JP6069480B2 - 複製可能偽型レトロウイルスベクターシステム - Google Patents

Description

本発明は、分裂中である異常増殖細胞への効率的な遺伝子伝達を可能にする複製可能偽型レトロウイルスベクターシステム、及びその用途に関する。

増殖は、１個の細胞を２個の細胞に分裂させる細胞周期を通じる細胞の発達につれて発生する。細胞周期は、Ｇ_０、Ｇ_１、Ｓ、Ｇ_２、及びＭ期である５段階で構成されている。Ｇ_０期の間に、細胞は停止しており、体内ほとんどの細胞は、この段階にある。Ｇ_１期の間に、細胞は分裂するための信号に反応して、ＤＮＡ合成に必要なＲＮＡ及びタンパク質を生成し、Ｓ期（Ｓ期初期であるＳＥ；Ｓ期中期であるＳＭ；及びＳ期後期のＳＬ）の間の細胞は、ＤＮＡを自己複製し、Ｇ_２期の間に、細胞が成長し続け、有糸分裂を準備するためのタンパク質合成が起こり、有糸分裂（Ｍ）期の間に、細胞は、２個の娘細胞に分裂される。癌のような、異常増殖細胞は、このような細胞周期進行での変更によって発生するが、これは、遺伝子の過多発現、調節遺伝子の突然変異、またはＤＮＡ損傷チェックポイントの欠陷から誘発されうる（Ｈｏｃｈｈａｕｓｅｒ Ｄ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，８：９０３，１９９７）。

異常増殖細胞疾患には、多様な類型がある。代表的な異常増殖細胞疾患としては、癌、バクテリア感染、臓器移植の免疫拒否反応、固形腫瘍、ウイルス感染、自己免疫疾患（例えば、関節炎、ループス、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、多発性硬化症）、またはこれらの組合わせなどによって起こり、このような異常増殖細胞のうち、最も代表的な疾患としては、癌が最もよく知られている。

癌とは、一般的に病んだ細胞の非正常な細胞分裂による増殖を特徴とする多様な部類の疾病を概括的に称する。知られたあらゆる類型の癌で一貫した特徴は、癌細胞とその子孫細胞との遺伝物質に異常が発生するということである。細胞が癌性になれば、正常限界とは関係なく増殖して、隣接組織を侵襲または破壊し、さらには転移と呼ばれる過程を通じて、解剖学的遠位部位まで拡散されうる。

一方、今まで２０年間約１，７００余件に達する遺伝子治療臨床試験が許可されて行われた。しかし、最近、一部の単一欠損遺伝子に起因した遺伝性疾患を対象とした成功的な遺伝子治療の成功事例が発表されているが、一方、最も多い遺伝子治療臨床ケースを記録している癌の遺伝子治療のおける結果は、期待したほどではなかった。数年前、大きな期待を受けた腫瘍分解性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）アデノウイルスベクターを利用した坑癌遺伝子治療も、一部の頭頸部癌で制限的な治療効果を示しているだけである。

このような低い癌遺伝子治療の効果の原因に対する共通の認識は、癌細胞組織への効率的な遺伝子伝達を可能にするベクターの開発が至急であるということである。実際、以前の癌遺伝子治療臨床研究で調査した癌細胞への遺伝子伝達効率は、全体癌組織内の癌細胞の１％未満に表われている。このような非効率的な癌組織への遺伝子伝達効率を高めるために、多種の腫瘍分解性ウイルスが開発されて研究されたが、免疫原性誘発による炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）と迅速なウイルス除去（ｒａｐｉｄ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）、複雑なウイルス遺伝子構造による開発の難点、生体内でのウイルス変形と不活性化とによって、その効果は期待したほどには出ていない。

しかし、最近、腫瘍分解性ワクシニアウイルスを利用した癌遺伝子治療が、過去の成績よりはさらに希望的な臨床研究結果を示すことを筆頭に、２０１０年には、米国で複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）を利用した癌遺伝子治療臨床研究が承認を受け、２０１１年現在、臨床第１相研究が終わり、２相研究が進められている状況であって、今後、このベクターシステムを改良し、実用化するための研究、及びこのシステムを利用した臨床研究が増加すると予想される。

本発明は、ＭｕＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターと、ＧａＬＶ（Ｇｉｂｂｏｎａｐｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターと、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムを提供することである。
本発明は、ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを提供することである。
本発明は、前記レトロウイルスを含む異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物を提供することである。
本発明は、前記異常増殖細胞治療遺伝子で癌治療遺伝子を挿入した前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを含む癌予防または治療用組成物を提供することである。
また、本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターを製造する段階と、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターを製造する段階と、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムの製造方法を提供することである。

本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子、ＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子及びＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を２つのベクターに分けて発現させたベクターシステム、前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルス、前記レトロウイルスを含む異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物、癌予防または治療用組成物、及びＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子、ＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子及びＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を２つのベクターに分けて発現させたベクターシステムの製造方法を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。

従来から知られた代表的な異常増殖細胞は、癌細胞であるために、本発明者は、持続的に分裂する細胞である癌細胞をターゲットで本発明のベクターシステムを実験した。異常増殖細胞遺伝子である、癌遺伝子治療でディフェクティブレトロウイルスベクターの癌細胞への遺伝子伝達効率は、全体癌組織内の癌細胞の１％未満であった。このような弱点を克服するために、複製可能レトロウイルスが使われているが、野生型レトロウイルス誘電体に追加的に治療遺伝子を挿入してベクターサイズが大きくなる場合、ベクターの遺伝子組替えによって治療機能を喪失するという問題点があった。これにより、本発明者は、前記問題点を解決するために努力していたところ、本発明のベクターシステムによる時、挿入遺伝子のサイズに制限が少なく、癌細胞への遺伝子伝達効率、特に、動物モデルに構築された癌組織への遺伝子伝達があらゆる分裂中である癌組織で起こることを確認することによって、本発明のベクターシステムが、あらゆる異常増殖細胞に適用可能であるということを確認し、本発明を完成した。

本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターと、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターと、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムを提供する。

前記第１組換え発現ベクターは、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含むものであって、その種類において、特に限定されるものではなく、望ましくは、図１の開裂地図のベクターを含みうる。

前記第２組換え発現ベクターは、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含むものであって、その種類において、特に限定されるものではなく、望ましくは、図２の開裂地図のベクターを含みうる。

本発明の複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）ベクターは、非溶菌性（ｎｏｎｌｙｔｉｃ）ウイルスであるために、宿主免疫システムによって細胞損傷が起こらず、ウイルスに対する抗体が生成されないために、ウイルス除去（ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）が起こらなくて、遺伝子伝達体として非常に優れている。

前記複製可能（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）は、特定のウイルスに対して感染性が高い動物細胞に前記ウイルス遺伝子をトランスファクションまたは前記ウイルスを感染させた場合、その結果から得られた感染あるいは形質転換された細胞からウイルス生産能を有したということを意味する。

前記複製可能レトロウイルスは、核膜が壊れる隙間を狙って核内に入るために、分裂する細胞にのみ感染することができて、癌細胞のように分裂する異常増殖細胞に特異的に感染することができる。したがって、挿入遺伝子が他の正常細胞から発現されることを防いで、異常増殖細胞に遺伝子伝達の安全性を提供するだけではなく、ウイルスが複製可能であるために、遺伝子伝達効率も増大させることができる。

前記Ｇａｇ遺伝子は、レトロウイルスのコアの４種のタンパク質を成すポリタンパク質であり、前記Ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素を表わし、前記Ｅｎｖ遺伝子は、外被糖タンパク質を表わすことができる。

本発明では、レトロウイルスのＥｎｖ遺伝子をＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子に変形することによって、ウイルス増殖及び誘電体伝達効率を高めうる。
一例として、前記第２組換え発現ベクターとして、ＭｕＬＶ外被タンパク質を含んだベクター（ｓＲＣＲ）と、本発明のＧａＬＶ外被糖タンパク質を含むベクター（ｓｐＲＣＲ）と、を製作して、比較した結果、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含んだ発現ベクターを使う場合、さらに高いウイルス感染率と誘電体伝達効率とを有しうる。

一実施例に表われたように、ベクターを高い力価（ｔｉｔｅｒ）で感染させ、１２日経過後、ＭｕＬＶ−Ｅｎｖを含んだベクターは、感染率が８０％線に留まっている一方、ＧａＬＶ−Ｅｎｖを含んだベクターは、ほぼ１００％の感染率に行っており、ベクターを低い力価で感染させ、２０日経過後、ＭｕＬＶ−Ｅｎｖを含んだベクターは、２％しか感染されない一方、ＧａＬＶ−Ｅｎｖを含んだベクターは、９４％まで占有されているということを確認することができる。

一実施例に表われたように、ベクターに細胞自殺遺伝子導入後、前具体薬物であるＧＣＶを１０μｇ／ｍｌの濃度で処理した一日目に、ｓＲＣＲ−ＴＫに感染された細胞でＧＣＶ処理一日のみに細胞数が４０％減少し、ｓｐＲＣＲ−ＴＫに感染された細胞では、６０％減少するということを確認することができる。

一実施例に表われたように、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのｓＲＣＲ−ＦＬとｓｐＲＣＲ−ＦＬとの癌細胞感染率の比較時、ｓＲＣＲ−ＦＬ感染された癌細胞では、蛍光強度も非常に弱く、ウイルスが局所的に感染されている一方、ｓｐＲＣＲ−ＦＬが感染された細胞では、ウイルスが癌細胞の形状に全体的に鮮明に発現されるということを確認することができる。

また、前記ベクターは、レトロウイルスベクターの最も最小機能単位である５´−ＬＴＲ及び３´−ＬＴＲを含み、このＬＴＲの間に運ぼうとする目的遺伝子のヌクレオチド配列を挿入することができる。

本発明の発現ベクターは、非正常に分裂する異常増殖細胞に外来遺伝子を伝達するために考案されたものであって、前記第１組換え発現ベクターまたは第２組換え発現ベクターには、外来遺伝子を挿入することができる。

従来の発現ベクターは、本来のウイルス誘電体に追加的に外来遺伝子を挿入したために、挿入することができる外来遺伝子のサイズに制限があり、一方、本発明のベクターシステムは、１つのウイルスベクターを２つに分けたために、外来挿入遺伝子を両側ベクターにいずれも入れることができるために、多様な遺伝子をサイズに制限されずに挿入できるだけではなく、１つのウイルスベクターを用いた時ほど複製と増殖とがよく進行しうる。

前記外来遺伝子は、特に限定されるものではないが、異常増殖細胞治療遺伝子であり、一例として、癌細胞治療遺伝子であり得る。

前記異常増殖細胞は、通常の、適当な、または予測されたコースから逸脱された細胞の増殖で不適切に高いレベルに細胞分裂が起こることを意味する。一例として、異常増殖細胞は、ＤＮＡまたはその他の細胞性成分が損傷または欠損された細胞の不適切な増殖を含みうる。

前記外来遺伝子は、目的によって非正常に分裂中である異常増殖細胞に伝達しようとするものであって、その種類において、特に限定されるものではなく、ホルモン、酵素、受容体、レポーター遺伝子、異常増殖細胞治療遺伝子などを含みうる。

一例として、前記ベクターに異常増殖細胞治療遺伝子を挿入する場合、図３の開裂地図のベクターで表わすことができ、第２組換え発現ベクターに異常増殖細胞治療遺伝子を挿入することができる。

一例として、異常増殖細胞が癌細胞である場合、癌治療遺伝子として細胞自殺遺伝子であるチミジンキナーゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＴＫ）を使うことができるが、従来、ＴＫ遺伝子のサイズが大きくて、既存のベクターとしては効果を期待しにくく、サイズが大きな遺伝子をレトロウイルスに適用する場合、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こる問題点があったが、一方、本発明のベクターシステムでは、サイズが大きな外来遺伝子も収容することができるために、前記問題点を起こせずにＴＫ遺伝子を癌細胞に伝達することができる。

本発明では、前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを提供することができる。

前記細胞株の種類は、特に限定されるものではないが、一例として、ヒト２９３細胞、ヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞、ケーナインＤ１７細胞、フィーラインＰＧ４細胞などが挙げられる。

前記トランスフェクション方法は、当業者に公知の方法に従い、リポフェクタミン法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、微小注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０））、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：８４１（１９８２））、リポソーム媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））を含むが、これらに限定されるものではない。

引き続き、形質感染された細胞を適した培地で培養する。本発明で利用される培地は、動物細胞の培養に通用される培地を使い、一例として、Ｅａｇｌｅｓ´ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ´ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２（１９５９））、ａ−ＭＥＭ（Ｓｔａｎｎｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ´ｓＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２（Ｈａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ´ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２との混合物（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ´ｓ ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ´ｓ ５Ａ（ＭｃＣｏｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１００：１１５（１９５９））、及びＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １４：１１（１９７８））などを用途に合わせて選択することができる。培地についての説明は、Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる。

前記培養によって形成された培養物から前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを収得することができる。
本発明は、前記レトロウイルスを含む異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物を提供する。

前記レトロウイルスが標的する細胞は、非正常に分裂中であるあらゆる異常増殖細胞を含み、その種類において、特に限定されるものではない。

前記のような非正常に分裂する異常増殖細胞は、人体内で多様な疾患を誘発するが、これには、癌疾患、炎症性疾患、異常増殖血管疾患などが含まれうる。

前記異常増殖細胞は、癌細胞であり得る。

前記癌細胞は、生体組織内で細胞が非正常に無制限に異常増殖して腫瘍を起こす細胞であって、その種類において、特に限定されるものではないが、粘液状細胞癌腫、丸い細胞癌腫、局所的進行腫瘍、転移性癌、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫、癌転移、リンパ性転移、扁平上皮細胞癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫、経口癌腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄球白血病、毛様細胞性白血病、流出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞肺癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンソングリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生成腫瘍、悚素細胞肺癌、乳房癌、小細胞癌腫、導管癌腫、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸腫瘍の形成と関連した茸腫、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、１次表面膀胱腫瘍、膀胱の侵襲性転移細胞膀胱癌腫、筋浸潤性膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、食道癌、卵巣癌腫、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸管癌腫、膣癌、外陰部癌、子宮癌、卵胞中の固形腫瘍、睾丸癌、陰茎癌、腎臓細胞癌腫、脳癌、頭頸部癌、口頸部癌、神経芽細胞腫、脳幹神経膠腫、神経膠腫、中枢神経系中の転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫、骨肉種、悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌腫、甲状腺癌、網膜芽腫、神経芽細胞腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養芽細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、またはカポジ肉腫由来の細胞などが含まれうる。

前記異常増殖細胞は、炎症性疾患または異常増殖血管疾患由来の非癌細胞であり得る。

前記炎症性疾患は、細胞が異常増殖して炎症を誘発する疾患をいずれも含む概念であって、炎症は、免疫適格細胞が外部個体または抗原性タンパク質に対する反応で活性化される場合に起こり、炎症性反応は、通常、外傷または抗原、例えば、ウイルス性、バクテリア性、原生動物性、または真菌性抗原などによって誘導されうる。

前記炎症性疾患は、その種類において、特に限定されるものではないが、前記炎症性疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、炎症−誘導骨疾患、退行性関節炎、糖尿病、自己免疫筋肉炎、動脈硬化、脳卒中、肝硬化、脳膜炎、炎症性胃潰瘍、胆嚢結石、腎臓結石、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性腸疾患、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、炎症性皮膚疾患、リウマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性紅斑性ループス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬（ｌｉｃｈｅｎ ｐｌａｎｕｓ）、慢性単純苔癬（ｌｉｃｈｅｎ ｓｉｍｐｌｅｘ ｃｈｒｏｎｉｃｕｓ）、天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、ブルース天疱瘡、表皮水泡症（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ）、蕁麻疹（Ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、血管浮腫（ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）、脈管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、紅斑、皮膚好酸球増多症（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）、貨幣状皮膚炎（ｎｕｍｍｕｌａｒ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、全身性剥脱皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、皮脂腺の疾患、口周囲皮膚炎、ひげ仮性毛嚢炎、薬物発疹、多形紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、結節性紅斑（Ｅｒｙｔｈｅｍａ ｎｏｄｏｓｕｍ）、環状肉芽腫（Ｇｒａｎｕｌｏｍａ ａｎｎｕｌａｒｅ）、または骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ：Ｐｅｌｖｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ）由来の異常増殖細胞であり得る。

前記炎症−誘導骨疾患は、骨発生疾患、骨の骨折、骨の老人性損失、軟骨異栄養症、高カルシウム血症、過骨化症、不完全骨形成症、骨軟化症、骨髄炎、骨多孔症、ページェット病、骨関節炎、またはくる病などを含みうるが、これらに限定されるものではない。

一例として、炎症性疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、リウマチ関節炎患者の異常増殖滑 膜細胞であり得る。

前記異常増殖血管疾患は、血管に存在する細胞、特に、血管平滑筋細胞の過度な増殖によって引き起こされる疾患などを意味する。

前記異常増殖血管疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、その種類において、特に限定されるものではなく、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再発狭窄症及び狭窄症、血管奇形、血液透析と関連した血管通路狭窄、移植後動脈病症（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、脈管炎、血管炎症疾患、ディジョージ症侯群、遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）、ケロイド性瘢痕、水泡疾患、過増殖性硝子体症侯群、未熟児網膜症、脈絡膜新生血管、黄斑変性、糖尿病性網膜症、眼内新生血管増殖、原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ（ｎａｓａｌ ｐｏｌｙｐｓ）、炎症性腸及び歯周疾患、子宮内膜症、卵巣嚢、卵巣過剰刺激症候群、関節炎、リウマチ性関節炎、慢性関節リウマチ、潤滑膜炎、骨関節炎、骨髄炎、骨増殖、敗血症、または血管漏出症侯群由来の異常増殖細胞であり得る。

一例として、前記炎症性疾患由来の異常増殖細胞は、動脈硬化の原因となる異常増殖血管内皮細胞、慢性骨髄増殖疾患を起こす異常増殖赤血球、顆粒球、血小板、血管濾胞瘍リンパ腺増殖症（ａｎｇｉｏｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）と知られた異常増殖リンパ細胞であり得る。

前記レトロウイルスベクターに挿入される遺伝子は、実験する目的によって選択可能なものであって、その種類において、特に限定されるものではなく、ホルモン、酵素、受容体または異常増殖細胞治療用薬物（ｄｒｕｇ）を発現する遺伝子などを含みうる。

本発明の組成物は、癌細胞のような非正常に分裂中である異常増殖細胞に外来遺伝子を伝達する伝達体として多くの長所を有している。前記レトロウイルスは、非溶菌性ウイルスであるために、宿主免疫システムによって細胞損傷が起こらず、ウイルスに対する抗体が生成されないために、ウイルス除去が起こらなくて、遺伝子伝達体として非常に優れ、分裂する細胞にのみ感染することができるために、癌細胞のような分裂中である異常増殖細胞に特異的に感染して、治療遺伝子が他の正常細胞から発現されることを防いで、細胞治療者にさらに安全性を提供するだけではなく、ウイルスが複製可能であるために、遺伝子伝達効率も増大させることができる。

一実施例に表われたように、本発明のベクターの遺伝子伝達効率を確認するために、ベクターによる感染率を確認した時、ＧａＬＶ−Ｅｎｖを含んだベクターをヌードマウスの移植された脳腫瘍に注入させた場合、ＭｕＬＶ−Ｅｎｖを含んだベクターよりも遥かに強度も高く、全体癌組織に鮮明に増殖されていることを確認できるだけではなく、癌組織を境界にして正常脳細胞では、如何なるウイルスの感染も確認されなくて、本発明の組成物が、癌細胞のような異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物として有用であるということを確認することができる。

本発明は、前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを含む異常増殖細胞惹起疾患予防、または治療用組成物を提供する。

前記異常増殖細胞は、通常の、適当な、または予測されたコースから逸脱された細胞の増殖で不適切に高いレベルに細胞分裂が起こることを意味する。一例として、異常増殖細胞は、ＤＮＡまたはその他の細胞性成分が損傷または欠損された細胞の不適切な増殖を含みうる。

前記異常増殖細胞惹起疾患は、不適切に高いレベルに細胞分裂が起こり、また、これによって引き起こされ、媒介または招かれる疾病、障害と関連した特徴の細胞増殖を含みうる。このような疾病、または障害は、例えば、癌性または非癌性、悪性または良性が含まれ、これについては、前述されたことを参照することができる。

また、本発明は、異常増殖細胞治療遺伝子で癌細胞治療遺伝子を挿入した前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを含む癌予防または治療用組成物を提供する。

本発明の第１組換え発現ベクターまたは第２組換え発現ベクターは、細胞治療遺伝子で癌治療遺伝子を含むものであって、癌治療遺伝子の種類は、特に限定されるものではないが、望ましくは、細胞自殺遺伝子、細胞死滅誘導遺伝子、免疫遺伝子、新生血管形成抑制遺伝子、及び癌細胞を死滅させることができる遺伝子沈黙（ＲＮＡｉ）を誘導するｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する塩基配列からなる群から選択された１つ以上を含みうる。

前記細胞自殺遺伝子は、その種類において、特に限定されるものではなく、一例として、ヘルペスシンプレックス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、バクテリアや酵母のシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）などを含みうる。

前記細胞自殺遺伝子は、前駆体薬物を活性化させることができるが、一例として、細胞自殺遺伝子導入後、前駆体薬物（ｐｒｏｄｒｕｇ）を投与すれば、細胞自殺遺伝子によって前駆体薬物が活性化されうる。

前記細胞自殺遺伝子としてヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ ＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＨＳＶ−ＴＫ）を使い、前記ヘルペスシンプレックススウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）によって前駆体薬物であるＧＣＶ（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）が活性化されうる。

前記ヘルペスシンプレックススウイルスのチミジンキナーゼは、他の哺乳類のチミジンキナーゼよりもＧＣＶを１０００倍以上効果的にリン酸化させるために、癌細胞の死滅効果を高めうる。

ＨＳＶ−ＴＫは、ヌクレオシド類似体（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ）であるガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ；ＧＣＶ）をリン酸化基質として用いて三リン酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の形態に変換させる。リン酸化されたＧＣＶは、細胞のＤＮＡ合成時に利用されて、超突然変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）でＤＮＡに損傷を与えて細胞周期停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を起こし、結局、細胞を死滅を起こしうる。また、ＴＫ遺伝子が発現されない細胞でも、ＴＫ遺伝子が発現する細胞のギャップジャンクション（ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を通じてリン酸化されたＧＣＶが伝達されることによって、同じ細胞死滅効果が表われる。

一実施例に表われたように、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を本発明のベクターに挿入して生存実験を進行した結果、ＧＣＶ濃度が１０〜３０μｇ／ｍｌである時、正常細胞に損傷を与えずとも、ｓｐＲＣＲ−ＴＫ感染Ｕ−８７ＭＧで細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が観察され、癌組織以外の他の組織では、ウイルスが発見されなくて、本発明の組成物が安全性を有するということを確認し、また、動物実験の結果、対照群のマウスは、癌移植後、４０日前後でいずれも死亡し、治療群のマウスは、毎日注射を受け、癌移植後、研究が進行中である現在である、７０日までいずれも生存しているだけではなく、体重も正常に保持するということを確認することができる。

前記結果は、本発明の組成物の安定性が高く、分裂する癌細胞に効果的に癌治療遺伝子を伝達することができるということを確認することができる。

前記癌細胞の種類は、特に限定されるものではなく、粘液状細胞癌腫、丸い細胞癌腫、局所的進行腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ性転移、扁平上皮細胞癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫、経口癌腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄球白血病、毛様細胞性白血病、流出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞肺癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンソングリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生成腫瘍、悚素細胞肺癌、乳房癌、小細胞癌腫、導管癌腫、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸腫瘍の形成と関連した茸腫、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、１次表面膀胱腫瘍、膀胱の侵襲性転移細胞膀胱癌腫、筋浸潤性膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、食道癌、卵巣癌腫、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸管癌腫、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、子宮癌、卵胞中の固形腫瘍、睾丸癌、陰茎癌、腎臓細胞癌腫、脳癌、頭頸部癌、口頸部癌、神経芽細胞腫、脳幹神経膠腫、神経膠腫、中枢神経系中の転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫、骨肉種、悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌腫、甲状腺癌、網膜芽腫、神経芽細胞腫、腹膜流出、悪性肋膜流出、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養芽細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫などを含み、望ましくは、脳腫瘍、大腸癌、肺癌、肝癌、乳房癌であり得る。

既存の抗癌剤治療が癌細胞だけではなく、全身に作用されて副作用をもたらす一方、このような自殺遺伝子／前駆体薬物システムは、癌細胞のみを目標とすることができて、正常細胞には、前駆体薬物が全く影響を与えないだけではなく、悪性腫瘍の局所部位の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）や低酸素化（ｈｙｐｏｘｉａ）の状態でも、傍観者効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）によってベクターが到逹することができないとしても癌治療の範囲が増大しうる。

本発明の前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを含む癌予防または治療用薬学組成物を製造する場合、前記レトロウイルスは、組成物総重量に対して、０．０１〜９９重量％で含みうるが、本発明の範囲が、これに限定されるものではない。

本発明の癌予防または治療用組成物は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，最新版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ］を参照して薬剤学的組成物として製造可能であり、この際、含まれる薬剤学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。

前記薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路に投与される。投与のあらゆる方式は、予想されうるが、一例として、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、気管支内吸入、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）などに注射によって投与される。

本発明の組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常、熟練された医師は、所望する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。

本発明の組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。

本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターを製造する段階と、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターを製造する段階と、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムの製造方法を提供する。

前記第１組換え発現ベクターは、その種類において、特に限定されるものではないが、図１の開裂地図のベクターを含みうる。
前記第２組換え発現ベクターは、その種類において、特に限定されるものではないが、図２の開裂地図のベクターを含みうる。
前記第１組換え発現ベクターまたは第２組換え発現ベクターは、癌細胞標的とする外来遺伝子を挿入し、前記外来遺伝子は、癌治療遺伝子を含みうる。
前記癌治療遺伝子を含む発現ベクターの例としては、図３の開裂地図のベクターを含みうる。

本発明では、異常増殖細胞標的性ベクターである、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターとＧａＬＶ−Ｅｎｖを含む第２組換え発現ベクターとの両側にいずれも治療遺伝子を入れることができるために、挿入遺伝子のサイズに制限されずに多様な治療用外来遺伝子を挿入し、前記ベクターは、癌のような非正常な細胞分裂を行う異常増殖細胞に９４〜１００％の高い感染率で感染されて外来遺伝子を伝達することができるが、このような伝達は、特異的に正常細胞には影響を及ぼさず、異常増殖細胞部位にのみ外来遺伝子を伝達することができるてめに、安全であり、一例として、異常増殖細胞である癌細胞に治療遺伝子を挿入した本発明のベクターを用いた場合、効果的に癌組織細胞のみを殺傷して、あらゆる実験体の生存期間を観察終了時点までいずれも生存を保持させることによって、本発明のベクターシステムは、癌のような異常増殖細胞惹起疾患予防または治療に効果的であるということを確認して、これを異常増殖細胞疾患予防または治療用薬学組成物として活用することができる。

Ｇａｇ遺伝子及びＰｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターの開裂地図を示した図面である。 ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターの開裂地図を示した図面である。 前記第２組換え発現ベクターに治療遺伝子が追加されたものを示した図面である。 ｓＲＣＲｇｐ−ＲＦＰのサブクローニングに関するものであって、ＦｖＧＥＬ１９９Ｅｎｖ配列を除去するために、ｐＲＣＲ（ＦｖＧＥＬ１９９）をＳｃａＩ、ＰｍｅＩに分解し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、自己結合させたものである。 ｓＲＣＲｇｐ−ＲＦＰのサブクローニングに関するものであって、マーカー遺伝子（ＲＦＰ）を挿入するために、ｓＲＣＲｇｐプラスミドをＥｃｏＲＩに分解し、ｐＬｅｎｔｉＭ１．４−ｍｏｎｏｍｅｒＲＦＰからＰＣＲ−で増幅させたｍＣＭＶプロモーター−ＲＦＰ切片を挿入したものである。 ｓｐＲＣＲｅ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）ＧＦＰのサブクローニングに関するものであって、図６のＡは、ｍＣＭＶプロモーターとＧＦＰ配列とを挿入するために、ｐＭＦＧ−ｅＧＦＰ−ＰｕｒｏをＸｈｏＩとＣｌａＩとに分解した後、ＰＣＲによってｐＬｅｎｔｉ−Ｍ１．４−ｅＧＦＰから増幅させたｍＣＭＶプロモーター−ｅＧＦＰ切片と結合させたものであり、図６のＢは、次にｐＭＹＫ−ｅｆ１−ＧａＬＶ−ＥｎｖのＧａＬＶ−Ｅｎｖ配列を増幅させ、ｐＭＦＧ−ｍＣＭＶ−ＧＦＰ２（図６のＡ）のＰｍｅＩに分解された地域に挿入したものである。 ｓｐＲＣＲｅ（ＧａｌＶ−Ｅｎｖ）ＴＫのサブクローニングに関するものであって、図７のＡは、ｓｐＲＣＲ （ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）ＭＣＳをサブクローニングするために、ｓｐＲＣＲｅ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰ上のｅＧＦＰを制限酵素に分解して除去させ、自己結合させた後、ＰＣＲ増幅（ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）ＭＣＳ）によってマルチクローニング位置を挿入させ、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）ＭＣＳをＰｍｅＩに分解させて、ＴＫ配列を挿入したものであり、図７のＢは、ｐＳＸＬＣ−ＴＫからＰｍｅＩに分解されたＴＫ切片をｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）ＭＣＳに挿入させたものである。 蛍光マーカータンパク質を発現するセミ−複製可能レトロウイルスベクターの構造を示したものであって、図８のＡは、ｓＲＣＲｇｐ−ＲＦＰが両末端のＬＴＲだけではなく、Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現構造及びＲＦＰ配列を含有したものであり、ｓＲＣＲｅ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰは、発現マーカーだけではなく、ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ発現構造及びＧＦＰ配列を含有したものであり、図８のＢは、ｓＲＣＲｅ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰ内のＭｕＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子をＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子に交換したものである。 ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックを示したものであって、図９のＡ、図９のＢは、ヒト神経膠腫細胞（Ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ）である、Ｕ−８７ＭＧを２．５Ｘ１０^７ゲノムコピー（ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｐｉｅｓ）からｓＲＣＲ−ＦＬまたはｓｐＲＣＲ−ＦＬに感染させたものであり、感染後、多様な時間点で、細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰまたはＲＦＰを発現する細胞のパーセンテージを決定するために、柔細胞分析器によって蛍光を測定したものである。 ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックを示したものであって、柔細胞分析器によって測定されたＧＦＰまたはＲＦＰを発現する細胞のパーセンテージを示した図面である。 ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックを示したものであって、図１１のＡ、図１１のＢは、Ｅｎｖベクター及びＧａｇ−Ｐｏｌベクターによって発現されるＧＦＰまたはＲＦＰのパーセンテージを示した図面である。 ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックを示したものであって、ｓｐＲＣＲｅ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰの複製キネティックをｓＲＣＲｅ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰと比較したものである。 ｌｏｗ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックに関するものであって、図１３のＡ、図１３のＢは、ヒト神経膠腫細胞である、Ｕ−８７ＭＧを１．５Ｘ１０^６ゲノムコピーのｓＲＣＲ−ＦＬまたはｓｐＲＣＲ−ＦＬに感染させ、以後、多様な時間点で細胞を蛍光顕微鏡下で観察したものであり、ＧＦＰまたはＲＦＰを発現させる細胞のパーセンテージを決定するために、柔細胞分析器によって測定された蛍光を示した図面である。 ｌｏｗ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックに関するものであって、柔細胞測定器によって測定されたＧＦＰまたはＲＦＰを発現する細胞のパーセンテージを示した図面である。 ｌｏｗ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックに関するものであって、Ｅｎｖベクター及びＧａｇ−Ｐｏｌベクターによって発現されるＧＦＰまたはＲＦＰのパーセンテージを示した図面である。 ｌｏｗ ｔｉｔｅｒ ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ及びｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬの複製キネティックに関するものであって、ｓｐＲＣＲｅ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰの複製キネティックをｓＲＣＲｅ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰと比較したものである。 発現するセミ−複製可能レトロウイルスベクターの構造を示したものであって、図１７のＡ、図１７のＢは、各ＥｎｖベクターでＧＦＰ遺伝子がヘルペスシンプレックススウイルスタイプＩチミジンキナーゼ遺伝子に置き換えられたものである。 ＴＫを発現するセミ−複製可能レトロウイルスベクターのＴＫ遺伝子の発現を示したものであって、ウェスタンブロッティングによってＡ５４９細胞でＨＳＶ−ＴＫ発現を観察したものである。レーン１（Ｌａｎｅ１）は、処理されていない（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）Ａ５４９を、レーン２（ｌａｎｅ２）は、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫウイルスで感染されたＡ５４９細胞を、レーン３（ｌａｎｅ３）は、ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫウイルスで感染されたＡ５４９細胞を、レーン４（ｌａｎｅ４）は、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫプラスミドでトランスフェクションされたｇｐ２９３細胞を示した図面である。 Ｕ−８７ＭＧでｓｅｍｉ−ＲＣＲ−ＴＫ／ＧＣＶの細胞毒性を示したものであって、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｕ−８７ＭＧを０日に０から７０μｇ／ｍｌに至る多様な濃度でＧＣＶ処理し、細胞の生存をＭＴＴ分析で決定したものである。 Ｕ−８７ＭＧでｓｅｍｉ−ＲＣＲ−ＴＫ／ＧＣＶの細胞毒性を示したものであって、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ、ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫ、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫ ｔｒａｓｎｄｕｃｅｄ Ｕ−８７ＭＧを１０μｇ／ｍｌ ＧＣＶで処理し、細胞の生存をＭＴＴ分析で決定したものである。 生体内ヒト神経膠腫（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ）でｓｅｍｉ−ＲＣＲウイルスの拡散を示すものであって、図２１のＡは、ヌードマウスの線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）内にヒト神経膠腫（Ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ）Ｕ−８７ＭＧを注入して癌を形成させ、７日後で、各ｓｅｍｉ−ＲＣＲ−ＦＬベクター１．５Ｘ１０^７ゲノムコピー（１０^４ＴＵ）を異種移植された癌内に注入し、ウイルス注入１８日後で、凍結切片（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）したものであり、図２１のＢ、図２１のＣは、ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ（図２１のＢ）またはｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＦＬ（図２１のＣ）拡散によるＧＦＰとＲＦＰとの発現の統合されたイメージを示した図面である。 脳腫瘍移植ヌードマウスで腫瘍にｓｐＲＣＲ−ＴＫを感染させた後、生存期間を調査したものである。 ｑＰＣＲ反応の標準曲線を描くために、１００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡに一定量のコピー数を添加した後、ＰＣＲを行った結果を示した図面である。３回の実験を行って計算した標準偏差を含んだデータを示す。 ヌードマウスの移植された脳腫瘍にｓｐＲＣＲ−ＧＦＰを腫瘍内注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、各臓器のＤＮＡ １００ｎｇを試料でｑＰＣＲを行ってＣｔ値をグラフで示した図面である。３回の実験を行って計算した標準偏差を含んだデータを示す。 ＰＣＲを用いて１００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡに存在するｓｐＲＣＲ−ＧＦＰゲノムの存在を確認した写真である。ヌードマウスの移植された脳腫瘍にｓｐＲＣＲ−ＧＦＰを腫瘍内注入した後、各臓器のＤＮＡ １００ｎｇを試料でＰＣＲを行って電気泳動した結果を示す。 ヌードマウスの移植された脳腫瘍にｓｐＲＣＲ−ＴＫを感染させた後、ウイルスの増殖を通じる癌組織内でのウイルス拡散をＰＥＴ−ＣＴを使って撮影したイメージである。

本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターと、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターと、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムを提供する。

前記第１組換え発現ベクターは、図１の開裂地図のベクターを含みうる。

前記第２組換え発現ベクターは、図２の開裂地図のベクターを含みうる。

前記第１組換え発現ベクターまたは第２組換え発現ベクターは、異常増殖細胞治療遺伝子を含みうる。

前記第２組換え発現ベクターは、図３の開裂地図のベクターを含みうる。

本発明は、前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを提供する。

本発明は、前記レトロウイルスを含む異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物を提供する。

前記異常増殖細胞は、癌細胞であり得る。

前記癌細胞は、粘液状細胞癌腫、丸い細胞癌腫、局所的進行腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ性転移、扁平上皮細胞癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫、経口癌腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄球白血病、毛様細胞性白血病、流出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞肺癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンソングリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生成腫瘍、悚素細胞肺癌、乳房癌、小細胞癌腫、導管癌腫、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸腫瘍の形成と関連した茸腫、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、１次表面膀胱腫瘍、膀胱の侵襲性転移細胞膀胱癌腫、筋浸潤性膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、食道癌、卵巣癌腫、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸管癌腫、膣癌、外陰部癌、子宮癌、卵胞中の固形腫瘍、睾丸癌、陰茎癌、腎臓細胞癌腫、脳癌、頭頸部癌、口頸部癌、神経芽細胞腫、脳幹神経膠腫、神経膠腫、中枢神経系中の転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫、骨肉種、悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌腫、甲状腺癌、網膜芽腫、神経芽細胞腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養芽細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、またはカポジ肉腫由来の細胞であり得る。

前記異常増殖細胞は、炎症性疾患または異常増殖血管疾患由来の非癌細胞であり得る。

前記炎症性疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、炎症−誘導骨疾患、退行性関節炎、糖尿病、自己免疫筋肉炎、動脈硬化、脳卒中、肝硬化、脳膜炎、炎症性胃潰瘍、胆嚢結石、腎臓結石、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性腸疾患、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、炎症性皮膚疾患、リウマチ関節炎、全身性紅斑性ループス、強直性脊椎炎、ベーチェット病、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、慢性単純苔癬、天疱瘡、ブルース天疱瘡、表皮水泡症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増多症、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、皮脂腺の疾患、口周囲皮膚炎、ひげ仮性毛嚢炎、薬物発疹、多形紅斑、結節性紅斑、環状肉芽腫、または骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ）由来の異常増殖細胞であり得る。

前記異常増殖血管疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再発狭窄症及び狭窄症、血管奇形、血液透析と関連した血管通路狭窄、移植後動脈病症、脈管炎、血管炎症疾患、ディジョージ症侯群、遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）、ケロイド性瘢痕、水泡疾患、過増殖性硝子体症侯群、未熟児網膜症、脈絡膜新生血管、黄斑変性、糖尿病性網膜症、眼内新生血管増殖、原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ、炎症性腸及び歯周疾患、子宮内膜症、卵巣嚢、卵巣過剰刺激症候群、関節炎、リウマチ性関節炎、慢性関節リウマチ、潤滑膜炎、骨関節炎、骨髄炎、骨増殖、敗血症、または血管漏出症侯群由来の異常増殖細胞であり得る。

本発明は、異常増殖細胞治療遺伝子で癌細胞治療遺伝子を挿入した前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルスを含む癌予防または治療用組成物を提供する。

前記癌治療遺伝子は、細胞自殺遺伝子、細胞死滅誘導遺伝子、免疫遺伝子、新生血管形成抑制遺伝子、及び癌細胞を死滅させることができる遺伝子沈黙（ＲＮＡｉ）を誘導するｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する塩基配列からなる群から選択された１つ以上を含みうる。

前記細胞自殺遺伝子は、前駆体薬物を活性化させることができる。

前記細胞自殺遺伝子は、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼであり、前駆体薬物であるＧＣＶを活性化させることができる。

本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターを製造する段階と、ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターを製造する段階と、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムの製造方法を提供する。

本発明は、ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子、ＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子及びＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を２つのベクターに分けて発現させたベクターシステム、前記ベクターシステムで細胞株をトランスフェクションさせて生産されたレトロウイルス、前記レトロウイルスを含む異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物、癌予防または治療用組成物、及びＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子、ＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子及びＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を２つのベクターに分けて発現させたベクターシステムの製造方法を提供するものであって、下記の実施例によってさらに詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示したものであって、本発明の内容が、実施例によって限定されるものではない。

実施例１：細胞培養
２９３Ｔ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、Ｕ−８７ＭＧ（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ）細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と抗生剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを入れたＤｕｌｂｅｃｃｏ´ミニマムエッセンシャル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。あらゆる実験で、細胞は、細胞培養容器（１００ｍｍ ｄｉｓｈ、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に５％ ＣＯ_２培養器で培養され、細胞頻度が７０〜８０％程度満ちれば、１：５で継代培養した。

実施例２：ベクターの製作
マーカー遺伝子、ＲＦＰが入っているｓＲＣＲｇｐ−ＲＦＰベクター（図４、図５参照）を作るために、ｐＲＣＲ（ＦｖＧＥＬ１９９Ｅｎｖ）のＦｖＧｅｌ１９９ＥｎｖをＳｃａIとＰｍｅIとに切り、ｐＬｅｎｔｉ Ｍ１．４−ｍｏｍｏｍｅｒＲＦＰベクターのｍＣＭＶプロモーターからＲＦＰまで部分をＰｐｕＭIとＮｏｔIとに切って、非粘着末端連結（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
マーカー遺伝子、ＧＦＰが入っているｓｐＲＣＲｅ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＧＦＰベクター（図６参照）を作るために、ＭＦＧ−ｅＧＦＰ−Ｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒのｇａｇ後のＸｈｏI ｓｉｔｅと３‘ＬＴＲの前のＣｌａI ｓｉｔｅとを切り、ｐＬｅｎｔｉ Ｍ１．４−ｅＧＦＰのｍＣＭＶからｅＧＦＰまでＰＣＲして切り取った位置に貼り付けた（Ｆｏｒｗａｒｄ：ＳａｌI−ＰｍｅI−ｍＣＭＶ、Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣｌａI−ＧＦＰ）。作られたＭＦＧ−ｍＣＭＶ−ＧＦＰ２ベクターのＧａｇとｍＣＭＶとの間にＧａＬＶ−Ｅｎｖ配列を入れるために、ＭＹＫ−ｅｆ１−ＧａＬＶ−Ｅｎｖを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）で両側プライマーいずれもＰｍｅI位置が含まれたプライマーを用いてＰＣＲし、前で作られたベクターをＰｍｅIに切って挿入体（Iｎｓｅｒｔ）と結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した。
マーカー遺伝子の代わりに、所望の治療遺伝子を入れるために、ｅＧＦＰをＢａｍＨIとＣｌａIとに切り取り、マルチクローニング位置（Ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を入れて、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＭＣＳベクターを作った。
ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＭＣＳにＴＫ遺伝子（図７参照）を入れるために、ｐＳＸＬＣ−ＴＫ ｖｅｃｔｏｒをＮｃｏIとＸｈｏIとに切ってＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）でｂｌｕｎｔ ｅｎｄを作り、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＭＣＳをＰｍｅIに切ってＣＩＡＰ処理後、挿入体と結合した。
ｓＲＣＲｅ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）ベクターを作るために、前で作ったＭＦＧ−ｍＣＭＶ−ＧＦＰ２のｍＣＭＶ前部をＰｍｅIに切った。Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ ｉｎｓｅｒｔを作るために、ＥＱＰＡＭ−ＡｍのＭｕＬＶ−Ｅｎｖ部分を前方（ｆｏｒｗａｒｄ）、逆方（ｒｅｖｅｒｓｅ）２つともＰｍｌI位置を含んだプライマーでＰＣＲして結合した。
ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）−ＲＦＰでＴＫ遺伝子を入れるために、ＲＦＰをＨｐａIに両側を切り、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）−ＴＫでＨｐａI、ＣｌａIにＴＫを切って非粘着（ｂｌｕｎｔ）に作った後、結合した。

実施例３：ウイルスの生産
２９３Ｔ細胞をトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）一日前６ウェルプレートに６×１０^５個／ｗｅｌｌの細胞を接種した。翌日培地をＦＢＳが入っていないＤＭＥＭで１ｍｌずつ取り替えた。細胞培養器にプレート（ｐｌａｔｅ）を再び入れ、２個の１．５ｍｌチューブにそれぞれＤＭＥＭを１００μl／ｗｅｌｌずつ入れた。１つのチューブ（ｔｕｂｅ）に前記の表にあるＤＮＡ（ｔｏｔａｌ １μg）とＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μl／ｗｅｌｌ、他の１つには、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３μl／ｗｅｌｌを入れ、１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）する。１５分間常温で培養した後、リポフェクタミンが入っているチューブの溶液をＰＬＵＳが入っているチューブに入れ、再び１０秒間ボルテックスした。２０分間常温で培養した後、細胞が敷かれているプレートを取り出して２０８μl／ｗｅｌｌを細胞が落ちないようにぽたぽた落とした。細胞培養器に入れた後、４時間後で細胞培地を除去し、３％ ＦＢＳが入っているＤＭＥＭを気をつけて入れた。動物実験に使われるウイルスは、ＦＢＳを添加しなかった。４８時間後、培地を収穫してチューブに集めた。ウイルス濃縮と精製とのために、Ａｍｉｃｏｎ １００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に収穫したウイルスを入れ、４℃で３，０００ｒｐｍで１０×になるまで遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）した。１．５ｍｌチューブに作った日付を表示し、１００μlずつ分周して、−８０℃に保管した。
ウイルス定量のために、リアルタイムＰＣＲのためのレトロウイルス力価セット（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｓｅｔ ｆｏｒ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ、ＴａＫａＲａ）を利用した。このキット（ｋｉｔ）のプライマーは、ＭｕＬＶパッキング信号部分（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）を認識し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎIをマーカープローブ（ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｂｅ）で有している。ウイルスをトランスフェクション時、過量のＤＮＡを使うので、これを除去するために、次のようにＤＮａｓｅI過程［総２５μl（Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ １２．５μl、１０×ＤＮａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μl、ＤＮａｓｅ（５Ｕ／μl）２．０μl、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μl）０．５μl、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ７．５μl）；３７℃、３０分／７０℃、１０分］を経た。
Ｋｉｔに入っているＲＮＡ対照群鋳型（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）で一連に希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して、基準サンプル（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ）を準備した（１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８ｃｏｐｉｅｓ／μl）。次のようにリアルタイム（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）ＰＣＲを行った［総２５μl（２×Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＲＴ−ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒIII １２．５μl、ＴａＫａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５ｕ／μl）０．５μl、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ ＭｉｘII ０．５μl、Ｆｏｒｗａａｒｄ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ＦＲＴ−１（１０ｐｍｏｌ／μl）０．５μl、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ＦＲＴ−１（１０ｐｍｏｌ／μl）０．５μl、Ｖｉｒｕｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔまたはｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ ２μl、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ８．５μl；Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、４２℃、５分／９５℃、１０秒；ＰＣＲ、４０ｃｙｃｌｅ、９５℃、５秒／６０℃ ３０秒；Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、９５℃、１５秒／６０℃、３０秒／９５℃、１５秒］。
基準カーブ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を、そして、サンプル（ｓａｍｐｌｅ）値を計算した。

実施例４：実験室（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｓｐＲＣＲベクターの経時的な複製の態様
既存に使うＭｕＬＶに基づいたＲＣＲベクターは、１つのベクターでＧａｇ−Ｐｏｌ、ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ、そして、その後で、レポーター遺伝子（または、治療遺伝子）が発現するものであった。しかし、本研究で使われたセミ−複製可能偽型レトロウイルス（ｓｅｍｉ−ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ；ｓｐＲＣＲ）は、Ｇａｇ−ＰｏｌとＧａＬＶ−Ｅｎｖ、レポーター遺伝子（または、治療遺伝子）が２つのベクターで分けて発現される。ｓＲＣＲｇｐベクターは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ遺伝子を発現し、ＲＦＰで細胞内発現を確認することができる。ｓＲＣＲｅ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）、ｓｐＲＣＲｅ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）ベクターは、それぞれＭｕＬＶ−Ｅｎｖ、ＧａＬＶ−Ｅｎｖが発現され、ＧＦＰで確認することができる（図８）。
ウイルスは、２つのベクターを２９３Ｔ細胞に一時的トランスフェクト（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）もさせて、上層培地を通じて生産された。このウイルスでｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行って、ゲノムコピー（ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｐｙ）を算出した。２．５×１０^７、１．５×１０^６ｇｃ（０．０１ＭＯＩ、０．０００５ＭＯＩ）のｓｐＲＣＲ−ＦＬとｓＲＣＲ−ＦＬとをＵ−８７ＭＧ細胞に感染させて、２〜３日ごとに継代培養する前に蛍光写真を撮り、培養し、残った細胞は、ＦＡＣＳ分析を行った。ＦＡＣＳデータによれば、まず、高い力価（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ、ｇｃ）を感染させた時を見れば、感染速度や蛍光強度がｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）がｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）よりも比較的高かった。感染後、１２日目のｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）は、まだ８０％線に留まっている一方、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）は、ほぼ１００％の感染率に行っていた（図９〜図１２）。低い力価で感染させれば、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）とｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）との感染速度差がさらに顕著であった。低い力価で感染させた時の初期感染速度は、２つとも遅れるが、感染後、２０日になった時、ｓＲＣＲ（ＭｕＬＶ−Ｅｎｖ）は、２％しか感染されない一方、ｓｐＲＣＲ（ＧａＬＶ−Ｅｎｖ）は、９４％まで占有されていた（図１３〜図１６）。

実施例５：ｓｐＲＣＲ−ＴＫから発現されるチミジンキナーゼタンパク質の確認
レポーター遺伝子を発現するＥｎｖベクターでＧＦＰ遺伝子を除去し、治療遺伝子であるチミジンキナーゼ遺伝子をクローニングした（図１７）。ｓｐＲＣＲ−ＴＫベクターで実際にＴＫタンパク質が発現されるかを確認するために、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。
図１８で示すように、何らの処理もしていないＡ５４９細胞では、バンドが出ず、ＴＫ遺伝子を発現するｓｐＲＣＲ−ＴＫ、ｓＲＣＲ−ＴＫ、ｐＲＣＲ−ＴＫを感染させた細胞やトランスタクション（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）させた細胞では、バンドを観察することができた。

実施例６：ＧＣＶ濃度によるｓｐＲＣＲ−ＴＫ感染細胞の敏感度
実験室（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でｓｐＲＣＲ−ＴＫに感染された細胞がＧＣＶを処理した時、ある程度の細胞毒性を示すかを測定するために、ＭＴＴアッセイを行った。まず、ＥｎｖベクターのＧＦＰの代わりに、治療遺伝子であるＴＫが入ったベクターを作って、２９３Ｔ細胞にＧａｇ−ｐｏｌベクターと共にトランスフェクションさせて、ｓｐＲＣＲ−ＴＫを作った。Ｕ−８７ＭＧ細胞に、これらウイルスを感染させて、１４日間保持させた後、９６ウェルプレートに感染させた細胞と感染させていない細胞とを接種した。翌日ＧＣＶの濃度を０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０μｇ／ｍｌに漸次的に増やして処理した。ＧＣＶを処理した期間を１、２、３、４日に分けて、その度にＭＴＴアッセイを進行した。
ＧＣＶ １０μｇ／ｍｌの濃度処理一日目、ｓＲＣＲ−ＴＫに感染された細胞でＧＣＶ処理一日のみ細胞数が４０％減少し、ｓｐＲＣＲ−ＴＫに感染された細胞では、６０％減少した。正常細胞では、ＧＣＶ ７０μｇ／ｍｌの濃度から細胞毒性を表わした（図１９、図２０）。

実施例７：癌組織でｓｐＲＣＲ−ＦＬ、ｓＲＣＲ−ＦＬの拡散の態様
ｓｐＲＣＲ−ＦＬ、ｓＲＣＲ−ＦＬが、実際ヌードマウスの癌組織で広がる態様を調べるために、ヌードマウス脳の線条体に３×１０^５ Ｕ−８７ＭＧ細胞を植えた。癌移植７日後、１．５×１０^７ｇｃ（≒１０^４ ＴＵ）／１０μlウイルスベクターが癌に注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）させた。ウイルス注入後、１８日後、癌組織を蛍光顕微鏡で観察した。
正常細胞と癌細胞とを境界にして鮮明に癌細胞にのみ蛍光が観察され、脳（ｂｒａｉｎ）のどちらでもウイルスの感染された所はなかった。ｓＲＣＲ−ＦＬ感染された癌細胞では、蛍光強度も非常に弱く、ウイルスが局所的に感染されている一方、ｓｐＲＣＲ−ＦＬが感染された細胞では、ウイルスが癌細胞の形状に全体的に鮮明に発現された（図２１）。

実施例８：脳腫瘍移植ヌードマウスで腫瘍にｓｐＲＣＲ−ＴＫ感染時（＋ＧＣＶ注射）の生存期間
前記のような方法でヌードマウスの線条体にＵ−８７ＭＧ細胞を移植した。一週間後、１．５×１０^７ｇｃ（≒１０^４ ＴＵ）／１０μlのｓｐＲＣＲ−ＴＫと１０μl ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ）とを癌内注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。癌細胞移植後、２１日後から５１日までＰＢＳまたはＧＣＶ（１００ｍｇ／kg）を腹腔注射した。
対照群のマウス（Ｎ＝１３）は、癌移植後、４０日前後でいずれも死亡し、治療群のマウス（Ｎ＝２１）は、毎日１００ｍｇ／ｋｇ ＧＣＶ注射を受け、観察を終了した癌移植後、７０日までいずれも生存しているだけではなく、体重も正常に保持した（図２２）。

実施例９：ｓｐＲＣＲベクターの安全性
６週齢、雌ヌードマウスの線条体に３×１０^５個のＵ−８７ＭＧ細胞を移植してから７日後、１０^７ｇｃ ｓｐＲＣＲ−ＦＬベクターを腫瘍内注入する。注入後、７日後、マウスを貫流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）し、癌（ｔｕｍｏｒ）横の正常な脳、腫瘍（ｔｕｍｏｒ）、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、腸、卵巣、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）、手術部位の皮膚を滅菌された条件で取り外した。組織フリーキット（Ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ、ＧｅｎｅＡｌｌ）でゲノムＤＮＡをｐｒｅｐした。
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲのために、表５のようにプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）をデザインした。

ＰＣＲ反応のための組成は、２ＸＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２Ｘ）１０μl、センスプライマー（Ｓｅｎｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、１０ｐｍｏｌ／μl）０．４μl、アンチセンスプライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、１０ｐｍｏｌ／μl）０．４μl、ｇＤＮＡ（５０ｎｇ／μl）２μl、ＦＡＭプローブ（１００ｐｍｏｌ／μl）０．０３μl、滅菌水（Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）７．２μlで総２０．０３μlにした。
ＣＦＸ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｃ１０００ Ｔｈｅｒｍｏ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で９５℃で３分、９５℃で２０秒、５８℃で６０秒で４０サイクル（ｃｙｃｌｅ）反応を進行し、反応終了後、データを分析した。
前記と同じ組織の一般ＰＣＲ遂行のために、０．５μgサンプルＤＮＡ、０．５μＭ各プライマー（ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ）、５ｕｎｉｔｓ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼを２０μl準備し、３０サイクル、９４℃１分、６０℃３０秒、７２℃１分ＰＣＲした。ベクターのｐｏｌとＧＦＰとを認識するプライマーを用いた。生産物のサイズは、３．５ｋｂであり、プライマー配列は、表６のようである。

ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に１００Ｖ、４０分間電気泳動した。
正常脳、脳腫瘍、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、腸、卵巣、骨髄、手術部位の皮膚でのゲノムＤＮＡを抜き出して、ｑＰＣＲとＰＣＲ分析を行った結果、腫瘍組織でのみＧＦＰ配列が確認され、他のあらゆる組織では、ＧＦＰ配列が確認されなかった（図２３〜図２５）。

実施例１０：脳腫瘍内ＨＳＶ−ＴＫ発現マウスのＰＥＴ−ＣＴ撮影
前記のような方法でヌードマウスの線条体にＵ−８７ＭＧ細胞を移植した。（ｎ＝６）一週間後、１．５×１０^７ｇｃ（≒１０４ ＴＵ）／１０μlの比較群ｓｐＲＣＲｅ−ＴＫ（複製不能）または複製可能ｓｐＲＣＲ−ＴＫウイルスを癌組織内に注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。ウイルスを注入した後、３、７、１０、１４、１７日に、次のようにＰＥＴ−ＣＴ撮影を行った。［^１８Ｆ］ＦＨＢＧをマウス一匹当たり５００μＣｉ／５０μlをしっぽ静脈（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ；ｉ．ｖ．）注入した後、１時間後で、ａｎｉｍａｌ ＰＥＴ−ＣＴ（ｅＸｐｌｏｒｅ ＶＩＳＴＡ ＣＴ、ＧＥ）を撮影する過程に進められた。ＣＴの撮影条件は、２５０μA、４０ＫＡであり、ＰＥＴ撮影は、５分間映像を得た後、２Ｄ ＯＳＥＭ再構造（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）過程を経て完成することができた。このように得られた映像は、Ｏｓｉｒｉｘ ｉｍａｇｉｎｇソフトウェア（Ｔｈｅ Ｏｓｉｒｉｘ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って分析及び具現した（図２６）。
図２６に表われたように、複製不能ウイルスの場合、癌組織への拡散がほとんど起こっていない一方に、複製可能ｓｐＲＣＲ−ＴＫウイルスは、非常に効率的に癌組織内での拡散が起こるということが分かった。

本発明は、複製可能偽型レトロウイルスベクターシステム関連の分野に適用可能である。

Claims (14)

1. ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターと、
   ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターと、
   を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムであって、
   前記第１組換え発現ベクターは、図１の開裂地図のベクターであり、かつ、
   前記第２組換え発現ベクターは、図２の開裂地図のベクターである
   複製可能偽型レトロウイルスベクターシステム。
2. 前記第１組換え発現ベクターまたは第２組換え発現ベクターは、異常増殖細胞治療遺伝子を含む請求項１に記載の複製可能偽型レトロウイルスベクターシステム。
3. 前記第２組換え発現ベクターは、図３の開裂地図のベクターである請求項２に記載の複製可能偽型レトロウイルスベクターシステム。
4. 請求項１ないし請求項３のうち何れか一項に記載の複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムを含む異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物。
5. 前記異常増殖細胞は、癌細胞である請求項４に記載の異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物。
6. 前記癌細胞は、粘液状細胞癌腫、丸い細胞癌腫、局所的進行腫瘍、転移性癌、ユーイング肉腫、癌転移、リンパ性転移、扁平上皮細胞癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫、経口癌腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄球白血病、毛様細胞性白血病、流出リンパ腫（体腔系リンパ腫）、胸腺リンパ腫肺癌、小細胞肺癌腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生成腫瘍、非小細胞肺癌、乳房癌、小細胞癌腫、導管癌腫、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸腫瘍の形成と関連した茸腫、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、１次表面膀胱腫瘍、膀胱の侵襲性転移細胞膀胱癌腫、筋浸潤性膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、食道癌、卵巣癌腫、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、原発性腹膜上皮新生物、子宮頸管癌腫、膣癌、外陰部癌、子宮癌、卵胞中の固形腫瘍、睾丸癌、陰茎癌、腎臓細胞癌腫、脳癌、頭頸部癌、口頸部癌、神経芽細胞腫、脳幹神経膠腫、神経膠腫、中枢神経系中の転移性腫瘍細胞浸潤、骨腫、骨肉種、悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌腫、甲状腺癌、網膜芽腫、神経芽細胞腫、中皮腫、ウィルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養芽細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、またはカポジ肉腫由来の細胞である請求項５に記載の異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物。
7. 前記異常増殖細胞は、炎症性疾患または異常増殖血管疾患由来の非癌性異常増殖細胞である請求項４に記載の異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物。
8. 前記炎症性疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、炎症−誘導骨疾患、退行性関節炎、糖尿病、自己免疫筋肉炎、動脈硬化、脳卒中、肝硬化、脳膜炎、炎症性胃潰瘍、胆嚢結石、腎臓結石、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性腸疾患、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、炎症性皮膚疾患、リウマチ関節炎、全身性紅斑性ループス、強直性脊椎炎、ベーチェット病、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、慢性単純苔癬、天疱瘡、ブルース天疱瘡、表皮水泡症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増多、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、皮脂腺の疾患、口周囲皮膚炎、ひげ仮性毛嚢炎、薬物発疹、多形紅斑、結節性紅斑、環状肉芽腫、または骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ）由来の異常増殖細胞である請求項７に記載の異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物。
9. 前記異常増殖血管疾患由来の非癌性異常増殖細胞は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再発狭窄症及び狭窄症、血管奇形、血液透析と関連した血管通路狭窄、移植後動脈病症、脈管炎、血管炎症疾患、ディジョージ症侯群、遺伝性出血性毛細管拡張症（ＨＨＴ）、ケロイド性瘢痕、水泡疾患、過増殖性硝子体症侯群、未熟児網膜症、脈絡膜新生血管、黄斑変性、糖尿病性網膜症、眼内新生血管増殖、原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ、炎症性腸及び歯周疾患、子宮内膜症、卵巣嚢、卵巣過剰刺激症候群、関節炎、リウマチ性関節炎、慢性関節リウマチ、潤滑膜炎、骨関節炎、骨髄炎、骨増殖、敗血症、または血管漏出症侯群由来の異常増殖細胞である請求項７に記載の異常増殖細胞標的性遺伝子伝達用の組成物。
10. 異常増殖細胞治療遺伝子、例えば、癌細胞治療遺伝子を挿入した請求項２に記載の複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムを含む癌予防または治療用組成物。
11. 前記癌治療遺伝子は、細胞自殺遺伝子、細胞死滅誘導遺伝子、免疫遺伝子、新生血管形成抑制遺伝子、及び癌細胞を死滅させることができる遺伝子沈黙（ＲＮＡｉ）を誘導するｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する塩基配列からなる群から選択された１つ以上を含む請求項１０に記載の癌予防または治療用組成物。
12. 前記細胞自殺遺伝子は、前駆体薬物を活性化させる請求項１１に記載の癌予防または治療用組成物。
13. 前記細胞自殺遺伝子は、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジンキナーゼであり、前駆体薬物であるＧＣＶを活性化させる請求項１２に記載の癌予防または治療用組成物。
14. ＭｕＬＶ−Ｇａｇ遺伝子及びＭｕＬＶ−Ｐｏｌ遺伝子を含む第１組換え発現ベクターを製造する段階と、
    ＧａＬＶ−Ｅｎｖ遺伝子を含む第２組換え発現ベクターを製造する段階と、を含む複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムの製造方法であって、
    前記第１組換え発現ベクターは、図１の開裂地図のベクターであり、かつ、
    前記第２組換え発現ベクターは、図２の開裂地図のベクターである複製可能偽型レトロウイルスベクターシステムの製造方法。