CN117025678A - 一种多核苷酸构建体、其构建方法及应用 - Google Patents

一种多核苷酸构建体、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多核苷酸构建体、其构建方法及应用，本发明通过腺相关病毒、腺病毒或LNP等其它基因递送手段，通过两种肿瘤特异性启动子结构分别表达caspase‑1的p20和p10蛋白片段杀伤包括前列腺癌，结肠癌，肺癌，肝癌，消化道癌，胰腺癌等肿瘤，提高了基因疗法治疗癌症的安全性，也保证了杀伤肿瘤的效果。

Description

一种多核苷酸构建体、其构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种多核苷酸构建体、其构建方法及应用。
背景技术
基因药物通常由含工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分可为DNA、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞，通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正特定基因，以达到治疗和预防疾病的目的。基因药物是当今最前沿的药物开发领域之一，在治疗遗传病、癌症、糖尿病、预防传染病等方面正不断取得突破性进展，主要包括遗传病治疗病毒、溶瘤病毒、基因编辑药物、mRNA药物、小核酸药物等。
Caspase1编码的蛋白质是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)家族的成员，其活化涉及到两个步骤。第一步由上游的caspase如caspase-8，caspase-9，caspase-11在pro-caspase-1的第121位Asp和315位Asp切割成两个中间体蛋白片段p20和p10。p20的片段包含大的催化亚基，p10片段包含小的催化亚基。第二步，p20和p10结合形成一个异源四聚体、有活性的caspase-1酶。它们的结合由两个大小亚基间的保守的相互作用介导。一旦被激活，caspase-1切割下游的底物如原白介素-1β和原白介素-18产生成熟形式的白介素-1β和白介素-18。在pro-Gasdermin D存在的情况下，活化的caspase-1会切割pro-GasderminD引发细胞焦亡；而当缺少Gasdermin D时，细胞会发生凋亡。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，提供了以下技术方案：
本发明提供了一种多核苷酸构建体，其包含：
1)两个组织特异性启动子序列；和
2)分别与两个组织特异性启动子可操作地连接的功能片段；
所述功能片段包括编码caspase-1的p20和p10蛋白的基因片段。
本文中术语“多核苷酸构建体”的使用不意味将本发明限于包含DNA的多核苷酸构建体。本领域的普通技术人员将认识到，包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合的多核苷酸构建体，尤其多核苷酸和寡核苷酸，也可以用在本文公开的方法中。本发明的多核苷酸构建体还包括全部形式的多核苷酸构建体，它们包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。另外，本领域的普通技术人员理解在本文公开的每种核苷酸序列还包括所例示的核苷酸序列的互补物。
本文中术语“启动子”和“转录启动子”是等同的，启动子是启动特定基因转录的调节元件。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链和上游(朝向有义链的5’区域)。术语“特异性启动子”是指仅能在特定器官或组织(例如肿瘤)或特定细胞类型(例如肿瘤细胞)中活化的启动子。
进一步，所述组织特异性启动子的组织为癌症组织。
进一步，所述癌症包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。
进一步，所述癌症为前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃肠癌、唾液腺癌、食道癌、胆道肿瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤。
以单数或复数形式使用的术语“癌症细胞”或“癌细胞”可以指这样的细胞，其经历了恶性转化，从而对宿主生物体而言其为病理性的。恶性转化是一个单步骤或多步骤过程，其部分涉及细胞遗传组成和/或表达谱的改变。恶性转化可自发发生，也可通过诸如药物或化学处理、辐射、与其他细胞融合、病毒感染、或特定基因的激活或失活等事件或事件组合而发生。恶性转化可在体内或体外发生，必要时可通过实验诱导。
在一些实施方案中，所述癌症组织或癌症细胞是癌瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤等，包括实体瘤。在一些实施方案中，所述能够被治疗的癌症包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为神经母细胞瘤。在一些实施方案中，该癌症为神经胶质瘤。在一些实施方案中，该癌症为前列腺癌。
术语“患有癌症的受试者”可以指经测试发现具有癌细胞的受试者。
进一步，所述两个组织特异性启动子选自PhSurv269(Surv269启动子)、pGFAP、pPSA、pDBH、pPhox2b、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-1启动子和probasin基因启动子中的任意一种或两种。
进一步，所述两个组织特异性启动子及其可操作地连接的功能片段可单独存在于多核苷酸构建体上，也可分别存在于两个多核苷酸构建体上，所述两个组织特异性启动子均表达出功能片段后两片段结合行使治疗功能。
在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体的结构包括组织特异性启动子-功能片段-组织特异性启动子-功能片段的形式，具体地，组织特异性启动子为在癌症中特异性启动的启动子，启动子与功能片段之间顺次连接。在某个具体的实施方案中，所述多核苷酸构建体的结构包括组织特异性启动子1-功能片段1-组织特异性启动子2-功能片段2，其中组织特异性启动子1与组织特异性启动子2为不同的癌症组织特异性启动子，功能片段1与功能片段2是相互结合后可以行使治疗癌症功能的片段。
进一步，所述多核苷酸构建体可连接标记物。
本发明所述的标记物用于增生疾病(如癌症)的诊断，如在开展治疗之前、之中或之后增生疾病的过强活性或过低活性、出现、表现、生长、缓解、复发或耐受。本发明的标记物也可用于诊断肿瘤级别，肿瘤预后以及肿瘤的治疗反应。所述标记物的预测功能可以通过如下来确认，例如在人类增生疾病如癌症中的过表达或低表达、蛋白水平升高或降低、或活性升高或降低(如通过所述标记物所参与的路径的调控来确定)；所述标记物在生物样本中的存在或缺少，所述样本包含来自患有增生疾病如癌症的受试者的组织、细胞或生物液体的样本；或所述标记物在患有增生疾病如癌症的不同临床分组的患者(如对特定疗法有反应的那些或产生耐受的那些)中的存在或缺失。
进一步，所述多核苷酸构建体包括编码如SEQ ID NO:1所示的p10蛋白的核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括编码如SEQ ID NO:2所示的p20蛋白的核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:3所示的PhSurv269核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:4所示的pGFAP核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:5所示的pPSA核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:6所示的pDBH核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:7所示的pPhox2b核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸构建体包括如pAAV-pPSA-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-pDBH-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-pPhox2b-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-pGFAP-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p10-FRT、pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10、pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-p20-P2A-p10-FRT结构的多核苷酸构建体。
进一步，所述pAAV-pPSA-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步，所述pAAV-pDBH-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。
进一步，所述pAAV-pPhox2b-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
进一步，所述pAAV-pGFAP-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
进一步，所述pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p10-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步，所述pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
进一步，所述pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-p20-P2A-p10-FRT的核苷酸序列如SEQ IDNO:14所示。
在一个实施方案中，所述“p10”与“Caspase1p10”同义，“p20”与“Caspase1p20”同义，是指细胞焦亡相关基因Casp1的前体经剪切形成的两个亚基，本领域技术人员常称为“p10”、“p20”、“p10亚基”或“p20亚基”。
本发明提供了一种已改造的细胞，所述细胞包括前面所述的核苷酸构建体。
进一步，所述的细胞包括细菌、蓝藻、放线菌、衣原体、支原体、立克次氏体、酵母细胞、植物细胞、衣藻、动物细胞。
本文所用的术语“改造细胞”或宿主细胞，可以指已引入外源核酸序列(例如载体)的细胞。因此，重组细胞或改造细胞与不含重组引入的核酸的天然细胞是可以区分的。
本发明提供了一种病毒，所述病毒包括前面所述的核苷酸构建体。
进一步，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、CMV病毒、细小病毒、塞姆利基森林病毒、猴空泡病毒。
本发明提供了一种组合物或产品，所述组合物或产品包括前面所述的核苷酸构建体、或前面所述的病毒。
进一步，所述组合物或产品还包括用于将所述多核苷酸构建体递送至受试者中的细胞的递送媒介物。
进一步，所述递送媒介物包括质粒、脂质、线性核苷酸、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、CMV病毒、细小病毒、塞姆利基森林病毒、猴空泡病毒。
本发明提供了一种多核苷酸构建体的构建方法，所述构建方法用于构建前面所述的多核苷酸构建体。
进一步，所述构建方法包括：
i)克隆组织特异性启动子序列与功能片段序列；
ii)将所述启动子序列与功能片段序列组装成多核苷酸构建体。
进一步，所述功能片段包括编码caspase-1的p20和p10蛋白的基因片段。
进一步，所述两个组织特异性启动子选自PhSurv269(Surv269启动子)、pGFAP、pPSA、pDBH、pPhox2b、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-1启动子和probasin基因启动子中的任意一种或两种。
癌细胞的一个常见特征是倾向于以不受宿主控制的方式生长。通过成熟的技术，尤其是组织学检查，可以很容易地将原发性癌细胞(即从恶性转化部位附近获得的细胞)与非癌细胞区分开来。本文中，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括源自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞、体外培养物和源自癌细胞的细胞系。
本发明提供了一种非治疗目的的将前面所述的多核苷酸构建体递送至细胞的方法，其包括将前面所述的多核苷酸构建体与细胞接触，导致所述多核苷酸构建体递送至细胞中的步骤。
进一步，所述多核苷酸构建体接触细胞的过程中还可使用递送媒介物。
进一步，所述递送媒介物包括质粒、脂质、线性核苷酸、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、CMV病毒、细小病毒、塞姆利基森林病毒、猴空泡病毒。
本发明提供了一种促进体外癌细胞焦亡的方法，所述方法包括使用前面所述的多核苷酸构建体、前面所述的病毒、或前面所述的产品或组合物与癌细胞接触的步骤。
进一步，所述癌细胞的癌种包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。
进一步，所述癌细胞的癌种为前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃肠癌、唾液腺癌、食道癌、胆道肿瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤。
本发明提供了前面所述的多核苷酸构建体、前面所述的细胞、前面所述的病毒、前面所述的构建方法在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的添加剂。
进一步，所述药学上可接受的添加剂包括缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮盖剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂。
在一些情况下，根据预防或治疗个体所患疾病或病症的需要，治疗方法可以包括单次施用、多次施用和反复施用。在一些情况下，治疗方法可以包括在治疗前、治疗期间和/或治疗后评估个体的疾病水平。在一些情况下，治疗可以继续，直到检测到个体的疾病水平下降。
本发明提供了前面所述的多核苷酸构建体、前面所述的细胞、前面所述的病毒、前面所述的构建方法在制备抑制和/或杀伤肿瘤细胞的药物或者试剂中的应用。
进一步，所述肿瘤包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。
进一步，所述肿瘤为前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃肠癌、唾液腺癌、食道癌、胆道肿瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤。
本发明的有益效果：
本方案通过腺相关病毒、腺病毒或LNP等其它基因递送手段，通过两种肿瘤特异性启动子结构分别表达caspase-1的p20和p10蛋白片段杀伤包括前列腺癌，结肠癌，肺癌，肝癌，消化道癌，胰腺癌、神经母细胞瘤等肿瘤，提高了基因疗法治疗癌症的安全性，也保证了杀伤肿瘤的效果。
附图说明
图1是AAV病毒载体结构示意图；
图2是AAV病毒载体结构示意图；
图3是共聚焦显微成像图，其中，A为pAAV2-pPSA-GFP病毒转染C42(1:300000)后的GFP荧光图，B为pAAV2-pDBH-GFP病毒转染SH-SY5Y(1:300000)后的GFP荧光图，C为pAAV2-pPhox2b-GFP病毒转染SH-SY5Y(1:300000)后的GFP荧光图；
图4是AAV2-PhSurv269-GFP病毒转染不同细胞(1:300000)后的分布图；
图5是慢病毒感染不同细胞的阳性率统计图，其中，A为慢病毒感染C42细胞GFP阳性率图，B为慢病毒感染RWPE-1细胞GFP阳性率图，C为慢病毒感染U87细胞GFP阳性率图；
图6是慢病毒转染对结肠癌的杀伤效果统计图，其中，CK为对照(DPBS缓冲液)，p10为pAAV2-PhSurv269-p10(1:300000)，p20为pAAV2-PhSurv269-p20(1:300000)，p10+p20为AAV2-PhSurv269-p10+AAV2-PhSurv269-p20(1:300000)；
图7是慢病毒转染对神经母细胞瘤的杀伤效果统计图，其中，CK为对照(DPBS缓冲液)，S为PhSurv269；
图8是慢病毒转染对胶质瘤的杀伤效果统计图，其中，CK为对照(DPBS缓冲液)，Surv为PhSurv269；
图9是慢病毒转染对前列腺癌的杀伤效果统计图，其中，CK为对照(DPBS缓冲液)，Surv为PhSurv269；
图10是慢病毒转染载体在小鼠体内杀伤前列腺癌的效果统计图，其中，A为肿瘤大小统计图，B为小鼠肿瘤情况的实况图，C为各小鼠肿瘤实物图；
图11是实施例9中小鼠注射pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10后在1个月内的体重变化图；
图12是实施例9中小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰胺转移酶(GGT)的检测结果图；
图13是联合感染组抑制前列腺癌细胞C42效果图；
图14是单独或联合感染抑制正常前列腺上皮细胞RWPE-1的效果图；
图15是慢病毒转染对正常前列腺上皮细胞RWPE-1的杀伤效果图；
注：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
具体实施方式
实施例1载体及病毒的构建
具体构建序列如表1所示，本发明中所使用的载体结构如图1与图2所示。
表1
1、腺相关病毒的包装
(1)细胞接种：T175Flasks接种2×107个293FT细胞。加30ml含10％ FBS的DMEM培养基，37℃，5％ CO2培养箱过夜培养，16-24h后转染。
(2)细胞转染：细胞生长的交汇度达到80-90％，准备转染。A液和B液分别混合后，室温静置5min。接着B液逐滴加入A液中，边加边摇匀，室温22-26℃静置20min。逐滴加到培养皿中，轻轻摇匀，5％ CO2，37℃过夜培养。转染体系如表2所示：
表2
(3)转染换液：16-18h后，去掉含转染试剂的培养基，加入30ml含10％ FBS的DMEM，5％ CO2、37℃条件下继续培养。
(4)病毒第一次收获：从转染开始算48h后，收获细胞上清，转移到50ml离心管中，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。细胞加入30ml含10％ FBS的DMEM，5％ CO2、37℃条件下继续培养。
(5)病毒第二次收获：收获细胞上清，转移到50ml离心管中，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。细胞用10％消毒液(84消毒液)处理后丢弃。
(6)病毒浓缩：将收集到的腺相关病毒组分用0.45μm滤器过滤去除细菌污染，将过滤后组分与PEG8000按照体积比3:1混合，轻轻颠倒混匀。
(7)4℃孵育30min或过夜。
(8)4℃1500g离心45min，离心后会在管底看到白色沉淀。
(9)小心吸去上清液，不能破坏白色沉淀。
(10)用适当体积腺相关病毒保存液重悬沉淀，对病毒进行qPCR检测测定病毒滴度并将所获取的腺相关病毒分别分装、保存于-80℃。
2、病毒滴度测定
对腺相关病毒进行qPCR检测测定病毒滴度。
(1)将待测定病毒的标准质粒10倍梯度稀释，选1011～107copies/μL作为实验标准曲线建立的标准品。
(2)按照Top Green qPCR SuperMix说明书及荧光定量PCR仪反应体系要求配置qPCR反应的试剂，反应体系如表3所示。
表3
(3)将反应混合液取19μL/孔(20μL体系)分装至8联管中，依次在孔中加入1μL/孔反应标准品及待检样品。
(4)将加入反应液的8联管瞬离，轻微震荡混匀，瞬离后放入96System仪中，设定反应程序，运行。反应程序如表4所示。
表4
(5)反应程序结束后，取出检测8联管丢弃，拷出数据进行保存分析。
3、实验结果
具体病毒滴度测定结果如表5所示。
表5
实施例2启动子的验证
1、实验方法
(1)细胞复苏
1)从液氮罐中取出1支冻存管，立即在37℃水中不断摇晃，使冻结的细胞悬液彻底融化。
2)冻存管中的细胞一旦彻底融化(液态)，立即将其从热水桶中取出，75％的酒精彻底消毒冻存管表面，放入超净工作台内。冻存管即将融化时，将含有已预热至37℃内皮培养基的离心管经酒精消毒后，放置于超净工作台内。
3)严格无菌操作条件下将冻存管中的细胞悬液取出，加入预热DMEM完全培养基15ml离心管内，轻轻吹打2～3次，1300rpm，5min离心，离心结束后弃上清。
4)加入内皮培养基，轻轻吹打2～3次，将细胞转移至细胞培养瓶中，加入培养液。将培养瓶放置于CO2培养箱中培养。
(2)细胞传代
1)从培养箱取出待传代的孔板/培养瓶，吸弃上清，DPBS洗一次。
2)加胰蛋白酶，铺满瓶底后，吸弃胰蛋白酶，置于培养箱孵育4-5min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
3)轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱壁，然后用枪头轻轻吹打几次，最后加入内皮培养基终止消化，将细胞吹打脱落后转移至新培养瓶，加入内皮培养基，置于37℃5％ CO2培养箱培养。
4)每三天均进行换液操作，待细胞汇合度约70％～80％时，进行传代。
(3)AAV病毒感染
3万C42细胞铺24孔板，DMEM完全培养基培养，同时按1:300000加入AAV2-启动子-GFP病毒，三天后共聚焦显微镜观察。
2、实验结果
按1:300000对C42进行pAAV2-pPSA-GFP病毒感染的荧光显示结果如图3A所示，按照1:300000对SH-SY5Y进行pAAV2-pDBH-GFP、pAAV2-pPhox2b-GFP病毒感染的荧光显示结果如图3B、3C所示。
按1:300000的比例对C42、HCT116、U87、NCM460、RWPE-1细胞进行pAAV2-PhSurv269-GFP病毒感染的荧光显示结果如图4所示，由结果可知，在人前列腺癌细胞C42、结肠癌细胞HCT116、人神经胶质瘤细胞U87中感染后的GFP荧光明显，说明在癌细胞中表达，在人正常结肠上皮细胞NCM460、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中病毒转染后的GFP荧光微弱，说明在正常细胞中几乎不表达，综上可知pAAV2-PhSurv269-GFP仅在肿瘤细胞中表达，载体构建成功。
实施例3luciferase-GFP稳转细胞系的建立
1、实验方法
(1)HEK293T细胞复苏
实验试剂、仪器、耗材准备：37℃水浴锅、配制好的高糖培养基(含10％的FBS和1％的双抗)、离心机、10mm的细胞培养皿和细胞培养箱。
实验步骤：1)从液氮中取出冻存的HEK293T细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，向细胞冻存管中加入1mL DMEM高糖培养基重悬；2)1300r/min，离心5min，弃上清，用2mL高糖培养基重悬后铺于10mm的细胞培养皿中，补足液体到10mL，摇匀，置于细胞培养箱中。
(2)HEK293T细胞传代
实验试剂、仪器、耗材准备：细胞消化液(Tryple：DPBS为1:1)、配制好的高糖培养基(含10％的FBS和1％的双抗)、离心机、10mm的培养皿和细胞培养箱。
实验步骤：1)从培养箱中取出待传代的细胞(细胞生长密度达到90％左右)，吸弃培养液，加入3mL的DPBS清洗一次(动作缓慢)，吸弃DPBS，加入3mL提前预热的细胞消化液，置于细胞培养箱中3min(中间可拿出观察)；2)加入7mL高糖培养基终止消化，吹打几次(将细胞吹打成单细胞)，将细胞悬液置于15mL离心管中，1300r/min，离心5min，弃上清；3)根据实验需要进行后续传代密度(若用于第二天细胞转染，接种密度可按一个10mm的细胞皿接1.0×107个细胞)。注意事项：使用HEK293T细胞时进行支原体检测；用于转染的HEK293T细胞最好传代2次以上。
(3)HEK293T细胞外源质粒转染(包被慢病毒)
实验试剂、仪器、耗材准备：表达质粒(1个)、辅助质粒(3个)、Opti-MEM、PEI(转染试剂)、高糖培养基、15mL离心管、50mL离心管和细胞培养箱。
实验步骤：1)A液和B液按表6和表7配置(以一个10mm细胞培养皿进行转染为例)；2)A液和B液配置好后，常温静置5min，将A液全部吸到B液中，常温静置20min；3)A液和B液静置混匀期间，取出培养箱中的细胞培养皿，吸弃培养液，加入8mL高糖培养基(动作轻柔)，置于培养箱中继续培养；4)待A液和B液混合好后，取出已经更换培养液的细胞培养皿，每个皿中均匀加入2mL的混合液(尽量加入时均匀)，然后轻微晃动，置于培养箱中继续培养；5)转染6h后，取出转染后的细胞培养皿，吸弃培养液，加入10mL配制好的高糖培养基(动作轻柔)，置于培养箱中继续培养；6)分别收集转染48h、72h后的细胞培养液于50mL的离心管中，4℃保存(保存时间最多为7天)或放于-80℃保存。注意事项：使用HEK293T细胞时进行支原体检测；接种时细胞要接均匀；换液时动作要缓慢，轻柔；将所有与病毒接触的相关试剂和耗材消毒。
表6A液配置方法
用量(ng) 所用体积/皿
pLP-VSVG 5000 --
pRSV-ReV 4000 --
pMD2.G 7000 --
表达质粒 10000 --
opti-MEM -- 1mL
表7B液配置方法
用量
PEI 20μL
opti-MEM 1mL
(4)慢病毒浓缩(超速离心法)
实验试剂、仪器、耗材准备：0.45μM的细胞过滤器、50mL的注射器、50mL离心管，高速离心管(需提前灭菌并在使用前预冷)、电子天平、涡旋振荡器、普通离心机和湘仪高速离心机。
实验步骤：1)将收集的含病毒的培养液用0.45μM的细胞过滤器过滤，将过滤后液体放于50mL离心管中，向每个超速离心管中加入大约20mL左右的病毒液，并做好标记；2)将高速离心管两两配平，两管之间重量差异小于0.01g(可用封口膜平衡差异)，离心，5000g，4℃，2h；3)离心完成后对病毒沉淀位置做上标记，弃掉上清，每个高速离心管缓慢加入10mL预冷的DPBS(注意不要将液体直接对准病毒沉淀)，轻轻晃动几下，5-10s后弃掉DPBS，并倒扣于无菌纸上5min左右(注意倒扣时间不要太长)；4)吸弃残留液体，然后每个管中加入150μL预冷的DPBS，然后在涡旋振荡器上震荡，震荡1min，静置3min(于冰上静置)，重复此操作直到病毒沉淀完全溶解，3000r/min，瞬时离心；5)将收集到的病毒液体分装到提前预冷的1.5mL离心管中，50μL/支(依据个人实验目的确定)，做好标记，-80℃保存(整个过程尽量在冰上操作，病毒液持续混匀)。注意事项：使用病毒时避免反复冻融；将所有与病毒接触的相关试剂和耗材消毒。
(5)慢病毒感染与药筛
使用0.1-10μg/ml Puromycin筛选人前列腺癌细胞C42、人神经胶质瘤细胞U87、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1，确定了最小药杀浓度，其中人正常前列腺上皮细胞RWPE-1为0.5μg/ml，人前列腺癌细胞C42为2μg/ml，人神经胶质瘤细胞U87为1μg/ml。
(6)细胞系构建-慢病毒感染细胞
实验试剂、仪器、耗材准备：E8完全培养液、F12、细胞消化液(Tryple：DPBS为1:1)、DPBS、水浴锅、15mL离心管、细胞计数板、冰盒、Polybrene。
实验步骤：1)取出病毒浓缩液、Polybrene于冰上解冻；2)将贴壁细胞消化成单细胞，进行细胞计数，从中吸取一定体积的细胞悬液(5×105个细胞)，1020r，离心5min；3)吸弃上清，加入luciferase-gfp慢病毒，用DMEM补充至50μL，混匀，置于37℃细胞培养箱中30min(期间配置下一步所需培养液)；4)取出病毒和细胞的培养液，加入3mL提前配制好的培养液(含8μg/mL的Polybrene)，混匀，接种于六孔板的一个孔中，置于37℃细胞培养箱中培养；5)24h后更换新鲜的条件培养液(不含Polybrene DMEM完全培养液)，置于37℃细胞培养箱中培养，继续培养48h后更换新鲜的条件培养液。注意事项：使用细胞时进行支原体检测。
2、实验结果
慢病毒感染人前列腺癌细胞C42的GFP阳性率、慢病毒感染人正常前列腺上皮细胞RWPE-1的GFP阳性率、慢病毒感染人神经胶质瘤细胞U87的GFP阳性率如图5所示，由图可知，慢病毒感染人前列腺癌细胞C42的GFP阳性率为91.6％，慢病毒感染人正常前列腺上皮细胞RWPE-1的GFP阳性率为68.1％，慢病毒感染人神经胶质瘤细胞U87的GFP阳性率为85.5％，阳性率高，转化效果好。
实施例4pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-PhSurv269-p20组合抑制结肠癌
1、实验材料
CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promeg，G1780)，DMEM高糖培养基(Gibco，12100-046)，fetal bovine serum(Cellmax，SA211.02)，DPBS(Gibco，2380005)，0.25％胰酶(Cytiva，J210027)，HCT116结肠癌细胞，Promega LDH试剂盒。
2、实验方法-LDH法测杀伤
LDH在细胞培养上清的半衰期为9小时，通过1个30分钟的酶偶联反应将紫色的四唑盐转化为一种红色的甲瓒，产生的量与被裂解细胞的数量正相关，可通过酶标仪检测。步骤如下：
1)T175培养的细胞用无钙镁的DPBS洗一遍，0.25％胰酶消化3-5min，加完全培养基终止消化，离心，计数，24孔板接种细胞HCT116，每孔加入10万HCT116细胞，分别加入两种AAV病毒，每种以细胞：病毒＝1:10万的比例添加，每组重复3个孔，DMEM完全培养基培养2天。2)每孔取50μl上清后，每孔加入50μl裂解液后45min，取裂解细胞液稀释10倍测LDH结果×10作为LDH最大释放量，每份样品加入50μl CytoTox 96试剂，室温下孵育30min。每孔(96孔板)加入50μl终止液，一小时内检测在490nm/492nm下的吸收值。3)通过LDH吸收值与最大LDH释放的吸收值之比计算AAV对细胞的杀伤效果。
3、实验结果
杀伤结果如图6所示，由结果可知，pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-PhSurv269-p20(简称p10+p20)实验组的杀伤效果显著高于对照组(p<0.01)，PhSurv269-p10(简称p10)实验组、PhSurv269-p20(简称p20)实验组与对照组(简称CK)的杀伤效果无显著性差异。
实施例5pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-pDBH/pPhox2b-p20组合抑制神经母细胞瘤
1、实验方法-LDH法测杀伤
具体方法同实施例4，区别为用SH-SY5Y细胞(30万)替换结肠癌细胞HCT116(10万)，pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-pDBH/pPhox2b-p20组合替换pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-PhSurv269-p20组合。
2、实验结果
杀伤结果如图7所示，由结果可知，pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-pDBH-p20(简称Sp10+DBHp20)实验组的杀伤效果显著高于对照组(p<0.001)，pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-pPhox2b-p20(简称Sp10+PHOX2B-p20)实验组的杀伤效果显著高于对照组(p<0.01)，pAAV2-pDBH-p20(简称DBHp-20)实验组、pAAV2-pPhox2b-p20(简称PHOX2B-p20)实验组、pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-PhSurv269-p20(简称Sp10+p20)实验组与对照组(简称CK)的杀伤效果无显著性差异，显示由肿瘤特异性启动子启动的p20与p10才具有对肿瘤细胞优越的杀伤性能。
实施例6pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-pGFAP-p20组合抑制胶质瘤
1、实验方法-LDH法测杀伤
具体方法同实施例4，区别为用U87细胞(5万)替换结肠癌细胞HCT116(10万)，pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-pGFAP-p20组合替换pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-PhSurv269-p20组合。
2、实验结果
杀伤结果如图8所示，由结果可知，pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-pGFAP-p20(简称Surv-p10+GFAP-p20)实验组的杀伤效果显著高于对照组(p<0.001)，pAAV2-PhSurv269-p10(简称Surv-p10)实验组、pAAV2-pGFAP-p20(简称GFAP-p20)实验组、pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-PhSurv269-p20(简称Surv-p10+p20)实验组与对照组(简称CK)的杀伤效果无显著性差异，显示由肿瘤特异性启动子启动的p20与p10才具有对肿瘤细胞优越的杀伤性能。
实施例7pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-pPSA-p20组合抑制前列腺癌
1、实验方法-LDH法测杀伤
具体方法同实施例4，区别为由C42细胞(10万)替换结肠癌细胞HCT116(10万)，pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-pPSA-p20组合替换pAAV2-PhSurv269-p10和pAAV2-PhSurv269-p20组合。
2、实验结果
杀伤结果如图9所示，由结果可知，pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-pPSA-p20组合(简称Surv-p10+PSA-p20)实验组、pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-PhSurv269-p20(简称Surv-p10+p20)实验组的杀伤效果显著高于对照组(p<0.05)，pAAV2-PhSurv269-p10(简称Surv-p10)实验组、pAAV2-pPSA-p20(简称PSA-p20)实验组的杀伤效果与对照组(简称CK)无显著性差异。
实施例8pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10在小鼠体内杀伤前列腺癌C42
1、实验材料
①Nude裸鼠；②前列腺癌细胞C42。
2、实验方法
消化C42肿瘤细胞，调整细胞浓度为2×107个细胞/mL；②选取小鼠右侧腋下进针，向前方穿行，注射前针头稍微动一动，确保位于皮下；③将整根针头缓慢插入皮下后缓慢注射细胞悬液100μL，可看见明显的鼓包；④注射完毕后，缓慢旋转退出针头，尽量避免漏液；⑤待皮下肿瘤形成后进行肿瘤体积测量，肿瘤体积计算依据公式：体积＝长径×短径×短径×1/2。
3、实验结果
小鼠实验结果显示pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10实验组可以显著抑制肿瘤的生长(图10)。说明肿瘤特异性启动子启动杀伤基因AAV病毒可以有效抑制肿瘤生长且没有明显毒副作用。
实施例9pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10对小鼠的安全性
1、实验材料与方法
表8
1)给药后正常饲养小鼠1个月，每周2次进行一般观察，包括但不限于外观体征、一般行为活动、精神状态、腺体分泌、呼吸状态、粪便性状及颜色、生殖器、死亡等情况及其它毒性表现。每周称量1次体重，并绘制体重变化曲线。
2)饲养一个月后，对所有小鼠安乐死后采集血清，采用生化试剂盒检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰胺转移酶(GGT)的含量。
2、实验结果
(1)给药后饲养期间，对照组和实验组小鼠的外观、行为、精神状态、粪便形状、身体各部位状态均正常。实验组小鼠略低于对照组小鼠，但是无显著性差异(图11)，表明注射pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10后，对小鼠的体重和健康不会产生不良影响。
(2)血液生化结果显示，对照组和实验组的ALT、AST、ALP、GGT水平均无统计学差异(图12)，表明注射pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10后不会对小鼠产生毒性。
实施例10联合感染组抑制前列腺癌细胞C42效果更加明显
将pAAV2-PhSurv269-p10-pPSA-p20、pAAV2-PhSurv269-p10-PhSurv269-p20、pAAV2-PhSurv269-p10、pAAV2-pPSA-p20、CK(DPBS缓冲液)分别加入前列腺癌细胞C42中，得到结果如图13所示，由图可知，pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-pPSA-p20(简称Surv269-p10+PSA-p20)及pAAV2-PhSurv269-p10+pAAV2-PhSurv269-p20(简称Surv269-p10+p20)联合感染组抑制C42效果较单加pAAV2-PhSurv269-p10(简称Surv269-p10)或pAAV2-pPSA-p20(简称PSA-p20)或对照组(简称CK)效果明显。
实施例11AAV病毒疗法并不杀伤正常前列腺上皮细胞RWPE-1
将pAAV2-PhSurv269-p10-pPSA-p20(简称surv-p10+PSA-p20)、pAAV2-PhSurv269-p10-PhSurv269-p20(简称surv-p10+p20)、pAAV2-PhSurv269-p10(简称surv-p10)、pAAV2-pPSA-p20(简称PSA-p20)、CK(DPBS缓冲液)分别加入正常前列腺上皮细胞RWPE-1中，得到结果如图14，15所示，由图可知，各组间均无统计学差异，说明无论是联合感染还是单独感染，均不会抑制正常前列腺上皮细胞的生长，一定程度上证明了本发明的AAV疗法是安全的。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多核苷酸构建体，其包含：
1)两个组织特异性启动子序列；和
2)分别与两个组织特异性启动子可操作地连接的功能片段；
所述功能片段包括编码caspase-1的p20和p10蛋白的基因片段；
优选地，所述组织特异性启动子的组织为癌症组织；
优选地，所述癌症包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌；
优选地，所述癌症为前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃肠癌、唾液腺癌、食道癌、胆道肿瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤；
优选地，所述两个组织特异性启动子选自PhSurv269、pGFAP、pPSA、pDBH、pPhox2b、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-1启动子和probasin基因启动子中的任意一种或两种；
优选地，所述两个组织特异性启动子及其可操作地连接的功能片段可单独存在于多核苷酸构建体上，也可分别存在于两个多核苷酸构建体上，所述两个组织特异性启动子均表达出功能片段后两片段结合行使治疗功能；
优选地，所述多核苷酸构建体可连接标记物。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包括编码如SEQ IDNO:1所示的p10蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括编码如SEQ ID NO:2所示的p20蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:3所示的PhSurv269核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:4所示的pGFAP核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:5所示的pPSA核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:6所示的pDBH核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括如SEQ ID NO:7所示的pPhox2b核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸构建体包括如pAAV-pPSA-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-pDBH-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-pPhox2b-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-pGFAP-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p10-FRT、pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p20-FRT、pAAV2-PhSurv269-p20-P2A-p10、pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-p20-P2A-p10-FRT结构的多核苷酸构建体；
优选地，所述pAAV-pPSA-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
优选地，所述pAAV-pDBH-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，所述pAAV-pPhox2b-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
优选地，所述pAAV-pGFAP-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p10-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-T2A-p20-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
优选地，所述pAAV-PhSurv269-FRT-CRE-p20-P2A-p10-FRT的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
3.一种已改造的细胞，所述细胞包括权利要求1或2所述的核苷酸构建体；
优选地，所述的细胞包括细菌、蓝藻、放线菌、衣原体、支原体、立克次氏体、酵母细胞、植物细胞、衣藻、动物细胞。
4.一种病毒，所述病毒包括权利要求1或2所述的核苷酸构建体；
优选地，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、CMV病毒、细小病毒、塞姆利基森林病毒、猴空泡病毒。
5.一种组合物或产品，所述组合物或产品包括权利要求1或2所述的核苷酸构建体、或权利要求4所述的病毒；
优选地，所述组合物或产品还包括用于将所述多核苷酸构建体递送至受试者中的细胞的递送媒介物；
优选地，所述递送媒介物包括质粒、脂质、线性核苷酸、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、CMV病毒、细小病毒、塞姆利基森林病毒、猴空泡病毒。
6.一种多核苷酸构建体的构建方法，所述构建方法用于构建权利要求1或2所述的多核苷酸构建体；
优选地，所述构建方法包括：
i)克隆组织特异性启动子序列与功能片段序列；
ii)将所述启动子序列与功能片段序列组装成多核苷酸构建体；
优选地，所述功能片段包括编码caspase-1的p20和p10蛋白的基因片段；
优选地，所述两个组织特异性启动子选自PhSurv269、pGFAP、pPSA、pDBH、pPhox2b、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-1启动子和probasin基因启动子中的任意两种。
7.一种非治疗目的的将权利要求1或2所述的多核苷酸构建体递送至细胞的方法，其包括将权利要求1或2所述的多核苷酸构建体与细胞接触，导致所述多核苷酸构建体递送至细胞中的步骤；
优选地，所述多核苷酸构建体接触细胞的过程中还可使用递送媒介物；
优选地，所述递送媒介物包括质粒、脂质、线性核苷酸、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、CMV病毒、细小病毒、塞姆利基森林病毒、猴空泡病毒。
8.一种促进体外癌细胞焦亡的方法，所述方法包括使用权利要求1或2所述的多核苷酸构建体、权利要求4所述的病毒、或权利要求5所述的产品或组合物与癌细胞接触的步骤；
优选地，所述癌细胞的癌种包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌；
优选地，所述癌细胞的癌种为前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃肠癌、唾液腺癌、食道癌、胆道肿瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤。
9.权利要求1或2所述的多核苷酸构建体、权利要求3所述的细胞、权利要求4所述的病毒、权利要求6所述的构建方法在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的添加剂；
优选地，所述药学上可接受的添加剂包括缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮盖剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂。
10.权利要求1或2所述的多核苷酸构建体、权利要求3所述的细胞、权利要求4所述的病毒、权利要求6所述的构建方法在制备抑制和/或杀伤肿瘤细胞的药物或者试剂中的应用；
优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、肝癌、胃肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤，和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌；
优选地，所述肿瘤为前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃肠癌、唾液腺癌、食道癌、胆道肿瘤、胰腺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤。
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