CN104974226A - 一种用于蛋白质表达的信号肽 - Google Patents

一种用于蛋白质表达的信号肽 Download PDF

Info

Publication number
CN104974226A
CN104974226A CN201410128463.6A CN201410128463A CN104974226A CN 104974226 A CN104974226 A CN 104974226A CN 201410128463 A CN201410128463 A CN 201410128463A CN 104974226 A CN104974226 A CN 104974226A
Authority
CN
China
Prior art keywords
signal peptide
protein
polynucleotide
mammalian
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410128463.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104974226B (zh
Inventor
张玉晶
倪宝富
高宏海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201410128463.6A priority Critical patent/CN104974226B/zh
Publication of CN104974226A publication Critical patent/CN104974226A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104974226B publication Critical patent/CN104974226B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于蛋白质表达的信号肽，具体地，本发明涉及用于引导外源蛋白质（如抗体）在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的信号肽可添加于哺乳动物细胞重组蛋白（如抗体）的表达载体,用于引导外源蛋白的高效分泌表达。与现有信号肽相比，本发明信号肽引导的外源蛋白表达量得到了大幅提升。

Description

一种用于蛋白质表达的信号肽
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于引导外源蛋白质（如抗体）在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。
技术背景
2007年我国基因重组蛋白类药物取得较快发展，在基因组技术的上游阶段，利用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统，结合新的融合蛋白载体的构建，有效的提高现有重组蛋白药物的半衰期和可溶性等特性，为工业化制备提供了新的工艺，从而提高了重组蛋白的回收率；但在下游的分离纯化技术和哺乳细胞表达系统的表达和纯化能力方面，仍存在较大差距。特别是现代生物医药的重要组成部分——抗体，抗体针对相应抗原具有高特异性和高亲和力的特性，使得其在疾病的诊断和治疗中显示出其他类型药物无可比拟的优势。抗体药物经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体的发展，抗体药物向低抗原性、高特异性方向发展。抗体制备方法经历了常规血清技术、杂交瘤技术、基因工程抗体技术及抗体库技术。使用体外筛选技术与转基因动物筛选获得全人源抗体成为抗体研究的主要方向。利用哺乳动物细胞表达蛋白质（如抗体）成为蛋白质生产的主流，但哺乳动物细胞外源蛋白表达效率低，且成本高，因此提高哺乳动物细胞外源蛋白表达效率，降低生产成本是当前工作中的重中之重。
工业上，蛋白质（如抗体）的表达水平受很多因素影响，如表达载体、宿主、培养基、培养工艺等。而表达载体的表达能力又受启动子、信号肽等因素影响，其中信号肽在蛋白质（如抗体）的分泌表达过程中扮演着至关重要的作用，直接影响分泌蛋白质的质量。
信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端；一个中间疏水序列，以中性氨基酸为主，能够形成一段α螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，
新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。信号肽分泌外源蛋白的作用如下：
1）信号肽能够引导分泌蛋白或膜蛋白出胞。
2）信号肽的疏水核心决定蛋白质的分泌效率。
3）信号肽能够引导蛋白质在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确的定位。
4）信号肽能够分泌增强子增强外源蛋白的分泌。
5）短的信号欣有利于减少表达载体的分子置，提高整合到宿主染色体上外源基因表达盒的
稳定性和转录效率。
同一种蛋白在不同信号肽的作用下，即使都能分泌表达，其分泌效率也会相差甚远。如Nagarajan选择了枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢杆菌RNA酶(barnase)和果聚糖蔗糖酶等4种酶的信号肽，以芽孢杆菌BE1510为宿主菌，分别研究它们对重组链霉抗生物素蛋白(streptavidin)分泌效果的影响。结果表明，携带4种融合基因的菌株都能有效分泌四聚体链霉抗生物素蛋白，但以用中性蛋白酶信号肽时效率最高。适当改造信号肽结构可提高外源蛋白的分泌效率。对于外源蛋白（如抗体），选择合适的信号肽可以将其表达量成倍提高，无论对于工业生产还是科学研究，其意义都是非常深远的。
发明内容
本发明目的是提供一种可以引导外源蛋白质（如抗体）高效表达的信号肽，以降低外源蛋白的生产成本。
首先，本发明提供了一种人工合成的用于引导外源蛋白质在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1MGKWVKVLFALICIAVAYS
所述的哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）、幼年仓鼠肾细胞（baby hamster kidney，BHK）、小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）、小鼠乳腺肿瘤细胞(C127)、人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293）等。
本发明的信号肽可用于在哺乳动物宿主细胞中引导外源蛋白（如抗体）的分泌表达。
本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述用于引导外源蛋白（如抗体）在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。
进一步的，所述多核甘酸的序列为SEQ ID NO:7：
ATGGGAAAATGGGTGAAAGTGCTGTTTGCCCTGATCTGTATTGCAGTGGCATATAGC（SEQ IDNO:7）
本发明的多核苷酸可通过常规的合成方法制备。
本发明的多核苷酸可添加于哺乳动物细胞表达载体,用于引导外源蛋白的分泌表达。
利用本发明的信号肽在动物细胞中分泌表达蛋白质（如抗体）的方法为：将编码本发明信号肽的多核苷酸与编码表达蛋白质（如抗体）的多核苷酸连接后克隆入哺乳动物细胞表达载体，而后将该重组哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物细胞后表达目的蛋白。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞表达载体，所述表达载体含有前述编码本发明信号肽的多核苷酸及编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸。
所述表达载体中，编码本发明信号肽的多核苷酸紧接在所述编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸前端。本发明引用了天然抗体信号肽进行对比，氨基酸序列为SEQ ID NO:2-6。
SEQ ID NO:2METPAQLLFLLLLWLP(GenBank:AAA36085.1,Homo sapiens)
SEQ ID NO:3MGWSCIILFLVATATGVHS(GenBank:CAA25967.1,Mus musculus)
SEQ ID NO:4MGWSCIILFLVATATG（GenBank:AAA38605.1,Mus musculus）
SEQ ID NO:5MSVPTQVLGLLLLWLTDARC（GenBank:CAB46315.1,Mus musculus）
SEQ ID NO:6MDMRVPAQLLGLLLLWLPG（GenBank:AAA58934.1,Homo sapiens）
所述表达载体的启动子可以是EF-1α（human elongation factor-1α）启动子、hCMV（human cytomegalovirus）启动子、SV40（Simian vacuolating virus40）晚期启动子、SV40早期启动子或者EF-1α与hCMV启动子的杂合启动子等。
如本发明实施例列举的，所述表达载体为Freedom pCHO1.0。
本发明还提供了一种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为前述表达载体所转染。所述的哺乳动物细胞可选自CHO、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。
所述外源蛋白可以为任意蛋白质，如抗体、融合蛋白或者非融合蛋白等
本发明将本发明信号肽与天然抗体信号肽进行比较，外源蛋白表达量的测定结果表明，本发明的信号肽特别适用于CHO细胞的外源蛋白表达，与现有信号肽相比，在动物细胞中的外源蛋白（如抗体）表达量获得大幅提升，表达水平提高了2倍以上，其应用有利于筛选到高表达单克隆细胞株，并可以降低生产成本。
附图说明
图1Freedom pCHO1.0表达载体图
图2本发明信号肽与天然抗体信号肽引导的外源蛋白表达量对比图
图3利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的纯度
图4利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的轻链N端测序图谱
图5利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的重链N端测序图谱
图6利用本发明信号肽制备的贝伐单抗的完整分子量图谱
具体实施方式
下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制
本发明实施例所列举的表达载体为Freedom pCHO1.0（购自invitrogen）。
实施例1信号肽的合成
因信号肽较短，将信号肽按引物合成。每条信号肽5’端都分别添加单独AvrII、EcoRV酶切位点，即一条信号肽合成含有一个酶切位点；每条信号肽3’端添加部分与目的基因序列相同的片段，便于拼接。信号肽核苷酸序列如下。
信号肽1：ATGGGAAAATGGGTGAAAGTGCTGTTTGCCCTGATCTGTATTGCAGTGGCATATAGC（SEQ ID NO:7）
信号肽2：ATGGAAACCCCTGCTCAGCTCCTCTTCCTGCTCCTCCTCTGGCTCCCA（SEQ ID NO:8）
信号肽3：ATGGGATGGTCCTGTATTATTCTGTTTCTCGTGGCTACTGCAACTGGCGTCCACAGC（SEQ ID NO:9）
信号肽4：ATGGGATGGTCCTGTATTATTCTGTTTCTCGTGGCTACTGCAACTGGA（SEQ ID NO:10）
信号肽5:ATGAGCGTCCCAACACAAGTGCTGGGTCTGCTGCTGCTGTGGCTGACTGACGCAAGGTGC（SEQ ID NO:11）
信号肽6：ATGGATATGAGGGTGCCCGCTCAACTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGCCAGGC（SEQ ID NO:12）
实施例2重组pCHO1.0表达载体的构建
将经过密码子优化的贝伐单抗基因重链（WO2004/065417,SEQ ID NO:24，3’端添加BstZ171酶切位点）分别与信号肽1-6（5’端含有AvrII）进行拼接，并分别经AvrII/BstZ171双酶切处理后，连接至AvrII/BstZ171双酶切后的质粒pCHO1.0（购自Invitrogen），所获得的重组质粒命名为pCHO-LC1，pCHO-LC2，pCHO-LC3，pCHO-LC4，pCHO-LC5，pCHO-LC6。
将经过密码子优化的贝伐单抗基因轻链（WO2004/065417,SEQ ID NO:25，3’端添加PacI酶切位点）分别与信号肽1-6（5’端含有EcoRV）进行拼接，并分别经PacI/EcoRI双酶切处理后，连接至分别经PacI/EcoRI双酶切后的质粒pCHO-LC1，pCHO-LC2，pCHO-LC3，pCHO-LC4，pCHO-LC5，pCHO-LC6，所获得的重组质粒命名为pCHO-A1，pCHO-A2，pCHO-A3，pCHO-A4，pCHO-A5，pCHO-A6。
实施例3重组表达载体瞬时转染表达研究
采用脂质体法(freestyle MAX,invitrogen）将质粒pCHO-A1，pCHO-A2，pCHO-A3，pCHO-A4，pCHO-A5，pCHO-A6分别转染CHO-S细胞，检测抗体瞬时表达水平。
按照freestyle MAX操作说明书，将5μg pCHO-A1，pCHO-A2，pCHO-A3，pCHO-A4，pCHO-A5，pCHO-A6质粒分别转染培养于6孔板（3ml/well）的CHO-S细胞（约3×106个细胞）。转染细胞在8%CO2，37℃的细胞震荡培养箱Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用Elisa法检测人贝伐单抗表达量。pCHO-A1，pCHO-A2，pCHO-A3，pCHO-A4，pCHO-A5，pCHO-A6的抗体表达量分别为4.2ug/ml,1ug/ml,1.1ug/ml,1.41ug/ml,1.28ug/ml,1.2ug/ml。结果显示，本发明信号肽相对于天然抗体信号肽，在相同条件下，抗体表达量提高了2倍以上,具体见附图2。
实施例4小量抗体的制备
按照Freedom CHO-2Kit操作说明书，将50ug pCHO-A1质粒转染于摇瓶培养的30mlCHO-S细胞（1×106cells/ml）。转染细胞在8%CO2，37℃的Infors中摇动培养48小时后，加入MTX和嘌呤霉素进行加压筛选。待细胞活力上升至90%，进行简单流加（Simple Fed-batch）（3×105细胞密度接种，Day3和Day5补入4g/L糖，Day7补入6g/L糖；37℃/130rpm/8%CO2）以生产小量抗体。收集SimpleFed-batch上清，用ProteinA(MabSelect SuRe,购自GE Healthcare)纯化柱进行亲和纯化（结合缓冲液:NaCl，0.5M，Na2HPO4,20mM，PH8.0；洗脱液：50mM柠檬酸缓冲液PH3.5），最终获得高纯度的贝伐单抗。
实施例5表达抗体质量初步鉴定
将实施例4制备的贝伐单抗进行SEC-HPLC（Agilent1260,TSK3000SWXL色谱柱）纯度分析，纯度大于99%（见图3）。
用氨基酸测序仪将实施例4制备的贝伐单抗进行N端测序，N端测序结果与理论序列完全一致（见图4，图5）。
利用Q-TOF（Q-TOF，Agilent6500）对制备的贝伐单抗进行完整分子量分析，分子量测定结果与原研药一致（见图6）。
根据各项检测结果表明本发明信号肽所引导分泌的抗体序列切割完全正确，可以用于引导外源蛋白（如抗体）的表达。
按照上述方法，本发明的申请人还对依那西普、曲妥珠单抗、利妥昔单抗（Rituximab、MabThera）等等蛋白质进行类似实验，结果表明，本发明信号肽引导的蛋白质在哺乳动物细胞中的表达量均获得大幅提升。

Claims (12)

1.一种人工合成的信号肽，其特征在于所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述信号肽用于在哺乳动物宿主细胞中引导外源蛋白的分泌表达。
3.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述信号肽。
4.根据权利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核甘酸的序列为SEQ IDNO:7所示。
5.一种哺乳动物细胞表达载体，所述哺乳动物细胞表达载体含有权利要求3或4所述多核苷酸及编码外源蛋白的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，权利要求3或4所述多核苷酸紧接在所述编码外源蛋白的多核苷酸前端。
7.根据权利要求5-6所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体的启动子选自EF-1α启动子、hCMV启动子、SV40启动子或者EF-1α与hCMV启动子的杂合启动子等。
8.根据权利要求5-6所述外源蛋白，其特征在于，所述外源蛋白选自抗体、融合蛋白或者非融合蛋白。
9.一种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为权利要求5-7任一所述表达载体所转染。
10.根据权利要求9所述哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞为CHO、BHK、SP2/0、C127或HEK293细胞。
11.根据权利要求10所述哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述细胞是CHO细胞。
12.一种外源蛋白质的生产方法，为在适合表达哺乳动物来源的蛋白质的条件下，培养权利要求10或11所述重组哺乳动物细胞，而后从培养物中分离出所述哺乳动物来源的蛋白质。
CN201410128463.6A 2014-04-01 2014-04-01 一种用于蛋白质表达的信号肽 Active CN104974226B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410128463.6A CN104974226B (zh) 2014-04-01 2014-04-01 一种用于蛋白质表达的信号肽

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410128463.6A CN104974226B (zh) 2014-04-01 2014-04-01 一种用于蛋白质表达的信号肽

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104974226A true CN104974226A (zh) 2015-10-14
CN104974226B CN104974226B (zh) 2019-10-15

Family

ID=54271230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410128463.6A Active CN104974226B (zh) 2014-04-01 2014-04-01 一种用于蛋白质表达的信号肽

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104974226B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112028972A (zh) * 2020-08-27 2020-12-04 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 提高哺乳动物细胞重组蛋白分泌表达的信号肽及其应用
CN113402589A (zh) * 2021-06-18 2021-09-17 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 一种提高抗体产量的信号肽
CN116102625A (zh) * 2023-03-20 2023-05-12 杭州斯达特生物科技有限公司 一种信号肽及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921315A (zh) * 2010-09-17 2010-12-22 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659927A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659928A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN103254277A (zh) * 2013-05-03 2013-08-21 南京工业大学 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用
CN103328647A (zh) * 2010-09-21 2013-09-25 廖经伦 黄病毒重组体及其应用
WO2013163654A2 (en) * 2012-04-27 2013-10-31 Pronutria, Inc. Nucleic acids, cells, and methods for producing secreted proteins
CN103483423A (zh) * 2010-09-17 2014-01-01 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921315A (zh) * 2010-09-17 2010-12-22 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659927A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659928A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN103483423A (zh) * 2010-09-17 2014-01-01 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN103328647A (zh) * 2010-09-21 2013-09-25 廖经伦 黄病毒重组体及其应用
WO2013163654A2 (en) * 2012-04-27 2013-10-31 Pronutria, Inc. Nucleic acids, cells, and methods for producing secreted proteins
CN103254277A (zh) * 2013-05-03 2013-08-21 南京工业大学 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUNNAR YON HEIJNE: "The Signal Peptide", 《J. MEMBRANE BIOL.》 *
信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用: "郑斌 等", 《生物技术通讯》 *
张志谦 等: "生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达", 《中国生物化学与分子生物学报》 *
赵慧 等: "信号肽对外源蛋白分泌效率的影响", 《生命的化学》 *
韦雪芳 等: "信号肽及其在蛋白质表达中的应用", 《生物技术通报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112028972A (zh) * 2020-08-27 2020-12-04 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 提高哺乳动物细胞重组蛋白分泌表达的信号肽及其应用
CN113402589A (zh) * 2021-06-18 2021-09-17 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 一种提高抗体产量的信号肽
CN116102625A (zh) * 2023-03-20 2023-05-12 杭州斯达特生物科技有限公司 一种信号肽及其应用
CN116102625B (zh) * 2023-03-20 2023-09-22 杭州斯达特生物科技有限公司 一种信号肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104974226B (zh) 2019-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106661588B (zh) 双顺反子细菌表达系统
AU2018201094B2 (en) Production cell line enhancers
CN102659928B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
CN104974226A (zh) 一种用于蛋白质表达的信号肽
JP2023109812A (ja) 生物製剤の製造のためのユニバーサル自己調節性哺乳動物細胞株プラットフォーム
CN106478773B (zh) 一种人工合成的新型信号肽
CN101245106A (zh) 抗vrgf受体单克隆抗体及其制备方法和应用
JP2023156329A (ja) 目的タンパク質を産生するための宿主細胞
CN103483423B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
CN101921315B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
CN106478774B (zh) 一种用于蛋白质表达的信号肽
CN105779490A (zh) 一种och1缺陷型抗cd20四价抗体表达毕赤酵母的构建方法
CN110117325B (zh) 一种猪cd127多肽及其编码基因和应用
CN106636123B (zh) 在CHO细胞中rhIL-12表达系统的构建方法
CN102659927B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
CN103374068A (zh) 一种新的单克隆抗体的制备方法及用途
CN105112382B (zh) 一种基于家蚕-杆状病毒系统制备人髓过氧化物酶的方法
CN116496417B (zh) 含有膜型il7的融合蛋白及t细胞
CN104059128B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
CN113151126B (zh) 一种高表达n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用
EP2385131A1 (en) The use of a genetically modified cell line expressing functional asialoglycoprotein receptor in the production of highly sialylated glycoproteins
CN116574173A (zh) 蛋白稳定性增强的重组人源纤连蛋白突变体及其表达菌株
EP4370704A1 (en) Method of modulating the extent of galactosylation of proteins in mammalian producer cells
JP2023504648A (ja) Ｃｈｏ細胞由来のタンパク質分泌因子及びそれを含む発現ベクター

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information

Address after: Shanghai city 201203 libing road Pudong New Area Zhangjiang hi tech Park No. 399

Applicant after: Three country Kin Pharmaceutical (Shanghai) Limited by Share Ltd

Address before: Shanghai city 201203 libing road Pudong New Area Zhangjiang hi tech Park No. 399

Applicant before: Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant