を、それぞれピューロマイシン耐性のＶｅｒｏ−ＳＦ細胞クローン、およびｐＡＭ００１によってトランスフェクトされたＶｅｒｏ−ＳＦ細胞クローンの未精製溶解液１００マイクロリットルによって形質導入した。形質導入の２日後、続いて、ＣＯＳ−１細胞を、対応する、ピューロマイシン耐性Ｖｅｒｏ−ＳＦ細胞クローンおよびｐＡＭ００１によってトランスフェクトされたＶｅｒｏ−ＳＦ細胞クローンにおいてＳＶ−Ｌｕｃベクターの生産量の尺度としてホタルルシフェラーゼの発現について試験した。ＣＯＳ−１細胞に匹敵するルシフェラーゼの発現レベルを示した細胞クローンを選択し、増殖させ、細胞バンクを作製するためにエクスパンドした。細胞クローンであるＶｅｒｏ−ＳＦ００１−８６は、ＳＶ−Ｌｕｃ生産について繰り返し検討され、組換えＳＶ４０ベクター粒子をＣＯＳ−１と同程度の量で生産した。Ｖｅｒｏ−ＳＦ００１−８６−０１と示されたＶｅｒｏ−ＳＦ００１−８６細胞のサブクローンを、親のＶｅｒｏ−ＳＦ００１−８６細胞のクローンと同程度の量の組換えＳＶ４０ベクター粒子を繰り返し生産する限界希釈によって生成した。Vera M. et al., Molecular Therapy 10: 780-791, 2004に従う定量的ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＶｅｒｏと命名された細胞クローンであるＶｅｒｏ−ＳＦ００１−８６−０１が、細胞培養液１ミリリットルあたり１〜１０×１０^１１個のベクターゲノムコピーを定常的に製造することを明らかにした。

実施例６：ＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞における組換えタンパク質の製造に用いられるベクターの分子クローニング
複製のＳＶ４０開始点を、ｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０（Invitrogen）からＰＣＲ単離し、ホタルルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ３（Promega）にクローニングし、発現ベクターｐＡＭ００６を得た。その後、ＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞を、精製されたｐＡＭ００６およびコントロールのｐＧＬ３発現ベクターＤＮＡによってトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ルシフェラーゼ発現を測定した。ｐＡＭ６によってトランスフェクトされたＳｕｐｅｒＶｅｒｏ細胞は、コントロールであるｐＧＬ３によってトランスフェクトされた細胞に比較して有意に多くのホタルルシフェラーゼを製造した。

Claims

機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができず、ポリオーマウイルススモールＴ抗原も発現することができない、組換えポリオーマウイルスベクター粒子の製造方法であって、
ａ．機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができ、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができない、野生型ポリオーマウイルスの複製を許容する細胞株を提供し、ポリオーマウイルスラージＴ抗原をコードする遺伝子が細胞の染色体に安定して組み込まれる工程、
ｂ．機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原をコードすることができず、機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原もコードすることができないポリオーマウイルスＤＮＡを前記細胞株に導入する工程、
ｃ．組換えポリオーマウイルスベクター粒子の形成を可能にする条件下において、前記細胞を増殖培地中で培養する工程、および
ｄ．組換えポリオーマウイルスベクター粒子を細胞培養から回収する工程、
を含むことを特徴とする製造方法。
機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができず、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原も発現することができない、１００万個以上の組換えポリオーマウイルスベクター粒子を含む組成物であって、
前記ポリオーマウイルス粒子は、野生型ポリオーマウイルスの複製を許容することができる細胞において複製することができず、
前記組成物は、野生型ポリオーマウイルスの複製を許容する細胞において複製することができる単一のポリオーマウイルス粒子を含まず、前記細胞は、機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現しないことを特徴とする組成物。
前記ポリオーマウイルスは、霊長類ポリオーマウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
前記ポリオーマウイルスは、シミアンポリオーマウイルスであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
前記ポリオーマウイルスは、ＳＶ４０、ＳＶ１２、リンパ系ポリオーマウイルス、アフリカミドリザルポリオーマウイルス、およびチンパンジーポリオーマウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
前記ポリオーマウイルスは、ＳＶ４０であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
前記野生型ポリオーマウイルスの複製を許容する細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ、ＰｅｒＣ．６、ＨＥＫ２９３、およびＣＶ１からなる群から選択されることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載の組成物。
機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原をコードする遺伝子を含まず、機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原をコードする遺伝子も含まない組換えポリオーマウイルスベクター粒子を含む、ポリオーマウイルスを許容する細胞株であって、細胞の染色体に安定して組み込まれた機能的なポリオーマウイルスラージＴ抗原を発現することができ、機能的なポリオーマウイルススモールＴ抗原を発現することができないことを特徴とする細胞株。
薬剤としての使用のための、請求項２〜７のいずれか１項に記載の組成物。