KR101381064B1

KR101381064B1 - 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템

Info

Publication number: KR101381064B1
Application number: KR1020120025008A
Authority: KR
Inventors: 김연수; 강문경; 송아영
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2014-04-25
Also published as: KR20130103954A

Abstract

본 발명은 MuLV-Gag 유전자, MuLV-Pol 유전자 및 GaLV-Env 유전자를 두 개의 벡터에 나누어서 발현시킨 벡터시스템은 양쪽 모두에 치료 유전자를 넣을 수 있기 때문에 삽입 유전자의 크기에 제한받지 않고 다양한 치료용 외래 유전자를 삽입하여 목적하는 암조직 부위에 안전하면서도 효과적으로 전달할 수 있으므로, 상기 벡터시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 포함하는 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물, 암 예방 또는 치료용 조성물로 활용가능하다.

Description

슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템 {Pseudotype Replication-Competent Retrovirus two-vector system}

본 발명은 암세포조직으로의 효율적인 유전자 전달을 가능하게 하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템에 관한 것이다.

지금까지 20년간 약 1,700여 건에 달하는 유전자치료 임상시험이 허가되어 수행되어 왔다. 그러나 최근 들어 일부 단일결손 유전자에 기인한 유전성 질환을 대상으로 한 성공적인 유전자치료의 성공사례가 발표되고 있는 것과는 대조적으로, 가장 많은 유전자치료 임상케이스를 기록하고 있는 암의 유전자치료에서는 기대했던 것만큼의 결과를 도출하지 못하고 있다. 수년 전 큰 기대를 받았던 종양분해성 (oncolytic) 아데노바이러스 벡터를 이용한 항암 유전자치료도 일부 두경부암에서 제한적인 치료효과를 보이고 있을 뿐이다.

이러한 낮은 암 유전자치료 효과의 원인에 대한 공통적인 인식은 암세포조직으로의 효율적인 유전자 전달을 가능하게 하는 벡터의 개발이 시급하다는 것이다. 실제 지난 암유전자 치료 임상연구에서 조사한 암세포로의 유전자전달 효율은 전체 암조직 내 암세포의 1% 미만으로 나타나고 있다. 이러한 비효율적인 암 조직으로의 유전자전달 효율을 높이기 위해서 여러 종류의 oncolytic 바이러스들이 개발되고 연구되었지만 면역원성 유발에 의한 염증 (inflammation)과 신속한 바이러스 제거 (rapid viral clearance), 복잡한 바이러스 유전자구조에 따른 개발의 어려움, 생체 내에서의 바이러스 변형과 불활성화로 인해 기대했던 효과는 거둘 수 없었다.

그러나 최근 종양분해성 (oncolytic) 백시니아 바이러스를 이용한 암유전자 치료가 과거의 성적보다는 보다 매우 희망적인 임상연구결과를 보여주는 것을 필두로 2010년에는 미국에서 복제가능 레트로바이러스 (RCR: Replication-Competent Retrovirus)을 이용한 암 유전자치료 임상연구가 승인을 받고 2011년 현재 임상 제1상 연구가 마무리되고 2상 연구가 진행되고 있는 상황으로 추후 이 벡터시스템을 개량하고 실용화하기 위한 연구 및 이 시스템들을 이용한 임상연구들이 증가할 것으로 예상된다.

본 발명은 MuLV (Murine Leukemia virus, MuLV)-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터; 및 GaLV (Gibbon Ape Leukemia Virus)-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터;를 포함하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 재조합 복제가능 레트로바이러스를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 재조합 복제가능 레트로바이러스를 포함하는 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물 또는 암예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 MuLV-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 및 GaLV-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;를 포함하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 MuLV (Murine Leukemia virus, MuLV)-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터; 및 GaLV (Gibbon Ape Leukemia Virus)-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터;를 포함하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템을 제공한다.

상기 제 1 재조합 발현벡터는 도 1의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

상기 제 2 재조합 발현벡터는 도 2의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

상기 제 1 재조합 발현벡터 또는 제 2 재조합 발현벡터는 암 치료 유전자를 포함할 수 있다.

상기 제 2 재조합 발현벡터는 도 3의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 제공한다.

본 발명은 상기 레트로바이러스를 포함하는 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물을 제공한다.

상기 암세포는 점액상 세포 암종, 둥근 세포 암종, 국소적 진행 종양, 전이성 암, 어윙 (Ewing) 육종, 암전이, 림프성 전이, 편평상피 세포 암종, 식도 편평상피 세포 암종, 경구 암종, 다발성 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 유출 림프종 (체강계 림프종), 흉선 림프종 폐암, 소 세포 폐암종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨성 림프종, 부신 피질 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 폐암, 유방암, 소 세포 암종, 도관 암종, 위암, 결장암, 결장직장암, 결장직장 종양 형성과 관련된 용종, 췌장암, 간암, 방광암, 1차 표면 방광 종양, 방광의 침습성 전이 세포 방광암종, 근 침윤성 방광암, 전립선암, 대장암, 신장암, 간암, 식도암, 난소 암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 원발성 복막상피 신생물, 자궁 경관 암종, 질암, 외음부암, 자궁암, 난포 중 고형 종양, 고환암, 음경암, 신장 세포 암종, 뇌암, 두경부암, 구경부암, 신경아세포종, 뇌간 신경교종, 신경교종, 중추신경계 중 전이성 종양 세포 침윤, 골종, 골육종, 악성 흑색종, 인간 피부 케라티노사이트의 종양 진행, 편평상피 세포 암종, 갑상선 암, 망막아종, 신경아세포종, 중피종, 빌름스 종양, 담낭암, 영양아세포 종양, 혈관주위세포종, 또는 카포시 육종으로부터 유래된 세포일 수 있다.

본 발명은 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 암 치료 유전자는 세포자살 유전자, 세포사멸유도 유전자, 면역 유전자, 신생혈관형성억제 유전자, 및 암세포를 사멸시킬 수 있는 유전자침묵 (RNAi)을 유도하는 shRNA, miRNA 또는 siRNA를 발현하는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 세포자살 유전자는 전구체약물을 활성화시킬 수 있다.

상기 세포자살유전자는 허피스 심플렉스 (herpes simplex) 바이러스의 티미딘 키나아제 (thymidine kinase)이며 전구체약물인 GCV (Ganciclovir)를 활성화시킬 수 있다.

상기 세포자살유전자로 박테리아나 효모의 싸이토신 디아미네이즈 (cytosine deaminase)일 수 있다.

본 발명은 MuLV-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 및 GaLV-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;를 포함하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 암세포 표적성 벡터인, MuLV-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터와 GaLV-Env를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터의 양쪽 모두에 치료 유전자를 넣을 수 있기 때문에 삽입 유전자의 크기에 제한받지 않고 다양한 치료용 외래 유전자를 삽입할 수 있으며, 상기 벡터는 U-87 신경교종세포에 감염시 역가 (titer)에 관계없이 94 내지 100%의 높은 감염률 및 증식속도를 보였고, 기존의 항암제가 암세포뿐만 아니라 전신에 작용하여 부작용을 초래하는데 반해, 본 발명의 벡터시스템은 목적하는 암 조직 부위에만 특이적으로 작용하여 부작용없이 안전하게 암 치료유전자를 전달하여 효과적으로 암 조직 세포만을 살상함으로 모든 실험체의 생존기간을 관찰 종료시점까지 생존을 유지시켰을 뿐만 아니라, 분열하는 세포를 표적으로 하기 때문에 암의 종류에 상관없이 모든 종류의 암에 작용할 수 있어, 본 발명의 벡터 시스템은 모든 종류의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용할 수 있다.

도 1는 Gag 유전자 및 Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 GaLV-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3는 상기 제 2 재조합 발현벡터에 치료 유전자가 추가된 것을 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 sRCRgp-RFP의 서브클로닝에 관한 것으로,
도 4는 FvGEL199Env 서열을 제거하기 위해, pRCR(FvGEL199)을 ScaＩ, PmeＩ으로 분해하고, T4 DNA 폴리머라아제로 처리한 다음, 자가결합시킨 것이다.
도 5는 마커유전자 (RFP)를 삽입하기 위해, sRCRgp 플라스미드를 EcoRＩ으로 분해하고 pLentiM1.4-monomerRFP로부터 PCR-로 증폭시킨 mCMV 프로모터-RFP조각을 삽입한 것이다.
도 6은 spRCRe(GaLV-Env)GFP의 서브클로닝에 관한 것으로, 도 6A는 mCMV 프로모터와 GFP 서열을 삽입하기 위해, pMFG-eGFP-Puro을 XhoＩ와 ClaＩ로 분해한 다음, PCR에 의해 pLenti-M1.4-eGFP로부터 증폭시킨 mCMV 프로모터-eGFP 조각과 결합시킨 것이고, 도 6B는 다음에 pMYK-ef1-GaLV-Env의 GaLV-Env서열을 증폭시키고 pMFG-mCMV-GFP2 (도 3A)의 PmeＩ로 분해된 지역에다 삽입한 것이다.
도 7은 spRCRe(GalV-Env)TK의 서브클로닝에 관한 것으로, 도 7A는 spRCR (GaLV-Env)MCS을 서브클로닝하기 위하여, spRCRe(GaLV-Env)-GFP상의 eGFP를 제한효소로 분해하여 제거시키고 자가 결합시킨 다음, PCR 증폭 (spRCR(GaLV-Env)MCS)에 의해 멀티클로닝 위치를 삽입시키고 spRCR(GaLV-Env)MCS을 PmeＩ으로 분해시켜서 TK 서열을 삽입한 것이고, 도 7B는 pSXLC-TK로부터 PmeＩ로 분해된 TK 조각을 spRCR(GaLV-Env)MCS로 삽입시킨 것이다.
도 8는 형광마커단백질을 발현하는 세미-복제가능 레트로바이러스 벡터의 구조를 나타낸 것으로, 도 8A는 sRCRgp-RFP가 양말단의 LTR뿐만 아니라 Gag-Pol 발현 구조 및 RFP 서열을 함유한 것이고, sRCRe(MuLV-Env)-GFP은 발현 마커뿐만 아니라 MuLV-Env 발현 구조 및 GFP 서열을 함유한 것이고, 도 8B는 sRCRe(MuLV-Env)-GFP내의 MuLV-Env 유전자를 GaLV-Env 유전자로 교환한 것이다.
도 9 및 도10은 high titer sRCR(MuLV-Env)-FL 및 spRCR(GaLV-Env)-FL의 복제 키네틱을 나타낸 것으로,
도 9A, B는 인간 신경교종 세포 (Human glioma cell)인, U-87 MG를 2.5X10⁷ 게놈 카피 (genomic copies)에서 sRCR-FL 또는 spRCR-FL로 감염시킨 것이고, 감염 후 다양한 시간점에서, 세포들을 현광현미경 하에 관찰하고 GFP 또는 RFP을 발현하는 세포 퍼센티지를 결정하기 위해 유세포분석기에 의해 형광을 측정한 것이다.
도 10은 유세포분석기에 의해 측정된 GFP 또는 RFP을 발현하는 세포의 퍼센티지를 나타낸 것이다.
도 11 및 도 12는 high titer sRCR(MuLV-Env)-FL 및 spRCR(GaLV-Env)-FL의 복제 키네틱을 나타낸 것으로,
도 11A, B는 Env 벡터 및 Gag-Pol 벡터에 의해 발현되는 GFP 또는 RFP의 퍼센티지를 나타낸 것이며, 도 12는 spRCRe(GaLV-Env)-GFP의 복제 키네틱을 sRCRe(MuLV-Env)-GFP와 비교한 것이다.
도 13 및 14는 low titer sRCR(MuLV-Env)-FL 및 spRCR(GaLV-Env)-FL의 복제 키네틱에 관한 것으로,
도 13A, B는 인간 신경교종 세포 (Human glioma cell)인, U-87 MG를 1.5X10⁶ 게놈 카피 (genomic copies)의 sRCR-FL 또는 spRCR-FL로 감염시키고 이후 다양한 시간점에서 세포를 현광현미경 하에서 관찰한 것이고, GFP 또는 RFP를 발현시키는 세포의 퍼센티지를 결정하기 위해 유세포분석기에 의해 측정된 형광을 나타낸 것이고. 도 14는 유세포측정기에 의해 측정된 GFP 또는 RFP를 발현하는 세포의 퍼센티지를 나타낸 것이다.
도 15 및 도 16은 low titer sRCR(MuLV-Env)-FL 및 spRCR(GaLV-Env)-FL의 복제 키네틱에 관한 것으로,
도 15는 Env 벡터 및 Gag-Pol 벡터에 의해 발현되는 GFP 또는 RFP의 퍼센티지를 나타낸 것이고, 도 16은 spRCRe(GaLV-Env)-GFP의 복제 키네틱을 sRCRe(MuLV-Env)-GFP와 비교한 것이다.
도 17은 발현하는 세미-복제가능 레트로바이러스 벡터의 구조를 나타낸 것으로, 도 17A, B는 각 Env 벡터에서 GFP 유전자가 허피스 심플렉스 바이러스 타입I 티미딘 키나아제 유전자로 대체된 것이다.
도 18은 TK를 발현하는 세미-복제가능 레트로바이러스 벡터의 TK 유전자의 발현을 나타낸 것으로, 웨스턴 블롯팅에 의해 A549 세포에서 HSV-TK 발현을 관찰한 것이다. 레인 1 (Lane 1)은 처리되지 않은 (untreated) A549를, 레인 2 (lane2)는 spRCR(GaLV-Env)-TK 바이러스로 감염된 A549 세포를; 레인 3 (lane3)은 sRCR(MuLV-Env)-TK 바이러스로 감염된 A549 세포를, 레인 4 (lane4)는 spRCR(GaLV-Env)-TK 플라스미드로 트랜스펙션된 gp293 세포를 나타낸 것이다.
도 19 및 도 20은 U-87 MG에서 semi-RCR-TK/GCV의 세포독성 (Cytotoxicity)을 나타낸 것으로,
도 19는 spRCR(GaLV-Env)-TK transduced U-87 MG을 0일에 0 부터 70㎍/ml에 이르는 다양한 농도로 GCV 처리하고, 세포의 생존을 MTT 분석으로 결정한 것이며,
도 20은 spRCR(GaLV-Env)-FL, sRCR(MuLV-Env)-TK, spRCR(GaLV-Env)-TK trasnduced U-87 MG를 10㎍/ml GCV로 처리하고, 세포의 생존을 MTT 분석으로 결정한 것이다.
도 21은 생체 내 인간 신경교종 (human gliomas)에서 semi-RCR 바이러스의 확산을 보여주는 것으로, 도 21A는 누드 마우스의 선조체 (striatum)내에 인간 신경교종 (Human glioma) U-87 MG를 주입하여 암을 형성시키고, 7일 후에 각 semi-RCR-FL 벡터 1.5X10⁷ 게놈 카피 (genomic copies) (10⁴ TU)를 이종이식된 암 내로 주입하고, 바이러스 주입 18일 후에 동결절편 (cryosection)한 것이며, 도 21 B, C는 sRCR(MuLV-Env)-FL (도 21B) 또는 spRCR(GaLV-Env)-FL (도 21C) 확산에 의한 GFP와 RFP의 발현의 통합된 이미지를 나타낸 것이다.
도 22는 뇌종양 이식 누드마우스에서 종양에 spRCR-TK를 감염시킨 뒤 생존기간을 조사한 것이다.
도 23은 qPCR반응의 표준곡선을 그리기 위하여 100 ng의 생쥐 지노믹 DNA에 일정량의 카피수를 첨가한 뒤 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 세 번의 실험을 수행하여 계산한 표준편차를 포함한 데이터를 보여준다.
도 24는 누드마우스의 이식된 뇌종양에 spRCR-GFP를 종양내 주입 (intratumoral injection) 한 후, 각 장기의 DNA 100 ng을 시료로 qPCR을 수행하여 Ct 값을 그래프로 나타낸 것이다. 세 번의 실험을 수행하여 계산한 표준편차를 포함한 데이터를 보여준다.
도 25는 PCR을 이용하여 100 ng의 생쥐 지노믹 DNA에 존재하는 spRCR-GFP 지놈의 존재를 확인한 사진이다. 누드마우스의 이식된 뇌종양에 spRCR-GFP를 종양내 주입 (intratumoral injection) 한 후, 각 장기의 DNA 100 ng을 시료로 PCR을 수행하여 전기영동한 결과를 보여준다.
도 26는 누드마우스의 이식된 뇌종양에 spRCR-TK를 감염시킨 후, 바이러스의 증식을 통한 암조직 내에서의 바이러스 확산을 PET-CT를 사용하여 촬영한 이미지이다.

본 발명은 MuLV-Gag 유전자, MuLV-Pol 유전자 및 GaLV-Env 유전자를 두 개의 벡터에 나누어서 발현시킨 벡터시스템, 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스, 상기 레트로바이러스를 포함하는 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물, 암 예방 또는 치료용 조성물 및 MuLV-Gag 유전자, MuLV-Pol 유전자 및 GaLV-Env 유전자를 두 개의 벡터에 나누어서 발현시킨 벡터시스템의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

종래에 이용되는 암유전자 치료에서 디펙티브 레트로바이러스벡터의 암세포로의 유전자전달 효율은 전체 암 조직 내 암세포의 1% 미만이었다. 이러한 취약점을 극복하기 위해 복제가능 레트로바이러스가 사용되고 있지만 야생형 레트로바이러스 유전체에 추가적으로 치료 유전자를 삽입하여 벡터사이즈가 커지게 될 경우, 벡터의 유전자재조합에 인해 치료기능을 상실한다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자는 상기 문제점을 해결하고자 노력하던 중, 본 발명의 벡터 시스템에 의할 때 삽입 유전자의 크기에 제한이 적고 암세포로의 유전자전달 효율, 특히 동물모델에 구축된 암조직으로의 유전자전달이 모든 분열중인 암조직으로 일어나는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 제 1 재조합 발현벡터는 MuLV-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 것으로, 그 종류에 있어서 특별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 도 1의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

상기 제 2 재조합 발현벡터는 GaLV-Env 유전자를 포함하는 것으로, 그 종류에 있어서 특별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 도 2의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명의 복제가능 레트로바이러스 (Replication Competent Retrovirus, RCR) 벡터는 비용균성 (nonlytic) 바이러스이기 때문에 숙주 면역 시스템에 의해 세포 손상이 일어나지 않으며, 바이러스에 대한 항체가 생성되지 않기 때문에 바이러스 제거 (viral clearance)가 일어나지 않아 유전자 전달체로써 매우 우수하다.

상기 복제가능 (Replication Competent)은 특정 바이러스에 대해 감염성이 높은 동물 세포에 상기 바이러스 유전자를 트랜스팩션 또는 상기 바이러스를 감염시켰을 경우, 그 결과로 얻어진 감염 혹은 형질전환된 세포에서 바이러스를 생산할 수 있는 능력을 가졌음을 의미할 수 있다.

상기 복제가능 레트로바이러스는 핵막이 깨지는 틈을 타 핵 안으로 들어가기 때문에 분열하는 세포에만 감염할 수 있어 암세포에 특이적으로 감염할 수 있다. 따라서 삽입유전자가 다른 정상세포에서 발현되는 것을 막아 암 세포에 유전자 전달의 안전성을 제공할 뿐만 아니라, 바이러스가 복제 가능하기 때문에 유전자 전달 효율도 증대시킬 수 있다.

상기 Gag 유전자는 레트로바이러스의 코어의 4종의 단백질을 이루는 폴리단백질일 수 있으며, 상기 Pol 유전자는 역전사효소를 나타내며, 상기 Env 유전자는 외피당단백질을 나타낼 수 있다.

본 발명에서는 레트로바이러스의 Env 유전자를 GaLV-Env 유전자로 변형함으로 바이러스 증식 및 유전체 전달 효율을 높일 수 있다.

일례로, 상기 제 2 재조합 발현벡터로서 MuLV (Murine Leukemia virus) 외피단백질을 포함한 벡터 (sRCR)와 본 발명의 GaLV 외피당단백질을 포함하는 벡터 (spRCR)를 제작하여 비교해 본 결과, GaLV-Env 유전자를 포함한 발현벡터를 사용할 경우 더 높은 바이러스 감염율과 유전체 전달 효율을 지닐 수 있다.

일 실시예에 나타난 바와 같이, 벡터를 높은 titer를 감염시키고 12일 경과 후 MuLV-Env를 포함한 벡터는 감염율이 80% 선에 머물러 있는 반면 GaLV-Env를 포함한 벡터는 거의 100% 감염율로 가고 있었으며, 벡터를 낮은 titer로 감염시키고 20일 경과 후, MuLV-Env를 포함한 벡터는 2% 밖에 감염이 되지 않는 반면 GaLV-Env를 포함한 벡터는 94%까지 점유되어 있음을 확인할 수 있다.

일 실시예에 나타난 바와 같이,벡터에 세포자살유전자 도입 후 전구체 약물인 GCV를 10 μg/ml 농도로 처리한 하루째에, sRCR-TK에 감염된 세포에서 GCV 처리 하루만에 세포수가 40% 감소하였고, spRCR-TK에 감염된 세포에서는 60% 감소함을 확인할 수 있다.

일 실시예에 나타난 바와 같이, in vivo에서의 sRCR-FL와 spRCR-FL의 암세포 감염률을 비교시 sRCR-FL 감염된 암세포에서는 형광 밝기도 매우 약하고 바이러스가 국소적으로 감염되어 있는 반면, spRCR-FL이 감염된 세포에선 바이러스가 암세포 모양으로 전체적으로 뚜렷하게 발현됨을 확인할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터의 가장 최소 기능 단위인 5'-LTR 및 3'-LTR을 포함할 수 있으며, 이 LTR 사이에 운반하고자 하는 목적유전자의 뉴클레오타이드 서열을 삽입할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 암세포에 외래 유전자를 전달하기 위해 고안된 것으로, 상기 제 1 재조합 발현벡터 또는 제 2 재조합 발현벡터에는 외래 유전자를 삽입할 수 있다.

종래의 발현벡터는 본래 바이러스 유전체에 추가적으로 외래 유전자를 삽입하였기 때문에 삽입할 수 있는 외래유전자 크기에 제한이 있었음에 반하여, 본 발명의 벡터 시스템은 하나의 바이러스 벡터를 두 개로 나누어서 외래 삽입 유전자를 양쪽 벡터 모두에 넣을 수 있기 때문에 다양한 유전자를 크기에 제한받지 않고 삽입할 수 있을 뿐만 아니라, 하나의 바이러스 벡터를 사용하였을 때만큼 복제와 증식이 잘 진행될 수 있다.

상기 외래 유전자는 목적에 따라 암세포에 전달하고자 하는 것으로 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 호르몬, 효소, 수용체, 리포터 유전자, 암 치료 유전자 등을 포함할 수 있다.

일례로, 암치료 유전자를 제 2 재조합 발현벡터에 삽입할 경우, 이러한 재조합 벡터에는 도 3의 개열지도 벡터가 포함될 수 있다.

일례로, 암 치료 유전자로 세포자살 유전자인 티미딘 키나아제 (thymidine kinase, TK)를 사용할 수 있는데, 종래에는 TK 유전자 크기가 커서 기존의 벡터로는 효과를 보기 어려웠고 사이즈가 큰 유전자를 레트로바이러스에 적용할 경우 재조합 (recombination)이 일어나는 문제점이 있었는데 반하여, 본 발명의 벡터 시스템에서는 사이즈가 큰 외래 유전자도 수용할 수 있기 때문에 상기 문제점을 일으키지 않고 TK 유전자를 암 세포로 전달할 수 있다.

본 발명에서는 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 제공할 수 있다.

상기 세포주의 종류는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 인간 293세포, 헬라 (Hela)세포, 케나인 D17세포, 펠라인 PG4세포 등을 들 수 있다.

상기 트랜스펙션 방법은 당업계에 공지된 방법에 따를 수 있으며, 리포펙타민 방법 (Invitrogen사), 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 형질감염된 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 배지를 사용할 수 있으며, 일례로, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), a-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등을 용도에 맞게 선택할 수 있다. 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York을 참조할 수 있다.

상기 배양에 의해 형성된 배양물로부터 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 수득할 수 있다.

상기 레트로바이러스 벡터에 삽입되는 유전자로는 호르몬, 효소, 수용체 또는 약물 (drug)을 발현하는 유전자 등을 포함할 수 있다.

상기 레트로바이러스가 표적하는 세포는 분열 중인 모든 세포를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 암세포일 수 있다.

상기 암세포는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 상기 암세포는 점액상 세포 암종, 둥근 세포 암종, 국소적 진행 종양, 전이성 암, 어윙 (Ewing) 육종, 암전이, 림프성 전이, 편평상피 세포 암종, 식도 편평상피 세포 암종, 경구 암종, 다발성 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 유출 림프종 (체강계 림프종), 흉선 림프종 폐암, 소 세포 폐암종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨성 림프종, 부신 피질 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 폐암, 유방암, 소 세포 암종, 도관 암종, 위암, 결장암, 결장직장암, 결장직장 종양 형성과 관련된 용종, 췌장암, 간암, 방광암, 1차 표면 방광 종양, 방광의 침습성 전이 세포 방광암종, 근 침윤성 방광암, 전립선암, 대장암, 신장암, 간암, 식도암, 난소 암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 원발성 복막상피 신생물, 자궁 경관 암종, 질암, 외음부암, 자궁암, 난포 중 고형 종양, 고환암, 음경암, 신장 세포 암종, 뇌암, 두경부암, 구경부암, 신경아세포종, 뇌간 신경교종, 신경교종, 중추신경계 중 전이성 종양 세포 침윤, 골종, 골육종, 악성 흑색종, 인간 피부 케라티노사이트의 종양 진행, 편평상피 세포 암종, 갑상선 암, 망막아종, 신경아세포종, 중피종, 빌름스 종양, 담낭암, 영양아세포 종양, 혈관주위세포종, 또는 카포시 육종으로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 암세포에 외래 유전자를 전달하는 전달체로서 많은 장점을 지니고 있다. 상기 레트로바이러스는 비용균성 (Nonlytic) 바이러스이기 때문에 숙주 면역 시스템에 의해 세포 손상이 일어나지 않으며, 바이러스에 대한 항체가 생성되지 않기 때문에 바이러스 제거 (viral clearance)가 일어나지 않아 유전자 전달체로써 매우 우수하고, 분열하는 세포에만 감염할 수 있기 때문에 암세포에 특이적으로 감염하여 치료유전자가 다른 정상세포에서 발현되는 것을 막아 암 치료자에게 더 안전성을 제공할 뿐만 아니라, 바이러스가 복제 가능하기 때문에 유전자 전달 효율도 증대시킬 수 있다.

일 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 벡터의 유전자 전달 효율을 확인하기 위해 벡터에 의한 감염율을 확인하였을 때, GaLV-Env를 포함한 벡터를 누드마우스의 이식된 뇌종양에 주입시켰을 경우 MuLV-Env를 포함한 벡터보다 훨씬 강도도 높고, 전체 암 조직에 뚜렷하게 증식되어 있는 것을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 암 조직을 경계로 정상 뇌세포에서는 어떠한 바이러스의 감염도 확인되지 않아, 본 발명의 조성물이 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물로 유용함을 확인할 수 있다.

본 발명의 제 1 재조합 발현벡터 또는 제 2 재조합 발현벡터는 암 치료 유전자를 포함하는 것으로, 암 치료 유전자의 종류는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 세포자살 유전자, 세포사멸유도 유전자, 면역 유전자, 신생혈관형성억제 유전자, 및 암세포를 사멸시킬 수 있는 유전자침묵 (RNAi)을 유도하는 shRNA, miRNA 또는 siRNA를 발현하는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 세포자살 유전자는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로 허피스 심플렉스 (herpes simplex) 바이러스의 티미딘 키나아제 (thymidine kinase), 박테리아나 효모의 싸이토신 디아미네이즈 (cytosine deaminase) 등을 포함할 수 있다.

상기 세포자살 유전자는 전구체약물을 활성화시킬 수 있는데, 일례로 세포자살 유전자 도입 후, 전구체약물 (prodrug)을 투여하면 세포자살 유전자에 의해 전구체약물이 활성화될 수 있다.

상기 세포자살유전자로 허피스 심플렉스 (herpes simplex) 바이러스의 티미딘 키나아제 (thymidine kinase)(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK) 를 사용할 수 있으며, 상기 허피스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제 (HSV-TK)에 의해 전구체약물인 GCV (Ganciclovir)가 활성화될 수 있다.

상기 허피스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제는 다른 포유류의 티미딘 키나아제보다 GCV를 1000배 이상 효과적으로 인산화시키기 때문에 암세포 사멸효과를 높일 수 있다.

HSV-TK는 뉴클레오시드 유사체 (nucleoside analogs)인 간시클로비르 (ganciclovir,GCV)를 인산화 기질로 이용하여 삼인산 (triphosphate) 형태로 변환시킨다. 인산화된 GCV는 세포의 DNA 합성 때 이용되어 과돌연변이 (hypermutation)으로 DNA에 손상을 주어 세포주기 정지 (cell cycle arrest)가 일으키고 결국 세포를 사멸을 일으킬 수 있다. 또한, TK 유전자가 발현되지 않는 세포에서도 TK 유전자가 발현하는 세포의 갭 정션 (gap junction)을 통해 인산화된 GCV가 전달됨에 따라 똑같은 세포 사멸 효과가 나타날 수 있다.

일 실시예에 나타난 바와 같이, HSV-TK 유전자를 본 발명의 벡터에 삽입하여 생존 실험을 진행한 결과, GCV 농도가 10-30㎍/㎖ 일 때, 정상세포에 손상을 주지 않으면서 spRCR-TK 감염 U-87 MG에서 세포독성 (cytotoxicity)이 관찰되었고, 암 조직 이외의 다른 조직에서는 바이러스가 발견되지 않아 본 발명의 조성물이 안전성을 지님을 확인할 수 있으며 또한, 동물 실험결과, 대조군의 마우스는 암 이식 후 40일 전후로 모두 사망하였으며 치료군의 마우스는 매일 주사를 받았으며 암 이식 후 연구가 진행중인 현재인, 70일까지 모두 생존하고 있을 뿐 아니라 체중도 정상으로 유지함을 확인할 수 있다.

상기 결과는 본 발명의 조성물의 안정성이 높으며, 분열하는 암세포에 효과적으로 암치료 유전자를 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.

기존 항암제 치료가 암 세포뿐만 아니라 전신에 작용되어 부작용을 초래하는 반면, 이러한 자살 유전자/전구체약물 (prodrug) 시스템은 암세포만을 목표로 할 수 있어서 정상세포에는 전구체약물이 전혀 영향을 주지 않을 뿐만 아니라, 악성 종양의 국소부위의 괴사 (necrosis)나 저산소화 (hypoxia) 상태에서도 방관자효과 (bystander effect)에 의해 벡터가 도달하지 못하더라도 암 치료 범위가 증대될 수 있다.

본 발명의 상기 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조할 경우, 상기 레트로바이러스는 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 99중량%으로 포함할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA)를 참조하여 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이때 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 일례로, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 등에 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 제 1 재조합 발현벡터는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 도 1의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

상기 제 2 재조합 발현벡터는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 도 2의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

상기 제 1 재조합 발현벡터 또는 제 2 재조합 발현벡터는 암세포 표적으로 하는 외래 유전자를 삽입할 수 있으며, 상기 외래 유전자는 암치료 유전자를 포함할 수 있다.

상기 암 치료 유전자를 포함하는 발현벡터의 예로는, 도 3의 개열지도의 벡터를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 세포배양

293T (human embryonic kidney) 세포, U-87 MG (human glioma) 세포들은 10% 소태아혈청 (Invitrogen)과 항생제 (Invitrogen)를 넣어준 Dulbecco' 미니엄 에센셜 배지 (DMEM, Thermo Hyclone)로 배양하였다. 모든 실험에서 세포들은 세포배양용기 (100mm dish, 6well plate)에 5% CO₂ 배양기에서 배양되었으며 세포빈도가 70-80%정도 차면 1:5로 계대배양하였다.

실시예 2: 벡터의 제작

마커 유전자, RFP가 들어있는 sRCRgp-RFP 벡터 (도 4,5 참조)를 만들기 위해 pRCR (FvGEL199Env)의 FvGel199Env를 ScaⅠ과 PmeⅠ으로 자르고, pLenti M1.4-momomerRFP 벡터의 mCMV 프로모터부터 RFP까지 부분을 PpuMⅠ과 NotⅠ으로 잘라서 비점착말단 연결 (blunt end ligation)을 하였다.

마커 유전자, GFP가 들어있는 spRCRe (GaLV-Env)-GFP 벡터 (도 6 참조)를 만들기 위해 MFG-eGFP-Puro vector의 gag뒤의 XhoⅠ site와 3‘LTR 앞의 ClaⅠ site를 자르고, pLenti M1.4-eGFP의 mCMV에서 eGFP까지 PCR하여 잘라낸 자리에 붙였다.(Forward: SalⅠ-PmeⅠ-mCMV, Reverse: ClaⅠ-GFP) 만들어진 MFG-mCMV-GFP2 벡터의 Gag과 mCMV 사이에 GaLV-Env 서열를 넣기 위해 MYK-ef1-GaLV-Env를 주형 (template)으로 양쪽 프라이머 모두 PmeⅠ위치가 포함된 프라이머를 이용하여 PCR하고, 앞에서 만들어진 벡터를 PmeⅠ으로 잘라 삽입체 (Insert)와 결합 (ligation)하였다.

마커 유전자 대신 원하는 치료유전자를 넣기 위해 eGFP를 BamHⅠ과 ClaⅠ으로 잘라내고 멀티 클로닝 위치 (Multi cloning site)를 넣어 spRCR (GaLV-Env)-MCS 벡터를 만들었다.

spRCR (GaLV-Env)-MCS에 TK 유전자 (도 7참조)를 넣기 위해 pSXLC-TK vector를 NcoⅠ과 XhoⅠ으로 잘라 T4 DNA 폴리머라아제 (TAKARA)로 blunt end를 만들고 spRCR(GaLV-Env)-MCS를 PmeⅠ으로 잘라 CIAP 처리 후 insert와 결합 (ligation)하였다.

sRCRe (MuLV-Env) 벡터를 만들기 위해 앞에서 만든 MFG-mCMV-GFP2의 mCMV 앞부분을 PmeⅠ으로 잘랐다. Amphotropic MuLV-Env insert를 만들기 위해 EQPAM-Am의 MuLV-Env 부분을 전방 (forward), 역방 (reverse) 둘 다 PmlⅠ 위치를 포함한 프라이머로 PCR 하여 결합 (ligation)하였다.

sRCR (MuLV-Env)-RFP에서 TK 유전자를 넣기 위해 RFP를 HpaⅠ으로 양쪽을 자르고 spRCR (GaLV-Env)-TK에서 HpaⅠ, ClaⅠ으로 TK를 잘라 비점착 (blunt)으로 만든 뒤 결합 (ligation)하였다.

실시예 3: 바이러스 생산

293T세포를 트랜스펙션 (transfection) 하루 전날 6 well 플레이트에 6×10⁵개/well의 세포를 접종하였다. 다음날 배지를 FBS가 들어있지 않은 DMEM으로 1ml씩 교체하였다. 세포배양기에 플레이트 (plate)를 다시 넣고 2개의 1.5ml 튜브에 각각 DMEM을 100㎕/well씩 넣었다. 한 튜브 (tube)에 위의 표에 있는 DNA (total 1㎍)와 PLUS reagent (Invitrogen) 5㎕/well, 다른 하나에는 리포펙타민 (Invitrogen) 3㎕/well을 넣고 10초간 볼텍스 (vortex)한다. 15분간 상온에서 배양한 후 리포펙타민이 들어있는 튜브의 용액을 PLUS가 들어있는 튜브에 넣고 다시 10초간 볼텍스 (vortex)하였다. 20분간 상온에서 배양한 후 세포가 깔려있는 플레이트를 꺼내어서 208㎕/well을 세포가 떨어지지 않게 방울방울 떨어뜨렸다. 세포배양기에 넣어준 뒤 4시간 뒤에 세포배지를 제거하고 3% FBS가 들어있는 DMEM을 조심히 넣어주었다. 동물실험에 사용될 바이러스는 FBS를 첨가하지 않았다. 48시간 뒤 배지를 수확하여 튜브에 모았다. 바이러스 농축과 정제를 위해 Amicon 100K (Millipore)에 수확한 바이러스를 넣고 4℃에서 3,000rpm으로 10×가 될 때까지 원심분리 (centrifugation)하였다. 1.5ml 튜브에 만든 날짜를 표시하고 100㎕씩 분주하여 -80℃에 보관하였다.

바이러스 정량을 위해 리얼타임 PCR을 위한 레트로바이러스 역가 세트 (Retrovirus Titer Set for Realtime PCR, TaKaRa)을 이용하였다. 이 키트 (kit)의 프라이머는 MuLV 패킹신호부분 (packaging signal region)을 인식하며, SYBR Green Ⅰ을 마커 프로브 (marker probe)로 가지고 있다. 바이러스를 트랜스펙션 (transfection) 시 과량의 DNA를 사용하므로 이를 제거하기 위해, 다음과 같이 DNase Ⅰ과정 [총 25㎕ (Virus Supernatant 12.5㎕, 10×DNase Buffer 2.5㎕, DNase(5U/㎕) 2.0㎕ RNase Inhibitor(40U/㎕) 0.5㎕, RNase-Free Water 7.5㎕); 37℃, 30분/ 70℃, 10분]을 거쳤다.

Kit에 들어있는 RNA 대조군 주형 (Control Template)으로 일련으로 희석 (serial dilution)하여 기준 샘플 (standard sample)을 준비하였다. (103,104,105,106,107,108copies/㎕) 다음과 같이 real time PCR을 하였다 [총 25㎕ (2×One Step SYBR RT-PCR BufferⅢ 12.5㎕, TaKara Ex Taq HS(5u/㎕) 0.5㎕, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5㎕, Forwaard Titer Primer FRT-1 (10pmol/㎕) 0.5㎕, Reverse Titer Primer FRT-1 (10pmol/㎕) 0.5㎕, Virus supernatant 또는 standard sample 2㎕, RNase-Free Water 8.5㎕; Reverse transcription, 42℃, 5분/ 95℃, 10초; PCR, 40cycle, 95℃, 5초/ 60℃ 30초; Dissociation, 95℃, 15초/ 60℃, 30초/ 95℃, 15초].

기준 커브 (Standard curve)를 그리고 샘플 (sample) 값을 계산하였다.

이식 유전자( Transfer gene )	벡터이름	바이러스 생산을 위해 사용된 벡터
리포터 유전자( Reporter gene )	sRCR-FL	sRCRgp-RFP + sRCRe(MuLV-env)-GFP
리포터 유전자( Reporter gene )	spRCR-FL	sRCRgp-RFP + spRCRe(GaLV-env)-GFP
치료 유전자( Therapeutic gene )	sRCR-TK	sRCRgp-RFP + sRCRe(MuLV-env)-TK
치료 유전자( Therapeutic gene )	spRCR-TK	sRCRgp-RFP + spRCRe(GaLV-env)-TK

실시예 4: 실험실 ( In vitro) 에서 spRCR 벡터의 시간에 따른 복제 양상

기존에 사용하는 MuLV에 근거한 RCR 벡터는 하나의 벡터에서 Gag-Pol, MuLV-Env 그리고 그 뒤에서 리포터 유전자 (또는 치료유전자)가 발현하는 것이었다. 그러나 본 연구에서 사용된 세미-슈도타입 복제가능 레트로바이러스 (semi-pseudotyped replication competent retrovirus, spRCR)는 Gag-Pol과 GaLV-Env, 리포터 유전자 (또는 치료유전자)이 두 개의 벡터에서 나누어서 발현된다. sRCRgp 벡터는 Gag-Pol 유전자를 발현하고, RFP로 세포 내 발현을 확인할 수 있다. sRCRe(MuLV-Env), spRCRe(GaLV-Env) 벡터는 각각 MuLV-Env, GaLV-Env가 발현되고 GFP로 확인할 수 있다. (도 8)

바이러스는 두 개의 벡터를 293T 세포에 일시적 트랜스펙트 (transient transfect)도 시켜 상층 배지를 통해 생산되었다. 이 바이러스로 quantitative real time PCR을 하여 게놈 카피 (genomic copy)를 산출하였다. 2.5×10⁷, 1.5×10⁶ gc(0.01MOI, 0.0005MOI)의 spRCR-FL과 sRCR-FL을 U-87 MG 세포에 감염시켜 2-3일 마다 계대배양 하기 전에 형광 사진을 찍고, 배양하고 남은 세포는 FACS 분석을 하였다. FACS 데이터에 의하면 먼저 높은 역가 (titer) (genome copy, gc)를 감염시켰을 때를 보면 감염속도나 형광 강도가 spRCR(GaLV-Env)가 sRCR(MuLV-Env)보다 비교적 높았다. 감염 후 12일째 sRCR(MuLV-Env)는 아직 80% 선에 머물러 있는 반면 spRCR(GaLV-Env)는 거의 100% 감염율로 가고 있었다. (도 9~12) 낮은 역가 (titer)로 감염시키면 spRCR(GaLV-Env)와 sRCR(MuLV-Env)의 감염속도 차이가 더 현저하게 두드러졌다. 낮은 역가 (titer)로 감염시켰을 때의 초기 감염속도는 둘 다 늦지만, 감염 후 20일이 되었을 때, sRCR(MuLV-Env)는 2% 밖에 감염이 되지 않은 반면 spRCR(GaLV-Env)는 94%까지 점유되어있었다. (도 13~16)

실시예 5: spRCR - TK 에서 발현되는 티미딘 키나아제 ( thymidine kinase) 단백질 확인

리포터 유전자를 발현하는 Env 벡터에서 GFP 유전자를 제거하고 치료유전자인 티미딘 키나아제 (thymidine kinase) 유전자를 클로닝하였다 (도 17). spRCR-TK 벡터에서 실제로 TK 단백질이 발현되는 지 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅 (western blotting)을 하였다.

도 18에서 나타난 바와 같이, 아무 처리도 하지 않은 A549 세포에서는 밴드가 나오지 않고, TK유전자를 발현하는 spRCR-TK, sRCR-TK, pRCR-TK를 감염시킨 세포나 트랜스덕션 (transduction)시킨 세포에서는 밴드를 관찰할 수 있었다.

실시예 6: GCV 농도에 따른 spRCR - TK 감염세포의 민감도

실험실 (In vitro)에서 spRCR-TK에 감염된 세포가 GCV를 처리했을 때 어느 정도의 세포독성 (cytotoxicity)를 보여주는 지 측정하기 위해 MTT 어세이를 하였다. 먼저 Env 벡터의 GFP 대신 치료 유전자인 TK가 들어간 벡터를 만들어 293T 세포에 Gag-pol 벡터와 함께 트랜스펙션 (transfection) 시켜 spRCR-TK를 만들었다. U-87 MG 세포에 이들 바이러스를 감염시켜 14일 동안 유지시킨 후 96well 플레이트에 감염시킨 세포와 감염시키지 않은 세포를 접종하였다. 다음날 GCV의 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70㎍/㎖로 점차적으로 늘려서 처리하였다. GCV를 처리한 기간을 1, 2, 3, 4일로 나누어 그 때마다 MTT 어세이를 진행하였다.

GCV 10 μg/ml 농도 처리 하루째, sRCR-TK에 감염된 세포에서 GCV 처리 하루만에 세포수가 40% 감소하였고, spRCR-TK에 감염된 세포에서는 60% 감소하였다. 정상 세포에서는 GCV 70μg/ml 농도부터 세포독성 (cytotoxicity)를 나타내었다. (도 19, 도 20)

실시예 7: 암조직에서 spRCR - FL , sRCR - FL 의 확산 양상

spRCR-FL, sRCR-FL이 실제 누드마우스의 암 조직에서 퍼지는 양상을 알아보기 위해 누드마우스 뇌의 선조체 (Striatum)에 3×10⁵ U-87 MG 세포를 심었다. 암 이식 7일 후, 1.5×10⁷gc(≒10⁴ TU)/10㎕ 바이러스 벡터를 암에 주입시켰다. 바이러스 주입 (injection) 후 18일 후 암 조직을 형광현미경으로 관찰하였다.

정상 세포와 암세포를 경계로 뚜렷하게 암세포에만 형광이 관찰되었고 뇌 (brain)의 어느 곳에서도 바이러스가 감염된 곳은 없었다. sRCR-FL 감염된 암세포에서는 형광 밝기도 매우 약하고 바이러스가 국소적으로 감염되어 있는 반면, spRCR-FL이 감염된 세포에선 바이러스가 암세포 모양으로 전체적으로 뚜렷하게 발현되었다 (도 21).

실시예 8: 뇌종양 이식 누드마우스에서 종양에 spRCR -TK 감염시 (+GCV 주사) 생존 기간

실시예 7과 같은 방법으로 누드마우스의 선조체 (Striatum)에 U-87 MG 세포를 이식했다. 일주일 뒤, 1.5×10⁷gc (≒10⁴ TU)/10㎕의 spRCR-TK와 10 ㎕ PBS (control)을 암내 주입 (intratumoral injection)했다. 암세포 이식 후 21일 후부터 51일까지 PBS 또는 GCV (100㎎/㎏)를 복강주사 하였다.

대조군의 마우스 (N=13)는 암 이식 후 40일 전후로 모두 사망하였으며 치료군의 마우스 (N=21)는 매일 100 mg/kg GCV 주사를 받았으며 관찰을 종료한 암 이식 후 70일까지 모두 생존하고 있을 뿐 아니라 체중도 정상으로 유지하였다 (도 22).

실시예 9: spRCR 벡터의 안전성

6주령, 암컷 누드마우스의 선조체 (striatum)에 3×10⁵개의 U-87MG 세포를 이식한지 7일 뒤, 10⁷gc spRCR-FL벡터를 종양내 주입 (intratumoral injection)한다. 주입 (Injection) 후 7일 뒤, 마우스를 관류 (perfusion) 하고 암 (tumor) 옆의 정상적인 뇌 (brain), 종양 (tumor), 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 장, 난소, 골수 (bone marrow), 수술 부위의 피부를 멸균된 조건에서 떼어내었다. 조직 프리키트 (Tissue prep kit, GeneAll)로 게놈 DNA를 prep했다.

Quantitative PCR을 위해 표 5와 같이 프라이머 (primer)를 디자인하였다.

전방 프라이머(Forward Primer)	5'-TCCAGGTAAACTGACAGC-3'
역방 프라이머 (Reverse Primer)	5'-CGCCTTTCTAGCCTCTAA-3'
FAM 프로브	5'-TGTTCTCATCACCCATCAGCCCAC-3'

PCR 반응을 위한 조성은 2X IQ Supermix (2X) 10㎕, 센스 프라이머 (Sense Primer, 10pmol/㎕) 0.4㎕, 안티 센스 프라이머 (anti-sense primer, 10 pmol/㎕) 0.4㎕ , gDNA (50 ng/㎕) 2㎕, FAM 프로브 (100 pmol/㎕) 0.03㎕ , 멸균수 (Sterilized water) 7.2㎕으로 총 20.03㎕으로 하였다.

CFX real time PCR C1000 Thermo (Bio-Rad)에서 95℃에서 3 분, 95℃에서 20초, 58℃에서 60초로 40 사이클 (cycle) 반응을 진행하였고, 반응이 끝난 후 데이터를 분석했다.

위와 동일한 조직의 일반 PCR 수행을 위해 0.5㎍ 샘플 DNA, 0.5μM 각 프라이머 (each primer), 5 units TaKaRa Ex Taq 폴리머라아제를 20㎕ 준비하고 30 사이클, 94℃ 1분, 60℃ 30초, 72℃ 1분 PCR하였다. 벡터의 pol과 GFP를 인식하는 프라이머를 사용하였다. 생산물의 크기는 3.5kb이며, 프라이머 서열은 표6과 같다.

전방 프라이머 (Forward primer)(pol)	5'-GGAAAGGACCTTACACAGTC-3'
역방 프라이머 (Reverse primer)(GFP)	5'-CGGGTTAACTTACTTGTACAGCTCGTCC-3'

PCR product를 1% 아가로스 겔 (agarose gel)에 100V, 40분간 전기영동 하였다.

정상 뇌, 뇌종양, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 장, 난소, 골수, 수술부위 피부에서의 게놈 DNA를 뽑아 qPCR과 PCR분석을 한 결과, 종양 (tumor) 조직에서만 GFP 서열이 확인이 되고 다른 모든 조직에서는 GFP 서열이 확인되지 않았다. (도 23~도 25)

실시예 10: 뇌종양 내 HSV - TK 발현 마우스의 PET - CT 촬영

실시예 7과 동일한 방법으로 누드마우스의 선조체 (Striatum)에 U-87 MG 세포를 이식하였다.(n=6) 일주일 뒤, 1.5×10⁷gc (≒10⁴ TU)/10㎕의 비교군 spRCRe-TK (복제불능) 또는 복제가능 spRCR-TK 바이러스를 암조직 내로 주입 (intratumoral injection)하였다. 바이러스를 주입한 후 3, 7, 10, 14, 17일에 다음과 같이 PET-CT 촬영을 하였다. [¹⁸F]FHBG를 마우스 한 마리 당 500 μCi/50㎕를 꼬리 정맥 (tail vein; i.v.) 주입한 다음, 1시간 후에 animal PET-CT (eXplore VISTA CT, GE)를 촬영하는 과정으로 진행되었다. CT의 촬영 조건은 250 ㎂, 40 KA였고, PET 촬영은 5분간 영상을 얻은 후 2D OSEM 재구조 (reconstruction) 과정을 거쳐서 완성할 수 있었다. 이렇게 얻어진 영상은 Osirix imaging 소프트웨어 (The Osirix Foundation, Geneva, Switzerland)를 사용하여 분석 및 구현하였다. (도 26)

도 26에 나타난 바와 같이, 복제불능 바이러스의 경우 암조직으로의 확산이 거의 일어나지 않은 반면에 복제가능 spRCR-TK 바이러스는 매우 효율적으로 암조직 내에서의 확산이 일어남을 알 수 있었다.

Claims

MuLV (Murine Leukemia virus, MuLV)-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터; 및
GaLV (Gibbon Ape Leukemia Virus)-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터;를 포함하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 제 1 재조합 발현벡터는 도 1의 개열지도의 벡터를 포함하는, 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 제 2 재조합 발현벡터는 도 2의 개열지도의 벡터를 포함하는, 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 제 1 재조합 발현벡터 또는 제 2 재조합 발현벡터는 암 치료 유전자를 포함하는, 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템.
제 4항에 있어서, 상기 제 2 재조합 발현벡터는 도 3의 개열지도의 벡터를 포함하는, 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템.
제 1 내지 제 5항 중 어느 한 항의 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스.
제 6항의 레트로바이러스를 포함하는 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 암세포는 점액상 세포 암종, 둥근 세포 암종, 국소적 진행 종양, 전이성 암, 어윙 (Ewing) 육종, 암전이, 림프성 전이, 편평상피 세포 암종, 식도 편평상피 세포 암종, 경구 암종, 다발성 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 유출 림프종 (체강계 림프종), 흉선 림프종 폐암, 소 세포 폐암종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨성 림프종, 부신 피질 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 폐암, 유방암, 소 세포 암종, 도관 암종, 위암, 결장암, 결장직장암, 결장직장 종양 형성과 관련된 용종, 췌장암, 간암, 방광암, 1차 표면 방광 종양, 방광의 침습성 전이 세포 방광암종, 근 침윤성 방광암, 전립선암, 대장암, 신장암, 간암, 식도암, 난소 암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 원발성 복막상피 신생물, 자궁 경관 암종, 질암, 외음부암, 자궁암, 난포 중 고형 종양, 고환암, 음경암, 신장 세포 암종, 뇌암, 두경부암, 구경부암, 신경아세포종, 뇌간 신경교종, 신경교종, 중추신경계 중 전이성 종양 세포 침윤, 골종, 골육종, 악성 흑색종, 인간 피부 케라티노사이트의 종양 진행, 편평상피 세포 암종, 갑상선 암, 망막아종, 신경아세포종, 중피종, 빌름스 종양, 담낭암, 영양아세포 종양, 혈관주위세포종, 또는 카포시 육종으로부터 유래된 세포인, 암세포 표적성 유전자 전달용 조성물.
제 4항의 벡터 시스템으로 세포주를 트랜스펙션시켜 생산된 레트로바이러스를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 암 치료 유전자는 세포자살 유전자, 세포사멸유도 유전자, 면역 유전자, 신생혈관형성억제 유전자, 및 암세포를 사멸시킬 수 있는 유전자침묵 (RNAi)을 유도하는 shRNA, miRNA 또는 siRNA를 발현하는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 세포자살 유전자는 전구체약물을 활성화시키는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 세포자살 유전자는 허피스 심플렉스 (herpes simplex) 바이러스의 티미딘 키나아제 (thymidine kinase)이며 전구체약물인 간사이클로비르(Ganciclovir; GCV)를 활성화시키는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
MuLV-Gag 유전자 및 MuLV-Pol 유전자를 포함하는 제 1 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 및
GaLV-Env 유전자를 포함하는 제 2 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
를 포함하는 슈도타입 복제가능 레트로바이러스 벡터 시스템의 제조방법.