WO2015020215A1 - レンチウイルスベクターｔｈｔｄ、該ｔｈｔｄを含有する老化剤、がん抑制剤および医薬組成物、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、並びにウイルス様中空粒子の製造方法 - Google Patents

レンチウイルスベクターｔｈｔｄ、該ｔｈｔｄを含有する老化剤、がん抑制剤および医薬組成物、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、並びにウイルス様中空粒子の製造方法 Download PDF

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virus
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毅 廣田
貴亮 新井
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永田 啓司
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a lentiviral vector THTD, an aging agent containing the THTD, a cancer inhibitor and a pharmaceutical composition, a protein packaged with virus-like hollow particles, and a method for producing virus-like hollow particles.
  • Cancer cells are caused by abnormalities in the cell cycle of living cells. Therefore, it is considered that abnormalities in the cell cycle can be stopped and returned to normal, or cancer can be suppressed or prevented by appropriate apoptosis of abnormal cells. Has been.
  • An object of the present invention is to efficiently and reliably prevent the occurrence of cell cycle abnormality and the occurrence of cancer resulting from the cell cycle abnormality.
  • cancer cells are caused by abnormal cell cycles. Therefore, the present inventor has identified the root cause of the cell cycle abnormality, and efficiently and reliably prevented the occurrence of the cell cycle abnormality by removing the cause on the upstream side where the abnormal state occurs. It was found that the occurrence of cancer can be prevented. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention relates to the following.
  • Lentiviral vector THTD capable of producing CDC6 shRNA, which is a short hairpin RNA for human CDC6 mRNA, by gene transfer in infected cells.
  • a human breast cancer MCF7 cell aging agent comprising the lentiviral vector THTD.
  • a virus-like hollow particle constructed from a lentiviral RNA comprising a transgene product and / or a transgene is produced by a method including the following steps. That is, a step of culturing a cell into which a transgene is introduced in vitro using a lentiviral vector that releases virus-like hollow particles composed of a transgene product and / or a lentiviral RNA comprising a transgene to the outside of the cell And collecting the released virus-like hollow particles.
  • the lentiviral RNA includes pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T.
  • a lentiviral vector is a transgene lacking at least one structural protein gene, and consists of a transgene controlled by a human telomerase reverse transcriptase (TERT) gene promoter contained in a lentiviral genomic sequence.
  • Cells incorporating pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T cause cdc6 depletion, and cdc6 depletion results in activation of a tumor suppressor gene-producing protein (also referred to as an anti-tumor protein), p16INK4a.
  • a tumor suppressor gene-producing protein also referred to as an anti-tumor protein
  • pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T can transfect cancer cells with the p16 tumor suppressor gene (GENEbank accession No. L27211). Transfection of the p16 tumor suppressor gene into cancer cells inhibits the G1 / S phase transition of the cell cycle.
  • the expression of the P16 gene and P16 gene product in cells by pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T activates the function of the RB protein to capture the transition of the cancer cell's cell cycle to the G1 / S phase, This induces aging of cancer cells.
  • pRBL002 contains [PRBLVIF], a protein derived from vif of the HIV viral genome. Due to p53 deficiency and the strong phosphorylation of CDC6 in cancer cells and cancer cell precursors, CDC6 is more stable and cell apoptosis is avoided. In contrast to the correlation between CDC6 and p53, vif of pRBL002 binds to the central part of p53 inhibitor MDM and activates p53. In addition, [PRBLVIF] of pRBL002 inhibits G2 phase M phase transition of cancer cell cycle
  • pRBL2013T contains “PRBLVPR”. This is a protein derived from VPR of the HIV-1 genome. VPR transports PTEN gene-transferred into pRBL2013T into the nucleus. PTEN is known to negatively regulate cell proliferation signals as a dephosphorylation enzyme in the PIK3-AKT pathway under the cell membrane. PRBL2013T also contains a telomerase template sequence. Furthermore, it contains DNA encoding the human PTEN gene downstream of the HTERT (human telomerase reverse transcriptase) promoter. The sequence of human PTEN mRNA is [GENEbank accession No. NM_000314] is used.
  • pRBL2013T After pRBL2013T enters the cell, the cDNA of the PTEN gene moves into the nucleus by binding to [PRBLVPR] and is integrated into the chromosome. pRBL2013T activates the production of the PTEN gene product. After pRBL2013T enters the cell, the cDNA of the PTEN gene moves into the nucleus by binding to [PRBLVPR] and is integrated into the chromosome. pRBL2013T activates the production of the PTEN gene product. In cancer patients, PTEN is a tumor suppressor with many mutations after p53. PTEN introduced into pRBL2013T is an enzyme that removes phosphate groups from PIP3 of lipids involved in AKT activation.
  • AKT promotes cell proliferation and inhibits apoptosis by several mechanisms. Inhibiting AKT activation by PTEN suppresses cell proliferation and promotes apoptosis. PTEN dephosphorylates PIP3, thereby inhibiting the downstream activity of AKT.
  • Forkhead box (FOX) transcription factors are known to be involved in INK4B, p21, p27, ARF, and apoptosis, which are involved in cell cycle suppression.
  • Bim, FasL, G6P involved in gluconeogenesis, and others related to angiogenesis and differentiation.
  • IIS activated through AKT suppresses FoxO function.
  • FoxO1 There are four types of FoxO transcription factors, FoxO1, 3, 4, and 6 in mammals. In either case, the function is suppressed by phosphorylation by AKT.
  • FoxO1, 3, and 4 When FoxO1, 3, and 4 are phosphorylated, they bind to 14-3-3 and are transported out of the nucleus.
  • Phosphorylated FOXO1 and FOX3A are ubiquitinated and degraded by MDM2.
  • Deletion of FoxO in HSCs hematopoietic stem cells
  • Cell apoptosis is performed by several pathways and mechanisms.
  • pRBL2013T provides a method for inhibiting the activation of protein kinase B (AKT) synthesized in cells by PI3K (phosphatidylinositol 3 kinase) that contributes to the expression of the above-mentioned biological activity.
  • AKT protein kinase B
  • AKT is activated by phosphorylation of PIP3, which is the second messenger of PI3K.
  • pRBL2013T negatively regulates AKT by dephosphorylating PIP3, thereby inhibiting cell growth signals and affecting downstream of AKT, affecting apoptosis-inducing factors and transcription factors, and cancer. Commands the cells to age or program cell death.
  • a Gag protein contained in pRBL2013T and RT form a complex directly under the cell membrane and bind to a group of proteins involved in the release of intracellular endoplasmic reticulum to form PTEN exosomes that are released to the outside of the cell and become PTEN protein in the recipient cells. To transport.
  • CDC6 depletion caused by RNA interference by pRBL001 promotes BAX expression of the pro-apoptotic BCL-2 effector.
  • CDC6 depletion caused by pRBL001 decreases the expression of anti-apoptotic BCL-2 protein (anti-apoptoic BCL-2 protein), inhibits MOMP, and negatively controls the mechanism that suppresses apoptosis.
  • pRBL001 promotes the expression of BIM, BAD, etc. of BH3-only protein of BCL-2 subfamily and promotes MOMP and apoptosis.
  • BCL-2 subfamily BH-3 only proteins activated by pRBL001 activate BCL-2 effectors.
  • pRBL001 causes CDC6 depletion by RNA interference by CDC6 shRNA, it has been confirmed that CDC6 is highly expressed in many cancer cells.
  • the specificity of cancer cells can be recognized by using Htert activated in 85% to 90% of cancer cells as a promoter and CDC6 expression as a target (target) Cdc6 mRNA.
  • Current molecular targeted drugs target molecules receptors that are specifically expressed on membrane proteins of cancer cells.
  • the treatment with one target molecule cannot continue the dominant treatment for the cancer cell. Also, continuous treatment will eventually create tolerance to the receptor.
  • pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T are forms of viral proteins that do not have an envelope, and use endocytosis by fusing to the cell membrane. It can also enter non-dividing cells. It can also enter stem cells with high expression of TERT, and can introduce genes or express gene products.
  • pRBL2013T contains PTEN, a tumor suppressor. PTEN exists in both the cytoplasm and nucleus, but becomes exosomes (Exosomes) that are secreted out of the cell and taken up by the recipient (recipient) cell, reducing the phosphorylation of Akt in the cell and suppressing cell proliferation. The effect of doing. Patients with PTEN mutations are known to cause brain, breast cancer, prostate, and skin tumors.
  • PTEN exosomes are vesicles derived from endosomes and multivesicular bodies (MVBs). MVBs are responsible for extracellular secretion by fusing with the cell membrane. Exosomes may be varied as its contents, protein as produced product of a gene, DNA, physiological state of the cell and transported to the cell of Te hand receives the microRNA.
  • the PTEN gene is introduced into pRBL2013T, and a method for mass production of PTEN exosomes from HEK293T cells by centrifugation protocol is provided. This exosome is a VLP (virus-like hollow particle), and the introduced gene is not limited to PTEN.
  • the pharmaceutical or pharmaceutical composition according to the present invention comprises colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, lung cancer, neuroblastoma, breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, prostate cancer, thyroid cancer and malignant lymphoma. Used for the treatment of cancer selected from the group. These cancers have been confirmed to contain CDC6, which is more highly expressed than normal.
  • the pharmaceutical or pharmaceutical composition according to the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • virus-like hollow particles into which a gene or gene product has been introduced are used as a cancer patient or a human mesenchymal stem cell different from the patient and / or Alternatively, hematopoietic stem cells (Stem cells) are sensitized, and the supernatant obtained when the sensitized stem cells are cultured is introduced into cancer patients. Thereby, the preventive effect of the canceration with respect to the precancerous state is obtained for the gene or gene product in which the virus-like hollow particles are formed.
  • the precancerous state refers to a state in which division of cancer cells and cancer precursor cells is promoted by inactivation of the tumor suppressor gene rb.
  • This state is a state in which cancer cell division is promoted, and is accompanied by phosphorylation of s807, s811, t821, t826, and s780 in the band 701 to 928 of the rb-c domain.
  • the activity / inactivity of the tumor suppressor gene rb can be confirmed.
  • the activity / inactivity of the tumor suppressor gene rb can be examined by a well-known method described later, and the state before and after introduction can be compared by this method and confirmed by dephosphorylation.
  • the production method according to [3], wherein the cell into which the transgene is introduced does not have at least one structural protein gene.
  • the TERT gene promoter is a human TERT gene promoter.
  • the human TERT gene promoter comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or 90% or more, preferably 95% or more of the sequence of SEQ ID NO: 1 A production method comprising a nucleotide sequence having identity.
  • the lentiviral vector is any of the following (i) to (iii): (i) RNA vector containing lentiviral genome sequence (ii) DNA vector encoding RNA containing lentiviral genomic sequence (iii) Virus particle carrying RNA containing lentiviral genomic sequence
  • the genomic sequence of the lentivirus includes at least part of the TERT transcription region between the TERT gene promoter and the transgene.
  • at least a portion of the TERT transcription region comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or comprises a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the genomic sequence of the lentivirus is an HIV genomic sequence.
  • the HIV genomic sequence is preferably an HIV-1 genomic sequence.
  • the HIV-1 genomic sequence includes: 5'LTR; packaging signal ⁇ ; gag gene; pol gene; VIF gene; VPR gene; tat gene; rev gene; [12]
  • the transgene containing a lentiviral vector is a tumor suppressor gene.
  • the tumor suppressor gene is preferably a PTEN or p16 gene.
  • the lentiviral vector comprises a transgene encoding a short hairpin RNA (shRNA).
  • shRNA targets a gene encoding a cell growth regulator.
  • the cell growth regulator is, for example, CDC6.
  • the cells are kidney-derived cells, in particular human embryonic kidney 293T cells.
  • drugs, pharmaceuticals, or pharmaceutical compositions such as a cancer inhibitor which can prevent cancer effectively or eliminate the cancer which generate
  • 13 to 54 are diagrams for explaining the operation and effect of the present invention.
  • the figure which shows aging of a baboon breast cancer cell Diagram showing aging of Cdc6 deficient MCF7 cannons (special changes in chromosomal structure in the nucleus of cancer cells, ie formation of SAHF). Carbon image showing Cdk4 protein kinase reaction in vitro.
  • the figure which shows that MCF7 cell is infected with THTD for Cdc6 knockdown, or is pseudo-infected with multiplicity of infection 1.0.
  • the figure which shows that MCF7 cell is infected with THTD (lane 5) or THTP (lane 4), or is mock-infected (lane 3).
  • the other figure for demonstrating invention The other figure for demonstrating invention.
  • the other figure for demonstrating invention The other figure for demonstrating invention.
  • the other figure for demonstrating invention The other figure for demonstrating invention.
  • the other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention.
  • the other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention.
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  • the other figure for demonstrating invention. The other figure
  • the other figure for demonstrating invention The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The other figure for demonstrating invention. The figure which shows the effect of pBRL001 and pRBL002 with respect to the patient who shows a high value in a p53 antibody test
  • ⁇ Summary of invention> The RNTEIN BIOTECH JAPAN Corporation created a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1 virus) derived from a genetically modified lentiviral vector pRBL001.
  • PRBL001 an extrachromosomal gene, can be introduced in vitro by DNA transfection into cultured human fetal kidney cells 293T, and infectious lentiviral particles THTD that cannot replicate can be purified.
  • THTD a genetically modified lentiviral particle, can infect various types of human cell lines in vitro.
  • the lentiviral vector THTD can produce short hairpin RNA (CDC6 shRNA) against human CDC6 mRNA by gene transfer in infected cells. Production of CDC6 shRNA in infected cells specifically causes degradation of CDC6 mRNA.
  • RNA interference results in knockdown of Cdc6, which is a DNA replication induction factor.
  • THTD transgenic lentiviral vector infection and RNAi knockdown of Cdc6 causes human neuroblastoma apoptosis and leads to aging of human breast cancer MCF7 cells.
  • THTD genetically modified lentiviral vector is applicable to molecular therapy, and its commercial name is called AJS2010.
  • AJS2010 275 ⁇ g of purified viral particle-containing protein per nude mouse with tumor
  • AJS2010 has been tested in the treatment of advanced cancer patients in Tokyo and other cities in Japan.
  • DNA replication begins by incorporating a pre-replication complex (pre-RC), and the DNA replication protein Cdc6 (cell division cycle 6) plays a central role in the initiation of DNA replication. As cells enter G1 from mitosis, Cdc6 is recruited along with Cdtl to the origin of replication associated with the six components of the origin recognition complex (ORC).
  • pre-RC pre-replication complex
  • ORC origin recognition complex
  • the pre-replication ORC complex is formed by stacking microchromosome maintenance protein (MCM) together with other replication proteins at the origin of replication, and Cdc6 controls this stacking.
  • MCM microchromosome maintenance protein
  • Cdc6 controls this stacking.
  • the stability of Cdc6 in the G1 phase is key to adjusting pre-RC incorporation.
  • Cdc6 targets ubiquitin-dependent proteolysis by late prophase complex (APC) in G1 phase.
  • APC late prophase complex
  • Cyclin E-Cdk2 kinase is important for phosphorylation of human amino terminal Cdc6, and phosphorylated Cdc6 is stable. Phosphorylation of Cdc6 by cyclin Cdk2 kinase ensures that the origin of replication is initiated in S phase, and DNA is replicated only once in S phase.
  • Cdc6 may be more stable in tumor cells. Cdc6 depletion has been found to result in apoptosis in human cancer cells. RNA (siRNA) mediated by Cdc6 depletion is remarkably generated without damaging other replication proteins such as Orc2, Cdt1, and MCM7.
  • siRNA siRNA
  • Cdc6 depletion causes apoptosis only in human cancer cells, not normal cells.
  • High levels of Cdc6 are associated with carcinogenic effects in rabbit cancer, and in human lung cancer cell lines, the protein levels of Cdc6 and p16INK4a are reciprocal.
  • Cdc6 results in increased colony formation in primary MEF cells with wild type INK4 / ARF sites. Since there is no significant carcinogenic effect in INK4a / ARF ⁇ / ⁇ MEF, Cdc6 promotes tumor development by suppressing the INK4a / ARF site.
  • PTHTK was prepared from the HIV-1 strain NL4-3 genomic construct, pUC19-NL4-3, and the sequence assignment index number of NL4-3 is M19921.
  • pTHTK the region from nucleotide 6342 to nucleotide 7512 in HIV-1 genomic DNA is deleted, and the ends of Kpn1 (6342) and Bgl 11 (7512) are smoothed and removed. This modification results in deletion of the HIV-1 envelope gene (FIG. 1).
  • pTHTK In pTHTK, the original Hpa1 site was modified, and an Mlu1 linker was added to add the gene-introduced DNA fragment.
  • the introduced DNA fragment can be prepared by degradation of Mlu1 and Xho1 (or Sal1), and the purified DNA fragment can be inserted into the Mlu1 and Xho1 sites of the pTHTK vector.
  • the journal of the transgenic fragment disrupts the translational region gene of the HIV-1 nef gene, so the cloned lentiviral vector differs from the wild type HIV-1 strain NL4-3 without the help of other viruses. Cannot produce infectious virus particles.
  • the PCR method via ligation is used to produce LTR-Tags and detect whether the recombinant lentiviral vector can replicate in infected cells (see FIGS. 3 and 4 below for details). reference).
  • the pTHTK vector was not able to produce lentiviral particles by itself.
  • Pseudotyped recombinant lentiviral particles by simultaneous introduction of 293T cells using pTHTK plasmid and pCMV-VSV / G, which provides the envelope protein of varicella stomatitis virus, can replicate in infected cells. There wasn't.
  • proviral cDNA can be integrated into the host cell chromosome. Genomic DNA isolated from infected cells was reliable in LM-PCR and showed LTR-Tags (FIGS. 4 and 5).
  • Mock infection or “reinfection” is performed, in which case the infected cell culture medium is collected, filtered through a 0.45 ⁇ m pore size filter, and added to the newly cultured cells (FIG. 5).
  • the incorporated puffer virus cDNA cannot produce infectious virus particles in infected cells, and there are no infectious virus particles in the medium of infected cells, therefore In “reinfection”, infectious virus particles are not collected and cultured. “Reinfected” cells do not have any pouchvirus cDNA integrated into their chromosomes. Such genomic DNA is not reliable in the LM-PCR test and LTR-Tags are not shown (FIG. 5).
  • the LM-PCR test which tests whether a genetically modified lentiviral vector is incompetent in infected cells, results are completely repeatable and accurate, in false positives and in direct PCR amplification of HIV-1 sequences Contamination can be avoided.
  • hTERT synthesizes a telomere repeat sequence during DNA replication.
  • HTERT is also associated with the stage of cell proliferation.
  • hTERT is active in the fast-paced details and not so much in stationary cells. In about 90% of human cancers, hTERT activity is activated.
  • hTERT gene expression is mainly regulated at the transcriptional level.
  • the hTERT promoter is a key element that controls hTERT activity in human cells.
  • the hTERT promoter is activated in most human cancer cells, it can also be used as a specific transcription switch for controlling heterologous gene expression only in cancer cells.
  • HTERT promoter construction pGL-1375 was provided by Dr. Satoshi Kyo (Kanazawa University).
  • a 1.4 kb hTERT promoter DNA fragment is inserted into the MLu I and Bg lII sites.
  • the promoter amplifies luciferase gene expression within the vector.
  • the GeneBank assignment number of the hTERT5 ′ upstream sequence is AF128893.
  • the 1.4 kb hTERT promoter DNA fragment contains the first exon of the hTERT gene sequence.
  • downstream E box at +6 to +45 nucleotides at the 3 ′ end of the 1.4 kb hTERT promoter sequence.
  • This downstream E box at +6 to +45 nucleotides at the 3 'end of the 1.4 kb hTERT promoter sequence plays a role in transcriptional repression in human hematopoietic stem cells or human cancer cells transfected with chromosome 3. Fulfill.
  • the 1.4 kb hTERT promoter DNA fragment is assembled in a genetically modified lentiviral vector-pRBL001.
  • the genetically modified lentivirus THTD is prepared from the lentiviral transgene plasmid vector-pRBL001.
  • plasmid pRBL001 a double-stranded oligonucleotide synthesized for CDC6 shRNA is replicated and placed under the control of the hTERT promoter for transcription.
  • the GeneBank assignment number of CDC6 mRNA is NMOO1254.
  • the sequence of the synthesized oligonucleotide Cdc6-5-A is: GATCCCCAGGCACTTGCTACCAGCAATTCAAGAGATTGCTGGTAGCAAGTGCCT TTTTTGGAAA
  • the sequence of Cdc6-3-A is: AGCTTTTCCAAAAAAGGCACTTGCTACCAGCAATCTCTTGAATTGCTGGTAGCAAGTGCCT GGG It is.
  • oligonucleotide In order to make a double-stranded oligonucleotide, equal amounts of Cdc6-5-A and Cdc6-3-A are mixed and denatured, and then slowly cooled again. After blunting the ends, the double-stranded oligonucleotide is inserted into pBlueScript, a subclone vector at the EcoR V site. The DNA sequence is performed in order to clone correctly.
  • the subclone is modified by linearization at the Xba I site, blunted at the ends and transferred with Mlu I linker.
  • Degradation of pGL3-1375 with Mlu I and Bgl II purifies the 1.4 kb DNA fragment containing the hTERT promoter sequence and clones it into a subclone vector that carries the Cdc6 double-stranded oligonucleotide to the Mlu I and BamH I sites. .
  • MluMI and Xho I double digestion cleaves the 1.5 kb DNA fragment containing the hTERT promoter and the Cdc6 oligonucleotide.
  • the digested 1.5 kb fragment is purified and inserted into the pTHTK vector.
  • the gene lentiviral vector THTD is generated by introducing pRBL0O1 and pCMV-VSV / G into cells by simultaneous transcription of plasmid DNA in 293T cells. Mock-infected virus particles become infectious virus particles.
  • the genetically modified lentiviral vector THTD can infect many different types of human cells regardless of whether they are proliferating, differentiated or non-differentiated. Unlike wild-type HIV-1 strain NL4-3, THTD cannot replicate in infected cells.
  • hTERT promoter initiates transcription of the CDC6 shRNA precursor. These precursors form double-stranded shRNA and complete as specific RNA interferents to degrade CDC6 mRNA.
  • Gene transfer via THTD in infected cells causes degradation of CDC6 mRNA by the function of CDC6 shRNA, and 98% of Cdc6 protein is used up (FIG. 6).
  • Cdc6 knockdown causes apoptosis of human neuroblastoma LA-N-2 cells and CHLA-255 cells (FIG. 7).
  • Cdc6 knockdown is associated with antibodies against H3K9me2 along with mock-infected MCF7 cells.
  • Indirect immunofluorescent staining reveals an overall increase in positive staining for H3K9me2 in the nucleus of Cdc6 knockdown MCF7 cells compared to these mock-infected cells.
  • Confocal fluorescence microscopy reveals gray structured nuclei with accumulated H3K9me2. This change is in contrast to mock-infected cells, where evenly dispersed H3K9me2 staining is observed in the nuclei of mock-infected cells (FIG. 9).
  • Cdc6 inhibits p16INK4a, an antitumor protein, and promotes tumor cell growth.
  • p16INK4a levels were elevated, but the inhibitory effect of Cdk protein was inactive. Cyclin Cdk4 kinase activity was abnormally activated in parental MCF7 cancer cells.
  • Japan Lapian's Corporation used the Impito Mouth method of protein kinase assay that detects p16INK4a in the inhibition of D-type cyclin Cdk4 activity (details are described later, see FIG. 10 and FIG. 11).
  • the active activity of D-type cyclin Cdk4 protein kinase caused C-terminal phosphorylation of retinoblastoma protein.
  • the phosphorylated retinoblastoma protein could not control the transcription factor E2F, and Rb-E2F changed from a transcriptional repressor to an activator.
  • Reactivation of p16INK4a in THTD-mediated gene transfer has a function of inhibiting the reactivation of cyclin Cdk4 kinase, and prevents cyclin Cdk4 kinase from phosphorylating retinoblastoma protein (FIG. 11 lane 3, Lane IV 4).
  • Cdc6 deficiency by Cdc6 shRNA Since the biological effect of Cdc6 deficiency by Cdc6 shRNA is very prevalent in MCF7 cells, even Cdk4 protein overproduction by DNA transcription cannot overcome the Cdk inhibitory action by reactivated p16INK4a. This indicates that suppression of cancer cell growth can be achieved by suppression of Cdc6 mRNA expression and Cdc6 protein deficiency.
  • AJS2010 the commercial name of the recombinant lentiviral vector THTD that produces CDC6 shRNA
  • AJS2010 the commercial name of the recombinant lentiviral vector THTD that produces CDC6 shRNA
  • a control group of mice that received placebo was inoculated with 1 ⁇ phosphate saline buffer in the tumor foci. After inoculation, the length and width of each tumor was measured twice a week. A standard caliper was used for the measurement, and the mice were euthanized by cervical dislocation before the tumor was excised and measured for pathological observation.
  • 275 ⁇ g of protein in AJS2010 per unit was used, the growth of transplanted tumors was inhibited by 34.70% and the average tumor weight was clearly smaller compared to the negative control (P ⁇ 0.02).
  • Tissue sections of “+++” showed the greatest fibrosis in the assessment of tumor tissue pathology. Inoculation of 275 ⁇ g protein in AJS2010 resulted in strong fibrosis within the tumor tissue and suppressed tumor growth.
  • FIG. 1 is a diagram of the pTHTK vector.
  • pTHTK most HIV-1 viral genes are retained.
  • the DNA fragment from the 6342th Kpn I site to the 7512th Bgl II site is deleted, thereby deleting the HIV-1 envelope gene.
  • the Mlu I linker is indicated by a thick short vertical line.
  • the lower side of FIG. 2 is an illustration of the transgenic lentiviral transgene vector pRBLO01, and the upper side is an agarose gel showing plasmid DNA mapping.
  • the hTERT promoter is represented by a rectangle with an arrow indicating the transcription direction.
  • the gray rectangle represents the nucleotide that produces the CDC6 shRNA.
  • the restriction enzyme sites are indicated as RI: EcoR I, Sal: Sal I, Mlu: Mlu 1, Nhe: Nhe I, and Xho: Xho I.
  • the two LTR boxes represent HIV-1 long terminal repeats.
  • FIG. 3 shows the detection of LM-PCR and the generation of a Bpm I site for the LTR-Tag test.
  • Bpm I is a class II S restriction enzyme and can recognize and cut out a recognition site downstream of position 16 nucleotides.
  • Bpm I is located at the 3 ′ end of the U5 region of the 5 ′ LTR and retains the last conserved 5′-CA-3 ′ double nucleotide.
  • the Bpm I site can be copied into the U5 region of the 3 ′ LTR after HIV-1 cDNA degradation and is adjacent to the host chromosomal DNA at the integration site.
  • BpmI splits the chromosomal DNA into 5'-CA-3 'double nucleotides at the 3' end of the proviral cDNA at position 14 nucleotides.
  • FIG. 4 shows the LM-PCR method for detecting whether there is infection and integration of a recombinant viral vector and whether an infectious viral vector is produced in the infected cell, ie, TR. -Tag technology analysis.
  • LTR-Tag was detected from the pouch virus cDNA of the recombinant lentiviral vector in the infected cells.
  • “ ⁇ ” indicates a negative control for LTR-Tag, ie, no template DNA is present in the reaction
  • “+” indicates a positive control for LTR-Tag.
  • the cloned LTR-Tag template DNA is added.
  • one end of the template is a recombinant lentiviral cDNA and the other end is a sequence derived from a linker adapter, between which is 14-bp from the host chromosome of the integration site.
  • linker adapter There are random genomic DNAs.
  • the length of the LTR-Tag varies because different forward primers are selected from the PCR, while the reverse primer is always constant because the sequence is derived from the linker adapter.
  • Fig. 5 shows LM-PCR for detecting THTK proviral cDNA.
  • HeLa / tat cells are infected with the genetically modified lentiviral vector THTK. Cells are cultured at different times after infection. Genomic DNA is isolated and the LTR-Tag is prepared for LM-PCR detection.
  • PCR primers are BHU5-S2 and HDA / SBOT, and PCR amplification shows a 138 bp DNA fragment (indicated by arrows).
  • LTR-Tag can be detected in cells infected with THTK and in stable cell lines. However, medium that was collected from “mock-infected” or HeLa / tat cells infected with THTK and cultured with fresh cultured cells (reinfection) shows negative results in LM-PCR. The 138 bp LTR-Tag could not be amplified from isolated genomic DNA collected at different time points from “mock-infected” cells. This result indicates that THTK is powerless in infected cells.
  • FIG. 6 is a Western blot showing inhibition of Cdc6 expression in cells infected with a recombinant lentiviral vector producing CDC6 shRNA.
  • LA-N-2 cells, CHLA255 cells, and MCF7 cells are infected with THTD. These cells are also infected with THTP, which produces a scrample sequence as a control, and are mock infected. Forty-eight hours after infection, cells are cultured and a cell extract is prepared. The same amount of protein in the extract from each infected cell is separated on an SDS polyacrylamide gel.
  • FIG. 7 shows that Cdc6 deficiency results in apoptosis of human breast cancer cells.
  • LA-N-2 cells can be THTD cells that produce CDC6 shRNA, or THTP that produce scrambled sequences, or mock infected. Cells are cultured for Annex IV and 7-AAD staining 48 hours after infection. Stained cells are analyzed by a flow cytometry machine. In mock-infected cells, Annex V staining was only 3.6% and in 10.0% of cells infected with THTP.
  • FIG. 8 is a diagram showing that Cdc6 deficiency causes aging in human breast cancer MCF7 cannons.
  • MCF7 cells are first seeded on slides, infected with THTD, THTP, and mock infected. 48 hours after infection, slides are washed with 1 ⁇ PBS and fixed with formaldehyde before staining with SA- ⁇ -GaL reagent. Stained cells are observed with a fluorescence microscope. MCF7 cells infected with mock and THTP show the same staining as the background, whereas MCF7 cells infected with THTD are stained green or blue. This indicates aging of cell proliferation.
  • FIG. 9 is a diagram showing that MCF7 cells deficient in Cdc6 age, and a special chromosomal structure change occurs in the nucleus of the cancer cell, that is, the formation of SAHF.
  • MCF7 cells are seeded on slides (0.1 ⁇ 10 4 cells per 100 mm 2 ), infected with THTD, THTP, and mock infected. 48 hours after infection, slides are first washed with 1 ⁇ PBS and then fixed with formaldehyde. Indirect immunofluorescence staining is performed using anti-H3K9me2 antibody.
  • SAHF shows a granular structure, while in sham-infected cells, the nuclei are uniformly stained.
  • FIG. 10 is a carbon image showing the Cdk4 protein kinase reaction in vitro.
  • IP p16INK4a antibody immunoprecipitation
  • SDS-polyacrylamide gel separation is performed.
  • Western blotting is performed using an antibody against site-specific phosphorylated Rb-C. The stronger the signal, the more phosphorylated Rb-C.
  • MCF7 cells are infected with THTD for Cdc6 knockdown or mock infected with a multiplicity of infection of 1.0. Prepare cell extract 2 days after infection. Whole cell extract (approximately 1000 ⁇ g protein) is mixed with anti-P16INK4a monoclonal antibody.
  • IP Immunoprecipitation
  • An in vitro kinase reaction is prepared using 1/4 of IP beads mixed with Rb-C substrate and ATP, and the reaction is incubated at 37 ° C. for 30 minutes according to the manufacturer's instructions.
  • Specific Rb-C phosphorylation is determined by Western blotting using anti-Phospho® Ser780 antibody (upper panel) or anti-Phospho® Ser807 / 811 antibody (middle panel).
  • Mouse IgG signal is presented as an IP control (lower panel).
  • MCF7 cells are infected with THTD (lane 5) or THTP (lane 4) or mock-infected (lane 3). Two days after infection, cells are transfected with pSK-J3 (for Cdk4-HA production; lanes 3-5) or transfected with pSK-HA (HA-tag control; Lane 6). Cell extracts are prepared and subjected to IP using various antibodies. Upper panel: Each IP sample is added to the kinase reaction and in vitro Rb-C phosphorylation is performed. Phosphorylated Rb-C is tested by Western blotting using anti-Phospho ser807 / 811 antibody. Lower panel: Mouse IgG was presented as a loading control. Overexpression of HA-Cdk4 results in sustainable Rb-C phosphorylation across endogenous Cdk4 (Comparative Lane 3 and Lane 7).
  • p16INK4a Cdk inhibitory reactivation predominates over D-type cyclin Cdk4 protein kinase activity, even when forced overexpression of HA-Cdk4 fails to cause a sustainable level of Rb-C phosphorylation (Lane 5).
  • the genetically modified lentiviral vector THTP that produces non-specific nucleotides has no effect on Rb-C phosphorylation by HA-Cdk4 (lane IV4).
  • the 293T cells are grown at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator and the culture is amplified into 10 T75 flasks.
  • Collect 200 ⁇ l of virus medium add 1 ⁇ PBS to dilute 50-200 times, and then perform p24 ELISA assay to determine the titer of virus vector.
  • the p24 ELISA kit is manufactured by Coulter Inc., Miami, USA. 10 x PBS 1000 ml: Potassium chloride (Sigma P9333) 2g Potassium phosphate, monobasic (ACROS 205925000) 2g NaCl (Sigma S7653-1KG) 80g Sodium phosphate, dibasic (ACROS 204855000) 11.5g Add ddH 2 O to bring the final volume to 1000 ml.
  • the cleaned medium is collected on a 250 ml high-speed centrifuge pin and centrifuged at 9000 ⁇ g and 4 ° C. for 60 minutes.
  • the medium is ultrafiltered (1000 kDa mw. Co.) Using Vivaspin 20 (Sartoriu, NY, USA) to reduce the volume to 1/5.
  • MMP MMP to the precipitated viral vector and keep at 4 ° C overnight.
  • 50M 50g NaCl (ultra high purity)
  • 30ml Add autoclaved ddH 2 O to 300 ml. Centrifuge for 30 minutes at 9000 xg and 4 ° C. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 10 ml of 1 ⁇ PBS. Using a Slide-A-Lyzer cassette (20 kDa mw. Co., Thermo Scientific, Illinois, USA), the resuspended solution was dialyzed against 1 ⁇ PBS at 4 ° C. and 1 ⁇ PBS every 24 hours for 2 days. Exchange.
  • the virus solution is concentrated 30-fold using AmiconUltra15 (100 kDa mw. Co., Millipore, Mass., USA).
  • the purified virus solution is passed through a syringe filter with a pore size of 0.45 ⁇ m and the preparation is stored at ⁇ 80 ° C.
  • Cells are grown in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Observe the cells with an inverted microscope. Cell growth shall be approximately 80% confluent.
  • A1 1 ⁇ PBS 20 ⁇ l
  • A2 and A3 1:10 2 diluted virus medium 20 ⁇ l
  • B1 and B2 1:10 1 diluted virus medium 20 ⁇ l
  • B3 20 ⁇ l undiluted virus medium
  • Cells are incubated for 8 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Observe the cells with an inverted microscope. Cells should be healthy and free of any visible contamination.
  • GTC buffer Guanidine thiocyanate (mw. 118.16) 6M 212g Sodium citrate (mw. 294.1) 25mM 2.2g Sarkosyl (10% w / v) 0.5% 12ml Prior to use, 1.4 ml of ⁇ -mel force-to-ethanol is added for every 20 ml of GTC solution.
  • RNA sample When collecting an RNA sample, vortex the test tube for 30 seconds, collect 200 to 30 ⁇ l of RNA solution, transfer it to an autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube, and centrifuge for 15 minutes at 13000 rpm and 4 ° C.
  • RNA is redissolved in 10 ⁇ l autoclaved ddH 20 .
  • TE buffer 50ml 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 1 M 500 ⁇ l 1mM EDTA 500mM 100 ⁇ l Add autoclaved dd H 2 O to 50 ml.
  • RNA is redissolved in 20 ⁇ l of autoclaved dd H 2 O for reverse transcription and PCR to amplify the cDNA.
  • RT-PCR sample is 200 ⁇ g of RNA for each reverse transcription.
  • First strand cDNA synthesis in a reverse transcription (RT) reaction is as follows: 10 ⁇ l DNase digested RNA (approximately 200 ⁇ g), 1 ⁇ l 10 mM dATP / dCTP / dGTP / dTTP stock, 1 ⁇ l RNasin (30 units / ⁇ l, Promega), 2 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer, 1 ⁇ l O.1 ⁇ g / ⁇ l random primer (random hexamer), add 1 ⁇ l 50 mM MgCl 2 and mix gently, then add 1 ⁇ l Mo-MuLV reverse transcriptase (200 units / ⁇ l), mix by rotation for 2 seconds, Incubate first at room temperature for 10 minutes, then at 42 ° C for 60 minutes.
  • RT reverse transcription
  • PCR reaction Primer HIV-1 NL4-3 2205 (20 ⁇ M), 25 ⁇ l, Primer HIV-1 NL4-3 2868 (20 ⁇ M) 2.5 ⁇ l, RT reaction, 5 ⁇ l, PCR mixture, 40 ⁇ l, Thermal Cycle (Applied Biosystems).
  • PCR mix (for 6 samples): 10 mM dATP / dCTP / dGTP / dTTP stock 6 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer 30 ⁇ l Taq DNA polymerase (5 units / ⁇ L) 3 ⁇ l Autoclaved ddH 2 O 201 ⁇ l Final volume 240 ⁇ l
  • PCR After PCR, take 10 ⁇ l of the reaction from each tube, add 3 ⁇ l of loading buffer, load the PCR sample onto a 1.5% agarose gel, and run the gel in 1 ⁇ TBE. The gel is stained with ethidium promophenol (EB) solution and the DNA on the gel is observed under an ultraviolet (UV) light box.
  • EB ethidium promophenol
  • UV ultraviolet
  • the complete PCR product shall be approximately 660 bp.
  • pRBL001 plasmid DNA (20 ng) can be used as a positive control in PCR, while RNA from untransfected 293T cells can be used as a negative control in RT-PCR.
  • TAE buffer 1000ml Tris Base (molecular biology grade) 242g Glacial acetic acid (molecular biology grade) 57.1ml EDTA, pH 8.0 (molecular biology grade) 100ml Add ddH 2 O to 1000 ml.
  • pTHTK is first modified to create a new Bpm I site in the HIV-1 genome.
  • the Bpm I site is generated by overlapping the PCR at the 3 ′ end of the U5 element.
  • Bpm I is a class IIS restriction enzyme (FIG. 3).
  • Bpm I recognizes 5'-CTGGAG-3 ', but DNA can be cut at its top strand downstream of the 16th nucleotide and at its bottom strand downstream of the 14th nucleotide, 2 Create a nucleotide 3 'overhanger.
  • This 5 'LTR's BpmI site is replicated in the 3' LTR at the 3 'end of the U5 element as a synthesis of the pouch virus cDNA of infected cells.
  • the new BpmI site created in the HIV-1 genome has no effect on THTK virion assembly, viral vector infection, or incorporation of the provial cDNA into the infected cell.
  • the copied Bpm I site is within the 3 'end of the two conserved "5-CA-3" HIV-1s, and the Bpm I enzyme is responsible for host cell chromosomal DNA at its integration site at the 14th nucleotide. Cut into the upstream HIV-1 DNA ends ( Figure 3).
  • ⁇ Preparation of LTR-Tags> Isolate genomic DNA from THTK-infected cells. DNA is subjected to Kas I and Xho I double degradation. Kas I (637) is a unique site in the HIV-1 genome. Kas I degradation degrades the Bpm I cleavage sequence (629-645) in the 5 ′ LTR.
  • XhoI (8892) is another site unique to the HIV-1 genome.
  • the Xho I degradation has an HIV-1 upstream viral cDNA separated from the 3 ′ end of the HIV-1 genomic plasmid and host cell chromosomal DNA at the integration site.
  • the primer for DNA extension is a biotinylated nucleotide, B-NLR8950, whose nucleotide sequence is 5'-B-GTG CCT GGC TAG AAG CAC AAG-3 '.
  • B-NLR8950 a biotinylated nucleotide
  • the biotinylated DNA expansion product is purified by conjugation with streptavidin magnetic beads (Dynabeads M-280).
  • the DNA expansion reaction has an H1V-l integration site containing a significantly enhanced DNA fragment, and contaminated DNA, especially contaminated DNA from upstream HIV-1 provincial cDNA, is dramatically reduced. ing.
  • DNA extension reaction B-NLR8950 50 ⁇ M Kas 1+ Xho Degraded DN
  • a 10 ⁇ g dNTPs 200 ⁇ M Incubate a 5 unit Taq DNA polymerase tube at 94 ° C for 5 minutes, 55 ° C for 5 minutes, and 72 ° C for 30 minutes.
  • biotinylated DNA is subjected to Bpm I degradation.
  • Bpm I digestion is performed overnight at 37 ° C and DNA is purified by Dynabeads M-280 and then ligated with a double-stranded oligolinker.
  • the double-stranded oligo linker has the following characteristics: one end is a 2 ′ nucleotide 3 ′ overhanger and is complementary to the Bpm I digestion end; the other end is a 3 ′ nucleotide 5 ′ overhanger; It effectively prevents the linker from self-ligating.
  • the nucleotide sequence of the double-stranded linker is HD-A (provided by Dr. Sam Chow, University of California, UCLA): 5'-CAC GCG TCG CAT CAT ATC TCC AGG TGT GAC AG-3 ' , And HS-S (provided by Dr. Sam Chow, University of California, UCLA): 5'-CCT CT GTC ACA CCT GGA GAT ATG ATG CGA CGC GTG NN-3 '(details in paragraph 062 and Figure III-) 2-2).
  • Linker ligation is performed at room temperature for 16 hours.
  • the ligation reaction is purified by Dynabeads M-280.
  • LTR-Tags can be detected by PCR amplification.
  • Forward primer BHU5-S2 5'-GAG TGC TCA AAG TAG TGT GT-3 ', nucleotide sequence is derived from HI V-l genomic DNA 9617-963.
  • Reverse Primer HDA / SBOT 5'-CT GTC ACA CCT GGA GAT ATG AT-3 'nucleotide sequence is derived from the lowest strand of the double-stranded oligolinker HD-S (see description and Figure 4 for details) .
  • the biotinylated DNA / phosphorus strength or LTR-Tags is template DNA.
  • Non-radioactive protein kinase reaction at in-bi mouth The reaction is for examining D-type cyclin Cdk 4 protein kinase activity on the recombinant protein Rb-C (FIG. 10).
  • the tumor suppressor P16 INK4a can be associated with Cdk4 / Cdk6, and the antibody against P16INK4a can isolate the Cdk4 / Cdk6 protein kinase complex by immunoprecipitation (IP).
  • IP immunoprecipitation
  • D-type cyclin Cdk4 protein kinase specifically phosphorylates threonine residual sites of multiple serine and C-terminal (Rb -C) of retinoblastoma protein (for details, refer to the description part and Fig. 10).
  • the antibodies used for Western blotting are: Anti-Phospho® Ser780 and Anti-Phospho® Ser807 / 811 manufactured by Cell Sinaling Technology (Danvers, Massachusetts, USA).
  • a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) was recombined to develop a pRBL001 viral vector derived from a lentiviral vector.
  • the RNA contains a special sequence that forms a triple-helix cDNA structure (Central DNA Flap) during the reverse transcription process of RNA, and its coat component is the widely used varicella stomatitis virus. Born from G (VSV-G) protein.
  • VSV-G varicella stomatitis virus.
  • a genetically engineered plasmid (Plasmid) and a VSV-G gene plasmid are drawn into the packaging cell to produce a highly active nucleic acid protein complex.
  • pRBL001 can be introduced into cultured human embryonic kidney 293T cells in vitro via DNA transfection and can generate replication-incompetent infectious lentiviral particles.
  • Lentiviral vector-pRBL001 produces short hairpin RNA against human CDC6 protein mRNA (CDC6 shRNA) via gene transfer in infected cells; enables the degradation of CDC6 mRNA in cells infected with pRBL001; Recognizes the DNA replication origin and degrades CDC6 mRNA as a result of RNA interference (RNAi) in CDC6 knockdown. This stops the infinite proliferation function of cancer cells.
  • CDC6 shRNA human CDC6 protein mRNA
  • PRBL001 recombinant lentiviral vector that recognizes the origin of DNA replication knocks down CDC6 via intracellular infection: pRBL001 RNAi causes apoptosis in neuroblastoma cells, and senescence in human breast cancer MCF7 cannon Leads to.
  • pRBL001 kills HeLa cells (40 x O.6) in 7 days.
  • the pRBL001 recombinant lentiviral vector enables non-invasive cancer molecular targeted therapy for normal cells. This uses human telomerase as a promoter. In nude mouse experiments, 4.7% was inhibited by direct injection into human breast cancer MCF'7 tumors due to tumor growth (275 ⁇ g purified protein content per virus nude mouse).
  • PRBL001 can inhibit the growth of breast cancer.
  • HIV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • PGBL002 inhibits cyclin D and CDK4 / 6 via gene transfer in cells infected, and stops the G1 / S phase of the cell cycle to activate PRB protein and suppress E2F protein.
  • pRBL002 encodes a gene that is an inhibitor of CDK4 / 6, which is the target of TGF (transforming growth factor) - ⁇ signal, suppresses these kinases, and releases large amounts of p27 bound to CDK4 / 6
  • TGF transforming growth factor
  • pRBL2013T activates PTEN through gene transfer in infected cells and functions as a catalyst for dephosphorylation of the pathway through PIK3. This inhibits activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the AKT / mammalian rapamycin target protein (mTOR) pathway.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • mTOR mammalian rapamycin target protein
  • Each of pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T is a kind of low molecular weight viral protein containing “PRBLVPR” and having anticancer activity. “PRBLVPR” has only 96 amino acid residues, and its molecular weight is 14 kD.
  • PRBLVPR has a variety of biological functions, blocking the cell's growth cycle and triggering the cell to enter apoptosis.
  • PRBLVPR can specifically block the growth cycle from G2 to M phase.
  • M phase driving proteins interact to suppress the activity of the driving protein, resulting in cell cycle stagnation.
  • PRBLVPR can inhibit the activation of Cdc2 cell cycle protease kinase and can even delay and block DNA replication.
  • PRBLVPR protein kinase 2A
  • P2A protein kinase 2A
  • pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T contain the mouth merase template sequence.
  • HTERT Human Telomerase Reverse RNA a component that promotes an important reverse transcriptase.
  • telomere RNA as a template, each nucleotide is duplicated to the end of the chromosomal DNA for duplication.
  • a special DNA structure containing the TTAGGG sequence is formed.
  • telomere-replicating enzyme-negative cells contain the mRNA of [Hter] gene transcription of the telomere sequence when detected, but the mRNA of “HTERT” has a large amount of transcription only in tumor cells. And the “HTERT” enzyme is enhanced in immortalized cells and nearly 90% of chick cancer cells.
  • HTERT messenger RNA
  • HTERT HTERT-like gene promoter 5 ′ upstream. It contains abundant GC sequences, and there are many binding sites for the transcription protein SP1 in the center of its 380 bp promoter. SP1 assumes the role of “administrator” and begins basic activities of “HTERT” gene transcription, but also receives the deployment of different “supervisors” and cooperates in gene transcription activity according to the state of cell proliferation.
  • the intracellular tumor suppressor gene Rb closely supervises the cell cycle, places normal cells in the G0 phase, regulates chromosomes and acetylates, and attenuates the transcriptional action of SP1.
  • the cancer protein Myc When a cell is stimulated by a proliferation signal, the cancer protein Myc, another protein in the cell, promotes SP1 to form a macromolecular transcription complex or produce an “extremely active” action. , "HTERT" gene transcription levels increase rapidly.
  • E-box In the center of the 380 bp promoter, two CACGTGs called “E-box” for advanced maintenance are arranged to control the transcriptional position of Myc / Max or Mad / Max.
  • the promoter of the “HTERT” gene is a sufficiently effective control system that can control the transcription of the “HTERT” gene through its regulation and can control cell growth or the purpose of cell growth.
  • the promoter of the “HTERT” gene is activated in cancer cells, this promoter can be linked to a special test gene component by a genetic engineering method to produce a specific expression effect on cancer cells.
  • the expression of LacZ which incorporates the “HTERT” gene promoter, allows it to specifically express the LacZ gene in cancer cells, producing a large amount of LacZ protein and a similar carrier in normal cells is the promoter of the “HTERT” gene promoter. There is no activity, so there is no LacZ gene expression and no LacZ protein is detected.
  • the “HTERT” gene promoter and the viral VPR genome are connected, and can transcribe VPR RNA in cancer cells, producing the “pRBLVpr” protein, thereby blocking the cancer cell growth cycle and effective cancer gene therapy It becomes.
  • the “HTERT” gene promoter In normal cells, the “HTERT” gene promoter has no activity or very low activity.
  • LacZ incorporating the promoter of the “HTERT” gene allows it to specifically express the LacZ gene in cancer cells, producing a large amount of LacZ protein, and the same carrier is the promoter of the “HTERT” gene in normal cells. Is not active, so there is no LacZ gene expression and no LacZ protein is detected.
  • the “HTERT” gene promoter and the viral VPR genome are linked, can transcribe pRBLVPR RNA in cancer cells, produce “p RBLVpr” protein, thereby blocking the growth cycle of cancer cells, and effective oncogenes It becomes treatment.
  • pRBL001, pRBL002, and pRBL2013T effectively stop infinite growth of cancer, without being destroyed by cancer guns that infiltrate and spread to nearby normal tissues. It is a clear difference between the gene cancer treatment and the standard cancer treatment that the “bad epidemic quality” produced by malignant growth of cancer cells is greatly reduced. In addition, performing “gene therapy” on the tumor ensures the safety of the patient's physical environment and maintains the healing effect.
  • the pRBL2013T viral vector is used for nanoparticle assembly.
  • the material is non-cytotoxic. It is an activated PEG that forms a biocompatible, biodegradable hydrophilic shell.
  • the immune reaction polycation polymer-polyethylenenimine (PEI) which increases and minimizes circulation time in the blood, is negatively charged and fills DNA or RNA. Formed with approximately 80 nanoparticles, it has a structure that protects RNA from DNA and enzymatic degradation.
  • pRBL2013T is an inhibitor of many CDKs that simultaneously target mRNA and targets cyclin D and transcription factor E2F. This has a cancer suppression function.
  • DNA replication begins by assembling a pre-replication complex (pre-RC), and DNA replication protein replication origin recognition (Cdc6) plays a central role in the initiation of DNA replication (mailand and Diffley, 2005). Plays. Cells are recruited to origin of replication bound to six components of CDT1 and origin recognition complex (ORC) (Dutta and Bell, 1997) along with mitosis, origin of replication recognition, entering G1. Pre-RC is formed by replicating on origin and origin recognition control loading and loading minichromosomal maintenance protein (MCM) along with other proteins. The stability of replication origin recognition in G1 is an important step in regulating pre-RC assembly. CDC6 targets ubiquitin-mediated proteolysis by promoting G1 complex (APC) late.
  • APC G1 complex
  • Cyclin E-Cdk2 complex kinase is responsible for the phosphorylation of human amino terminal replication origin recognition, recognizes the phosphorylated replication origin (Jiang et al., 1999; mailand and Diffley, 2005) and is stabilized. Replication origin recognition complex phosphorylation by the cyclin E-Cdk2 complex ensures that the origin is degraded in S phase and DNA is replicated only once per S phase (mailand and DiffLey, 2005).
  • CDC6 levels change significantly in response to various stresses. DNA re-replication is seen in those CDC6 and CDT1 overexpressing cells or tumor cells along with p53 activated cells. More recently, the p53 recognizes the origin of replication and modifies the gene below it to link to DNA damage as a complex protein that recognizes the origin of replication directly in the DNA replication stress response. Since CDC6 expression is reduced in response to that link, p53 expressed as a function of DNA repair does not cause re-expression on the detectable cell cycle.
  • the present invention provides a protein for correcting cancer cells and a method for producing the same.
  • a protein that corrects cancer cells is a protein packaged with a virus-like hollow particle that expresses a tumor suppressor gene or gene product that causes apoptosis or aging of the cancer cell. Or in the form of virus-like hollow particles that release the transgene product.
  • the present invention provides nucleic acid therapy using a hematopoietic stem cell in which a gene is recombined by introducing a tumor suppressor gene packaged with virus-like hollow particles into a hematopoietic stem cell line.
  • the p16 protein (also called p16INK4a) is known as a cyclin-dependent kinase inhibitor.
  • the p16 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 (GenBank accession number: L27211) or is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, relative to the nucleotide sequence. More preferably 99% or more, for example 99.5% or 99.9% or more nucleotide sequences having sequence identity.
  • the p16 gene also encodes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, or an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more to the amino acid sequence.
  • the p16 gene preferably encodes a protein having CDK inhibitory activity.
  • An example of a p16 gene includes a nucleic acid comprising a nucleotide sequence at positions 434 to 480 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.
  • the p53 gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 (GenBank Accession No. BC003596), or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 99%, relative to the nucleotide sequence. %, Such as 99.5% or 99.9% or more.
  • the p53 gene also encodes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, or an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more sequence identity to the amino acid sequence It may be a nucleic acid.
  • the p53 gene preferably encodes a protein having transcription factor activity.
  • the transgene may encode shRNA.
  • shRNA is a single-stranded RNA.
  • the antisense sequence of single-stranded RNA is complementary to the target sequence, and the sense sequence complementary to the antisense sequence (typically having a poly U overhang at the 3 'end) is ligated via a linker.
  • the shRNA forms a hairpin structure through intramolecular duplex formation. Such shRNA is cleaved at the double-stranded portion into siRNA in the cell, and then RNAi can suppress the expression of the target gene containing the target sequence.
  • shRNA precursors may be transcribed from a transgene and then edited. Moreover, the process for forming shRNA is performed. Even so, the transgene encodes shRNA. Although it may be a target of shRNA, a gene encoding a cell growth regulator is not limited to these.
  • cell growth regulators include DNA replication and proteins involved in cell cycle regulation such as CDC6, cyclin E, CDK2, CDT1, ORC2 and MCM7.
  • the cell growth regulator may be CDC6.
  • CDC6 is a protein that plays a central role in the initiation of DNA replication. CDC6 knockdown has been found to result in apoptosis of human cancer cells (Feng, et al., Cancer Res., 2003, Vol. 63, p. 7356-7364; Lau et al., EMBO Rep. , 2006, Vol. 7, p. 425-430; and Feng et al., Mol. Cell. Biochem., 2008, Vol. 311, p. 189-197).
  • the CDC6 gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, such as 99.5% or 99.9% or more, relative to the nucleotide sequence. Nucleotide sequences may be included.
  • the transgene encoding the shRNA of CDC6 is a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, or a nucleotide sequence having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more to the nucleotide sequence May be included.
  • the shRNA of CDC6 is the antisense sequence of CDC6 shRNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 or a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity to the nucleotide sequence; SEQ ID NO: A linker consisting of 20 nucleotide sequences or a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity to the nucleotide sequence; and a sense sequence consisting of a sequence complementary to the antisense sequence, and 2 or more bases and 3 ′ poly U overhang. Consists of.
  • the transgene product may include RNA from the transgene, as described above, or may include proteins translated from RNA from the transgene.
  • Each lentiviral vector may contain at least one transgene. Two or more transgenes may be introduced into a cell using one lentiviral vector or using two or more lentiviral vectors.
  • the lentiviral vector comprises a transgene encoding a CDC6 shRNA and / or a transgene encoding a p16 protein, a PTEN protein.
  • the transgene according to the present invention is introduced into cells in vitro using a lentiviral vector.
  • the cell species used in the present invention is preferably the same species as the recipient of the virus-like hollow particles produced.
  • the cells are mammalian cells, such as, but not limited to, dogs, cats, cows, sheep, mice, rats, or primate cells such as monkeys or humans. Human cells are preferred.
  • the cells are kidney-derived cells, uterine-derived cells, lymphocyte-derived cells or fibroblasts.
  • the cells can include human embryonic kidney 293T cells, human cervical cancer HeLa cells, human lymphocyte CEM cells, N144 fibroblasts and other human cell lines, but preferably the cells are human embryonic kidney 293T cells or human cervical cancer HeLa cells.
  • a transgene into a cell using a lentiviral vector can be performed by a method known in the art. Introducing a transgene into a cell using an RNA vector or DNA vector such as a lentiviral vector is performed by the calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method, electroporation method, and other methods known in the art. For example, it can be performed using transfection reagents commercially available as Lipofectamine (R) 2000 (Invitrogen) and FuGene (R) 6 (Roche).
  • transfection reagents commercially available as Lipofectamine (R) 2000 (Invitrogen) and FuGene (R) 6 (Roche).
  • a transgene into a cell using a virus particle such as a lentiviral vector
  • a virus particle such as a lentiviral vector
  • additional expression vectors may be introduced into the cells.
  • Such an expression vector may contain a transgene encoding a protein or RNA encapsulated in a virus-like hollow particle under the control of a promoter.
  • the cell into which the transgene has been introduced is cultured. Culturing can be performed by an appropriate method depending on the cells.
  • the culture is DMEM / high glucose complete medium supplemented with 10% fetal bovine serum and appropriate antibiotics for 1-5 days, eg 2-4 days, especially 36-96 hours, or 36-72 hours Can be done in.
  • lentiviral DNA produced from lentiviral RNA by the action of reverse transcriptase acts as an integrase to form proviral DNA. Is integrated into the intracellular genome. From this proviral DNA, lentiviral RNA is produced by mediated transcription by intracellular RNA polymerase II. From the lentiviral RNA produced in this way, transgene products are usually generated via RNA splicing and / or protein translation.
  • the transgene product and / or lentiviral RNA thus produced in the cell is incorporated into the virus-like hollow particle.
  • the cells release such virus-like hollow particles out of the cells, and as a result, the virus-like hollow particles accumulate in the medium.
  • the lentiviral vector used in the present invention is deficient in structural protein genes and therefore does not form virus-like hollow particles, and virus-like hollow particles are not accumulated in the medium.
  • the method for producing virus-like hollow particles according to the present invention includes a step of recovering the released virus-like hollow particles.
  • Virus-like hollow particles can be recovered by recovering the cell culture medium.
  • the virus-like hollow particles recovered in this way can be further purified.
  • larger vesicles can be removed by centrifugation at 1,000-10,000 ⁇ g (in a preferred embodiment, 9,000 ⁇ g), thereby purifying the recovered virus-like hollow particles.
  • centrifugation may be performed one or more times, and is preferably performed with different centrifugal forces.
  • virus-like hollow particles can be purified by ultrafiltration using, for example, a membrane that can be cut off with a molecular weight of 1,000 kDa.
  • virus-like hollow particles can be precipitated by mixing with a PEG / NaCl solution and mixing with centrifugation, thereby purifying it. After purification in this way, a polyethylene glycol structure may be added (PEGylated) to virus-like hollow particles.
  • PEGylation of virus-like hollow particles can be performed using various types of PEGylation reagents. For example, methoxy PEG succinimidyl carbonate NHS (mPEG-NHS) can be used (Croyle et al., J. Virol., 2004, Vol. 78, p. 912-). 921).
  • methoxy PEG succinimidyl carbonate NHS mPEG-NHS, molecular weight 10K (NANOCS, USA)
  • mPEG-NHS molecular weight 10K (NANOCS, USA)
  • NANOCS molecular weight 10K
  • the virus-like hollow particle produced by the method of the present invention consists of a lentiviral RNA containing a transgene product and / or transgene.
  • the lentiviral RNA can include a TERT gene promoter sequence upstream of the transgene.
  • the transgene is introduced into the cell using a lentiviral vector containing the TERT gene promoter sequence, thereby facilitating integration of the transgene into the host genome and its expression, and further releasing the virus-like hollow particles from the cell To strengthen. Therefore, virus-like hollow particles can be produced efficiently.
  • the present invention relates to a method for producing a virus-like hollow particle comprising a transgene product and / or a lentiviral RNA comprising a transgene, comprising the following steps: A step of introducing a transgene into a cell using a lentiviral vector in vitro; wherein the lentiviral vector is deficient in at least one structural protein gene and telomerase reverse transcriptase (TERT) in the lentiviral genomic sequence Including transgenes under the control of gene promoters, Culturing the cells to release virus-like hollow particles containing the transgene product and / or lentiviral RNA comprising the transgene out of the cells, and collecting the released virus-like hollow particles.
  • a method for producing a virus-like hollow particle comprising a transgene product and / or a lentiviral RNA comprising a transgene comprising the following steps: A step of introducing a transgene into a cell using a lentiviral vector in
  • the invention also relates to proteins packaged with virus-like hollow particles that cause apoptosis or aging of cancer cells containing the transgene product.
  • Proteins packaged with virus-like hollow particles that cause apoptosis or aging of cancer cells are lentiviral RNAs containing genes produced by the method of the present invention.
  • Virus-like hollow particles according to the present invention are produced by cells, It means virus-like hollow particles having a size of 5 nm to 5 mm, preferably 10 nm to 1 mm, more preferably 20 nm to 500 nm, which are released or dropped out of cells.
  • the size of the virus-like hollow particles can be determined by electron microscopy.
  • virus-like hollow particles generally include, but are not limited to, exosomes, shedding virus-like hollow particles and apoptotic bodies.
  • the virus-like hollow particles of the present invention are exosomes.
  • Exosomes are membrane vesicles composed of lipid bilayers. Exosomes are 150 nm or smaller and typically have a size of 20-120 nm or 40-100 nm. Exosomes are produced by exocytosis due to cell membrane fusion of multibodies (MVBs) secreted extracellularly and formed through inward budding of endosomal membranes.
  • MVBs multibodies
  • the virus-like hollow particle according to the present invention may contain RNA such as protein and / or lentiviral RNA containing transgene product and / or transgene. RNA is transported from the host cell and encapsulated therein.
  • RNA that can be included in a virus-like hollow particle include, but are not limited to, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, and lentiviral RNA (including various splicing variants of lentiviral RNA).
  • proteins that can be included in a virus-like hollow particle include viral proteins (eg, HIV-1 Vpu protein and reverse transcriptase (RT) protein), cellular endogenous proteins (eg, cytoskeletal proteins, signaling) Proteins and enzymes) and foreign transgene products, but are not limited to these.
  • viral proteins eg, HIV-1 Vpu protein and reverse transcriptase (RT) protein
  • cellular endogenous proteins eg, cytoskeletal proteins, signaling Proteins and enzymes
  • exosomes are generally cytoskeletal proteins (eg, tubulin, actin and actin binding proteins), membrane transport related proteins (eg, annexins and Rab proteins), signal transduction proteins (eg, protein kinases and 14-3-3).
  • Metabolic enzymes eg GAPDH, ATPase and enolase
  • tetraspanin family eg CD9, CD63, CD81 and CD82
  • heat shock proteins eg HSP90 and HSP70
  • MVB biosynthetic proteins eg Alix
  • TSG101 TSG101
  • immunomodulatory molecules eg, MHCI and MHCII
  • Lentiviral DNA containing a lentiviral genomic sequence containing the above-described transgene is introduced into a cell by the method of the present invention and integrated into the host genome.
  • Lentiviral RNA contained in the virus-like hollow particles of the present invention is transcribed from this proviral DNA.
  • the lentiviral RNA may contain an RNA sequence of a TERT gene promoter (eg, hTERT promoter) at the 5 ′ end upstream of the transgene.
  • the virus-like hollow particles of the invention comprise, as transgene products, tumor suppressor proteins such as PTEN and p16 protein, and / or shRNA such as CDC6 shRNA or its precursor RNA, etc. Can do.
  • the virus-like hollow particles of the present invention can be taken up by the other gene delivering lentiviral RNA containing the transgene product and / or the transgene contained in the virus-like hollow particle.
  • the present invention also includes a step of bringing a target cell into contact with a virus-like hollow particle containing a transgene product and / or a lentiviral RNA containing the transgene and fusing them, thereby introducing the transgene into the cell.
  • virus-like hollow particles are thus produced by the method of the invention.
  • target cells can be contacted with virus-like hollow particles in vitro or in vivo.
  • Virus-like hollow particles, particularly exosomes can penetrate other neighboring cells to participate in cell-cell interactions.
  • virus-like hollow particles can reach the interior of target cells via membrane fusion or via methods such as endocytosis, but the invention is limited to this theory is not.
  • the contact between the virus-like hollow particle and the target cell can be performed by any method known to those skilled in the art.
  • in vitro contact of virus-like hollow particles with target cells can be achieved by adding virus-like hollow particles to the cell culture medium.
  • In vivo contact of virus-like hollow particles with target cells can be achieved, for example, by oral administration of virus-like hollow particles or by virus-like hollows to target sites (eg, sites in the liver, joints, intraventricular and intranasal cavities). It may be done by parenteral administration such as direct application of particles or injection.
  • the gene transfer method of the present invention can efficiently deliver a lentiviral RNA containing a gene contained in a transgene product and / or a virus-like hollow particle to a target cell.
  • the present invention also relates to a composition comprising virus-like hollow particles produced by the method of the present invention.
  • the composition can include any component other than virus-like hollow particles depending on its intended use.
  • the composition may be one used in gene transfer. In that case, the composition may include an agent that promotes gene transduction and / or an agent that stabilizes nucleic acids.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising virus-like hollow particles produced by the method of the present invention.
  • the pharmaceutical composition is for use in the treatment of diseases such as, for example, cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, immune dysfunction, inflammation, cirrhosis, arteriosclerosis, thrombus and infection. Also good.
  • the pharmaceutical composition is for use in the treatment of cancer.
  • the cancer is from the group consisting of colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, lung cancer, neuroblastoma, breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, prostate cancer, thyroid cancer and malignant lymphoma. Selected.
  • the transgene product contained in the virus-like hollow particle can cause a decrease in the expression of CDC6.
  • the transgene product is a shRNA that targets CDC6.
  • the disease to be treated such as cancer
  • the transgene or transgene product contained in the virus-like hollow particles functions to prevent and / or treat diseases according to the present invention.
  • such a transgene may be a tumor suppressor gene such as the PTEN or p16 gene and / or a gene encoding an shRNA that targets a gene encoding a cell growth regulator or precursor thereof. There may be.
  • the transgene is a gene encoding a PTEN gene and / or CDC6 shRNA.
  • the pharmaceutical composition is a virus-like hollow particle produced by the method of the present invention, wherein the transgene is a PTEN gene, and the transgene is a gene that encodes the CDC6 shRNA in combination. Particles may be included.
  • the transgene is a gene encoding the p16 gene and / or CDC6 shRNA.
  • the pharmaceutical composition is, for example, a virus-like hollow particle whose transgene is the p16 gene produced by the method of the present invention, and the transgene is a gene that encodes the CDC6 shRNA in combination. Virus-like hollow particles may be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a liquid medium in addition to the virus-like hollow particles of the present invention.
  • Liquid media include water, physiologically acceptable buffers (such as phosphate buffered saline), and biocompatible aqueous media such as propylene glycol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. If necessary, such a medium is desirably sterilized and preferably adjusted to be isotonic with blood.
  • the pharmaceutical composition can include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” means an additive commonly used in the field of pharmaceutical technology. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include suspending agents, isotonic agents, buffers and preservatives. Such carriers are primarily used to facilitate shaping and maintain dosage forms and drug effects, and are used appropriately as needed.
  • glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose and sodium lauryl sulfate can be used as suspending agents.
  • isotonic agents include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • buffering agents include phosphate, acetate, carbonate, citrate buffers.
  • preservatives include benzalkonium chloride, parahydroxybenzoic acid, and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition is also a flavoring agent, thickener, solubilizer, pH adjuster, diluent, surfactant, swelling agent, stabilizer, absorption enhancer, wetting agent, humectant.
  • compositions of the present invention can contain an additional drug without losing the pharmacological effect of the virus-like hollow particles of the present invention.
  • the pharmaceutical composition can contain a predetermined amount of antibiotic.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not limited, and any form that does not inactivate the virus-like hollow particles or inactivate the lentiviral RNA contained in the transgene product and / or virus-like hollow particles. It can be.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition may be, for example, a liquid, solid or semi-solid form.
  • Specific examples of dosage forms include, for example, parenteral dosage forms such as injections, suspensions, emulsions, creams, eye drops, nasal drops, ointments, plasters, patches, suppositories, liquid formulations, Oral dosage forms such as capsules, sublingual preparations, troches, powders, tablets, granules and the like can be mentioned.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is preferably a liquid formulation such as injection.
  • the pharmaceutical composition can be administered to the organism in a pharmaceutically effective amount for the treatment of the target disease.
  • Recipient organisms are, for example, vertebrates such as mammals, birds, amphibians and reptiles, preferably mammals. Examples of mammals include non-primates such as dogs, cats, horses, pigs, cows, goats, sheep, mice and rats, and primates such as humans, chimpanzees and gorillas, preferably humans.
  • the “pharmaceutically effective amount” is used to prevent or treat the target disease or reduce the symptoms with little or no harmful side effects on the host.
  • the specific dose depends on the type of disease to be treated, the mechanism of action underlying the occurrence of the disease, depending on the dosage form used, information about the subject and route of administration, and the like.
  • the range of pharmaceutically effective amounts and preferred routes of administration of pharmaceutical compositions administered to humans are generally set based on data obtained from cell culture assays and animal experiments.
  • the final dose is determined and adjusted according to the individual subject, for example, at the physician's discretion. Information about the subject considered in that case includes the degree or severity of disease progression, general health, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, and resistance to treatment.
  • the pharmaceutical composition of the invention is administered one or more times at a dose of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 transfection units (TU) / kg body weight.
  • TU transfection units
  • direct injection into the affected site at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 tu / kg body weight, or 2 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 6 tu / kg body weight per single dose, or It can be injected intravenously.
  • the transfection unit is a lentiviral vector of the present invention (for example, a DNA vector such as a plasmid vector (pRBL2013T, etc.)).
  • a step of determining the amount of a transgene product eg, a protein such as a PTEN protein
  • the amount determined as a transfection unit can be determined by a step of normalizing.
  • one transfection unit is equivalent to 20 PG of transgene product (for example, protein) per 1000 cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered two or more times at predetermined time intervals.
  • the predetermined time interval is, for example, every hour, every 3 hours, every 6 hours or every 12 hours, or every day, every 2 days, every 3 days or every 7 days, every 1 month, every 2 months, every 3 months, Every 6 months or every 12 months.
  • Other parenteral or oral administrations can be performed in amounts according to those described above. Especially in severe cases, the dose can be increased depending on the symptoms.
  • Administration of the pharmaceutical composition may be systemic administration or local administration, and can be appropriately selected according to the type of disease, the site where the disease occurs, or the degree of progression.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered locally by direct administration to the local site (eg, tumor) and its vicinity, such as by injection or indwelling catheter. This is because the virus-like hollow particles of the present invention can be administered in a sufficient amount to the site (tissue or organ) to be treated and do not affect other tissues.
  • the site to be treated may not be identified or the disease may occur systemically. In that case, systemic administration by intravenous injection or the like is preferable.
  • the pharmaceutical composition can be administered by any suitable method that does not inactivate the active ingredients contained therein.
  • administration is done parenterally (eg, injection, aerosol, application, eye drops, nasal or indwelling catheter) or orally. Injection is preferred.
  • the injection site may be a non-limiting site where the virus-like hollow particle of the present invention can exert its function and achieve the purpose of the pharmaceutical composition.
  • injection sites include intravenous, intraarterial, intrahepatic, intramuscular, intraarticular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, percutaneous, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intranasal, intestinal and tongue The lower part is mentioned. In one embodiment, direct administration to the tumor is also preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used to effectively prevent and / or treat a disease by a transgene product or the like contained in a virus-like hollow particle. Accordingly, the present invention also provides a method for treating a patient comprising administering to a patient in need of transgene or transgene product a virus-like hollow particle produced by the method of the present invention. .
  • the patient may suffer from cancer, diabetes, neurodegenerative disease, immunodeficiency, inflammation, cirrhosis, arteriosclerosis, thrombus or infection, but preferably suffers from cancer.
  • the cancer is from, for example, colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, lung cancer, neuroblastoma, breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, prostate cancer, thyroid cancer and malignant lymphoma. May be selected from the group consisting of
  • the transgene product contained in the virus-like hollow particle can cause a decrease in the expression of CDC6.
  • the transgene product may be an shRNA that targets CDC6.
  • the disease to be treated, eg, cancer may be accompanied by increased expression of CDC6.
  • the administration method and administration site of the virus-like hollow particles to the patient can be used in relation to the administration method and administration site of the pharmaceutical composition as described above.
  • the treatment method of the present invention can effectively treat a disease such as cancer in a patient.
  • the treatment methods of the invention can inhibit (reduce) tumor growth.
  • case (1) shows the result of the patient administered with pRBL001
  • case (2) shows the result of the patient administered with pRBL002.
  • case (1) the numerical value of the p53 antibody test was within the reference value after 10 weeks from the start of administration.
  • case (2) the value of the p53 antibody test was within the reference value after 14 weeks from the start of administration.

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Abstract

　本発明は、細胞周期異常が生じる根源的な原因を突き止め、異常状態が発生する上流側においてその原因を除去することによって効率的かつ確実に細胞周期異常ならびにこれから生じるがんの発生を阻止することを目的する。本発明は、ヒトCDC6 mRNAに対する短へアピンRNAであるCDC6 shRNAを、感染した細胞内における遺伝子導入によって生産することができるレンチウイルスベクターTHTD、並びに該レンチウイルスベクターTHTDを含むヒト乳がんMCF7細胞の老化剤、がん抑制剤および医薬組成物である。

Description

レンチウイルスベクターＴＨＴＤ、該ＴＨＴＤを含有する老化剤、がん抑制剤および医薬組成物、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、並びにウイルス様中空粒子の製造方法
　本発明は、レンチウイルスベクターTHTD、該THTDを含有する老化剤、がん抑制剤および医薬組成物、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、並びにウイルス様中空粒子の製造方法に関する。
　がん細胞は、生体の細胞の細胞周期の異常によって起きる。従って、細胞周期の異常現象を食い止め、正常な状態に戻す、ないしは、異常な細胞を適切にアポトーシスすることによりがんの発生を抑制、あるいは阻止することができると考えられ、そのための技術が求められてきた。
特開2013-56930号公報
　本発明は、効率的かつ確実に細胞周期異常の発生、ならびに細胞周期異常から生じるがんの発生を阻止することを課題とする。
　上述したように、がん細胞は細胞周期の異常によって起きる。そこで、本発明者は、細胞周期異常が生じる根源的な原因を突き止め、異常状態が発生する上流側においてその原因を除去することによって効率的かつ確実に細胞周期異常の発生を阻止し、ひいてはがんの発生を阻止することができることを見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
　すなわち本発明は以下に関する。
[1] ヒトCDC6mRNAに対する短へアピンRNAであるCDC6 shRNAを、感染した細胞内における遺伝子導入によって生産することができるレンチウイルスベクターTHTD。
[2] 上記レンチウイルスベクターTHTDを含むヒト乳がんMCF7細胞の老化剤。
[3] がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるためのがん抑制遺伝子および／またはがん抑制遺伝子産物からなる、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質、および該タンパク質を含む医薬品、医薬組成物、並びに前記タンパク質、前記医薬品、及び前記医薬組成物の製造方法。
　ここで、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子からなる、レンチウイルスRNAから構築されるウイルス様中空粒子は、以下の工程を含む方法により製造される。
　すなわち、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子から成るレンチウイルスRNAから構成されるウイルス様中空粒子を、細胞外に放出するレンチウイルスベクターを用いて、インビトロで導入遺伝子が導入された細胞を培養する工程、および放出されたウイルス様中空粒子を集める工程。
　前記レンチウイルスRNAは、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tを含む。また、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの構造タンパク質遺伝子が欠損している導入遺伝子であり、レンチウイルスゲノム配列に含まれるヒトテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）の遺伝子プロモーターに制御される導入遺伝子から成る。
　pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tが組み込まれた細胞はcdc6の枯渇をもたらし、cdc6の枯渇は、腫瘍抑制遺伝子産生タンパク質（抗腫瘍タンパク質ともいう。）であるp16INK4aの活性化をもたらす。
　cdc6の枯渇によるP16INK4aの活性化に加え、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tは、p16腫瘍抑制遺伝子（GENEbank accession No ．L27211 ）をがん細胞にトランスフェクションさせることができる。p16腫瘍抑制遺伝子のがん細胞へのトランスフェクションによって細胞周期のG1／S期の移行を阻害する。また、細胞周期のcdk4/6、サイクリンDのインヒビターとなる。
　細胞老化を起こした細胞の多くが細胞周期のG1期を停止してDNA合成を開始することができないことが知られているが、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tはそれを可能とする。
　CDK4／6、サイクリンDが複合体を形成するとRBタンパク質の機能が失活する。これは、RBタンパク質のリン酸化に起因する。pRBL002によって脱リン酸化されたRB蛋白質はサイクリン（転写因子）を捕らえる。これにより細胞周期は、G1期にとどまることが確認された。
　要するに、pRBL001、pRBL002、pRBL2013TによってP16遺伝子およびP16遺伝子産生産物が細胞に発現することで、RBタンパク質の機能を活性化してがん細胞の細胞周期のG1/S期への移行を捕捉し、これによりがん細胞の老化を誘導する。
　pRBL002は、［PRBLVIF］を含有しており、これは、HIVウイルスゲノムのvif由来のタンパク質である。
　p53の欠乏と、がん細胞およびがん細胞前駆体でのCDC6の強力なリン酸化が原因で、CDC6がより安定し、細胞のアポトーシスが回避される。このようなCDC6とp53の相関関係に対して、pRBL002のvifは、p53のインヒビターMDMの中央部分に結合しp53を活性化する。
　また、pRBL002の［PRBLVIF］は、がん細胞の細胞周期のG2期M期移行を阻害する
　pRBL2013Tは、「PRBLVPR」を含有している。これは、HIV-1ゲノムのVPRに由来するタンパク質である。VPRはpRBL2013Tに遺伝子導入されたPTENを核内に移送する。PTENは、細胞膜下におけるPIK3-AKTの経路において脱リン酸化の酵素として細胞増殖のシグナルを負に制御することが知られている。
　また、pRBL2013Tはテロメラーゼ鋳型配列を含有している。さらに、HTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）プロモーターの下流にヒトPTEN遺伝子をエンコードしたDNAを含有している。ヒトPTEN mRNAの配列は[GENEbank accession No．NM_000314]を利用している。
　pRBL2013Tは、細胞に侵入後、PTEN遺伝子のcDNAは［PRBLVPR］との結合によって核内に移動して染色体に組み込まれる。
　pRBL2013TによってPTEN遺伝子産物の産生を活性化する。
　pRBL2013Tは、細胞に侵入後、PTEN遺伝子のcDNAは［PRBLVPR］との結合によって核内に移動して染色体に組み込まれる。pRBL2013TによってPTEN遺伝子産物の産生を活性化する。
　がん患者において、PTENはp53についで変異の多い腫瘍抑制因子である。
　pRBL2013T に遺伝子導入されたPTENはAKTの活性化に関わる脂質のPIP3からリン酸基を取り除く酵素である。　
　AKTは細胞増殖を促進し幾つかのメカニズムでアポトーシスを阻害する。
　PTENによって、AKTの活性化を阻害すると細胞増殖を抑制してアポトーシスを促進する。
　PTENがPIP3を脱リン酸化することによって、その下流のAKTの活性を阻害する。
　Forkhead　box（FOX）転写因子は、細胞周期の抑制に関わるINK4B、p21、p27、ARF、アポトーシスに関わることが知られている。
　また、Bim、FasL、糖新生に関わるG6P、その他血管新生や分化に関わるものなど多岐にわたる。
　AKTを通じて活性化されたIISはFoxOの機能を抑制する。
　哺乳類には４種類のFoxO転写因子、FoxO1、3、4、6が存在している。いずれも、AKTによるリン酸化を受けて機能が抑制される。FoxO1、3、4はリン酸化されると14-3-3と結合し、核外へ移送される。リン酸化されたFOXO1,FOX3AがMDM2によりユビキチン化され分解される。HSC（造血幹細胞）でFoxOの欠失は、ARFやP27の発現低下を通じて細胞の過剰な増殖とアポトーシスへの抵抗性を誘導し、がんの発生を促進する。細胞のアポトーシスには、いくつかの経路とメカニズムによって実行される。ミトコンドリアの経路によるいくつかのアポトーシス誘導因子の内、活性化したAKTは、アポトーシス促進性のBaxタンパクに結合してアポトーシスを阻害する。FoxO3を欠失するとT細胞ではNF-KBが活性化して過剰な炎症反応が起こる。NF-KBの活性化は、がん細胞の特徴である新生血管の形成を促進する。
　pRBL2013Tは、上述の生物活性の発現に寄与するPI3K（ホスファチジルイノシトール３キナーゼ）によって細胞内で合成されるプロテインキナーゼB（AKT）の活性化を阻害する方法を提供する。
　ここで、PI3KのセカンドメッセンジャーであるPIP3がリン酸化されることでAKTは活性化する。pRBL2013Tは、PIP3の脱リン酸化することでAKTを負に制御することで、細胞増殖のシグナルを阻害し、AKTの下流に影響を与えることでアポトーシス誘導因子や転写因子に影響を与え、がん細胞を老化もしくはプログラム細胞死の指令を出す。
　細胞膜直下でpRBL2013Tに含まれるGagタンパク質とRTが複合体を形成して細胞内の小胞体の遊離に関与するタンパク質群と結合してPTENのエキソソームを形成し細胞外へ遊離しレピシエント細胞にPTENタンパク質を輸送する。
　Cdc6 shRNAの作用によって、CDC6が枯渇すると、ミトコンドリアのアポトーシス経路におけるMOMP（mitochondrial outer membrane permeabilization）ミトコンドリア外膜透過性亢進が促進される。pRBL001によるRNA干渉によって引き起こされたCDC6の枯渇は、アポトーシス促進性BCL-2エフェクター（Pro-apoptoicBCL-2effector）のBAXの発現を促進する。また、pRBL001によって引き起こされたCDC6の枯渇は、抗アポトーシス性BCL-2タンパク質（anti-apoptoicBCL-2 protein）の発現を低下させ、MOMPを阻害し、アポトーシスを抑制する機構を負に制御する。
 pRBL001は、BCL-2のサブファミリーのBH3-only proteinのBIM、BADなどの発現を促進しMOMPとアポトーシスを促進する。pRBL001によって活性化されたBCL-2のサブファミリーのBH-3 only proteinのいくつかは、BCL-2エフェクターを活性化させる。
pRBL001は、CDC6 shRNAによるRNA干渉によってCDC6の枯渇を引き起こすが、多くのがん細胞においてCDC6は高度に発現していることが確認されている。
　がん細胞の85%～90%で活性化しているHtertをプロモーターにすることとCDC6の発現をターゲット（標的）Cdc6 mRNAにすることでがん細胞の特異性を認識できる。
　現在の分子標的薬は、がん細胞の膜タンパク上に特異的に発現している分子＝レセプター（受容体）を標的にしている。しかしながら、がん細胞の核内からは多種多様な分子が発現しているために１つの標的分子による治療ではがん細胞に対して優位な治療を継続することができない。また、継続的な治療はやがて受容体に対する耐性を作る。
　pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tは、エンベロープを持たないウイルスタンパクの形態であり、細胞膜に融合にしてエンドサイトーシス（Endocytosis）を利用する。非分裂性の細胞にも侵入できる。また、TERTの発現の高い幹細胞にも侵入でき、遺伝子導入もしくは、遺伝子産生産物を発現できる。
　pRBL2013Tは、腫瘍抑制因子であるPTENを含有している。PTENは、細胞質と核の両方に存在するが、エキソソーム（Exosomes）となって細胞外に分泌し受け手（レシピエント）細胞に取り込まれ、その細胞のAktのリン酸化を低下させ、細胞増殖を抑制するという効果を発揮する。
　PTENの変異を持つ患者は、脳、乳がん、前立腺、皮膚の腫瘍を起こすことが知られている。
　PTENエキソソームは、後記エンドソームや多少胞体（multivesicular bodies;MVBs）由来の小胞である。MVBsが細胞膜と融合することにより細胞外分泌を担う。
　エキソソームは、その内容物として、遺伝子の産生産物としてのタンパク、DNA、microRNAを受け手ての細胞に輸送して細胞の生理状態を変えることができる。
　pRBL2013TにPTEN遺伝子導入し、HEK293T細胞から遠心プロトコールによってPTENエキソソームの大量生産の方法を提供する。
　このエキソソームは、VLP（ウイルス様中空粒子）であり、導入される遺伝子は、PTENに限らない。
　本発明に係る医薬品または医薬組成物は、結腸がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび悪性リンパ腫からなる群から選択されるがんの治療に使用される。これらのがんは、正常よりも高度に発現したCDC6を含むことが確認されている。
　本発明に係る医薬品または医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含んでも良い。
　本発明に係る医薬品または医薬組成物をがんの治療に用いる場合は、遺伝子または遺伝子産物が導入されたウイルス様中空粒子をがん患者もしくは該患者とは別のヒトの間葉系幹細胞及び／または造血幹細胞（Stem cell）に感作させ、感作した幹細胞を培養した際の上清液をがん患者に導入する。
　これにより、ウイルス様中空粒子化した遺伝子または遺伝子産物が前がん状態に対する、がん化の予防効果が得られる。前がん状態とは、がん抑制遺伝子rbが不活性になることにより、がん細胞及びがん前駆体細胞の分裂が促進した状態をいう。この状態はがん細胞の分裂が促進している状態であり、rb-cドメインの701～928のバンドで、s807,s811,t821,t826,s780のリン酸化を伴う。これらのリン酸化によりがん抑制遺伝子rbの活性・不活性を確認することができる。がん抑制遺伝子rbの活性・不活性は、後述する周知の方法で検査可能であり、導入前後の状態をこの方法で比較し、脱リン酸化していることで確認できる。
[4] [3]に記載の製造方法において、導入遺伝子が導入された細胞が、少なくとも１つの構造タンパク質遺伝子を持たない、製造方法。
[5] [3]または[4]に記載の方法において、レンチウイルスベクターが、env遺伝子を欠損している製造方法。
[6] [3]～[5] のいずれかに記載の方法において、TERT遺伝子プロモーターが、ヒトTERT遺伝子プロモーターである製造方法。
[7] [6]に記載の方法において、ヒトTERT遺伝子プロモーターが、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列と90％以上、好ましくは95％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む製造方法。
[8] [3]～[7]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスRNAが導入遺伝子の上流のTERT遺伝子プロモーター配列を含む製造方法。
[9] [3]～[8]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスベクターが、下記の(i)～(iii)のいずれかである製造方法。
 (i) レンチウイルスゲノム配列を含むRNAベクター
 (ii) レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNAベクター
 (iii) レンチウイルスゲノム配列を含むRNAを担持するウイルス粒子
[10] [3] ～[8]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスのゲノム配列が、TERT遺伝子プロモーターと導入遺伝子の間のTERT転写領域の少なくとも一部を含む製造方法。
ここで、TERT転写領域の少なくとも一部がSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:2のヌクレオチド配列と90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
[11] [3]～[10]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスのゲノム配列が、HIVのゲノム配列である製造方法。この場合、前記HIVゲノム配列はHIV-1ゲノム配列であることが好ましい。HIV-1ゲノム配列は、5 'LTR; パッケージング信号ψ; gag遺伝子; pol遺伝子; VIF遺伝子; VPR遺伝子; tat遺伝子; rev遺伝子; VPU遺伝子;および3 'LTRを含む。
[12] [3]～[11]のいずれかに記載の方法において、導入遺伝子がタンパク質またはRNAをコードする製造方法。
[13] [3]～[12]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスベクターを含む導入遺伝子ががん抑制遺伝子である製造方法。この場合、がん抑制遺伝子は、PTENまたはp16遺伝子であることが好ましい。
[14] [3]～[13]のいずれかに記載の方法において、レンチウイルスベクターが、短ヘアピンRNA（shRNA）をコード化する導入遺伝子を含む製造方法。ここで、前記shRNAは、細胞増殖調節因子をコードする遺伝子を標的とする。前記細胞増殖調節因子は例えばCDC6である。
[15] [3]～[14]のいずれかに記載の方法において、前記細胞がヒト細胞である製造方法。この場合、前記細胞は腎臓由来細胞であり、特に、ヒト胚性腎臓293T細胞である。
[16] 細胞内へ導入遺伝子を導入し、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNA（pRBL001、pRBL002、pRBL2013T）から成るウイルス様中空粒子と標的細胞を接触させ、それらを融合することにより、遺伝子を導入する方法。
[17] [16]に記載の方法において、標的細胞が、インビトロでウイルス様中空粒子と接触される遺伝子導入方法。
　本発明によれば、効果的にがんを予防し、又は発生したがんを消去するがん抑制剤等の薬剤、医薬品または医薬組成物を提供することができる。
　なお、図１３～図５４は本発明の作用および効果を説明する図である。
pTHTKベクターの図。 下:遺伝子組換レンチウイルス導入遺伝子ベクタ-pRBL001の図。上:プラスミドDNAマッピングを示すアガロースゲルの図。 LM-PCRの検知及びLTR-Tag試験のためのBpm I部位の生成を説明する図。 PCRメソッド、TR-Tag技術分析を説明する図。 THTKプロウイルスcDNAを検知するLM-PCRを説明する図。 CDC6 shRNAを生み出す遺伝子組み換えレンチウイルスベクターに感染した細胞内におけるCdc6の発現阻止を示すウエスタンブロット。 Cdc6の欠乏がヒト乳がん細胞のアポトーシスをもたらすことを示す図。 ヒ卜乳がん細胞の老化を示す図。 Cdc6が欠乏したMCF7細砲が老化することを示す図（がん細胞の核における特別な染色体構造の変化が起こる、すなわちSAHFの形成）。 生体外におけるCdk4タンパク質キナーゼ反応を示すカーボン画像。 MCF7細胞はCdc6ノックダウンのためにTHTDに感染しているか、又は感染多重度1.0で偽感染していることを示す図。 MCF7細胞はTHTD （レーン 5）若しくはTHTP（レーン 4）に感染するか、又は偽感染（レーン 3）していることを示す図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 発明を説明するための他の図。 p53抗体検査において高値を示す患者に対するpBRL001およびpRBL002の効果を示す図。 卵巣がんを全摘出術後６ヶ月を経過した患者に対するpBRL001およびpRBL002の効果を示す図。 卵巣がんを全摘出術後６ヶ月を経過した患者に対するpBRL001およびpRBL002の効果を示す図。 乳房全摘出術を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。 乳房全摘出術を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。 乳房全摘出術を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。 乳房温存治療を行う乳がん（エストロゲン陽性）患者に対するpBRL001、pRBL002およびpRBL2013Tの効果を示す図。
　以下、本発明のいくつかの実施の形態について説明する。なお、本発明はこれら実施の形態に何等限定されるものでなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施しえる。
＜発明の概要＞
　The RNTEIN BIOTECH JAPAN Corporationは、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターであるpRBL001由来のヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1ウイルス）を作製した。染色体外遺伝子であるpRBL001は、培養されたヒト胎児由来腎臓細胞293TへのDNAトランスフェクションによる生体外導入が可能であり、複製不能な感染レンチウイルス粒子THTDを精製することができる。遺伝子組み換えレンチウイルス粒子であるTHTDは、生体外で様々な種類のヒト細胞株に感染可能である。レンチウイルスベクターTHTDは、感染した細胞内における遺伝子導入によって、ヒトCDC6 mRNAに対する短へアピンRNA （CDC6 shRNA） を生産することができる。感染した細胞内におけるCDC6 shRNAの生産は、CDC6 mRNAの分解を特異的に引き起こす。
　RNA干渉（RNAi）によるCDC6 mRNAの分解は、DNA複製導入因子であるCdc6のノックダウンをもたらす。THTD遺伝子組み換えレンチウイルスベクター感染及びRNAiによるCdc6のノックダウンは、ヒト神経芽細胞腫のアポトーシスを引き起こし、ヒト乳がんMCF7細胞の老化をもたらす。
　THTD遺伝子組み換えレンチウイルスベクターは、分子治療に適用可能であり、その商業的名称をAJS2010という。ヌードマウス実験では、AJS2010を用いたヒト乳がんBap-37腫瘍移植片の直接注射（腫瘍を有するヌードマウスあたり、精製したウイルス粒子の含有タンパク質275μg）により、腫瘍成長が34.7％阻害された。AJS2010は、東京及び日本のその他の都市で、進行したがん患者の治療において試験された。
＜実施の形態＞
　DNA複製は複製前複合体（pre-RC）を組み込むことによって開始し、DNA複製タンパク質Cdc6 （細胞分裂周期6）は、DNA複製の開始において中心的な役割を果たす。細胞が有糸分裂からG1期に入ると、Cdc6はCdtlと共に、複製起点認識複合体（ORC）の6個の構成要素と結合した複製起点に補充される。
　複製前ORC複合体は、微小染色体維持タンパク質（MCM）を他の複製タンパク質と共に複製起点に積み重ねることによって形成され、Cdc6がこの積み重ねを制御する。G1期におけるCdc6の安定性は、pre-RCの組み込みを調整するための鍵である。
　Cdc6は、G1期において、後期促進複合体（APC）によるユビキチン依存性タンパク質分解を標的とする。サイクリンE-Cdk2キナーゼは、ヒトアミノ末端Cdc6のリン酸化にとって重要であり、リン酸化されたCdc6は安定する。サイクリントCdk2キナーゼによるCdc6のリン酸化は、複製起点がS期において始動することを保証し、DNAはS期に一度だけ複製される。
　ヒト細胞内において、Cdc6のレベルは様々なストレスに応答して著しく変化する。Cdc6及びCdt1が過発現している正常細胞又は腫瘍細胞においては、p53の活性化と共にDNAの再複製が観察されている。近年になって、DNAの損傷に応答してp53がCdc6を減少させるという報告が、Cdc6とp53を介した複製ストレス応答とを直接結びつけた。
　p53を介したCdc6の減少は、検知可能な細胞周期の再分配を引き起こすことなく発生する。しかしながら、Cdc6ノックダウンによる内因性Cdc6の阻害はS期細胞分画の減少、p53の欠乏と共に、Gl期細胞の増加をもたらす。ヒ卜の腫瘍の約50％で、p53遺伝子の突然変異が発見され、多くの腫瘍細胞は、p53機能の低下によって細胞周期停止とアポトーシスの減少に陥っている。
　P53の欠乏と、サイクリンE-Cdk2キナーゼによって活性化されるCdc6の強力なリン酸化が原因で、Cdc6は腫瘍細胞内ではより安定する可能性がある。Cdc6の枯渇は、ヒトがん細胞におけるアポトーシスをもたらすことが発見されている。Cdc6の枯渇を介したRNA（siRNA）は、Orc2、Cdt1、MCM7といった他の複製タンパク質を損傷することなく顕著に発生する。
　その上、Cdc6の枯渇によってアポトーシスが引き起こされるのはヒトがん細胞のみであり、正常な細胞では起こらない。高レベルのCdc6はヒ卜がんにおける発がん作用と関係があり、ヒト肺がん細胞株においては、Cdc6とp16INK4aのタンパク質レベルは相反関係にある。
　Cdc6の過剰発現は、野性型INK4/ARF部位を有するプライマリMEF細胞におけるコロニ一形成の増大をもたらす。INK4a/ARF-/-MEFにおいて顕著な発がん効果を有さないため、Cdc6は、INK4a/ARF部位を抑制することにより、腫瘍発生を促進する。
＜遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの構築＞
　RNtein Biotech Japan Corporationによって作製された染色体外遺伝子pRBL001を、pTHTKの中に構築する（詳細は後述する）。
　pTHTKはHIV-1株のNL4-3ゲノム構築物、pUC19-NL4-3から作製され、NL4-3の配列割り当て索引番号は、M19921である。pTHTKにおいては、HIV-1ゲノムDNA内の6342番目のヌクレオチドから7512番目のヌクレオチドまでの領域が削除され、Kpn1（6342番目）とBgl 11（7512番目）の末端が平滑化され、取り除かれる。この改変によってHIV-1エンベロープ遺伝子が欠損する（図１）。
　pTHTKにおいては、もともとのHpa1部位が改変され、Mlu1リンカーが遺伝子導入DNA断片を付加するためにそこに追加されている。遺伝子導入DNA断片はMlu1とXho1（又はSal 1）の分解によって調製可能であり、精製されたDNA断片は、pTHTKベクターのMlu1及び、Xho1部位に挿入することができる。遺伝子導入断片の結誌によって、HIV-1nef遺伝子の翻訳領域遺伝子が破壊されしたがって、クローン化されたレンチウイルスベクターは、野生型HIV-1株NL4-3とは異なり、他のウイルスの助けなしには、感染力のあるウイルス粒子を生産することができない。
　結紮を介したPCRメソッドは、LTR-Tagsを生産し、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターが感染した細胞内で複製可能か否かを検出するために用いられている（詳細は後述図３及び図４を参照）。pTHTKベクターは、それ自身でレンチウイルス粒子を生産することができなかった。pTHTKプラスミドと、水痘性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質を提供するpCMV-VSV/Gと、を用いた293T細胞の同時導入による偽型遺伝子組み換えレンチウイルス粒子は、感染した細胞内で複製を行うことができなかった。しかしながら、プロウイルスcDNAは、宿主細胞染色体に組み込み可能である。感染した細胞から隔離されたゲノムDNAは、LM-PCRにおいて信頼でき、LTR-Tagsを示した（図４、図５）。
　偽感染、あるいは「再感染」が行われ、その際には感染した細胞培養の培地が集められ、孔径0.45μmのフィルターで濾過され、新たに培養された細胞に付け加えられる（図５）。
　すでに述べたとおり、組み込まれたプ口ウイルスcDNAは感染した細胞内で感染力のあるウイルス粒子を生産することができず、感染した細胞の培地には感染力のあるウイルス粒子は存在しない、したがって、「再感染」においては、感染力のあるウイルス粒子が集められて培養されることはない。「再感染した」細胞は、染色体に組み込んだプ口ウイルスcDNAを全く持っていない。このようなゲノムDNAはLM-PCRテストにおいて信頼できず、LTR-Tagsは示されない（図５）。
　遺伝子組み換えレンチウイルスベクターが感染した細胞内で無能力か否かを調べるLM-PCRテストは、結果は完全に反復可能で正確であり、偽陽性や、HIV-1配列の直接的なPCR増幅における汚染を回避することができる。
＜ヒトテロメラーゼ逆転写酵素による遺伝子導入の制御＞
　hTERTは、DNA複製中に、テ口メア反復配列を合成する。また、hTERTは、細胞増殖の段階と関係している。そして、hTERTは、増速中の細臨内では活発に活動し、静止した細胞内ではあまり活動しない。ヒトのがんの約90%で、hTERTの活動が活性化している。hTERT遺伝子発現は、主に転写レベルで制御される。したがって、hTERTプロモーターは、ヒトの細胞内のhTERTの活動を制御する主要な要素である。
　その上、hTERTプロモーターはほとんどのヒトがん細胞内で活性化しているので、がん細胞でのみ異種遺伝子発現を制御するための特定の転写スイッチとしても用いることができる。
　hTERTプロモーター構築pGL-1375は、京哲（きょう　さとる）博士（金沢大学）から提供されたものである。プラスミドpGL-1375内で、1.4kbのhTERTプロモーターDNA断片をMLu I及びBg l II部位に挿入する。プロモーターは、ベクタ一内で、ルシフェラーゼ遺伝子発現を増幅させる。hTERT5'上流配列のGeneBank割り当て番号は、AF128893である。pGL-1375ベクター内では、1.4kbのhTERTプロモーターDNA断片は、hTERT遺伝子配列の最初のエクソンを含んでいる。
　pGL-1375ベクター内では、1.4kbのhTERTプロモーター配列の3'末端の+6から+45ヌクレオチドにダウンストリームEボックスがある。1.4kbのhTERTプロモーター配列の3'末端の+6から+45ヌクレオチドにおけるこのダウンストリームEボックスは、ヒト造血幹細胞、又は第3染色体トランスフェクションを行ったヒトがん細胞内で、転写抑制の役割を果たす。
　多くのヒトのがんやがん細胞系統においては、この転写抑制作用が、遺伝子の不安定性や、遺伝子の突然変異や、何らかの不明な理由によって失われており、それによって、このEボックスは、転写活性因子となる。
　1.4kbのhTERTプロモーターDNA断片は、遺伝子組み換えレンチウイルスベクタ-pRBL001において組み立てられる。
＜CDC6 shRNAを生産する遺伝子組換えレンチウイルスベクタ-THTDの生産＞
　遺伝子組み換えレンチウイルスTHTDは、レンチウイルス導入遺伝子プラスミドベクタ-pRBL001から作製される。プラスミドpRBL001においては、CDC6 shRNAのために合成された二重鎖のオリゴヌクレオチドが複製され、転写のためにhTERTプロモーターの制御下に置かれる。
　CDC6 mRNAのGeneBank割り当て番号は、NMOO1254である。
　pRBL001においては、合成されたオリゴヌクレオチドCdc6-5-Aの配列は:
GATCCCCAGGCACTTGCTACCAGCAATTCAAGAGATTGCTGGTAGCAAGTGCCT TTTTTGGAAA
であり、Cdc6-3-Aの配列は:
AGCTTTTCCAAAAAAGGCACTTGCTACCAGCAATCTCTTGAATTGCTGGTAGCAAGTGCCT GGG
である。
　二重鎖のオリゴヌクレオチドを作るために、等量のCdc6-5-AとCdc6-3-Aが混合されて変性され、再び徐冷される。末端を平滑化した後、二重鎖オリゴヌクレオチドは、EcoR V部位のサブクローンベクターであるpBlueScriptに挿入される。DNA配列は、正しくクローンするために行われる。
　サブクローンはXba I部位において直線化によって改変され、末端を平滑化されてMlu Iリンカーによって移管される。Mlu I及びBgl IIによるpGL3-1375の分解によって、hTERTプロモーター配列を含む1.4kbのDNA断片は精製され、Cdc6の二重鎖オリゴヌクレオチドをMlu I及びBamH I部位に運ぶサブクローンベクターにクローンされる。
　正しいサブクローンにおいては、Mlu IとXho Iの二重分解がhTERTプロモーターを含む1.5kbのDNA断片とCdc6オリゴヌクレオチドを切断する。pRBL0O1を作るために、分解された1.5kbの断片が精製されてpTHTKベクターに挿入される。
　293T細胞のプラスミドDNA同時転写によって、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDがpRBL0O1とpCMV-VSV/Gを細胞内に導入することで生成される。偽感染ウイルス粒子は、感染力のあるウイルス粒子となる。
　遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDは、増殖中か分化型か非分化型かにかかわらず、多くの異なる種類のヒト細胞に感染可能である。野生型HIV-1株NL4-3とは異なり、THTDは感染した細胞内で複製できない。
＜遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDの生物学的機能の実験及び特定＞
　感染した細胞においては、hTERTプロモーターは、CDC6 shRNAの前駆物質の転写を開始させる。これらの前駆物質が二重鎖shRNAを形成し、CDC6 mRNAを分解するための特定のRNA干渉物質として完成する。感染した細胞内におけるTHTDを介した遺伝子導入は、CDC6 shRNAの機能によってCDC6 mRNAの分解を引き起こし、Cdc6タンパク質の98％が使い尽くされる（図６）。
　感染した細胞内におけるTHTDを介した遺伝子導入によって、Cdc6ノックダウンは、ヒト神経芽細胞腫LA-N-2細胞とCHLA-255細胞のアポ卜ーシスを引き起こす（図７）。
　THTDを介した遺伝子導入はヒト乳がんMCF7細胞の大規模な細胞死を引き起こすことはできなかったが、代わりに、Cdc6ノックダウンによってがん細胞が老化した（図８、図９）。
　CDC6 shRNAの機能によるCdc6ノックダウンは、ヒト乳がんMCF7細胞の老化を引き起こすことが示された（図８）。
　CDC6 shRNAの機能によるMCF7の老化は、細胞老化特異的ヘテロクロマチン構造の形成を引き起こし、細胞増殖作用が失われた。Cdc6ノックダウンは、偽感染MCF7細胞と共に、H3K9me2に対する抗体と結び付けられる。
　間接的な免疫蛍光染色により、これら偽感染細胞と比較して、Cdc6ノックダウンMCF7細胞の核におけるH3K9me2の陽性染色の、全体にわたる増大が明らかになる。
共焦点蛍光顕微鏡により、集積したH3K9me2を有する灰色の構造の核が明らかになる。この変化は、偽感染細胞と対照的であり、偽感染細胞の核では均一に分散したH3K9me2染色が観察される（図９）。
　CDC6 shRNAの機能によるCDC6 mRNA発現の阻害は、MCF7がん細胞内のCdc6の枯渇をもたらす（Cdc6タンパク質の70～98％が枯渇した）。しかしながら、細胞は生きており、大規模な細胞死は、p53がプラスミド転写によって細胞内に導入された時に起きる（図８）。
　親のMCF7がん細胞内では、Cdc6が抗腫瘍タンパク質であるp16INK4aを阻害し、腫瘍細胞の増殖を促進させる。親のMCF7がん細胞内では、p16INK4aレベルの上昇が示されたが、Cdkタンパク質の阻害作用は不活性であった。親のMCF7がん細胞内では、サイクリンCdk4キナーゼの活動が異常に活性化していた。
　Japan Lapian's Corporationは、DタイプサイクリンCdk4活性の阻害においてp16INK4aを検知するタンパク質キナーゼアッセイのインピト口方法を用いた（詳細は後述。図１０及び図１１参照）。
　親のMCF7がん細胞内では、DタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼの活発な活動が、網膜芽細胞腫タンパク質のC末端のリン酸化を引き起こした。リン酸化が進んだ網膜芽細胞腫タンパク質は転写因子であるE2Fを制御できなくなり、Rb-E2Fが転写抑制因子から活性化因子に変化した。
　THTDを介したMCF7細胞の遺伝子導入においては、Cdc6の欠乏がp16INK4aの再活性化をもたらした。THTDを介した遺伝子導入におけるp16INK4aの再活性化は、サイクリンCdk4キナーゼの活動再開を阻害する機能を有し、サイクリンCdk4キナーゼによって網膜芽細胞腫タンパク質がリン酸化することを防ぐ（図１１ レーン 3、レーン 4）。
　Cdc6 shRNAによるCdc6欠乏の生物学的効果はMCF7細胞内において非常に優勢であるため、DNA転写によるCdk4タンパク質の過生成でさえも、再活性化したp16INK4aによるCdk阻害作用に打ち勝つことはできない。このことは、がん細胞の増殖抑制は、Cdc6 mRNAの発現抑制とCdc6タンパク質の欠乏によって達成可能であることを示している。
＜ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍に対するAJS2010の直接接種＞
　AJS2010、すなわちCDC6 shRNAを生み出す遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTDの商業名を、ヌードマウスに移植されたヒト乳がんBap-7腫瘍細胞に対して直接接種する動物実験が行われた。それぞれのグループのマウスは、週に2回、3週間腫瘍病巣の複数の場所に接種され、最終接種から48時間後、頸椎脱臼による安楽死処分となった。
　偽薬の投与を受けた対照群のマウスは、腫瘍病巣に、1倍のリン酸生理食塩緩衝液を接種された。接種後、週に2目、それぞれの腫瘍の長さと幅が計られた。計測にはstandard caliperが用いられ、マウスは腫瘍が切除されて計られる前に頸椎脱臼によって安楽死させられ、病理観察が行われた。一体あたりAJS2010中のタンパク質の275μgが用いられた場合、移植された腫瘍の増殖は34.70％阻害され、腫瘍の平均重量は、陰性対照の場合と比べて明らかに小さかった（P<0.02）。
　「+++」の組織切片が、腫瘍組織の病理の評価において最大の繊維増多を示した。AJS2010中のタンパク質275μgの接種は、腫瘍組織内で強力な線維化をもたらし、腫瘍の成長を抑制した。
＜遺伝子組換えレンチウイルスベクターとウイルスプラスミドDNAマッピング＞
　図１は、pTHTKベクターの図である。pTHTKにおいては、ほとんどのHIV-1ウイルス遺伝子が保たれている。6342番目のKpn I部位から7512番目のBgl II部位までのDNA断片が削除され、これによってHIV-1エンベロープ遺伝子が欠損する。
　Mlu Iリンカーは、太い短い縦線で示されている。図２の下側は遺伝子組み換えレンチウイルス導入遺伝子ベクターpRBLO01の図解であり、上側はプラスミドDNAマッピングを示すアガ口ースゲルの図である。図中において、hTERTプロモーターは、転写方向を示す矢印と共に長方形で表されている。灰色の長方形は、CDC6 shRNAを生み出すヌクレオチドを表している。
　制限酵素の部位は、RI: EcoR I， Sal: Sal I， Mlu: Mlu 1， Nhe: Nhe I，and Xho: Xho Iのように示されている。2つのLTRボックスは、HIV-1の長い末端反復を表している。
＜III-2. 遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの複製無能力を確かめるためのLM-PCR及びLTRタグ法＞
　図３は、LM-PCRの検知及びLTR-Tag試験のためのBpm I部位の生成を示す。Bpm Iはclass II S制限酵素であり、ポジション16ヌクレオチドの下流において、認識部位を認識して切り取ることができる。Bpm Iは5' LTRのU5領域の3' endに位置しており、最後に保存された5'-CA-3'二重ヌクレオチドが保たれている。Bpm I部位はHIV-1 cDNA分解後に3' LTRのU5領域にコピー可能であり、組み込み部位の宿主染色体DNAに隣接している。
　したがって、Bpm Iは、ポジション14ヌクレオチドにおいて、染色体DNAをプロウイルスcDNAの3' endにおける5'-CA-3'二重ヌクレオチドに切り分ける。
　図４は、遺伝子組み換えウイルスベクターの感染及び組み込みがあるか否か、及び、感染した細胞内に感染力のあるウイルスベクターが生産されているか否かを検知するためのLM-PCR法、すなわちTR-Tag技術分析である。感染した細胞内の遺伝子組み換えレンチウイルスベクターのプ口ウイルスcDNAからLTR-Tagが検出された。PCRゲル図において、「－」は、LTR-Tagの陰性対照、すなわち反応においてテンプレートDNAが存在しないことを示し、「＋」は、LTR-Tagの陽性対照を示す。この反応においては、クローンされたLTR-TagテンプレートDNAが付け加えられる。PCR反応の全てにおいては、テンプレートの一方の末端は遺伝子組み換えレンチウイルスcDNAであり、他方の末端はリンカーアダプタ一由来の配列であり、それらの間には、組み込み部位の宿主染色体由来の14-bpのランダムなゲノムDNAが存在する。PCRの中から異なる順方向プライマーが選択されるためLTR-Tagの長さは様々である、他方、逆方向プライマーは、配列がリンカーアダプターに由来しているため、常に一定である。
　図５は、THTKプロウイルスcDNAを検知するLM-PCRである。HeLa/tat細胞は、遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTKに感染している。細胞は、感染後、異なる時点において培養される。ゲノムDNAは隔離され、LM-PCR検出のためにLTR-Tagが準備される。PCRプライマーはBHU5-S2とHDA/SBOTであり、PCR増幅は138bpのDNA断片を示す（矢印で示す） 。
　THTKに感染した細胞内及び安定的な細胞系統においてはLTR-Tagが検出可能である。しかしながら、「偽感染」すなわちTHTKに感染したHeLa/tat細胞から集められ、新鮮な培養細胞によって培養された（再感染）培地は、LM-PCRにおいて負の結果を示す。138bpのLTR-Tagは、「偽感染」の細胞から異なる時点、で集められた隔離されたゲノムDNAから増幅することができなかった。この結果は、THTKが感染した細胞内において無力であることを示している。
＜III-3. ヒト神経芽細胞種LA-N-2及びCHLA255細胞とヒト乳がんMCF7細胞のTHTD感染によるCdc6ノックダウン＞
　図６は、CDC6shRNAを生み出す遺伝子組み換えレンチウイルスベクターに感染した細胞内におけるCdc6の発現阻害を示すウエスタンブロットである。LA-N-2細胞、CHLA255細胞、及びMCF7細胞は、THTDに感染している。これらの細胞はまた、対照としてスクランプル配列を生み出すTHTPに感染し、偽感染させられている。感染後48時間で、細胞が培養されて細胞抽出液が準備される。それぞれの感染細胞から同量の抽出液内タンパク質がSDSポリアクリルアミドゲル上に分離される。
　ウエスタンブロットにおいては、Cdc6の発現を証明するために抗ヒトCdc6モノク口一ナル抗体が用いられる。ウエスタンプロットの結果は、Cdc6の発現は、偽感染した細胞及びTHTPに感染した細胞においては影響を受けないことを示した。
　しかしながら、THTDに感染した細胞内のCdc6発現は、CDC6 shRNAによるCDC6 mRNAの分解により、98％も減少した。図７は、Cdc6の欠乏がヒト乳がん細胞のアポトーシスをもたらすことを示す。LA-N-2細胞はCDC6 shRNAを生み出すTHTD細胞、又はスクランブル配列を生み出すTHTP、又は偽感染させられる。感染から48時間後、Annex V及び7-AAD染色のために細胞が培養される。染色された細胞は、フローサイトメトリー機械によって分析される。偽感染した細胞では、Annex V染色はわずか3.6％であり、THTPに感染した細胞では、10.0％であった。
　しかしながら、THTDに感染した細胞においては、31％ものAnnex V染色が表れた。このことは、プログラムされた細胞の死を示している。細胞抽出物から同量のタンパク質がSDSポリアクリルアミドゲル上に分離され、ウエスタンプロットによって、THTDに感染した細胞においてはアポトーシス促進性タンパク質であるBaxが増加しており、抗アポトーシス性のBcl-2は減少し、死んだタンパク質であるBim及びミトコンドリア外膜透過（MOMP）の活動と関連するBadには変化がないことが示された。
　図８は、Cdc6の欠乏がヒト乳がんMCF7細砲に老化をもたらすことを示す図である。MCF7細胞は最初にスライド上に播かれ、THTD、THTPに感染、及び偽感染させられる。感染から48時間後、スライドはSA-β-GaL試薬によって染色される前に1×PBSで洗浄され、ホルムアルデヒドで固定される。染色された細胞は、蛍光顕微鏡で観察される。偽感染及びTHTPに感染したMCF7細胞は背景と同じ染色を示しており、他方、THTDに感染したMCF7細胞は、緑色又は青色で染色されている。これは細胞増殖の老化を示している。
　老化した細胞は生きているが、大規模な細胞死が、腫瘍抑制因子p53タンパク質を生み出すプラスミドによる細胞転写の後に起きる。空のプラスミドによる細胞の転写は、大規模な細胞死を示さない。
　図９は、Cdc6が欠乏したMCF7細胞が老化することを示す図であり、がん細胞の核における特別な染色体構造の変化が起こる、すなわちSAHFの形成である。まずMCF7細胞をスライド上に蒔種し（100mm２あたり細胞0.1×10４個）、THTD、THTPに感染させ、及び偽感染させる。感染の48時間後、まずスライドを1×PBSで洗浄し、その後ホルムアルデヒドで固定する。間接的な免疫蛍光染色が抗H3K9me2抗体を用いて行われる。THTDに感染した細胞の核においては、SAHFが粒状構造を示し、他方偽感染した細胞においては、核は均一に染色されている。
　図１０は、生体外におけるCdk4タンパク質キナーゼ反応を示すカーボン画像である。（上）：キナーゼ反応において基質として用いられる遺伝子組み換えタンパク質Rh-C（帯）は、複数のCdk4タンパク質キナーゼ反応部位を含む（点）。（下）：反応チューブ内においてＤタイプサイクリンCdk4錯体を含むp16INK4a抗体免疫沈降（IP） を、Rb-C基質及びATP分子と共に添加する。タンパク質キナーゼ反応の後、SDS-ポリアクリルアミドゲル分離を行う。部位特異的リン酸化Rb-Cに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行う。信号が強ければ強いほど、Rb-Cのリン酸化が激しい。
　図１１では、MCF7細胞はCdc6ノックダウンのためにTHTDに感染しているか、又は感染多重度1.0で偽感染している。感染2日後、細胞抽出液を調製する。全細胞抽出液（約1000μgのタンパク質）を、抗P16INK4aモノク口ーナル抗体と混合する。
　免疫沈降（IP）を4℃で一晩進行させる。インビト口でのキナーゼ反応を、Rb-C基質及びATPと混合したIPビーズの1/4を用いて準備し、製造元の指示に従って反応を37℃で30分間インキュベートする。特定のRb-Cリン酸化を、抗Phospho Ser780抗体（上パネル）、又は抗Phospho Ser807/811抗体（中パネル）を用いたウエスタンブロッティングで決定する。マウスIgG信号をIP対照として提示する（下パネル）。
　レーン 1では、マウスIgGを用いてIPを行う。MCF7親細胞における極めて高いＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ活性は明らかであり、これは、Rb-Cの強いリン酸化を示す（レーン 2）。THTD感染によるCdc6ノックダウンはCdc6の枯渇を引き起こし、これは、ＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ活性を阻害し、Rb-Cリン酸化信号は極めて弱くなる（レーン 3及びレーン 4）。
　図１２では、MCF7細胞はTHTD（レーン 5）若しくはTHTP（レーン 4）に感染するか、又は偽感染（レーン 3）する。感染２日後、細胞をpSK-J3を用いてトランスフェク卜する（Cdk4-HA生成のため;レーン 3～5） か、又はpSK-HAを用いてトランスフェク卜する（HA-tag対照;レーン６）。細胞抽出液を調製し、様々な抗体を用いたIPに供する。
　上パネル:各IP試料をキナーゼ反応に添加し、インビトロRb-Cリン酸化を実施する。リン酸化Rb-Cを、抗Phospho ser807/811抗体を用いたウエスタンブロッティングで試験する。
　下パネル:マウスIgGを負荷対照として提示した。HA-Cdk4の過剰発現により、内因性Cdk4にわたる持続可能なRb-Cリン酸化が起こる（比較レーン 3及びレーン 7）。
　しかしながら、HA-Cdk4の強制的な過剰発現によって持続可能なレベルのRb-Cリン酸化を起こすことができない場合でさえ、p16INK4a Cdk阻害性の再活性化は、ＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ活性より優勢である（レーン 5）。非特異的ヌクレオチドを生成する遺伝子組み換えレンチウイルスベクターTHTPは、HA-Cdk4によるRb-Cリン酸化に何の影響も示さない（レーン 4）。
　しかしながら、Cdc6の枯渇を引き起こし、P16INK4aの再活性化を誘発するTHTD感染は、Rb-Cリン酸化におけるHA-Cdk4タンパク質キナーゼ活性を強く阻害し（レーン 5）、これは、Cdc6欠乏によるP16INK4aの再活性化の際のがん細胞増殖の抑制を示す。
＜本発明の実験方法および材料＞
＜遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの生成＞
＜プラスミドDNAトランスフェクション＞
　クラスIIの安全キャビネット中で、15mlのDMEM/高グルコース（米国ユタ州、Hyclone社製）完全培地（ウシ胎児血清10％及び適切な抗生物質を補充）をT75フラスコに加え、ヒト胎児由来腎臓293T細胞に接種する。
　5％C02インキユベータにおいてこの293T細胞を37℃で成長させ、培養物を10個のT75フラスコに増幅する。
　オートクレーブ処理した1.5ml微量遠心管に170μlのpRBL001、30μlの1μg/ml pCMV/VSV/G 、50μlの3M酢酸ナトリウム（pH5.3）を添加し、続いて1mlの100％エタノールを添加し、溶液を混合して、-80℃で60分間冷却する。
　13000rpmで15分間遠心脱水し、溶液を捨て、1mlの70％エタノールを添加し、13000rpmで5分間違心脱水する。工タノールを注意深く捨て、DNAペレットを空気乾燥する。
　500μlのオートクレーブ処理したdd H2Oを添加して、DNAを溶解させる。
　クラスIIの安全キャビネット中で、50mlの清浄な試験管に以下:
a） 500μlのプラスミドDNA
b） 1650μlのオートクレーブ処理したdd H2O
c） 350μlの2M CaCl2
を添加し、溶液を優しく混合した後、2500μlの2×HEPBSを、一滴ずつ優しく撹拌しながら滴加する。大きな沈降物の形成を回避する。
　2× HEPBS 100 ml :
HEPES（酸性塩） 1g
NaCl 1.6g
Na2HP04 （0.25M）0.75ml
KCl（1M）1ml
NaOH （5M）を用いてpHを6.9に調整し、続いてNaOH（1M）を用いてpHを7.12～7.14に微調整する。クラスIIの安全キャビネット中で、孔径O.22μmのシリンジフィルタに溶液を通過させた後、2×HEPBSを使用する。
　試験管を室温に20分間置く。
　293T細胞のT75フラスコ10個を取り出し、培地を捨て、続いて各フラスコに12mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。
　500μlのトランスフェクション混合物を各フラスコにゆっくり添加し、培養物を5％C02インキュベータ内で37℃で8時間インキュベートし、続いて培地を捨て、各フラスコに15mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。
　細胞を5％C02インキュベータ内で37℃で36時間インキュベートする。
＜ウイルス培地の回収及びp24アッセイの実施＞
　トランスフェクシヨンの36、72、及び96時間後、クラスIIの安全キャビネット中で培養培地を回収する。トランスフェクションの36及び72時間後に培地を回収した後、各フラスコに15mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加するが、96時間後に回収したものには添加せず、細胞を5％C02インキュベータ内で37℃で成長させ続ける。
　トランスフェクションの96時間後、培地を回収して各フラスコの10％の漂白剤を添加し、30分後に溶液を捨て、フラスコ及び使用したピペットをオートクレープ処理に供する。
　回収した培地を含む50ml試験管それぞれを、3000rpmで4℃で5分間遠心脱水する。
　200 μlのウイルス培地を採取し、1×PBSを添加して50～200倍に希釈し、その後p24 ELISAアッセイを行ってウイルスベクターの力価を決定する。
　p24 ELISAキットは、米国フ口リダ州マイアミのCoulter Inc.製である。
10×PBS 1000 ml:
塩化カリウム（Sigma P9333） 2g
リン酸カリウム、一塩基性（ACROS 205925000） 2g
NaCl （Sigma S7653-1KG） 80g
リン酸ナトリウム、二塩基性（ACROS 204855000） 11.5g
ddH2Oを添加し、最終的な体積を1000mlとする。
＜AJS2010の濃縮及び精製＞
　清浄した培地を250ml高速遠心分離ピンに回収し、9000×g及び4℃で60分間遠心脱水する。
　Vivaspin 20 （米国ニューヨーク州、Sartoriu製）を用いて培地を限外濾過し（1000kDa mw. co.）、体積を1/5に削減する。
　沈殿したウイルスベクターにMMPを添加し、4℃で一晩保つ。
MMP溶液300ml：
PEG 8000 （遺伝子工学グレード） 90g
NaCl（超高純度） （5M） 30ml
オートクレーブ処理したddH2Oを添加し、300mlにする。
9000×g及び4℃で30分間遠心脱水する。
浮遊物を捨て、ペレットを10 mlの1×PBS中で再懸濁する。
Slide-A-Lyzerカセット（20kDa mw. co. 米国イリノイ州、Thermo Scientific製）を用いて、再懸濁した溶液を1×PBS について4℃で透析し、1×PBSを24時間毎に2日間交換する。
AmiconUltra15（100 kDa mw. Co. 米国マサチューセッツ州、Millipore製）を用いて、ウイルス溶液を30倍に濃縮する。
精製したウイルス溶液を孔径0.45μmのシリンジフィルタに通過させ、調製物を-80℃で貯蔵する。
＜RT-PCRによる遺伝子組み換えレンチウイルスベクターの感染の検知＞
　クラスIIの安全キャビネット中で、MCF7細胞を1ウェルあたり2×105個の細胞となるように6ウェルプレートに蒔種し、3ml/wellのDMEM/高グルコース完全培地を添加する。
　細胞をインキュベータ内で、37℃及び5％ CO2で24時間成長させる。倒立顕微鏡で細胞を観察する。細胞成長は約80％の集密度であるものとする。
　プレートを取り出し、クラスIIの安全キャビネット中で培地を捨て、2ml/wellの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。1×PBSを用いて、適切に希釈されたウイルス溶液を作製する。
　続いて、特定のウェルに以下を添加する:
A1：1×PBS　20μl；
A2及びA3：1：102希釈ウイルス培地　20μl；
B1及びB2：1：101希釈ウイルス培地　20μl；
B3：20μl非希釈ウイルス培地
　細胞を5％C02インキュベータ内で37℃で8時間インキュベー卜する。倒立顕微鏡で細胞を観察する。細胞は健康であり、視認できるいかなる汚染も存在しないものとする。
　クラスIIの安全キャビネット中で丁寧に培地を捨て、3ml/wellの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を添加する。細胞をインキュベータ内で、37℃及び5％CO2で、48時間成長させる。
　細胞を1×PBSを用いて3回洗浄し、細胞をウェルの表面からラバーポリスマンを用いて掻き取り、細胞を15ml低速遠心分離チューブ内に回収し、1×PBSを12mlになるまで添加し、3000rpmの遠心分離を行う。溶液を捨て、細胞ペレットをドライアイスで30分間冷凍する。
　1000μlのGTC緩衝液を各試験管に添加し、細胞抽出液を18 G1/2針に5回通過させることにより細胞をホモジナイズし、その後各試験管に1000μlの水飽和フェノール、1000μlのク口口フォルムを添加し、ボルテックスして混合する。
　続いて、各試験管に3mlの1M酢酸ナトリウム（pH5.3）を添加し、ボルテックスして混合する。試験管を9000×9及び4DCで10分間違心脱水する。上相の溶液を新鮮かつ清浄な50ml試験管に移し、0.6～1.0体積のイソプロパノールを添加し、試験管を5回ひっくり返すことにより溶液を混合し、室温で一晩置く。9000×9及び4℃で15分間遠心脱水し、溶液を捨て、RNAピペットを75％イソプ口パノールで洗浄して、RNAを-80℃で貯蔵する。
　GTC緩衝液300ml：
チオシアン酸グアニジン（mw. 118.16） 6M 212g
クエン酸ナトリウム（mw. 294.1） 25mM 2.2g
サルコシル（10％w/v） 0.5％ 12ml
使用前に、1.4mlのβ-メル力プトエタノールをGTC溶液20ml毎に添加する。
　RNA試料を採取する際、試験管を30秒間ボルテックスし、200～30OμlのRNA溶液を採取し、これをオートクレーブ処理した1.5ml微量遠心管に移し、13000rpm及び4℃で15分間遠心脱水する。
　溶液を捨て、75％エタノールを1ml添加してペレットを洗浄し、13OOOrpm及び4℃で5分間遠心脱水する。
　溶液を捨て、RNAペレットを空気乾燥する。RNAを10μlのオートクレーブ処理したddH20に再び溶解させる。
　2μlの10×DNase I緩衝液、5μlのオートクレープ処理したdd H2O 、1μlの1:5に希釈したDNase Iを添加し、室温で3O分間インキュベー卜する。
　2μlの10％ SDSを添加し、68℃で15分間インキュベートする。
　150μlのTE（pH8.0）を添加し、続いて2μlの5M NaCl、100μlのフェノール、100μlのク口口フォルムを添加し、ボルテックスして混合し、13000rpmで5分間遠心脱水する。
　TE緩衝液50ml：
10mM Tris-HCI、pH8.0 1M 500μl
1mM EDTA 500mM 100μl
オートクレーブ処理したdd H2Oを50mlになるまで加える。
　上相の溶液を新鮮かつ清浄な試験管に注意深く移し、各試験管に1μlの10mg/mlグリコーゲン、次に1000μlの無水エタノールを添加し、-20℃で一晩又は-80℃で30分間冷却する。
　13000rpm及び4℃で15分間遠心脱水し、溶液を捨て、1000μlの75％エタノールを添加し、13000rpmで5分間遠心脱水する。溶液を注意深く捨て、RNAペレットを空気乾燥する。
　cDNAを増幅する逆転写反応及びPCRのために、RNAを20μlのオートクレーブ処理したdd H2Oに再び溶解させる。
　RT-PCR試料は、各逆転写につきRNA200μgとなる。
　逆転写（RT）反応における第1のストランドcDNA合成は、以下の通りである:
10μlのDNase 消化済みRNA（約200μg）に、1μlの10mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPストック、1μlのRNasin （30単位/μl、Promega製）、2μlの10×PCR緩衝液、1μlのO.1μg/μlランダムプライマ（ランダムヘキサマ）、1μlの50 mM MgCl2を添加し、優しく混合した後、1μlのMo-MuLV逆転写酵素（200単位/μl）を添加し、回転により2秒間混合し、まず室温で10分間、続いて42℃で60分間インキュベー卜する。
　これが終わると、RT反応試験管を1OO℃の水浴で15分間煮沸し、氷上で5分間冷却する。溶液を4本の試験管に分け（各試験管に等しく50μgのRNA）、-80℃で貯蔵するか、更なる使用に供する。
　PCR反応：プライマHIV-1 NL4-3 2205（20μM）、25μl、プライマHIV-1 NL4-3 2868 （20μM） 2.5μl、RT反応、5μl、PCR混合物、40μl、PCR反応のためにThermal Cycle （Applied Biosystems製）を使用する。
　PCR混合物（6つの試料について）：
10mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPストック　6μl
10×PCR緩衝液　30μl
Taq DNAポリメラーゼ（5単位/μL）　3μl
オートクレーブ処理したddH2O　201μl
最終体積　240μl
　プライマ-HIV-1 NL4-3 2205ヌクレオチド配列: 5' CTCTC AGAAG CAGGA GCCGA TAG 3' 及び、プライマHIV-1 NL4-3 2868ヌクレオチド配列: 5'GCATC GCCCA CATCC AGTAC TGT 3'。
　PCRの後、10μlの反応物を各試験管から取り、3μlの負荷緩衝液を添加し、PCR試料を1.5％のアガロースゲルに負荷し、1×TBE内でゲルを走らせる。ゲルをエチジウムプロモフェノール（EB）溶液で染色し、ゲル上のDNAを紫外線（UV）光ボックス下で観察する。完全なPCR産物は約660bpであるものとする。pRBL001プラスミドDNA（20ng）を、PCR中で陽性対照として用いることができ、その一方でトランスフェクションされていない293T細胞由来のRNAをRT-PCR中で陰性対照として用いることができる。
　50 × TAE緩衝液1000ml
Tris Base （分子生物学グレード） 242g
氷酢酸（分子生物学グレード） 57.1ml
EDTA、pH 8.0 （分子生物学グレード） 100ml
ddH2Oを1000mlになるまで添加する。
＜LM-PCRによる遺伝子組換えレンチウイルスベクターのコンピテンスの検知＞
＜THTKにおけるBpm Ｉ部位の生成＞
　LM-PCRを実施するために、まずpTHTKを改変して新規のBpm I部位をHIV-1ゲノムに作成する。HIV-1 5'LTR領域には、3つの要素：U3、R及びU5が存在する。Bpm I部位は、PCRをU5要素の3'末端で重ね合わせることによって生成される。Bpm IはクラスIIS制限酵素である（図３）。
　Bpm Iは5'-CTGGAG-3'を認識するが、DNAを16番目のヌクレオチドの下流においてその最上位ストランドで、また、14番目のヌクレオチドの下流においてその最下位ストランドで切り取ることができ、2ヌクレオチド3'オーバーハンガを作成する。
　この5'LTRのBpm I部位を、U5要素の3'末端の3'LTRに、感染細胞のプ口ウイルスcDNAの合成として複製する。
　HIV-1ゲノムに作成された新規のBpm I部位は、THTKビリオン集合、ウイルスベクター感染、及び感染細胞へのプロバイラルcDNA組み込みに何ら影響を与えない。
　コピーしたBpm I部位は、2つの保存された"5-CA-3"HIV-1の3'末端内にあり、Bpm I酵素は、ホスト細胞染色体DNAをその組み込み部位である14番目のヌクレオチドにおいて、その上流のHIV-1DNA末端に切り分ける（図３）。
＜LTR-Tagsの調製＞
　THTK感染細胞由来のゲノムDNAを単離する。DNAをKas I及びXho I 二重分解に供する。Kas I（637）は、HIV-1ゲノムに固有の部位である。Kas I分解により、Bpm I切断配列（629-645）が5'LTRにおいて分解される。
　Xho I（8892）は、HIV-1ゲノムに固有の別の部位である。Xho I分解は、HIV-1プ口パイラルcDNAの3'末端から分離したHIV-1上流プ口バイラルcDNAと、組み込み部位のホスト細胞染色体DNAとを有する。
　DNA断片を含む組み込み部位のために、特別なDNA拡張を実施するがDNA拡張のためのプライマはビオチン標識ヌクレオチド、B-NLR8950であり、そのヌクレオチド配列は5'-B-GTG CCT GGC TAG AAG CAC AAG-3'である。配列はHIV-1染色NL4-3ゲノム、DNA8950-8970由来であるo
　ストレプトアビジン磁性ビーズ（Dynabeads M-280）との結合によってビオチン化DNA拡張産物を精製する。
　DNA拡張反応は、有意に強化されたDNA断片を含むH1V -l組み込み部位を有し、また、汚染されたDNA、特に上流HIV-1プロバイラルcDNA由来の汚染されたDNAは劇的に減少している。
　DNA拡張反応:
B-NLR8950 50 μM
Kas 1+ Xho 分解DN A 10 μg
dNTPs 200 μM
Taq DNAポリメラーゼ5単位の試験管を94℃で5分、55℃で5分、及び72℃で30分インキュベートする。
　約5ピコモルのビオチン化DNAを、40ピコモルのDynabeadsM-2 80と混合し、室温で30分でインキユベートする。試験管を磁性スタンド（Dynal MPC standz）上に配置し、2分間静置した後、TE（pH8. 0）緩衝液でビーズを洗浄する。毎回1mlのTEを用いてさらに２回洗浄を繰り返す。2秒間遠心脱水し、浮遊物を捨てる。
　次に、ビオチン化DNAをBpm I分解に供する。Bpm I分解を37℃で一晩行い、DNAをDynabeads M-280によって精製した後、二重鎖オリゴリンカーと結紮する。
　二重鎖オリゴリンカーは、以下の特徴を有する:一端は2'ヌクレオチド3'オーバーハンガであり、Bpm I分解末端に対して相補的であり;他端は3'ヌクレオチド5'オーバーハンガであり、リンカーが自己結紮するのを効率的に防止する。
　二重鎖リンカーのヌクレオチド配列は、HD-A （カリフォルニア大学、UCLAのDr. Sam Chowから提供） : 5'ーCAC GCG TCG CAT CAT ATC TCC AGG TGT GAC AG-3'
、及び、HS-S （カリフォルニア大学、UCLAのDr. Sam Chow から提供）: 5'ーCCT CT GTC ACA CCT GGA GAT ATG ATG CGA CGC GTG NN-3'である（詳細は段落062及び図III-2-2参照）。
　リンカーの結紮は、室温で16時間行われる。
　結紮反応をDynabeads M-280によって精製する。
＜LTR-Tagsを増幅するためのPCR反応＞
　LTR-TagsをPCR増幅で検知することができる。
　順方向プライマBHU5-S2:5'-GAG TGC TCA AAG TAG TGT GT-3'、ヌクレオチド配列はHI V-lゲノムDNA 9617-963に由来する。逆方向プライマHDA/SBOT:5'-CT GTC ACA CCT GGA GAT ATG AT-3' ヌクレオチドシーケンスは、二重鎖オリゴリンカーHD-Sの最下位ストランドに由来する（詳細は記述部分及び図４参照）。
　PCR反応（プライマが異なる以外は段落117及び118に記載したものと同じ条件）において、ビチオン化DNA/リン力一又はLTR-TagsはテンプレートDNAである。
　PCRの後、核反応から5μlの試料を取り、ゲル（2.0％アガロース）にl×TAE中を走らせる。ゲル上で約138塩基対のDNAバンドを観察することができる（詳細は記述部分及び図４及び図５参照）。
＜インビ卜口での非放射性タンパク質キナーゼ反応＞
　反応は、遺伝子組み換えタンパク質Rb-C上でのDタイプサイクリンCdk 4タンパク質キナーゼ活性を調べるためのものである（図１０）。
　　腫瘍抑制因子P16 INK4aは、Cdk4/Cdk6と関連することができ、P16INK4aに対する抗体は、免疫沈降（IP）においてCdk4/Cdk6タンパク質キナーゼ錯体を単離することができる。
　ＤタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼは、網膜芽細胞腫タンパク質の複数のセリン及びC末端（Rb -C） のトレオニン残留部位を特異的にリン酸化する（詳細は記述部分及び図１０参照）。
　インビト口でのキナーゼ反応では、以下:基質Rb-C、DタイプサイクリンCdk4タンパク質キナーゼ錯体を含むP16INK4 a IPビーズ、及びATPを試験管に添加し、37℃で30分間インキュベー卜する。
　SDS-ポリアクリルアミドゲルを走らせてタンパク質を分離する。ウエスタンブロッティングでは、特異的アミノ酸残留部位においてphosphor-Rb-Cに対する抗体を用いる（詳細は記述部分及び図１０及び図１１参照）。
　ウエスタンブロッッティングに使用する抗体は:Cell Sinaling Technology （米国マサチューセッツ州ダンバーズ）製の、抗Phospho Ser780及び抗Phospho Ser807/811である。
＜その他の発明＞
　ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）を組換え、レンチウイルスベクター由来のpRBL001ウイルスベクターを開発した。RNA内部には特殊な配列が含まれ、RNAの逆転写過程中に1種の三重螺旋のcDNA構造（Central DNA Flap） を形成し、その被膜成分は、現在広く用いられている水痘性口内炎ウイルスＧ（VSV-G）タンパク質より生まれる。共同トランスフェクション（Co-transfection） 法によって、遺伝子工学的に改造したプラスミド（Plasmid）とVSV-G遺伝子のプラスミドをパッケージング細胞内へ引き入れ、高活性の核酸タンパク質複合体が産生される。pRBL001は、DNAトランスフェクションを介してinvitroで、培養したヒト胚性腎臓293T細胞に導入することができ、複製無能感染性レンチウイルス粒子を生成することができる。
　pRBL001組換えレンチウイルス粒子は、in vitroでのヒト細胞株の様々ながん細胞に感染することができる。
　レンチウイルスベクタ-pRBL001が感染した細胞内での遺伝子伝達を介したヒトCDC6タンパク質mRNA（CDC6 shRNA）に対する短いへアピンRNAを生成する;
pRBL001 の感染細胞内でCDC6mRNAの分解を引き起こすことを可能とする;
DNA複製開始点を認識してCDC6のノックダウンにおけるRNA干渉（RNAi） の結果、CDC6 mRNAを分解する。これによってがん細胞の無限増殖機能を停止させる。
　DNA複製開始点を認識したpRBL001組換えレンチウイルスベクターは、細胞内への感染を介してCDC6をノックダウンする:pRBL001のRNAiによって神経芽腫細胞ではアポトーシスを引き起こし、ヒト乳がんMCF7細砲では、老化につながる。
　pRBL001はヒーラ細胞（40×O.6）を7日で、消滅させる。
pRBL001組み換えレンチウイルスベクターは、正常細胞に無侵襲ながん分子標的療法を可能とする。これは、ヒトテロメラーゼをプロモーターとする。
ヌードマウスの実験では、腫瘍の成長が（がんヌードマウス1あたりのウイルス粒子275μg精製したタンパク質含有量）によるヒト乳がんMCF'7腫瘍に直接注入によって4.7％が阻害されています。
　pRBL001は乳がんの成長を阻害することができる。
　ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）を組換え、レンチウイルスベクター由来のpRBL002を開発することができる。
　pRBL002が感染した細胞内での遺伝子伝達を介しサイクリンD、CDK4/6を阻害し、PRBタンパク質を活性化しE2F蛋白を抑制するために細胞周期のG1/S期を停止する。
　pRBL002は、TGF （トランスフォーミング増殖因子）-βシグナルの標的となるCDK4/6のインヒビターである遺伝子にコードして、これらのキナーゼを抑制し、CDK4/6に結合している大量のp27を引き離して、CDK2複合体を抑制できるようにすることでがん細胞のG1/S期を停止させる。
　pRBL2013Tが感染した細胞内での遺伝子伝達を介し、PTENを活性化させPIK3を介した経路の脱リン酸化の触媒として機能する。これによって分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（MAPK） 経路、AKT・哺乳類ラパマイシン標的蛋白（mTOR）経路の活性化を阻害する。pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tいずれも、一種の低分子のウイルス・タンパク質で「PRBLVPR」を含有し、抗がん作用を有する。
「PRBLVPR」は96個のアミノ酸残基を有しているだけで、その分子量は14kDとなる。研究の結果「PRBLVPR」は多種の生物学的な機能を有しており、細胞の増殖周期を遮断し、細胞がアポトーシスに入るのを誘発する。
「PRBLVPR」は、G2からM期における増殖周期を特異的に遮断できる。研究の結果、以下のことが認められた。M期の駆動タンパク質は相互に作用し、駆動タンパク質の活性を抑制して、細胞周期の停滞をもたらす。一方では、「PRBLVPR」はCdc2細胞周期プ口テインキナーゼの活性化を阻害でき、DNAの複製を遅延させ遮断することさえもできる。
　別の一面では、「PRBLVPR」とタンパク質リン酸化酵素2A（PP2A）は複合体を形成し、G2期にタンパク質Cdc25の脱リン酸化反応の調整コントロールを増強し、Cdc25の機能を抑制させるので、駆動タンパク質は刺激活性されず、細胞周期は遮断されるに至る。
　「PRBLVPR」の作用下で、細胞は長時間のG2期の遮断を経ても、M期に入ることができるが、ただ多極紡錘体（MultipolarSpindles） を産生するだけで正常の有糸分裂を産生できない。この種のG2期からM期を遮断された細胞内では、染色体中心体（Centrosoma） が継続して倍増するが、染色体DNA断片の形成を伴わない。
　しかしながら、「PRBLVPR」が細胞増殖周期を遮断した後に、もしがん細胞がなお成長シグナルの刺激を受けると、まもなくアポトーシスを誘発する。
　pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tは，テ口メラーゼ鋳型配列を含有している。
　ヒトテ口メラーゼ逆転写酵素（HTERT Human Telomerase Reverse RNA）で、重要な逆転写酵素を促進する成分を有しており、テロメアRNAを鋳型にし、ヌクレオチドを複製した染色体DNAの末端に逐一加入させ、重複するTTAGGG配列を含有する特殊なDNA構造を形成する。
　逆転写酵素HTERTとは「HTERT」の活性は人体細胞内で厳しいコント口ールを受けていて、[Hter]遺伝子転写も「HTERT」酵素活性をコントロールする一つのキーポイントの場所で、「HTERT」のmRNA発現水準と状態は「HTERT」の細胞中の活性と特異な関係を有している。研究の結果、以下のことが分かった。
多くのテロメア複製酵素陰性の細胞内では、検出するとテロメア配列の[Hter]遺伝子転写のmRNAを含有しているが、「HTERT」のmRNAは腫瘍細胞中のみで大量の転写がある。そして「HTERT」酵素は不死化細胞（Inmmortalized Cells）および90％近くのヒ卜のがん細胞中で活性が増強する。
　これに反して、増殖周期GO期の正常体細胞内部では「HTERT」のメッセンジャーRNA（mRNA）は検出できず「HTERT」の活性もない。しかしながら「HTERT」自身はがんになれない。それはがん化するのに必要な染色体遺伝子の悪性変化を造れないことによる。がん細胞の無限の増殖は「HTERT」に依存しており、遺伝子複写の調節コントロールを通して「HTERT」遺伝子の発現を抑制し、頼粒球性白血病細胞（HL-60） の増殖を停止させ、細胞分化を発生させ、がん細胞の悪性度を次第に消失させることができる。
　「HTERT」遺伝子を分析すると、5'上流に1400bpの長さの遺伝子プロモーターが明らかになる。それはGC配列を豊富に含有し、その380bpのプロモーターの中心に、数多くの転写タンパク質SP1の結合位置が存在している。SP1は「管理者」の身分を担い、「HTERT」遺伝子転写の基本活動を始めるが、異なった「主管者」の配備も受け、遺伝子転写活性を細胞増殖状態に応じて協同活動させる。細胞内のがん抑制遺伝子Rbは、細胞周期を厳重に監督し、正常細胞をG0期に置き、染色体を調節しアセチル化過程にしてSP1の転写作用を減弱させる。
　細胞が増殖シグナル刺激を受けた時に、細胞内に別の１つのタンパク質であるがんタンパク質MycがSP1を促進して、大分子転写複合体を形成したり「超過激な活性」作用を産生し、「HTERT」遺伝子転写水準を急激に増加させる。
　380bpのプロモーターの中心内にさらに2つのCACGTGで高度な保守の「Ｅボックス」と称されるものが配置されMyc/MaxあるいはMad/Maxの結合位置を転写調整コントロールしている。
　Myc/Max結合がこの１個のＥボックス上にある時、遺伝子プロモーターは活性化され、高水準の遺伝子転写を産生する。そしてMad/Max結合がＥボックス上にある時、遺伝子プロモーターは活性を失い、遺伝子転写はそれゆえに抑制されあるいは低水準に置かれる。「HTERT」遺伝子のプロモーターは、十分に有効なコントロールシステムで、その調節を通して「HTERT」遺伝子転写をコントロールでき、細胞増殖あるいは細胞増殖の目的をコントロールできる。
　がん細胞中において染色体DNAの悪性変化によりRbがん抑制遺伝子は機能を喪失し、細胞周期は不断の増殖過程に入いり細胞増殖を伴い、Mycタンパク質は不断にSPIが「超過激な活性」反応を発生するのを促進し、Myc/Max対Mad/Maxの比は大きく増加しMyc/Maxはそれによって「HTERT」遺伝子のプロモーターの活性を有効に増強させる。
　「HTERT」遺伝子のプロモーターががん細胞内で活性化状態にあるので、遺伝子工学の方法によってこのプロモーターと特殊な検測遺伝子成分を連結し、がん細胞に特異的な発現作用を産生できる「HTERT」遺伝子のプロモーターを組み込んだLacZ の発現により、それは特異的にがん細胞中にLacZ遺伝子を発現でき、大量のLacZタンパク質を産生し同様の担体は正常細胞内では「HTERT」遺伝子のプロモーターの活性がなく、それでLacZの遺伝子発現もなく、LacZタンパク質を検出しない。
　「HTERT」遺伝子プロモーターとウイルスVPRゲノムはつながり、がん細胞中でVPR のRNAを転写でき、「pRBLVpr」タンパク質を産生し、それによってがん細胞の増殖周期を遮断し、有効ながん遺伝子治療となる。
　正常細胞内において、「HTERT」遺伝子プロモーターは活性を有しないか活性が極めて低い。
　このため、「pRBLVpr」の発現がなく細胞周期は遮断されない、以上のことからも、（p RBL001、pRBL002、pRBL2013 T ）はがん細胞に対して特異な作用を有していると分かる。
　「HTERT」遺伝子のプロモーターを組み込んだLacZの発現により、それは特異的にがん細胞中にLacZ遺伝子を発現でき、大量のLacZタンパク質を産生し同様の担体は正常細胞内では「HTERT」遺伝子のプロモーターの活性がなく、それでLacZの遺伝子発現もなく、LacZタンパク質を検出しない。
　「HTERT」遺伝子プロモーターとウイルスVPRゲノムはつながり、がん細胞中でpRBLVPR のRNAを転写でき、「p RBLVpr」タンパク質を産生し、それによってがん細胞の増殖周期を遮断し、有効ながん遺伝子治療となる。
　正常細胞内において、「HTERT」遺伝子プロモーターは活性を有しないか活性が極めて低い。このため、「pRBLVpr」の発現がなく細胞周期は遮断されない。以上のことからも、（ pRBL001、pRBL002、pRBL2013T） はがん細胞に対して特異な作用を有していると分かる。
　pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tががん細胞の増殖周期を遮断することにより、がんの無限増殖を有効に制止し、近隣の正常組織に浸潤し拡散するがん細砲に破壊されることなく、がん細胞の悪性増殖により作られる「悪疫質」を大幅に減少させることが、この遺伝子がん治療と標準がん治療の明確な相違であり、この生物学的に高度な遺伝科学技術を駆使し、腫瘍に対して「遺伝子治療」を実施することは、治療を受ける患者の身体環境の安全を確保し、治癒作用を維持する。
　pRBL2013Tウイルスベクターは、ナノ粒子アセンブリーのために使用される。材料は、非細胞毒性である。生体適合性、生分解性親水性の外殻を形成する活性化PEGである。
血液中の循環時間を増加し、最小化する免疫反応ポリカチオンポリマ-polyethylenenimine（PEI）は、負に帯電し、DNAまたはRNAを満たす。約80ナノ粒子で形成されているこれは、DNAや酵素分解からRNAを保護する構造を有する。ナノ粒子で組み立て哺乳類に発現するベクターの新しいタイプである。標的（Target）の細胞の核に対して、遺伝子を封入されたナノデバイスとして有効に効率的な遺伝子導入を行う。pRBL2013Tは、mRNAを同時に標的にして多くのCDKのインヒビターであり、サイクリンD、転写因子E2Fを標的とする。これによってがん抑制機能を持つ。
　DNA複製は、複製前複合体（プレRC）を組み立てることによって開始し、DNAの複製タンパク質複製開始点認識（Cdc6）は、DNAの複製の開始（mailandとDiffley、2005）において中心的な役割を果たしている。細胞が有糸分裂、複製開始点認識から、G1に入ると一緒にCDT1と起点認識複合体（ORC）（Duttaとベル、1997）の6つのコンポーネントにバインド複製起源に動員されている。プレRCが、起源および複製開始点認識コントロールローディング上に複製し、他のタンパク質と一緒にminichromosomalメンテナンスタンパク質（MCM）をロードすることによって形成される。G1中の複製開始点認識の安定性は、プレRC組立を規制する重要なステップである。CDC6はG1の複合体（APC）を推進後期によってユビキチン媒介タンパク質分解を対象としている。サイクリンE-Cdk2複合キナーゼは、ヒトアミノ末端複製開始点認識のリン酸化を担当し、リン酸化された複製開始点認識し（Jiangら、1999;　mailandとDiffley、2005）、安定化される。サイクリンE-Cdk2複合によって複製開始点認識複合リン酸化は、その原点はS期で分解され、DNAが（mailandとDiffLey、2005）S期ごとに1回だけ複製されることが保証される。
　ヒトの細胞では、CDC6のレベルは様々なストレスに反応して著しく変化する。DNA再複製は、それらのCDC6とCDT1過剰発現の細胞または腫瘍細胞で、p53の活性化細胞と一緒に見られる。さらに最近では、そのp53が複製開始点を認識し、その下方の遺伝子を修飾してDNA複製ストレス応答に直接複製開始点を認識する複合タンパクとしてDNA損傷へリンクする。そのリンクに対応してCDC6発現が低下されるため、DNA修復の機能として発現したp53は、検出可能な細胞周期上で再度発現を引き起こすことはない。
＜さらに別の発明＞
　本発明は、がん細胞を更正するタンパク質及びその製造方法を提供する。がん細胞を更正するタンパク質とは、がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるがん抑制遺伝子または遺伝子産生産物を発現するウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質であり、遺伝子導入されたウイルス様中空粒子、もしくは導入遺伝子産物を放出するウイルス様中空粒子の形態をとる。
　また、本発明は、ウイルス様中空粒子で包装されたがん抑制遺伝子を造血幹細胞系に導入することにより、遺伝子が組み換えられた造血幹細胞による核酸療法を提供する
　p16タンパク質（p16INK4aとも呼ばれる）は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤として知られている。
　例えば、p16遺伝子は、SEQ ID NO:23（GenBank　アクセッション番号：L27211）のヌクレオチド配列を含むか、もしくは、前記ヌクレオチド配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99％以上、例えば、99.5％又は99.9％又はこれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　p16遺伝子はまた、SEQ ID NO:24のアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。
。
　p16遺伝子は、好ましくはCDK阻害活性を有するタンパク質をコードする。
　p16遺伝子の例としては、SEQ ID NO:25のヌクレオチド配列の434から480の位置のヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。
　さらに、p53遺伝子は、SEQ ID NO:26（GenBank アクセッション番号BC003596）のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　p53遺伝子はまた、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列、またはが　アミノ酸配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。
　p53遺伝子は、好ましくは、転写因子活性を有するタンパク質をコードする。
　別の実施形態において、導入遺伝子は、shRNAをコードしてもよい。
　shRNAは一本鎖RNAである。一本鎖RNAのアンチセンス配列は標的配列に相補的であり、該アンチセンス配列に相補的なセンス配列（典型的には3 '末端にポリUオーバーハングを有する）はリンカーを介して連結される。
　shRNAは、分子内二本鎖形成を介してヘアピン構造を形成する。
　そのようなshRNAは、細胞内でsiRNAへの二本鎖部分で切断され、次に、RNAiは、標的配列を含む標的遺伝子の発現を抑制させることができる。
　本明細書においては、shRNAの前駆体は、導入遺伝子から転写され、次いで編集が施されていてもよい。また、shRNAを形成するための処理を行う。その場合でも、導入遺伝子はshRNAをコードする。
　shRNAの標的としてもよいが、細胞増殖調節因子をコードする遺伝子はこれらに限定されない。
　細胞増殖調節剤の例としては、DNA複製や、CDC6、サイクリンE、CDK2、CDT1、ORC2及びMCM7のような細胞周期の調節に関与するタンパク質が含まれる。好ましくは、細胞増殖調節剤は、CDC6であってもよい。
　CDC6は、DNA複製の開始において中心的な役割を果たすタンパク質である。CDC6ノックダウンは、ヒトがん細胞のアポトーシスをもたらすことが見出されている (Feng, et al., Cancer Res., 2003, Vol. 63, p. 7356-7364; Lau et al., EMBO Rep., 2006, Vol. 7, p. 425-430; and Feng et al., Mol. Cell. Biochem., 2008, Vol. 311, p. 189-197)。
　CDC6遺伝子は、SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる場合がある。
　CDC6のshRNAをコードする導入遺伝子は、SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列に対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれていても良い。
　典型的には、CDC6のshRNAは、SEQ ID NO:19のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるCDC6 shRNAのアンチセンス配列；SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に対して80％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるリンカー；及びアンチセンス配列に相補的な配列からなるセンス配列、そして2以上の塩基および3 'ポリUオーバーハング。
から成る。
　導入遺伝子産物は、上述のように、導入遺伝子からのRNAを含んでいてもよく、導入遺伝子からのRNAから翻訳されたタンパク質を含んでもよい。
　各々のレンチウイルスベクターは、少なくとも一つの導入遺伝子を含んでもよい。
　二つ以上の導入遺伝子は、一つのレンチウイルスベクターを用いて、または二つ以上のレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入されてもよい。
　好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、CDC6のshRNAをコードする導入遺伝子、および／またはp16タンパク質、PTENタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
　本発明に係る導入遺伝子は、インビトロでレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入される。
　本発明において使用される細胞の生物種は、好ましくは、製造されるウイルス様中空粒子のレシピエントと同じ種である。細胞は、哺乳動物細胞、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、あるいはサルまたはヒトなどの霊長類の細胞であるが、これらに限定されない。好ましくはヒト細胞である。また好ましくは、細胞は、腎臓由来細胞、子宮由来細胞、リンパ球由来の細胞または線維芽細胞である。
　細胞は、ヒト胚性腎臓293T細胞、ヒト子宮頸がんHeLa細胞、ヒトリンパ球CEM細胞、N144繊維芽細胞および他のヒト細胞株を含むことができるが、好ましくは、細胞は、ヒト胚性腎臓293T細胞又はヒト子宮頸がんHeLa細胞である。
　レンチウイルスベクターを用いた細胞内への導入遺伝子の導入は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。レンチウイルスベクターなどのRNAベクター又はDNAベクターを用いた細胞内への導入遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、その他当技術分野で知られている方法により行うことができ、例えば、リポフェクタミン（R）2000（Invitrogen）およびFuGene（R）6（Roche社）として市販されているトランスフェクション試薬を用いて行うことができる。
　レンチウイルスベクターなどのウイルス粒子を用いた細胞内への導入遺伝子の導入は、ウイルスによって細胞に感染する細胞の培養培地中にウイルス粒子を添加することにより行うことができる。
　レンチウイルスベクターに加えて、付加的な発現ベクターを細胞に導入してもよい。
　このような発現ベクターは、プロモーターの制御下で、ウイルス様中空粒子に封入されるタンパク質またはRNAをコードする導入遺伝子を含んでもよい。
　このようにして導入遺伝子が導入された細胞は培養される。
　培養は、細胞に応じて適切な方法によって行うことができる。
　例えば、培養は、１～５日間、例えば２～４日間、特には３６時間から９６時間、あるいは３６時間から７２時間、10％ウシ胎児血清および適切な抗生物質を補充したDMEM /高グルコース完全培地中で行うことができる。
　レンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子が導入された細胞において、レンチウイルスDNA（逆転写酵素の作用により、レンチウイルスRNAから産生される）は、プロウイルスDNAを形成するために、インテグラーゼ等の作用により細胞内のゲノムに組み込まれる。
　このプロウイルスDNAから、レンチウイルスRNAは、細胞内のRNAポリメラーゼIIによる媒介転写によって産生される。
　このようにして製造されたレンチウイルスRNAから、導入遺伝子産物は、通常、RNAスプライシングおよび／またはタンパク質翻訳を介して生成される。
　導入遺伝子産物および／またはこのようにして細胞内で産生されたレンチウイルスRNAがウイルス様中空粒子に組み込まれる。
　培養中に細胞はこのようなウイルス様中空粒子を細胞外に放出し、その結果、ウイルス様中空粒子は、培地中に蓄積される。
　好ましくは、本発明において使用されるレンチウイルスベクターは構造タンパク質遺伝子を欠損しており、それゆえウイルス様中空粒子を形成せず、ウイルス様中空粒子は培地中に蓄積されていない。
　本発明に係るウイルス様中空粒子を製造するための方法は、放出されたウイルス様中空粒子を回収する工程を含む。ウイルス様中空粒子の回収は、細胞培養培地を回収することによって行うことができる。
　こうして回収されたウイルス様中空粒子は、更に精製することができる。例えば、より大きい小胞を、1,000～10,000×g（好ましい実施形態において、9,000×g）の遠心分離により除去し、それによって回収されたウイルス様中空粒子を精製することができる。そのような遠心分離は、１回以上行ってもよく、好ましくは、異なる遠心力で遠心分離を行う。代替的に又は付加的に、例えば、1,000 kDaの分子量でカットオフできる膜を用いた限外濾過によりウイルス様中空粒子を精製することができる。
　さらに、ウイルス様中空粒子は、PEG/NaCl溶液と混合し、遠心分離と混合することによって沈殿させ、それによって精製することができる。このようにして精製した後、ウイルス様中空粒子に、ポリエチレングリコール構造が付加（PEG化）することがある。
　ウイルス様中空粒子のPEG化は、PEG化試薬の種々のタイプを用いて行うことができる。例えば、メトキシPEGスクシンイミジルカーボネートNHS（methoxy PEG succinimidyl carbonate NHS(mPEG-NHS)）を用いて行うことができる（Croyle et al., J. Virol., 2004, Vol. 78, p. 912-921）。
　例えば、メトキシPEGスクシンイミジルカーボネートNHS（mPEG-NHS、分子量10K（NANOCS、USA））をウイルス様中空粒子を含有する溶液に添加する。そして、この混合物を、回転プラットフォーム上で60分間室温でインキュベートし、それによって、ウイルス様中空粒子をペグ化することができる。
　PEG化または非PEG化ウイルス様中空粒子は、次いで透析（例えば、1×PBSを用いる）によるバッファ交換、シリンジフィルター（例えば、0.45 mmの孔径を有する）を介した限外濾過および濾過による濃縮に供されてもよい。
　本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子は、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAから成る。レンチウイルスRNAは、導入遺伝子の上流TERT遺伝子プロモーター配列を含むことができる。
　導入遺伝子は、TERT遺伝子プロモーター配列を含むレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入され、それによって宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込み、およびその発現を促進し、さらに、細胞からのウイルス様中空粒子の放出を増強する。したがって、ウイルス様中空粒子を効率よく製造することができる。
　一実施形態において、本発明は、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含むウイルス様中空粒子を製造する方法に関し、以下の工程を含む：
　インビトロにおけるレンチウイルスベクターを用いた導入遺伝子の細胞への導入工程；ここで、前記レンチウイルスベクターは少なくとも1つの構造タンパク質遺伝子が欠損しており、レンチウイルスゲノム配列中のテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下の導入遺伝子を含む、
　導入遺伝子産物を含むウイルス様中空粒子および／または導入遺伝子から成るレンチウイルスRNAを細胞外に放出するために細胞を培養する工程、および
　放出されたウイルス様中空粒子を集める工程。
＜本発明の方法により製造される、がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質＞
　本発明はまた、導入遺伝子産物を含むがん細胞をアポトーシスもしくは老化させるウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質に関する。
　がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質は、本発明の方法により産生される遺伝子を含むレンチウイルスRNAである
　本発明に係るウイルス様中空粒子は、細胞により産生され、細胞外に放出又は落下する、大きさが5nm～5mm、好ましくは10nm～1mm、より好ましくは20nm～500nmのウイルス様中空粒子を意味する。
　ウイルス様中空粒子の大きさは、電子顕微鏡法により決定することができる。
　ウイルス様中空粒子の例としては、一般に、エキソソーム、取り除かれている（shedding）ウイルス様中空粒子およびアポトーシス小体が挙げられるが、これらに限定されない。
　典型的には、本発明のウイルス様中空粒子はエキソソームである。エキソソームは、脂質二重層から成る膜小胞である。エキソソームは、150nmもしくはそれよりも小さく、典型的には、20～120nm又は40～100nmのサイズを有する。
　エキソソームは、細胞外に分泌され、エンドソーム膜の内向き出芽を介して形成された多小体（MVB）の細胞膜融合に起因するエキソサイトーシスにより製造される。
　本発明に係るウイルス様中空粒子は、タンパク質および／または、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAのようなRNAを含んでいてもよい。RNAは、宿主細胞から輸送され、その中でカプセル化される。
　ウイルス様中空粒子中に含まれ得るRNAの例には、mRNA、miRNA、shRNA、siRNAおよびレンチウイルスRNA（レンチウイルスRNAの種々のスプライシング変異体を含む。）が挙げられるが、これらに限定されない。
　ウイルス様中空粒子中に含まれ得るタンパク質の例には、ウイルスタンパク質（例えば、HIV-1のVpuタンパク質および逆転写酵素（RT）タンパク質）、細胞の内因性タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質、シグナル伝達タンパク質及び酵素）及び外来導入遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。
　例えば、エキソソームは、一般に、細胞骨格タンパク質（例えば、チューブリン、アクチンおよびアクチン結合タンパク質）、膜輸送関連タンパク質（例えば、アネキシンおよびRabタンパク質）、シグナル伝達タンパク質（例えば、プロテインキナーゼおよび14-3-3）、代謝酵素（例えば、GAPDH、ATPアーゼおよびエノラーゼ）、テトラスパニンファミリー（例えば、CD9 、CD63、CD81およびCD82）、熱ショックタンパク質（例えば、HSP90およびHSP70）、MVB生合成タンパク質（例えば、アリックスおよびTSG101）、免疫調節分子（例えば、MHCI及びMHCII）などを含んでいてもよい。
　上述の導入遺伝子を含むレンチウイルスゲノム配列を含むレンチウイルスDNA（プロウイルスDNA）は、本発明の方法により細胞に導入され、宿主ゲノムに組み込まれる。
　本発明のウイルス様中空粒子中に含まれるレンチウイルスRNAは、このプロウイルスDNAから転写される。レンチウイルスRNAは、導入遺伝子の上流の5 '末端にTERT遺伝子プロモーター（例えば、hTERTプロモーター）のRNA配列を含んでいてもよい。
　特に好ましい実施形態において、本発明のウイルス様中空粒子は、導入遺伝子産物として、PTENおよびp16タンパク質のような腫瘍抑制タンパク質、および／またはCDC6のshRNAもしくはその前駆体RNA等のようなshRNAを含むことができる。
　本発明のウイルス様中空粒子は、導入遺伝子産物および／またはウイルス様中空粒子に含まれる導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを送達する他の細胞によって、該細胞に取り込まれ得る。
＜本発明のウイルス様中空粒子を用いた遺伝子導入の方法＞
　本発明はまた、導入遺伝子産物および／または導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含むウイルス様中空粒子と標的細胞を接触させてそれらを融合する工程を含み、それにより導入遺伝子を細胞に導入する遺伝子導入方法に関し、このようにしてウイルス様中空粒子は本発明の方法により産生される。
　一実施形態において、標的細胞は、インビトロまたはインビボでウイルス様中空粒子と接触させることができる。
　ウイルス様中空粒子、特にエキソソームは、細胞－細胞相互作用に参加するために、その隣接する他の細胞に浸透することができる。
　ウイルス様中空粒子は、膜融合を介して、またはエンドサイトーシスのような方法を介して標的細胞の内部に到達することができると考えられているが、本発明はこの理論に限定されるものではない。
　本発明の遺伝子導入方法において、ウイルス様中空粒子と標的細胞との接触は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、ウイルス様中空粒子と標的細胞のインビトロでの接触は、細胞培養培地中にウイルス様中空粒子を添加することによって為すことができる。
　ウイルス様中空粒子と標的細胞のインビボでの接触は、例えば、ウイルス様中空粒子の経口投与によって、または標的部位（例えば、肝臓内、関節内、脳室内および鼻腔内のサイト）へのウイルス様中空粒子の直接適用または注射などの非経口投与により為されてもよい。
　使用され得る他のインビボの投与方法および投与部位は、医薬組成物の投与方法及び投与部位に関連して後述する。

　本発明の遺伝子導入の方法は、標的細胞に、導入遺伝子産物および／またはウイルス様中空粒子に含まれる遺伝子を含むレンチウイルスのRNAを効率的に、送達することができる。
＜本発明のウイルス様中空粒子を含む組成物＞
本発明はまた、本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子を含む組成物に関する。
　組成物は、その意図される用途に応じてウイルス様中空粒子以外の任意の成分を含むことができる。
　組成物は、遺伝子導入において使用されるものであってもよい。
　その場合、組成物は、遺伝子形質導入を促進する薬剤および／または核酸を安定化する薬剤などを含んでいてもよい。
＜本発明のウイルス様中空粒子を含む医薬組成物および治療方法＞
　本発明はまた、本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子を含む医薬組成物に関する。
　一実施形態において、医薬組成物は、例えば、がん、糖尿病、神経変性疾患、免疫機能障害、炎症、肝硬変、動脈硬化、血栓や感染症などの疾患の治療に使用するためのものであってもよい。
　 好ましくは、医薬組成物は、がんの治療に使用するためのものである。
　具体的には、がんは、結腸がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび悪性リンパ腫からなる群から選択される。
　一実施形態において、ウイルス様中空粒子中に含まれる導入遺伝子産物は、CDC6の発現低下を引き起こす可能性がある。
　例えば、導入遺伝子産物は、CDC6を標的とするshRNAである。その場合には、治療する疾患、例えば、がんは、CDC6の発現の上昇を伴っているものがよい。
　医薬組成物中にウイルス様中空粒子を用いた場合には、ウイルス様中空粒子に含まれる導入遺伝子または導入遺伝子産物は、本発明におうじて、疾患を予防および／または治療するために機能する。例えば、そのような導入遺伝子は、PTENやp16遺伝子のような腫瘍抑制遺伝子であってもよく、および／または細胞増殖調節剤又はその前駆体をコードする遺伝子を標的とするshRNAをコードする遺伝子であってもよい。
　一実施形態において、導入遺伝子は、PTEN遺伝子および／またはCDC6shRNAをコードしている遺伝子である。この実施形態では、医薬組成物は、本発明の方法によって製造される、導入遺伝子がPTEN遺伝子であるウイルス様中空粒子、および導入遺伝子が、組み合わせてCDC6のshRNAをコードする遺伝子であるウイルス様中空粒子を含んでもよい。
　別の実施形態において、導入遺伝子は、p16遺伝子および／またはCDC6のshRNAをコードしている遺伝子である。
　この実施形態において、医薬組成物は、例えば、本発明の方法により製造された、導入遺伝子がp16遺伝子であるウイルス様中空粒子、および、導入遺伝子が、組み合わせてCDC6のshRNAをコードする遺伝子であるウイルス様中空粒子を含んでもよい。
　本発明の医薬組成物は、本発明のウイルス様中空粒子に加えて、液体培地を含む。
　液体培地としては、水、生理的に許容される緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水など）、および、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどの生体適合性水性媒体を含む。
　必要であれば、このような媒体は、望ましくは滅菌し、好ましくは血液と等張になるように調整される。
　医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。
　「薬学的に許容される担体」とは、製薬技術の分野で通常に使用される添加剤を意味する。薬学的に許容される担体の例としては、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤および防腐剤が挙げられる。そのような担体は、成形を容易にし、投薬形態および薬物効果を維持するために主に使用され、必要に応じて適切に使用される。
　例えば、モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースおよびラウリル硫酸ナトリウムが、懸濁化剤として使用することができる。
　等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の例は、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液が挙げられる。
　防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラヒドロキシ安息香酸、クロロブタノールが挙げられる。
　医薬組成物はまた、上述したものに加えて、矯味剤、増粘剤、可溶化剤、pH調整剤、希釈剤、界面活性剤、膨張剤、安定剤、吸収促進剤、湿潤剤、保湿剤、吸着剤加えて、コーティング剤、着色剤、酸化防止剤、香味剤、甘味料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流れ制御添加剤、潤滑剤等を必要に応じて含むことができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のウイルス様中空粒子が有する薬理効果を失うことなく、追加の薬物を含有することができる。例えば、医薬組成物は、所定量の抗生物質を含有することができる。
　医薬組成物の剤形は限定されず、ウイルス様中空粒子を不活性化することも、導入遺伝子産物および／またはウイルス様中空粒子に含まれるレンチウイルスRNAを不活性化することもない任意の形態とすることができる。
　医薬組成物の剤形は、例えば、液体、固体または半固体の形態であってもよい。剤形の具体例としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、点眼剤、点鼻薬、軟膏剤、硬膏剤、パッチ剤、坐剤等の非経口剤形や、液体製剤、カプセル剤、舌下製剤、トローチ、粉末、錠剤、顆粒剤などの経口剤形が挙げられる。
　医薬組成物の剤形は、好ましくは、注射のような液体製剤である。
　医薬組成物は、標的疾患の治療のための薬学的に有効な量で生物に投与することができる。
　レシピエント生物は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類や爬虫類等の脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物である。
　哺乳類の例としては、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウスおよびラットなどの非霊長類や、ヒト、チンパンジーおよびゴリラなどの霊長類が挙げられるが、好ましくはヒトである。
　本明細書中の「薬学的有効量」は、宿主に対して有害な副作用がほとんど無い、あるいは全く無い状態で標的疾患を阻止あるいは治療したり症状を軽減したりするために、本発明の医薬組成物中に含まれるウイルス様中空粒子に必要とされる用量を指す。具体的な用量は、治療すべき疾患の種類、疾患の発生の根底にある作用機序は、使用される剤形、被験体に関する情報および投与経路等によって異なる。
　薬学的有効量の範囲、およびヒトに投与される医薬組成物の好ましい投与経路は、一般に、細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータに基づいて設定される。最終用量は、個々の被験体に応じて、例えば、医師の判断により決定され、調整される。その場合に考慮される被験者についての情報は、疾患の進行の程度あるいは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食事、薬物感受性および治療に対する抵抗性等を含む。
　一実施形態において、導入遺伝子がタンパク質をコードするとき、本発明の医薬組成物は、１×１０４～１×１０５トランスフェクションユニット（TU）/ kg体重の用量で１回または複数回投与することができ、例えば、単回投与当たり、１×１０５ ～１×１０７t.u./kg体重、または２×１０５～５×１０６t.u./kg体重の用量で、罹患部位への直接注射または静脈内注射することができる。
　ここで、トランスフェクションユニットは、本発明のレンチウイルスベクター（例えば、プラスミドベクター（pRBL2013T等）のようなDNAベクター）として、例えば、DNAベクターを10μgを用いて、導入遺伝子を細胞（例えば、ヒト胚性腎臓293T細胞）に導入する工程、ELISAアッセイに基づいて、細胞から放出されるウイルス様中空粒子の断片中の導入遺伝子産物（例えば、PTENタンパク質などのタンパク質）の量を決定する工程、および１トランスフェクションユニットとして決定された量（トランスフェクション効率）を正規化する工程によって決定することができる。ここで、１トランスフェクションユニットとは、1000細胞あたりの導入遺伝子産物（例えば、タンパク質）の20 PGと同等である。
　本発明の医薬組成物は、所定の時間間隔で2回またはそれ以上投与されてもよい。所定の時間間隔とは、例えば、１時間毎、３時間毎、６時間毎または１２時間毎、あるいは、毎日、２日毎、３日毎または７日毎、１ヶ月毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎または１２ヶ月毎である。
　他の非経口投与または経口投与は、上記のものに従う量で行うことができる。
　特に重症の場合には、用量は症状に応じて増加させることができる。
　医薬組成物の投与は、全身投与または局所投与であってもよく、疾患の種類、疾患が起こる部位、または進行の程度に応じて適宜選択することができる。
　疾患が局所部位で起こる場合、医薬組成物は、好ましくは、注射または留置カテーテルなどを用いてローカルサイト（例えば、腫瘍）およびその近傍への直接投与により局所的に投与される。これは、本発明のウイルス様中空粒子は、処置されるべき部位（組織または器官）に十分な量で投与し、他の組織に影響を与えないことができるからである。
　一方、転移性がんのように、治療すべき部位が同定されないか、疾患が全身的に起こり得る場合がある。その場合には、静脈内注射等により全身投与することが好ましい。
　これは、本発明のウイルス様中空粒子は、血流を介して全身に広がることができるためであり、それによって、たとえ診断によって発見することができない病変にも投与することが可能になる。
　医薬組成物は、その中に含まれる活性成分を不活性化しない任意の適切な方法によって投与することができる。
　例えば、投与は、非経口（例えば、注射、エアロゾル、アプリケーション、点眼、点鼻または留置カテーテル）または経口によりなされる。注射が好ましい。
　注射による投与の場合、注射部位は、本発明のウイルス様中空粒子がその機能を発揮し、医薬組成物の目的を達成することができる非限定的な部位でよい。
　注射部位の例としては、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内および舌下の部位が挙げられる。
　１つの実施形態として、腫瘍への直接投与も好ましい。
　本発明の医薬組成物は、ウイルス様中空粒子中に含まれる導入遺伝子産物等により、疾患の予防および／または治療を効果的に達成するために使用することができる。
　従って、本発明はまた、導入遺伝子または導入遺伝子産物の導入を必要とする患者に本発明の方法により製造されるウイルス様中空粒子を投与する工程を含む、患者を治療するための方法を提供する。
　患者は、がん、糖尿病、神経変性疾患、免疫不全、炎症、肝硬変、動脈硬化、血栓または感染を患っていてもよいが、好ましくは、がんを患っている。より具体的には、がんは、例えば、結腸がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび悪性リンパ腫からなる群から選択され得る。
　一実施形態では、ウイルス様中空粒子中に含まれる導入遺伝子産物は、CDC6の発現低下を引き起こす可能性がある。
　例えば、導入遺伝子産物は、CDC6を標的とするshRNAであってもよい。その場合には、治療する疾患、例えば、がんは、CDC6の発現の上昇を伴ってもよい。
　患者に対するウイルス様中空粒子の投与方法および投与部位は、上記のように医薬組成物の投与方法及び投与部位に関連して使用することができる。
　本発明の治療方法は、患者のがんのような疾患を効果的に治療することができる。好ましい一実施形態では、本発明の治療方法は、腫瘍の増殖を阻害する（減らす）ことができる。
　以下、本発明に係る治療剤を用いた結果について以下に説明する。
［効果１］
　p53遺伝子異常を有する固形がんでは、タンパク質の高次構造が変化する結果、半減期が延長するために変異したp53タンパク質の過剰発現が認められる。その結果、がん患者の血清中にIgG抗体が出現する。p53腫瘍マーカーは2007年より保険収載されている新規腫瘍マーカーであり、p53抗体の基準値は1.3U/mlである。
　そこで、画像検診などでがんと診断されていないが、p53抗体検査において高値を示す２人の患者に対してpRBL001、pRBL002をそれぞれ週2回のインターバルで点滴治療を10週間連続投与した。投与には、pRBL001、pRBL002ともに、タンパク質の量として0.4mgを200mlの0.9％Naclに溶解したものを用いた。
　その結果を図５５に示す。図５５中、ケース(1)はpRBL001を投与した患者の結果、ケース(2)はpRBL002を投与した患者の結果を示す。図５５から分かるように、ケース(1)では投与開始から10週間経過後にp53抗体検査の数値が基準値以内に収まった。また、ケース(2)では投与開始から14週間経過後にp53抗体検査の数値が基準値以内に収まった。
［効果２］
　卵巣がん全摘出術後6ケ月を経過した患者の腫瘍増殖因子のmRNAをRT-PCR法によって観察した。1回目のmRNAの検査後2週間の間に、pRBL001、pRBL002を、それぞれ5回投与した。投与には、pRBL001、pRBL002ともに、タンパク質の量として0.4mgを200ml/0.9％Naclに溶解したものを用いた。その後、3週間後、mRNAの変化を観察したところ、増殖因子のmRNAの低下が顕著に観察された。その結果を図５６に示す。
［効果３］
　卵巣がんの全摘出後患者においてp53の突然変異を確認した。
2週間でpRBL001、pRBL002をそれぞれタンパク質の量として0.4mgを200ｍｌ/0.9％Naclに溶解して5回投与。その後、3週間後、観察したところp53の突然変異は解消された。また、MDM2のmRNAの発現量も低下していた。その結果を図５７に示す。
［効果４］
　乳房全摘出術前治療を行う乳がん（エストロゲン陽性）（HER2陽性）のSTAGE2の患者に対して、術前にpRBL001、pRBL002をそれぞれ0.4mgとpRBL2013Tを0.85mg混合し200ml/0.9％Naclで溶解して6回投与した。術前に3.0cmの大きさであった腫瘍は、術後は1.5cmまで縮小された。図５８Ａ～５８Ｃは腫瘍縮小効果を示す画像である。図５８Ａの(ａ）～（ｄ）および図５８Ｂの(ｅ）～（ｇ）は術前、図５８Ｃの（ｈ）～（ｍ）は術後の状態である。
［効果５］
　乳房温存治療を行う乳がん（エストロゲン陽性）（HER2陽性）のSTAGE2の患者に対して、１回につき、pRBL001、pRBL002をそれぞれ0.4mgとpRBL2013T 0.85mgを5ml0.9％Naclに溶解して10日に1回のインターバルで腫瘍に直接穿刺した。また、同量のpRBL001、pRBL002、pRBL2013Tを点滴として投与した。腫瘍縮小効果を図５９に示す。図５９の(ａ）および（ｂ）は術前、図５９の（ｃ）および（ｄ）は術後の状態である。

Claims (10)

  1. 　ヒ卜CDC6 mRNAに対する短へアピンRNAであるCDC6 shRNAを、感染した細胞内における遺伝子導入によって生産することができるレンチウイルスベクターTHTD。
  2. 　請求項１に記載のレンチウイルスベクターTHTDにおいて、
    　pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tから選択されるいずれか１つ又は複数のレンチウイルスRNAを、感染した細胞に導入するレンチウイルスベクターTHTD。
  3. 　pRBL002が、HIVウイルスゲノムのvif由来のタンパク質を含有する、請求項２に記載のレンチウイルスベクターTHTD。
  4. 　pRBL2013Tが、HIV-1ウイルスゲノムのVPR由来のタンパク質を含有する、請求項２に記載のレンチウイルスベクターTHTD。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載のレンチウイルスベクターTHTDを含むヒト乳がんMCF7細胞の老化剤。
  6. 　請求項１～４のいずれかに記載のレンチウイルスベクターTHTDを含むがん抑制剤。
  7. 　請求項１～４のいずれかに記載のレンチウイルスベクターTHTDを含む医薬組成物。
  8. 　がん細胞をアポトーシスもしくは老化させるためのがん抑制遺伝子および／またはがん抑制遺伝子産物からなる、ウイルス様中空粒子で包装されたタンパク質。
  9. 　レンチウイルスベクターTHTDを細胞に感染させてCDC6 shRNAを生産する遺伝子を導入する工程と、
    　前記遺伝子が導入された細胞を培養する工程と、
    　細胞外に放出された、レンチウイルス由来のRNAを含むウイルス様中空粒子を集める工程と
    を備えたウイルス様中空粒子の製造方法。
  10. 　前記レンチウイルスベクターTHTDが、pRBL001、pRBL002、pRBL2013Tから選択されるいずれか１つ又は複数のレンチウイルスRNAを感染した細胞に導入する、請求項９に記載のウイルス様中空粒子の製造方法。
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