CN105018524B - 一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素‑1的基因片段，重组到病毒表达载体上，转染人干细胞可延长细胞的寿命，并提高人干细胞的成血管能力，且无成瘤性；本发明还提供了延长细胞寿命和成血管能力的人干细胞的试剂盒，该人干细胞将有望对缺血性心脑血管疾病的达到较好的治疗效果。

Description

一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法 及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的方法以及通过所述方法获得细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，特别地，本发明涉及构建RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1的双基因的重组慢病毒载体，使得人干细胞能过表达RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1；本发明的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞增殖活性和端粒酶活性提高，延长了人干细胞寿命，促进了新生血管形成，而无成瘤性，可望用于临床治疗缺血性心脑血管疾病，提高了受损部位血供，促使了受损神经细胞的修复。

背景技术

目前动物体内实验和临床研究工作，证实成体干细胞移植治疗缺血性心脑血管疾病有治疗效果，促进了缺血部位的新血管再生提高患者的功能状态，改善患者的生活质量。成体干细胞应用细胞治疗的主要优势在于其可以自体移植，因而不存在胚胎干细胞移植所存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。但是成体干细胞在体内数量稀少，用于自体移植需要在体外大量扩增，才能满足细胞治疗的需要。

然而，成体干细胞同大多数的成体细胞一样，会发生衰老，主要表现在两个方面：①随年龄增长，BMSCs的数量和质量均有明显下降(而老年人正是缺血性心脑血管病的高发人群，是可能的需要细胞移植治疗的主体)；②在体外扩增过程中，细胞的增殖能力、分化潜力、乃至向病灶区归巢的能力均会逐渐丧失。这严重限制了成体干细胞自体移植的临床应用。

本发明利用人于细胞修复和“归巢”特性，将构建好的能过表达RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1，使得人干细胞能延长细胞寿命，增强成血管能力，而无成瘤性。人干细胞来源方便，主要包括人基质干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞和胚胎干细胞等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产。因而，本发明细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞制备简单，促进缺血区的新血管再生，创造有利于神经再生的微环境，有望对缺血性心脑血管病较好的治疗效果，能个体化临床治疗，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗缺血性心脑血管疾病。

发明内容

许多基础研究及临床研究已经证实，干细胞在治疗缺血性心脑血管疾病中发挥着独特的功能，能促进缺血区的新血管再生及神经再生，修复受损的组织，同时也能分泌神经营养因子和细胞因子，改善机体微环境。然而临床使用的人干细胞均需要在体外大量扩增培养，保证足够的数量进行临床治疗。人成体干细胞均有寿命，一旦体外扩增到几代后就出现生长速率减缓，其端粒变短，分化潜能减弱、“归巢”能力降低和成血管能力也大打折扣。

人干细胞衰老分子机制还不清楚，研究证实端粒酶活性降低使得端粒变短是一个非常重要的原因。RNA睾丸信号转导与激活子(testis-signal transduction andactivator of RNA，T-STAR)参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入端粒酶反转录酶的磷酸化促进端粒酶活化，从而催化TTAGGG重复序列增加到染色体末端，以维持端粒长度，也是保持细胞复制活性的关键因素。

血管生成素-1(angiopoietin-1，Angl)在胚胎发育过程中血管生成和成年人血管再生的关键因子。研究发现Angl在神经保护，以及局部脑出血后神经生长和血管生成中起到重要的作用。

本发明是我们长期科研工作，发现了T-STAR和Angl双慢病毒载体转染的人干细胞，能提高端粒酶活性，保持端粒长度，而延长了干细胞的寿命；同时增强了成血管生成的能力，而且无成瘤活性。这一结果就提示了我们可以通过转染T-STAR和Angl双慢病毒载体转染方法，提高人干细胞的体外增殖能力，经大量传代培养后仍具有很强的增殖能力，并具有高活性的成血管生长能力。因而这样保证了临床治疗使用的细胞数量的同时，也保持了干细胞很强的增殖、分化、归巢以及成血管生成活性，可能在临床治疗缺血性心脑血管疾病中发挥着更好的作用。

本发明提供了一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1的双基因片段，重组到病毒载体上，转染人干细胞制备成可延长细胞寿命的人干细胞，以促使人干细胞提高成血管活性，但无成瘤性。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，通过PCR技术扩增RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1 cDNA序列，分别重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒载体上，两个基因重组病毒载体共转染，包装成病毒后转染人干细胞，获得细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，传代培养到10代后倒置显微镜下观察仍具有干细胞形态，培养到120天还具有很好增殖能力；而未转染T-STAR和Angl双慢病毒载体的干细胞倒置显微镜观察细胞形态发生变化，培养到120天细胞已无法继续扩增。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，相对端粒酶活性得到显著提高，与未转染T-STAR和Angl双慢病毒载体的干细胞相比，具有显著差异，是其的76.4倍以上。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，体内成血管能力与未转染T-STAR和Angl双慢病毒载体的干细胞相比，具有明显的差异，是其的3.1倍以上。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，体内、体外成瘤实验中未发现成瘤现象，保证了其安全性。

所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞和人胚胎干细胞等，优选地，为人基质干细胞和人内皮祖细胞。由于人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人神经干细胞来源人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)人干细胞基础培养基；

2)包装好的T-STAR和Angl基因的慢病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得人干细胞的来源为人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓。

所述的过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供所述细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的应用，保证了体外培养获得足够数量的人干细胞，

并具有促血管再生能力，能用于从人干细胞修复缺血性心脑血管疾病中损伤的血管细胞并促进神经细胞再生。

附图说明

图1表示为重组T-STAR和Angl在实施例1中制备的重组T-STAR和Angl双慢病毒转染hMSCs后基因表达水平

图2表示为hMSCs细胞群体倍增水平曲线对比图

图3表示为hMSCs倒置显微镜下观察的细胞形态比较图

图4表示为检测hBMSC相对端粒酶活性的对比图

图5表示为hBMSCs裸鼠体内皮下注射后成血管能力对比结果图

图6表示为hBMSCs裸鼠体内皮下注射后成瘤结果图

具体实施方式

本发明提供了一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1的基因片段，重组到病毒载体上，转染人干细胞制备细胞寿命延长的人干细胞，3促使人干细胞提高成血管能力，且无成瘤性。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，通过PCR技术扩增得到RNA睾丸信号转导与激活子和血管生成素-1 cDNA序列，分别基因重组到表达质粒上，例如pET系列、pUC系列和pDONR系列等表达质粒。

T-STAR和Angl基因重组后分别引入双酶切位点，连接到病毒载体上，取对数生长期的293FT细胞，以(2～2.5)×10⁶细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用Lipofectamine^TM2000转染进行T-STAR和Angl病毒包装。48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5min后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染。转染分为4组：未转染对照组，T-STAR单基因转染组，Angl单基因转染组，T-STAR和Angl双基因转染组。

将两组病毒上清分别感染人干细胞，同时加入工作液浓度为5μg-ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为干细胞完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带重组T-STAR和Angl目的基因病毒转染人干细胞成功，获得持续表达T-STAR和Angl的人干细胞。

所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞和人胚胎干细胞等，优选地，为人基质干细胞和人内皮祖细胞。人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人干细胞来源人废弃脐血、胎盘血、脐带、自体骨髓等体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统，例如pPACK-REV、pPACK-GAG和pVSV-G；pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0以及pspax2、pMD2G和pHBLV^TM等，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，传代培养到10代后倒置显微镜下观察仍具有干细胞形态，培养到120天还具有很好增殖能力；而未转染T-STAR和Angl慢病毒载体的干细胞倒置显微镜观察细胞形态发生变化，培养到120天细胞已无法继续扩增。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，通过端粒酶PCR-ELISA试剂盒检测相对端粒酶活性得到显著提高，与未转染T-STAR和Angl双慢病毒载体的干细胞相比，具有显著差异，是其的76.4倍以上。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，裸鼠体内皮下注射后分析成血管能力，与未转染T-STAR和Angl慢病毒载体的干细胞相比具有明显的差异，血管密度均显著高于不转染的干细胞，是其的3.1倍以上。

本发明所述的细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞，裸鼠体内皮下注射后，未发现成瘤现象，保证了其安全性，而接种的宫颈癌细胞系Hela阳性对照出现了成瘤。

本发明还提供了一种制备细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)人干细胞基础培养基；

2)包装好的T-STAR和Angl过表达病毒载体；

3)消化细胞的酶；

4)细胞因子以及；

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得所述人干细胞包括人基质干细胞、人内皮祖细胞、人神经干细胞和人胚胎干细胞等，优选地，为人基质干细胞和人内皮祖细胞。人干细胞来源人废弃脐血、胎盘血、脐带、自体骨髓等体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓。

所述的过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明还提供细胞寿命延长及成血管能力增强的人干细胞的应用，体外培养可以获得更多数量级的人干细胞，并保证了人干细胞增殖、分化、“归巢”和成血管能力，在慢性神经退行性疾病临床治疗中更佳的发挥出神经修复和成血管保护神经的功能。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1 重组T-STAR和Angl慢病毒载体的构建及人基质干细胞的制备

将T-STAR和Angl序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，分别将T-STAR和Angl目的片段和pLenti6.3_MCS载体PacI/AscI双酶切后，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，分别与双链T-STAR和Angl于4℃12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(美国Invitrogen公司)后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。

取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜。第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液。取9ug Packaging Mix(Invitrogen)和3ug慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM(经37℃预热)中，轻轻混匀，取36ul lipofectamine2000加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；轻轻混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min。将3ml质粒脂质体复合物小心地加入到人基质干细胞(human mesenchymalstem cells，hBMSCs)培养皿中，轻轻混匀，37℃，5％CO₂的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM(含10％胎牛血清)。48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤(美国BD公司)。将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于opti-MEM培养液中，滴度测定后分装成小管保存于-80℃。转染分为4组：未转染对照组(hBMSC)，T-STAR单基因转染组(hBMSC-T)，Angl单基因转染组(hBMSC-A)，T-STAR和Angl双基因转染组(hBMSC-T&A)。

图1中为重组T-STAR和Angl在转染hMSCs后基因表达水平。A为Angl在转染了T-STAR和Angl的hMSCs中的表达水平，B为T-STAR在转染了T-STAR和Angl的hMSCs中的表达水平。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测，转染了T-STAR和Angl双病毒载体的hBMSCs传代培养到第10代后，其表达T-STAR和Angl基因均高于未转染的第1代hBMSCs，分别高于27.8和20.7倍。

实施例2 重组T-STAR和Angl慢病毒转染人基质干细胞增殖能力分析

实施例1中重组T-STAR和Angl双慢病毒载体转染的hBMSCs通过完全培养液DMEM(含10％胎牛血清)体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用0.25％(质量体积比)胰酶(含0.05％EDTA，质量体积比)消化传代。根据每次细胞传代一次计算细胞群体倍增水平，图2中，未转染的hBMSCs和单独转染了Angl的hMSCs(hBMSC-A)传代培养到120天时不再能扩增，生长停止了。而单独转染了T-STAR(hBMSC-T)和转染了T-STAR和Angl的hBMSC(hBMSC-T&A)均可以扩增到210天以上，表明转染了T-STAR和Angl的hBMSC(hBMSC-T&A)具有良好增殖能力。

图3中是取传代培养到3代和10代hMSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的hBMSC在培养到第3代时细胞形态与其他转染目的基因的hBMSC具有相似的细胞形态，但是培养到第10代时，其细胞形态发生了变化，不具有梭形，细胞变得粗大，而转染目的基因的hBMSC仍具有梭形，包括转染了T-STAR和Angl的hBMSC。

实施例3 重组T-STAR和Angl慢病毒转染人基质干细胞端粒酶活性检测

通过瑞士罗氏公司TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA^PLUS试剂盒检测，取实施例2中传代培养获得第1代hBMSC，第10代单独转染了T-STAR(hBMSC-T)、第10代单独转染了Angl的hBMSC(hBMSC-A)和第10代转染了T-STAR和Angl的hBMSC(hBMSC-T&A)，根据使用说明书检测其相对端粒酶活性。

图4为检测hBMSC相对端粒酶活性的对比图。单独转染了T-STAR(hBMSC-T)和转染了T-STAR和Angl的hBMSC(hBMSC-T&A)具有很高的端粒酶活性，与未转染的hBMSCs和单独转染了Angl的hMSCs(hBMSC-A)对比具有明显的差异，其中hBMSC-T&A相对端粒酶活性是hBMSCs的76.4倍，表明转染了T-STAR和Angl的hBMSC可能保持了染色体上端粒的长度，从而延长了细胞的寿命。

实施例4 重组T-STAR和Angl慢病毒转染人基质干细胞成血管生成分析

取实施例2中传代培养获得第1代hBMSC，第10代单独转染了T-STAR(hBMSC-T)、第10代单独转染了Angl的hBMSC(hBMSC-A)和第10代转染了T-STAR和Angl的hBMSC(hBMSC-T&A)，各5×10⁵细胞。与冰浴中的Matrigel(BD Labware)500μL混匀，皮下注射于8周裸鼠背脊皮下(南方医科大学实验动物中心)。3周后，断颈处死小鼠，手术取出Matrigel种植体，生理盐水中清洗2～3次。体内取出的Matrigel种植体福尔马林固定，石蜡包埋，制成4μm的切片，常规脱蜡，水化。先经30mL/L H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，0.001mol/L枸橼酸缓冲液抗原修复，再依次加入30mL-L小牛血清、抗vWF免疫荧光组织化学显示微血管。用PBS代替一抗作空白对照。结果判断：每只实验动物随机选出5张切片，先在低倍荧光显微镜下(×100)下检查整个切片，找到并选取微血管面积最高的3个视野(热点)，数码相机高倍镜下(×200)摄片，图象分析软件计算微血管数量。

图5为hBMSCs裸鼠体内皮下注射后成血管能力对比结果图，与未转染T-STAR和Angl双慢病毒载体的干细胞相比具有明显的差异，血管密度均显著高于不转染的干细胞，是其的3.1倍，表明转染了T-STAR和Angl的hBMSCs具有很好的成血管生成能力。

实施例5 重组T-STAR和Angl慢病毒转染人基质干细胞体内成瘤分析

取实施例2中传代培养获得的第1代hBMSC，传代培养到第120天单独转染了T-STAR(hBMSC-T)、独转染了Angl的hBMSC(hBMSC-A)和转染了T-STAR和Angl的hBMSC(hBMSC-T&A)，各3×10⁶细胞，其中以宫颈癌Hela细胞系为阳性对照，皮下注射于8周裸鼠腹部侧翼(南方医科大学实验动物中心)，连续观察3个月，注意是否注射部位是否出现肿瘤生长。

图6为hBMSCs裸鼠体内皮下注射后成瘤结果图，裸鼠体内皮下注射后，所有hBMSCs均未发现成瘤现象，而接种的宫颈癌细胞系Hela阳性对照出现了成瘤，表明转染了T-STAR和Angl的hBMSCs具有很好临床安全性。

Claims (3)

1.一种细胞寿命延长及成血管能力增强的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的制备方法，其特征在于，

将T-STAR和Angl序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，将T-STAR和Angl分别经PacI/AscI双酶切后，分别得到双酶切后的T-STAR和Angl，pLenti6.3_MCS载体经PacI/AscI双酶切后，将所述双酶切后的T-STAR、Angl分别与双酶切后的载体在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定，得到慢病毒表达质粒；

取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个直径为10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，得到质粒溶液，取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min，得到lipofectamine2000稀释液；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min，得到质粒脂质体复合物；将3ml质粒脂质体复合物加入到293T细胞培养皿中，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM，获得转染后的293T细胞；48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45μm的滤器过滤；将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于opti-MEM培养液中，滴度测定后分装成小管保存于-80℃，转染人骨髓间充质干细胞；

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了T-STAR和Angl双病毒载体的hBMSCs传代培养到第10代后，其表达T-STAR和Angl基因均高于未转染的hBMSCs，分别为27.8和20.7倍。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

重组T-STAR和Angl双慢病毒载体转染的hBMSCs通过完全培养液DMEM体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶消化传代。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，

通过瑞士罗氏公司TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAPLUS试剂盒检测，取传代培养获得第10代转染了重组T-STAR和Angl双慢病毒载体的hBMSCs，根据使用说明书检测其相对端粒酶活性。

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