ES2694778T3 - Vectores de expresión que comprenden secuencias promotoras y potenciadoras quiméricas de citomegalovirus - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en células de mamífero, el vector comprendiendo una primera secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende: i) una secuencia promotora procedente del promotor de IE1 del citomegalovirus humano que consiste en la SEQ ID NO: 5 y que está unida operativamente al sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar; y ii) una secuencia potenciadora procedente de la región IE1 del citomegalovirus de simio o que representa una quimera procedente de la región IE1 del citomegalovirus humano y de simio, estando situada la secuencia potenciadora en 5' y unida operativamente a la secuencia promotora humana, en donde la secuencia potenciadora comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.

Description

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DESCRIPCION

Vectores de expresión que comprenden secuencias promotoras y potenciadoras quiméricas de citomegalovirus Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas de expresión en mamíferos, y en particular a construcciones de expresión que comprenden secuencias reguladoras de promotores quiméricos para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en células de mamíferos. Las secuencias reguladoras de promotores quiméricos están compuestas de una secuencia promotora procedente del promotor de IE1 del citomegalovirus humano que consiste en la SEQ ID NO: 5 y una secuencia potenciadora procedente de la región IE1 del citomegalovirus de simio o que representa una quimera procedente de las regiones IE1 del citomegalovirus humano y de simio, comprendiendo la secuencia potenciadora la SEQ ID NO: 6.

Antecedentes

Los (poli)péptidos y proteínas recombinantes para aplicaciones en investigación básica, en diagnóstico y terapia, tales como moléculas de anticuerpos, vacunas, hormonas y factores de crecimiento, se producen utilizando una amplia variedad de organismos modificados genéticamente que incluyen tanto células procariotas como eucariotas. Sin embargo, la gran mayoría de péptidos o proteínas recombinantes incluyen modificaciones postraduccionales que no pueden ser imitadas ni reproducidas cuando se usan células hospedantes procariotas. Por esta razón, los sistemas de expresión génica de mamíferos han dejado de representar una opción preferida.

Los sistemas de expresión de mamíferos basados en células de ovario de hámster chino (CHO) se usan ampliamente en la producción de proteínas recombinantes. Además de las líneas celulares linfoides, las células de CHO representan uno de los pocos tipos de células que permiten un cultivo sencillo y eficaz por lotes en suspensión de alta densidad de células animales. Además, el uso de células de CHO da como resultado altos rendimientos del producto, mientras que las células linfoides son más difíciles de cultivar a escala industrial. En vista de los costos considerables para la producción recombinante de polipéptidos y proteínas, también es de suma importancia maximizar el rendimiento de la proteína recombinante por operación del biorreactor. Los parámetros del proceso que tienen un impacto considerable sobre el rendimiento del producto incluyen, entre otros, las condiciones del cultivo celular, el número de copias de los ácidos nucleicos (genes) que se han de expresar, la eficiencia con la que estos genes son transcritos y los mRNA correspondientes que se traducen, la estabilidad del mRNA, y similares.

Por consiguiente, las mejoras de la fuerza o actividad transcripcional de los elementos genéticos reguladores que controlan la expresión génica constituyen un factor particularmente crítico para aumentar el rendimiento de la proteína recombinante producida. Incluso pequeños aumentos progresivos en la actividad transcripcional solo a nivel celular se traducirán finalmente en mejoras considerables en el rendimiento del producto en cultivos por lotes de alta densidad a escala industrial.

La gran mayoría de los sistemas de expresión génica de mamíferos emplea vectores de expresión que codifican las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que se han de expresar bajo el control de secuencias reguladoras promotoras procedentes de virus. Dos de los elementos reguladores virales más frecuentemente utilizados en estos casetes de expresión son los de los genes tempranos inmediatos 1 y 2 (IE1 e IE2) del citomegalovirus humano (hCMV). Sin embargo, una desventaja asociada al uso de los elementos reguladores IE1 e IE2 de hCMV es su pronunciada especificidad de especies.

La patente de EE.UU. 5.866.359 describe que la expresión génica de dicho promotor de hCMV se puede mejorar coexpresando la proteína EIA adenovírica bajo el control de un promotor débil. EIA es un factor de transcripción multifuncional que puede actuar sobre la regulación del ciclo celular y tiene dominios tanto activadores transcripcionales independientes como funcionales represores. El ajuste fino de la expresión de EIA es crucial para lograr el equilibrio ideal entre la transactivación génica y cualquier impacto negativo sobre la progresión del ciclo celular. Sin embargo, la sobreexpresión de la expresión de EIA podría reducir la capacidad de la célula para sintetizar la proteína recombinante de interés.

La patente de EE.UU. 5.591.639 describe vectores que comprenden, aguas arriba (5') de una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que se ha de expresar, el potenciador, el promotor y la región no traducida en 5' completa del principal gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV-MIE), incluyendo el intrón A (es decir, el primer intrón natural). Sin embargo, si estaban presentes las primeras 400 pb (extremo 5') de esta secuencia (longitud total de aproximadamente 2100 pb), se observaban bajas tasas de expresión génica tanto en células COS7 como en células de CHO (Chapman, B.S. et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 3979-3986).

La actividad transcripcional de los elementos reguladores de los genes tempranos inmediatos del citomegalovirus de múrido (mCMV) es mayor que la de los correspondientes de hCMV sin presentar la preferencia de especies pronunciada observada para las secuencias humanas (Addison, C.L. et al., (1987). J. Gen. Virol. 78, 1653-1661).

La publicación de patente internacional WO 2004/081167 describe vectores de expresión que comprenden el promotor IE2 de mCMV que se puede usar en combinación con un elemento potenciador de IE2 de mCMV. Keil y

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colaboradores (Keil, G.M. et al., (2009) J. Virol. Meth. 160, 132-137) describieron vectores de expresión para la expresión simultánea de proteínas duales de alto nivel en células de vertebrados e insectos empleando elementos promotores y potenciadores de IE1 de mCMV en combinación con un promotor de baculovirus. Finalmente, en la solicitud de patente europea EP 0314161 se describen construcciones de promotores quiméricos que comprenden secuencias promotoras y potenciadoras, cada una de ellas de genes IE del citomegalovirus de origen humano, de múrido o de simio.

Sin embargo, fracasaron los intentos para mejorar la actividad de los elementos reguladores del promotor de IE de mCMV, análogamente a los correspondientes de hCMV, por la inserción del primer intrón natural del principal gen temprano inmediato de múrido aguas abajo (3') del promotor de IE de mCMV (véase, entre otros, la patente EP 1525320 B1). Sin embargo, la generación de vectores de expresión que comprende un casete quimérico compuesto por los elementos reguladores de IE1 de mCMV y el primer intrón natural del principal gen temprano inmediato humano dio como resultado rendimientos de producto comparables al uso de las secuencias completamente humanas (véase, por ejemplo, WO 2006/111387 A2). También se obtuvieron tasas de expresión génica similares para los vectores de expresión que comprendían las secuencias reguladoras de IE2 de mCMV (véase, entre otros, la patente EP 1601776 B1).

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas mejorados de expresión génica de mamíferos que den como resultado altos rendimientos de los polipéptidos o las proteínas recombinantes producidos. En particular, existe la necesidad de sistemas de expresión génica de mamíferos que superen las limitaciones antes mencionadas, es decir, sistemas de expresión basados en las secuencias promotoras de mCMV o de hCMV pero que logren mayores tasas de expresión (y, por lo tanto, rendimientos de producto) que con los sistemas disponibles.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar dichos sistemas de expresión génica, principalmente construcciones de expresión adecuadas y las correspondientes células hospedantes de mamíferos.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en células de mamífero, comprendiendo el vector una primera secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende:

i) una secuencia promotora del promotor de IE1 del citomegalovirus humano que consiste en la SEQ ID NO: 5 y que está unida operativamente al sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar; y

ii) una secuencia potenciadora de la región IE1 del citomegalovirus de simio o que representa una quimera de la región IE1 del citomegalovirus humano y de simio, estando situada la secuencia potenciadora en 5' y unida operativamente a la secuencia promotora humana, en donde la secuencia potenciadora comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.

En realizaciones particularmente preferidas, la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 13.

En otras realizaciones particulares, el vector de expresión comprende además una segunda secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la segunda secuencia reguladora del promotor quimérico es idéntica a la primera secuencia reguladora del promotor quimérico.

En realizaciones particulares alternativas, el vector de expresión comprende además una segunda secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la segunda secuencia reguladora del promotor quimérico es diferente de la primera secuencia reguladora del promotor quimérico.

Preferiblemente, la primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos que se han de expresar codifican diferentes polipéptidos. En realizaciones específicas, los diferentes polipéptidos representan subunidades de una proteína dimérica o multimérica. De manera particularmente preferible, la proteína dimérica o multimérica es una molécula de anticuerpo.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedante de mamífero transfectada con un vector de expresión, como se ha definido antes en la presente memoria. Preferiblemente, la célula hospedante es una célula de CHO.

Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula hospedante de mamífero, que comprende:

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i) transfectar la célula hospedante de mamífero con un vector de expresión, como se ha definido antes en la presente memoria; y

ii) cultivar la célula hospedante de mamífero transfectada en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de interés.

En realizaciones preferidas, la transfección es una transfección estable.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un vector de expresión, como se ha definido antes en la presente memoria, para la expresión heteróloga in vitro de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula hospedante de mamífero.

Otras realizaciones de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la descripción detallada siguiente. Descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el vector de expresión pRY42 (SEQ ID NO: 1) utilizado como “vector precursor” para generar los vectores de expresión de mamíferos, como se define en la presente memoria. El pRY42 abarca dos casetes reguladores para dirigir la expresión génica heteróloga (entre “mCMV” y “pA”, respectivamente): Múltiples sitios de clonación situados en 3' (es decir, “aguas abajo”) de las regiones “Ex2” para la inserción de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que se han de expresar. Los casetes reguladores están flanqueados por sitios diana de reconocimiento de flipasa de tipo natural (“wFRT”) y mutantes (“F5-mFRT”). Se ha añadido un codón de metionina de iniciación en marco al extremo 5' del sitio wFRT (“ATG+F”). Un promotor temprano de SV40 (“SV”) está localizado en 5' (“aguas arriba”) de ATG+F. La transcripción de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas es dirigida por el promotor del gen IE1 del citomegalovirus de múrido (“mCMV”) que va seguido por 5'UTR, donde el exón 1 (“Ex1”) es un híbrido de secuencias derivadas de CMV de múrido (“m”) y humano (“h”), y donde el exón 2 (“Ex2”) y la secuencia del intrón A (“Int A”) proceden de la secuencia de hCMV. El gen marcador de selección de p- lactamasa se denomina “bla”. El pRY42 se usa como vector diana para clonar las diferentes secuencias reguladoras del promotor quimérico, como se define en la presente memoria.

La Figura 2 ilustra el vector de expresión pRY57 (SEQ ID NO: 2) que codifica la cadena ligera (“CL”) y la cadena pesada (“CP”) del anticuerpo monoclonal quimérico de ratón-humano (mAb) cB72.3 (Whittle, N. et al., (1987) Protein Eng. 1, 499-505), cada una situada entre los sitios de clonación 3' de las regiones “Ex2” y los sitios de poliadenilación (“pA”), respectivamente. Por lo demás, el pRY57 es idéntico al pRY42. Las secuencias de ácidos nucleicos de CL y CP de pRY57 se separaron y clonaron en variantes de pRY42 en las que la secuencia promotora del mCMV original fue reemplazada por las diferentes secuencias reguladoras del promotor quimérico, como se define en la presente memoria.

La Figura 3 representa esquemáticamente la secuencia promotora del mCMV original (SEQ ID NO: 3) incluida en pRY42 (parte superior) así como cinco secuencias reguladoras de diferentes promotores quiméricos (construcciones “1 a 5”), principalmente SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 11, respectivamente, que no forman parte de la presente invención, y que comprenden secuencias promotoras de IE1 de CMV de múrido (mCMV) situadas en 3' de elementos potenciadores procedentes de la región IE1 de CMV de simio (sCMV) y/o humano (hCMV). Además, se muestran dos secuencias reguladoras adicionales del promotor quimérico (construcciones “6 y 7”), como se definen en la presente memoria (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13), que comprenden secuencias promotoras de IE1 de hCMV situadas en 3' de elementos potenciadores procedentes de la región IE1 de sCMV de simio y/o hCMV humano. Todas las secuencias promotoras de mCMV y hCMV empleadas específicamente en la presente invención incluyen en sus extremos 3' un nucleótido de guanosina (“G”) adicional, que representa el sitio de iniciación de la transcripción.

La Figura 4 muestra una comparación de las concentraciones de mAb cB72.3 producido en líneas de CHO estables donde la expresión génica de las secuencias del mAb estaba bajo el control de las construcciones quiméricas 1 a 5 (que no forman parte de la presente invención), como se ilustra en la Figura 3. La determinación se realizó por HPLC con proteína A después de 15 días de crecimiento en 50 mL de medio de cultivo en un matraz E250 con agitación utilizando un protocolo de sobrecrecimiento alimentado en lotes (abreviadamente FOG, por la expresión inglesa Fed Batch Overgrow). Para cada una de las construcciones quiméricas, n = 4, que representa análisis de lotes alimentados por duplicado para las transfecciones por duplicado, con la excepción de la construcción 4, donde n = 6 (análisis FOG duplicados para las transfecciones por triplicado) y pRY57 (mCMV original), donde n = 8, combinándose los puntos de datos de los experimentos 1 y 2.

La Figura 5 muestra una comparación de las concentraciones del mAb cB72.3 producidas en líneas de CHO estables en donde la expresión génica de las secuencias del mAb estaba bajo el control de las construcciones quiméricas 6 y 7, como se ilustra en la Figura 3. La determinación se realizó por HPLC con proteína A después de 7 días de crecimiento en 30 mL de medio de cultivo en un matraz E125 con agitación utilizando un protocolo de sobrecrecimiento en lotes (abreviadamente BOG por la expresión inglesa Batch OverGrow). Para mCMV y la construcción 7, n = 6 (análisis de lotes por duplicado para transfecciones por triplicado), y para la construcción 6, n = 4 (análisis de lotes por duplicado para transfecciones por duplicado).

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que los vectores de expresión de mamíferos que comprenden secuencias reguladoras del promotor quimérico (es decir, híbridas) que están compuestas de una secuencia promotora de IE1 de hCMV particular en unión operativa al sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar y una secuencia potenciadora de IE1 de sCMV o de IE1 de sCMV/hCMV que está localizada en 5' y unida operativamente a la secuencia promotora de mCMV o de hCMV dio como resultado tasas de expresión génica significativamente mejoradas en comparación con los sistemas de expresión existentes solo basados en secuencias promotoras de mCMV, y por tanto también con rendimientos mucho mayores (hasta un aumento de casi 3 veces) de las proteínas recombinantes producidas.

Por consiguiente, los vectores de expresión de mamíferos como se definen en la presente memoria representan herramientas moleculares superiores para la producción de proteínas recombinantes, particularmente a escala industrial.

Cuando el término “que comprende” se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones, no excluye otros elementos o etapas. Para los fines de la presente invención, el término “que consiste en” se considera que es una realización preferida del término “que comprende”. Si en lo sucesivo un grupo se define como que comprende al menos cierto número de realizaciones, también debe entenderse que describe un grupo, que consiste preferiblemente solo en estas realizaciones.

Cuando se usa un artículo indefinido o definido en referencia a un sustantivo singular, por ejemplo, “un”, “una” o “el”, incluye un plural de ese sustantivo a menos que se especifique lo contrario.

En el caso de que en el contexto de la presente invención se indiquen valores numéricos, el experto en la técnica entenderá que el efecto técnico de la característica en cuestión se garantiza dentro de un intervalo de precisión, que abarca típicamente una desviación del valor numérico dado de ± 10%, y preferiblemente de ± 5%.

Además, los términos primero, segundo, tercero, (a), (b), (c) y similares, en la descripción y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos utilizados de esta manera son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria son capaces de funcionar en otras secuencias distintas de las descritas o ilustradas en la presente memoria.

A continuación, se darán definiciones adicionales de un término en el contexto en el que se usan los términos. Los siguientes términos o definiciones se proporcionan únicamente para ayudar en la comprensión de la invención. Estas definiciones no se deben considerar de modo que tengan un alcance menor que el que entiende una persona con experiencia ordinaria en la técnica.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en células de mamífero, comprendiendo el vector una primera secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende:

i) una secuencia promotora del promotor de IE1 de citomegalovirus humano que consiste en la SEQ ID NO: 5 y que está unida operativamente al sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar; y

ii) una secuencia potenciadora de la región IE1 del citomegalovirus de simio o que representa una quimera de las regiones IE1 del citomegalovirus humano y de simio, estando localizada en 5' la secuencia potenciadora y unida operativamente a la secuencia promotora humana, en donde la secuencia potenciadora comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.

En otras palabras, la disposición de que la secuencia reguladora del promotor quimérico, como se define en la presente memoria, comprende elementos de secuencia tanto del citomegalovirus humano como del citomegalovirus de simio asegura que el objeto reivindicado no incluye ninguna construcción quimérica derivada únicamente del citomegalovirus humano.

El término “vector de expresión”, como se usa en la presente memoria, denota un vehículo de ácidos nucleicos (plásmido) que se caracteriza por la presencia de al menos un “casete de expresión”. El término “casete de expresión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una construcción genética que es capaz de permitir la expresión génica de una secuencia de ácidos nucleicos de interés (es decir, una secuencia de ácidos nucleicos “heteróloga”). Esto requiere que dicho casete de expresión comprenda elementos de secuencia reguladores que contienen información con relación a la regulación transcripcional y/o traduccional, y que dichas secuencias reguladoras estén “unidas operativamente” a la secuencia de ácidos nucleicos de interés. Una unión operativa es una unión en la que los elementos de secuencia reguladores y la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar están conectados de modo que se permita la expresión génica.

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La naturaleza precisa de las regiones reguladoras de un “casete de expresión” que son necesarias para controlar y dirigir la expresión génica puede variar entre especies, pero en general estas regiones comprenden secuencias reguladoras del promotor (es decir, una región de secuencia localizada en 5’ (“aguas arriba”) de la secuencia de ácidos nucleicos de interés) y secuencias reguladoras no traducidas en 3’ (es decir, una región de secuencia localizada en 3’ (“aguas abajo”) de la secuencia de ácidos nucleicos de interés).

El término “promotor”, (también denominado “promotor mínimo”), como se usa en la presente memoria, denota elementos de secuencia que dirigen per se la iniciación de la transcripción (por ejemplo, sitios de unión para factores de transcripción y para RNA-polimerasa dependiente de DNA, caja TATA, secuencias CAAT y elementos protectores de 5’). Siempre que esta funcionalidad de promover la iniciación de la transcripción sea retenida o sustancialmente retenida (por ejemplo, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de la actividad de tipo natural, es decir, la actividad de una secuencia de longitud completa), cualquier variante truncada, mutada o modificada de cualquier otra manera de una secuencia promotora de tipo natural (que existe en la naturaleza) también está dentro de la definición anterior. Como se usa en la presente memoria, el término “promotor mínimo” se refiere a una secuencia de longitud mínima que retiene la actividad del promotor. Como se usa en la presente memoria, la secuencia promotora está unida operativamente al sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar.

Los vectores de expresión de la presente invención, como se especifica en la reivindicación 1, comprenden (como parte de un casete de expresión) una primera secuencia reguladora del promotor (quimérico) (es decir, al menos una de dichas secuencias), que, a su vez, abarca una secuencia promotora (mínima) particular del promotor de IE1 del citomegalovirus humano (hCMV) (You, C.Y. et al., (1992) Intervirology 34, 94-104; Klucher, K.M. et al., (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 1238-1250).

El promotor de IE1 de hCMV es muy conocido en la técnica y puede obtenerse fácilmente del genoma de hCMV depositado en la base de datos de genomas virales de NCBI con el número de registro NC_006273 (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome; supra).

La secuencia del promotor de IE1 de hCMV comprendida en los vectores de expresión definidos en la presente memoria tiene (es decir, consiste en) una secuencia de ácidos nucleicos con una longitud de 117 pb (también denominada “promotor mínimo”) como se muestra en la SEQ ID NO: 5.

1 gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 51 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 101 gctcgtttag tgaaccg

La SEQ ID NO: 5 incluye en su extremo 3’ un nucleótido de guanosina (“G”) adicional, que representa el sitio de iniciación de la transcripción.

Además, las secuencias reguladoras del promotor de un casete de expresión comprenden generalmente una secuencia “potenciadora”. El término “potenciadora”, como se usa en la presente memoria, denota elementos de secuencia que aumentan, perfeccionan o mejoran la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos independientemente de su localización y orientación con relación a la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar. Un potenciador puede potenciar la transcripción a partir de un solo promotor o simultáneamente a partir de más de un promotor. Siempre que esta funcionalidad de mejora de la transcripción sea retenida o sustancialmente retenida (por ejemplo, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de la actividad de tipo natural, es decir, la actividad de una secuencia de longitud completa), cualquier variante truncada, mutada o modificada de otra manera de una secuencia potenciadora de tipo natural (que existe en la naturaleza) también se encuentra dentro de la definición anterior.

Los vectores de expresión de la presente invención, como se especifica en la reivindicación 1, comprenden (como parte de un casete de expresión) en su primera secuencia reguladora del promotor (quimérico) respectiva una secuencia potenciadora particular procedente de la región IE del citomegalovirus de simio (sCMV) o que representa una quimera de las regiones IE1 del citomegalovirus humano (hCMV) y del citomegalovirus de simio (sCMV) (Meier, J.L. and Stinski, M.F. (1996) Intervirology 39, 331-342; Kim, G.Y. et al., (2011) Biotechnol. Lett. 33, 1319-1326). En otras palabras, dentro de la presente invención, la secuencia reguladora del promotor puede comprender una secuencia potenciadora únicamente procedente de sCMV o una secuencia potenciadora quimérica compuesta de secuencias procedentes de hCMV y sCMV. Dentro de la secuencia reguladora del promotor, las secuencias potenciadoras están localizadas en 5’ (es decir, “aguas arriba”) de las secuencias del promotor (mínimo) de hCMV y están unidas operativamente a la secuencia del promotor humano. Típicamente, las secuencias potenciadoras están dispuestas en la misma orientación que las secuencias promotoras. Sin embargo, en realizaciones específicas, las secuencias de la región aguas arriba y/o potenciadoras están dispuestas en orientación inversa con relación a las secuencias promotoras.

Las secuencias potenciadoras de IE1 de hCMV y/o sCMV son muy conocidas en la técnica y pueden obtenerse fácilmente de los genomas de hCMV y sCMV depositados en la base de datos de genomas virales del NCBI bajo los números de registro X17403.1 y U38308.1, respectivamente.

La secuencia potenciadora comprendida en los vectores de expresión como se especifica en la reivindicación 1, 5 comprende la secuencia de nucleótidos con una longitud de 452 pb, como se muestra en la SEQ ID NO: 6, que procede de la región potenciadora de IE1 de sCMV.

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gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat

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ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc

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aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg

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gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag

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gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc

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caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg

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gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc

351

aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat

401

agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg

451

gg

En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6 es una parte integral de un elemento de secuencia más largo procedente de la región IE1 de sCMV (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 13). En algunas

10 otras realizaciones, el elemento de secuencia procedente de la región IE1 de sCMV que tiene la secuencia SEQ ID NO: 6 está presente en combinación con un elemento de secuencia adicional procedente de la región IE1 de hCMV (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 12).

En realizaciones particularmente preferidas, la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

15 La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 7 (en la presente memoria también denominada “construcción 1”, que no forma parte de la presente invención) tiene una longitud total de 1074 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de hCMV de 582 pb y una secuencia potenciadora de IE1 de mCMV (mostradas en cursiva) y una secuencia promotora de IE1 de mCMV de 492 pb (también denominada SEQ ID NO: 3).

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ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat

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ttctgtcgcc gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga

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tagagatggc gatattggaa aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga

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aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac tgatatcgcc atttttccaa

201

aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct tatatcgttt

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acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc

301

gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg

351

ccgatagagg cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat

401

acattgaatc aatattggcc attagccata ttattcattg gttatatagc

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ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata

501

atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat

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tgattattga ctagttatta atagtaatca attactgagt cattagggac

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tttccaatgg gttttgccca gtacataagg tcaatagggg tgaatcaaca

651

ggaaagtccc attggagcca agtacactga gtcaataggg actttccatt

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gggttttgcc cagtacaaaa ggtcaatagg gggtgagtca atgggttttt

751

cccattattg gcacgtacat aaggtcaata ggggtgagtc attgggtttt

801

tccagccaat ttaattaaaa cgccatgtac tttcccacca ttgacgtcaa

851

tgggctattg aaactaatgc aacgtgacct ttaaacggta ctttcccata

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gctgattaat gggaaagtac cgttctcgag ccaatacacg tcaatgggaa

951

gtgaaagggc agccaaaacg taacaccgcc ccggttttcc cctggaaatt

1001

ccatattggc acgcattcta ttggctgagc tgcgttctac gtgggtataa

1051

gaggcgcgac cagcgtcggt accg

La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 8 (también denominada en la presente memoria “construcción 2”, que no forma parte de la presente invención) tiene una longitud total de 1128 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de hCMV de 1026 pb (mostrada en cursiva) y una secuencia 5 promotora “mínima” de IE1 de mCMV de 102 pb (también denominada sEq ID NO: 4).

1

ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat

51

ttctgtcgcc gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga

101

tagagatggc gatattggaa aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga

151

aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac tgatatcgcc atttttccaa

201

aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct tatatcgttt

251

acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc

301

gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg

351

ccgatagagg cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat

401

acattgaatc aatattggcc attagccata ttattcattg gttatatagc

451

ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata

501

atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat

551

tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca

601

tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc

651

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat

701

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga

751

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc

801

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat

851

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta

901

cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca

951

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc

1001

attgacgtca atgggagttt gttttgacac cgccccggtt ttcccctgga

1051

aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt

1101

ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccg

La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 9 (también denominada en la presente memoria “construcción 3”, que no forma parte de la presente invención) tiene una longitud total de 509 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de hCMV de 407 pb (mostrada en cursiva) y una secuencia 5 promotora “mínima” de IE1 de mCMV de 102 pb (también denominada sEq ID NO: 4).

1

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga

51

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa

101

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc

151

cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga

201

cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct

251

tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt

301

accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt

351

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt

401

tgttttgaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca

451

ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tataagaggc gcgaccagcg

501

tcggtaccg

La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 10 (también denominada en la presente memoria “construcción 4”, que no forma parte de la presente invención) tiene una longitud total de 961 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de sCMV de 452 pb (mostrada en negrita; SEQ ID NO: 6),

una secuencia potenciadora de IE1 de hCMV de 407 pb (mostrada en cursiva) y una secuencia promotora “mínima” de IE1 de mCMV de 102 pb (también denominada SEQ ID NO: 4).

1 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat 51 ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc 101 aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg 151 gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag 201 gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc 251 caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 301 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc 351 aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat 401 agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg 451 ggcgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 501 gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 551 aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 601 cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 651 gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac

10

701 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 751 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 801 tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 851 tttgttttga caccgccccg gttttcccct ggaaattcca tattggcacg 901 cattctattg gctgagctgc gttctacgtg ggtataagag gcgcgaccag 951 cgtcggtacc g

La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 11 (también denominada en la presente memoria “construcción 5”, que no forma parte de la presente invención) tiene una longitud total de 909 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de sCMV de 807 pb (mostrada en negrita; estando subrayado el elemento de secuencia de SEQ ID NO: 6) y una secuencia promotora “mínima” de IE1 de mCMV de 102 pb (también denominada SEQ ID NO: 4).

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gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat

51

ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc

101

aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg

151

gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag

201

gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc

251

caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg

301

gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc

351

aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat

401

agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg

451

ggcggtccca tataccatat atggggcttc ctaataccgc ccatagccac

501

tcccccattg acgtcaatgg tctctatata tggtctttcc tattgacgtc

551

atatgggcgg tcctattgac gtatatggcg cctcccccat tgacgtcaat

601

tacggtaaat ggcccgcctg gctcaatgcc cattgacgtc aataggacca

651

cccaccattg acgtcaatgg gatggctcat tgcccattca tatccgttct

701

cacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccact tggcagtaca

751

tcaatatcta ttaatagtaa cttggcaagt acattactat tggaagtacg

801

ccagggtaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca

851

ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tataagaggc gcgaccagcg

901

tcggtaccg

La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 12 (también denominada en la presente memoria “construcción 6”) tiene una longitud total de 976 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de sCMV de 452 pb (mostrada en negrita; y que tiene SEQ Id NO: 6), una secuencia 5 potenciadora de IE1 de hCMV de 407 pb (mostrada en cursiva) y una secuencia promotora “mínima” de mCMV de 117 pb (también denominada SEQ ID NO: 5).

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gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat

51

ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc

101

aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg

151

gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag

201

gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc

251

caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg

301

gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc

351

aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat

401

agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg

451

ggcgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac

501

gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc

551

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg

601

cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt

651

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac

701

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta

751

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg

801

tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag

851

tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact

901

ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat

951

ataagcagag ctcgtttagt gaaccg

La secuencia reguladora del promotor quimérico de acuerdo con SEQ ID NO: 13 (también denominada en la presente memoria “construcción 7”) tiene una longitud total de 924 pb y está compuesta por una secuencia potenciadora de IE1 de sCMV de 807 pb (mostrada en negrita; estando subrayada la porción que tiene SEQ ID NO: 5 6) y una secuencia promotora “mínima” de mCMV de 117 pb (también denominada SEQ ID NO: 5).

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gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat

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ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc

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aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg

151

gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag

201

gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc

251

caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg

301

gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc

351

aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat

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agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagee cctcccaatg

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ggcggtccca tataccatat atggggcttc ctaataccgc ccatagccac

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tcccccattg acgtcaatgg tetetatata tggtctttcc tattgacgtc

551

atatgggcgg tcctattgac gtatatggcg cctcccccat tgacgtcaat

601

tacggtaaat ggcccgcctg gctcaatgcc cattgacgtc aataggacca

651

cccaccattg acgtcaatgg gatggctcat tgcccattca tatccgttct

701

cacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccact tggcagtaca

751

tcaatatcta ttaatagtaa cttggcaagt acattactat tggaagtacg

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ccagggtgca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc

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gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat

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aagcagagct cgtttagtga accg

Las secuencias reguladoras en 3’ de un “casete de expresión” tal como se definen en la presente memoria abarcan típicamente elementos reguladores implicados en la terminación transcripcional, la poliadenilación, o similares. Sin embargo, si estas secuencias de terminación no son satisfactoriamente funcionales en una célula hospedante particular, entonces pueden ser sustituidas por señales funcionales en dicha célula.

Otros elementos reguladores comprendidos en dicho “casete de expresión” incluyen, entre otros, sitios internos de entrada al ribosoma (abreviadamente IRES por la expresión inglesa Intemal Ribosome Entry Sites); que permiten la expresión de secuencias de ácidos nucleicos “policistrónicos”), así como también secuencias señal traducidas para dirigir el polipéptido natural a un compartimento específico de una célula hospedante. Las secuencias señal ilustrativas adecuadas para células de CHO se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/148519 A2. El experto en la técnica también conoce bien todos estos elementos reguladores y cómo seleccionar dichos elementos adecuados para la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos en un entorno celular particular.

El vector de expresión de la presente invención puede ser, por ejemplo, un plásmido, cósmido, fagémido, cromosoma artificial u otro vehículo comúnmente utilizado en ingeniería genética.

Dichos vectores de expresión incluyen típicamente, además de uno o más “casetes de expresión” que abarcan las secuencias reguladoras descritas anteriormente, uno o más sitios de clonación múltiple con el fin de facilitar la inserción y/o la eliminación de secuencias de ácidos nucleicos. Los sitios de clonación múltiples pueden estar localizados aguas arriba y aguas abajo de los casetes de expresión descritos anteriormente, permitiendo así la sustitución del casete completo. También pueden estar localizados sitios de clonación múltiples dentro de dicho casete de expresión aguas abajo de las secuencias reguladoras del promotor y aguas arriba de las secuencias reguladoras en 3’, permitiendo así que se exprese la inserción o sustitución de una secuencia de ácidos nucleicos. Para las transfecciones estables (véase a continuación), los vectores de expresión pueden comprender además secuencias de reconocimiento para integrasas o recombinasas específicas del sitio con el fin de facilitar la recombinación e integración estable en el genoma de la célula hospedante.

Además, los vectores de expresión como se definen en la presente memoria comprenden típicamente al menos un origen de replicación, así como secuencias de control procedentes de una especie compatible con la célula hospedante empleada con el fin de asegurar la replicación autónoma/mantenimiento episomal del vector de expresión (en particular, para uso en transfecciones transitorias; véase a continuación). Los orígenes de replicación ilustrativos en mamíferos incluyen el origen de replicación de SV40 o de EBV. Los vectores de expresión diseñados específicamente (es decir, vectores lanzadera) que comprenden más de un origen de replicación permiten el

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traslado entre diferentes hospedantes, tal como entre células bacterianas y de animales. Los orígenes de replicación adecuados para células procariotas incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación de ColE1 y M13.

Además, un vector de expresión como se define en la presente memoria puede comprender uno o más marcadores de selección que confieren un fenotipo seleccionable a las células transfectadas. Los marcadores de selección adecuados incluyen, entre otros, el gen de la higromicina B fosfatasa, el gen de la timidina quinasa, el gen de la ornitina descarboxilasa, el gen de la dihidrofolato reductasa y el gen de la glutamina sintasa. Preferiblemente, se emplea el gen de la glutamina sintasa (GS) (Cockett, D. K. et al., (1990) Bio/Technology 8, 662-667; Bebbington, C.R. et al., (1992) Bio/Technology 10:169-175).

Numerosos métodos que se pueden usar para diseñar y/o modificar vectores de expresión recombinantes están bien establecidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.) Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA). Un gran número de vectores de expresión de mamíferos adecuados también están disponibles comercialmente y son bien conocidos por los expertos en la técnica que también pueden determinar qué vectores son adecuados para expresar una molécula de ácidos nucleicos de interés en un entorno dado. Los ejemplos de dichos vectores incluyen, entre otros, pcDNA3, pFRT, pTARGET, pSV2-dhfr, así como también derivados de los vectores pRY42 (SEQ iD NO: 1) y pRY57 (SEQ ID NO: 2) descritos a continuación en la presente memoria.

Las secuencias de ácidos nucleicos que se ha de expresar empleando los vectores de expresión de la invención pueden ser monocistrónicas (es decir, codifican un único polipéptido o proteína incluyendo proteínas de fusión) o policistrónicas (es decir, codifican dos o más polipéptidos o proteínas individuales).

En realizaciones particulares, el vector de expresión comprende una única (es decir, primera) secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una (primera) secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar.

En otras realizaciones particulares, el vector de expresión comprende además una segunda secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la segunda secuencia reguladora del promotor quimérico es idéntica a la primera secuencia reguladora del promotor quimérico.

En realizaciones particulares alternativas, el vector de expresión comprende además una segunda secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la segunda secuencia reguladora del promotor quimérico es diferente de la primera secuencia reguladora del promotor quimérico.

En realizaciones específicas, el vector de expresión comprende una tercera secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una tercera secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la tercera secuencia reguladora del promotor quimérico puede ser idéntica a la primera y/o segunda secuencias reguladoras del promotor o puede ser diferente tanto de la primera como de la segunda secuencias reguladoras del promotor quimérico. En realizaciones específicas adicionales, el vector de expresión comprende más de tres secuencias reguladoras del promotor quimérico.

Las secuencias de ácidos nucleicos que se han de expresar empleando los vectores de expresión de la presente invención pueden codificar cualesquiera polipéptidos o proteínas de interés, en particular polipéptidos o proteínas que tienen una aplicabilidad en diagnóstico o terapéutica, tales como, entre otros, factores de crecimiento, citoquinas (interferones, interleuquinas), hormonas, tirosina quinasas, receptores (GPCR), integrinas, factores de transcripción, factores de coagulación sanguínea, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos (anticalinas) y similares.

En el caso de vectores de expresión, como se definen en la presente memoria, que comprenden dos secuencias reguladoras del promotor quimérico (como parte de los casetes de expresión), la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos que se han de expresar codifican diferentes polipéptidos (o proteínas). En realizaciones específicas, los diferentes polipéptidos representan subunidades de una proteína dimérica o multimérica, tales como, entre otras, moléculas receptoras homómeras o heterómeras, hormonas peptídicas, DNA/RNA polimerasas, hemoglobinas, vacunas y similares.

En realizaciones particularmente preferibles, la proteína dimérica o multimérica es una molécula de anticuerpo “clásica” que comprende la cadena ligera como la primera subunidad y la cadena pesada como la segunda subunidad. La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo que existe en la naturaleza o genéticamente modificado, ya sea un anticuerpo de longitud completa o una de sus variantes truncada (tal como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2). Se prefieren particularmente los anticuerpos inmunoglobulinas IgG. Dependiendo de la aplicación específica, las moléculas de anticuerpos pueden ser quiméricas (por ejemplo, de múrido/humanas), humanizadas o completamente humanas.

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En otras realizaciones que emplean vectores de expresión que comprenden dos secuencias reguladoras del promotor quimérico, la primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos que se han de expresar codifican una “proteína diana” que se ha de analizar y una proteína indicadora correspondiente (tales como proteína verde fluorescente, luciferasa, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa y peroxidasa de rábano picante) para controlar, por ejemplo, la localización celular o la actividad funcional de la proteína diana.

Cuando se usan dos (o más) secuencias reguladoras del promotor quimérico que presentan diferentes tasas de expresión génica, puede ser posible producir ciertas relaciones molares de las correspondientes proteínas de interés.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedante de mamífero transfectada con un vector de expresión como se ha definido anteriormente en la presente memoria.

Las células hospedantes adecuadas incluyen cualquier tipo de células de mamífero, siendo las células de origen humano o no humano. Las células de mamífero de origen no humano incluyen, entre otras, células procedentes de ratón, rata, hámster, conejo, gato, perro, cerdo, vaca, caballo o mono.

Las células hospedantes de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares inmortalizadas, tales como Hela humana, fibroblastos MRC5, melanoma 983M, HEK293, H9, MCF7 y células Jurkat; células renales caninas MDCK; fibroblastos de pulmón de rata cultivados en RF aislados de ratas Sprague-Dawley; células de mastocitomas NIH3T3, C127, P815 de múridos, de adenocarcinomas mamario MT1A2 y células L; células COSI y COS7 de simio, células QC1-3 de codorniz; y células o líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO).

En realizaciones preferidas, las células hospedantes empleadas son células de CHO o líneas celulares de CHO.

Las líneas celulares de CHO adecuadas incluyen, entre otras, CHO KI (Tjio, J.T. and Puck, T.T. (1958) J. Exp. Med. 108, 945-955), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12, DUK-B11 negativas a dhfr (Urlaub, G. and Chasin L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220) y particularmente CHOK1 SV (Lonza Ltd. Basilea, Suiza). CHOK1 SV es un derivado de CHOK1 adaptado exento de proteínas en suspensión que utiliza el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (GS): los transfectantes positivos se obtuvieron con selección doble de metionina sulfoximina y medios exentos de glutamina.

Todas estas células o líneas celulares hospedantes se pueden obtener de entidades de depósito tales como la American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) o la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Alemania), así como también de varios proveedores comerciales. También dentro de la presente invención se encuentran células de mamíferos primarias, es decir, células obtenidas directamente de un organismo (en cualquier etapa de desarrollo, incluidos, entre otros, blastocitos, embriones, estadios larvales y adultos). Los ejemplos de células primarias adecuadas comprenden cardiomiocitos, hepatocitos primarios, fibroblastos, células neuronales, así como también células madre. También dentro de la presente invención se encuentran líneas celulares estables inmortalizadas procedentes de células primarias.

En algunas realizaciones, la célula hospedante de la presente invención constituye una parte de un organismo multicelular.

En la presente invención, el vector de expresión introducido se puede propagar y mantener en la célula hospedante como una unidad genética independiente (es decir, episomalmente) (también denominada en la presente memoria “transfección transitoria”) o los fragmentos de vectores pueden llegar a integrarse establemente en el genoma de la célula hospedante (también denominada en la presente memoria “transfección estable”). Dicha recombinación puede producirse en posiciones aleatorias del genoma por recombinación no homóloga o en posiciones específicas del genoma por recombinación homóloga o por integrasas específicas del sitio. Preferiblemente, los fragmentos de vector (incluyendo las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que se han de expresar) llegan a integrarse en el genoma de la célula hospedante como una sola copia.

Para introducir los vectores de expresión como se definen en la presente memoria en una célula hospedante de mamífero se puede emplear cualquier técnica de transfección que sea apropiada para el tipo de células particular empleado. Numerosos métodos de transfección están bien establecidos en la técnica, entre otros, la electroporación, coprecipitación con fosfato de calcio, transfección química (por ejemplo, ciclodextrina, DEAE-dextrano, polietilenimina), lipofección, magnetofección y “pistola génica” (véase, por ejemplo, Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), supra; Ausubel, F.M. et al., (2001), supra).

Incluso en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula hospedante de mamífero, que comprende:

i) transfectar la célula hospedante de mamífero con un vector de expresión como se ha definido anteriormente en la presente memoria; y

ii) cultivar la célula hospedante de mamífero transfectada en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de interés.

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En otras palabras, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción recombinante (es decir, heteróloga) de polipéptidos o proteínas de interés en células hospedantes de mamíferos que son transfectadas con un vector de expresión, como se define en la presente memoria, que comprende las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes que codifican dichos polipéptidos o proteínas. La transfección se puede realizar con un solo vector de expresión o, como una cotransfección, con dos o más vectores de expresión diferentes.

Como ya se describió anteriormente, hay disponibles numerosos métodos para la transfección transitoria o estable de una célula hospedante de mamífero. En realizaciones preferidas, la transfección es una transfección estable con el fin de establecer células o líneas celulares que expresan continuamente las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que codifican los polipéptidos o proteínas de interés.

En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de recolectar (y opcionalmente purificar) los polipéptidos o proteínas recombinantes producidos. Dependiendo de la naturaleza de dichos polipéptidos o proteínas, pueden llegar a segregarse en el líquido sobrenadante del cultivo celular, integrarse en la membrana de la célula hospedante o permanecer en un compartimento intracelular.

Típicamente, si se emplea una célula hospedante de mamífero unicelular, el experto en la técnica puede volver a una variedad de condiciones de cultivo celular que permiten la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de interés. Convenientemente, los polipéptidos o proteínas producidos se recolectan (y opcionalmente purifican) del medio de cultivo, de lisados o extractos de las células cultivadas o de membranas (biológicas) aisladas por técnicas establecidas, tales como, entre otras, precipitación fraccionada con sales o disolventes orgánicos, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en gel, cromatografía de exclusión por tamaños, HPLC, cromatografía de afinidad (véase, por ejemplo, Sambrook, J., and Russel, D.W. (2001), supra). En caso de que la célula hospedante sea parte de un organismo multicelular, una fracción de estas células puede servir como fuente para aislar el péptido de la invención.

Los medios y las condiciones de cultivo apropiados para las células hospedantes descritas anteriormente son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Fresney, R.I. (2000) Culture of Animal Cells. A manual (4th Ed.) Wiley- Liss, Nueva York). Dependiendo de los requisitos específicos de crecimiento de la célula hospedante empleada, se puede realizar un cultivo de células de mamíferos, por ejemplo, en medio RPMI 1640, medio F12 de Ham o DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco). Alternativamente, se puede usar un medio de crecimiento con una concentración de suero reducida, tal como OptiMEM. Los medios se pueden suplementar opcionalmente con FCS (suero fetal de ternero) al 10% (v/v), diversos factores de crecimiento, aminoácidos, antibióticos y otros aditivos. Los medios de cultivo celular especialmente adaptados para células de CHO están descritos en, por ejemplo, las patentes EP 0481791 B1 y eP 1525320 B1. Las células hospedantes de mamífero transfectadas se pueden incubar a 37°C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5%. Los medios de crecimiento, kits y reactivos respectivos están disponibles comercialmente de varios proveedores.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un vector de expresión, como se ha definido anteriormente en la presente memoria, para la expresión heteróloga in vitro de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula hospedante de mamífero. Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos de interés puede codificar un polipéptido o proteína destinada a aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas.

En realizaciones preferidas, el vector de expresión se usa para la expresión concomitante in vitro de dos o más secuencias de ácidos nucleicos de interés que se insertan en el vector de expresión bajo el control de secuencias reguladoras separadas de promotores quiméricos. Por ejemplo, un vector de expresión se puede usar para la expresión de un gen de interés junto con un gen indicador para controlar el direccionamiento celular y/o la funcionalidad del gen de interés.

En particular preferiblemente, el vector de expresión se usa para la expresión concomitante de dos o más secuencias de ácidos nucleicos de interés que codifican subunidades de una proteína dimérica o multimérica, por ejemplo, cadenas ligera y pesada de una molécula de anticuerpo o subunidades de una vacuna. Empleando diferentes secuencias reguladoras de promotores quiméricos que dan como resultado diferentes tasas de expresión génica, se puede usar un vector de expresión como se define en la presente memoria para la expresión de dos o más secuencias de ácidos nucleicos de interés en una relación (molar) particular.

En una realización específica, los vectores de expresión, como se definen en la presente memoria, son para uso como medicamentos (o como partes de un medicamento o de un kit de piezas) para terapia génica.

La invención se describe además por las figuras y los siguientes ejemplos, que tienen únicamente la finalidad de ilustrar realizaciones específicas de esta invención, y no deben interpretarse que limitan de ninguna manera el alcance de la invención.

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Ejemplos

Fundamento:

Se generaron siete secuencias reguladoras diferentes de promotores quiméricos, como se especifica en las reivindicaciones, basadas en secuencias de los genomas de citomegalovirus humano y de simio (hCMV y sCMV) (véase la Tabla 1, Figura 3). Estas construcciones se analizaron para determinar su eficacia en el control de la expresión génica heteróloga de las cadenas ligera y pesada (CL y CP) de un anticuerpo monoclonal en células de ovario de hámster chino (CHO).

Ejemplo 1: Construcción de vectores

Se usó la síntesis de genes para generar las siete construcciones reguladoras diferentes de promotores quiméricos empleadas en la presente memoria (es decir, las construcciones “1-7”, en donde las construcciones 1-5 no forman parte de la presente invención). Las construcciones se proporcionaron listas para la clonación en el vector de direccionamiento “vacío” pRY42 (véase la Figura 1, SEQ ID NO: 1), con el fin de reemplazar los promotores originales del citomegalovirus de múrido (mCMV) (SEQ ID NO: 3) contenidos en el mismo. El vector precursor pRY42 comprende dos casetes de expresión, cada uno bajo el control de una secuencia reguladora del promotor (originalmente procedente de mCMV).

Se sintetizaron las construcciones quiméricas (véase la Tabla 1, Figura 3, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 13, en donde la SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 11 no forman parte de la presente invención) para que incluyeran secuencias de DNA adicionales en los extremos 5' y 3' que flanquean las secuencias reguladoras del promotor, permitiendo así la incorporación de sitios de restricción de endonucleasas (es decir, también presentes en pRY42) con el fin de facilitar el intercambio de fragmentos de ácidos nucleicos.

La Tabla 1 ilustra los diversos elementos de secuencia comprendidos en las construcciones 1-7 reguladoras del promotor quimérico descritas en la presente memoria, en donde las construcciones 1-5 no forman parte de la presente invención. Se muestran las longitudes respectivas y las localizaciones genéticas de las secuencias reguladoras individuales, como se indica en la base de datos de genomas virales del NCBI (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome; Bao, Y. et al., (2004) J. Virol. 78, 7291-7298). Notablemente, todas las secuencias promotoras de mCMV o hCMV empleadas en la presente memoria incluyen en su extremo 3' un nucleótido de guanosina (“G”) adicional, que representa el sitio de iniciación de la transcripción.

Construcción

Longitud del sCMV N° de registro del genoma viral en NCBI Coordenadas Longitud del hCMV N° de registro del genoma viral en NCBI Coordenadas

1

- - - 582 X17403.1 174292-174873

2

- - - 1026 X17403.1 173848-174873

3

- - - 407 X17403.1 173848-174254

4

452 U38308.1 3873-4324 407 X17403.1 173848-174254

5

807 U38308.1 3873-4679 - - -

6

452 U38308.1 3873-4324 524 X17403.1 173731-174254

7

807 U38308.1 3873-4679 117 X17403.1 173731-173847

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Construcción

Longitud del mCMV N° de registro del genoma viral en NCBI Coordenadas

1

492 U68299.1 182895-183386

2

102 U68299.1 182895-182996

3

102 U68299.1 182895-182996

4

102 U68299.1 182895-182996

5

102 U68299.1 182895-182996

Los nuevos vectores que comprenden las construcciones quiméricas 1-7 (no formando las construcciones 1-5 parte de la presente invención) fueron construidos cada uno por una reacción de ligación de cuatro vías de acuerdo con el esquema ilustrado en la Tabla 2. La secuencia reguladora del promotor quimérico para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena ligera del anticuerpo se insertó en 3' (es decir, “aguas abajo”) del sitio FRT (diana de reconocimiento de flipasa) mutado (F5-mFRT) de pRY42, seguido de un fragmento entre cadenas y la secuencia reguladora del promotor quimérico para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena pesada del anticuerpo.

Las reacciones de ligación se realizaron utilizando el Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los vectores plasmídicos resultantes se transformaron en células competentes DH5a de E. coli (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemania). Las muestras se colocaron en placas sobre agar-agar de Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 pg/mL de ampicilina y se incubaron durante una noche a 37°C. Se usaron colonias individuales para inocular matraces en agitación de 500 mL que contenían 200 mL de medio líquido LB más 50 pg/mL de ampicilina. Los matraces se incubaron durante una noche en una incubadora con agitación a 37°C y 200 rpm. Los cultivos resultantes se utilizaron para la preparación del DNA plasmídico utilizando un Nucleobond Maxi Kit (Macherey-Nagel GmbH, Düren, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos producidos se verificaron por digestión con enzimas de restricción para diagnóstico.

La Tabla 2 muestra el esquema de clonación para generar las construcciones 1-7 de la secuencia reguladora del promotor quimérico, en donde las construcciones 1-5 no forman parte de la presente invención.

Construcción

Elemento regulador de la CL Fragmento entre cadenas (procedente de pRY42) Elemento regulador de la CP Cadena principal del vector (procedente de pRY42)

1

AatII-PacI PacI-EcoRI EcoRI-XhoI XhoI-AatII

2

PvuI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-PvuI

3

SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI

4

SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI

5

SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI

6

SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI

7

SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI

En una etapa posterior, se clonaron la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CP) del anticuerpo monoclonal IgG4 cB72.3 (Whittle, N. et al., (1987) Protein Eng. 1, 499-505) en cada uno de los siete vectores que comprendían las construcciones quiméricas 1-7 (no formando las construcciones 1 a 5 parte de la presente invención). Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas del anticuerpo se obtuvieron del vector pRY57 (Figura 2, SEQ ID NO: 2) como fragmentos de restricción EcoRI/HindlII (CL) y BamHI/Nrul (CP) y se clonaron secuencialmente

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en los vectores para cada construcción del promotor, utilizando las mismas endonucleasas de restricción. Los métodos utilizados fueron los descritos anteriormente. Los vectores plasmídicos resultantes se verificaron por digestión con enzimas de restricción para diagnóstico y secuenciación de DNA de las regiones promotoras, respectivamente.

Ejemplo 2: Transfección y construcción de una línea celular

Se utilizó una línea celular procedente de la línea celular de ovario de hámster chino adaptada en suspensión CHOK1SV para todos los experimentos (Lonza Ltd., Basilea, Suiza). En esta línea celular, las construcciones de expresión de ácidos nucleicos se insertan en un locus genómico específico de la célula hospedante y en un número de copias definido por medio de un sistema de integración específico del sitio (SSI).

La selección positiva para la integración se realiza por restauración funcional de un casete de resistencia a higromicina B presente en el sitio SSI. La integración de la construcción de expresión en el genoma del hospedante elimina también una copia del gen de la timidina quinasa, que convierte el profármaco ganciclovir en un análogo de nucleótido fosforilado, tóxico. Por tanto, la adición de higromicina B y ganciclovir durante la construcción de la línea celular proporciona presiones de selección positivas y negativas, respectivamente, para la integración en el locus genómico diana.

La línea celular hospedante se reanimó a partir de los viales crioconservados y se subcultivó. Todos los cultivos celulares se realizaron en medio CD-CHO (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemania). 48 horas antes de la transfección, las células se sembraron en 30 mL de medio CD-CHO, a una concentración final de 0,3 x 106 células/mL.

El día de la transfección, 1,2 x 107 células se sedimentaron y volvieron a poner en suspensión en 1 mL de CD-CHO antes de la cotransfección con 45 |jg de plásmido pOG44 (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemania) y se prepararon 5 jg de cada vector de direccionamiento (que comprendía las construcciones quiméricas 1-7, respectivamente) utilizando electroporación en una cubeta Bio-Rad GenePulser Xcell de 0,4 cm (un solo impulso de 300 V/900 jF, constante de tiempo 12-16 milisegundos). El plásmido pOG44 abarca un casete de expresión para la recombinasa FLP (flipasa) de levadura requerida para facilitar la recombinación en los sitios FRT presentes en el locus diana. Todos los experimentos de transfección se realizaron al menos por duplicado.

Cada muestra de electroporación se transfirió a 20 mL de medio CD-CHO en un matraz T75 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se incubó en modo estático a 36,5°C, en una incubadora humidificada (CO2 al 5% (v/v) en aire). 48 horas después de la transfección, las células se sedimentaron (150 x g, 5 min) y se volvieron a poner en suspensión en 20 mL de medio CD-CHO que contenía 200 jg/mL de higromicina B (selección positiva). El cultivo se mantuvo en modo estático y, después de 72 horas, el medio se intercambió con CD-CHO recién preparado que contenía 200 jg/mL de higromicina B.

Posteriormente, cada 72 horas se determinó la concentración de células viables y el medio se intercambió con 20 mL de CD-CHO recién preparado que contenía 200 jg/mL de higromicina B y ganciclovir 3 jM (selección negativa). Una vez que el cultivo en el matraz T75 alcanzó una concentración de células total de 9 x 106 células/mL, el cultivo se ajustó hasta un volumen final de 30 mL de CD-CHO que contenía 200 jg/mL de higromicina B y ganciclovir 3 jM. Cada cultivo diluido se transfirió luego a un matraz E125 con agitación.

Ejemplo 3: Cultivo en suspensión de sobrecrecimiento alimentado en lotes (FOG) para determinar la concentración de anticuerpo monoclonal producido utilizando las “construcciones de promotor 1-5” (que no forman parte de la presente invención)

El análisis en un matraz con agitación del sobrecrecimiento alimentado en lotes (FOG) se realizó como se ha descrito en la publicación de patente internacional WO 2008/148519 A2. Todos los experimentos de FOG para un cultivo en suspensión de células transfectadas dado se realizaron al menos por duplicado.

En resumen, las células transfectadas se sembraron a una concentración de 2 x 105 células/mL en matraces con agitación de 250 mL, conteniendo cada uno 50 mL de medio de crecimiento CM42/SPE (Lonza Ltd., Basilea, Suiza) y se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada de agitación orbital (CO2 al 5% (v/v) en aire) a 140 rpm. Las células se alimentaron, comenzando el día 3 del cultivo, con una alimentación que consistía en una mezcla de aminoácidos y oligoelementos. Las viabilidades diarias y las concentraciones de células viables se determinaron utilizando un analizador automatizado de viabilidad celular Cedex (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). La concentración de anticuerpo en el medio se determinó por HPLC con proteína A el día 15 de cultivo (cosecha de los cultivos “sobrecrecidos”).

Ejemplo 4: Determinación de la concentración del anticuerpo monoclonal producido por medio de HPLC con proteína A (usando las “construcciones de promotor 1-5”, que no forman parte de la presente invención)

Las concentraciones del anticuerpo monoclonal (mAb) cB72.3 IgG4 producido por las líneas celulares respectivas que albergan los casetes de expresión génica de CL/CP bajo el control de las diferentes construcciones quiméricas 1-5 y segregadas al medio de cultivo celular se determinaron por cromatografía de líquidos de alta resolución

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(HPLC) con proteína A. Los líquidos sobrenadantes libres de células (pasados a través de una unidad de filtración de 0,22 |jm) se cargaron en una columna de inmunodetección con proteína A POROS (Applied Biosystems Inc., Foster City, Ca, USA), conectada a un HPLC Agilent 1200. La columna se lavó y el mAb unido se eluyó disminuyendo el pH del disolvente.

La concentración del mAb se determinó por comparación con una curva estándar generada con diluciones en serie de cB72.3 IgG4 de MabSelect SuRe-purified (Ge Healthcare GmbH, Freiburg, Alemania) (intervalo de la curva estándar: 1025 ng/jL a 200 ng/jL).

Los resultados de los experimentos anteriores se resumen en la Tabla 3 y la Figura 4, respectivamente: para cada una de las construcciones quiméricas empleadas en la presente invención, n = 4, que representan análisis de FOG por duplicado para transfecciones por duplicado, con la excepción de la construcción 4, donde n = 6 (análisis de FOG por duplicado para transfecciones por triplicado) y pRY57 (mCMV original), donde n = 8, estando combinados los puntos de datos de los experimentos 1 y 2. Los cálculos de los parámetros del cultivo celular se realizaron como se había descrito anteriormente (Porter et al., (2010) Biotechnol. Progr. 26, 1446-1454).

De la Figura 4, es evidente que el día de la recolección del cultivo (es decir, el día 15), el uso de una cualquiera de las construcciones quiméricas números 2-5 dio como resultado la producción de mayores concentraciones de anticuerpos que con el uso de la secuencia promotora de mCMV original (es decir, el vector pRY57). El uso de la construcción quimérica número 1 también dio como resultado una mayor concentración de anticuerpos que con el promotor de mCMV (un factor de 1,31), aunque el resultado no alcanza significación estadística, en donde las construcciones 1-5 no forman parte de la presente invención.

Los mejores resultados se obtuvieron con la construcción quimérica número 4, lo que dio como resultado una expresión génica aproximadamente 2,88 veces mayor en comparación con el promotor de mCMV, seguido (en orden descendente) por la construcción quimérica número 5 (factor de aproximadamente 2,54), la construcción quimérica número 2 (factor de aproximadamente 1,80) y la construcción quimérica número 3 (factor de aproximadamente 1,45).

La Tabla 3 ilustra las tasas de crecimiento y las cantidades de mAb producidas por las diferentes líneas celulares hospedantes transfectadas empleadas en la presente invención (que comprenden las secuencias/construcciones reguladoras del promotor quimérico 1-5, que no forman parte de la presente invención).

Grupo transfectante/FOG

Max. (106 células/mL) j (1/h) IVC (106 células.h/mL) pp (pg/célula.h) [mAb](mg/L)

Experimento 1

mCMV 9,36 ± 1,02 0,0183 ± 0,0018 1523,35 ± 164,78 0,29 ± 0,02 439,74 ± 23,51

Construcción 1 8,5 ± 0,75 0,0206 ± 0,0013 1445,11 ± 70,55 0,46 ± 0,07 638,87 ± 110,18

Construcción 2

7,97 ± 0,41 0,0198 ± 0,0008 1409,29 ± 87,92 0,71 ± 0,06 883,10 ± 109,78

Construcción 3

11,17 ± 1,02 0,0191 ± 0,0009 1873,58 ± 250,14 0,40 ± 0,03 707,98 ± 80,28

Experimento 2

mCMV 9,29 ± 0,82 0,0143 ± 0,0013 1790,34 ± 104,97 0,29 ± 0,05 539,31 ± 76,24

Construcción 4

10,39 ± 0,90 0,0165 ± 0,0023 1848,05 ± 306,29 0,73 ± 0,22 1408,44 ± 337,47

Construcción 5

11,58 ± 0,46 0,0139 ± 0,0028 2261,28 ± 50,84 0,46 ± 0,03 1244,15 ± 74,90

Leyenda: Max. - concentración máxima de células viables (106 células/mL); j - tasa de crecimiento específica (1/h); IVC: tiempo integral de la concentración de células viables (106 células.h/mL); pp - tasa de producción específica del mAb (pg/célula.h); y [mAb] - concentración del mAb producido en la cosecha (mg/L).

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Los datos anteriores muestran que el uso de secuencias reguladoras del promotor quimérico que comprenden la región aguas arriba y/o elementos potenciadores de sCMV y/o hCMV en combinación con elementos promotores de mCMV representan herramientas genéticas superiores para obtener sistemas de expresión génica heteróloga altamente eficaces para células de mamíferos.

Ejemplo 5: Cultivo en suspensión de sobrecrecimiento en lotes (BOG) para determinar la concentración del anticuerpo monoclonal producido utilizando las “construcciones de promotor 6-7”

Los cultivos en lotes se realizaron en matraces E125 ventilados que contenían 30 mL de CD-CHO en modo de suspensión (incubadora de 4 niveles Kühner, 36,5°C, CO2 al 5% (v/v) en aire y 85% de humedad (v/v)). En resumen, las células transfectadas se sembraron a una concentración de 2 x 1o5 células/mL y se controlaron las concentraciones de células viables durante el cultivo. Se tomaron muestras del medio el día siete de cultivo (alta viabilidad de cultivo) para la determinación de la concentración de cB72.3 en el medio usando HPLC con proteína A. Todos los experimentos de BOG para un cultivo en suspensión de células transfectadas dado se realizaron al menos por duplicado.

Ejemplo 6: Determinación de la concentración del anticuerpo monoclonal producido por medio de HPLC con proteína A (usando las “construcciones de promotor 6-7”)

Las concentraciones del anticuerpo monoclonal (mAb) cB72.3 IgG4 producido por las respectivas líneas celulares que alojan los casetes de expresión génica de CL/CP bajo el control de las diferentes construcciones quiméricas 6-7 y segregadas al medio de cultivo celular se determinaron por Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con proteína A. Los líquidos sobrenadantes libres de células (pasados a través de una unidad de filtración de 0,22 |jm) se cargaron en una columna de inmunodetección con proteína A POROS (Applied Biosystems Inc., Foster City, Ca, USA), conectada a un HPLC Agilent 1100. La columna se lavó y el mAb unido se eluyó disminuyendo el pH del disolvente.

La concentración del mAb se determinó por comparación con una curva estándar generada con diluciones en serie de cB72.3 IgG4 de MabSelect SuRe-purified (Ge Healthcare GmbH, Freiburg, Alemania) (intervalo de la curva estándar: 1025 ng/jL a 64 ng/jL).

Los resultados de los experimentos anteriores se resumen en la Figura 5: Para mCMV y la construcción 7, n = 6 (análisis de lotes por duplicado para transfecciones por triplicado) y para la construcción 6, n = 4 (análisis de lotes por duplicado para transfecciones por duplicado).

De la Figura 5, es evidente que el día 7 del cultivo, el uso de una cualquiera de las construcciones quiméricas 6 y 7 dio como resultado la producción de mayores concentraciones de anticuerpos que con el uso de la secuencia promotora de mCMV original (es decir, el vector pRY57).

Los mejores resultados se obtuvieron con la construcción del promotor quimérico 6, lo que dio como resultado productividades de mAb aproximadamente 2,27 veces mayores en comparación con el promotor de mCMV.

Los datos anteriores muestran que el uso de secuencias reguladoras de promotores quiméricos que comprenden la región aguas arriba y/o elementos potenciadores de sCMV y/o hCMV en combinación con elementos promotores mínimos de hCMV representan herramientas genéticas superiores para obtener sistemas de expresión génica heterólogos altamente eficaces para células de mamíferos.

Listado de secuencias

<110> Lonza Biologics PLC

<120> Vectores de expresión que comprenden secuencias promotoras y potenciadoras quiméricas de citomegalovirus

<130> 827-1 PCT

<140> no asignado todavía <141>

<150> EP12185728.8 <151> 2012-09-24

<160> 15

<170> BiSSAP Version 1.1

<210> 1 <211> 5908

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<212>ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> vector plásmido pRY42 <220>

<221> Señal_polyA <222> (7)...(245)

<223> Señal_polyA SV40

<220>

<221> promotor <222> (266)...(756)

<223> fragmento promotor mCMV-MIE (IE1)

<220>

<221> 5'UTR <222> (758)...(791)

<223> parte de mCMV-MIE (IE1) 5'UTR exón 1 <220>

<221> 5'UTR <222> (803)...(884)

<223> parte de hCMV-MIE (IE1) 5'UTR exón 1

<220>

<221> intrón <222> (885)...(1711)

<223> intrón A hCMV-MIE (IE1)

<220>

<221> 5'UTR <222> (1712)...(1729)

<223> hCMV-MIE (IE1) 5'UTR exón 2

<220>

<221> Señal_polyA <222> (1767)...(2005)

<223> Señal polyA SV40

<220>

<221> promotor <222> (2019)...(2345)

<223> promotor temprano SV40, derivado de pFRT/lacZeo (Invitrogen)

<220>

<221> fuente <222> (2350)...(2354)

<223> secuencia que contiene sitio ATG encontrado aguas arriba del tipo salvaje FRT en pFRT/lacZeo (Invitrogen)

<220>

<221> recomb_misc <222> (2355)...(2402)

<223> sitio diana de reconocimiento de flippasa tipo salvaje (FRT), derivada de pcADN5-Frt (Invitrogen)

<220>

<221> fuente <222> (3183)...(4043)

<223> complemento inverso CDS del gen beta-lactamasa <220>

<221> recomb_misc <222> (4319)...(4366)

<223> sitio diana de reconocimiento de flippasa tipo salvaje (FRT)

<220>

<221> promotor <222> (4410)...(4900)

<223> fragmento promotor mCMV-MIE (IE1)

5 <220>

<221> 5'UTR <222> (4902)...(4935)

<223> parte de mCMV-MIE (IE1) 5'UTR exón 1

<220>

10 <221> 5'UTR

<222> (4947)...(5028)

<223> parte de hCMV-MIE (IE1) 5'UTR exón 1 <220>

<221> intrón

15 <222> (5029)...(5855)

<223> hCMV-MIE (IE1) intrón A

<220>

<221> 5'UTR <222> (5856)...(5873)

20 <223> hCMV-MIE (IE1)5'UTR exón 2

<400> 1

gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60

cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120

gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180

agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240

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Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en células de mamífero, el vector comprendiendo una primera secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende:

   i) una secuencia promotora procedente del promotor de IE1 del citomegalovirus humano que consiste en la SEQ ID NO: 5 y que está unida operativamente al sitio de iniciación de la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar; y

   ii) una secuencia potenciadora procedente de la región IE1 del citomegalovirus de simio o que representa una quimera procedente de la región IE1 del citomegalovirus humano y de simio, estando situada la secuencia potenciadora en 5' y unida operativamente a la secuencia promotora humana, en donde la secuencia potenciadora comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
2. 2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia reguladora del promotor quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.
3. 3. El vector de expresión de la reivindicación 1 o 2, que comprende además una segunda secuencia reguladora del promotor quimérico que está operativamente unida a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la segunda secuencia reguladora del promotor quimérico es idéntica a la primera secuencia reguladora del promotor quimérico.
4. 4. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además una segunda secuencia reguladora del promotor quimérico que está unida operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que se ha de expresar, en donde la segunda secuencia reguladora del promotor quimérico es diferente de la primera secuencia reguladora del promotor quimérico.
5. 5. El vector de expresión de la reivindicación 3 o 4, en donde las primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos que se han de expresar codifican diferentes polipéptidos.
6. 6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en donde los diferentes polipéptidos representan subunidades de una proteína dimérica o multimérica.
7. 7. El vector de expresión de la reivindicación 6, en donde la proteína dimérica o multimérica es una molécula de anticuerpo.
8. 8. Una célula hospedante de mamífero transfectada con un vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. La célula hospedante de mamífero de la reivindicación 8, en donde la célula hospedante es una célula de CHO.
10. 10. Un método para la expresión heteróloga de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula hospedante de mamífero, que comprende:

    i) transfectar la célula hospedante de mamífero con un vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

    ii) cultivar la célula hospedante de mamífero transfectada en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de interés.
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde la transfección es una transfección estable.
12. 12. Uso de un vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la expresión heteróloga in vitro de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una célula hospedante de mamífero.

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