RU2011146243A

RU2011146243A - Экспрессионный плазмидный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и усиленной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, бицистронная мрнк, способ получения стабильных линий продуцентов рекомбинантных белков с использованием указанного вектора, способ получения рекомбинантных белков

Info

Publication number: RU2011146243A
Application number: RU2011146243/10A
Authority: RU
Inventors: Надежда Александровна Орлова; Сергей Владимирович Ковнир; Иван Иванович Воробьев
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ")
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2013-05-27
Also published as: RU2488633C1

Abstract

1. Экспрессионный плазмидный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и ускоренной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, в следующей последовательности содержащий участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' нетранслируемой областью этого гена; участок для клонирования открытой рамки считывания целевого белка (полилинкер); внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с целевым геном (IRES DHFR); и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' нетранслируемой областью этого гена.2. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.3. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что используют открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.4. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный вектор дополнительно содержит консенсусную последовательность Козак.5. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанным вектором является вектор p1.1, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.6. Бицистронная мРНК, образующаяся в процессе экспрессии вектора по п.1, содержащая открытую рамку считывания целевого рекомбинантного бел�

Claims

1. Экспрессионный плазмидный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и ускоренной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, в следующей последовательности содержащий участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' нетранслируемой областью этого гена; участок для клонирования открытой рамки считывания целевого белка (полилинкер); внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с целевым геном (IRES DHFR); и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' нетранслируемой областью этого гена.

2. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

3. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что используют открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.

4. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный вектор дополнительно содержит консенсусную последовательность Козак.

5. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанным вектором является вектор p1.1, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.

6. Бицистронная мРНК, образующаяся в процессе экспрессии вектора по п.1, содержащая открытую рамку считывания целевого рекомбинантного белка, внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV) и открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR).

7. Бицистронная мРНК по п.6, отличающаяся тем, что используют открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.

8. Способ получения стабильной линии клеток млекопитающих с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме - продуцентов рекомбинантного белка, включающий следующие стадии:

а) трансфекцию клеток млекопитающего, не содержащих активные аллели дегидрофолатредуктазы, экспрессионным вектором по п.1, содержащим вставку с открытой рамкой считывания гена, кодирующего целевой рекомбинантный белок;

б) отбор жизнеспособных клеток на среде, не содержащей гипоксантин и тимидин; и

в) отбор полученных на стадии б) клеток млекопитающих - продуцентов целевого белка на среде, содержащей метотрексат.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что концентрация метотрексата в среде составляет от 50 нМ до 200 нМ.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что используют клетки эпителия яичника китайского хомячка (СНО) DG-44, нокаутные по гену дигидрофолатредуктазы.

11. Способ получения рекомбинантного белка, включающий следующие стадии:

- культивирование в питательной среде клеток млекопитающих - продуцентов целевого белка, полученных способом по п.8; и

- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что культивируют клетки СНО DG44, трансфицированные экспрессионным вектором по п.1, содержащим вставку с открытой рамкой считывания гена, кодирующего целевой рекомбинантный белок.