ES2619407T3

ES2619407T3 - Unidades de transcripción y su utilización en vectores de expresión

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Publication number: ES2619407T3
Application number: ES12794398.3T
Authority: ES
Inventors: Alexandre Fontayne; François COUTARD
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2017-06-26
Anticipated expiration: 2032-10-29
Also published as: BR112014010226A2; FR2981946A1; EP2771470B1; CA2850328C; CA2850328A1; KR20140092853A; JP6100270B2; CN104024417B; JP2014530634A; DK2771470T5; US9551009B2; US20140242638A1; FR2981946B1; DK2771470T3; CN104024417A; WO2013061010A1; EP2771470A1; IL232224A0

Abstract

Unidad de transcripción constituida de un polinucleótido que comprende los elementos reguladores siguientes: - el potenciador del virus hCMVe, teniendo dicho potenciador la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 1, y - la región promotora de las quinasas 9 dependiente de ciclina (CDK9), teniendo dicha región promotora la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2.

Description

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-: el intrón del gen de la ubiquitina que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 53, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 53,

-: el intrón del gen humano ROSA que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 54, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 54,

estando dicho potenciador situado en 5' o en 3' de la unidad de transcripción, o en el interior de la secuencia codificante a nivel de un intrón;

estando dicho intrón situado:

(i): secuencia abajo de la región 5' UTR y secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción, o

(ii): secuencia abajo del promotor y secuencia arriba de la región 5'UTR, o

(iii) después del sitio de inicio de la traducción y en el interior de la secuencia codificante, o

(iv) entre el codón stop de la secuencia codificante y la señal de poliadenilación.

La presente divulgación describe una unidad de transcripción constituida de un polinucleótido que comprende los elementos reguladores siguientes:

(i): el potenciador del virus hCMVie representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 1, o un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 1 y que posee esencialmente unas propiedades de activación de la transcripción, y

(ii): la región promotora de la Quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2, o un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID: NO 2 y que posee esencialmente una actividad promotora, y

(iii) el intrón del gen factor 1 de elongación (EF1α) que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 10, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 10.

Un modo de realización particular de la invención se refiere a una unidad de transcripción constituida de un polinucleótido que comprende los elementos reguladores siguientes:

(i): el potenciador del virus hCMVie representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 1, y

(ii): la región promotora de la Quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2, y

En un modo de realización más particular de la invención, una unidad de transcripción según la invención está constituida de un polinucleótido que comprende un ácido nucleotídico representado por la secuencia SEC ID NO: 21 y constituido de:

(i): el potenciador del virus hCMVie representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 1,

(ii): la región promotora del gen CDK9 representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2, y

(iii) el intrón del gen EF1α representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 10, o de un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 21.

(i) el potenciador del virus hCMVie representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 1, o un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 1 y que posee esencialmente unas propiedades de activación de la transcripción, y

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(iii) el intrón pCI-neo que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 13, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 13.

En un modo de realización más particular de la invención, una unidad de transcripción según la invención está constituida de un polinucleótido que comprende un ácido nucleotídico representado por la secuencia SEC ID NO: 24 y constituido de:

(i): el potenciador del virus hCMVie representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO:1,

(iii) el intrón quimérico pCI-neo representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 13,

o de un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 24.

(iii) el intrón del gen ubiquitina que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 53, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 53.

En un modo de realización más particular de la invención, una unidad de transcripción según la invención está constituida de un polinucleótido que comprende un ácido nucleotídico representado por la secuencia SEC ID NO: 55 y constituido de:

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(ii) la región promotora de la Quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2,

(iii) la región 5' UTR representada por la secuencia SEC ID NO: 8, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 8, y

(iv) intrón del gen de la ubiquitina que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 53, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 53.

En un modo de realización más particular de la invención, una unidad de transcripción según la invención está constituida de un polinucleótido que comprende un ácido nucleotídico representado por la secuencia SEC ID NO: 62 y constituido de:

(ii): la región promotora de la Quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2,

(iii) la región 5' UTR representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 8, y

(iv) intrón del gen de la ubiquitina que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 53,

o de un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 62.

(i): el potenciador del virus hCMVie representado por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 1, o un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 1 y que posee esencialmente unas propiedades de activación de la transcripción,

(ii): la región promotora de la Quinasa 9 dependiente de ciclina (CDK9) representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 2, o un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 2 y que posee esencialmente una actividad promotora,

(iv) intrón del gen humano ROSA que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 54, o un ácido nucleotídico que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 54.

En un modo de realización más particular de la invención, una unidad de transcripción según la invención está constituida de un polinucleótido que comprende un ácido nucleotídico representado por la secuencia SEC ID NO: 69 y constituido de:

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En un modo de realización más particular de la invención, una unidad de transcripción según la invención está constituida de un polinucleótido que comprende un ácido nucleotídico representado por la secuencia SEC ID NO: 70 y constituido de:

(iii) la región 5' UTR representada por la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 9, y

(iv) intrón del gen humano ROSA que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 54, o de un ácido nucleotídico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO: 70.

En un modo de realización ventajoso, la presente invención se refiere a una unidad de transcripción, en la que la región promotora es la de CDK9, la región 5' UTR es la del gen eIF4GI (U3) y el intrón es el del gen EF1α, dicha unidad de transcripción que tiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO: 33, o una secuencia nucleotídica que presenta al menos un 70% de identidad con la secuencia SEC ID NO: 33 y que permite una producción volúmica de una proteína de interés superior a la obtenida con la combinación del potenciador CMV asociado a la región promotora de CDK9.

Se entiende por una “producción volúmica”, una cantidad de proteína expresada en masa por unidad de volumen (g/l) también denominada título de proteína o concentración de la proteína de interés.

La presente invención se refiere también un vector de expresión que comprende al menos una unidad de transcripción tal como se ha definido anteriormente, y al menos un sitio de clonación que permite la integración de un ácido nucleico que codifica para una proteína de interés.

Dicho ácido nucleico puede ser un ADN genómico, un ADN complementario (ADNc), un ácido nucleico sintético o un ácido nucleico quimérico.

Mediante la expresión “sitio de clonación”, se entiende un segmento corto de ADN que comprende uno o varios sitios de restricción, reconocidos respectivamente por una o varias enzimas de restricción y que permite la inserción de una secuencia nucleotídica de interés.

La presente invención se refiere también un vector de expresión que comprende al menos una unidad de transcripción tal como se ha definido anteriormente y al menos un sitio para la recombinación del sitio específico que permite la integración de un ácido nucleotídico que codifica para una proteína de interés.

Dicho ácido nucleotídico puede ser un ADN genómico o un ADN complementario (ADNc).

Mediante la expresión “sitio para la recombinación del sitio específico”, se entiende un segmento corto de ADN que es reconocido por una recombinasa, tal como el sitio loxP que es reconocido por la recombinasa Cre, el sitio xis que es reconocido por la integrasa Int, el sitio FRT que es reconocido por la recombinasa FLP.

Un vector de expresión según la presente invención puede comprender además un gen de resistencia eucariota, un gen de resistencia bacteriana, un origen de replicación bacteriana y una unidad dedicada a la amplificación génica.

Un gen de resistencia eucariota puede ser un gen de resistencia a la Geneticina (G418), Blasticidina, Zeocina.

Un gen de resistencia bacteriana puede ser un gen de resistencia a la ampicilina, Kanamicina, Puromicina, Blasticidina, Zeocina.

Un origen de replicación (Ori) bacteriana es una secuencia de ADN particular de origen bacteriano que permite el inicio de la replicación del material genético como un vector de expresión y condicionar en la bacteria el número de copias de vector por bacteria. Tal origen de replicación se puede seleccionar entre Ori-P, Ori-C, Ori-f1, ColE1, pSC101 Ori, p15A Ori, pACYC Ori, SV40 Ori, pMB1 Ori, pUC ori.

Mediante la expresión “una unidad dedicada a la amplificación génica”, se entiende cualquier unidad que permite realizar una amplificación génica y/o un enriquecimiento fuerte en células fuertemente productoras. Lo más frecuentemente, esta unidad permite la expresión de un gen de resistencia a un inhibidor que actúa de manera dependiente de la dosis; mediante el aumento de la dosis del inhibidor, se seleccionan variantes celulares que expresan más fuertemente el gen de resistencia, en particular tras una amplificación génica o integración en un sitio de fuerte expresión. Lo más frecuentemente, los genes próximos de esta unidad son también amplificados genéticamente y/o tienen una expresión aumentada. Tal unidad puede ser el gen dhfr (dihidrofolato reductasa) cuyo inhibidor es el metotrexato o el gen glutamina sintasa cuyo inhibidor es la metionilsulfoximina, un sistema de

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CDK9-U3 con intrón hROSA, E2-CDK9-U3 con intrón mROSA, LTR RSV con intrón EF1α, LTR RSV con intrón mROSA, E2-CDK9-U3 con intrón EF1α, LTR RSV con intrón hROSA. Los vectores de referencia son RSV_T125_K2 y pRep4KT125. El eje de las ordenadas representa la concentración en cadenas kappa libres en el medio de cultivo. E2 representa el potenciador hCMVie. U3 corresponde a la región 5'UTR del gen eIF4G1.

La figura 31 ilustra la comparación de la expresión en pools estables de transfectantes que expresan IgG anti-Rh(D) en la línea CHO-S en función del vector (E2CDK9U3 / LTR RSV intrón pCIneo) y más precisamente la productividad en pools estables del anticuerpo entero anti-Rh(D) T125 con el vector que contiene la unidad de transcripción E2CDK9-U3 (HK E2 CDK9 U3) en comparación con la referencia con LTR RSV intrón pCIneo (HK463-18). E2 representa el potenciador hCMVie. U3 corresponde a la región 5'UTR del gen eIF4G1.

La figura 32 es un diagrama de distribución de los transfectantes que expresan IgG anti-Rh(D) en la línea CHO-S en función del vector (E2CDK9U3 / LTR RSV intrón pCI neo). Este diagrama ilustra la productividad de clones que producen el anticuerpo entero anti-Rh(D) T125 con el vector que contiene la unidad de transcripción E2-CDK9-U3 (HK E2 CDK9 U3) en comparación con la referencia con LTR RSV intrón pCIneo (HK463-18).

La figura 33 ilustra la comparación de los títulos medios de cadenas kappa T125 obtenidos en la línea YB2/0 a partir de los vectores que contienen diferentes unidades de transcripción según la invención, a saber E2-CDK9-U1, E2CDK9-U2, E2-CDK9-U3, E2-CDK9-U2U3, E2-CDK9-U1U2U3. Los 6 medios obtenidos son comparados a fin de determinar cuales son significativamente diferentes los unos de los otros (ensayos de extensiones múltiples).

La figura 34 ilustra la comparación de los títulos medios en inmunoglobulina entera anti-Rh(D) obtenidas en la línea YB2/0 a partir del vector E2-CDK9-U3 y del vector de referencia HK463-18 que contiene RSV + intrón pCIneo. Se comparan los medios obtenidos a fin de determinar si son significativamente diferentes el uno del otro (ensayo de extensiones múltiple).

La figura 35 ilustra la comparación de los títulos medios de la inmunoglobulina anti-CD71 (H7) obtenida en la línea YB2/0 a partir del vector E2-CDK9-U3 que contiene el intrón EF1α con la obtenida a partir del vector de referencia RSV_pCLneo que contiene también el intrón EF. Los medios obtenidos son comparados a fin de determinar cuales son significativamente diferentes los unos de los otros (ensayos de extensiones múltiples).

Ejemplos:

1. Materiales y métodos 1.1. Transfección transitoria

En YB2/0, las células parentales son sembradas el día anterior de la transfección (D-1) a 2E5 cv/ml en EMS (Invitrogen, medio por encargo) + 5% SVF (Invitrogen) en Flask. El día de la electroporación (D0), centrifugación de 4E6 células por pila (Biorad) de 4 mm recogidos en 100 µl de tampón V (Cell line nucleofector kitV, Lonza) que son nucleofectadas por AMAXA con 4 µg de ADN plasmídico utilizando el programa T020 del aparato. Las células son cultivadas en pocillos placa P6 a 37°C, 7% de CO2 en 3 ml de medio EMS + 5% de SVF. Los sobrenadantes son recogidos para la determinación ELISA a D+5.

En CHO-S, las secuencias a expresar son evaluadas en transfección transitoria según el protocole del kit FreeStyle (Invitrogen). Las células parentales son inoculadas 24h antes de la transfección (D-1) en Erlenmeyer (VWR) a 6E5 cv/ml en FreeStyle CHO EM (Fisher Bioblock scientific) e incubadas bajo agitación a 120 rpm, 37°C, 8% de CO2. El día de la transfección, se forma un complejo FreeStyle MAX Reagent (Fisher Bioblock Scientific) /ADN, en la relación 1:1, en Opti Pro SFM (Invitrogen). El complejo se deposita después sobre las células en suspensión previamente centrifugadas y recogidas a 1E6 cv/ml en FreeStyle CHO EM en un cultiflask (Sartorius) (5ml) e incubado a 200 rpm a 37°C, 8% de CO2. Los sobrenadantes son recogidos D+5 para la evaluación del porcentaje de moléculas segregadas en el medio.

1.2. Transfección estable 1.2.1 Transfección estable de la línea YB2/0 en medio con suero

Las células deben tener un crecimiento estabilizado y estar descongeladas desde al menos 4 semanas en medio EMS (LFB) + 5% SVF en unos flask F150 (80 ml). Las células se trasplantan el día anterior a 2E5 cv/ml en medio EMS + 5% SVF.

El día de la electroporación, las células son electroporadas por Gene Pulser Xcell (BioRad) con un voltaje de 230 V y una capacitancia de 960 µF en cubetas (Biorad) de 4 mm con 5E6 cv (csp 500 µl de tampón de electroporación del kit electrobuffer (Ozyme) que contiene el ADN plasmídico linealizado). Después de la electroporación, se realiza el esparcimiento en placas de 24 pocillos (P24) (25000 células/pocillo) en medio EMS + 5% SVF.

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➢: Ligación de dicho fragmento digerido en el vector CHK622-21 digerido para obtener el vector HK622-21_138H11B_MB7 de 10757 pb (figura 16),

➢: Cribado por PCR con los cebadores apropiados que da un amplicón de 601 pb.

Clonación de las cadenas pesadas del anticuerpo 138H11 con péptido señal MB7 en el vector genérico E2CDK9-U3-Gen

➢: Digestión del vector E2-CDK9-U3-Gen (figura 17) por NheI y AseI

➢: Recuperación de un fragmento de 8928 pb por extracto nucleoespinoso

➢: Digestión del vector HK622-21_138H11B_MB7 por NheI y AseI

➢: Recuperación de un fragmento de 1435 pb por extracto nucleoespinoso

➢: Ligación de dicho fragmento digerido en el vector E2-CDK9-U3-Gen digerido para obtener el vector E2CDK9-U3-H138H11B_MB7

➢: Cribado por PCR con los cebadores apropiados que da un amplicón de 512 pb

Clonación de las cadenas ligeras del anticuerpo 138H11 con péptido señal MB7 en el vector genérico E2CDK9-U3-Gen

➢: Digestión del vector E2-CDK9-U3-H138H11B_MB7 por SpeI y XbaI

➢: Desfosforilación del vector digerido y recuperación de un fragmento de 10347 pb por extracto nucleoespinoso

➢: Digestión del vector HK622-21_138H11B_MB7 por SpeI y XbaI

➢: Recuperación de un fragmento de 709 pb por extracto nucleoespinoso

➢: Ligación de dicho fragmento digerido en el vector E2-CDK9-U3-Gen digerido para obtener el vector E2CDK9-U3-HK138H11B_MB7 (figura 18)

➢: Cribado por PCR con los cebadores apropiados que da un amplicón de 407 pb

Ejemplo 15: Construcción del vector E2-CDK9-U3-pCI-neo-HK138H11B

El vector HK1358-4 (figura 19), en el que el intrón quimérico del pCI-neo está insertado en el vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7, se construye para la expresión en pools estable del anticuerpo quimérico anti-GGT 138H11_B en la línea YB2/0.

Clonación del intrón quimérico del pCI-neo en el vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7

El vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7 está digerido por NheI y SpeI. Se obtienen 2 fragmentos de 7978 pb y 3088 pb por extracto nucleoespinoso. El ácido nucleotídico del intrón quimérico pCI-neo está amplificado a partir del vector CHK622-21 utilizando los cebadores P1pCiNeo-NheI (acagaggagagctaggtaagtatcaaggttacaagac) y P2p-pCIneo-NheI (tacgcattgagctagctgtggagagaaaggcaaagtg ) que da un amplicón de 163 pb y los cebadores P1pCiNeo-SpeI (acagaggagaactaggtaagtatcaaggttacaagac) y P2p-pCI-neo-SpeI (cagccacagtactagctgtggagagaaaggcaaagtg) que da un amplicón de 164 pb.

Las PCR son realizadas con la enzima KAPAHIFI. Cada cebador está compuesto de 15 bases complementarias a la secuencia del vector E2-CDK9-U3-HK138H11B_MB7 a nivel del sitio de inserción y de una veintena de bases que pertenecen a la secuencia del intrón a reinsertar.

Se ha añadido une base suplementaria a fin de recrear el sitio de inserción.

El intrón quimérico pCI-neo se inserta en el vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7 digerido mediante el método IN-FUSION. El método IN-FUSION es un método descrito en el kit comercial de Ozyme (ref 639690).

Los dos fragmentos de 163 pb y 164 pb obtenidos por PCR, así como el vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7 digerido son reunidos en una sola etapa para obtener el vector HK1358-4. La inserción del intrón en el vector se verifica por los cebadores 5'1PLC/CHoptiREV que da un amplicón de 570 pb y los cebadores 5'PLC/GGT KD3 que da un amplicón de 387 pb.

Ejemplo 16: Construcción del vector E2-CDK9-U3-pEF

El vector HK1358-5 (figura 20), en el que el intrón EF1α está insertado en el vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7, se construye para la expresión en pools estable del anticuerpo quimérico anti-GGT 138H11_B en la línea YB2/0.

El vector E2-CDK9-U3-HK138H11B MB7 está digerido por NheI y SpeI. Dos fragmentos de 7978 pb y 3088 pb son obtenidos por extracto nucleoespinoso. El ácido nucleotídico del intrón EF1α está amplificado a partir del vector K622-37EF utilizando los cebadores P1EF-NheI (ACAGAGGAGAGCTAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCC) y P22

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➢ todos los intrones ensayados aportan una ganancia suplementaria a la combinación E2CDK9U3: más modesta para los intrones beta-actina, pCIneo y HTLV, bastante importante para los intrones murino y humano ROSA, muy importantes para los intrones ubiquitina y EF (con o sin el pequeño exón en 5') que permite unas ganancias máximas de aproximadamente 6x con respecto a la referencia LTR RSV + intrón

5 pCI neo.

La figura 27 muestra en particular que:

➢ La jerarquía global de los intrones en combinación con E2CDK9U3 está mantenida con respecto al

10 ensayo con el anticuerpo anti-GGT. En particular, los intrones EF (con y sin exón) y ubiquitina son los más fuertes (aproximadamente x2 con respecto a la referencia LTR RSV + intrón pCI neo), el intrón mROSA guarda un efecto importante (x1,6). El intrón hROSA no se ha ensayado en este ensayo.

➢ Las ganancias con respecto a la referencia LTR RSV + intrón pCI neo son menos importantes en este

15 ensayo sin causa identificada. La jerarquía de los intrones no está, no obstante, cuestionada y unos ensayos ulteriores, con el mismo anticuerpo a expresar y el mismo procedimiento en medio sin suero, han mostrado unas ganancias más elevadas y similares a las obtenidas en medio con suero (x5 para el intrón EFss; véase la figura 28).

20 Ejemplo 23: Producción de 3 anticuerpos diferentes en YB2/0, con y sin suero, por un vector que contiene la unidad de transcripción E2CDK9U3+EFss (o EF).

Las secuencias que codifican para 3 anticuerpos: anti-CD20 (R603), anti-GGT (138H11B MB7) y anti-AMHRII (3C23K) se han integrado en un vector que contienen la unidad de transcripción E2CDK9U3+EFss. Estos vectores,

25 así como sus vectores homologues salvo que la unidad de transcripción está bajo el control del LTR RSV+intrón pCI neo (control de referencia) en lugar de E2CDK9U3+EFss, se han expresado en pool, con y sin suero para anti-CD20 y anti-AMHRII, con suero para anti-GGT, en transfecciones independientes.

La ganancia aportado por la estructura E2CDK9U3+intrón EF se estima por comparación con el vector de referencia 30 que codifica para la misma IgG pero con una estructura de UT que comprende el LTR RSV + intrón pCIneo en lugar de la estructura E2CDK9U3+intrón EF.

La figura 28 ilustra la productividad de los 3 anticuerpos anti-GGT (138H11B), anti-AMHRII (3C23K) y anti-CD20 (R603) en el contexto E2CDK9U3 + intrón EFss, en comparación con la referencia LTR RSV + intrón pCI neo.

35 Muestra en particular que la combinación E2CDK9U3+intrón EFss aporta siempre una ganancia significativa con respecto a LTR RSV + intrón pCI neo: de 4,6 a 6,1x para los 3 anticuerpos en medio con suero. En medio sin suero, para los 2 anticuerpos ensayados, los resultados son más variables pero muestran también un efecto importante de la combinación E2CDK9U3+intrón EFss (la ganancia más baja de 2x es la ya mostrada en la figura 27).

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Ejemplo 24: Comparación de los intrones en asociación con el LTR RSV

Los intrones a ensayar (Bact (β-actina), EF1α, mROSA, hROSA, 5'-LTR HTLV1, ubc (ubiquitina) son insertados en el vector de expresión K622_37, que comprende el LTR RSV, para producir la cadena ligera kappa del anticuerpo 45 T125. La ganancia de productividad de los vectores así construidos se compara con la de los vectores de referencia RSV_int_KT125_2STP y RSV_T125_K2.

Los resultados obtenidos a partir de 3 transfecciones realizadas sobre 3 semanas diferentes son ilustrados en la figura 29 y permiten observar unas diferencias significativas entre los intrones.

50 Une comparación múltiple se realiza para las medias (ng/ml) de producción de cadena ligera de Ig obtenidas con los diferentes intrones en la línea CHO-S (Tabla 1). El método actualmente utilizado para discriminar entre las medias es el procedimiento de las diferencias significativas mínimas de Fisher (LSD). Se efectúan unos ensayos de las extensiones múltiples con el método 95,0% LSD. Estos pares tienen diferencias estadísticamente significativas a

55 nivel de confianza del 95,0%.

Tabla 1

Efectivo: Media Grupo homogéneo

RSV_int_KT125_2STP: 18 25506,3 X

K622_37_HTLV: 18 26511,3 X

K622_37_Ubc: 18 28790,0 XX

K622_37_Bact: 17 31992,3 XX

K622_37_hROSA: 18 33561,0 X

RSV_T125_K2: 16 34362,8 X

K622_37_mROSA: 15 38874,8 X

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Se identifican cinco grupos homogéneos utilizando unas columnas de X. El intrón EF1α es significativamente el más eficaz. En segunda posición se sitúa el intrón mROSA. Los otros intrones no tienen efecto positivo en asociación con el LTR RSV.

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Ejemplo 25: Comparación de las unidades de transcripción en los contextos E2-CDK9-U3 y LTR RSV

Las diferentes unidades de transcripción a ensayar son ensayadas para la producción de la cadena ligera kappa del anticuerpo T125. La ganancia de productividad de los vectores así construidos se compara con la de los vectores de

10 referencia pRep4KT125 y RSV_T125_K2.

Los resultados obtenidos a partir de 3 transfecciones realizadas en 3 semanas diferentes son ilustrados en la figura 30 y permiten observar unas diferencias significativas entre las asociaciones ensayadas.

15 Se realiza una comparación múltiple para las medias (ng/ml) de producción de cadena ligera obtenidas con las diferentes asociaciones en la línea CHO-S (Tabla 2). El método actualmente utilizado para discriminar entre los medios es el procedimiento de las diferencias significativas mínimas de Fisher (LSD). Se efectúan unos ensayos de extensiones múltiples con el método 95,0% LSD. Estos pares tienen diferencias estadísticamente significativas a nivel de confianza del 95,0%.

20 Tabla 2

Efectivo: Media Grupo homogéneo

RSVT125K2: 12 10940,2 X

E2CDK9U3 hRosa: 12 15847,6 X

K622_37 hRosa: 12 23340,0 X

pRep4KT125: 12 23843,2 X

E2CDK9U3: 12 31903,9 X

K622_37 mRosa: 12 35041,1 X

E2CDK9U3 mRosa: 12 40688,4 X

K622_37 EF: 12 41708,2 X

E2CDK9U3 EF: 12 51907,2 X

Se identifican cinco grupos que utilizan unas columnas de X.

25 La asociación de E2-CDK9-U3 con el intrón EF1α es significativamente la más eficaz. En el contexto E2-CDK9-U3, el intrón EF1α aporta así una ganancia del 63%.

Las asociaciones LTR RSV con intrón EF y E2-CDK9-U3 con intrón mROSA son también significativamente muy eficaces. 30 En una menor medida, las otras asociaciones ensayadas son más eficaces que la referencia RSV T125 K2.

Ejemplo 26: Producción del anticuerpo anti-Rh(D) entero (HK) por unos vectores que contienen E2CDK9U3 en las células CHO-S

35 Los anticuerpos anti-Rh(D) enteros (HK) son producidos respectivamente en las células CHO-S transfectadas por los vectores que contienen una unidad de transcripción de estructura E2-CDK9-U3 y en las células CHO-S transfectadas por los vectores que contienen una unidad de transcripción de estructura RSV-intrón pCineo (vector de referencia).

40 La tabla 3 siguiente muestra los resultados de determinación de los anticuerpos anti-Rh(D) enteros producidos por unos pools de células transfectadas por el vector HK463-18 o por el vector HK E2-CDK9-U3. La figura 31 ilustra estos resultados.

45 Tabla 3: F6-2= pool procedente de transfección con HK463-18, F11-2 = pool procedente de transfección con HK E2CDK9-U3

Pool: Medio Tipo de producción discontinuo Análisis IgG ELISA en ng/ml Ganancia E2CDK9U3 / RSV+intronpCl

F6-2: Freestyle + G418 D+12 F25 2324

F112: Freestyle + G418 D+12 F25 14 193 6,1

62

Claims

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