KR20240009417A

KR20240009417A - 욕창의 예방제 및/또는 치료제

Info

Publication number: KR20240009417A
Application number: KR1020237039642A
Authority: KR
Inventors: 타카유키 요시모토; 야스히로 카타히라; 야스히로 야마시타
Original assignee: 도쿄 메디컬 유니버시티; 가부시키가이샤 사이세이
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2024-01-22
Also published as: EP4342478A1; WO2022244851A1; JPWO2022244851A1

Abstract

특정한 유전자를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. hTERT 또는 pTERT 유전자 중 어느 하나 및 bmi-1 유전자, HPV-E6 유전자, HPV-E7 유전자를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제를 제공한다. 여기서, 상기 간엽계 줄기세포는 인간 또는 돼지 유래인 것이 바람직하고, 상기 배양 상청은 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, 메탈로프로테이나제 조직 저해제, 혈관 내피세포 증식인자, 간세포 증식인자, 종양 괴사인자 수용체 II, 및 오스테오프로테게린·파골세포 분화 억제인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3종류 이상의 사이토카인을, 각각 1×10³∼1×10⁶pg/mL의 농도 범위에서 포함하는 것이 바람직하다.

Description

욕창의 예방제 및/또는 치료제

본 발명은 간엽계 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는, 욕창의 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 간엽계 줄기세포에 유전자를 도입해서 제작한 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는 욕창의 예방제 및/또는 치료제에 관한 것이다.

현재의 사회에서는, 고령화가 진행된 것에 의해, 다양한 질환에 이환하는 고령자가 증가하는 경향이 있다. 그리고, 고령자의 경우, 누워 있게 되면, 욕창의 문제가 발생한다.「욕창」이란 누워 있는 등에 기인하여, 체중으로 압박되고 있는 몸의 부위의 혈류가 나빠지거나 정체되어, 그것에 의해서 체중으로 압박되어 있는 부위의 피부의 일부가 붉게 되거나, 진무르거나, 상처가 생기는 것을 말한다. 일반적으로, 「욕창」이라고도 말해진다.

건상인의 경우, 수면 중에도 무의식적으로 몸을 뒤척이고, 장시간 의자에 앉아 있을 때는 엉덩이를 뜨우는 등의 동작을 행하여 동일한 부위에 장시간의 압박이 가해지지 않도록, 「체위 변환」을 행하고 있다.

그러나, 스스로 체위 변환을 행할 수 없게 되면, 장시간, 체중으로 압박된 피부의 세포에 충분한 산소나 영양이 보급되지 않고, 이것에 의해 「욕창」이 형성된다.「욕창」은 피부의 표면 뿐만 아니라, 피부 중에 있는 뼈에 가까운 조직이 상처받아서 형성되는 경우도 있다.

장기간 누워 있는 환자뿐만 아니라, 항암제나 스테로이드 등의 약의 부작용으로 면역력이 저하하고 있는 환자, 울혈성 심부전, 골반 골절, 척수 손상, 당뇨병, 뇌혈관 질환, 만성 폐색성 폐질환 등에 이환하고 있는 환자는, 욕창에 걸리기 쉽기 때문에 주의가 필요하다. 이것은 욕창의 형성이 세균 등의 감염로가 되기 때문이다. 이 때문에, 어떤 욕창이 형성되어 있는지에 의해, 약제의 도포, 드레싱재에 의한 피복 등의 보존적 치료, 및 절제 및 조직 재건 등의 외과적 치료가 행해지고 있다.

욕창의 치료제로서는, 아연화 연고, 올세논(등록상표) 연고, 리플랩(등록상표) 연고, 액트신(등록상표) 연고 기타의 마크로골 연고, 트레티노인 토코페릴, 리소짐 염산염 등의 화합물이, 욕창의 부위의 상태에 따라서 다른 약제와 병용해서 사용되고 있다.

한편, 최근에는 화합물이 아닌 생체 물질을 이용한 바이오 의약품을 사용하는 치료법이 행해지고 있고, 2015년에는, 인간 타가 골수 간엽계 줄기세포(이하, 「MSC」라고 하는 경우가 있다.)가 급성 이식편대숙주병의 치료에 대하여, 일본국내에서 최초 재생 의료 등 제품으로서 승인되어 있다(이하, 「종래 기술 1」이라고 한다.). 이것은 간엽계 줄기세포(이하, 「MSC」라고 하는 경우가 있다.)는 간엽계에 속하는 체성 줄기세포이고, 골수나 지방 조직, 제대, 제대혈, 치수 등으로부터 채취 가능하고, 골아 세포나 지방 세포, 근육 세포, 연골 세포 등의 간엽계 세포로의 분화능을 갖는 것, 또한 면역 억제나, 염증 부위에의 손상 조직에 집적하기 쉬운 성질을 갖고, 조직 수복·재생능을 나타내는 것에 기초하는 것이다. 이것에 의해, MSC는 재생 의료의 세포 요법으로서 이목을 모으고 있다.

여기서, 후생 노동성에 의하면, 광의의 「재생 의료」란 살아 있는 세포를 조립한 기기 등을 환자의 체내에 이식 등 하는 것 또는 내재성 줄기세포를 세포 증식 분화 인자에 의해 활성화/분화시킴으로써, 손상된 장기나 조직의 자기 재생 능력을 활성화함으로써 손실된 기능을 회복시키는 의료를 말한다. 보다 구체적으로는, 환자의 체외에서 인공적으로 배양된 줄기세포 등을, 환자의 체내에 이식 등 함으로써 손상된 장기나 조직을 재생하고, 손실된 인체 기능을 회복시키는 의료 및 환자의 체외에 있어서 줄기세포 등으로부터 인공적 구축한 조직을, 환자의 체내에 이식 등 함으로써 손상된 장기나 조직을 재생하고, 손실된 인체 기능을 회복시키는 의료를 말한다.

현재, 욕창 치료약으로서 염기성 섬유 아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, 이하, 「bFGF」라고 하는 경우가 있다.)가 시판되어 있다(비특허문헌 1 참조). 또한, 골수 또는 제대혈 유래의 MSC를 세포 요법에 사용한 경우, 욕창 모델에 대하여 효과가 있다고 하는 것이, 이미 보고되어 있다. 또한, MSC 자신이 소포체 스트레스의 억제 효과를 통해 욕창의 치유에 관여하고 있는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 2 참조, 이하, 「종래 기술 2」라고 한다). 여기서, 소포체 스트레스란 소포체(이하, 「ER」이라고 생략하는 경우가 있다.)에서 단백질이 정상으로 접히지 않고, 변성 단백질 기타의 정상으로 접히지 않은 단백질(이하, 「잘못된 단백질」이라고 하는 경우가 있는다.)이 축적함으로써 발생되는 현상을 말하고, 이러한 잘못된 단백질은 파킨슨병이나 알츠하이머병 등의 신경 변성 질환, 염증이나 암 등에 관여하는 것이 보고되어 있다. 또한, ER 스트레스가 발생하면, 소포체 스트레스 응답(UPR:unfolded protein response)이라고 불리는 몇몇의 시그널 전달 경로의 활성화가 야기되는 것도 알려져 있다.

또한, MSC로서 인간 유치 유래의 치수 줄기세포를 사용하고, 불사화 유전자(hTERT나 HPV16 E6/E7, hBMI1)를 도입한 세포주를 제작하는 기술이 알려져 있다(특허문헌 1 참조, WO2017/078176 참조, 이하, 「종래 기술 3」이라고 한다.)

WO2017/078176

Robson M, et al. The safety and effect of topically applied recombinant basic fibroblast growth factor on the healing of chronic pressure sores Ann Surg. 1992 216:401-406. Motegi S, et al., Protective effect of mesenchymal stem cells on the pressure ulcer formation by the regulation of oxidative and endoplasmic reticulum stress. Sci Rep. 2017 7(1):17186. Y. Yukie, et al. Thickness and pressure deformability of soft tissue over the sacrum in elderly and young subjects. 일본 간호 연구 학회잡지 vol.27, No.2 2004

종래 기술 1은 인간 타가 MSC를, 급성 이식편대숙주병의 치료에 대하여 사용한다고 하는 점에서는 우수하고 있다. 그러나, 종래 기술 1은 용도가 급성이식편대숙주병의 치료에 한정되어 있는 것, 및 타가 세포를 사용하기 때문에, 면역 응답을 생기게 할 가능성을 배제할 수 없다고 하는 문제가 있다.

종래 기술 2는, 골수 또는 제대혈 유래의 MSC를 세포 요법에 사용한 경우, 욕창 모델에 대하여 효과가 있다고 하는 점에서는 우수하고 있다. 그러나, 여기서 사용되고 있는 MSC는 세포 자체이고, 종래 기술 1과 동일하게, 면역 응답을 생기게 할 가능성을 배제할 수 없다고 하는 문제가 있었다.

또한, 상기 세포 요법으로 MSC를 사용한 경우, 염증 국소로 유주하여 손상 세포와 교체된다고 하는 메카니즘 외, 세포로부터 분비되어지는 사이토카인이나 증식인자 등의 트로픽 인자에 의한 파라크린 효과라고 하는 메카니즘도 생각되고 있다. 그러나, 이러한 트로픽 인자의 종류 및 산생량은 사용한 세포 집단에 의해 상이하다고 하는 문제가 있었다.

종래 기술 3은 불사화 유전자(hTERT나 HPV16 E6/E7, hBMI1)를 도입한 세포주를 제작한다고 하는 점에서는 우수하고 있다. 그러나, 종래 기술 3에서는, 얻어진 불사화 줄기세포 또는 그 배양 상청을, 욕창의 예방 및/또는 치료에 사용한다고 하는 것은 전혀 상정되어 있지 않다.

따라서, 효과 및 안전성이 높은 욕창의 예방 및/또는 치료제에 대한 강한 사회적 요청이 있었다.

본원 발명은 상기와 같은 사정 하에서 완성되어진 것이고, 특정한 유전자를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는, 욕창의 예방 및/또는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본원 발명의 제 1 형태는, bmi-1 유전자, HPV-E6 유전자, HPV-E7 유전자, 및 TERT 유전자를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는, 욕창의 예방 및/또는 치료제이다. 여기서, 상기 TERT는 hTERT 또는 pTERT인 것이 바람직하다. 또한, 상기 간엽계 줄기세포는 치수 줄기세포인 것이 바람직하다. 또한, 상기 치수 줄기세포는 인간 또는 돼지 유래인 것이 바람직하다.

또한, 상기 배양 상청은 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, 메탈로프로테이나제 조직 저해제, 혈관 내피세포 증식인자, 간세포 증식인자, 종양 괴사인자 수용체 II 및 오스테오프로테게린·파골세포 분화 억제인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3종류 이상의 사이토카인을, 각각 1×10³∼1×10⁶pg/mL의 농도 범위로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질은 IGFBP-2, IGFBP-3, 및 IGFBP-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 것이 바람직하다. 또한, 상기 메탈로프로테이나제 조직 저해제는 TIMP-1 또는 TIMP-2인 것이 바람직하다.

상기 배양 상청은 동결품, 동결 건조 분말, 및 액제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태인 것이 바람직하다. 또한, 상기 욕창의 예방 및/또는 치료제는, 필요에 따라서, 부형제, pH 조정제, 희석제, 완충제 등을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 욕창의 예방 및/또는 치료제는 주사제, 연고, 경고, 크림제, 및 경피 흡수제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것이 바람직하다.

본원 발명의 욕창의 예방 및/또는 치료제에 의하면, bmi-1, HPV-E6, HPV-E7, 및 TERT 유전자를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 함으로써, 욕창을 예방할 수 있고, 또한 욕창이 형성된 후이어도, 신속한 회복을 촉진시킬 수 있다.

또한, 본원 발명의 욕창의 예방 및/또는 치료제에 의하면, 상기 불사화 줄기세포를 사용하기 때문에, 배양 상청 중의 함유 성분의 종류 및 양을 안정시킬 수 있고, 품질이 일정한 욕창의 예방 및/또는 치료제를 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용하는 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청(hSHED-CM) 중에 일정 농도 이상으로 포함되는 사이토카인을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 상기 hSHED-CM의 조제 방법을 나타내는 플로우차트이다.
도 3은 상기 hSHED-CM 중에 포함되는 사이토카인의 정량적 발현 해석의 플로우차트이다.
도 4는 상기 hSHED-CM 중에 포함되는 사이토카인의 정성적 발현 해석의 플로우차트이다.
도 5는 상기 hSHED-CM 중으로부터 얻은 엑소좀 중의 마이크로 RNA의 발현 해석의 플로우차트이다(그 1).
도 6은 상기 hSHED-CM 중으로부터 얻은 엑소좀 중의 마이크로 RNA의 발현 해석의 플로우차트이다(그 2).
도 7은 도 4의 순서로 얻은 사이토카인의 정성적 발현 해석 결과를 나타내는 그래프이다(그것의 1).
도 8은 도 4의 순서로 얻은 사이토카인의 정성적 발현 해석 결과를 나타내는 그래프이다(그것의 2).
도 9는 실험적으로 마우스에 욕창을 형성시키는 방법(A) 및 형성된 욕창(B)을 나타내는 사진이다. 도 9(C) 및 (D)는 그것들 사진을 나타낸 선도이다.
도 10은 투여 스케줄 1일 때의 투여 부위 및 투여 결과를 나타내는 도면이다. 도 10(A)는 투여 스케줄 1(I/R 처치의 다음날부터 4일 연속 투여 후, 1일 쉬고 2일 연속 투여)를 나타내고, 투여 부위를 도 10(B)에 나타낸다. 또한, 도10(C)는 재관류 후의 장애 면적의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 10(C) 중, DMEM은 둘베코 변법 이글 배지를, hSHED-CM은 인간 치수 줄기세포 유래의 불사화 줄기세포의 배양 상청을, 또한 bFGF는 염기성 섬유 아세포 성장인자를 각각 나타낸다.
도 11은 투여 스케줄 2일 때의 투여 부위 및 투여 결과를 나타내는 도면이다. 도 11(A)는 투여 스케줄 2(I/R 처치의 다음날부터 7일 연속 투여)를 나타내고, 투여 부위를 도 11(B)에 나타낸다. 또한, 도 11(C)는 재관류 후의 장애 면적의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11(C) 중, DMEM은 둘베코 변법 이글 배지를, hSHED-CM은 인간 치수 줄기세포 유래의 불사화 줄기세포의 배양 상청을 각각 나타낸다.
도 12(A)는 도 11(A)에 나타낸 투여 스케줄로 치료한 마우스의 욕창 형성 부위의 치유 상황을 나타내는 사진이다. 상단은 Day 2∼Day 12 사이의 대상군의 마우스의 I/R처치 부위의 변화를, 또한, 하단은 동일한 기간 내의 hSHED-CM 투여군의 상기 부위의 변화를 각각 나타낸 사진이다. 도 12(B)는 그들의 사진을 모식적으로 나타내는 선도이다.
도 13은 투여 스케줄 3일 때의 투여 부위 및 투여 결과를 나타내는 도면이다. 도 13(A)는 I/R 처치 부위를 나타내고, 적색의 화살표는, 100μl를 일방의 I/R 처치 부위에 투여한 것을 나타낸다. 도 13(B)는 투여 스케줄 3(I/R 처치의 다음날부터 7일 연속 투여)을 나타내고, Day 4에 있어서, 환부 조직을 도 11(C)에 나타내는 부위로부터 채취했다.
도 14는 도 13(C)에 나타내는 환부 조직을 채재(採材)한 마우스의 모습을 나타내는 사진(도 14(A)) 및 그 부위를 확대한 사진(동 (B)) 및 그 조직을 포르말린 고정한 상태를 나타내는 사진이다(동 (C)). 사진 아래((A) 및 (B)) 또는 옆(C)에 그 선도를 나타낸다.
도 15는 도 14(C)에 나타내는 채재 조직을 파라핀 포매하고, 박절한 절편의 헤마톡실린·에오신(HE) 염색과 활성 산소의 지표인 8-OHdG의 면역 조직 화학 염색을 행한 사진(도 15(A)) 및 그 면적을 정량화한 그래프(도 15(B))이다. 도 15(A)에 있어서, 확대한 염색 사진을 모식적으로 나타낸 선도를 4단째에 나타낸다. 선도 중, 흰 부분은 절편을, 또한 사선부는 절편 중 8-OHdG가 양성이었던 부위를 각각 나타낸다.
도 16는 도 14에 나타낸 조직을 파라핀 포매하고 박절 절편을 HE 염색과 페리사이트의 마커인 CD31에 대한 항체를 사용한 면역 조직 화학 염색을 행한 사진(도 16(A)), 및 그 CD31+의 면적을 정량해서 비교한 결과(동 도면(B))이다. 도 16(A)에 있어서, 3단째에 있는 확대한 염색 사진의 모식적인 선도를 4단째에 나타낸다. 선도 중 흰색 부분은 절편, 또한 그 절편 중에 있는 검은 선은 mCD31 양성이었던 부위이고, 화살표로 강조되어 있다.
도 17은 도 14에 나타낸 조직을 파라핀 포매하고 박절한 절편의 HE 염색과 페리사이트의 마커인 NG2에 대한 항체를 사용한 면역 조직 화학 염색을 행한 사진(도 17(A)) 및 그 NG2+의 면적을 정량해서 비교한 결과(동 도면(B))이다. 도 17(A)에 있어서, 3단째에 있는 확대한 염색 사진의 모식적인 선도를 4단째에 나타낸다. 선도 중 흰색 부분은 절편이고, 그 절편 중에 있는 검은 파선은 조직의 경계선을 나타내고, 또한 검은 선은 mCD31 양성이었던 부위를 나타내고, 화살표로 강조되어 있다.
도 18은 투여 스케줄 4일 때의 투여 부위 및 투여 결과를 나타내는 도면이다. 도 18(A)는 투여 스케줄 4(욕창 발증 후부터 7일간 연속 투여)를 나타내고, 투여 부위를 도 18(B)에 나타낸다. 또한, 도 18(C)는 장애 면적의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 18(C) 중, 화살표는 투여 개시일을 나타낸다. 도면 중, Control medium은 둘베코 변법 이글 배지를, hSHED-CM은 인간 치수 줄기세포 유래의 불사화 줄기세포의 배양 상청을 각각 나타낸다.
도 19(A)는 도 18(A)에 나타낸 투여 스케줄로 치료한 마우스의 욕창 형성 부위의 치유 상황을 나타내는 사진이다. 상단은 Day 2∼Day 10 사이의 대상군의 마우스의 욕창 형성 처치(이하, 「I/R 처치」라고 하는 경우가 있다.) 부위의 변화를, 또한 하단은 동일한 기간 내의 hSHED-CM 투여군의 상기 부위의 변화를 각각 나타낸 사진이다. 도 19(B)는 그들 사진을 모식적으로 나타낸 선도이다.
도 20은 I/R 처치 부위에, 소정의 사이토카인을 투여하는 경우의 실험 계획을 나타내는 모식도이다. 도 20(A)는 소정의 인자를 제거한 배양 상청의 투여 스케줄을 나타낸다. 또한, 도 20(B)는 마우스에의 투여 부위(욕창 부위)를 나타내는 모식도이다.
도 21은 도 20(A)의 투여 스케줄에 따라서, 도 20(B)에 나타내는 부위에 각 인자의 투여를 행했을 때의 창상 형성 영역의 크기의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 21(A)는 음성 대조(컨트롤 항체(control Ab))를 사용한 경우, (B)는 IGFBP-4을 제거한 상기 배양 상청을 사용한 경우, 도 21(C)는 VFGF를 제거한 상기 배양 상청을 사용한 경우, 및 도 21(D)는 HGF를 제거한 상기 배양 상청을 사용한 경우의 결과를 나타낸다.
도 22는 상기 배양 상청에 의한 활성 산소종(이하, 「ROS」라고 약기하는 경우가 있다.)의 억제 효과를 나타내기 위해서, 욕창 모델의 발증 메카니즘을 in vitro의 계에서 재현한 실험 공정의 모식도이다.
도 23은 도 22에 나타낸 in vitro 실험에 있어서 특이적 항체로 HGF, VEGF를 면역 침강에 의해 제거한 상청에서 NIH3T3을 배양했을 때의 ROS의 억제의 변화를 나타내는 형광 현미경에 의한 관찰 결과이다. 도 23(A)는 그 관찰 사진, (B)는 그 사진을 의미하는 선도이다.
도 24는 도 23의 사진의 최대 휘도와 최소 휘도로부터 산출한 콘트라스트를 ROS의 상대값으로서 정량 비교한 그래프이다.
도 25는 마우스 섬유 아세포주 NIH3T3 세포를 사용했을 때의 상기 배양 상청에 의한 소포체 스트레스의 억제 효과를 나타낸다. 도 25(A)는 1.5㎍/mL 튜니카마신(이하, 「TM」이라고 약기하는 경우가 있다.)을 첨가해서 리얼타임 PCR을 실행하기까지의 공정을 나타내는 모식도이다. 도 25(B)는 회수한 처리 완료 NIH3T3 세포를 리얼타임 PCR에 제공했을 때의, 소포체 스트레스 마커의 mRNA 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 26은 본 발명의 배양 상청의 사전 투여가 욕창의 발증 억제에 효과가 있는 것을 나타내는 실험의 모식도이다. 도 26(A)는 모델 마우스에의 투여 스케줄을 모식적으로 나타내는 도면이다. 도 26(B)는 마우스에의 SHED-CM 투여 부위를 나타내는 모식도이다.
도 27은 본 발명의 배양 상청의 사전 투여가 욕창의 발증 억제에 효과가 있는 것을 나타낸다. 도 27(A)는 7일간의 배양 상청 투여 후의 피부의 두께의 비교 결과를 나타내는 관찰상과 그 선도이며, 도 27(B)는 그 두께를 정량해서 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 28은 도 26(A)에 나타낸 투여 스케줄 6일 때의 투여 결과를 나타내는 도면이다. 도 28(A)는 장애 면적의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 28(B)는 사전 처치한 마우스의 욕창 형성 부위의 치유 상황을 나타내는 사진 및 그것을 모식적으로 나타낸 선도이다. 상단은 대상군의 마우스, 하단은 hSHED-CM 투여군의 I/R 처치 부위의 변화를 각각 나타내는 사진 및 상기 선도이다.

이하, 본원 발명의 일실시형태를, 도 1∼도 28을 참조해서 설명한다. 또한, 이하의 설명 및 도면에 있어서는, 동일 또는 동등한 요소에는 동일 부호를 붙이고, 중복하는 설명을 생략한다.

본 발명의 제 1 형태의 욕창의 예방 및/또는 치료제는, 이하의 순서로 제작된다. 즉, (S1) 간엽계 줄기세포에 특정한 4유전자의 세트를 조립하여 불사화 줄기세포를 제작하고, (S2) 얻어진 상기 간엽계 불사화 줄기세포를 배양하고, 그 배양 상청을 조제하고, (S3) 상기 배양 상청을 유효 성분으로 하는, 욕창의 예방 및/또는 치료제를 제작한다

본원 발명의 불사화 줄기세포를 얻기 위해서는, 우선, 포유류의 간엽계 세포로부터 줄기세포를 단리한다. 상기 포유류로서는 인간, 돼지, 말, 및 원숭이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이, 인간 세포와의 유전적 유사성이 높은 점, 및 감염의 위험성이 낮은 점으로부터 바람직하다.

본 명세서 중, 「간엽계 세포」란 골아 세포, 지방 세포, 근육 세포, 연골 세포 등, 간엽계에 속하는 세포로의 분화능을 갖는다고 하는 세포를 말한다. 구체적인 간엽계 세포로서는, 상기의 동물의 치수 세포, 골수 세포, 제대 세포 및 지방세포 등을 들 수 있다. 또한, 「치수 세포」란 재생능을 갖는 치아의 신경에 포함되는 줄기세포의 일종을 말한다. 치아라고 하는 경질한 재료로 보호되어 있기 때문에 자외선이나 방사선을 통과시키지 않고, 유전자도 상처받기 어렵다고 하는 특성을 갖는다.

또한, 상기 유전자의 세트는, bmi-1, HPV-E6, HPV-E7, 및 TERT로 이루어진다. hTERT는 텔로미어 수복 효소의 유전자이며, bmi-1은 폴리콤 복합체를 구성하는 단백질의 1개인 Bmi-1의 유전자이다. 여기서, Bmi-1은 조혈 줄기세포의 유지에 필요하고, 활성 증강에 의해 조혈 줄기세포를 늘릴 수 있다고 하는 작용을 갖는다. E6 및 E7은 HPV-16 또는 HPV-18의 DNA의 초기 유전자이다.

이하에, 인간의 탈락 유치로부터 치수 세포를 사용한 불사화 줄기세포의 제작을 설명한다.

우선, 탈락 유치를, 예를 들면, 클로로헥시딘, 이소딘 용액, 그 밖의 소독약으로 소독한 후, 치관부를 분할하고, 치과용 리머로 치수 조직을 회수한다.

채취한 치수 조직을, 기본 배지, 예를 들면, 5∼15% 소 혈청(이하, 「CS」라고 하는 경우가 있다.) 및 50∼150유닛/mL의 항생 물질을 함유하는 둘베코 변법 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 이하, 「DMEM」이라고 한다.)에 현탁한다. 다음에, 1∼5mg/mL의 콜라게나제 및 1∼5mg/mL의 디스파제를 사용하고, 37℃에서, 0.5∼2시간 처리한다.

상기 기본 배지로서는, DMEM 외, 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM)(GIBCO사등), 햄 F12 배지(HamF12)(SIGMA사, GIBCO사 등), RPMI1640 배지 등을 사용할 수 있다. 2종 이상의 기본 배지를 병용하는 것으로 해도 된다. 혼합 배지의 일례로서, IMDM과 HamF12를 등량 혼합한 배지(예를 들면 상품명:IMDM/HamF12(GIBCO사)로서 시판된다)를 들 수 있다.

또한, 기본 배지에 첨가하는 것으로서는, 소 태하 혈청(이하, 「FCS」라고 한다.), 인간 혈청, 양 혈청 기타의 혈청, 혈청 대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등), 소 혈청 알부민(이하, 「BSA」라고 하는 경우가 있다.), 페니실린, 스트렙토마이신 기타의 항생 물질, 각종 비타민, 각종 미네랄을 들 수 있다.

상기의 기본 배지는, 후술하는 세포 선별용의 배양, 및 선별 후의 세포의 배양에 사용할 수도 있다.

효소 처리 후, 3∼10분 간의 원심 조작(3,000∼7,000회전/분)을 행하고, 치수 세포를 회수한다. 필요에 따라서, 셀 스트레이너를 사용해서 세포의 선별을 행한다. 선별된 세포를, 예를 들면, 3∼6mL의 상기 기본 배지로 재현탁하고, 직경 4∼8cm의 부착성 세포 배양용 디시에 파종한다.

이어서, 배양액, 예를 들면, 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가한 후, 5% CO₂인큐베이터에서, 37℃에서 2주간 정도 배양한다. 상기 배양액을 제거한 후, PBS 등으로 세포를 1∼수회 세정한다. 배양액의 제거 및 세포의 세정을 대신하여 콜로니를 형성한 접착성의 치수 줄기세포를 회수할 수도 있다. 접착성의 치수 줄기세포는, 예를 들면, 0.025∼0.1%의 트립신과 0.3∼1mM의 EDTA로, 수분 간, 37℃에서 처리해서 디시로부터 박리시키고, 이어서 세포를 회수한다.

다음에, 상기한 바와 같이 선별된 접착성 세포를 배양한다. 예를 들면, 상기한 바와 같이 해서 얻은 치수 줄기세포를 부착성 세포 배양용 디시에 파종하고, 5% CO₂, 37℃의 조건으로 인큐베이터에서 배양한다.

계대 배양은 예를 들면, 육안으로 관찰해서 서브컨플루언트 또는 컨플루언트에 달했을 때에, 상술한 바와 같이, 트립신과 EDTA를 사용해서 세포를 배양 용기로부터 박리시켜서 회수하고, 다시, 배양액을 넣은 배양 용기에 파종한다.

여기서, 서브컨플루언트란 배양 용기 중의 세포 부착면의 약 70%에 세포가 부착된 상태를 말한다. 예를 들면, 계대 배양을 1∼8회 행하고, 선별된 세포를, 필요한 세포수, 예를 들면 약 1×10⁷개/mL까지 증식시킨다. 이상과 같이 배양한 후에, 세포를 회수해서 액체 질소 중에서 보존한다. 다양한 도너로부터 회수한 세포를 치수 줄기세포 뱅크의 형태로 보존하기로 해도 좋다.

이어서, 상기 줄기세포를 초기 배양해서 얻어진 초기 배양 세포에, 4종류의 유전자를 도입해서 유전자 도입 세포를 제작한다. 여기에 도입하는 유전자는, 상기한 바와 같은 hTERT, bmi-1, E6 및 E7인 것이, 보다 개체수 배가 횟수가 많은 불사화 줄기세포를 얻을 수 있는 점으로부터 바람직하다. 여기서, hTERT는, 인간 텔로머라제 역전사 효소의 유전자이고, bmi-1은 줄기세포의 자기 복제나 분화 제어에 관계하고 있는 폴리콤군 유전자이다. E6 및 E7은 인간 파필로마 바이러스가 자기 복제를 위해 사용하는 초기 유전자를 코드하는 오픈 리딩 프레임 중에 존재하는 유전자이다.

이러한 유전자의 도입은 이하와 같이 해서 행할 수 있다.

목적으로 하는 상기의 유전자를 조립하기 위한 플라스미드를 조제하고, 이것을 셔틀 벡터, 예를 들면, pSuttle2에 조립하고, 상기의 유전자를 클로닝한다. 이 셔틀 벡터로 대장균을 형질 전환하고, 카나마이신 내성 형질 전환체를 선택한다. 선택한 카나마이신 내성 형질 전환체의 플라스미드 DNA를 정제하고, 제한 효소 부위를 해석해서 재조합체를 동정한다.

1. DNA 단편의 제작 및 바이러스 벡터 제작 공정

1.1 바이러스 조립용 DNA 단편의 제작

우선, 바이러스에 DNA 단편을 조립하기 위해서 사용하는 벡터의 서열 정보를 입수한다. 본 발명의 방법에서, 유전자 도입용 벡터로서 사용하는 바이러스는, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 레트로 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것이, 도입된 유전자가 일과성이 아니게 발현되어지는 점으로부터 바람직하다. 렌티바이러스를 사용하는 것이, 도입 유전자의 안정 발현주의 산생 효율이 높기 때문에 바람직하다.

이하에, 렌티 플라스미드 벡터(pLVSIN)를 사용한 경우를 예로 들어서 설명한다. pLVSIN의 서열 정보를, 예를 들면, 타카라바이오웹카탈로그로부터 다운로드하고, 멀티클로닝사이트를 확인한다.

다음에, 이하와 같이 해서 DNA 단편을 제작한다. 본 발명에서는, 상기 DNA 단편에 2∼4 유전자를 조립하고, 불사화 줄기세포를 제작한다. 사용하는 세포는, 포유류로부터 얻어지는 줄기세포이면 특별히 한정되지 않지만, 입수가 용이하고,또한, 형질이 안정한 불사화 줄기세포를 얻을 수 있는 점으로부터, 돼지 치수 조직, 돼지 지방 조직 또는 인간 치수 조직을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 여기에서 도입하는 유전자는, 2개의 파필로마 바이러스의 초기 유전자, 텔로머라제 역전사 효소(TERT) 및 bmi로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2 이상의 유전자의 세트인 것이, 안정한 형질을 갖는 불사화 줄기세포를 제작할 수 있는 점으로부터 바람직하다. 또한, 상기 파필로마 바이러스의 초기 유전자는, 인간 파필로마 바이러스 E6, 인간 파필로마 바이러스 E7인 것이 발현 효율의 점으로부터 바람직하다.

(a) 인간 파필로마 바이러스 E7 및 텔로머라제 역전사 효소(TERT); (b) bmi 및 TERT; (c) bmi, 인간 파필로마 바이러스 E6 및 TERT; (d) 인간 파필로마 바이러스 E6, 인간 파필로마 바이러스 E7 및 TERT; (e) bmi, 인간 파필로마 바이러스 E6, 인간 파필로마 바이러스 E7, 및 TERT;라고 하는, 어느 하나의 유전자의 세트를 포함하는 DNA 단편을 제작하고, 사용하는 것이 더욱 바람직하다. TERT은 hTERT를 사용하는 것이 유전자의 발현 효율의 점으로부터 바람직하다.

상기 유전자 중 TERT는 가령(加齡)에 따라서 짧아지는 텔로미어 배열을 신장시키는 효소를 코드하는 유전자이다. 인간 파필로마 바이러스 E6 및 E7은 모두, 인간 파필로마 바이러스의 초기 유전자이며, E6은 TERT의 재활성화나 PDZ 도메인을 갖는 단백질을 분해하는 것이 알려져 있다. bmi-1은 폴리콤군 유전자이고, 줄기세포의 자기 복제나 분화 제어에 관여하고 있다는 것이 알려져 있다.

상기와 같은 유전자의 세트를 조립함으로써, 이러한 유전자를 어떤 조합으로 도입하면, 효율적으로 이들이 발현되어져, 세포가 불사화할 수 있는지를 확인할 수 있다.

이하에, 렌티 바이러스 벡터를 제작하고, 2개의 유전자를 도입하는 경우를 설명한다. 상기 (a)의 세트인 인간 파필로마 바이러스 E7의 유전자 및 텔로머라제 역전사 효소(TERT)를 조립하기 위해서, 서열 정보에 따라서, 예를 들면, EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHI의 2본쇄 DNA(서열표의 서열번호 1)을 표준적인 순서로 합성한다. 얻어진 DNA 단편을, 상기의 렌티 플라스미드 벡터(pLVSIN-CMV Neo)의 멀티클로닝 사이트에 표준적인 순서로 클로닝하고, 상기 2개의 유전자를 조립한 렌티 벡터(E7T)를 얻을 수 있다.

동일하게 하여, 상이한 2개의 유전자를 도입하는 경우, 예를 들면, 상기 (b)의 세트를 도입하는 경우에는, 우선, Bmi-1을 포함하는 EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A4/hTERT/BamHI의 2본쇄 DNA(서열표의 서열번호 2)를 표준적인 순서로 합성한다. 얻어진 DNA 단편을, 상기의 렌티 플라스미드 벡터(pLVSIN-CMV Neo)의 멀티클로닝 사이트에 표준적인 순서로 클로닝하고, 상기 2개의 유전자를 조립한 렌티 벡터(BT)를 얻을 수 있다.

동일하게 하여, 3개의 유전자를 도입하는 경우에는, 서열 정보에 따라서 T2A3E6의 2본쇄 DNA를 합성하고, 상기 (v2)로 제작한 렌티 바이러스 벡터의 Bmi-1과 T2A4 사이에 삽입하고, EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A3/E6/T2A4/hTERT/Bam HI의 2본쇄 DNA를 제작한다(서열표의 서열번호 3). 얻어진 DNA 단편을, 상기의 렌티 플라스미드 벡터(pLVSIN-CMV Neo)의 멀티클로닝 사이트에 표준적인 순서로 클로닝하고, 상기 3개의 유전자를 조립한 렌티 벡터(BE6T)를 얻을 수 있다.

동일하게 하여 4개의 유전자를 도입하는 경우에는, E6T2A3의 2본쇄 DNA를 합성하고, 상기 (d)에서 제작한 렌티 바이러스 벡터 E7T의 Kozak 서열과 E7 사이에 삽입하고, EcoRI/KoZal/E6/T2A3/E7/T2A4/hTERT/BamHI를 제작하는(서열표의 서열번호 4) 것을 표준적인 순서로 합성한다. 얻어진 DNA 단편을, 상기의 렌티 플라스미드 벡터(pLVSIN-CMV Neo)의 멀티클로닝 사이트에 표준적인 순서로 클로닝하고, 상기 3개의 유전자를 조립한 렌티 벡터(E6E7T)를 얻을 수 있다. 이상과 같은 DNA 단편의 합성은 DNA의 합성을 수탁하는 기업에 의탁하여 행해도 좋다.

레트로 바이러스의 경우에는, 렌티 바이러스 벡터의 경우와는 상이하고, 개별의 유전자를 조립한 벡터를 제작해서 공감염에 의해 도입을 행한다. 예를 들면, 개시 코돈의 상류에 Kozak 서열(gccacc)을 부가한 5종류의 불사화 유전자(hTERT(서열 표의 서열번호 5), 인간 파필로마 바이러스의 E6(서열표의 서열번호 6) 및 인간 파필로마 바이러스의 E7(서열표의 서열번호 7), pigTERT(서열표의 서열번호 8) 및 hBmi-1(서열표의 서열번호 9))을 상법에 따라서 조제하고, pDON-5 NEO DNA (TaKaRa Code 3657)의 PmaC I-Hpa I 사이트에 상법에 따라서 클로닝하고, 레트로 바이러스 플라스미드 벡터(pDON-5 Neo hTERT 벡터, pDON-5 Neo HPV16E6 벡터, pDON-5 Neo HPV16E7 벡터, pDON-5 Neo pHTERT 벡터 및 pDON-5 Neo hBmi1 벡터)를 조제할 수 있다.

그 후, 상기한 바와 같이 해서 제작한 5종류의 플라스미드 DNA를 사용해서 상법에 따라서 대장균을 형질 전환시키고, 얻어진 형질 전환체를 CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하고, 트랜스펙션 그레이드의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있다.

이어서, 5.5∼6.5×10⁶개/dish에서 G3T-hi 세포를 소망의 플레이트에 파종하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중, 약 37℃에서 약 20∼28시간 배양하고, 소망의 양의 트랜스펙션 시약(예를 들면, 0.3∼0.5mL의 TransIT-293)을 더해서, 상기의 5종류 플라스미드 벡터 중에서 3종류를 선택하고, pGP 및 pE-Ampho(모두 Retrovirus Packaging Kit Ampho에 부속되는 벡터))를 공도입하고, 또한 동일한 조건 하에서 40∼56시간 배양을 행하여 이들의 유전자를 도입할 수 있다.

1.2 벡터 산생 세포의 조제

상기의 작업과 병행하여, 재조합 렌티 바이러스 벡터 산생 세포를 준비한다. 이러한 세포주로서는, 예를 들면, Lenti-X 293T(클론테크사 제품, 코드 번호: 632180) 그 밖의 시판의 세포주를 사용할 수 있다. Lenti-X 293T의 배양에는, 소 태아 혈청 및 항생 물질을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 이러한 배지로서는, 예를 들면, 최소 배지(MEM), 둘베코 개변 이글 배지(DMEM) 등을 들 수 있다. 예를 들면, 5∼15%의 소 태아 혈청(FBS, 하이클론사 제품), 0.5∼2%의 항생 물질(페니실린/스트렙토마이신, 기브코사 제품)을 함유하는 DMEM(SIGMA사 제품, St. Louis, MO) 등을 사용하는 것이 세포의 증식 효율의 점으로부터 바람직하다.

예를 들면, 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM을 조제하고, 이 배지를 기본 배지로서 사용할 수도 있다. 이하, 본 명세서 중에서는, 이 배지를 「293T 기본 배지」라고 한다.

예를 들면, 상기의 세포주로서 Lenti-X 293T를 사용하는 경우에는, 1∼5×10⁵cells/mL의 세포 현탁액을 조제하고, 10cm 디시에 이 현탁액을 10mL 넣고, 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 약 24시간 배양하고, 그 후, 사용하기까지, 세포의 상태에 따라서 계대한다. 사용에 있어서는, 우선, 계대를 계속한 세포의 배양 상청을 제거해서 PBS로 세정하고, 시판의 박리제를 더해서 세포를 디시로부터 박리시켜서 회수한다. 이어서, 약 3∼5배 희석한 세포 현탁액을 소망량을 취해 트리판블루 염색액을 더하고, 혈구 계산반을 사용해서 생세포수를 계수한다. 상기 기본 배지를 더해서 약 5×10⁵cells/mL의 세포 현탁액을 조제하고, 예를 들면, 소망의 농도로 디시에 파종하고, 소망의 조건으로 배양한다. 예를 들면, 직경 6cm의 콜라겐코트 디시에, 1∼4×10⁶cells/4mL에서 상청 세포를 파종하고, 그 후, 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 약37℃에서 약 24시간 배양하고, 배지를 교환해서 더욱 배양을 계속한다.

또한, 레트로 바이러스 조제 세포로서, 인간 신장 유래의 세포주 293T(G418 내성)에 히그로마이신 내성 유전자를 사용해서 인간 N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 III(N-acetylglucosaminyltransferase III: GnT-III)를 도입한 GnT-III 고발현 세포주인, G3T-hi 세포를 사용하는 것이 바람직하다(다카라 바이오(주) 제품).

상기 G3T-hi 세포는, Retrovirus Packaging Kit Eco 또는 Ampho(다카라 바이오(주) 제품, 제품 코드 6160, 6161)를 사용하고, gag-pol, env 유전자의 발현 벡터 플라스미드와 목적 유전자를 조립한 재조합 레트로 바이러스 벡터 플라스미드를 공도입함으로써, 신속하면서 또한 일과성으로 고역가의 재조합 바이러스를 산생할 수 있도록 디자인되어 있다. 그리고, 상기 G3T-hi 세포는 293T 유래이기 때문에, SV40의 T항원 유전자가 도입되어 있고, 이 유전자의 기능에 의해 레트로 바이러스의 RNA가 증폭되어, 고역가 바이러스액이 얻어지기 때문이다. 통상, Retrovirus Packaging Kit를 사용한 일과성 발현에서는 10⁵∼10⁷cfu/mL의 바이러스를 포함하는 용액이 얻어진다.

상기 G3T-hi 세포에서는, 세포막 당쇄가 GnT-III에 의해 수식된다. 발아하는 레트로 바이러스는 숙주 세포막을 감기 때문에, 상기 G3T-hi 세포로부터 얻어진 재조합 레트로 바이러스의 막 단백질의 당쇄는 GnT-III에 의해 수식을 받고 있다고 추측된다. 이 당쇄 수식에 의해, 상기 G3T-hi 세포를 사용해서 조제한 레트로 바이러스는, RetroNectin(재조합 인간 피브로넥틴 플래그먼트)으로의 친화성이 높아져 있기 때문에, 배양기의 코트제로서 RetroNectin을 사용함으로써 표적 세포로의 유전자 도입 효율이 크게 향상한다. RetroNectin 은 특히, 혈구계 세포를 표적으로 한 유전자 도입에 유효하다.

G3T-hi 세포를 사용하는 경우에는, 상기 293T 기본 배지 대신에, 글루코오스(4.5g/L) 및 L-글루타민(584mg/L)을 포함하는 DMEM에, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지를 사용하는 것이 레트로 바이러스의 산생 효율의 면으로부터 바람직하다.

1.3 바이러스 벡터의 제작

이하에, 렌티 바이러스 벡터의 경우를 예로 들어서 설명한다.

이상 설명한 바와 같이 배양하고 있는 세포가 든 복수의 디시에, 상기한 바와 같이 해서 제작한 렌티 바이러스 벡터 플라스미드를 각각 더해서 코트랜스펙션을 행한다. 이러한 코트랜스펙션에는, 시판의 패키징 시스템, 예를 들면, Lenti-X HTX 패키징 시스템(클론테크사 제품) 등을 사용할 수 있다. 구체적인 순서는, 이러한 시스템에 부속되어 있는 메뉴얼을 따르면 된다.

코트랜스펙션 종료 후에, 배지를 신선한 완전 배지로 교환하고, 약 37℃에서 24∼48시간 배양한다. 바이러스 벡터의 역가 측정을 행해서 회수의 타이밍을 결정하고, 바이러스 역가가 최대가 된 시점에서 바이러스 벡터를 포함하는 배양 상청을 회수한다. 바이러스 벡터의 역가 측정에는, 시판의 간이 역가 측정 키트를 사용할 수 있고, 이러한 키트로서는, 예를 들면, Lenti-X GoStix(클론테크사 제품) 등을 들 수 있다.

예를 들면, 배지를 교환한 다음날에, 상기의 샬레의 배양 상청을 소망의 크기의 시린지로 흡수해서 회수하고, 회수한 배양 상청을 여과해서 바이러스 벡터를 얻는다. 예를 들면, 10mL의 디스포저블 시린지(데루모(주) 제품)로 배양 상청을 흡수하고, 그 후, 이 시린지에 예를 들면, 0.45㎛의 필터(MILEX-HV, 밀리포어사 제품)을 장착하고, 시린지 내의 배양 상청을 여과하면서, 예를 들면, 15mL 튜브에, 바이러스 벡터 용액을 회수한다.

다음에, 시판의 간이 역가 측정 키트에 포함되어 있는 시약을 사용하고, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 존재를 확인한다. 예를 들면, 상기의 Lenti-X GoStix의 S에, 소망량의 바이러스 벡터 용액, 예를 들면 20㎕를 더하고, 또한 Chase Buffer 1을 첨가해서 실온에서 소망의 시간, 예를 들면 10분간 반응시켜, 밴드의 유무에 의해, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 존재를 확인할 수 있다.

이상과 같이 해서 얻어진 4개의 플라스미드(E7T, BT, BE6T 및 E6E7T)를 포함하는 세포를 한천 배지 상에 스트리크하고, 형성된 콜로니를 취하여 소망량의 배지, 예를 들면, 항생 물질을 포함하는 약 2mL의 LB 배지에 파종하고, 약 37℃에서 약 8시간, 격렬하게 교반하면서 진탕 배양한다. 이어서, 상이한 항생 물질, 예를 들면, 암피실린을 포함하는 LB 배지, 예를 들면, 약 50mL 중에, 상기한 바와 같이 배양한 세포의 배양액을 소망량, 예를 들면 100μL 이식하고, 약 37℃에서 약 14∼18시간, 격렬하게 교반하면서 진탕 배양한다.

시판의 키트, 예를 들면, MN NucleoBond Xtra Mid Kit(클론테크사 제품)를 사용해서 물로 용출된 플라스미드의 양을 측정한다. 이것과 함께, 소망의 겔, 예를 들면, 약 1%의 아가로스 겔로 분석을 행하고, 조립된 DNA가 각각 상이한 것을 확인한다. 겔 전기 영동 분석의 마커로서는, 예를 들면, 슈퍼 코일의 DNA 래더, λ-Hind III 소화 DNA 등을 사용할 수 있다. 이상과 같이 해서, 바이러스 벡터를 제작할 수 있다.

2. 포유류의 줄기세포의 조제

2.1 돼지 치수 줄기세포의 조제

생후 5∼6개월의 돼지의 악골(하악 치아가 있는 하악골) 및 장간막을 입수한다. 이하의 순서를 따라서 상기의 돼지의 치아와 하악골로부터 돼지의 치수 줄기세포(이하, 「SHED」라고 하는 경우가 있다.)를 얻는다.

우선, 상기 돼지의 치아와 하악골을, 적당한 소독제, 예를 들면, 이소딘으로 소독한다. 그 후, 예를 들면, 치과용 다이아몬드 포인트를 사용하여 하악 치아의 치관을 수평 방향으로 절단, 이어서, 수직 방향으로 절삭해서 천개를 제거한다. 치관 및 치근부에서, 예를 들면, 치과용 수술용 스케일러를 사용해서 치수를 채취한다.

얻어진 치수를, 예를 들면, 안하용 천도를 사용해서 초핑하고, 소망의 농도, 예를 들면, 1∼3mg/mL의 콜라게나제 용액에 현탁시키고, 약 37℃의 항온조 중에 소망의 시간, 예를 들면, 1시간 두어서 세포를 단리한다. 단리한 세포를, 소망의 배지, 예를 들면, 10% FBS 및 1% Anti-Anti(Antibiotic, Anti-myotic, Invitrogen사 제품, Carlsbad, CA)를 포함하는 DMEM 중에서, 약 37℃에서, 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 예비 배양하여 계대용의 세포를 얻는다.

우선, 서브 컨플루언트가 되기까지, 주 2∼3회의 빈도로 배지를 교환하면서 배양하고, 서브 컨플루언트가 된 세포를, 박리제, 예를 들면, 0.05% 트립신을 포함하는 Hepes 용액을 사용해서 박리시키고, 소망의 조건, 예를 들면, 실온에서 1,500rpm으로 약 3분간 원심하여 수집한다. 얻어진 세포를 신선한 배지에 옮기고, 상기와 동일한 조건 하에서, 소망의 양, 예를 들면, 전량을 사용해서 계대 배양을 행한다.

2.2 인간 유치 치수 줄기세포의 조제

건상아로부터 얻어진 탈락 유치 또는 발치한 유치를 입수한다. 이러한 유치를, 적당한 소독제, 예를 들면, 이소딘 용액으로 소독한 후, 돼지의 치수를 얻은 것과 동일하게 해서 치수 조직을 회수한다. 얻어진 치수 조직을, 소망 농도의 콜라게나제 및 디스파제, 예를 들면, 약 3mg/mL의 I형 콜라게나제 및 약 4mg/mL의 디스파제의 용액 중, 소망의 온도에서 소망의 시간, 예를 들면, 약 37℃에서 약 1시간, 소화한다. 이어서, 이 용액을, 예를 들면, 70mm의 세포 스트레이너(Falcon사 제품)를 사용해서 여과하고, 세포를 여과 선별한다.

이렇게 여과 선별한 세포를, 소망량, 예를 들면, 4mL의 상기 배지에 재현탁하고, 소망의 지름, 예를 들면, 직경 6cm의 부착성 세포 배양용 디시에 파종한다. 여기에, 소망의 배지, 예를 들면, 약 10% FCS를 함유하는 DMEM을 첨가하고, 5% CO₂, 37℃로 조정한 인큐베이터에서, 소망의 기간, 예를 들면 2주일 정도 배양한다. 콜로니를 형성한 접착성 세포(치수 줄기세포)를, 소망의 박리제, 예를 들면, 약0.05% 트립신을 포함하는 약 0.2mM EDTA에서 소망의 시간, 예를 들면, 5분간, 약 37℃에서 처리하고, 디시로부터 박리한 세포를 회수한다.

이어서, 상기한 바와 같이 해서 회수한 접착성 세포를, 예를 들면, 부착성 세포 배양용 디시(콜라겐코트 디시)에 파종하고, 예를 들면, 5% CO₂, 37℃로 조정한 인큐베이터 중에서 1차 배양하고, 초대 배양 세포로 한다. 육안 관찰로 서브 컨플루언트 또는 컨플루언트가 되었을 때에, 상기와 동일한 박리제를 사용해서 마찬가지로 처리하고, 디시 내포의 세포를 회수한다.

그 후, 1차 배양 세포를 상기의 배지를 사용해서 소망의 농도, 예를 들면, 약 1×10⁴cells/cm² 농도로 계대 배양하고, 1∼3회 정도 계대한 세포를 실험에 사용한다. 이상과 같이 해서, 인간 탈락 유치 치수 줄기세포(SHED)를 얻을 수 있다.

필요에 따라서, 상기한 바와 같이 해서 얻어진 돼지 유치 치수 줄기세포, 돼지 지방 줄기세포 및 인간 유치 치수 줄기세포를 각각 바이알에 넣고, 마이너스 80도에서 동결 보존해도 된다.

3. 유전자 도입 세포의 제작

3.1 렌티 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

이상과 같이 해서 얻어진 돼지 치수 줄기세포, 돼지 지방 줄기세포, 및 인간 치수 줄기세포를 상기와 동일하게 배양하고, 약 70∼90% 컨플루언트가 되었을 때, 시판의 키트를 사용하여 마이코플라즈마 체크를 행한다. 이러한 키트로서는, 예를 들면, MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza사 제품, LT07-318) 등을 사용할 수 있다. 다음에, 폴리부텐 시약을 사용하고, 상기한 바와 같이 해서 제작한 렌티 바이러스 벡터를 상기의 각 줄기세포에 감염시키고, 약제 선택을 행하여 목적유전자의 안정 발현주를 선택한다.

상기한 바와 같이 배양한 각 줄기세포의 배양 상청을 제거하고, 예를 들면, PBS(pH 7.4)로 세정한 후에, 소망의 박리제를 사용해서 세포를 박리시키고, 개별로 회수한다. 이러한 박리제로서는, 예를 들면, 돼지 유치 치수 줄기세포 및 돼지 지방 줄기세포에 대해서는 StemPro(등록상표:GIBCO사 제품), 인간 유치 치수 줄기세포에 대해서는 Trypsin-EDTA 등을 사용할 수 있다.

얻어진 세포를 정법에 따라서 계수하고, 예를 들면, 조직 배양 처리(T. C. treatment)한 6웰 플레이트(CORNING사 제품)의 각 well에, 약 1×10⁵cells/well이 되도록 파종하고, 약 37℃의 CO₂ 인큐베이터 내에서 약 24시간 배양하고, 세포가 전체에 균일하게 존재하고 있는 것을 확인한다.

그 후, 배양 상청을 제거하고, 돼지 유치 치수 줄기세포에 대해서는, 소망 농도의 폴리부텐을 포함하는 소망의 배지, 예를 들면, 약 8㎍/mL의 폴리부텐 및 약 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 소망량, 예를 들면, 750μL/well식 첨가한다. 이어서, 각 웰에 상기한 바와 같이 해서 얻어진 렌티 바이러스 벡터 용액을, 예를 들면, 약 250μL/well씩 첨가한다.

인간 유치 치수 줄기세포의 경우는, 상기와 동일한 폴리부텐 및 FBS를 포함하는 DMEM을, 소망의 양, 예를 들면, 약 1.2mL/well씩 첨가하고, 이어서, 각 웰에 상기 렌티 바이러스 벡터 용액을 소망량, 예를 들면, 약 400μL/웰씩 첨가한다.

이상과 같이 바이러스 벡터를 첨가한 각각의 플레이트를, 소망의 조건, 예를 들면, 약 1,000×g에서 약 30분간, 약 32℃에서 원심하고, 세포에 바이러스를 감염시킨다. 그 후, 소망의 조건, 예를 들면, 약 37℃의 CO₂ 인큐베이터 내에서 약 4∼ 약 6시간 배양하고, 그 후, 각 웰 중에 배양 배지를 소망의 양, 예를 들면, 약 1 mL/웰씩 첨가하고, 또한 소망의 조건, 예를 들면, 37℃의 CO₂ 인큐베이터 내에서 약24시간 배양하여 유전자 도입을 행한다.

3.2 약제 선택

이상과 같이 배양한 줄기세포(돼지 치수 줄기세포, 돼지 지방 줄기세포 및 인간 치수 줄기세포)의 배양 플레이트의 각 웰로부터 배양 상청을 제거하고, 소망 농도의 선택 약제, 예를 들면, 약 0.4mg/mL 또는 약 0.8mg/mL의 GENETICIN(G418, GIBCO사 제품)을 포함하는 선택 배지를, 소망의 양, 예를 들면, 약 2mL/well 각 웰에 가하고, 선택 배지로 교환한다. 이후, 배지 교환을 행하면서 소망의 기간, 예를 들면, 약 3∼약 5일간 배양하고, 유전자 도입 세포의 선택을 행한다.

상기의 각 배양 세포의 일부를 클로닝에 제공하고, 나머지는 풀 세포로서 선택용 배지에 배양을 계속한다. 클로닝은 이하와 같이 행할 수 있다.

예를 들면, 항생 물질을 포함하지 않는 선택 배지, 예를 들면, 페니실린, 스트렙토마이신 및 G418을 포함하지 않는 선택 배지를 사용해서 세포를 희석하고, 소망의 농도, 예를 들면, 약 1×10³cells/4mL 또는 약 5×10³cells/4mL를, 각 디시에 파종하고, 이어서, 약 37℃의 CO₂ 인큐베이터 내에서 약 24시간 배양한다. 형성된 콜로니를 디시의 뒷측으로부터 마킹하고, 콜로니 수가 소망의 수, 예를 들면, 약 100개가 되었을 때 배양 상청을 제거하여 PBS로 세정한다. 클로닝 링을 디시에 세트하고, 박리제를 사용해서 벗긴 콜로니의 세포를, 각각 소망의 양, 예를 들면, 약 1mL의 배지를 넣은 48웰 플레이트의 각 웰에 개별적으로 넣는다.

3.3 총 RNA의 조제

유전자 발현의 확인용에, 예를 들면, NucleoSpin RNA II(MACHEREY- NAGEL사제품의 키트)를 사용해서 총 RNA를 조제한다. 이하에 사용하는 다양한 버퍼, 링 필터 등은 상기의 키트에 부속되는 것을 사용하고, 키트에 부속되는 메뉴얼을 따르고, 조작을 행하는 것이 고순도의 총 mRNA를 얻는 점에서 바람직하다.

소망의 수, 예를 들면, 약 5×10⁵개의 세포로 제작한 세포 펠릿을 용해시켜서 용해액을 조제하고, 자색의 링 필터에 이 용해액을 넣고, 소망의 조건, 예를 들면, 약 11,000×g에서 약 1분간 원심한다. 원심 후, 필터를 버리고, 콜렉션 튜브에 소망량의 에탄올, 예를 들면, 약 350μL의 약 70% 에탄올을 더해서, 소망의 횟수, 예를 들면, 약 5회 피펫팅을 행한다.

이어서, 얻어진 용액을 소망량, 예를 들면, 약 700μL 취해서 콜렉션 튜브에 세트한 옅은 청색의 링 컬럼에 로드하고, 소망의 조건, 예를 들면, 약 11,000×g으로 약 30초간 원심하여 RNA를 결합시킨다. 원심 후, 이 컬럼을 새로운 콜렉션 튜브에 세트하고, 소망량의 시약, 예를 들면, 약 350μL의 MDB를 더해서, 소망의 조건, 예를 들면, 약 11,000×g으로 약 1분간 원심 분리를 행하고, 탈염한다.

원심 후, 소망량, 예를 들면, 약 10μL의 rDNase와 약 90μL의 DNase용 반응 버퍼를 가볍게 섞어서 DNA 반응 혼합액을 조제하고, 소망량, 예를 들면, 약 95μL를 이 컬럼에 가하고, 소망의 조건, 예를 들면, 실온에서 약 15분간 인큐베이트해서 DNA를 소화한다. 계속해서, 소망량, 예를 들면, 200μL의 버퍼 RA2를 컬럼에 더하고, 소망의 조건, 예를 들면, 약 11,000×g으로 약 30초간 원심하여 세정한다. 계속해서, 컬럼을 새로운 콜렉션 튜브에 세트하고, 소망량, 예를 들면, 약 700μL의 버퍼 RA3을 이 컬럼에 더해서, 소망의 조건, 예를 들면, 약 11,000×g으로, 또한 약 30초간 원심하여 세정한다.

계속해서, 콜렉션 튜브에 유출된 용액을 버리고, 다시, 소망량, 예를 들면, 약 250μL의 버퍼 RA3을 이 컬럼에 더하고, 또한 소망의 조건, 예를 들면, 약11,000×g으로 약 2분간 원심하고, 이 컬럼의 실리카 멤브레인을 풍건시킨다. 이 컬럼을, 소망의 크기, 예를 들면, 약 1.5mL의 콜렉션 튜브에 세트하고, 소망량, 예를 들면, 약 60μL의 RNAase-free수를 이 컬럼에 더해서, 소망의 조건, 예를 들면, 약 11,000×g으로 약 1분간 원심하여, 총 RNA 샘플을 얻는다.

3.4 역전사 반응

상기한 바와 같이 해서 얻어진 총 RNA 샘플로부터 역전사를 행하고, 계속해서 리얼타임 PCR을 행해서 PCR 산물을 얻는다. 역전사에는, 예를 들면, PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real time, TaKaRa Bio사 제품) 등의 시판품을 사용하고, 이러한 키트에 부속되어 있는 메뉴얼에 따라서 역전사를 행하면 된다.

리얼타임 PCR은, 예를 들면, SYBR Premix Ex Taq 등의 시판의 키트를 사용해서 행할 수 있다. 또한, 여기에서 사용하는 표준 유전자로서는, 예를 들면, 돼지 β-액틴, 인간 β-액틴 등을 들 수 있고, 프라이머로서, 예를 들면, 서열표의 서열번호 10∼15에 나타내는 바와 같은 프라이머를 조제해서 사용할 수 있다.

우선, 소망량, 예를 들면, 약 350μL의 SYBR Premix Ex Taq II(×2)과, 약 28μL의 Primer mix(약 10μL)와, 약 266μL의 2회 증류수를 혼합해서 리얼타임 PCR용 Premix를 조제한다. 다음에, 소망량, 예를 들면, 상기의 Premix를 약 23μL씩 리얼타임 PCR용 튜브에 분주하고, 각 튜브에 주형 cDNA를 약 2μL씩 첨가한다. 이어서, 소망의 조건, 예를 들면, 약 95℃에서 약 30초, (약 95℃에서 약 5초 그 후, 약 60℃에서 약 30초)를 약 40사이클로 하는 조건으로, 리얼타임 PCR을 행한다. 계속해서, 약 95℃에서 약 15초, 약 60℃에서 약 30초, 약 95℃에서 약 15초로 하는 조건으로 분해시켜, 융해 곡선을 구한다. 인간 치수 줄기세포에 대해서도 동일한 조작을 행한다.

이상과 같이 해서 작성한 검량선으로부터, 각 바이러스 벡터로 유전자를 도입한 세포에 있어서의 각 유전자의 발현량을 구할 수 있다. 내부 표준 유전자의 발현량으로 보정을 행함으로써, 정밀도가 양호한 결과를 얻을 수 있다.

유전자를 도입한 각 줄기세포에 있어서, 도입된 유전자가 발현되고 있는 것을 확인한다. 이 확인에 의해, 상술한 바와 같이 제작한 각 바이러스 벡터에 의한 유전자의 도입 효율을 구할 수 있다. 다음에, 이상과 같이 해서 얻어진 유전자 도입 세포(이하, 「도입 유전자 안정 발현 세포 집단」또는 「풀 세포」라고 하는 경우가 있다.)로부터, 세포의 싱글 셀 클로닝을 행한다.

우선, 상기의 풀 세포를, 소망의 크기의 디시에 소망의 개수, 예를 들면, 60mm 디시에 약 1×10³개/디시의 세포 농도로 파종하고, CO₂ 인큐베이터 중에서, 소망의 온도로 소망의 시간, 예를 들면, 37℃에서 24시간 배양한다. 그 후, 상술한 선택 약제를 포함하는 생육 배지도 배지를 교환하고, 배양을 계속해서 콜로니를 형성시킨다. 형성된 콜로니를, 클로닝 링 및 박리제를 사용해서 콜로니마다로 박리시키고, 각각 소망의 플레이트, 예를 들면, 24웰 플레이트에 파종한다.

파종한 세포를 증식시킨 후에, 배양용 디시 등에 파종해서 증식시키고, 확대 배양을 행함으로써, 도입 유전자 안정 세포를 싱글 클론으로서 얻을 수 있다. 다음에, 얻어진 클론을, 상술한 것과 동일하게 배양하고, 증식시켜서 총 mRNA를 얻는다. 얻어진 총 RNA를 주형으로서, 소망의 키트, 예를 들면, PrimeScript RT reagent Kit를 사용해서 역전사 반응을 행하고, 주형 cDNA를 얻는다.

그 후, 예를 들면, cDNA(역전사 산물)를 주형으로 하고, 상술한 SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus), 프라이머(도입 유전자 및 내부 표준 유전자의 각각 특이적인 프라이머, 예를 들면, 서열표의 서열번호 10∼15에 나타내는 프라이머)를 사용하고, 상기와 동일하게 해서 리얼타임 PCR을 행한다.

상기 리얼타임 PCR의 2차 미분 곡선으로부터 산출한 Ct값을 X축에, 총 RNA의 상대값을 Y축에 각각 플롯하고, 각 유전자의 발현량 측정용의 검량선을 작성한다. 풀 세포의 발현량을 1로 했을 때의, 돼지 치수 줄기세포 유래의 도입 유전자 및 인간 치수 줄기세포 유래의 도입 유전자의 발현량의 상대값을 구함으로써, 도입한 유전자가 모두 발현되어 있거나, 또한 그들의 발현량을 구하여 목적으로 하는 클론을 선택한다.

이상과 같이 해서, 소망의 유전자를 도입한 불사화 줄기세포의 집단, 및 그 집단으로부터 클로닝된 불사화 줄기세포의 클론을 얻을 수 있다.

얻어진 형질 전환체 중에서, 예를 들면, 암피실린을 사용하고, 암피실린 내성 이질 전환체(이하, 「Amp+」라고 한다.)를 선택하여 정제하고, 제한 효소 부위를 해석해서 재조합체를 동정한다. 다음에, 예를 들면, Pac I에서 재조합 아데노바이러스를 소화하고, 얻어진 단편을 HEK293 세포에 트랜스펙트해서 증식시키고, 이것을 수집하여 상기 바이러스의 역가를 측정한다. 상법에 따라서 상기 바이러스를 정제하고, 표적 세포인 SHED-P에 감염시킨다.

바이러스 감염 후의 HEK293의 세포군을 상법에 따라서 FITC로 염색하고, 플로우 사이토미터를 사용하고, STRO-1 양성 세포를 검출한다. 여기서, STRO-1은 골수에 있어서의 다분화능을 갖는 간엽계 줄기세포의 마커의 1개로서 생각되고 있어, 세포의 불사화의 지표가 된다. 이상의 순서에 의해, 치수 유래의 불사화 줄기세포를 얻을 수 있다.

다음에, 얻어진 불사화 줄기세포를, 상술한 기본 배지, 예를 들면, 10% FBS를 더한 DMEM을 사용하고, 5% CO₂, 37℃의 조건 하에서, 24∼48시간 배양하고, 배양 상청을 얻는다. 배양 상청의 회수는, 예를 들면, 코마고메 피펫 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 불사화 줄기세포는, 인슐린 유사 성장인자(IGFBPs), 혈관 내피세포 증식인자(VEGF), 조직 메탈로프로테이나제조(TIMPs), 및 간세포 증식인자(HGF) 그 밖의 성장인자를 배양 상청 중에 분비한다. 여기서, 「성장인자」란 세포 분열을 촉진시키거나, 형태의 변화나 비대를 초래하거나 하는 폴리펩티드의 총칭이다. 성장인자를 산생하는 세포의 종류에 의해 인자는 상이하고, 상피 성장인자(EGF), 섬유 아세포 성장인자(FGF), 신경 성장인자(NGF), 종양 증식인자(TGF) 등으로 대별된다.

또한, 각 세포의 세포막에 있는 수용체는 티로신 키나제 활성을 갖고, 성장인자가 결합하면, 단백질의 티로신 잔기가 인산화되고, 세포의 증식이나 분화를 야기한다. 성장인자가 개체 발생에 있어서 중배엽 유도 물질이 되어 있는 예가 몇몇 알려져 있다. 또한, 면역계를 조절하는 림포카인 개체 발생에 있어서 중배엽 유도 물질이 되어 있는 예가 몇몇 알려져 있다. 이러한 성장인자는, 공지의 ELISA법, 마이크로 어레이법 등으로 정량할 수 있다.

상기 IGFBPs는, 인슐린과 배열이 고도로 유사한 폴리펩티드이고, 세포 배양으로 인슐린과 동일하게 유계 분열 유발 등의 반응을 야기한다. 신경 세포의 성장에도 영향을 주는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 VEGF는, 배(胚)의 형성 기에, 혈관이 없는 곳에 새로운 혈관을 형성하는 맥관 형성 및 기존의 혈관으로부터 분지 신장해서 혈관을 형성하는 혈관 신생에 관여하는 일군의 당 단백질이다. HGF는 간세포뿐만 아니라 다양한 세포에 대하여, 세포 증식 촉진, 세포 운동 촉진, 항아폽토시스(세포사), 형태 형성 유도, 혈관 신생 그 밖의 조직·장기의 재생과 보호를 담당하는 다재한 생리 활성을 갖고 있다.

상술한 각종 줄기세포를, 예를 들면, 15% FCS를 첨가한 DMEM 중에서, 37℃에서 소정의 기간, 배양함으로써, 상기의 성장인자를 포함하는 배양 상청을 얻을 수 있다. 또한, 상기 줄기세포의 배양 상청에는, IGFBPs, VEGF, 및 HGF 이외에도, 많은 단백질이 포함된다.

얻어진 배양 상청 중 15mL을, Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(밀리포어사 제품)에 넣고, 4,000×g에서 약 60분간 원심하고, 약 200㎕까지 농축한다. 다음에, 이 튜브에 배양 상청과 동량의 멸균 PBS를 투입하고, 다시, 4,000×g으로 약 60분간 원심하고, 용매를 PBS로 치환한다. 얻어진 200μL의 용액을 마이크로테스트 튜브로 회수하여 농축 줄기세포 배양 상청이라고 한다.

상기의 Amicon을 사용하는 방법을 대신하여, 에탄올 침전법으로 농축할 수도 있다. 예를 들면, 5mL의 배양 상청에 대하여 45mL의 100% 에탄올을 더해서 혼화하고, -20℃에서 60분간 방치한다. 그 후, 15,000×g으로 15분간, 4℃에서 원심하고, 상청액을 제거한다.

이어서, 예를 들면, 10mL의 90% 에탄올을 더해서 잘 교반하고, 다시, 15,000×g으로 5분간, 4℃에서 원심한다. 상청액을 제거하고, 얻어진 펠릿을, 예를 들면, 500μL의 멸균수에 용해할 수 있다. 용해 후, 전량을 마이크로테스트 튜브로 회수하고, 농축 줄기세포 배양 상청으로 한다.

이상과 같이 해서 얻어진 배양 상청을 상법에 따라서 동결 건조하면, 용시 조제의 조성물인 입자분말 13을 얻을 수 있다.

실시예

(실시예 1) 불사화 SHED의 작출(作出) 및 배양 상청의 조제

1. 아데노바이러스 도입용 벡터의 제작

(1) 시약 등

(1-1) 플라스미드 추출용 시약

카나마이신(Kan), 암피실린(Amp), LB 액체 배지 및 LB 한천 배지, 글리코겐, 아가로스, 멸균수, 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨, 도데실황산 나트륨 및 RNase A를 사용했다. 50mg/mL의 카나마이신(Kan) 및 암피실린(Amp)을 조제하고, 스톡 용액으로서 -20℃에서 보존했다. 글리코겐은 20mg/mL로 조제했다. 10mg/mL의 RNase A를 조제해서 -20℃에서 보존했다. 10M(포화) 아세트산 암모늄(NH₄OAc), 3M의 아세트산 나트륨(NaOAc; pH 5.2)을 조제했다.

(1-2) 제한 효소 등

대장균 컴피텐트 셀(Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, 제품 코드636756), Swa I(제품 코드 1111A, Smi I가 동등품), Xho I(제품 코드 1094A), T4 DNA Ligase(제품 코드 2011A), NucleoBond Xtra Midi(제품 코드 740410.10/.50/.100), NucleoSpin Plasmid(제품 코드 74058810/50/250)은 모두 다카라 바이오(주)로부터 구입했다. Pac I은 New England Biolabs로부터 구입했다.

(1-3) 버퍼 등

1×TE Buffer(1mM의 EDTA를 포함하는 10mM Tris-HCl[pH 8.0]), 100mM Tris-HCl(pH 8.0)로 포화한 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1, 이하, 「PCI 혼액」이라고 한다.)을 조제했다. 에탄올은 100% 및 70%로 사용했다. 미니스케일에서의 재조합에서 사용하는 pAdeno-X 플라스미드 DNA의 정제용에, 이하의 버퍼 1∼4를 조제했다.

버퍼 1: 10mM EDTA 및 50mM 글루코오스를 포함하는 25mM Tris-HCl(pH 8.0)

(오토클레이브 후, 4℃에서 보존)

버퍼 2: 1% SDS를 포함하는 0.2M NaOH(사용 직전에 용시 조제, 밀봉하고, 실온 보존)

버퍼 3: 5M KOAc(오토클레이브 후, 4℃에서 보존)

버퍼 4: 1mM EDTA, 20㎍/mL RNase를 포함하는 10mM Tris-HCl(pH 8.0)

(사용 직전에 RNase를 첨가한다. -20℃에서 보존)

(2) 아데노바이러스 정제 및 β-gal 애세이용 시약

인간 5형 아데노바이러스로 형질 전환한 인간 HEK293 세포(ATCC #CRL1573)를 사용했다. HEK293 세포는 완전 배지에서 배양했다. 완전 배지의 조성은 100 unit/mL의 페니실린 G 나트륨과 100㎍/mL의 스트렙토마이신, 4mM의 글루타민 및 10% FBS를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 기본 배지)로 했다. 페니실린 G 나트륨 용액은 10,000units/mL, 황산 스트렙토마이신 용액은 10,000㎍/mL로 조제하고, 스톡 용액으로서 보존했다. 배양에는, 60mm 플레이트, 100mm 플레이트, 6-웰 플레이트, T75 및 T175 플라스크를 사용했다.

트립신-EDTA(제품 코드 CC-5012)는 다카라 바이오(주)로부터 구입했다. 인산 완충 생리식염수(PBS, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 불포함) 및 Dulbecco's 인산 완충 생리식염수(DPBS, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 함유)를 조제했다. 또한, 0.33%의 뉴트럴 레드 염색액, 0.4%트리판 블루 염색액을 사용했다. β-gal 애세이에는, X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(25mg/mL))디메틸포름아미드(DMF) 용액은 -20℃에서 차광 보존했다. Luminescent β-gal Detection Kit II(제품 코드 631712, 다카라 바이오(주) 제품)을 사용했다.

(3) 예비 시험

(3-1) lacZ를 포함하는 재조합 아데노바이러스(pAdeno-X-lacZ)의 구축

10mL의 상술한 완전 배지에, 해동 후, DMSO를 제거한 HEK293 세포를 재현탁하고, 전량을 직경 100mm의 배양 플레이트에 옮겼다. HEK293 세포가 부착된 후에 배양액을 제거하고, 세포를 멸균 PBS로 한번 세정하고, 1mL의 트립신-EDTA 용액을 더해서 약 2분간 처리했다. 다음에, 10mL의 완전 배지를 더해서 트립신의 반응을 중지하고, 부드럽게 현탁했다. 바이어블 카운트(viable count)를 행하고, 배양액10mL을 넣은 직경 100mm의 플레이트에 10⁵개의 세포를 옮기고, 균일하게 펼쳤다.

pShuttle2-lacZ(Adeno-X Expression System 1에 포함되어 있는 양성 대조 벡터)와 키트에 포함되어 있는 Adeno-X Viral DNA(PI-Sce I 및 I-Ceu I digested)를 사용하고, 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라서, lacZ를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 구축했다. 표적 세포인 SHED에 감염시키고, β-갈락토시다제의 발현을 애세이하고, 벡터가 구축되어 있는 것을 확인했다.

(3-2) 재조합 pShuttle 2 플라스미드의 구축

재조합 pShuttle 2 Vector(이하, 「rpShuttle 2 Vector」라고 한다.)의 구축전에, 키트에 포함되어 있는 pShuttle 2 Vector 및 pShuttle 2-lacZ Vector로 DH5α대장균을 형질 전환했다. 50㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트(이하, 「LB/Kan」이라고 한다.) 상에서 형질 전환체를 선택하고, 단일 콜로니로부터 취한 균체를 새로운 LB/Kan에 획선하고, 37℃에서 밤새 인큐베이트했다.

다음에, hTERT, bmi-1, HPV-E6, HPV-E7을, pShuttle 2에 이하의 순서로 클로닝했다. 이들의 유전자에 적합한 제한 효소로 pShuttle 2 Vector를 절단했다. 이어서, 상기의 키트에 첨부되어 있는 pShuttle 2 Vector Information Packet(PT3416-5)을 참조하고, 삽입하는 DNA에 합치하는 멀티클로닝 사이트를 결정했다. 제한 효소처리 완료의 상기 플라스미드를 알칼리포스파타제로 처리해서 정제했다.

상법에 따라서, 표적 DNA 단편을 조제해서 정제했다. 상기의 제한 효소로 소화한 벡터와 상기의 유전자 단편을 라이게이션하고, DH5α 세포(컴피텐트 세포)를, 라이게이션 산물로 형질 전환했다. 상기 컴피텐트 세포의 일부를 취하고, 키트에 포함되어 있는 대조 벡터 pShuttle2-lacZ Vector로 형질 전환해서 양성 대조로 했다.

형질 전환한 대장균을 포함하는 혼합액을, LB/Kan 한천 플레이트에 접종하고, 카나마이신 내성(Kanr)의 형질 전환체(콜로니)를 선택했다. 5∼10개의 Kan 내성 클론을 선택하고, 소량의 액체 배지에 접종해서 증폭했다. 이들의 클론이 rpShuttle 2 Vector를 갖고 있는 것을 확인한 후에, 밤새 인큐베이트했다. 그 후, 시판의 실리카 흡착 컬럼을 사용하고, 상법에 따라서, 구축된 플라스미드 DNA를 정제했다.

이 플라스미드 DNA를 제한 효소로 처리하고, 1% 아가로스 겔 전기 영동을 행하고, 목적의 재조합 플라스미드를 동정했다. 시퀀싱에 의해, 삽입된 단편의 방향과 삽입 부위를 확인하고, 포지티브 클론을 동정했다. 재조합 pShuttle 2 플라스미드 DNA(이하, 「rpShuttle 2 플라스미드 DNA」라고 한다.)를 타겟 세포에 직접적으로 트랜스펙트하고, 웨스턴 블롯을 행하여 목적 단백질의 발현을 예비적으로 체크했다.

(3-3) rpShuttle 2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 2중 소화

상기한 바와 같이 해서 제작한 rpShuttle2 플라스미드 DNA로부터, 도입한 유전자의 발현 카세트를 PI-Sce I 및 I-Ceu I로부터 잘라냈다. 키트에 첨부된 프로토콜에 기재된 in vitro 라이게이션법에 따라서, 잘라낸 발현 카세트를 Adeno-X Viral DNA에 조립했다. rpShuttle 2 플라스미드 DNA의 PI-Sce I/I-Ceu I 2중 소화액을 30㎕ 조제하고, 하기의 표 1에 기재한 시약을 1.5mL의 멸균 완료의 마이크로 원심 튜브에 넣어서 혼합했다.

다음에, 충분히 혼화한 후에 마이크로 원심 튜브에 넣어서 가볍게 원심하고, 그 후, 37℃에서 3시간 인큐베이트했다. 1kb 래더(DNA 사이즈 마커)와 아울러 상기 2중 소화 후의 반응액(5μL)을 1% 아가로스/EtBr 겔로 영동했다.

(3-4) 페놀: 클로로포름: 이소아밀알콜 추출

원심 튜브에, 상술한 2중 소화액의 나머지(25㎕)에, 70μL의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100μL의 PCI 혼액을 첨가하고, 보텍스로 충분히 교반했다. 다음에, 미량 원심기를 사용하고, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5mL의 마이크로 원심 튜브로 옮겼다. 여기에, 400μL의 95% 에탄올, 25μL의 10M 아세트산 암모늄, 및 1μL의 글리코겐(20mg/mL)을 첨가하고, 보텍스로 충분히 교반했다.

다음에, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 흡인해서 제거하고, 펠릿을 얻었다. 이 펠릿에 300μL의 70% 에탄올을 가하고, 실온에서 14,000rpm으로 2분간 원심했다. 상청을 조심스럽게 흡인해서 제거하고, 펠릿을 실온에서 약 15분간 풍건했다.

펠릿이 건조한 후에, 이것을 10μL의 멸균한 1×TE Buffer(pH 8.0)에 용해하고, 사용하기까지 -20℃에서 보존했다.

(4) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 구축

(4-1) Adeno-X 바이러스 게놈에의 발현 카세트의 서브 클로닝

하기의 표 2에 나타내는 시약을, 순번대로 1.5mL의 멸균 완료 마이크로 원심 튜브에 넣고, 부드럽게 혼화하고, 가볍게 원심한 후에, 16℃에서 밤새 인큐베이트했다.

각 샘플에, 90μL의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100μL의 PCI 혼액을 가하고, 보텍스로 부드럽게 교반했다. 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5mL의 마이크로 원심 튜브로 옮기고, 여기에 400μL의 95% 에탄올, 25μL의 10M아세트산 암모늄, 및 1μL의 글리코겐(20mg/mL)을 첨가하고, 보텍스로 부드럽게 교반했다.

4℃에서 5분간, 14,000rpm으로 원심하고, 상청을 흡인에 의해 제거해서 펠릿을 얻었다. 이하의 에탄올 침전 조작은 상기 (3-4)와 동일하게 행했다. 펠릿이 건조한 후에, 이것을 15μL의 멸균 탈이온 수에 용해했다.

(4-2) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 Swa I 소화

하기 표 3에 나타내는 소화액을 조제하고, 원심 튜브에 넣은 각 샘플에 더해서, 2시간, 25℃에서, 인큐베이트했다.

각 샘플에, 80μL의 1×TE Buffer(pH 8.0)와 100μL의 PCI 혼액을 더하고, 보텍스로 부드럽게 교반했다. 마이크로 원심 튜브, 4℃에서 5분간, 14,000rpm으로 원심했다. 이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)와 동일하게 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다.

(4-3) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA에 의한 대장균의 형질 전환의 확인

일렉트로포레이션용 컴피텐트 셀(대장균)을, Supercharge EZ10Electrocompetent Cell(제품 코드 636756)을 사용하고, 상기 (4-2)에서 얻은 Swa I 소화 산물로 형질 전환했다. 형질 전환 혼합액을, LB 배지에 암피실린(종농도 100㎍/mL)을 가한 한천 플레이트(이하, 「LB/Amp 한천 플레이트」라고 한다.)에 접종하고, 37℃에서 밤새 인큐베이트했다. 암피실린 내성(Ampr) 형질 전환체로서, 약 10⁶개의 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를, 제품에 부속의 Adeno-X System PCR Screening Primer Set로 체크했다.

5mL의 신선한 LB/Amp 액체 배지에 단일의 콜로니로부터의 균체를 접종하고, 밤새 배양했다. 다음날, 후술하는 미니 스케일법에 따라서, Adeno-X 플라스미드 DNA를 정제했다.

(5) 재조합 Adeno-X 플라스미드 DNA의 미니 스케일 조제

대수 증식에 있는 배양액 5mL을, 14,000rpm으로 30초간 원심하고, 상청을 제거했다. 펠릿을 다시 10,000rpm으로 1분간 원심하고, 마이크로 피펫을 사용하여 상청을 제거했다. 여기에, 150μL의 상기 버퍼 1을 더해서 부드럽게 피펫팅하고, 재현탁했다. 이 세포 현탁액에, 150μL의 버퍼 2를 첨가하고, 부드럽게 전도 혼화하고, 빙상에 5분간 방치했다. 냉각한 세포 현탁액에, 150μL의 버퍼 3을 더하고, 다시 전도 혼화하고, 빙상에 5분간 방치했다.

이 세포 현탁액을, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 투명한 상청을 청정한 1.5mL의 원심 튜브로 옮겼다. 이 상청에, 450μL의 PCI 혼액을 첨가하고, 전도 혼화해서 교반했다. 그 후, 4℃에서 14,000rpm으로 5분간 원심하고, 수층을 청정한 1.5mL의 마이크로 원심 튜브로 옮겼다.

이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (4-1)과 동일하게 조작을 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다. 목적의 rDNA는, 후술하는 제한 효소에 의한 해석 및 PCR에 의해 동정했다.

(6) 얻어진 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 제한 효소 부위 해석

PI-Sce I 및 I-Ceu I를 사용해서 해석을 행했다. 하기의 표 4에 나타내는 시약을, 1.5mL의 멸균완료 마이크로 원심 튜브에 넣고, 30μL의 PI-Sce I/I-Ceu I 2중 소화 반응액을 더하여 충분히 교반하고, 가볍게 회전시켜서 내용물을 수집했다.

37℃에서 3시간 인큐베이트하고, 제한 효소 처리를 행했다. 이 처리 후의 반응액을 1% 아가로스/EtBr 겔로 영동했다.

(7) 재조합 아데노바이러스의 산생

(7-1) HEK293세포 트랜스펙트용 rAdeno-X 플라스미드 DNA의 조제

하기 표 5에 나타내는 시약 등을, 1.5mL의 멸균완료 원심 튜브에 넣어서 혼합하고, 미량 원심기로 가볍게 원심했다. 그 후, 37℃에서 2시간, 인큐베이트하고, rAdeno-X 플라스미드 DNA의 Pac I 제한 효소 처리를 행했다.

60μL의 1×TE Buffer(pH 8.0)와, 100μL의 PCI 혼액을 첨가하고, 보텍스로 부드럽게 교반하고, 미량 원심기로, 4℃에서 5분간, 14,000rpm으로 원심했다. 수층을, 청정한 1.5mL의 멸균완료 원심 튜브에 조심스럽게 옮겼다.

이하의 에탄올 침전의 조작은 상기 (3-4)과 동일하게 조작을 행하고, 펠릿의 용해액은 사용까지 -20℃에서 보존했다.

(7-2) Pac I 소화 Adeno-X 플라스미드 DNA의 HEK293 세포에의 트랜스펙션

상기 플라스미드 DNA의 트랜스펙션의 24시간 전에, 직경 60mm의 배양 플레이트당의 세포수가 1∼2×10⁶(약 100cells/mm²)이 되도록, HEK293 세포를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 존재 하에 인큐베이트했다.

각 배양 플레이트에, Pac I 소화한 10μL의 Adeno-X 플라스미드 DNA를 트랜스펙트하고, 표준적인 트랜스펙션법(CalPhos Mammalian Transfection Kit 제품 코드 631312, 다카라 바이오(주) 제품)에 따라서, HEK293 세포에 Adeno-X DNA를 도입했다. 트랜스펙션의 다음날부터, CPE(세포 변성 효과)가 일어나고 있는지의 여부를 확인했다. 1주일 후에, 배양 플레이트의 저면이나 측면에 부착되어 있는 세포를 부드럽게 교반해서 유리시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 15mL의 멸균완료의 원추 원심 튜브로 옮기고, 실온에서 5분간, 1,500×g으로 원심했다.

얻어진 침전을, 500μL의 멸균 PBS에 현탁했다. 드라이 아이스/에탄올 중에서 동결시키고, 37℃의 항온조에서 융해시킨다고 하는 동결 융해 조작을 3회 반복하고, 세포를 충분히 융해시킨 용해물을 얻었다. 다음에, 가볍게 원심해서 부유물을 제거하고, 상청을 멸균한 다른 튜브로 옮기고, 즉시 사용했다. 즉시 사용하지 않는 쪽은 -20℃에서 보존했다. 60mm 플레이트의 배양 세포에 250μL의 상기 용해물을 첨가하고, 배양을 계속했다. 또한, Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드631028, 다카라 바이오(주) 제품)에 포함되는 항Hexon 항체를 사용하고, 이 키트의 취급 설명서(PT3651-1)에 따라서, 아데노바이러스의 역가를 측정했다.

(7-3) 고역가 바이러스 조제를 위한 바이러스의 증폭

이 역가 측정을 개시하는 약 24시간 전에, HEK293 세포를 T75 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 하룻밤 배양하고, 50∼70% 컨플루언트가 되어 있는 것을 확인했다.

다음날, 바이러스를 포함하는 새로운 배지와 교환하고, MOI=10으로 감염시켰다. 37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 90분간 배양한 후에 플라스크를 인출하고, 10mL의 배지를 더했다.

37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 3∼4일간 배양하고, CPE를 확인했다. 50%의 세포가 벗겨졌을 때, 상기와 마찬가지로 해서 유리 세포 현탁액으로 하고, 15mL의 멸균완료 원추 원심 튜브로 옮겼다. 상기와 동일한 동결 융해 조작을 행하고, 세포를 융해시켰다. Adeno-X Rapid Titer Kit(제품 코드 631028)를 사용하고, 10⁷PFU/mL의 역가를 얻었다. 웨스턴 블로팅을 행하고, 패키징된 아데노바이러스 게놈이, 목적 유전자에 특이적인 전사 단위의 카피를, 기능하는 형태로 가지고 있는지를 확인했다.

(8) 표적 세포에의 아데노바이러스 감염

(8-1) 표적 세포에의 감염

감염의 24시간 전에 6-웰 플레이트에 1×10⁶개의 SHED를 접종했다. 접종의 다음날에 배지를 제거하고, 바이러스를 포함하는 1.0mL의 배지를 각 플레이트의 중심에 첨가했다. 이 용액을 SHED가 형성한 단층 전체에 균일하게 펼쳤다.

37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 4시간 배양하고, 바이러스를 SHED에 감염시켰다. 다음에, 신선한 배지를 첨가하고, 또한, 37℃, 5% CO₂ 존재 하에서 배양했다. 감염 24시간 후∼48시간 후에 걸쳐서 도입 유전자의 발현을 경과적으로 해석했다.

(8-2) 감염 세포의 β-갈락토시다제 발현의 해석

Adeno-X-lacZ을 감염시킨 접착성 세포에 있어서의 β-갈락토시다제의 발현은 Luminescent β-galDetection Kit II(제품 코드 631712, 클론테크사 제품)를 사용해서 애세이했다.

2. 레트로 바이러스 벡터의 제작

(1) 시약 등

G3T-hi 세포(다카라 바이오 제품, 제품 코드 6163), TransIT-293(트랜스펙션 시약, 다카라 바이오 제품, 제품 코드 MIR2704), Retrovirus Packaging Kit Ampho(다카라 바이오 제품, 제품 코드 6161), Retrovirus Titer Set(for Real Time PCR)(다카라 바이오 제품, 제품 코드 6166), One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time, 다카라 바이오 제품, 제품 코드 RR066A)를 사용했다. 또한, 리얼타임 PCR 장치 Thermal Cycler Dice Real System(다카라 바이오 제품, 형식 TP800)을 사용했다.

(2) 플라스미드 제작

레트로 바이러스 벡터 조제용 레트로 바이러스 플라스미드를 제작하기 위해서, pDON-5 Neo(다카라 바이오 제품, 카탈로그 번호 3657)를 사용했다. 불사화 유전자로서, TERT(인간 또는 돼지, 이하, 「hTERT」또는 「pTERT」라고 약기하는 경우가 있다.), 인간 파필로마 바이러스의 E6 및 E7, hBmi-1의 개시 코돈의 상류에, Kozak 서열(gccacc)을 상법에 따라서 부가했다.

Kozak 서열을 부가한 상기 5종류의 불사화 유전자를, 상기 pDON-5 Neo DNA의 Pmac I-Hpa I 사이트에 클로닝하고, pDON-5 Neo hTERT Vector(SYN5587-1-4), pDON-5 Neo HPV16E6 Vector(SYN5587-2-10), pDON-5 Neo HPV16 E7 Vector(SYN5587-3-7), pDON-5 Neo pigTERT Vector(SYN5587-4-9), pDON-5 Neo hBmi1 Vector(SYN5587-5-1)를 탑재한 재조합 레트로 바이러스 벡터(Amphotropic Envelope)를 각 10mL 조제했다.

이상과 같이 해서 얻어진 플라스미드 DNA에 대해서, 편쇄 해석에 의해 삽입 유전자 서열을 확인했다. 상기 플라스미드 DNA를 사용하고, 대장균을 형질 전환해서 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체를 배양한 후에, 상법에 따라서 트랜스펙션 그레이드의 플라스미드 DNA(약 50㎍)를 정제하고, 멸균수에 용해한 DNA 용액으로서 플라스미드 DNA 용액을 얻었다.

(3) 재조합 레트로 바이러스 벡터의 산생

5매의 조직 배양 디시(직경 100mm)를 사용하고, 1매당 6×10⁶개의 G3T-hi 세포를 파종하고, 37℃에서 약 24시간 배양을 행하고, 트랜스펙션 시약을 사용해서 디시 1매당 레트로 바이러스 산생용 플라스미드 3종(pDON-5 Neo hTERT 벡터, pDON-5 Neo HPV16E6 벡터, pDON-5 Neo HPV16E7 벡터, pDON-5 Neo pigTERT 벡터, 및 pDON-5 Neo hBmi1 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 벡터, Retrovirus Packaging Kit Ampho에 부속의 pGP 및 pE-Ampho)을 공도입하고, 37℃에서 48시간 더욱 배양을 행했다.

배양 종료 후, 상기의 레트로 바이러스 벡터가 포함되는 배양 상청을 회수하고, 0.45㎛ 필터(밀리포어)로 여과 멸균하고, 여과액을 1mL씩 멸균 튜브로 분주했다.

(4) 재조합 레트로 바이러스 벡터의 역가의 산출

재조합 레트로 바이러스 벡터의 역가를, Retrovirus Titer Set(for Real Time PCR) 및 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)를 사용하고, 키트 부속의 설명서에 따라서 정량했다. 하기 표 6 및 7에, 레트로 바이러스 벡터의 역가 측정 시의 주형 처리 및 리얼타임 PCR의 반응 조건을 나타냈다.

하기 표 6에는, 레트로 바이러스 벡터의 역가 측정 시의 주형 처리(주형의 Dnase I에 의한 처리) 시에 사용한 반응액의 조성을 나타낸다. 하기 표 7에는, 반응 조건을 나타낸다. 즉, 하기 표 6에 나타내는 용액을 37℃에서 30분 인큐베이트하고, 그 후, 70℃로 승온해서 10분간 유지하고, 4℃로 급냉했다.

리얼타임 PCR은 하기 표 7에 나타내는 용액을 사용하고, 이하의 반응 조건으로 행했다. (s1) 42℃에서 5분, (s2) 95℃에서 10초, 그 후 (s3) 95℃에서 5초 및 60℃에서 30초를 40사이클로 하고, Dissociation curve를 작성했다.

키트 부속의 RNA Control Template의 카피수를 X축으로, 2차 미분 곡선(2^nd Derivative)으로부터 산출한 Ct값을 Y축으로 플롯해서 검량선을 작성했다. 하기 표 8에 리얼타임 PCR의 검량선의 Ct값을 나타낸다. 또한, 하기 표 중, 예를 들면, 「1.00E+08」은 「1.00×10⁸」을 나타낸다. 이하, 동일하다.

상기의 Ct값은 2nd1Derivative Maximum(SDM)법에 의해 산출하고, 산출된 Ct값으로부터, 기울기 -3.54, 절편 43.88, 증폭 효율 91.6 및 결정 계수 0.999를 얻었다. 이 검량선으로부터, 피검샘플의 역가를 산출하고, 표 9에 그 결과를 나타낸다.

상기 표 중, E.D.는 희석용 버퍼 EAST Dilution(for Real Time PCR)을 사용한 것을 나타낸다. 또한, 역가(카피수/mL)는 산출된 카피수(카피수/μL)×2(Dnase I처리 시의 희석 배율)×리얼타임 PCR 반응 시의 희석 배율(100 또는 500)×1,000(μL로부터 mL로의 환산)으로서 구했다.

리얼타임 PCT에 의한 측정 결과로부터, DON-5 Neo hTERT는 1.46×10¹⁰카피/mL, pDON-5 Neo HPV16E6은 1.15×10¹⁰카피/mL, pDON-5 Neo HPV16E7은 4.05×10¹⁰카피/mL, pDON-5 Neo pigTERT는 1.27×10¹⁰카피/mL, 또는 pDON-5 Neo hBmi1은 2.83×10¹⁰카피/mL의 역가를 나타냈다.

(실시예 2) SHED의 제작

10세의 건상 남아로부터 얻은 탈락 유치를 사용했다. 이 탈락 유치를 이소딘 용액으로 소독한 후, 치과용 다이아몬드 포인트를 사용하여 치관을 수평 방향으로 절단하고, 치과용 리머를 사용해서 치수 조직을 회수했다. 얻어진 치수 조직을, 3mg/mL의 I형 콜라게나제 및 4mg/mL의 디스파제의 용액 중에서 37℃로 1시간 소화했다. 다음에, 이 용액을 70mm의 세포스트레이너(Falcon사 제품)를 사용해서 여과했다.

여과 선별한 세포를, 4mL의 상기 배지에 재현탁하고, 직경 60mm의 부착성 세포 배양용 디시에 파종했다. 10% FCS를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이 디시에 첨가하고, 5% CO₂, 37℃로 조정한 인큐베이터에서 2주일정도 배양했다. 콜로니를 형성한 접착성 세포(치수 줄기세포)를, 0.05% 트립신·0.2mM EDTA로 5분간, 37℃에서 처리하고, 디시로부터 박리한 세포를 회수했다.

다음에, 상기한 바와 같이 해서 선발한 접착성 세포를, 부착성 세포 배양용 디시(콜라겐 코트 디시)에 파종하고, 5% CO₂, 37℃로 조정한 인큐베이터 중에서, 1차 배양해서 초대 배양 세포로 했다. 육안 관찰로 서브 컨플루언트(배양 용기의 표면의 약 70%를 세포가 차지하는 상태) 또는 컨플루언트가 되었을 때에, 0.05% 트립신·0.2mM EDTA로 5분간, 37℃에서 처리해서 세포를 배양 용기로부터 박리해서 회수했다. 이렇게 해서 얻어진 세포를, 다시, 상기의 배지를 넣은 디시에 파종하고, 계대 배양을 수회 행하여 약 1×10⁷개/mL까지 증식시켰다. 얻어진 세포를, 액체 질소중에서 보존했다.

그 후, 1차 배양 세포를 상기의 배지를 사용해서 약 1×10⁴세포/cm² 농도로 계대 배양했다. 1∼3회 계대한 세포를 실험에 사용했다. 인간 BMMSC(골수 간엽계 줄기세포, Bone Marrow Mesenchymal stem cells)는 론자사로부터 구입하고, 메이커의 취급 설명서에 따라서 배양했다. 이상과 같이 해서, 인간 탈락 유치 치수 줄기세포(SHED)를 얻었다. 얻어진 SHED를, FACSTARPLUS(벡톤·디킨슨사 제품)을 사용하고, 각 시료에 대해서, 약 1×10⁶개의 STRO-1 양성 세포를 이하와 같이 해서 소트했다.

브로모데옥시우리딘 BrdU 염색 키트의 메이커(Invitrogen사 제품)의 취급 설명서에 따라 BrdU를 12시간 도입시키고, SHED의 증식 속도를 평가했다(각 군에 대해서 n=3). 실험은 5회 반복했다. 1원 배치 분산 분석 후, Tukey-Kramer 검정을 행하고, 통계적 유의차를 평가했다.

STRO-1을 면역 형광으로 검출하기 위해서, SHED를 3% 파라포름알데히드로 고정하고, 그 후 PBS로 2회 린스하고, 100mM의 글리신으로 20분간 처리했다. 다음에, 이들의 세포를 0.2%의 Triton-X(Sigma-Aldrich사 제품)로 30분간 투과 처리하고, 그 후, 5%의 당나귀 혈청 및 0.5%의 소 혈청 알부민의 혼합물 중에서 20분간인큐베이트했다.

다음에, 세포를 1차 항체의 마우스 항인간 STRO-1 항체(1:100, R&D사 제품)와 함께 1시간 인큐베이트하고, 2차 항체의 염소 항마우스 면역 글로불린 M-FITC 항체(1:500, Southern Biotech사 제품)와 함께 30분간 인큐베이트하고, 벡터 실드 DAPI(Vector Laboratories Inc.)를 사용해서 마운트했다. 그 후, 15% FBS를 첨가한 α-MEM을 6웰 플레이트에 넣고, 소트한 세포를 클론 제작용에 파종했다. 증식한 세포 중으로부터 약 300콜로니를 시험용에 풀했다.

(2) 유전자의 도입

(2-1) 아데노바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

상술한 바와 같이, bmi-1, E6, E7 및 hTERT의 4개의 유전자를 아데노바이러스 벡터에 조립하고, 이들의 유전자 산물을 발현되는 바이러스 벡터를 제작했다. 대조로서, 이들의 유전자를 조립하고 있지 않은 대조 벡터를 제작했다.

SHED를 직경100mm의 콜라겐 코트 디시에 1×10⁶개를 파종하고, 10% FBS를 첨가한 DMEM을 더해서 서브 컨플루언트까지 배양했다. 이 배지를 흡인 제거해서 상기 배지로 희석한 바이러스 용액 500μL를 가하고(MOI=10), 37℃에서, 5% CO₂인큐베이터 중에서 1시간 배양하고, 상기 바이러스 벡터를 감염시켰다. 감염 48시간 후, 퓨로마이신(1pg/mL)을 더한 상기의 배지 중에 감염 세포를 옮겨서 10일간 배양해서 선택하고, 500∼600개의 내성 클론을 풀 했다. 3∼4일마다 약 0.5×10⁵개의 SHED를 직경 100mm의 배양 샬레에 파종하고, 계대했다. 유전자가 도입된 SHED를 SHED-T, 유전자가 도입되지 않는 SHED를 SHED-C라고 했다.

(2-2) 레트로 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

상기한 바와 같이 해서 얻어진 레트로 바이러스 벡터를 인간 치수 유래 세포(KA_01_W14_P5D3) 또는 인간 치수 유래 세포(KA_02_W4-6_P4D3)에 감염시키고, 약제 내성 풀 세포(이하, 단지 「풀 세포」라고 한다.)를 얻었다. 얻어진 풀 세포를 리얼타임 PCR에 제공해서 해석을 행하고, 삽입 유전자의 수를 확인했다. 리얼타임 PCR에는, 하기 표 10에 기재한 프라이머(모두 다카라 바이오 제품)를 사용했다.

코닝 제품의 접착성 세포 배양용 디시(직경 6cm 또는 10cm의 Cell culture Dish, TC treated surface)에, 상기 KA_01_W14_P5103을, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 배양했다. 이들의 세포를 기상해서 파종했을 때의 계대수를 [0](이하, 「+P0」라고 표시)으로 하고, 1회 계대일 때는 「+1」, 2회 계대일 때는 「+2」와 같이 표시했다.

상기 디시 중의 세포가 약 80% 컨플루언트에 달한 시점에서 배양 상청을 제거하고, PBS로 2∼3회 세정하고, 그 후, 박리제로서 0.25% 트립신-EDTA 용액(1×)(페놀 레드 함유)(Thermo Fisher Scientific 제품, 25200-056)을 더해서 3분간, 5% CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 인큐베이트하고, 부착 세포를 디시 저면으로부터 박리시켰다.

여기에 적당량의 배지를 더해 피펫팅을 행하여 싱글 셀의 세포 부유액을 조제했다. 세포 부유액을 적당량에 희석해서 새로운 디시에 계대했다. 이 이후, 동일한 방법으로 배양을 계속하고, 세포의 증식 및 세포의 형태에 이상이 없는 것을 확인했다. 또한, 계대 시에 채취한 배양 상청에 대해서, MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Loza 제품, 제품 코드 LT07-318)를 사용하고, 마이코플라즈마 오염이 없는 것을 확인했다.

(3) 약제 내성 농도의 검토

유전자 도입 세포를 약제에 의해 선택하기 위해서, 표적 세포의 G418 내성 농도를 검토했다. 코닝사의 6웰 플레이트(6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plate, 제품 코드 3516)를 사용하고, 1웰당 대수 증식기에 있는 세포 2.0×10⁴개를 파종했다. 5% CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 약 24시간 배양하고, 그 후, 웰의 저면에의 세포의 접착을 확인했다. 각 웰의 배지를, 상이한 농도의 G418을 첨가한 배지로 교환했다. 약제 선택 개시로부터, 4일 후, 8일 후 및 10일 후의 세포의 상태를 촬영하고, 약제 내성 농도를 검토했다.

약제 선택 개시부터 4일 후에는 약제 농도가 250μL/mL 이상의 웰에서는 세포의 증식 활성이 손실되고, 11일 후에는 약제 농도가 500μL/mL 이상의 웰에서는 대부분의 세포가 사멸하고 있는 것이 확인되었다. 이상으로부터, 표적 세포의 G418 선택 약제 농도를, 충분한 선택 효과를 나타내는 500μL/mL이라 결정했다.

레트로 바이러스 벡터 용액을 폴리부텐법으로 표적 세포에 감염시키고, 배지B에 의해 불사화 유전자 안정 발현주의 선택을 행했다. 상기 6웰 플레이트에, 1웰당 대수 증식기에 있는 세포 1.40×10⁵개를 파종하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 약 24시간 배양했다. 그 후, 배지 A에서 4배 또는 10배로 희석한 재조합 레트로 바이러스 벡터 용액에 폴리부텐(Hexadimethrine bromide, 시그마알드리치 제품, 제품 코드 H9268)을 종농도 8㎍/mL가 되도록 첨가하고, 각 웰에 동량씩 더해서 세포에 바이러스를 감염시켰다. 바이러스 감염으로부터 약 4시간 후에, 배지 A를 1.0mL씩 각 웰에 첨가했다. 이 플레이트를 5% CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 인큐베이트하고, 24시간 후에 배지 B로 교환하고, 약제 선택을 개시했다.

약제 선택 개시 10일째 이후에, 약제 내성이 되어서 증식해 온 세포를 수집하고, 1mL의 CELLBANKER 1 Plus(일본전약공업 제품, 제품 코드 CB021)를 더해서, 1×10⁶개/mL을 포함하는 현탁액으로 하고, 이것을 수용하는 세포 스톡으로서 -80℃에서 보존했다. 동시에, 리얼타임 PCR 해석용으로 5×10⁵개/바이알의 세포 펠릿을 조제하고, -80℃에서 보존했다

(실시예 3) 배양 상청 중에 포함되는 인자의 해석

(1) 불사화 줄기세포의 배양 상청의 조제

상기 실시예 1 및 2에서 제작한 불사화 줄기세포(이하, 「hSHED」라고 하는 경우가 있다.) 2×10⁵개/mL를, 10mL의 10% 소 태아 혈청(이하, 「FBS」라고 약기하는 경우가 있다.)을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 이하, 「DMEM」라고 약기하는 경우가 있다.)를 넣은 배양 디시(55cm²)에 넣고, 37℃에서 70% 컨플루언트가 되기까지(4일∼6일 간), 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 배양했다.

70% 컨플루언트가 된 것을 현미경으로 확인하고, 그 후, 배양 플라스크 중의 배양 상청을, 아스피레이터를 사용해서 제거하고, 혈청 무첨가의 DMDM을 사용해서 2회 세정했다. 이어서, 이 배양 플라스크 중에, 혈청 무첨가의 DMEM(이하, 「Plain DMEM」이라고 하는 경우가 있다.)을 10mL 더했다. 첨가 후, 즉시 회수한 배양 상청을 컨트롤로 했다. 첨가 후, 37℃에서, 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 72시간 배양했다. 배양 상청을 15mL의 멸균 원심 튜브에 수집하고, 1,500rpm(약 440×g)으로 3분간 원심하고, 원심 상청을 0.22mm PVDF 필터(밀리포어사 제품)에 통과시키고, 불사화hSHED의 배양 상청(이하, 「hSHED-CM」이라고 하는 경우가 있다.)을 얻었다.

(2) 정량적 발현 해석

이상과 같이 해서 얻은 hSHED-CM 중에 어떤 사이토카인이 발현되어 있는지에 대해서, Quantibody(등록상표) Human Cytokine Antibody Array 1000(RayBiotech Inc., 카탈로그 번호 QAH-CAA-1000)을 사용하고, 첨부의 설명서에 따라서, 이하의 순서로 정량적 발현 해석을 행했다(도 3).

우선, 상기 SHED-CM 지지체에 어레이 형상으로 고정화된 항체와 1∼2시간 접촉시키고, 그 후, 비오틴화 항체의 칵테일을 각 웰에 가해서 1∼2시간 인큐베이트했다. 이어서, 표식한 스트렙타아비딘을 더해서 2시간 인큐베이트하고, 표식의 시그널을 검출하고, GenePix(등록상표) 4400A(Molecular Dveices, LLC)를 사용해서 데이터 해석을 행했다. 결과를 도 1에 나타낸다. 80종류의 사이토카인을 측정하고, 대조와의 차가 1pg/mL 이상이 된 36종류를 농도가 높은 순서대로 나타냈다. 하기 표 11에는, 측정한 80종류의 사이토카인의 명칭을 나타냈다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질인, IGFBP-4, IGFBP-6 및 IGFBP-2, 메탈로프로테이나제 조직 저해제인 TIMP-1 및 TIMP-2의 함유량이 비교적 많은 것이 나타내어졌다. 인슐린은 이번에 제대로 측정되지 않았으므로 제외한다.

(3) 정성적 발현 해석

이상과 같이 해서 얻은 hSHED-CM 중에 어떤 사이토카인이 발현되어져 있는지에 대해서 RayBio(등록상표) Human Cytokine Antibody Array G-Series 4000(RayBiotech Inc., 카탈로그 번호 AAH-CYT-G4000-4)을 사용하고, 첨부의 설명서에 따라서, 이하의 순서로 정성적 발현 해석을 행했다(도 4).

우선, 상기 SHED-CM 또는 표준 단백질 칵테일을 유리 슬라이드에 고정화된 항체의 어레이와 1∼2시간 접촉시키고, 그 후, 비오틴화 항체의 칵테일과 함께 1∼2시간 인큐베이트했다. 이어서, Cy3 등량의 표식 스트렙타비딘과 1시간 인큐베이트하고, GenePix(등록상표) 4400A(Molecular Dveices, LLC)을 사용해서 스캔, 데이터 추출 및 데이터 해석을 행했다.

이 정성적 해석에 의해, 264종류의 사이토카인(하기 표 12∼16)을 측정한 바, 컨트롤에 대한 상대 발현 강도가 1.5 이상이 된 것이 77종류있었다. 도 7과 8에는, 상기의 77종류의 사이토카인 중 상대 발현 강도 3 이상의 것을 나타냈다.

이상의 결과, NGF, IL 패밀리(IL-6, IL-8, IL6R, IL-17C, IL-17R 등) 등의 상대 발현 강도는, 10 미만이 되었다.

(실시예 4) 엑소좀 중의 microRNA 발현 해석

엔도솜으로부터 유래되는 막소포인 엑소좀 중의 MicroRNA의 발현 해석을 이하의 순서로 행했다.

우선, 상기 실시예 2에서 수립한 불사화 줄기세포를, 상기 실시예 3에 기재한 바와 같이 무혈청 배지로 배양하고, 배양 상청을 약 10mL 취했다. ExoQuicl-TC(System Biosciences사 제품)를 사용하고, 이 배양 상청으로부터 이 키트에 첨부된 메뉴얼에 따라서 엑소좀을 정제했다.

miRNeasy Mini Kit(Quiagen사 제조)를 사용하여 정제한 엑소좀으로부터 miRNA 및 전 RNA를 추출하고, 이하와 같이 해서 표식하고, GeneChip(등록상표) miRNA Array(Affimetrix사)를 사용해서 사이토카인의 발현을 해석했다(도 5).

상기 정제 엑소좀으로부터 추출한 miRNA 및 전 RNA의 RNA 분자를, ATP의 존재 하에, 폴리 A 폴리머라아제와 15분간 반응시켜서, 폴리 A 테일을 결합시키고, 폴리 A 테일이 있는 mRNA로 했다. 다음에, Flash Tag Ligation Mix주로 30분간 리가제와 반응시켜서, 비오틴 표식 RNA와, 상기 폴리 A 테일이 있는 mRNA를 도 6에 나타내는 바와 같이 연결시켜, 표식 분자를 얻었다. 여기서, 시료로서는, 상기 불사화 줄기세포를 72시간 배양하고 있었던 hSHED-CM을 사용했다.

상기 표식 분자를, GeneChip을 사용한 애세이에 제공하고, 형광 표식 스트렙타비딘으로 검출했다. 검출한 결과를 발현의 높은 순서대로 1∼100까지 표 17에 나타낸다. 상기 GeneChip miRNA Array로 분석을 행한 6,599종류의 전 microRNA 중, 845개가 양성이었다.

(실시예 5) 욕창 치유 효과의 검증

(1) 모델 동물의 제작

허혈 재관류(ischemia/reperfusion, I/R)법을 이용하고, 허혈 재관류 장애의 1개인 욕창을 마우스에 발생시키고, hSHED-CM을 투여하고, 욕창이 치유되기까지의 경과를 관찰했다. 여기서, 허혈 재관류 장애란, 혈류(산소) 공급이 차단되어서 허혈(저산소)에 빠진 조직에, 다시 혈류가 관류되었을 때에 야기되는 다양한 장애를 말한다.

8주 예의 C57/BL6(암컷)의 배부(背部) 피부를, 1180가우스의 자석으로 12시간 끼워서 허혈 상태의 부위(허혈 부위)를 만들어 내어 욕창 모델 마우스를 제작했다(도 9 참조). 여기서, 자석으로 끼워져 있었던 부위는 강한 허혈 상태가 되어 있고, 그 부위 중에서 장애가 일어나면 욕창 등이 형성되는 것, 또한 강한 허혈 부위의 주위에서도 혈액 순환이 감소하기 때문에, 약한 허혈 상태는 생기고 있고, 탈모가 생기고 있는 것이 도 9로부터 확인된다. 이 모델 마우스에의 투여 스케줄 및 자석을 뗀 후의 욕창 부위의 시간 경과에 의한 변화를 이하에 나타낸다.

(2) 투여 스케줄 및 경과

(2-1) 투여 스케줄 1(I/R 처치의 다음날부터 4일 연속 투여 후, 1일 쉬고 2일 연속 투여)

상기 (1)에서 제작한 욕창 모델 마우스(음성 대상군: 5마리, 양성 대상군: 5마리, 시험군 5마리)를 사용했다. 어느 쪽의 군에 대해서도, 허혈 개시 시를 Day 0으로 하고, Day 1∼Day 4까지, 음성 대상군에는 DMEM을, 또한 양성 대상군에는 bFGF를 1㎍/100μL을, 각각 배부 피하에 투여했다. 시험군에는, hSHED-CM을 100μL(HGF량으로 250pg에 상당), 배부 피하에 연일 투여했다. 그 후, Day 5에는 모든 군에 대하여 투여를 행하지 않고, Day 6 및 Day 7에 상기와 동일한 양으로, 상기 모델 마우스의 배부 피하에 투여를 행했다(도 10(A) 및 (B) 참조).

재관류 후의 일수와, 창상 영역(욕창 형성 영역)의 비율을 도 10(C)에 나타낸다. 대조와 비교하여, hSHED-CM 또는 bFGF를 투여한 군은 모두, 창상 영역의 비율이 신속하게 축소되는 것이 나타내어졌다.

(2-2) 투여 스케줄 2(I/R 처치의 다음날부터 7일간 연속 투여-1)

상기 (1)에서 제작한 욕창 모델 마우스(음성 대상군: 5마리, 시험군 5마리)를 사용했다. 이들의 모델 마우스 욕창 형성 부위(2개소)에 대하여, 상기 (2-1)과 마찬가지로, DMEM 또는 hSHED-CM을 100μL씩, 대상군 또는 시험군에 각각 투여했다 (도 11(A) 및 (B) 참조). 결과를 도 11(C)에 나타낸다. hSHED-CM 투여군은 대조군과 비교하여 재관류 직후로부터 창상 영역의 비율의 확대 경향도 유의하게 작고, 축소도 신속하고 day 10까지 유의하게 축소되고 있는 것이 나타내어졌다(도 11(C) 참조). 또한, 욕창이 형성된 피부의 상태를 대비하면, 대조군보다 신속하게 회복하는 것, 및 Day 12에는 거의 욕창이 소실되는 것이 나타내어졌다(도 12 참조).

(2-3) 투여 스케줄 3(I/R 처치의 다음날부터 7일간 연속 투여-2)

상기 (1)에서 제작한 욕창 모델 마우스(음성 대상군: 5마리, 시험군 5마리)를 사용했다. 이들의 모델 마우스 욕창 형성 부위(2개소)에 대하여, 상기 (2-2)와 마찬가지로, DMEM 또는 hSHED-CM을 100μL씩, 대상군 또는 시험군에 각각 투여했다 (도 13(A)∼(C)). 그리고, day 4에 창상 영역의 피부를 채취하고, 포르말린으로 고정해서 8-OHdG, CD31 및 NG2의 면역 염색을 행했다(도 14(A)∼(C)). 각각의 염색의 결과를 도 15(A)∼(B), 도 16(A)∼(B) 및 도 17(A)∼(B)에 나타낸다.

(2-4) 투여 스케줄 4(욕창 발증 후로부터 7일간 연속 투여)

욕창 발증 후의 치유를 확인하기 위해서, I/R 처치 후 5일 간은 치료를 행하지 않고, 욕창이 형성된 후의 I/R 처치 후 6일 후부터 7일 간 연속 투여를 행했다.

상기 (1)에서 제작한 욕창 모델 마우스(음성 대상군: 5마리, 시험군 5마리)를 사용했다. 이들의 모델 마우스 욕창 형성 부위(2개소)에 대하여, 상기 (2-1)과 마찬가지로, DMEM 또는 hSHED-CM을 50μL씩, 대상군 또는 시험군에 각각 투여했다 (도 18(A) 및 (B) 참조). 결과를 도 18(C)에 나타낸다.

hSHED-CM 투여군은 대조군과 비교하여 hSHED-CM 투여 후, 창상 형성 영역이 유의하게 축소되고 있었다. 또한, 욕창이 형성된 피부의 상태를 대비하면, 대조군보다 신속하게 회복하는 것, 및 Day 10에는 거의 욕창이 소실되는 것이 나타내어졌다(도 19 참조).

(2-5) 투여 스케줄 5(I/R 처치 직후부터 표적 인자를 제거한 배양 상청을 7일간 연속 투여)

배양 상청으로부터 사이토카인을 제거한 후의 치유 효과를 검토하기 위해서, hSHED-CM에 포함되는 사이토카인과, 프라이머리 세포의 배양 상청에 포함되는 사이토카인을, 실시예 3과 같이 해서 성분 해석을 행했다. 프라이머리 세포로서는, (주) 셀테크놀로지로부터 구입한 인간 유래 Primary 치수 줄기세포 배양 상청액을 사용했다. 이 결과를 표 13에 나타낸다. 이 중 IGFBP-4, VEGF 및 HGF를 함유량 및 조직 수복·재생능이 높은 점으로부터, 후술하는 면역 침강에 있어서의 표적 인자로 했다.

(2-6) 투여 스케줄 6(I/R 처치 7전부터 7일 간 연속 투여)

배양 상청을 사전 투여함으로써 욕창의 발증을 억제하는 효과가 있는 것인지 검토하기 위해서, I/R 처치 전에 hSHED-CM을 7일간 연속 투여했다. 상기 (1)에서 제작한 욕창 모델 마우스(음성 대상군: 4마리, 시험군 4마리)를 사용했다. 이것들의 모델 마우스 욕창 형성 부위(2개소)에 대하여, 상기 (2-1)과 동일하게, DMEM 또는 hSHED-CM을 100μL씩, 대상군 또는 시험군에 각각 투여했다(도 26(A) 및 (B) 참조). 결과를 도 27 및 도 28에 나타낸다.

또한, 본 발명의 불사화 줄기세포를 배양했을 때의 배양 상청 중에 포함되는 각종 인자(사이토카인 등)의 양과, 초대 배양 세포를 배양했을 때의 그것들의 양을 하기 표 18에 정리했다. 하기 표 18 중, 초대 배양 세포는 「프라이머리」라고 표시했다.

상기 실시예 3에 기재한 조건으로 배양한 불사화 줄기세포 상청을 멸균 튜브에 수집하고, Protein G Sepharose(Cytiva사 제품)와, 항체(α-IGFBP-4, α-VEGF 및 α-HGF, R&D사 제품)를 사용해서 면역 침강을 행하고, 상기 표적 인자를 제거한 상청을 조제했다.

이상과 같이 해서 얻은 상청을, 상기 (1)에서 제작한 모델 마우스 욕창 형성 부위(2개소)에, 100μL씩, 각 군 2마리로 해서 투여했다. 음성 대조군에는 DMEM을,또한, 양성 대조군에는 hSHED-CM을 투여했다. 여기서, 본 발명의 hSHED-CM은 배양 상청의 성분 해석 결과에 근거하여 IGFBP-4, VFGF(혈관 내피세포 증식인자) 및 HGF(간세포 증식인자)를 각각의 분자에 대한 특이적 항체를 사용해서 면역 침강시킴으로써 이들을 제거해서 사용했다. 도 20(A) 중, 「면침」은 「면역침강」의 약어이다. 투여 스케줄은 마우스에 I/R 처치를 행한 날을 Day 0으로 하고, Day 1∼Day 7까지 연속 투여로 했다(도 20(A) 참조). 또한, 투여는, 도 20(B)에 나타내는 바와 같이, I/R 처치를 행한 마우스의 배부 2개소에 100μL씩으로 했다. 투여한 인자 및 사용한 동물의 수(N)는 도 20(B)에 나타내는 바와 같다.

이상의 투여 결과를, 도 21(A)∼(D)에 나타낸다. 도 21(A)는 음성 대조로서 컨트롤 항체(도 20(B) 및 도 21(A) 중, 「control Ab」라고 표기)를 사용해서 처리한 본 발명의 배양 상청을 사용한 경우, 도 21(B)는 항 IGFBP-4 항체(도 20(B) 및 도 21(B) 중, 「α-IGFBP-4」라고 표기)를 사용해서 IGFBP-4을 제거한 경우, 도21(C)는 항 VFGF 항체(도 20(B) 및 도 21(C) 중, 「α-VEGF」라고 표기)를 사용해서 VEGF를 제거한 경우, 및 도 21(D)는 항 HGF 항체(도 20(B) 및 도 21(D) 중, 「α-HGF」라고 표기)를 사용해서 HGF를 제거한 경우를 각각 나타낸다. 도 중, ＊은 P<0.05、＊＊은 P<0.01、＊＊＊은 P<0.001을 나타낸다.

α-IGFBP-4로 처리한 hSHED-CM(IGFBP-4 제거 hSHED-CM)을 투여한 경우에는, 미처리의 hSHED-CM을 투여한 경우와 비교하여, 큰 차이는 보이지 않았다. 이것에 대하여, α-HGF로 처리한 hSHED-CM(HGF 제거 hSHED-CM)을 투여한 경우에는, 미처리의 hSHED-CM을 투여한 경우와 비교하여 창상 영역이 늦어서 확대되고, 치유도 늦어진다고 하는 경향이 보였다. α-VEGF로 처리한 hSHED-CM(VEGF 제거 hSHED-CM)을 투여한 경우에는, 미처리의 hSHED-CM을 투여한 경우와 비교하여 창상 영역이 크게 확대되고, 치유도 늦는다고 하는 차이가 유의하게 보였다. 이상으로부터, 욕창의 치유에는, HGF 및 VEGF가 공헌하고 있다고 하는 결론이 얻어졌다.

(2) 상기 세포의 배양 상청을 사용한 활성 산소 억제 효과의 검토

간엽계 줄기세포(이하, 「MSC」라고 약기하는 경우가 있다.) 자신이, 활성 산소종(이하, 「ROS」라고 약기하는 경우가 있다.)의 억제 효과로써, 욕창의 치유에 관여하고 있는 것이 이하의 문헌에 보고되어 있다(Protective effect of mesenchymal stem cells on the pressure ulcer formation by the regulation of oxidative and endoplasmic reticulum stress). 이 때문에, MSC 자신이 아니고, MSC의 배양 상청에 이러한 효과가 있는지의 여부를 검증하기 위해, in vitro 시험을 실시했다(도 22 참조).

도 22에, 욕창 모델의 발증 기서를 in vitro의 계에서 재현한 실험 공정을 나타낸다. 또한, 도 23에 나타내는 바와 같이, HGF 또는 VEGF를 특이적 항체로 면역 침강에 의해 제거한 본 발명 상청을 첨가해서 NIH3T3을 배양하고, 각 사이토카인에 의한 ROS 억제의 유무를 확인했다. 양성 대조로서는, t-부틸히드록시퍼옥시다제(이하, 「TBHP」이라고 약기하는 경우가 있다.)를 사용했다.

이 실험에는, NIH3T3세포를 사용하고, 이하의 순서로 행했다(도 22 참조). 저면이 클리어한 8웰 슬라이드 챔버에 NIH3T3 세포를 3.0×10⁴개/웰로 파종하고, 밤새, DMEM 배지 중, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하고, 각 웰의 세포의 접착을 현미경으로 확인하고 1×PBS로 워시했다. 사전에 72시간 1.0% 산소 하에서 폭로한 1.0% FBS가 있는 DMEM 배지를 슬라이드 챔버에 첨가하고, 1.0% 산소 하에서, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 36∼48시간 배양했다. 그 후, 통상의 20.0%산소 하의 배양조에서 5∼6시간, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 배양했다.

이어서, 2',7'－dichlorofluorescein diacetate(이하, 「DCFDA」라고 약기하는 경우가 있다.) Cellular ROS Detection Assay kit(abcam사 제품) 부속의 1× buffer로 다시 세정하고, 그 후, 1×buffer에 용해시킨 10∼20㎛ DCFDA를 각 웰에 200μL 가하고, 37℃에서 45분 간 배양해서 세포에 DCFDA를 도입시켰다. 세포 내에서 발생한 ROS를, DCF(dichlorofluorescein)의 형광으로서 형광 현미경을 사용해서 Ex/Em(여기 파장/형광 파장)=480/527nm의 조건으로 검출했다.

세포에 도입된 DCFDA가 ROS에 의해 산화되어 강한 형광을 발하는 DCF가 되고, 그 강도가 세포 내의 ROS 레벨과 비례하는 성질을 이용하고, ROS의 산생량을 측정했다. 구체적으로는, ROS의 발생량에 비례해서 증가한 DCF에 480nm의 여기광을 조사하고, 발생한 형광의 강도로부터 정량했다. 대조에는 155nM의 TBHP를 사용하고, 관찰 결과의 암부와 명부의 콘트라스트로부터 ROS를 정량 했다. 결과를 도 23 및 도 24에 나타낸다. 도 23(A)의 화상의 최대 휘도와 최소 휘도로부터 산출한 콘트라스트를 ROS의 상대값으로서 정량 비교하고, 도 24로서 나타냈다.

음성 대조군으로서 통상 배양한 NIH3T3을 사용하고, 양성 대조군으로서 TBHP첨가 배지로 배양한 NIH3T3을 사용했다. 어느 쪽의 대조라도, 배양 시의 산소 농도는 통상과 같이 20.0%로 했다. 음성 대조군에서는, ROS의 발생을 나타내는 시그널의 Contrastive value가 약 50이었다. 이것에 대하여, 양성 대조군에서는 약 3배의 강한 수치가 나타내어졌다. 또한, 1.0% 산소 하에서 36∼48시간 배양 후에 20.0% 산소 하에서 배양한 세포(이하, 이러한 배양을 「재산소화」라고 하는 경우가 있다.)로부터는, 상기 음성 대조군과 비교하여 약 2배라고 하는 강한 ROS의 시그널이 검출되었다. 이것에 대하여, 본 발명의 배양 상청을 첨가해서 상기와 동일하게 배양한 세포의 ROS의 시그널은 음성 대조군과 동 레벨이었다. 그러나, 상기 배양 상청으로부터 HGF 및 VEGF를 제외하면 ROS의 시그널이 증가했다. 이상으로부터, hSHED-CM이 ROS의 산생 억제 활성을 갖는 것, 특히, HGF와 VEGF가 ROS의 산생 억제에 중요한 것이 나타내어졌다.

(3) 상기 세포의 배양 상청을 사용한 소포체 스트레스 억제 효과의 검토

마우스 섬유 아세포주 NIH3T3 세포를 사용했을 때의 상기 배양 상청에 의한 소포체 스트레스의 억제 효과에 대해서, MSC 자신이 아니고, MSC의 배양 상청에 이러한 효과가 있는지의 여부를 검증하기 위해, in vitro 시험을 실시했다. 1.5㎍/mL 튜니카마신(TM)을 첨가해서 리얼타임 PCR을 실시하기까지의 실험의 개요를, 도 25(A)에 모식적으로 나타낸다.

이 실험에는, 마우스 NIH3T3 세포를 사용하고, 배지로서는 DMEM을 사용하고, 이하의 순서로 행했다. 12웰 플레이트에 세포를 1×10⁵개 파종해서 밤새 배양하고, 1.5㎍/ml 튜니카마신을 현탁한 대조 배지 또는 50% hSHED-CM/DMEM(v/v)을, 각 웰에 500μL 더했다. 37℃에서 밤새 배양하고, 상기의 세포를 트립신 처리한 후에 회수하고, 상법에 따라서 RNA를 추출했다. 그 후, 역전사 효소를 사용해서 리얼타임PCR(이하, 「q-PCR」이라고 하는 경우가 있다.)을 행하고, 소포체 스트레스 마커(평가의 지표 유전자)의 발현량을 이들의 mRNA 양으로 정량했다. 평가의 지표는, 소포체 스트레스 마커인, XBP-1, GRP78 및 CHOP으로 하고, 내재성 컨트롤은 HPRT로 했다. 결과를 도 25(B)에 나타낸다. 도 25(B) 중, 종축은 대조를 1이라고 했을 때의 발현량의 상대비를 나타낸다.

여기서, XBP-1은 소포체 스트레스 시에 표적 유전자의 전사를 차단하는 부의 피드백 조절 인자로서 알려져 있고, 소포체 스트레스 시에 핵이행해서 GRP78 등의 분자 샤페론의 UPR에 결합해서 샤페론 유도에 관여하는 것이 보고되어 있다. GRP78(HSPA5)은 「면역 글로불린 중쇄 결합 단백질(immunoglobulin heavy chain-binding protein:BiP)」이라고도 불리는, HSP70(열 쇼크 단백질 70) 패밀리의 멤버이고, 소포체에서의 단백질 어셈블리와 접힘에 관여한다. GRP78은 모든 진핵 생물 세포의 소포체에서 항상적으로 발현되는 소포체 단백질이고, 암 세포 증식의 저해 및 아폽토시스에 관련되는 것이 보고되어 있다. CHOP는 소포체 스트레스 하에서 유도되는 전사 인자이고, DR5(Death receptor 5) 등을 유도하고, caspase 캐스케이드를 활성화해서 아폽토시스를 일으키는 것이 보고되어 있다.

첨가물 없음의 DMEM 중에서 배양한 NIH3T3 세포의 각 소포체 스트레스 마커의 발현을 1.0으로 했다. DMEM에 1.5㎍/mL의 튜니카마이신을 가해서 배양한 세포에서는, 각 마커의 발현량은 XBP-1이 약 7배, GRP78이 약 18배, CHOP이 4배로 유의하게 상승하고 있었다. 이것에 대하여, hSHED-CM을 첨가한 세포에서는, XBP-1이 약 4배, GRP78이 약 14배, CHOP이 약 3배이며, hSHED-CM을 첨가하지 않은 세포와 비교해서 유의하게 소포체 스트레스 마커의 발현이 억제되었다. 결과를, 하기 표 19 및 도 25(B)에 나타낸다.

* : 유의차 있음

(4) 상기 세포의 배양 상청을 사용한 욕창의 억제 효과의 검토

도 1에 나타내는 바와 같이, hSHED-CM은 콜라겐 및 엘라스틴의 분해 효소를 억제하는 작용을 갖는 메탈로프로테이나제 조직 저해제 TIMP를 많이 함유한다. 지금까지, 욕창에 대하여 연부 조직이 압력을 완충·분산시키는 쿠션으로서 작용한다고 보고되어 있는(비특허문헌 3 참조) 것으로부터, hSHED-CM의 투여에 의해 욕창에 대한 피부 조직의 저항성이 높아지는 것인지의 여부를 검증하기 위해서, in vivo 시험을 실시했다.

상기 실시예 5의 (2-6) 투여 스케줄 6과 마찬가지로, 대조군 또는 시험군의 환부 형성 예정 부위에, DMEM 또는 hSHED-CM을 100μL씩 I/R 실시 7일 전부터 투여했다(도 26(A) 및 (B)). I/R 처치 전에 배부 피부 조직을 회수하고, 이 부위의 피부조직이 어떻게 변화될지를 관찰했다(도 27(A) 및 (B)). 그 결과, hSHED-CM을 투여한 시험군의 마우스에서는, 투여 부위의 피부 조직이 두꺼워지는 경향이 보였다.

도 28(A)에, 상기의 투여 스케줄로 투여했을 때의 장애 면적의 경시 변화를 나타낸다. 도면 중, *은 p<0.05를, 또한 **은 p<0.01을 나타낸다. 또한, 도 28(B)에, 투여 스케줄 6로 사전 처치한 마우스 욕창 형성 부위의 치유 상황을 나타낸다. 상단은 Day 2∼Day 16 간의 대상군을, 하단은 동일한 기간 내의 hSHED-CM 투여군의 상기 부위의 변화를 각각 나타낸다. I/R 처치 후의 욕창 형성 부위(환부)의 장애 면적을 비교하면, hSHED-CM을 사전 투여한 군에서는, DMEM 투여군에 비해서 장애 면적의 확대가 유의하게 억제되어 있었다(도 28(A) 및 (B)).

(5) 정리

이상으로부터, 상기 hSHED-CM에는 욕창의 악화를 막는 효과가 있다고 생각되었다. 또한, 욕창이 형성되는 전후 어느 시기에 투여한 경우라도, 일정한 효과를 발휘하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 hSHED-CM에 포함되는 다양한 사이토카인 중 HGF 및 VEGF가 욕창의 예방 및 치유에 관여하는 것이라고 생각되었다. 또한, 이것에 따라 욕창의 치유의 기서를 검토한 바, hSHED-CM은 ROS의 억제 및 소포체 스트레스의 완화를 통하여 조직의 재생을 촉진하는 것이라 생각되었다.

본 발명은 의약의 기술분야에 있어서 매우 유용하다.

서열표 프리 텍스트

서열번호 1: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(1)

서열번호 2: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(2)

서열번호 3: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(3)

서열번호 4: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(4)

서열번호 5: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(5)

서열번호 6: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(6)

서열번호 7: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(7)

서열번호 8: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(8)

서열번호 9: 세포에 도입하는 유전자를 포함하는 DNA단편의 염기서열(9)

서열번호 10: PCR용 프라이머(1)의 염기서열

서열번호 11: PCR용 프라이머(2)의 염기서열

서열번호 12: PCR용 프라이머(3)의 염기서열

서열번호 13: PCR용 프라이머(4)의 염기서열

서열번호 14: PCR용 프라이머(5)의 염기서열

서열번호 15: PCR용 프라이머(6)의 염기서열

서열번호 16: PCR용 프라이머(7)의 염기서열

서열번호 17: PCR용 프라이머(8)의 염기서열

서열번호 18: PCR용 프라이머(9)의 염기서열

서열번호 19: PCR용 프라이머(10)의 염기서열

SEQUENCE LISTING <110> Cysay Inc. Tokyo Medical University <120> Prophylaxis and/or treatment agent for pressure ulcer <130> F22CY02WO <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment for gene transduction <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1978) <223> SYN122-1-7 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1978) <223> SYN4122-1-7 <400> 1 agctgacgtg gaagatgagc gtgcgggact gcgcttggct gcgcaggagc ccaggggttg 60 gctgtgttcc ggccgcagag caccgtctgc gtgaggagat cctggccaag ttcctgcact 120 ggctgatgag tgtgtacgtc gtcgagctgc tcaggtcttt cttttatgtc acggagacca 180 cgtttcaaaa gaacaggctc tttttctacc ggaagagtgt ctggagcaag ttgcaaagca 240 ttggaatcag acagcacttg aagagggtgc agctgcggga gctgtcggaa gcagaggtca 300 ggcagcatcg ggaagccagg cccgccctgc tgacgtccag actccgcttc atccccaagc 360 ctgacgggct gcggccgatt gtgaacatgg actacgtcgt gggagccaga acgttccgca 420 gagaaaagag ggccgagcgt ctcacctcga gggtgaaggc actgttcagc gtgctcaact 480 acgagcgggc gcggcgcccc ggcctcctgg gcgcctctgt gctgggcctg gacgatatcc 540 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cgacgtgagg tatatgactt tgcttttcgg gatttatgca 240 tagtatatag agatgggaat ccatatgctg tatgtgataa atgtttaaag ttttattcta 300 aaattagtga gtatagacat tattgttata gtttgtatgg aacaacatta gaacagcaat 360 acaacaaacc gttgtgtgat ttgttaatta ggtgtattaa ctgtcaaaag ccactgtgtc 420 ctgaagaaaa gcaaagacat ctggacaaaa agcaaagatt ccataatata aggggtcggt 480 ggaccggtcg atgtatgtct tgttgcagat catcaagaac acgtagagaa acccagctgg 540 gatctgaagg cagaggctct ctgctgacat gtggggatgt ggaggaaaat cctggcccta 600 cgcgtcatgg agatacacct acattgcatg aatatatgtt agatttgcaa ccagagacaa 660 ctgatctcta ctgttatgag caattaaatg acagctcaga ggaggaggat gaaatagatg 720 gtccagctgg acaagcagaa ccggacagag cccattacaa tattgtaacc ttttgttgca 780 agtgtgactc tacgcttcgg ttgtgcgtac aaagcacaca cgtagacatt cgtactttgg 840 aagacctgtt aatgggcaca ctaggaattg tgtgccccat ctgttctcag aaaccaggat 900 ctgaaggtag gggaagtttg cttacttgcg gtgacgtcga agagaatcca ggaccagatg 960 gccgcaacat gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctgctg cgcagccact 1020 accgcgaggt gctgccgctg gccacgttcg tgcggcgcct ggggccccag ggctggcggc 1080 tggtgcagcg cggggacccg gcggctttcc gcgcgctggt ggcccagtgc ctggtgtgcg 1140 tgccctggga cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccaggtg tcctgcctga 1200 aggagctggt ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg 1260 ccttcggctt cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca 1320 gcgtgcgcag ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg 1380 ggctgctgct gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc 1440 tctttgtgct ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc 1500 tcggcgctgc cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg 1560 gatgcgaacg ggcctggaac catagcgtca gggaggccgg ggtccccctg ggcctgccag 1620 ccccgggtgc gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc 1680 ccaggcgtgg cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc 1740 acccgggcag gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac 1800 ccgccgaaga agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat 1860 ccgtgggccg ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg 1920 acacgccttg tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca 1980 aggagcagct gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc 2040 ggaggctcgt ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca 2100 ggttgccccg cctgccccag cgctactggc aaatgcggcc cctgtttctg gagctgcttg 2160 ggaaccacgc gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg 2220 cgg 2223 <210> 5 <211> 3399 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> hTERT <220> <221> gene <222> (1)..(3399) <223> hTERT <400> 5 atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60 gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120 cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180 gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240 gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300 ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360 agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420 ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480 ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540 gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600 cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660 gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720 ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780 aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840 gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900 cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960 tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020 ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080 gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140 cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200 gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260 ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320 gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380 gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440 aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500 gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560 cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620 ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680 ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740 tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800 ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860 ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920 ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980 ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040 ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100 gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160 ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220 gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280 agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340 caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400 gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460 aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520 ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580 gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640 aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700 cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760 cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820 gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880 aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940 aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000 atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060 tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120 tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180 gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240 aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300 acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360 ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399 <210> 6 <211> 477 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <220> <221> gene <222> (1)..(477) <223> HPV16 E6 <400> 6 atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60 cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120 aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180 tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240 agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300 aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360 gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420 ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477 <210> 7 <211> 297 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <220> <221> gene <222> (1)..(297) <223> HPV 16 E7 <400> 7 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60 gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120 ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180 tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240 gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297 <210> 8 <211> 3396 <212> DNA <213> swine <220> <221> gene <222> (1)..(3396) <223> pigTERT <400> 8 atgccgcgcg cgccccggtg ccgggccgtg cgctccctgc tccgggaccg ctacaggcag 60 gtgctgccgc tggccacctt cgtgcggcgc ctgggccctg agggccggcg gcttgttcgg 120 cgcggggacc cggcggccta ccgcgcgctg gtggcgcagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180 gacgcgcagc cgcctcctgc ctccccgtcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240 gtggccaggg tcgtgcagag gctctgcgag cgcggcgcga ggaacgtgct ggcctttggc 300 ttcgcgctgc tggacggggc tcgcggcggg ccgcccgtgg ccttcacgac cagcgtgcgc 360 agctacctgc ccaacaccgt gaccgacaca ctgcgcggga gcggcgcgtg ggggctgctg 420 ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctcacc cacctgttgg cgcgctgcgc gctgtacctg 480 ctggtgcccc cgagttgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cactctatga cctctacacc 540 gcagcggagg ctcggcccat gcgacacaag ggccagaccc cgactggcct cggactcacg 600 cgccccgttt gcaatgggga agccgggcga ccccaggagc agagggcgca aggtgtgagg 660 cgacgtcggg gcagagcggg gggacatcca cttccagcca agaggcccag gcacgtcccg 720 gagcctgaac agggtcccga agggcaggcg tcccgggccc accagggcag ggcgcctggg 780 ccgagcgaca gcgacccccc cgtgatgaca cctaccagag ccgctgcgaa agccaagtct 840 cgggagggtg aggcgcccgg aacccggcac ctttcccctc aagcaggcgg tgcgcggggt 900 acctgccccc catcctggtg gcagccacac ctccagggca agcccagtcc tcatgtgtgc 960 gctgccgaga ccaagcgctt cctctactgc tcggggagca aggaagggct gcgccgctcg 1020 ttcctgctct gctccctgcc gcccagcctg gcgggggccg ggaggctcgt ggaggtcatc 1080 tttctggcct caaagcccgg gcagccaggg gcgcgccgcg tgcccgcacg ctactggcgg 1140 atgaggcccc tgttccggga gctgcttaag aaccacgcgc ggtgccccta caaggcgctt 1200 ctcagggcgc actgcccgtt gcgggctgcg gcgaccctct cggggtccgg cggtcaggtg 1260 tgcgaccaca aagtgggccc cctcgctcca gagcggctgg cagcggccgc cgagggggac 1320 tcggcctcga ggcgcctagt ccagctgctc cgccagcaca gcagcccctg gcaggtgtac 1380 cgcctcctgc gggcctgtct tcaccggctg gtgcccccgg gcctctgggg ctccccgcac 1440 aacaagcggc gctttctgaa gaatgtgaag aagctcgtct ccctggggaa gcacgccagg 1500 ctctcgctgc aggagctgat gtggaagatg aaagtgcaag actgcatctg gctgcgccgg 1560 agcccggacg ctcgccatgt ccaggccgcc gagcaccgtc tgagagaggc cattctggcc 1620 aagttcctgc gctggttgat gggcacgtac gtggtcgagc tgctcaggtc gtttttttat 1680 gtcacggaga ccacgtttca gaagaaccgg ctcttcttct tccggaagcg catctggagc 1740 cggctgcaga gcgcaggcat caggcaacac ttagatcgtg tgcggcttcg agaactgtcg 1800 gaagcagaga tcaggcgacg ccgggaggcc aggcccgctg tactgacctc caagctccgc 1860 ttcgtcccca aacccgacgg gctgcggccc atcgtgaaca tggcgaacgt cgtgcgagcc 1920 aggacaggcc ccggagacaa gaaggtccgg cgtctcacgg ggcaggtcaa gacgctgttt 1980 gctgtgctga actacgagcg ggcgcggcgc ccgcgcctcc tgggggcctc cgtgctgggc 2040 gtgggtgaca tccacagggc gtggcgggcc tttgtgctgc ccctgcgggc ccaggacccg 2100 gcccccccgc tgtactttgt caaggtggac gtgacggggg cctacgacgc cctccctcag 2160 gacaggcttg ctgaggtggt cgccaacgtg atccggccct acgagagcac gtactgcgtg 2220 cgccagtgcg ccgtgctccg gaggaccgcc cgcgggcacg tgcgcaagtc cttccaaacc 2280 cacgtgtcca ccttcgcaga cctccagcct tacatgagac agtttgtggc acacctgcag 2340 gcaaccggcc cgctgaggga cgccgtggtc atcgagcaga gctgctctct gaacgaggcc 2400 ggcagccgtc ccctggagct tttcctgagc ctgctgcgaa accacgtcat ccggatcggg 2460 ggcaggtcct acgtccagtg tcaggggatc ccacagggct ccattctgtc cacgctgctc 2520 tgcagcctgt gctacgggga catggaaaac agactgtccc cggggatcca gcgtgacggg 2580 gtgctcctgc gcttggtgga cgacttcctg ctggtgaccc ctcacctgac acgagccaaa 2640 gcctttctca ggaccctggt ccgcggcgtg cccgagtacg gctgcctggc caacttgcgg 2700 aagacggccg tgaacttccc tgtggaggac ggcgcccggg gcggcccggc cccactgcag 2760 ctgccggcac actgcctgtt cccctggtgc gggctgctgc tggacacccg cacgctggag 2820 gtgcactgcg actatgccag ttacgcccgg acctcgatca gagcgagtct caccttcaac 2880 cagggcttca agcccgggag gaacatgcgc cgcaagctct tggcggtctt gcggctaaag 2940 tgccacggga tccttctgga cctgcaggtg aacagtcttc cgacggtgct cgccaacgtt 3000 tacaagatct tcctgctgca ggcctacagg ttccacgcgt gtgtgctgca gctgcccttc 3060 cgtcagccgc ttgcgaggaa cccctcattt ttcctccggc ttgtctccga caccgcgtcc 3120 tgctgctact cgctcctgaa agccagaaac gcagggatgt ccctgggagc caggggcgcc 3180 tccggcccgt ttccctctga agccgcagag tggctctgcc tccacgcctt cctgctcaag 3240 ctggttcgtc accgcgttac ctacagctgt cttctggggc cgctccgggc agccagagag 3300 cgattgtgcc agcggctccc tggggccaca ctggccgccc tcgaggccgc cgccgaccca 3360 gccctgacta cagacttccg gaccatcctg gactga 3396 <210> 9 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(981) <223> hbmi1 <400> 9 atgcatcgaa caacgagaat caagatcact gagctaaatc cccacctgat gtgtgtgctt 60 tgtggagggt acttcattga tgccacaacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120 acgtgtattg ttcgttacct ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaagtt 180 cacaagacca gaccactact gaatataagg tcagataaaa ctctccaaga tattgtatac 240 aaattagttc cagggctttt caaaaatgaa atgaagagaa gaagggattt ttatgcagct 300 catccttctg ctgatgctgc caatggctct aatgaagata gaggagaggt tgcagatgaa 360 gataagagaa ttataactga tgatgagata ataagcttat ccattgaatt ctttgaccag 420 aacagattgg atcggaaagt aaacaaagac aaagagaaat ctaaggagga ggtgaatgat 480 aaaagatact tacgatgccc agcagcaatg actgtgatgc acttaagaaa gtttctcaga 540 agtaaaatgg acatacctaa tactttccag attgatgtca tgtatgagga ggaaccttta 600 aaggattatt atacactaat ggatattgcc tacatttata cctggagaag gaatggtcca 660 cttccattga aatacagagt tcgacctact tgtaaaagaa tgaagatcag tcaccagaga 720 gatggactga caaatgctgg agaactggaa agtgactctg ggagtgacaa ggccaacagc 780 ccagcaggag gtattccctc cacctcttct tgtttgccta gccccagtac tccagtgcag 840 tctcctcatc cacagtttcc tcacatttcc agtactatga atggaaccag caacagcccc 900 agcggtaacc accaatcttc ttttgccaat agacctcgaa aatcatcagt aaatgggtca 960 tcagcaactt cttctggttg a 981 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 10 ggcactgccc tcagacttca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 11 ctgctaaagc gcatgctcca 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 12 ctgcggcatc cacgaacta 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 13 acagcaccgt gttggcgta 19 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 14 ttggtcaagc agcataatcc aaag 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 15 gtcaagggca tagcctacca caa 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 16 gcactgccct cagacttcaa ga 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 17 gcgggactat ggttgctgac 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 18 tggcacccag cacaatgaa 19 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer for real-time PCR <400> 19 ctaagtcata gtccgcctag aagcca 26

Claims

bmi-1 유전자, HPV-E6 유전자, HPV-E7 유전자, 및 TERT 유전자를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포의 배양 상청을 유효 성분으로 하는, 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 1 항에 있어서,
상기 TERT는 hTERT 또는 pTERT인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 1 항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포는 치수 줄기세포인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 치수 줄기세포는 인간 또는 돼지 유래인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 상청은 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, 메탈로프로테이나제 조직 저해제, 혈관 내피세포 증식인자, 간세포 증식인자, 종양 괴사인자 수용체 II 및 오스테오프로테게린·파골세포 분화 억제인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3종류 이상의 사이토카인을, 각각 1×10³∼1×10⁶pg/mL의 농도 범위에서 포함하는 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 5 항에 있어서,
상기 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질은 IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, 및 IGFBP-6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 5 항에 있어서,
상기 메탈로프로테이나제 조직 저해제는, TIMP-1 또는 TIMP-2인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 상청은 동결품, 동결 건조 분말 및 액제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 8 항에 있어서,
부형제, pH 조정제, 희석제, 및 완충제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
제 9 항에 있어서,
주사제, 주사제, 연고, 경고, 크림제 및 경피 흡수제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 욕창의 예방 및/또는 치료제.
Bmi-1 유전자, HPV16-E6 유전자 및 HPV16-E7 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 유전자와, 텔로머라제 역전사 효소(TERT) 유전자의 세트를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포를 배양해서 얻어진, 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, 메탈로프로테이나제 조직 저해제, 혈관 내피세포 증식인자, 간세포 증식인자, 종양 괴사인자 수용체 II 및 오스테오프로테게린·파골세포 분화 억제인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3종류 이상의 사이토카인을, 각각 1×10³∼1×10⁶pg/mL의 농도 범위에서 포함하는 상기 배양 조성물을 사용하는, 욕창 조직의 수복 방법.
Bmi-1 유전자, HPV16-E6 유전자 및 HPV16-E7 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 유전자와, 텔로머라제 역전사 효소(TERT) 유전자의 세트를 조립한 간엽계 불사화 줄기세포를 배양해서 얻어진, 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, 메탈로프로테이나제 조직 저해제, 혈관 내피세포 증식인자, 간세포 증식인자, 종양 괴사인자 수용체 II 및 오스테오프로테게린·파골세포 분화 억제인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3종류 이상의 사이토카인을, 각각 1×10³∼1×10⁶pg/mL의 농도 범위에서 포함하는 상기 배양 조성물을 사용하는, 욕창에 있어서의 세포의 재생 방법.