JP2024519041A - 固形腫瘍における癌関連線維芽細胞を調節することによるｔ細胞媒介性免疫療法の効力の増強 - Google Patents

固形腫瘍における癌関連線維芽細胞を調節することによるｔ細胞媒介性免疫療法の効力の増強 Download PDF

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Abstract

本発明は、それを必要としている患者における固形腫瘍の処置の方法であって、（ｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する、ドナーが起源である操作型免疫細胞の有効量、及び（ｉｉ）前記患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置の有効量を前記患者へ投与するステップを含む方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、一般的には、癌の分野、特に、患者における固形腫瘍の処置のための細胞治療及び免疫療法に関する。
細胞免疫療法としても知られた養子細胞治療は、感染細胞又は悪性細胞などの病的細胞を排除するための私達の免疫系の細胞を用いる処置の一種である。これらのアプローチのいくつかは、私達自身の免疫細胞を直接、単離し、単純にそれらの数を増加させることを含み、一方、他のアプローチは、患者（自家性アプローチ）又はドナー（同種間アプローチ）由来の免疫細胞を、ブーストし及び／又はそれらを特定の標的組織へと再方向づけするように遺伝子操作することを含む。癌の場合、免疫細胞、とりわけ、免疫細胞溶解性リンパ球、ナチュラルキラー、及び抗原提示細胞／マクロファージは特に、癌細胞の表面上の抗原として知られたマーカーと結合する能力により、癌に対して強力である。細胞免疫療法は、この自然の能力を利用し、以下の異なる様式で活用することができる：腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）治療、操作型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）治療、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞治療。
キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現する免疫細胞は、通常、特定の腫瘍抗原を認識し、かつ（１つ又は複数の）上記腫瘍抗原を発現する癌細胞を殺滅するようにデザインされた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されている細胞である。一般的には、ＣＡＲを発現するＴ細胞（「ＣＡＲ－Ｔ細胞」）又はＣＡＲを発現するナチュラルキラー細胞（「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」）、又はＣＡＲを発現するマクロファージがある。
ＣＡＲは、単一又は複数の融合分子において１つ又は複数のシグナル伝達ドメインと会合しているターゲティング部分からなる合成受容体である。一般的に、ＣＡＲの結合部分は、可動性リンカーによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体又はリガンドドメインに基づいた結合部分もまた、成功裏に用いられている。第一世代ＣＡＲについてのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域又はＦｃ受容体ガンマ鎖に由来する。第一世代ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性を成功裏に再方向づけすることが示されているが、それらは、インビボで、長期の増殖及び抗腫瘍活性をもたらすことができなかった。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子に由来したシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ改変型Ｔ細胞の生存を増強しかつそれの増殖を増加させるために、単独で（第二世代）又は組み合わせて（第三世代）付加されている。ＣＡＲは、リンパ腫及び固形腫瘍を含む様々な悪性病変由来の腫瘍細胞の表面に発現した抗原に対してＴ細胞が再方向づけされるのを成功裏に可能にしている（Ｊｅｎａ、Ｄｏｔｔｉら ２０１０、Ｂｌｏｏｄ １１６（７）：１０３５～４４）。
エクスビボで作製された自家又は同種の抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞臨床試験の数の増加によって裏付けられているように、ウイルス感染及び癌を処置するための有望なストラテジーである。
今までのところ、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞のみが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている（例えば、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病の処置についてのＮｏｖａｒｔｉｓの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ チサゲンレクルユーセル（tisagenlecleucel）（キムリア（Kymriah）（商標））、マーカーとしてＣＤ１９を発現する成人患者における大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のある特定の型についてのＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ アキシカブタゲン シロルユーセル（axicabtagene ciloleucel）（イエスカルタ（Yescarta）（商標）））。同種間アプローチは、患者自身の免疫細胞に対する細胞のアロ反応性により、より困難である。最も進歩したプログラムは、Ｐｏｉｒｏｔら（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｅｄｉｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ “Ｏｆｆ－ｔｈｅ－Ｓｈｅｌｆ” Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ （２０１５） Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．７５（１８）：３８５３～３８６４）及びＱａｓｉｍ，Ｗ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆａｎｔ Ｂ－ＡＬＬ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＴＡＬＥＮ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｅｄ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ９（３７４））により報告されているように、細胞を患者へ投与する前に、細胞のアロ反応性を低下させるために特異的なレアカッティングエンドヌクレアーゼ、特に、ＴＡＬＥヌクレアーゼを用いることにより内因性Ｔ細胞受容体遺伝子を不活性化することからなる。一方、プライマリーＴ細胞におけるＴＣＲの不活性化は、例として国際公開第２０１４／１８４７４４号に記載されているように、β２ｍなどのＭＨＣコンポーネントの不活性化、及びまたさらに、チェックポイントインヒビタータンパク質をコードする遺伝子と組み合わせることができる。
Ｔ細胞媒介性抗腫瘍細胞傷害性は、白血病と固形腫瘍の両方についての有望な免疫療法的ストラテジーである。これらの中でも有名なのは、チェックポイントインヒビター（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１インヒビター、ＣＴＬＡ４インヒビター）、加えて、腫瘍抗原ターゲット化ＣＡＲ－Ｔ治療である。しかしながら、いくつかの因子が、固形腫瘍に対するこれらのストラテジーの効力を制限し、その因子には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の欠乏及び免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）が挙げられる。Ｓｔｅｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ．（２０２０）；１８０：２９７～３２６。たいていの固形腫瘍微小環境は、ＦＡＰなどの固有の表面タンパク質を発現する、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と呼ばれると活性化線維芽細胞の存在によって特徴づけられる（Ｋａｌｌｕｒｉ Ｒ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．（２０１６）；１６：５８２～９８）。ＣＡＦは、ＴＩＬを阻害し、免疫抑制を促進することができる（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．（２０１４）；２：１５４～６６）。
最近では、Ｃｈｏｉら（ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ＢｉＴＥｓ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｓｃａｐｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ （２０１９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３７：１０４９～５８）は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（engager）（ＢｉＴＥ）の発現によって、抗原逃避を回避するように自家ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作している。自家ＣＡＲ－Ｔ細胞により分泌されるこれらのトランスジェニックＢｉＴＥは、一方では、標的抗原ＣＤ１９又はＥＧＦＲｖＩＩＩと結合し、他方では、ＣＤ３抗原をターゲットすることによりＴＣＲと結合する。これらのＢｉＴＥは、患者の自家Ｔ細胞を、ＣＤ１９か又はＥＧＦＲｖＩＩＩかのいずれかが陽性である腫瘍細胞と引き合わせるのを助け、それにより、ＣＡＲ－Ｔ効率を最適化し、抗原逃避を制限する。しかしながら、このアプローチは、患者の免疫細胞が一般的に事前のリンパ球除去レジメンにより除去されかつ同種免疫細胞がＴＣＲ欠損（細胞表面のＣＤ３を欠く）である同種処置設定においては適用することができなかった。
癌の処置、特に、固形腫瘍により特徴づけられる癌の処置は、ヘルスケアにおいて依然として大きな課題のままである。必要とされることは、患者において固形腫瘍に対して有効である新しい組成物及び処置である。より特に、いかなる同種間制限もなく、全ての患者において固形腫瘍を処置することに有用である、新しい「普遍的な」組成物及び処置が必要とされ、なぜなら、一般的に、患者は、上記組成物が調製されているところの細胞のドナーではないからである。
この背景情報は、情報のみを目的として提供される。前述の情報のいずれもが本発明に対する先行技術を構成することの承認を必ずしも意図するものでもなく、そのように解釈されるべきものでもない。
実施形態の前述の一般的な説明と以下の詳細な説明のどちらも例示的であり、したがって、実施形態の範囲を制限しないことは、理解されるべきである。
本発明は、そのコンポーネントが多くの非血縁患者において用いることができる、固形癌の「普遍的な」処置に特に適している。
一般的な態様において、本発明は、それを必要としている患者において固形腫瘍を処置する方法であって、（ｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する、ドナー又は細胞株が起源である操作型免疫細胞の有効量、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置の有効量を患者へ投与するステップを含む方法を提供する。
上記操作型免疫細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。
上記免疫細胞がＴ細胞である状況に適用される本発明の様々な態様が本明細書で詳述されているが、これらの様々な態様は、ＮＫ細胞に同様に適用され、したがって、本出願に含まれる。
特定の態様において、本発明は、それを必要としている患者において固形腫瘍を処置する方法であって、（ｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する、不活性化ＴＣＲを含む操作型Ｔ細胞又は操作型ＮＫ細胞の有効量、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置の有効量を患者へ投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞であって、
ＣＡＲが
（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジアミノ酸配列、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインアミノ酸配列、並びに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインからのアミノ酸配列を含む細胞質ドメイン
を含み；並びに
Ｔ細胞が、Ｔ細胞において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現をＴＣＲの不活性化により抑制又は抑圧するように、及び任意選択で、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍ又はＨＬＡの発現を抑制又は抑圧するように、及び任意選択で、ＣＤ５２の発現を抑制又は抑圧するように、遺伝子改変されている、操作型Ｔ細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型ＮＫ細胞であって、
ＣＡＲが
（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジアミノ酸配列、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインアミノ酸配列、並びに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインからのアミノ酸配列を含む細胞質ドメイン
を含み；並びに
任意選択で、ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞において、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍ又はＨＬＡの発現を抑制又は抑圧するように、及び任意選択で、ＣＤ５２の発現を抑制又は抑圧するように、遺伝子改変されている、操作型ＮＫ細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、（ｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する、不活性化ＴＣＲを含む操作型Ｔ細胞又は操作型ＮＫ細胞、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む医薬組成物であって、コンポーネント（ｉ）と（ｉｉ）の両方が別々の投与のために製剤化されている、医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、それを必要としている患者における固形腫瘍の処置での使用のための、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する、不活性化ＴＣＲを含む操作型Ｔ細胞又は操作型ＮＫ細胞を含む組成物であって、上記操作型細胞が、上記患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置と併用して投与される、組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、患者における固形腫瘍の処置での使用のための、患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む組成物であって、上記免疫療法処置が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する、不活性化ＴＣＲを含む操作型Ｔ細胞又は操作型ＮＫ細胞と併用して投与される、組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、抗ＦＡＰ－ＣＡＲは、レンチウイルス組込みを通してか、又はＴＲＡＣ、β２Ｍ、又はＣＤ５２などの活性遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介性ｃＤＮＡ挿入を通してかのいずれかで、操作型ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞において構成的に発現させる。追加として、いくつかの実施形態において、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座は、例として、同種設定において、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を阻害しかつＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞持続を増加させるために、ＴＡＬＥヌクレアーゼにより破壊することができる。
いくつかの実施形態において、抗ＦＡＰ－ＣＡＲ処置は、抗ＰＤ－１阻害剤、抗ＰＤ－Ｌ１阻害剤、抗ＣＴＬＡ４阻害剤、又は抗ＬＡＧ－３阻害剤を用いることにより誘導することができるチェックポイント遮断と併用することができる。いくつかの実施形態において、抗ＦＡＰ－ＣＡＲ処置は、腫瘍ターゲティング二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの免疫療法と併用することができる。いくつかの実施形態において、上記腫瘍抗原ターゲティング免疫細胞エンゲージャーは、ＭＵＣ１、メゾテリン、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、又はＴｒｏｐ２に対して方向づけることができる。
別の態様において、本発明は、以下のステップを含む、操作型Ｔ細胞の集団を産生する方法を提供する：
（ｉ）Ｔ細胞受容体遺伝子の発現が低下し若しくは抑制されている、ドナーが起源である遺伝子操作型Ｔ細胞の集団を用意するステップ；又はドナーが起源であるＴ細胞の集団を用意し、上記Ｔ細胞においてＴ細胞受容体遺伝子の発現を低下させ若しくは抑制するステップ；
（ｉｉ）Ｔ細胞の集団において、（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン、並びに（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ；並びに
（ｉｉｉ）任意選択で、細胞表面におけるＴＣＲ発現が低下し又は抑制されているＴ細胞を単離するステップ。
別の態様において、本発明は、以下のステップを含む操作型ＮＫ細胞の集団を産生する方法を提供する：
（ｉ）ドナー又は細胞株が起源であるＮＫ細胞の集団を用意するステップ；
（ｉｉ）ＮＫ細胞の集団において、（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン、並びに（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的な例は、本発明の具体的な実施形態を示すが、本発明の精神及び範囲内での様々な変化及び改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるだろうゆえに、例証としてのみ与えられていると理解されるべきである。
当業者は、下に記載された図面が例証のみを目的とすることは理解しているだろう。図面は、決して、本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
Ａ．本発明の一態様による、冷たい腫瘍を熱い腫瘍へ転換させる概略図である。抗ＦＡＰ－ＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞）により「冷たい」腫瘍からＣＡＦを排除することが、腫瘍を「熱く」かつＴ細胞により排除されやすいものへ転換させるＴ細胞浸潤を可能にする。Ｂ．以下の処置による細胞挙動の概略図である：リンパ球除去は、内因性Ｔ細胞（黒色曲線）の一時的排除をもたらす；抗ＦＡＰ ＣＡＲ免疫細胞（灰色点線曲線）の注射は、ＣＡＦ（黒色点線曲線）を排除して、腫瘍における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）浸潤及びＴ細胞の活性化を増強し（灰色曲線）、免疫療法処置（例えば、抗ＰＤ１処置）の効力を増強する。 Ａ．ＴＣＲα／β及びＭＨＣＩ発現のノックアウト、並びにＦＡＰ－ＣＡＲ発現を有するＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の概略図である。 Ｂ．ｍｏｃｋトランスフェクトＴ細胞及びＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＦＡＰ－ＣＡＲの発現、ＴＣＲα／β及びＭＨＣＩ表面発現は矢印によって示されている。 Ａ．ＴＲＡＣ座にターゲットされたＦＡＰ－ＣＡＲの概略図である。Ｂ．ｍｏｃｋトランスフェクトＴ細胞及び実施例２で得られたＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＦＡＰ－ＣＡＲ及びＴＣＲα／β発現は矢印によって示されている。 Ａ．ＣＡＦに対する操作型Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の特異的細胞溶解活性を評価するための概略図である。Ｂ．ｍｏｃｋトランスフェクト細胞又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞とのインキュベーション後のＣＡＦ生存率／死亡率のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＣＡＦ溶解のパーセンテージは四角形で示されている。異なるＣＡＦ：Ｔ細胞比における、３つの異なるドナー由来のｍｏｃｋ処置又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置によるＣＡＦ生存の定量化を表すグラフである。 Ａ．ＣＡＦに対する操作型Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の特異的細胞溶解活性を評価するための概略図である。Ｂ．ｍｏｃｋトランスフェクト細胞又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞とのインキュベーション後のＣＡＦ生存率／死亡率のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＣＡＦ溶解のパーセンテージは四角形で示されている。異なるＣＡＦ：Ｔ細胞比における、３つの異なるドナー由来のｍｏｃｋ処置又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置によるＣＡＦ生存の定量化を表すグラフである。 Ａ．ＣＡＦ細胞スフェロイドがｍｏｃｋ又は示されたＣＡＲＴ細胞で処置されたＨＣＣ７０－ＮＬ－ＧＦＰのイメージを示す図である。緑色（明るい）細胞はＨＣＣ７０－ＮＬ－ＧＦＰ腫瘍細胞である。 Ｂ．示されたＣＡＲ－Ｔ細胞処置後の腫瘍生存の定量化を表すグラフである。示されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、２つの異なるドナーから作製された。ＭＥＳＯ＝Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ、ＦＡＰ＝Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ。 Ａ．マウスＴ細胞のＦＡＰ－ＣＡＲでの形質導入効率を示す図である。Ｂ．以下の処置の概略図である：０日目（Ｄ０）に、４－Ｔ１マウス乳癌細胞が免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて正所性に移植された。９日目（Ｄ９）、マウスは、マウスＣＡＲＴ－ＦＡＰ若しくは抗ＰＤ１（α－ｍＰＤ－１）で処置され、又は処置されなかった（Ｍｏｃｋ）。１７日目（Ｄ１７）、マウスは、分析のために安楽死させられたか、又は抗ＰＤ１抗体（α－ｍＰＤ－１）でさらに処置されたかのいずれかであった。Ｃ．Ｄ１７に腫瘍において検出された浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数を示す図である。Ｄ．Ｄ１７に腫瘍において浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞により産生されたＩＦＮγレベルを示す図である。Ｅ．処置されたマウスの異なるコホートにおける時間経過による腫瘍体積を示す図である。 Ａ．マウスＴ細胞のＦＡＰ－ＣＡＲでの形質導入効率を示す図である。Ｂ．以下の処置の概略図である：０日目（Ｄ０）に、４－Ｔ１マウス乳癌細胞が免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおいて正所性に移植された。９日目（Ｄ９）、マウスは、マウスＣＡＲＴ－ＦＡＰ若しくは抗ＰＤ１（α－ｍＰＤ－１）で処置され、又は処置されなかった（Ｍｏｃｋ）。１７日目（Ｄ１７）、マウスは、分析のために安楽死させられたか、又は抗ＰＤ１抗体（α－ｍＰＤ－１）でさらに処置されたかのいずれかであった。Ｃ．Ｄ１７に腫瘍において検出された浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数を示す図である。Ｄ．Ｄ１７に腫瘍において浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞により産生されたＩＦＮγレベルを示す図である。Ｅ．処置されたマウスの異なるコホートにおける時間経過による腫瘍体積を示す図である。 ヒトトリプルネガティブ乳房腫瘍由来ＣＡＦと混合されたＨＣＣ７０－ＮａｎｏＬｕｃ－ＧＦＰを移植されたＮＳＧマウスにおいて抗ＰＤ－１阻害剤と併用されたＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯへのＵＣＡＲＴ－ＦＡＰの効果を測定するための実験デザインの概略図である。 腫瘍生着マウスにおけるＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ、ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ、及び抗ＰＤ－１阻害剤の併用の抗腫瘍活性を示す図である。腫瘍生着後の異なる日数における、Ａ．腫瘍重量（ｇ）、Ｂ．腫瘍体積（ｍｍ３）。Ｃ．生存曲線。 腫瘍生着マウスにおけるＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ、ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ、及び抗ＰＤ－１阻害剤の併用の抗腫瘍活性を示す図である。腫瘍生着後の異なる日数における、Ａ．腫瘍重量（ｇ）、Ｂ．腫瘍体積（ｍｍ３）。Ｃ．生存曲線。
チェックポイント遮断及び／又は免疫細胞エンゲージャーの投与などの免疫療法の抗腫瘍活性を増幅するために腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の空間的特性の利用を可能にする組成物及び方法が本明細書に提供される。より具体的には、いくつかの態様において、本発明は、固形腫瘍微小環境を炎症性環境へとリプログラムし、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）レベルを促進するための併用処置様式として、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）ターゲティング抗ＦＡＰ ＣＡＲの関与を提供する。その後、このＴＩＬリッチな免疫適格性微小環境は、チェックポイント遮断及び／又は免疫細胞エンゲージャー治療などの免疫療法の効力を促進することができる。
この明細書を解釈することを目的として、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語はまた複数形を含み、逆もまた同様である。下記に示された任意の定義が、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書を含む任意の他の文書におけるその語の用法と矛盾する場合、正反対の意味が明らかに意図される（例えば、その用語がもともと用いられている文書において）ものでない限り、下記に示された定義が、この明細書及びそれの関連した特許請求の範囲を解釈することを目的として、常に優先されるものとする。「又は」の使用は、他に記述がない限り、「及び／又は」を意味する。本明細書及び特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、文脈が明らかに他に指図しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「１つの（ａ）細胞」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、交換可能であり、限定することを意図されない。さらに、１つ又は複数の実施形態の説明が用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いる場合、いくつかの特定の場合において、１つ又は複数の実施形態は、代替として、言語「から本質的になる」及び／又は「からなる」を用いて記載することができることを当業者は理解しているだろう。
本明細書で用いられる場合、用語「約」は、それが用いられている数の数値のプラス又はマイナス１０％を意味する。
本明細書に記載された方法及び材料と類似した又は等価の全ての方法及び材料が、本発明の実践又は試験に用いることができ、適切な方法及び材料が本明細書に記載されている。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、全体が参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び例は、例証となるのみであり、他に規定がない限り、限定することを意図されない。
本発明の実践は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の通常の技術を利用する。そのような技術は、文献において十分、説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ及びＭ．Ｓｉｍｏｎ編集長、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、特に、１５４巻及び１５５巻（Ｗｕら編）並びに１８５巻、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ～ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；並びにＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照されたい。
本明細書で明確に他に定義されない限り、用いられる全ての技術的及び科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学、免疫学、癌、及び分子生物学の分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ出版、２０００（ＩＳＢＮ ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）；Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版、１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版、１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）に見出され得る。
本明細書で用いられる場合、「レシピエント」は、移植片、例えば、操作型Ｔ細胞の集団を含有する移植片を受ける患者である。レシピエントへ投与される移植細胞は、例えば、自家、同系、又は同種の細胞であり得る。
本明細書で用いられる場合、「ドナー」は、１つ又は複数の細胞がその細胞又はその子孫のレシピエントへの投与前に単離される、ヒト又は動物である。１つ又は複数の細胞は、例えば、その細胞又はその子孫のレシピエントへの投与前に、本発明の方法に従って操作されるか、増殖されるか、濃縮されるか、又は維持される免疫細胞又は造血幹細胞の集団であり得る。本明細書で企図される場合、「ドナー」は、処置されるべき患者ではない。
細胞の関連における「増殖」は、同一でも同一でなくてもよい、最初の細胞集団由来の（１つ又は複数の）特徴的な細胞型の数の増加を指す。増殖のために用いられる最初の細胞は、増殖から産生された細胞と同じではない可能性がある。
「細胞集団」は、生物学的源、例えば、血液産物又は組織から単離され、かつ１個より多い細胞に由来した、真核生物の哺乳動物の、好ましくはヒトの、細胞を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤、例えば、製薬工業で一般的に用いられる担体及び／又は賦形剤と組み合わせた活性物質を指す。句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは混乱なしにヒト及び動物の組織と接触しての使用に適し、合理的なベネフィット／リスク比に相応である、それらの化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すように本明細書で用いられる。
本明細書で用いられる場合、用語「投与すること」は、本明細書に開示されているような化合物、細胞、又は細胞集団の対象への、所望の部位におけるその作用物質の少なくとも部分的な送達を生じる方法又は経路による、配置を指す。本明細書に開示された化合物又は細胞を含む医薬組成物は、対象において効果的な処置を生じる任意の適切な経路により投与することができる。
本明細書で用いられる場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により産生された断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成された断片などの、ヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、若しくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性型）、又は両方の組合せであるモノマーで構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾には、例えば、１つ若しくは複数のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基での置き換えが挙げられ、又は糖は、エーテル若しくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体は、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体的及び電子的に類似した構造で置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式置換体が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような連結の類似体により連結され得る。核酸は、一本鎖か又は二本鎖かのいずれかであり得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に用いられる。その用語はまた、１個又は複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
本明細書で用いられる場合、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」、及びその他同種類のものは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に防止するという観点から予防的であり得、並びに／又は疾患及び／若しくはその疾患に起因し得る有害効果についての部分的若しくは完全な治癒という観点から治療的であり得る。本明細書で用いられる場合の「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し、それには、（ａ）疾患の素因をもつ可能性があるが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害する、すなわち、それの発生を停止すること；及び（ｃ）疾患を軽減する、例えば、疾患の退行を引き起こして、例えば、疾患の症状を完全に又は部分的に除去することが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「対象」又は「患者」は、非ヒト霊長類及びヒトを含む動物界の全メンバーを含む。
「有効量」又は「治療的有効量」は、対象（例えば、ヒト）へ投与された時、疾患を処置するのを助けるのに十分である、本明細書に記載された組成物の量を指す。「治療的有効量」を構成する組成物の量は、細胞調製物、状態及びそれの重症度、投与の様式、及び処置されるべき対象の年齢によって異なるが、当業者により、彼自身の知識及びこの開示を鑑みて、日常的に決定することができる。単独で投与された個々の活性成分又は組成物に言及する場合、治療的有効量は、単独でのその成分又は組成物を指す。組合せに言及する場合、治療的有効量は、同時に（concurrently）投与されるか、同時に（simultaneously）投与されるか、又は逐次的に投与されるかに関わらず、治療効果を生じる活性成分、組成物、又は両方の組み合わされた量を指す。
「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送する能力がある核酸分子を意味する。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡベクター、又は染色体の、非染色体の、半合成若しくは合成の核酸からなり得る直鎖状若しくは環状ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子が挙げられるが、それらに限定されない。好ましいベクターは、自律複製（エピソームベクター）及び／又はそれらが連結している核酸の発現（発現ベクター）の能力があるベクターである。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市販されている。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、及びカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳類Ｃ型、Ｂ型、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）が挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「座」は、（例えば、遺伝子の）ＤＮＡ配列のゲノムへの特定の物理的位置である。用語「座」は、染色体又は感染物質のゲノム配列上のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的配列の特定の物理的位置を指し得る。そのような座は、本発明による、配列特異的エンドヌクレアーゼにより認識及び／又は切断される標的配列を含み得る。本発明の目的の座は、細胞の遺伝物質の本体（すなわち、染色体）において存在する核酸配列だけでなく、上記遺伝物質の本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部分、例えば、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、又は非限定的例としてミトコンドリアなどのオルガネラにおいて存在する核酸も認定できると理解される。
用語「切断」は、ポリヌクレオチドの共有結合性バックボーンの破壊を指す。切断は、様々な方法により開始することができ、その方法には、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解が挙げられるが、それらに限定されない。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ ＲＮＡハイブリッド切断は、平滑末端か又はねじれ型末端の生成を生じ得る。
「同一性」は、２つの核酸分子又はポリペプチドの間での配列同一性を指す。同一性は、比較のためにアライメントされ得る各配列における位置を比較することにより決定することができる。比較された配列における位置が同じ塩基によって占有されている場合、その分子は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度が、核酸配列によって共有される位置における同一の又は一致するヌクレオチドの数の関数である。様々なアライメントアルゴリズム及び／又はプログラムが、２つの配列間での同一性を計算するために用いられ得、そのアルゴリズム及び／又はプログラムには、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として利用できる、ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴが挙げられ、それらは、例えばデフォルト設定で、用いることができる。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドと少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一性を有しかつ好ましくは、実質的に同じ機能を示すポリペプチド、加えて、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。
「線維芽細胞活性化タンパク質」（「ＦＡＰ」）はまた、一般的には、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又は線維芽細胞活性化タンパク質アルファとも呼ばれる。
一態様において、本発明は、それを必要としている患者において固形腫瘍を処置する方法であって、（ｉ）不活性化ＴＣＲを含みかつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞の有効量、及び（ｉｉ）上記患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置の有効量を患者へ投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞であって、
ＣＡＲが
（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジアミノ酸配列、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインアミノ酸配列、並びに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインからのアミノ酸配列を含む細胞質ドメイン
を含み；並びに
Ｔ細胞が、Ｔ細胞において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現をＴＣＲの不活性化により抑制又は抑圧するように、及び任意選択で、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍ又はＨＬＡの発現を抑制又は抑圧するように、及び任意選択で、ＣＤ５２の発現を抑制又は抑圧するように、遺伝子改変されている、操作型Ｔ細胞を提供する。
一実施形態において、上記操作型Ｔ細胞は、不活性化されたＣＤ５２か又は不活性化されたβ２Ｍ遺伝子かのいずれかを含む。
別の態様において、本発明は、（ｉ）不活性化ＴＣＲを含みかつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ）、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む医薬組成物であって、コンポーネント（ｉ）と（ｉｉ）の両方が別々の投与のために製剤化されている、医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、それを必要としている患者において固形腫瘍の処置での使用のための、不活性化ＴＣＲを含みかつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞を含む組成物であって、上記操作型Ｔ細胞が、上記患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置と併用して投与される、組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、患者における固形腫瘍の処置での使用のための、患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む組成物であって、上記免疫療法処置が、不活性化ＴＣＲを含みかつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞と併用して投与される、組成物を提供する。
免疫療法処置及び操作型Ｔ細胞における使用のための組成物は、別々の投与のために製剤化することができ、同時に又は逐次的に投与することができる。いくつかの実施形態において、免疫療法処置における使用のための組成物は、操作型Ｔ細胞を含む組成物の投与後に投与され、例として、免疫療法処置は、操作型Ｔ細胞を含む組成物の投与後１週間目又は２週間目に、例えば、操作型Ｔ細胞を含む組成物の投与後、約１週間目又は２週間目から約３～１０カ月目の間、２週間目から８カ月目の間、又は２週間目から４カ月目の間に投与される。
他の特定の実施形態において、本明細書で記載された医薬組成物は、不活性化ＴＣＲを含み、かつ本明細書で定義される、癌に関連した抗原、好ましくは固形腫瘍抗原、例えば、メゾテリン、Ｔｒｏｐ２、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦに対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞をさらに含む。これらの実施形態によれば、このさらなるコンポーネントは、その他の２つのコンポーネント（ｉ）及び（ｉｉ）とは別個の投与のために製剤化される。
本明細書における操作型細胞及び方法は、自家処置の一部又は同種処置の一部であり得る。自家とは、患者を処置するために用いられる細胞が、上記患者が起源であることを意味する。同種とは、患者を処置するために用いられる細胞又は細胞集団が、上記患者が起源ではなく、ドナー又は細胞株が起源であることを意味する。
いくつかの実施形態において、操作型細胞は、免疫抑制処置を受ける患者に投与される。一実施形態において、投与される細胞は、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して抵抗性になっている。いくつかの実施形態において、免疫抑制処置は、患者内での操作型Ｔ細胞の選択及び増殖を助ける。
細胞の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、植込み、又は移植による様式を含む、任意の便利な様式で行われ得る。本明細書に記載された組成物は、患者へ、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内若しくはリンパ管内注射により、又は腹腔内に、投与され得る。一実施形態において、細胞組成物は、それらの所望の部位作用へ移動する能力がある場合、静脈内注射により投与される。
個々のニーズは様々であるが、特定の疾患又は状態についての所定の細胞型の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の能力の範囲内である。有効量は、治療的又は予防的ベネフィットを提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、及び体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、並びに望まれる効果の性質に依存する。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞集団の投与は、体重１ｋｇあたり約１０４～１０９細胞の投与を含む。いくつかの実施形態において、約１０５～１０６細胞／ｋｇ体重が投与される。それらの範囲内の細胞数の全ての整数値が企図される。
細胞は、１つ又は複数の用量で投与することができる。別の実施形態において、細胞の有効量が単一用量として投与される。別の実施形態において、細胞の有効量が、ある期間にわたって１つより多い用量として投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞を投与することは、宿主骨髄幹細胞を除去しかつ拒絶を防止するために骨髄破壊的及び／又は免疫抑制レジメンで患者を処置することを含み得る。いくつかの実施形態において、患者は、化学療法及び／又は放射線療法を投与される。いくつかの実施形態において、患者は、低下用量の化学療法レジメンを投与される。いくつかの実施形態において、標準用量の２５％でのブスルファンを用いた低下用量の化学療法レジメンは、コンディショニング関連毒性を低下させながら、改変型細胞の有意な生着を達成するのに十分であり得る（Ａｉｕｔｉ Ａ．ら（２０１３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３；３４１（６１４８））。より強い化学療法レジメンは、内因性ＨＳＣについての除去作用物質としてのブスルファンとフルダラビンの両方の投与に基づき得る。いくつかの実施形態において、ブスルファン及びフルダラビンの用量は、標準同種移植に用いられる用量のおよそ５０％及び３０％である。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去治療後に、投与される。いくつかの実施形態において、患者は、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、又はＯＫＴ３若しくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を投与される。
ある特定の実施形態において、操作型Ｔ細胞は、免疫抑制剤を含む併用治療として対象に投与される。例示的な免疫抑制剤には、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン、ミコフェノラート、抗胸腺細胞グロブリン、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗剤、移植後シクロホスファミド、又はそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、対象は、ＧＶＨＤに対する予防としてシロリムス又はタクロリムスのみで前処置される。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫抑制剤の前に対象へ投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫抑制剤の後に対象へ投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫抑制剤と同時に対象へ投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫抑制剤なしで対象へ投与される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変型細胞を受ける患者は、免疫抑制剤を６カ月未満、５カ月未満、４カ月未満、３カ月未満、２カ月未満、１カ月未満、３週間未満、２週間未満、又は１週間未満の間、受ける。
なおさらなる実施形態において、本明細書で記載されている、それを必要としている患者において固形腫瘍を処置する方法であって、（ｉ）ＦＡＰ－ＣＡＲを細胞表面に発現する操作型ＴＣＲネガティブ免疫細胞の有効量、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置の有効量を患者へ投与するステップを含む方法は、（ｉｉｉ）メゾテリン、Ｔｒｏｐ２、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦなどの癌に関連した抗原に結合するＣＡＲを細胞表面に発現する操作型ＴＣＲネガティブ免疫細胞の有効量を投与するステップをさらに含み得る。
特定のさらなる実施形態において、それを必要としている患者において固形腫瘍を処置する方法は、（ｉ）ＦＡＰ－ＣＡＲを細胞表面に発現する操作型ＴＣＲネガティブ免疫細胞の有効量、並びに（ｉｉ）免疫チェックポイントタンパク質及び／又はその受容体に対して方向づけられた抗体である免疫チェックポイントアンタゴニストの有効量であって、免疫チェックポイントタンパク質又はその受容体が、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＧＩＴＲ、及びＢＴＬＡからなる群から選択される、免疫チェックポイントアンタゴニストの有効量、並びに（ｉｉｉ）メゾテリン、Ｔｒｏｐ２、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦなどの癌に関連した抗原に結合するＣＡＲを細胞表面に発現する操作型ＴＣＲネガティブ免疫細胞の有効量を患者へ投与するステップを含む。
操作型抗ＦＡＰ－ＣＡＲ Ｔ細胞
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＦＡＰ－ＣＡＲ）を発現する操作型Ｔ細胞は、特に制限はない。
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、一般的には、単一の融合分子において１つ又は複数のシグナル伝達ドメインに会合しているターゲティング部分を含む合成受容体を意味する。本明細書で定義される場合、用語「キメラ抗原受容体」は、単鎖ＣＡＲ、加えて多重鎖ＣＡＲを網羅する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの結合部分は、可動性リンカーによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含む。受容体又はリガンドのドメインに基づいた結合部分もまた、成功裏に用いられている。第一世代ＣＡＲについてのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域又はＦｃ受容体ガンマ鎖に由来する。第一世代ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性を成功裏に再方向づけすることが示されている。しかしながら、第一世代ＣＡＲは、インビボで、長期の増殖及び抗腫瘍活性をもたらすことができなかった。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子に由来のシグナル伝達ドメインが、ＣＡＲ改変型Ｔ細胞の生存を増強しかつそれの増殖を増加させるために、単独で（第二世代）又は組み合わせて（第三世代）付加されている。ＣＡＲは、必ずしも単鎖ポリペプチドのみとは限らず、多重鎖ＣＡＲもまた可能である。例として国際公開第２０１４／０３９５２３号に記載されているような、多重鎖ＣＡＲ構造によれば、シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインは、異なるポリペプチド鎖に位置する。そのような多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の高親和性ＩｇＥ結合ドメインをｓｃＦｖなどの細胞外リガンド結合ドメインによって置き換えることにより、ＦｃεＲＩに由来し得、一方、ＦｃεＲＩベータ鎖及び／又はガンマ鎖のＮ末端及び／又はＣ末端テールを、それぞれ、シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインと融合させる。細胞外リガンド結合ドメインは、Ｔ細胞特異性を細胞標的へと再方向づけするという役割を有し、一方、シグナル伝達ドメインは免疫細胞応答を活性化する。
本発明のＣＡＲ、及び本明細書での方法において有用なＣＡＲは、特定のＣＡＲ構造に限定されないが、免疫細胞を操作するために用いることができる核酸は一般的に、以下を含むＣＡＲをコードする：疾患状態に関連した抗原（すなわち、癌であり、その抗原はＦＡＰである）と結合する細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びに刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン。一般的に、細胞外抗原結合ドメインは、リンカーを介して接続された、特定の抗原（例えば、腫瘍抗原）と結合する抗体の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含むｓｃＦｖである。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又は４－１ＢＢ膜貫通ドメインであり得る。刺激ドメインは、例えば、４－１ＢＢ刺激ドメイン又はＣＤ２８刺激ドメインであり得る。一次シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインであり得る。
Figure 2024519041000001
ＣＡＲは、ＦＡＰを認識する細胞外リガンド（又は抗原）結合ドメインをコードするアミノ酸配列を含む。本明細書で用いられる場合、用語「細胞外抗原結合ドメイン」は一般的に、ＦＡＰなどの特定の抗原に結合する能力があるオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、そのドメインは、リガンドなどの細胞表面分子と相互作用する能力がある。例えば、いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして働く抗原を認識するように選択され得る。特定の場合では、上記細胞外抗原結合ドメインは、可動性リンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変断片（ＶＬ）及び重鎖可変断片（ＶＨ）を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。本明細書に記載された操作型免疫細胞の細胞表面に発現したＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的抗原と結合し、かつ、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの機能断片に由来する、任意のドメインであり得る。
Figure 2024519041000002
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号７を含むＶＨ領域及び配列番号８を含むＶＬ領域を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号７を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、配列番号７及び配列番号８に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号７に含まれるＨ－ＣＤＲは、配列番号１～配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号８に含まれるＬ－ＣＤＲは、配列番号４～配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号７及び８に含まれるＣＤＲを含み、かつ配列番号７を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号８を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する、細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１８を含むＶＨ領域及び配列番号１９を含むＶＬ領域を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１８を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１９を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、配列番号１８及び配列番号１９に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１８に含まれるＨ－ＣＤＲは、配列番号１２～配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１９に含まれるＬ－ＣＤＲは、配列番号１５～配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１８及び１９に含まれるＣＤＲを含み、かつ配列番号１８を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１９を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する、細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２９を含むＶＨ領域及び配列番号３０を含むＶＬ領域を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２９を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号３０を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、配列番号２９及び配列番号３０に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２９に含まれるＣＤＲは、配列番号２３～配列番号２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３０に含まれるＣＤＲは、配列番号２６～配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２９及び３０に含まれるＣＤＲを含み、かつ配列番号２９を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号３０を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する、細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号４０を含むＶＨ領域及び配列番号４１を含むＶＬ領域を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号４０を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号４１を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、配列番号４０及び配列番号４１に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号４０に含まれるＣＤＲは、配列番号３４～配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号４１に含まれるＣＤＲは、配列番号３７～配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号４０及び４１に含まれるＣＤＲを含み、かつ配列番号４０を含むＶＨ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号４１を含むＶＬ領域と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する、細胞外結合ドメインを含む。
Figure 2024519041000003
いくつかの実施形態において、ＶＨ領域を含むアミノ酸配列及びＶＬ領域を含むアミノ酸配列は、１個又は複数のリンカーアミノ酸残基によって分離されている。リンカーを構成するアミノ酸の数は、必ずしも制限があるわけではないが、いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも５アミノ酸長、好ましくは、少なくとも約１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは、約１０～２５アミノ酸長の間である。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、配列番号４５～４６のいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、及び配列番号４２のいずれか１つから選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、及び配列番号４２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態において、モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ領域及びＶＬ領域を含む細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＦＡＰを認識する細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインを分離するヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、以下を含む：
（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン、並びに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲはＣＤ８αヒンジを含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４３、配列番号４４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１０、配列番号２１、配列番号３２、配列番号４３のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載された抗ＦＡＰ－ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、及び配列番号１３２のいずれか１つから選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で記載された抗ＦＡＰ－ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、又は配列番号１３２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有する核酸配列を含み、それぞれ、配列番号１０、配列番号２１、配列番号３２、及び配列番号４３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の抗ＦＡＰ－ＣＡＲをコードする。
いくつかの実施形態において、同種設定での使用のための本発明によるＣＡＲ－Ｔ細胞は、より速いＴ細胞活性化を引き起こすためにＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む、本明細書で記載されているような抗ＦＡＰ－ＣＡＲを与えられている。そのようなＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常、より急速に疲弊するようになるが、たとえそのＣＡＲ－Ｔ細胞が持続的でないにしても、ＣＤ２８誘導性ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いることは有利であり得、その理由は、本発明の主な目標が、患者において特異的な免疫応答を誘発している免疫療法の第二波に対して腫瘍を浸透可能にすることであるからである。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１１、配列番号２２、配列番号３３、配列番号４４のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明による操作型細胞は、本明細書で記載されているようなＦＡＰ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターの、上記細胞のゲノムにおける組込みを含むプロセスによって作製される。
いくつかの実施形態において、線維芽細胞活性化タンパク質に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＦＡＰ－ＣＡＲ）を発現する操作型細胞は、（ａ）ＦＡＰに対して特異的なキメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド（例えば、上記のいずれか１つにおいてのような）を遺伝子へ挿入することによって遺伝子を活性化することにより、少なくとも１つの遺伝子を編集するステップを含むプロセスによって作製される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、上記Ｔ細胞のゲノムにおける内因性ＴＲＡＣ、β２ｍ、又はＣＤ５２へ組み込まれる。
したがって、一実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、操作型Ｔ細胞集団を産生する方法を提供する：
（ｉ）ドナーが起源であるＴ細胞の集団を用意するステップ；
（ｉｉ）（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、並びに（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを上記Ｔ細胞のゲノムのＴＲＡＣ座へ挿入することによりＴＣＲ遺伝子を不活性化するステップ；
（ｉｉｉ）任意選択で、細胞表面にＴＣＲを発現しないＴ細胞を単離するステップ。
別の実施形態において、Ｔ細胞は、それのＴＣＲ遺伝子が不活性化されるように遺伝子操作され、ＣＡＲは、Ｔ細胞のゲノムにおいてＴＲＡＣ座の外側へ組み込まれる。
一実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、操作型Ｔ細胞集団を産生する方法を提供する：
（ｉ）ドナーが起源であるＴ細胞の集団を用意するステップ；
（ｉｉ）ＴＣＲの少なくとも１つのコンポーネントを、上記ＴＣＲコンポーネントをターゲットするＴＡＬＥヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼにより不活性化するステップ；
（ｉｉｉ）（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、並びに（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドをＴ細胞集団において発現させるステップ；
（ｉｖ）任意選択で、細胞表面にＴＣＲを発現しないＴ細胞を単離するステップ。
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、操作型Ｔ細胞集団を産生する方法を提供する：
（ｉ）Ｔ細胞受容体遺伝子の発現が不活性化されている、ドナーが起源である遺伝子操作型Ｔ細胞の集団を用意するステップ；
（ｉｉ）（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、並びに（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドをＴ細胞集団において発現させるステップ；
（ｉｉｉ）任意選択で、細胞表面にＴＣＲを発現しないＴ細胞を単離するステップ。
操作型ＣＡＲ Ｔ細胞についての源は特に制限はない。Ｔ細胞は一種の「免疫細胞」であり、「免疫細胞」とは、自然免疫及び／又は適応免疫応答の開始及び／又は実行に機能的に関与する造血系起源の細胞、例えば、典型的には、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、又はＣＤ４陽性細胞を意味する。免疫細胞には、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、Ｂ細胞、又は炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球、ガンマ－デルタＴ細胞、及びナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）からなる群から選択されるＴ細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞の源は、プライマリー細胞であり、「プライマリー細胞」（複数可）とは、生きている組織（例えば、生検材料）から直接的に採取され、かつ限られた量の時間の間のインビトロでの成長として確立された細胞を意図し、それらが限られた数の集団倍加を起こすことができることを意味する。プライマリー細胞は、持続的腫瘍原性又は人工的に不死化された細胞株とは対立する。そのような細胞株の非限定的例は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２－ＯＳ細胞；ＮＩＨ ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ－Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ－５６２細胞；Ｕ－９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＣＴ－１１６細胞；Ｈｕ－ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；及びＭｏｌｔ ４細胞である。
プライマリー免疫細胞は、いくつかの非限定的源から得ることができ、その源には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍浸潤リンパ球などの腫瘍が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記免疫細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、又は感染症と診断された患者に由来し得る。別の実施形態において、上記細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６陽性細胞を含むなどの異なる表現型特性を提示する免疫細胞の混合集団の一部である。プライマリー免疫細胞は、ドナー又は患者から当技術分野において知られた様々な方法を通して、例としては、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ．ら（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ－ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｗｒｉｔｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ： ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｉｓｓｕｅ（２０１３） Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒ．２８（３）：１４５～２８４）により概説されているような白血球除去技術により、用意される。
幹細胞に由来した免疫細胞もまた、本発明によるプライマリー免疫細胞として考えられ、特に、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．ら（２００８） 「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２（５９０３）：９４９～５３）に由来したものが挙げられる。リプログラミング因子のレンチウイルス発現は、ヒト末梢血細胞から多分化能性細胞を誘導するために用いられている（Ｓｔａｅｒｋ，Ｊ．ら（２０１０） 「Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」 Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ７（１）：２０～４）（Ｌｏｈ，ＹＨ．ら（２０１０） 「Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ」 Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ７（１）：１５～９）。
本発明の一実施形態によれば、免疫細胞は、ヒト胚の破壊を含まない当技術分野においてよく知られた技術によりヒト胚性幹細胞から派生させることができる（Ｃｈｕｎｇら（２００８） Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２（２）：１１３～１１７）。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球に由来する。
いくつかの実施形態において、本発明によるＴ細胞は、幹細胞から派生させることができる。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より特には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、又は造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はＣＤ３４＋ 細胞である。
別の実施形態において、操作型細胞は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球及びＣＤ８＋ Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、細胞の源は、様々な非限定的方法を通して対象から得ることができる。Ｔ細胞は、いくつかの非限定的源から得ることができ、その源には、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が挙げられる。本発明のある特定の実施形態において、入手可能でかつ当業者に知られたＴ細胞株のいくつでも用いられ得る。別の実施形態において、上記細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、又は感染症と診断された患者に由来し得る。別の実施形態において、上記細胞は、異なる表現型特性を提示する細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲には、前に記載された方法による形質転換型Ｔ細胞から得られた細胞株も包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性でかつ前の方法により獲得されやすい改変型細胞は、本発明の範囲に包含される。
いくつかの実施形態において、操作型免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は同種である。「同種」とは、細胞は、異なるハプロタイプを有する患者へ注入されることを考えれば、ドナーが起源であるか、細胞株が起源であるか、又は幹細胞から産生され及び／若しくは分化していることを意味する。そのような免疫細胞は、一般的には、それらの患者宿主に対して、アロ反応性が低く及び／又はより持続性になるように操作される。より具体的には、同種細胞を操作する方法は、Ｔ細胞における、又はＴ細胞へ派生させる幹細胞におけるＴＣＲ発現を低下させ又は不活性化するステップを含み得る。これは、非限定的例として、例えば、ヌクレアーゼ、塩基編集技術、ｓｈＲＮＡ、及びＲＮＡｉを用いることによる遺伝子サイレンシング又は遺伝子編集技術によるなどの種々の配列特定試薬によって得ることができる。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞はヒトが起源であり、好ましくは、そのヒトはドナーであり、患者ではない。
操作型Ｔ細胞は、不活性化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み、例えば、特異的なガイドＲＮＡに関連したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを用いること、又はＴＡＬＥヌクレアーゼなどの他の遺伝子編集アプローチを用いることにより、ＴＣＲの少なくとも１つのコンポーネントを不活性化することにより改変されている。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。ＴＣＲは、一般的には、２つの鎖、アルファ及びベータから構成され、その２つの鎖がアセンブルして、ヘテロダイマーを形成し、ＣＤ３伝達性サブユニットと会合して、細胞表面に存在するＴ細胞受容体複合体を形成する。ＴＣＲの各アルファ鎖及びベータ鎖は、免疫グロブリン様Ｎ末端可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域、疎水性膜貫通ドメイン、及び短い細胞質領域からなる。免疫グロブリン分子と同様に、アルファ及びベータ鎖の可変領域は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにより生成され、Ｔ細胞集団内の抗原特異性の大量の多様性を生み出す。しかしながら、無傷抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子と会合した、プロセシングされたペプチド断片により活性化され、ＭＨＣ拘束性として知られた、Ｔ細胞による抗原認識へ追加の次元を導入している。ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣ相違のＴ細胞受容体による認識は、Ｔ細胞増殖及びＧｖＨＤの潜在的発生をもたらす。ＴＣＲの正常な表面発現は、その複合体の全ての７つのコンポーネントの協調された合成及びアセンブリに依存する（Ａｓｈｗｅｌｌ及びＫｌｕｓｎｅｒ １９９０）。ＴＣＲアルファ又はＴＣＲベータの不活性化は、同種抗原の認識及びしたがって、ＧＶＨＤを防止する、Ｔ細胞の表面からのＴＣＲの排除を生じ得る。しかしながら、ＴＣＲ破壊は、一般的に、ＣＤ３シグナル伝達コンポーネントの排除を生じ、さらなるＴ細胞増殖の手段を変化させる。
好ましい実施形態によれば、集団における上記操作型Ｔ細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、それらのＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及び／又はＣＤ３アレルにおいて変異している。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、商標ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ、８，ｒｕｅ ｄｅ ｌａ Ｃｒｏｉｘ Ｊａｒｒｙ，７５０１３ ＰＡＲＩＳ）によって、よりよく知られた特異的なＴＡＬＥヌクレアーゼを用いることにより不活性化される。この方法は、同種Ｔ細胞の大量生産を可能にするプラットフォームの一部として、ＲＮＡトランスフェクションを用いて、プライマリー細胞において非常に効率的であることが立証されている。例えば、全体が本明細書に参照により組み入れられている、国際公開第２０１３／１７６９１５号参照。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、特異的なガイドＲＮＡと会合したＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを用いて不活性化される。本明細書に参照により組み入れられている、米国特許第１０，８７０，８６４号は、そのような方法を用いて細胞においてＴＣＲを不活性化するための方法を記載する。同種Ｔ細胞の生着は、ＴＣＲコンポーネントをコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することにより可能である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ遺伝子及び／又はＴＣＲベータ遺伝子（複数可）を不活性化することにより、細胞において非機能性にされる。同種Ｔ細胞におけるＴＣＲ不活性化は、ＧｖＨＤを防止し又は低下させることを目指す。
遺伝子を不活性化することにより、目的の遺伝子が機能性タンパク質型で発現しないことが意図される。特定の実施形態において、細胞の遺伝子改変は、１つのターゲットされた遺伝子において切断を触媒し、それにより、そのターゲットされた遺伝子を不活性化するようなＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼの、操作されるべき用意された細胞における、発現に依存する。エンドヌクレアーゼにより引き起こされた核酸鎖切断は、相同組換え又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の別個の機構を通して一般的に修復される。しかしながら、ＮＨＥＪは、切断の部位におけるＤＮＡ配列への変化を生じることが多い、不完全な修復過程である。機構は、２つのＤＮＡ末端の残るものの、直接的再ライゲーション（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ及びＪａｃｋｓｏｎ １９９８）による又はいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Ｂｅｔｔｓ、Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙら ２００３；Ｍａ，Ｋｉｍら ２００３）による再連結を含む。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復は、小さい挿入又は欠失を生じる場合が多く、特異的な遺伝子ノックアウトの生成に用いることができる。改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、又は付加であり得る。切断誘導性変異誘発事象、すなわち、ＮＨＥＪ事象と連続した変異誘発事象が起きた細胞は、当技術分野においてよく知られた方法により同定及び／又は選択することができる。
いくつかの実施形態において、ＦＡＰに対して方向づけられたＣＡＲを発現するように改変されている操作型Ｔ細胞は、１つ又は複数の追加の改変を有する。追加の遺伝的特質は、それらの治療的効力を向上させるためにＴ細胞を遺伝子編集することにより与えられ得る。
いくつかの実施形態において、操作型細胞は、患者におけるそれの持続又はそれの寿命を向上させるためにさらに改変することができ、特に、国際公開第２０１５／１３６００１号に、又はＬｉｕら（２０１７、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２７：１５４～１５７）により記載されているように、ＨＬＡ又はβ２ｍなどの（１つ又は複数の）ＭＨＣ－Ｉコンポーネントをコードする遺伝子を不活性化することができる。
β２ｍとしても知られた、ベータ－２ミクログロブリンは、ＭＨＣクラスＩ分子の軽鎖であり、そのようなものとして、主要組織適合複合体の不可欠な部分である。ヒトにおいて、β２ｍは、６番染色体上に遺伝子クラスターとして位置する他のＭＨＣ遺伝子とは対照的に、１５番染色体上に位置するβ２ｍ遺伝子によってコードされる。そのヒトタンパク質は、１１９アミノ酸で構成され、１１，８００ダルトンの分子量を有する。
ある特定の実施形態によれば、β２ｍの発現の阻害は、ゲノム改変により、より特に、ヒトβ２ｍ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１２９２０．１）又はヒトβ２ｍ遺伝子と全長に関して少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％配列同一性を有する遺伝子などのβ２ｍをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼのＴ細胞における発現を通して、達成される。そのようなレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得る。
ある特定の他の実施形態によれば、β２ｍの発現の阻害は、β２ｍをコードする細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズし（例えば、結合し）、それによりその遺伝子の転写及び／又は翻訳を阻害する核酸分子を用いる（例えば、Ｔ細胞へ導入する）ことにより達成することができる。特定の実施形態に従って、β２ｍの発現の阻害は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、又は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子を用いること（例えば、Ｔ細胞へ導入すること）により達成される。好ましくは、そのような核酸分子は、ヒトβ２ｍをコードするｍＲＮＡの相補体の少なくとも連続した１０ヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態によれば、β２ｍをコードする遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼを発現するＴ細胞又は前駆細胞が提供される。より特に、そのようなＴ細胞は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼであり得る上記レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む。したがって、よりアロ反応性が低いＴ細胞を提供するために、本発明の方法は、１つのＨＬＡ遺伝子を不活性化し又は変異させるステップをさらに含むことができる。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞は、上記Ｔ細胞においてＨＬＡの発現を抑制又は抑圧するように改変されている。ヒトにおけるクラスＩ ＨＬＡ遺伝子クラスターは、３つの主要な座、Ｂ、Ｃ、及びＡ、加えていくつかのマイナーな座を含む。クラスＩＩ ＨＬＡクラスターもまた、３つの主要な座、ＤＰ、ＤＱ、及びＤＲを含み、クラスＩ遺伝子クラスターとクラスＩＩ遺伝子クラスターの両方は、集団内にクラスＩ遺伝子とクラスＩＩ遺伝子の両方のいくつかの異なるアレルがある点で、多型である。その上、ＨＬＡ機能において役割を果たすいくつかのアクセサリータンパク質がある。Ｔａｐｌ及びＴａｐ２サブユニットは、クラスＩ ＨＬＡ複合体へペプチド抗原を負荷することにおいて必須であるＴＡＰトランスポーター複合体の一部であり、ＬＭＰ２及びＬＭＰ７プロテオソームサブユニットは、ＨＬＡ上のディスプレイのためのペプチドへの抗原のタンパク質分解において役割を果たす。ＬＭＰ７の低下は、おそらく安定化の喪失により、細胞表面におけるＭＨＣクラスＩの量を低下させることが示されている（Ｆｅｈｌｉｎｇら（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１２３４～１２３７）。ＴＡＰ及びＬＭＰに加えて、タパシン遺伝子があり、それの産物が、ＴＡＰ複合体とＨＬＡ クラスＩ鎖との間に架橋を形成し、ペプチド負荷を増強する。タパシンの低下は、ＭＨＣクラスＩアセンブリの不全、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現の低下、及び免疫応答の不全を有する細胞を生じる（Ｇｒａｎｄｅａら（２０００） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：２１３～２２２及びＧａｒｂｉら（２０００） Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２３４～２３８）。例として国際公開第２０１２／０１２６６７号に開示されているように、上記遺伝子のいずれかが、本発明の一部として不活性化され得る。
ある特定の実施形態に従って、操作型Ｔ細胞は、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＺＸＤＡ、ＺＸＤＢ、及びＺＸＤＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子において不活性化されている。不活性化は、例として、ゲノム改変を用いることにより、より特に、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＺＸＤＡ、ＺＸＤＢ、及びＺＸＤＣからなる群から選択される遺伝子をＤＮＡ切断におり選択的に不活性化することができるレアカッティングエンドヌクレアーゼのＴ細胞における発現を通して、達成され得る。そのような改変は、操作型免疫細胞が、患者へ注入された場合、より低いアロ反応性であることを可能にし得る。
いくつかの実施形態において、上記操作型Ｔ細胞は、国際公開第２０１４／１８４７４４号に記載されているように、ＰＤ１又はＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイントタンパク質及び／又はその受容体の、上記Ｔ細胞における発現を抑制又は抑圧するように遺伝子改変されている。
用語「免疫チェックポイント」は、Ｔ細胞により発現した分子の群を意味することは、当業者により理解されているだろう。これらの分子は、免疫応答を下方調節又は阻害するための「ブレーキ」としての役割を効果的に果たす。免疫チェックポイント分子には、免疫細胞を直接的に阻害する、プログラム死１（ＰＤ－１、別名ＰＤＣＤ１又はＣＤ２７９、アクセッション番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４、別名ＣＤ１５２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（別名ＣＤ２２３、アクセッション番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（別名ＨＡＶＣＲ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（別名ＣＤ２７２、アクセッション番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（別名ＣＤ１６０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（別名ＩＶＳＴＭ３、アクセッション番号：ＮＭ＿１７３７９９）、ＬＡＩＲ１（別名ＣＤ３０５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（別名ＣＤ２４４、アクセッション番号：ＮＭ＿００１１６６６６４．１）、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、ＣＴＬＡ－４は、ある特定のＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に発現する細胞表面タンパク質である；抗原提示細胞上のそれのリガンド（Ｂ７－１及びＢ７－２）が結合した（engage）時、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能が阻害される。いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞は、免疫チェックポイントに関与する少なくとも１つのタンパク質、特にＰＤ１及び／若しくはＣＴＬＡ－４、又は本明細書で言及された任意の免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することによりさらに遺伝子改変される。
いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３からなる群から選択される、免疫チェックポイントタンパク質をコードする少なくとも２つの遺伝子が不活性化される。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞は、少なくとも１つの免疫抑制薬又は化学療法薬に対する抵抗性を与えるように、及び任意選択で、自殺遺伝子を含むように、改変又は選択することができる。
いくつかの実施形態において、操作型Ｔ細胞は、例として国際公開第２０１３／１７６９１５号に記載されているように、少なくとも１つの免疫抑制薬に対する抵抗性を与えるように、例えば、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）の標的であるＣＤ５２を不活性化することにより、さらに改変することができる。
同種Ｔ細胞の癌治療及び選択的生着を向上させるために、化学療法又は免疫抑制剤の毒性副作用からＴ細胞を保護するために、薬物抵抗性が操作型Ｔ細胞へ与えられ得る。いくつかの実施形態において、操作型免疫細胞は、国際公開第２０１５／７５１９５号に記載されているように、化学療法薬、特にプリン類似体薬に対する抵抗性を与えるように、例えば、ＤＣＫを不活性化することにより、さらに改変することができる。
薬物抵抗性遺伝子を発現するＴ細胞は薬物感受性細胞と比べて、生存しかつ増加するため、Ｔ細胞の薬物抵抗性は、インビボ又はエクスビボでそれらの濃縮を可能にする。いくつかの実施形態において、方法は、免疫療法のために抵抗性のある、同種及び薬物抵抗性Ｔ細胞を操作する方法であって、（ａ）Ｔ細胞を用意するステップ；（ｂ）少なくとも１つの薬物を選択するステップ；（ｃ）薬物抵抗性を上記Ｔ細胞へ与えるようにＴ細胞を改変するステップ；及び（ｄ）上記薬物の存在下で上記操作型Ｔ細胞を増殖するステップを含む方法をさらに含む。前述のステップは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）コンポーネントをコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化し、その後、細胞表面にＴＣＲを発現しない形質転換型Ｔ細胞をソートすることにより、Ｔ細胞を改変するステップと組み合わせられ得る。
したがって、操作型Ｔ細胞は、薬物、より特に、化学療法剤に対する抵抗性を与えるようにさらに改変することができる。薬物に対する抵抗性は、薬物抵抗性遺伝子を発現することによりＴ細胞に与えることができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２）、カルシニューリン、又はメチルグアニントランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）などのいくつかの遺伝子のバリアントアレルが、細胞へ薬物抵抗性を与えると同定されている。いくつかの実施形態において、薬物抵抗性遺伝子は、上記遺伝子をコードする導入遺伝子を細胞へ導入することによるか、又は上記薬物抵抗性遺伝子を細胞のゲノムへ相同組換えにより組み込むことによるかのいずれかで、細胞において発現させることができる。
薬物に対する抵抗性は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ２６４３４．１）などの、薬物に対する細胞の感受性の原因である１つ又は複数の遺伝子（薬物感作遺伝子）を不活性化することにより、Ｔ細胞に与えることができる。特に、細胞分裂停止性代謝産物、６－チオグアニン（６ＴＧ）（ＨＰＲＴにより細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドへ変換され、現在、癌、特に白血病を有する患者を処置するために用いられている）に対する抵抗性を与えるために、ＨＰＲＴは操作型Ｔ細胞において不活性化することができる（Ｈａｃｋｅ， Ｔｒｅｇｅｒら ２０１３）。別の例は、Ｔ細胞の表面で正常に発現したＣＤ３の不活性化が、テプリズマブなどの抗ＣＤ３抗体に対する抵抗性を与え得ることである。
別の方法では、薬物抵抗性は、少なくとも１つの薬物抵抗性遺伝子の発現によりＴ細胞へ与えることができる。薬物抵抗性遺伝子は、化学療法剤（例えば、メトトレキサート）などの作用物質に対する「抵抗性」をコードする核酸配列を指す。言い換えれば、細胞における薬物抵抗性遺伝子の発現は、薬物抵抗性遺伝子を含まない対応する細胞の増殖より高い程度、作用物質の存在下で細胞の増殖を可能にする。本発明の薬物抵抗性遺伝子は、抗代謝産物、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、それらの類似体又は誘導体、及びその他同種類のものに対する抵抗性をコードすることができる。
ターゲットされた細胞へ薬物抵抗性を与えるために用いられる可能性があり得るいくつかの薬物抵抗性遺伝子が、同定されている（Ｔａｋｅｂｅ、Ｚｈａｏら ２００１；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、Ｔｓｕｋａｈａｒａら ２００３；Ｚｉｅｌｓｋｅ、Ｒｅｅｓｅら ２００３；Ｎｉｖｅｎｓ、Ｆｅｌｄｅｒら ２００４；Ｂａｒｄｅｎｈｅｕｅｒ、Ｌｅｈｍｂｅｒｇら ２００５；Ｋｕｓｈｍａｎ、Ｋａｂｌｅｒら ２００７）。
薬物抵抗性遺伝子の一例はまた、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の変異体又は改変型でもあり得る。ＤＨＦＲは、細胞におけるテトラヒドロ葉酸の量を制御することに関与する酵素であり、ＤＮＡ合成に必須である。メトトレキサート（ＭＴＸ）などの葉酸類似体は、ＤＨＦＲを阻害し、したがって、臨床において抗悪性腫瘍剤として用いられている。治療に用いられる抗葉酸による阻害に対する抵抗性が増加している種々の変異体型のＤＨＦＲが記載されている。特定の実施形態において、本発明による薬物抵抗性遺伝子は、メトトレキサートなどの抗葉酸処置に対する抵抗性を与える少なくとも１つの変異を含む、ヒト野生型ＤＨＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ７１９９６．１）の変異型をコードする核酸配列であり得る。特定の実施形態において、ＤＨＦＲの変異型は、位置Ｇ１５、Ｌ２２、Ｆ３１、又はＦ３４、好ましくは位置Ｌ２２又はＦ３１において少なくとも１つの変異型アミノ酸を含む（（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ、Ｄｉｃｋｅｒら １９９０）；国際公開第９４／２４２７７号；米国特許第６，６４２，０４３号）。
本明細書で用いられる場合、「抗葉酸剤」又は「葉酸類似体」は、葉酸代謝経路に、ある程度、干渉するように方向づけられた分子を指す。抗葉酸剤の例には、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）；アミノプテリン；トリメトレキサート（ノイトレキシン（Neutrexin）（商標））；エダトレキサート；Ｎ１０－プロパルギル－５，８－ジデアザ葉酸（ＣＢ３７１７）；ＺＤ１６９４（ツモデックス（Tumodex））。５，８－ジデアザイソ葉酸（ＩＡＨＱ）；５，１０－ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）；５－デアザ葉酸；ＰＴ５２３（Ｎアルファ－（４－アミノ－４－デオキシプテロイル）－Ｎデルタ－ヘミフタロイル（hemiphthaloyl）－Ｌ－オルニチン）；１０－エチル－１０－デアザアミノプテリン（ＤＤＡＴＨＦ、ロメトレキソール（Lometrexol））；ピリトレキシム；１０－ＥＤＡＭ；ＺＤ１６９４；ＧＷ１８４３；ペメトレキサート（Pemetrexate）、及びＰＤＸ（１０－プロパルギル－１０－デアザアミノプテリン）が挙げられる。
薬物抵抗性遺伝子の別の例は、イノシン－５’－一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＰＤＨ２）、グアノシンヌクレオチドのデノボ合成における律速酵素の変異体又は改変型でもあり得る。ＩＭＰＤＨ２の変異体又は改変型は、ＩＭＰＤＨ阻害剤抵抗性遺伝子である。ＩＭＰＤＨ阻害剤は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）又はそれのプロドラッグミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）であり得る。変異体ＩＭＰＤＨ２は、ＩＭＰＤＨ阻害剤に対する有意に増加した抵抗性をもたらす、野生型ヒトＩＭＰＤＨ２（ＮＰ＿０００８７５．２）のＭＡＰ結合部位における少なくとも１つ、好ましくは２つの変異を含み得る。その変異は、好ましくは、位置Ｔ３３３及び／又はＳ３５１にある（Ｙａｍ、Ｊｅｎｓｅｎら ２００６；Ｓａｎｇｉｏｌｏ、Ｌｅｓｎｉｋｏｖａら ２００７；Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ、Ｂｒｏｗｎら ２０１３）。特定の実施形態において、位置３３３におけるスレオニン残基は、イソロイシン残基と置き換えられ、位置３５１におけるセリン残基が、チロシン残基と置き換えられる。
別の薬物抵抗性遺伝子は、カルシニューリンの変異型である。カルシニューリン（ＰＰ２Ｂ）は、多くの生物学的過程に関与する、遍在性に発現したセリン／スレオニンプロテインホスファターゼであり、Ｔ細胞活性化の中核をなす。カルシニューリンは、触媒サブユニット（ＣｎＡ；３つのアイソフォーム）及び制御サブユニット（ＣｎＢ；２つのアイソフォーム）で構成されるヘテロダイマーである。Ｔ細胞受容体の結合（engagement）後、カルシニューリンは、転写因子ＮＦＡＴを脱リン酸化して、ＮＦＡＴが核へ転位置して、ＩＬ２などの重要な標的遺伝子を活性化するのを可能にする。ＦＫＢＰ１２と複合したＦＫ５０６、又はＣｙＰＡと複合したサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、ＮＦＡＴのカルシニューリンの活性部位へのアクセスを遮断して、ＮＦＡＴの脱リン酸化を阻止し、それにより、Ｔ細胞活性化を阻害する（Ｂｒｅｗｉｎ、Ｍａｎｃａｏら ２００９）。本発明の薬物抵抗性遺伝子は、ＦＫ５０６及び／又はＣｓＡなどのカルシニューリン阻害剤に対して抵抗性であるカルシニューリンの変異型をコードする核酸配列であり得る。特定の実施形態において、上記変異型は、野生型カルシニューリンヘテロダイマーの、位置Ｖ３１４、Ｙ３４１、Ｍ３４７、Ｔ３５１、Ｗ３５２、Ｌ３５４、Ｋ３６０における少なくとも１個の変異型アミノ酸、好ましくは、位置Ｔ３５１とＬ３５４、又はＶ３１４とＹ３４１における二重変異を含み得る。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトカルシニューリンヘテロダイマー（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＸ３４０９２．１）の型のアミノ酸の位置に関して表現される場合が多い。
別の特定の実施形態において、上記変異型は、野生型カルシニューリンヘテロダイマーｂの、位置Ｖ１２０、Ｎ１２３、Ｌ１２４、又はＫ１２５における少なくとも１個の変異型アミノ酸、好ましくは、位置Ｌ１２４とＫ１２５における二重変異を含み得る。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、野生型ヒトカルシニューリンヘテロダイマーｂポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＸ３４０９５．１）の型のアミノ酸の位置に関して表現される場合が多い。
別の薬物抵抗性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）をコードするＯ６－メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）である。ＡＧＴは、ニトロソウレア及びテモゾロミド（ＴＭＺ）などのアルキル化剤の細胞傷害性効果に対する抵抗性を与えるＤＮＡ修復タンパク質である。６－ベンジルグアニン（６－ＢＧ）は、ニトロソウレア毒性を増強する、ＡＧＴの阻害剤であり、この作用物質の細胞傷害性効果を増強するためにＴＭＺと同時投与される。ＡＧＴのバリアントをコードするＭＧＭＴのいくつかの変異型は、６－ＢＧによる不活性化に対して抵抗性が高いが、ＤＮＡ損傷を修復する能力を保持する（Ｍａｚｅ、Ｋｕｒｐａｄら １９９９）。特定の実施形態において、ＡＧＴ変異型は、野生型ＡＧＴ位置Ｐ１４０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６４５５）の変異型アミノ酸を含み得る。
別の薬物抵抗性遺伝子は、多剤抵抗性タンパク質１（ＭＤＲ１）遺伝子であり得る。この遺伝子は、細胞膜を横断する代謝副産物の輸送に関与するＰ－糖タンパク質（Ｐ－ＧＰ）として知られた膜糖タンパク質をコードする。Ｐ－Ｇｐタンパク質は、いくつかの構造的に無関係の化学療法剤への幅広い特異性を示す。したがって、薬物抵抗性は、ＭＤＲ－１（ＮＰ＿０００９１８）をコードする核酸配列の発現により細胞へ与えられ得る。
薬物抵抗性遺伝子はまた、ｂｌｅ遺伝子又はｍｃｒＡ遺伝子などの細胞傷害性抗生物質であり得る。免疫細胞におけるｂｌｅ遺伝子又はｍｃｒＡ遺伝子の異所性発現は、化学療法剤、それぞれ、ブレオマイシン又はマイトマイシンＣへ曝露された時、選択優位性を与える。
免疫抑制剤に関して、本発明は、以下の可能な任意のステップを提供する：（ａ）Ｔ細胞を、好ましくは細胞培養物又は血液試料から、用意するステップ；（ｂ）免疫抑制剤についての標的を発現する、上記Ｔ細胞における遺伝子を選択するステップ；（ｃ）上記免疫抑制剤についての標的をコードする上記遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することができるＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを上記Ｔ細胞へ導入するステップ；（ｄ）上記細胞を、任意選択で上記免疫抑制剤の存在下で、増殖するステップ。より好ましい実施形態において、上記方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のコンポーネントを不活性化するさらなるステップを含む。
免疫抑制剤は、いくつかの作用機構の１つにより免疫機能を抑制する作用物質である。言い換えれば、免疫抑制剤は、免疫応答の程度及び／又は貪食を減少させる能力により示される化合物により果たされる役割である。非限定的例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン－２α鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤、コルチコステロイド、又は免疫抑制性代謝拮抗剤であり得る。古典的細胞傷害性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。他のものは、Ｔ細胞の活性化を通して、又はヘルパー細胞の活性化を阻害することにより、作用し得る。本発明による方法は、Ｔ細胞における免疫抑制剤の標的を不活性化することにより、免疫療法のためのＴ細胞へ免疫抑制剤抵抗性を与えることを可能にする。非限定的例として、免疫抑制剤についての標的は、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、及びシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーなどの免疫抑制剤に対する受容体であり得る。
免疫適格性宿主において、同種細胞は、正常には、宿主免疫系によって迅速に拒絶される。非照射の血液産物に存在する同種白血球は、たった５～６日間だけ、持続することが示される。（Ｂｏｎｉ、Ｍｕｒａｎｓｋｉら （２００８） Ｂｌｏｏｄ １１２（１２）：４７４６～５４）。したがって、同種細胞の拒絶を防止するために、宿主の免疫系は、効果的に抑制されなければならない。グルココルチコイドステロイドは、免疫抑制のために治療的に広く用いられている（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ及びＣｈａｐｍａｎ（２０１１） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３３５（１）：２～１３）。このクラスのステロイドホルモンは、Ｔ細胞のサイトゾルに存在するグルココルチコイド受容体（ＧＲ）と結合し、その結果として、核への転位置、及び免疫学的過程に関与するいくつかの遺伝子の発現を制御する特定のＤＮＡモチーフの結合を生じる。Ｔ細胞のグルココルチコイドステロイドでの処理は、サイトカイン産生レベルの低下を生じ、Ｔ細胞アネルギー及びＴ細胞活性化における干渉をもたらす。アレムツズマブ、別名ＣＡＭＰＡＴＨ１－Ｈは、ＣＤ５２（１２アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結糖タンパク質）をターゲットするヒト化モノクローナル抗体である（Ｗａｌｄｍａｎｎ及びＨａｌｅ（２００５） Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．３６０：１７０１～１１）。ＣＤ５２は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球上に高レベルで、並びに単球上ではより低いレベルで、発現しており、一方、顆粒球及び骨髄前駆体上には存在しない。ＣＤ５２に対して方向づけられたヒト化モノクローナル抗体である、アレムツズマブでの処理は、循環リンパ球及び単球の急速な除去を誘導することが示されている。アレムツズマブは、Ｔ細胞リンパ腫の処置において、及びある特定の場合では、移植のためのコンディショニングレジメンの一部として、頻繁に用いられる。しかしながら、養子免疫療法の場合、免疫抑制薬の使用がまた、導入された治療用Ｔ細胞へ有害効果を生じる。したがって、これらの条件で養子免疫療法アプローチを効果的に用いるために、導入された細胞は、免疫抑制処置に対して抵抗性である必要がある。
いくつかの実施形態において、免疫抑制処置に特異的である遺伝子は、ＣＤ５２であり、その免疫抑制処置は、ＣＤ５２抗原をターゲットするヒト化抗体を含む。別の実施形態において、免疫抑制処置に特異的である遺伝子は、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）であり、その免疫抑制処置は、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドを含む。別の実施形態において、免疫抑制処置に特異的である遺伝子は、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー又はそのバリアントであり、その免疫抑制処置は、ＦＫ５０６、別名タクロリムス又はフジマイシンを含む。別の実施形態において、免疫抑制処置に特異的である遺伝子は、ＦＫＢＰ１２などのＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー又はそのバリアントである。別の実施形態において、免疫抑制処置に特異的である遺伝子は、シクロフィリンファミリー遺伝子メンバー又はそのバリアントであり、その免疫抑制処置は、シクロスポリンを含む。
免疫療法処置
本明細書で提供される場合、処置方法は、患者において免疫応答を誘発する有効量の免疫療法処置を患者へ投与するステップを含む。
そのような免疫療法処置には、免疫チェックポイントアンタゴニスト、免疫細胞エンゲージャー、腫瘍特異的ワクチン（例えば、そのようなワクチン接種は、患者において腫瘍に対する免疫応答を生じさせるために、患者において、腫瘍特異的抗原の発現を可能にする）、及びそれらの組合せを挙げることができる。したがって、本発明は、いかなる腫瘍に対しても活性があるように調製された普遍的な抗ＦＡＰ－ＣＡＲ発現免疫細胞の使用を、患者の腫瘍に対して特異的な免疫療法処置の使用と組み合わすことができ、上記免疫療法処置が、好ましくは、例として、上記患者の腫瘍の１つの特異的な腫瘍抗原（すなわち、ＦＡＰである特異的な腫瘍抗原）に対して免疫応答を誘発するようにデザインされたワクチンを用いることにより、個別化される。
免疫チェックポイントアンタゴニスト
いくつかの実施形態において、免疫療法処置は、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストを患者へ投与するステップを含む。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＧＩＴＲ、及びＢＴＬＡのタンパク質性（例えば、抗体若しくはその断片、又は抗体模倣体）阻害剤である。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＧＩＴＲ、又はＢＴＬＡの有機小分子阻害剤を含む。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストはＣＴＬＡ４阻害剤である。いくつかの実施形態において、その阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＢＭＳ－９８６２１８、ＡＧＥＮ１１８１、ＡＧＥＮ１８８４、ＢＭＳ－９８６２４９、ＭＫ－１３０８、ＲＥＧＮ－４６５９、ＡＤＵ－１６０４、ＣＳ－１００２、ＢＣＤ－１４５、ＡＰＬ－５０９、ＪＳ－００７、ＢＡ－３０７１、ＯＮＣ－３９２、ＡＧＥＮ－２０４１、ＪＨＬ－１１５５、ＫＮ－０４４、ＣＧ－０１６１、ＡＴＯＲ－１１４４、ＰＢＩ－５Ｄ３Ｈ５、ＢＰＩ－００２、ＨＢＭ－４００３、加えて、多重特異性阻害剤ＦＰＴ－１５５（ＣＴＬＡ４／ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２８）、ＰＦ－０６９３６３０８（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＭＧＤ－０１９（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＫＮ－０４６（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＭＥＤＩ－５７５２（ＣＴＬＡ４／ＰＤ－１）、ＸｍＡｂ－２０７１７（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、及びＡＫ－１０４（ＣＴＬＡ４／ＰＤ－１）から選択される。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）又はＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）阻害剤である。いくつかの実施形態において、その阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピジリズマブ、ＡＭＧ－４０４、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、スパルタリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＣＫ－３０１、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７（チスレリズマブ）、ＧＥＮ－１０４６（ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ）、ＧＬＳ－０１０（ＷＢＰ－３０５５）、ＡＫ－１０３（ＨＸ－００８）、ＡＫ－１０５、ＣＳ－１００３、ＨＬＸ－１０、ＭＧＡ－０１２、ＢＩ－７５４０９１、ＡＧＥＮ－２０３４、ＪＳ－００１（トリパリマブ）、ＪＮＪ－６３７２３２８３、ゲノリムズマブ（ＣＢＴ－５０１）、ＬＺＭ－００９、ＢＣＤ－１００、ＬＹ－３３０００５４、ＳＨＲ－１２０１、ＳＨＲ－１２１０（カムレリズマブ）、Ｓｙｍ－０２１、ＡＢＢＶ－１８１、ＰＤ１－ＰＩＫ、ＢＡＴ－１３０６、ＣＸ－０７２、ＣＢＴ－５０２、ＴＳＲ－０４２（ドスタルリマブ）、ＭＳＢ－２３１１、ＪＴＸ－４０１４、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＳＨＲ－１３１６、ＣＳ－１００１（ＷＢＰ－３１５５、ＫＮ－０３５、ＩＢＩ－３０８（シンチリマブ）、ＨＬＸ－２０、ＫＬ－Ａ１６７、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＳＴＩ－Ａ１０１５（ＩＭＣ－００１）、ＢＣＤ－１３５、ＦＡＺ－０５３、ＴＱＢ－２４５０、ＭＤＸ１１０５－０１、ＧＳ－４２２４、ＧＳ－４４１６、ＩＮＣＢ０８６５５０、ＭＡＸ１０１８１、加えて多重特異性阻害剤ＦＰＴ－１５５（ＣＴＬＡ４／ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２８）、ＰＦ－０６９３６３０８（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＭＧＤ－０１３（ＰＤ－１／ＬＡＧ－３）、ＲＯ－７２４７６６９（ＰＤ－１／ＬＡＧ－３）、ＦＳ－１１８（ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１）、ＭＧＤ－０１９（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＫＮ－０４６（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＭＥＤＩ－５７５２（ＣＴＬＡ４／ＰＤ－１）、ＲＯ－７１２１６６１（ＰＤ－１／ＴＩＭ－３）、ＸｍＡｂ－２０７１７（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ４）、ＡＫ－１０４（ＣＴＬＡ４／ＰＤ－１）、Ｍ７８２４（ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ．ベータ．－ＥＣドメイン）、ＣＡ－１７０（ＰＤ－Ｌ１／ＶＩＳＴＡ）、ＣＤＸ－５２７（ＣＤ２７／ＰＤ－Ｌ１）、ＬＹ－３４１５２４４（ＴＩＭ－３／ＰＤＬ１）、ＲＧ７７６９（ＰＤ－１／ＴＩＭ－３）及びＩＮＢＲＸ－１０５（４－１ＢＢ／ＰＤＬ１）、ＧＮＳ－１４８０（ＰＤ－Ｌ１／ＥＧＦＲ）、ＲＧ－７４４６（テセントリク、アテゾリズマブ）、ＡＢＢＶ－１８１、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＫ－３４７７、ＳＣＨ－９００４７５、ラムブロリズマブ、ＣＡＳ登録番号１３７４８５３－９１－４）、ピジリズマブ、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７（チスレリズマブ）、ＧＬＳ－０１０（ＷＢＰ－３０５５）、ＡＫ－１０３（ＨＸ－００８）、ＣＳ－１００３、ＨＬＸ－１０、ＭＧＡ－０１２、ＢＩ－７５４０９１、ＲＥＧＮ－２８１０（セミプリマブ）、ＡＧＥＮ－２０３４、ＪＳ－００１（トリパリマブ）、ＪＮＪ－６３７２３２８３、ゲノリムズマブ（ＣＢＴ－５０１）、ＬＺＭ－００９、ＢＣＤ－１００、ＬＹ－３３０００５４、ＳＨＲ－１２０１、ＳＨＲ－１２１０（カムレリズマブ）、Ｓｙｍ－０２１、ＡＢＢＶ－１８１、ＡＫ－１０５、ＰＤ１－ＰＩＫ、ＢＡＴ－１３０６、ＢＭＳ－９３６５５９、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ－４７３６）、アベルマブ、ＣＫ－３０１、（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＭＥＤＩ－０６８０、ＣＸ－０７２、ＣＢＴ－５０２、ＰＤＲ－００１（スパルタリズマブ）、ＰＤＲ００１＋タフィンラー．ＲＴＭ．＋メキニスト．ＲＴＭ．、ＭＳＢ－２３１１、ＪＴＸ－４０１４、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＳＨＲ－１３１６、ＣＳ－１００１（ＷＢＰ－３１５５）、ＫＮ－０３５（エンバフォリマブ）、ＩＢＩ－３０８（シンチリマブ）、ＨＬＸ－２０、ＫＬ－Ａ１６７、ＳＴＩ－Ａ１０１４、ＳＴＩ－Ａ１０１５（ＩＭＣ－００１）、ＢＣＤ－１３５、ＦＡＺ－０５３、ＴＱＢ－２４５０、及びＭＤＸ１１０５－０１、並びに、例えば、国際公開第２０１８／１９５３２１号、第２０２０／０１４６４３号、第２０１９／１６０８８２号、及び第２０１８／１９５３２１号に記載されたものから選択される。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、ＬＡＧ－３阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＬＡＧ－３阻害剤は、レラトリマブ、ＬＡＧ５２５、ＢＭＳ－９８６０１６、及びＴＳＲ－０３３からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、上記免疫チェックポイントアンタゴニストは、抗ＰＤ１抗体又は抗ＰＤＬ１抗体である。いくつかの実施形態において、上記免疫チェックポイントアンタゴニストは、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、及びスパルタリズマブからなる群から選択される抗ＰＤ１抗体、又はデュルバルマブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブからなる群から選択される抗ＰＤＬ１抗体である。
具体的な実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、ペムブロリズマブである。ペムブロリズマブは、配列番号１３５のアミノ酸配列の重鎖及び配列番号１３６のアミノ酸配列の軽鎖を含む。
別の具体的な実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、ニボルマブである。ニボルマブは、配列番号１３３のアミノ酸配列の重鎖及び配列番号１３４のアミノ酸配列の軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、イピリムマブである抗ＣＴＬＡ４抗体である。イピリムマブは、配列番号１３７のアミノ酸配列の重鎖及び配列番号１３８のアミノ酸配列の軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、レラトリマブである抗ＬＡＧ３抗体である。レラトリマブは、配列番号１３９のアミノ酸配列の重鎖及び配列番号１４０のアミノ酸配列の軽鎖を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、１つより多い免疫チェックポイントアンタゴニストを併用する。例として、免疫チェックポイントアンタゴニストは、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペムブロリズマブ）又は抗ＰＤＬ１抗体（例えば、デュルバルマブ）、及び抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）を含む。別の例において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペムブロリズマブ）及び抗ＬＡＧ３抗体（例えば、レラトリマブ）を含む。
免疫細胞エンゲージャー
いくつかの実施形態において、免疫療法処置は、少なくとも２つの結合部位を含む免疫細胞エンゲージャーの有効量を投与するステップであって、上記第１の結合部位が、免疫細胞に結合し、上記第２の結合部位が固形腫瘍に関連した抗原に結合する、ステップを含む。
いくつかの実施形態において、免疫療法処置は、有効量の免疫細胞エンゲージャー及び有効量の、本明細書で記載されているような免疫チェックポイントアンタゴニストを投与するステップを含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び／又は細胞傷害性／食作用性細胞の再方向づけのために用いられる。
特定の実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞に結合する第１の結合部位を含む。
本明細書で用いられる場合、句「免疫細胞エンゲージャー」（又は「ＩＣエンゲージャー」）は、２つ以上の可動性に接続されたリガンド結合ドメインを含む組換えタンパク質構築物を指す。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。これらのリガンド結合ドメインの１つは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＡＰＣなどの免疫細胞の少なくとも１つの選択された型に選択的に結合する。リガンド結合ドメインは、好ましくは、下記に定義される「免疫細胞活性化受容体」に結合する。ＩＣエンゲージャーは一般的に、細胞表面抗原、好ましくは「疾患状態に関連した抗原」、より好ましくは「癌に関連した抗原」に特異的に結合する第２の結合ドメインを含み、その細胞表面抗原は一般的に、病的細胞のマーカーであるように、及び同種操作型Ｔ細胞自体の表面に存在しないように、選択される。本発明に用いられるＩＣエンゲージャーは、好ましくは、固形腫瘍に関連した抗原に結合する。ＩＣエンゲージャーの機能は、選択された型の免疫細胞を、ターゲットされた悪性細胞と引き合わせることである。
様々な型の可溶性免疫細胞エンゲージャーが、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （２０１５） Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０（７）：８３８～８４７）により概説されているように、文献に提供されており、それらは、本発明の方法に適している。非限定的リストとして、ＩＣエンゲージャーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）、二重親和性再ターゲティング抗体（ＤＡＲＴ）、Ｔ細胞受容体に基づいた抗体による二重特異性結合（engagement）（ＢＥＡＴ）、ＣＲＯＳＳＭＡＢ、ＴＲＩＯＭＡＢ、タンデムダイアボディ（ＴＡＮＤＡＢ）、ＡＤＡＰＴＩＲ、Ｔ細胞のための親和性テーラードアダプター（ＡＴＡＣ）、ＤＵＯＢＯＤＹ、ＸＭＡＢ、Ｔ細胞再方向づけ抗体（ＴＲＡＢ）、ＢＩＣＬＯＮＩＣＳ、ＤＵＴＡＭＡＢ、ＶＥＬＯＣＩ－ＢＩ、ヒンジ変異型二重特異性抗体武装の活性化Ｔ細胞（ＡＡＴＣ）、及び二重＆三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢＩＫＥ及びＴＲＩＫＥ）であり得る。国際公開第２０２０／１１３１６４号に記載されているような四価ヘテロダイマー抗体もまた、用いることができる。
「疾患状態に関連した抗原」は、所定の疾患において存在し又は過剰発現した抗原を指す。疾患は、例として、癌、特に固形腫瘍であり得る。疾患状態に関連した抗原は、上記疾患状態が癌である場合、すなわち、「癌に関連した抗原」は、本明細書に記載されているような腫瘍抗原であり得る。
用語「腫瘍抗原」は、「腫瘍特異的抗原」及び「腫瘍関連抗原」を網羅することを意図される。腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、一般的に、腫瘍細胞においてのみ存在し、いかなる他の細胞にも存在せず、一方、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、いくつかの腫瘍細胞に存在し、いくつかの正常細胞にも存在する。本明細書で意図されているように「腫瘍抗原」はまた、変異型のタンパク質を指し、その変異型のタンパク質は、腫瘍においてはその型でのみ現れ、一方、非変異型は、非腫瘍組織において観察される。本明細書で定義される「腫瘍抗原」はまた、腫瘍微小環境及び／又は腫瘍間質に関連した抗原、例えば、腫瘍間質線維芽細胞に存在するＶＥＧＦを含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＡＰＣ／マクロファージの表面抗原に結合する第１の結合部位を含む。「免疫細胞の活性化受容体」は、好ましくは、Ｔ細胞についてのＴＣＲ、ＮＫ細胞についてのＣＤ１６、及びＡＰＣについてのＣＤ４０などの、免疫細胞の免疫活性を引き起こす受容体を指す。いくつかの実施形態において、エフェクター免疫細胞に対する特異性は、適切なシグナル伝達カスケードを引き起こして、癌細胞に対して方向づけられた免疫細胞の殺滅機構を活性化することができる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーはＴ細胞をターゲットする。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅｓ）である。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に会合しかつＴＣＲ媒介性シグナル伝達に関与するＣＤ３複合体の特定の鎖（主にＣＤ３ε鎖）を活性化するｓｃＦｖと連結された腫瘍抗原ターゲティングｓｃＦｖを含む。このアプローチを利用することにより、Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して物理的に再方向づけされ、同時に活性化される。この「人工的な」免疫学的シナプスの形成は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達及び分泌顆粒タンパク質の再分布を伴い得、パーフォリン及びグランザイムの放出をもたらす。理論によって縛られるつもりはないが、そのような接触依存性細胞傷害性は、おそらく、腫瘍細胞のＢｉＴｅｓ誘導性直接的殺滅についての主な機構であり、その理由は、Ｃａ２＋（パーフォリン多量体化及びポア形成に必要とされる）のＥＤＴＡキレート化が標的細胞アポトーシスの完全な阻害をもたらすからである。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカインの分泌、及び耐久性のある抗腫瘍免疫応答を持続することに必要とされ得るＴ細胞増殖を生じることができる。標準的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）は、ＣＤ３複合体に対して特異的なＢｉＴｅｓにより活性化され、かつＢｉＴｅｓの抗腫瘍活性に寄与し得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーはまた、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ）をターゲットし、それは、活性化Ｔ細胞に結合（engage）するために活用することができ、免疫細胞エンゲージャーを三重特異性にする。
いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、及び／又はＴＣＲデルタなどのＴ細胞活性化受容体複合体（すなわち、ＴＣＲ）のコンポーネントに結合する。
いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３に結合し、配列番号５３及び配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３に結合し、配列番号５３及び配列番号６０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３に結合し、配列番号５３に含まれる配列番号４７～５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３に結合し、配列番号６０に含まれる配列番号５４～５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３に結合し、配列番号４７～５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含み、配列番号５３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の結合部位は、ＣＤ３に結合し、配列番号５４～５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含み、配列番号６０と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、ＮＫ細胞をターゲットする。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞又は形質転換細胞を、１セットの生殖系列コード化受容体によって認識する能力がある細胞傷害性自然リンパ球系細胞であり、ＴＣＲ及びＣＤ３分子の欠如、並びにＣＤ５６（別名、神経細胞接着分子）及びＣＤ１６（別名、ＦｃγＲＩＩＩ）の発現により特徴づけられる。ＮＫ細胞活性は、活性化（例えば、ＣＤ１６のような自然細胞傷害性受容体）又は阻害性（例えば、阻害性キラー免疫グロブリン様受容体）機能を有する特異的な膜受容体によってバランスがとられている。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６と結合する。別の実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体と結合する。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーの第１の結合部位は、ＣＤ１６表面抗原などの、ＮＫ細胞の表面抗原に結合する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、細胞傷害性／食作用性免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びサイトカイン活性化好中球）をターゲットする。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、これらの免疫細胞により選択的に発現する、免疫グロブリンＧに対する高親和性受容体（ＦｃγＲＩ、別名ＣＤ６４）の非リガンド結合部位を介して結合（engage）され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーの第１の結合部位は、抗原提示細胞上のＣＤ４０などの表面抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞はマクロファージである。
免疫細胞エンゲージャーは、癌に関連した抗原、好ましくは固形腫瘍抗原に結合する第２の結合部位を含む。癌抗原には制限はない。いくつかの実施形態において、癌抗原は、ＣＥＡ、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、メゾテリン、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＰＳＭＡ１、ＬＡＰ３、ＡＮＸＡ３、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＭＵＣ１６、５Ｔ４、ＦＲα、ＭＵＣ２８ｚ、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＲＧ１β、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、カルボキシアンヒドラーゼ－ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１８．２、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ＣＸＣＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１特異的（ＲＯＲ１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エリスロポイエチン産生肝細胞癌Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＤＬＬ３、グリピカン－３、上皮細胞接着分子、ＧＵＣＹ２Ｃ（グアニル酸シクラーゼ２Ｃ）、及びダブルコルチン様キナーゼ１（ＤＣＬＫ１）、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ－カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、並びにＥｒｂＢ３から選択される。例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Ｍａｒｏｆｉら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ １２、８１（２０２１）参照。
いくつかの実施形態において、癌に関連した抗原は、メゾテリン、Ｔｒｏｐ２、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される。好ましい実施形態において、抗原は、メゾテリン、Ｔｒｏｐ２、及びＭＵＣ１から選択される。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＴｒｏｐ２と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３及びＴｒｏｐ２と結合する免疫細胞エンゲージャーは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、配列番号１０３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＴｒｏｐ２と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３に結合しかつ配列番号４７～５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第１の結合部位；Ｔｒｏｐ２に結合しかつ配列番号６８～７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第２の結合部位を含み、配列番号１０３又は配列番号７４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のメゾテリンと結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３及びメゾテリンと結合する免疫細胞エンゲージャーは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、配列番号１０４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のメゾテリンと結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３に結合しかつ配列番号５４～５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第１の結合部位；メゾテリンに結合しかつ配列番号８２～８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第２の結合部位を含み、配列番号１０４又は配列番号８８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＭＵＣ１と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３及びＭＵＣ１と結合する免疫細胞エンゲージャーは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、配列番号１０５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＭＵＣ１と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３に結合しかつ配列番号５４～５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第１の結合部位；ＭＵＣ１に結合しかつ配列番号７５～８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、第２の結合部位を含み、配列番号１０５又は配列番号８１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＴｒｏｐ２と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号５３及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＴｒｏｐ２と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のメゾテリンと結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号６０及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のメゾテリンと結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＭＵＣ１と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号６０及び配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３及び癌細胞上のＭＵＣ１と結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024519041000004
固形腫瘍を含む癌には、特に制限はない。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーに結合する腫瘍抗原を発現する癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌、メラノーマ、肺癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、脳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、又は肝臓癌のうちのいずれか１つである。上記に列挙された癌の全てが、１）Ｔ細胞上のＣＤ３及びメゾテリンと結合する免疫細胞エンゲージャー；２）Ｔ細胞上のＣＤ３及びＴｒｏｐ２と結合する免疫細胞エンゲージャー；３）Ｔ細胞上のＣＤ３及びＭＵＣ１と結合する免疫細胞エンゲージャー；又は４）本明細書記載されかつ本明細書に記載された癌抗原のいずれかと結合する免疫細胞エンゲージャーのいずれかで、処置することができる。
いくつかの実施形態において、腫瘍は卵巣癌腫瘍であり、抗原は、メゾテリン、糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＭＵＣ１６、Ｈｅｒ２、５Ｔ４、及びＦＲαのうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は乳癌腫瘍であり、抗原は、ＭＵＣ２８ｚ、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＲＧ１β、及びＨＥＲ２のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は前立腺癌腫瘍であり、抗原は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は腎癌腫瘍であり、抗原は、カルボキシアンヒドラーゼ－ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）である。
いくつかの実施形態において、腫瘍は胃癌腫瘍であり、抗原は、Ｔｒｏｐ２、クローディン１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、及びＨＥＲ２のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は膵臓癌腫瘍であり、抗原は、メゾテリン、ＭＵＣ１、ＣＸＣＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＰＳＣＡ、ＣＥＡ、及びＨｅｒ－２のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は肺癌腫瘍であり、抗原は、メゾテリン、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１特異的（ＲＯＲ１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エリスロポイエチン産生肝細胞癌Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、及びＤＬＬ３のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は肝臓癌腫瘍であり、抗原は、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、グリピカン－３、及び上皮細胞接着分子のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は結腸直腸癌腫瘍であり、抗原は、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＧＵＣＹ２Ｃ（グアニル酸シクラーゼ２Ｃ）、ＴＡＧ－７２ダブルコルチン様キナーゼ１（ＤＣＬＫ１）、及びＣＥＡのうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、患者へ与えられている操作型免疫細胞によって生成される。いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは操作型Ｔ細胞によって生成される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現は、操作型Ｔ細胞において低下し又は抑制される。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、精製されたタンパク質として患者へ投与される。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、患者によって産生された非操作型免疫細胞へ特異的に方向づけられる。そのような免疫細胞は、好ましくは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）から選択される。免疫細胞エンゲージャーは好ましくは、患者の免疫細胞を活性化する効果を有する免疫細胞の活性化受容体複合体に結合する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは少なくとも以下に結合する：
－ ＣＤ３及びメゾテリン；並びに／又は
－ ＣＤ３及びＴｒｏｐ２；並びに／又は
－ ＣＤ３及びＭＵＣ１；並びに／又は
－ ＣＤ３及びＥＧＦＲ；並びに／又は
－ ＣＤ３及びＶＥＧＦ。
いくつかの実施形態によれば、免疫細胞エンゲージャーは少なくとも以下に結合する：
－ ＣＤ１６及びメゾテリン；並びに／又は
－ ＣＤ１６及びＴｒｏｐ２；並びに／又は
－ ＣＤ１６及びＭＵＣ１；並びに／又は
－ ＣＤ１６及びＥＧＦＲ；並びに／又は
－ ＣＤ１６及びＶＥＧＦ。
いくつかの実施形態によれば、免疫細胞エンゲージャーは少なくとも以下に結合する：
－ ＣＤ４０及びＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ；並びに／又は
－ ＣＤ４０及びＴｒｏｐ２；並びに／又は
－ ＣＤ４０及びＭＵＣ１；並びに／又は
－ ＣＤ４０及びＥＧＦＲ；並びに／又は
－ ＣＤ４０及びＶＥＧＦ。
患者に投与され、又は患者に投与される上記のような操作型免疫細胞において発現された免疫細胞エンゲージャーは、好ましくは、表５において言及されたポリペプチド配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％又は９９％配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
Figure 2024519041000005
Figure 2024519041000006
いくつかの実施形態において、本発明に用いることができる免疫細胞エンゲージャーは、下記の表６に示された二重特異性抗体の１つ又は複数を含む。
Figure 2024519041000007
操作及び遺伝子編集
細胞を操作又は遺伝子編集するために本明細書で用いることができる方法は、特に制限はない。いくつかの実施形態において、細胞を、細胞を改変し得る配列特異的試薬と接触させる。「配列特異的試薬」とは、「標的配列」と呼ばれる、ゲノム座における選択されたポリヌクレオチド配列を特異的に認識する能力を有する任意の活性分子を意味し、その標的配列は、一般的に、上記ゲノム座の発現を改変するということを考慮して、少なくとも９ｂｐ長、より好ましくは少なくとも１０ｂｐ長、さらにより好ましくは少なくとも１２ｐｂ長である。上記発現は、コード若しくは制御ポリヌクレオチド配列への変異、欠失、若しくは挿入により、エピジェネティック変化、例えばメチル化若しくはヒストン改変により、又は転写因子若しくはポリメラーゼに相互作用することによって転写レベルで干渉することにより、改変することができる。
配列特異的試薬の例は、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡガイド、ＲＮＡｉ、メチラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼなどの末端プロセシング酵素、より特に、例として、Ｈｅｓｓ，Ｇ．Ｔ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅｓ（２０１７） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．６８（１）：２６～４３）及びＬｉｕら（Ｒｅｅｓ，Ｈ．Ａ．＆ Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９、７７０～７８８（２０１８））により記載されているように、必ずしもヌクレアーゼによる切断に頼ることなしに塩基編集（すなわち、ヌクレオチド置換）を実施するようにＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムと共役したものなどのシチジンデアミナーゼである。
一態様によれば、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、ＴＣＲのコンポーネントをコードするポリヌクレオチド配列に対して方向づけられた低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現する。
別の態様によれば、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、ＴＣＲのコンポーネントをコードするポリヌクレオチド配列に対して方向づけられた低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、加えて、β２Ｍをコードするポリヌクレオチド配列に対して方向づけられた低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び／又はＣＤ３をコードするポリヌクレオチド配列に対して方向づけられた低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現する。
本発明の別の実施形態によれば、配列特異的試薬は、好ましくは、配列特異的ヌクレアーゼ試薬、例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼのようなレアカッティングエンドヌクレアーゼのようなエンドヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰのようなガイド型エンドヌクレアーゼと共役したＲＮＡガイドである。
本発明は、遺伝子編集技術を通して、特に遺伝子ターゲット化組込みにより、免疫細胞の治療的潜在能力を向上させることを目標とする。
「遺伝子ターゲティング組込み」とは、ゲノムコード配列を生細胞へ挿入し、置き換え、又は補正することを可能にする任意の既知の部位特異的方法を意味する。
本発明の好ましい態様によれば、遺伝子ターゲット化組込みは、少なくとも１つの外因性ヌクレオチド、好ましくは数個のヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）の配列、より好ましくはコード配列による、ターゲットされた遺伝子の挿入又は置き換えを生じる、ターゲットされた遺伝子の座における相同遺伝子組換えを含む。
「ＤＮＡ標的」、「ＤＮＡ標的配列」、「標的ＤＮＡ配列」、「核酸標的配列」、「標的配列」、又は「プロセシング部位」とは、本発明による配列特異的ヌクレアーゼ試薬によりターゲットされ、プロセシングされ得るポリヌクレオチド配列を意図される。これらの用語は、特定のＤＮＡ位置、好ましくは細胞におけるゲノム位置を指すが、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾンなど、遺伝物質の本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部分、又は非限定的例としてミトコンドリアなどのオルガネラにおける、特定のＤＮＡ位置も指す。ＲＮＡガイド型標的配列の非限定的例としては、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを所望の座へ方向づけるガイドＲＮＡをハイブリダイズすることができるゲノム配列である。
「レアカッティングエンドヌクレアーゼ」は、それらの認識配列が一般的に、連続した１０～５０塩基対、好ましくは１２～３０ｂｐ、より好ましくは１４～２０ｂｐの範囲である限りにおいて、より抜きの配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬である。
本発明の好ましい態様によれば、上記エンドヌクレアーゼ試薬は、例としてＡｒｎｏｕｌｄ Ｓ．ら（国際公開第２００４０６７７３６号）により記載されているようなホーミングエンドヌクレアーゼ、例としてＵｒｎｏｖ Ｆ．ら（Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６～６５１）により記載されているようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、例としてＭｕｓｓｏｌｉｎｏら（Ａ ｎｏｖｅｌ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｔｏｘｉｃｉｔｙ（２０１１） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２８３～９２９３）により記載されているようなＴＡＬＥヌクレアーゼ、又は例としてＢｏｉｓｓｅｌら（ＭｅｇａＴＡＬｓ：ａ ｒａｒｅ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（４）：２５９１～２６０１）により記載されているようなＭｅｇａＴＡＬヌクレアーゼなどの、「操作型」又は「プログラム可能な」レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸である。
別の態様によれば、エンドヌクレアーゼ試薬は、とりわけ、参照により本明細書に組み入れられている、Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．及びＣｈａｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（２０１４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６（６２１３）：１０７７）による教示のように、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１などのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと共に用いられ得るＲＮＡガイドである。
本発明の好ましい態様によれば、エンドヌクレアーゼ試薬は、細胞へ一過性に発現する、つまり、上記試薬が、ＲＮＡ、より特にｍＲＮＡ、タンパク質、又はタンパク質と核酸を混合する複合体（例えば、リボヌクレオタンパク質）の場合であるなど、ゲノムへ組み込まれ又は長期間にわたって持続することを想定されていないことを意味する。
ｍＲＮＡ型でのエンドヌクレアーゼは、好ましくは、例として、Ｋｏｒｅ Ａ．Ｌ．ら（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ （ＬＮＡ）－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍＲＮＡ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｕｅ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（２００９） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３１（１８）：６３６４～５）により記載されているように、当技術分野においてよく知られた技術により、それの安定性を増強するためにキャップと共に合成される。
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、並びに細胞を遺伝子改変するための本明細書に記載されたタンパク質及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段によってインビボ又はエクスビボで送達され得る。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞の外側で産生され、その後、細胞へ導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入するための方法は、当技術分野において知られており、それには、非限定的例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換方法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換方法、及びウイルス媒介性方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム、及びその他同種類のものにより細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換方法には、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、又は微粒子銃が挙げられる。ポリヌクレオチドは、細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より特に、プラスミド又はウイルスに含まれ得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、エンドヌクレアーゼ試薬をコードする核酸をトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ試薬の８０％は、トランスフェクション後３０時間目まで、好ましくは２４時間目まで、より好ましくは２０時間目までに分解される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているようにヌクレアーゼ及び／又はドナー構築物はまた、（１つ若しくは複数の）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、（１つ若しくは複数の）ジンクフィンガー又はＴＡＬＥＮタンパク質のうちの１つ又は複数をコードする配列を含有するベクターを用いて送達され得る。
任意のベクター系を用いることができ、そのベクター系には、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられるが、それらに限定されない。全体が参照により本明細書に組み入れられた、米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；及び第７，１６３，８２４号もまた参照。さらに、これらのベクターのいずれかが、処置に必要とされる配列のうちの１つ又は複数を含み得ることは明らかだろう。したがって、１つ又は複数のヌクレアーゼ及びドナー構築物が細胞へ導入される場合、ヌクレアーゼ及び／又はドナーポリヌクレオチドは、同じベクター又は異なるベクターにおいて運ばれ得る。複数のベクターが用いられる場合、各ベクターは、１つ又は複数のヌクレアーゼ及び／又はドナー構築物をコードする配列を含み得る。
通常のウイルス及び非ウイルスに基づいた遺伝子移入方法が、細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織においてヌクレアーゼ及びドナー構築物をコードする核酸を導入するために用いることができる。
ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後、エピソームゲノムか又は組み込まれたゲノムかのいずれかを生じる、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の概説について、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８～８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１～２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２～１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７～１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５～４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９～１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５～３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１～４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＢｏｈｍ（編）（１９９５）；並びにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３～２６（１９９４）を参照。
いくつかの実施形態において、核酸の非ウイルス送達の方法には、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ化ＲＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの、作用物質により増強された取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いた、ソノポレーションもまた、核酸の送達のために用いることができる。
一般的に、ＰＢＭＣなどのプライマリー免疫細胞をトランスフェクトするために用いられる電気穿孔ステップは、典型的には、例えば、参照により組み入れられている国際公開第２００４／０８３３７９号、特に２３ページ、２５行目～２９ページ、１１行目に記載されているように、処理体積全体にわたって実質的に均一な、１００ボルト／ｃｍより高くかつ５，０００ボルト／ｃｍより低い、平行板電極間にパルス電場を生じる平行板電極を含む密閉チャンバーにおいて実施される。１つのそのような電気穿孔チャンバーは、好ましくは、チャンバー体積（ｃｍ３）で割った電極ギャップの二乗（ｃｍ２）の商により定義される幾何学的因子（ｃｍ－１）であって、その幾何学的因子が０．１ｃｍ－１であり、細胞及び配列特異的試薬の懸濁液が、０．０１～１．０ミリシーメンスに及ぶ範囲での伝導度を有するように調整されている培地中にある、幾何学的因子を有する。一般的に、細胞の懸濁液は、１回又は複数のパルス電場を受ける。その方法に関して、懸濁液の処理体積は、拡大縮小可能であり、チャンバーにおける細胞の処理の時間は、実質的に均一である。
いくつかの実施形態において、異なる導入遺伝子又は導入遺伝子の複数コピーを１つのベクター内に含むことができる。ベクターは、２Ａペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含み得る。ピコウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、１つのコドンから次のコドンへ、そのコドンによってコードされた２個のアミノ酸の間にペプチド結合の形成なしで、リボソームの「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：１０１３～１０２５（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ら、Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：１３～２１（１９９７）；Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｍｏｌ．Ａｎｄ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８（１３）：４２２７～４２３９（２００８）；Ａｔｋｉｎｓら、ＲＮＡ １３：８０３～８１０（２００７）参照）。
「コドン」とは、リボソームにより１個のアミノ酸残基へ翻訳される、ｍＲＮＡ上（又はＤＮＡ分子のセンス鎖上）の３ヌクレオチドを意味する。したがって、２つのポリペプチドが、ｍＲＮＡ内の単一の連続したオープンリーディングフレームから合成され得、その時、そのポリペプチドが、インフレームである２Ａオリゴペプチド配列によって分離されている。そのようなリボソームスキップ機構は当技術分野においてよく知られており、単一のメッセンジャーＲＮＡによりコードされるいくつかのタンパク質の発現のために、いくつかのベクターによって用いられていることが知られている。
一実施形態において、本発明による配列特異的試薬をコードするポリヌクレオチドは、例えば電気穿孔により、細胞へ直接的に導入されるｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、材料の細胞への送達のために、パルス電場の使用により、生細胞を一過性に透過性にすることを可能にするｃｙｔｏＰｕｌｓｅテクノロジーを用いて電気穿孔することができる。ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（ＢＴＸ Ｈａｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、８４ Ｏｃｔｏｂｅｒ Ｈｉｌｌ Ｒｏａｄ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．０１７４６、ＵＳＡ）電気穿孔波形の使用に基づいたテクノロジーは、パルス持続時間、強度、加えて、パルス間の間隔の精密制御をかなえる（米国特許第６，０１０，６１３号及び国際公開第２００４／０８３３７９号参照）。全てのこれらのパラメーターは、最小の失敗率で高いトランスフェクション効率のための最善の条件に達するために改変することができる。最初の高い電場パルスは、ポア形成を可能にし、一方、引き続いてのより低い電場パルスは、ポリヌクレオチドを細胞へ移動させることを可能にする。
追加の例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第６，００８，３３６号参照）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；第４，９４６，７８７号；及び第４，８９７，３５５号に記載され、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適しているカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒの脂質（国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号）が挙げられる。
脂質：核酸複合体、例えば、免疫脂質複合体などのターゲット化リポソームの調製は、当業者によく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４～４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１～２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２～３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７～６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０～７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７～４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、及び第４，９４６，７８７号参照）。
いくつかの実施形態において、ドナー配列及び／又は配列特異的試薬は、ウイルスベクターによりコードされる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスに基づいた系を用いることができる。アデノウイルスに基づいたベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高い力価及び高いレベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に単純なシステムにおいて大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸及びタンパク質のインビトロ産生において、並びにインビボ及びエクスビボでの遺伝子治療手順のために、標的核酸を細胞に形質導入するために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８～４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３～８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、いくつかの刊行物に記載されており、その刊行物には、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１～３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２～２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ ８１：６４６６～６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２～３８２８（１９８９）が挙げられる。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥の非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づいた有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ １４５ｂｐ末端逆位配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みによる効率的な遺伝子移入及び安定的な導入遺伝子送達は、このベクター系についての重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２～３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８～５５（１９９６））。他のＡＡＶ血清型、例えば、非限定的例による、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ ｒｈ１０、並びにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、及びＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶもまた本発明に従って用いることができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、ＡＡＶベクターと併用して、１つ又は複数のカスパーゼ阻害剤の有効量を投与される。
いくつかの実施形態において、ドナー配列及び／又は配列特異的試薬は、組換えレンチウイルスベクター（ｒＬＶ）によりコードされる。
ヌクレアーゼコード配列及びドナー構築物は、同じ又は異なる系を用いて送達することができる。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、ウイルスベクターによって運ぶことができ、一方、１つ又は複数のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ組成物として送達することができる。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数の試薬は、ナノ粒子を用いて、細胞へ送達することができる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ＣＤ１０５（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１７８１３）などのＨＳＣ表面タンパク質に対して特異的親和性を有する抗体などのリガンドでコーティングされる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ポリヌクレオチド型での配列特異的試薬がポリ（ベータ－アミノエステル）のポリマーと複合体化されかつポリグルタミン酸（ＰＧＡ）でコーティングされている、生分解性ポリマーナノ粒子である。
ＴＡＬＥヌクレアーゼは、それらの、より高い特異性により、特にヘテロダイマーの形 － すなわち、例としてＭｕｓｓｏｌｉｎｏら（ＴＡＬＥＮ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（２０１４） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（１０）：６７６２～６７７３）により報告されているように、「右」モノマー（「５’」又は「フォワード」とも呼ばれる）と「左」モノマー（「３’」又は「リバース」とも呼ばれる）での対によって働く － において、治療的適用のための特に適切な配列特異的ヌクレアーゼ試薬であることが証明されている。
前で述べられているように、配列特異的試薬は、好ましくは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ又はそのサブユニットをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ型などの核酸の形をとるが、それらはまた、いわゆる「リボヌクレオタンパク質」などの（１つ又は複数の）ポリヌクレオチドと（１つ又は複数の）ポリペプチドを含むコンジュゲートの一部でもあり得る。そのようなコンジュゲートは、Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ら（Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ（２０１５） Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９～７７１）によりそれぞれ記載されているように、それぞれのヌクレアーゼと複合体化することができるＲＮＡ又はＤＮＡガイドを含むＣａｓ９又はＣｐｆ１（ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ）としての試薬で形成することができる。
「外因性配列」は、最初には、選択された座に存在しなかった任意のヌクレオチド又は核酸配列を指す。この配列は、ゲノム配列と相同若しくはゲノム配列のコピーであり得、又は細胞へ導入される外来配列であり得る。対立するものとして、「内因性配列」は、座に最初に存在した細胞ゲノム配列を意味する。
本明細書で用いられる場合、「ドナー構築物」又は「ドナーポリヌクレオチド」は、ターゲットされた遺伝子に挿入され、又はターゲットされた遺伝子を置き換えるための外因性ヌクレオチド配列を含む。ドナー構築物は、本明細書で記載されたＣＡＲ、並びに／又は本明細書で記載されたような免疫チェックポイントアンタゴニスト及び／若しくは免疫細胞エンゲージャーをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
ＣＡＲ、特に、本明細書で記載された抗ＦＡＰ ＣＡＲの、上記の免疫細胞、特にＴ細胞における安定的発現は、例えば、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）又はトランスポゾン／トランスポザーゼ系又はプラスミド又はＰＣＲ産物組込みを用いて達成することができる。他のアプローチには、直接的ｍＲＮＡ電気穿孔が挙げられる。
ＴＲＡＣ、ＣＤ５２、及びβ２Ｍを発現する内因性遺伝子をターゲットするＴＡＬＥヌクレアーゼの非限定的例は表７に提供されている。本発明は、表７に言及された配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％又は９９％同一性を有する、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して、本明細書に記載されているように実施することができる。
Figure 2024519041000008
Figure 2024519041000009

Figure 2024519041000010

Figure 2024519041000011

Figure 2024519041000012
いくつかの実施形態において、抗ＦＡＰ ＣＡＲの発現のための外因性ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲ、ＨＬＡ、β２ｍ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ６９、ＩＬ２Ｒａ、及び／又はＣＤ５２により制御され、又はそれらをコードする座において組み込むことができる。結果として、これらの実施形態において、ターゲットされた遺伝子の発現が低下し又は抑制される。
いくつかの実施形態において、ベクターは、キメラ受容体、例として、抗ＦＡＰキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性配列を含むことができ、そのキメラ受容体は、任意選択で、免疫チェックポイントアンタゴニスト又は免疫細胞エンゲージャーと同時発現する。
ＣＡＲ及び／又は他の外因性遺伝的配列をコードする配列の遺伝子ターゲット化挿入は、ＡＡＶベクター、特に、ＡＡＶ６ファミリー由来のベクター又はＳｈａｒｍａ Ａ．ら（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＡＡＶ ２／６， ２／８ ａｎｄ ２／９ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．（２０１０） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．８１（２－３）：２７３～２７８）により以前記載されたキメラベクターＡＡＶ２／６を用いることにより実施することができる。
したがって、本発明の一態様は、前に引用された座において遺伝子組込みを増加させるために、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼなどの配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬の発現と併せた、ヒトプライマリーＴ細胞における、ＣＡＲ、特に、本明細書で記載されているような抗ＦＡＰ ＣＡＲをコードするそのようなＡＡＶベクターの形質導入である。
本発明の別の態様は、前に引用された遺伝子（例えば、ＴＣＲ、ＨＬＡ、β２ｍ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ６９、ＩＬ２Ｒａ、及び／又はＣＤ５２）を不活性化するための、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼなどの配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬の導入前又は後に実施することができる、ヒトプライマリーＴ細胞における、ＣＡＲ、特に本明細書で記載されているような抗ＦＡＰ ＣＡＲをコードする組換えレンチウイルスベクター（ｒＬＶ）の形質導入である。
この発明の好ましい態様によれば、配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬は、上記配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬をコードするｍＲＮＡのトランスフェクション、より好ましくは、電気穿孔により、細胞へ導入することができる。
したがって、本発明は、以下のステップの少なくとも１つを含む、前に引用された座の１つにおいて、ＣＡＲ、特に本明細書に記載されているような抗ＦＡＰ ＣＡＲをコードする外因性核酸配列を挿入するための方法を提供する：
－ 抗ＦＡＰ ＣＡＲをコードする外因性核酸配列、及びターゲットされた内因性ＤＮＡ配列と相同的な配列を含むＡＡＶベクターを上記細胞へ形質導入するステップ；並びに、任意選択で
－ 挿入の座における上記内因性配列を切断するための配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬の発現を誘導するステップ。
外因性核酸配列の得られた挿入は、結果として、遺伝物質の導入及び内因性配列の置き換え、並びに、したがって、内因性座の不活性化を生じ得る。
本発明の１つの目的として、方法に用いられるＡＡＶベクターは、「プロモーターをもたない」外因性コード配列を含むことができ、そのコード配列は、この明細書で言及されたもののいずれかである。
当技術分野において知られた多くの他のベクター、例えば、プラスミド、エピソームベクター、直鎖状ＤＮＡマトリックスなどもまた、本発明の教示に従うことにより、それらの座において遺伝子挿入を実施するために用いることができる。
前に述べられているように、本発明による遺伝子組込みのために用いられるＤＮＡベクターは以下を含む：（１）本明細書で記載されているような抗ＦＡＰ ＣＡＲの外因性コード配列を含む、挿入されるべき外因性核酸、及び（２）挿入を促進する配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬をコードする配列。より好ましい態様によれば、（１）における上記外因性核酸は、いかなるプロモーター配列も含まないが、（２）における配列はそれ自体のプロモーターを有する。
別の態様によれば、上記抗ＦＡＰ ＣＡＲは多重鎖ＣＡＲである場合、（１）における核酸は、挿入された外因性コード配列がマルチシストロン性であるように、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は「自己切断性」２Ａペプチド、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａをさらに含む。ＩＲＥＳ又は２Ａペプチドは、上記外因性コード配列に先行し又は後に続き得る。
上記抗ＦＡＰ ＣＡＲの発現のための外因性ポリヌクレオチド配列の組込みはまた、ウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いることにより、Ｔ細胞へ導入することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載されているような抗ＦＡＰ ＣＡＲをコードするウイルスベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明によるレンチウイルス又はＡＡＶベクターは、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ配列によって分離された抗ＦＡＰ ＣＡＲの異なるエレメントをコードする配列を、１つの転写ユニットを形成するように、含むことができる。レンチウイルスベクターにおいて、上記配列は、一般的に、ヒトＥＥＦ１Ａ１遺伝子に由来したＥＦ１アルファプロモーターなどの構成的外因性プロモーターの調節下で転写される発現カセットを形成する。
Ｔ細胞の活性化及び増殖
遺伝子改変の前又は後に関わらず、本発明による免疫細胞は、たとえそれらが、抗原結合機構とは無関係に活性化又は増殖することができるとしても、活性化又は増殖させることができる。特に、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；及び第７，５７２，６３１号に記載されているような方法を用いて活性化及び増殖させることができる。Ｔ細胞はインビトロ又はインビボで増殖させることができる。Ｔ細胞は、一般的に、Ｔ細胞のための活性化シグナルを生じるために、Ｔ細胞の表面の、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体及び共刺激分子を刺激する作用物質との接触により増殖される。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール １２－ミリステート １３－アセテート（ＰＭＡ）、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような分裂促進性レクチンなどの化学物質が、Ｔ細胞のための活性化シグナルを生じさせるために用いることができる。
非限定的例として、Ｔ細胞集団は、表面に固定化された、抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、若しくは抗ＣＤ２抗体との接触による、又はカルシウムイオノフォアと共でのプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触によるなど、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面のアクセサリー分子の共刺激について、アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、Ｔ細胞の集団は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で接触させることができる。Ｔ細胞培養に適切な条件は、増殖及び生存能に必要な因子、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦｐ、及びＴＮＦ、又は当業者に知られた細胞の成長のための任意の他の添加物を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０、又はＸ－ｖｉｖｏ ５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、並びにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、それらに限定されない。培地には、無血清か、又は適切な量の血清（又は血漿）若しくは定義済みのセットのホルモン、並びに／若しくはＴ細胞の成長及び増殖に十分な量の（１つ又は複数の）サイトカインを追加したかのいずれかでの、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンを加えた、ＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、ＯｐｔＴｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンが、実験培養においてのみ含まれ、対象へ注入されることになっている細胞の培養においては含まれない。標的細胞は、成長を支援するために必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気プラス５％Ｃ０２）の下で維持される。様々な刺激回数に曝されたＴ細胞は、異なる特性を示し得る。
別の特定の実施形態において、上記細胞は、組織又は細胞との共培養により増殖することができる。上記細胞はまた、インビボで、例えば、上記細胞を対象へ投与した後の対象の血液中で、増殖することができる。
例として、サイトカイン産生及び分泌、脱顆粒、増殖、又はそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲを発現する操作型免疫細胞により示された任意の生物学的活性を決定することができる。
特定の場合において、ステップ（ｉｉｉ）において決定される生物学的活性は、サイトカイン分泌、細胞増殖、又は両方である。
生物学的活性は、当業者によりよく知られた標準方法、特にインビトロ及び／又はエクスビボでの方法により、測定することができる。
任意のサイトカインの分泌を測定することができ、特にＩＦＮγ、ＴＮＦαの分泌を決定することができる。サイトカイン分泌を決定するための標準方法には、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーが挙げられる。これらの方法は、例として、Ｓａｃｈｄｅｖａら（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ、２００７、１２：４６８２～９５）及びＰｉｋｅら（２０１６）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４５８巻 Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）に記載されている。
サイトカイン分泌のレベルは、例として、１個のＣＡＲ発現免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）あたり分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）の最大レベル、例えば、１個のＣＡＲ－Ｔ細胞あたり分泌されたＩＦＮγの最大量として測定することができる。
「脱顆粒」を評価するために、例として、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ、又は分泌グランザイムＢ若しくはパーフォリンの測定を含む標準方法を用いることができる（例えば、Ｌｏｒｅｎｚｏ－Ｈｅｒｒｅｒｏら［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （２０１９） １８８４：１１９～１３０；Ｂｅｔｔｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４） ７５：４９７～５１２］に記載されている）。
「増殖」活性を評価するために、ＤＮＡ合成の測定、増殖特異的マーカー、細胞膜結合色素の使用による連続的な細胞分裂の測定、細胞ＤＮＡ含有量の測定、及び細胞代謝の測定を含む方法に主に基づいている、標準方法を行うことができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞が、特にそれらの細胞傷害性活性に関して、それらの完全な免疫治療的潜在能力を保つように、約１５～３０日間、好ましくは１５～２０日間の間、最も好ましくは１８～２０日間の間の限られた時間枠内で操作型Ｔ細胞を産生することを可能にする。
これらの細胞は、好ましくは単一のドナー又は患者が起源である、細胞集団に由来し又はその細胞集団のメンバーであり得る。いくつかの実施形態において、これらの細胞集団は、最も高い製造実践必要条件に応じるように、閉鎖培養容器下で増殖することができ、患者への注入前に凍結し、それにより、「オフザシェルフ」又は「すぐに使える」治療用組成物を提供することができる。
いくつかの実施形態において、同じ白血球除去法から生じたかなりの数の細胞を得ることができ、そのことは、患者を処置するための十分な用量を得るために重要であり得る。様々なドナーが起源である細胞集団間の変動が観察され得るが、白血球除去法により調達された免疫細胞の数は、一般的に、約１０８～１０１０細胞のＰＢＭＣである。ＰＢＭＣは、いくつかの型の細胞：顆粒球、単球、及びリンパ球を含み、ＰＢＭＣの中では３０～６０％のＴ細胞であり、それは、一般的に、１つのドナー由来の１０８～１０９個のプライマリーＴ細胞を表す。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、一般的に、約１０８個より多いＴ細胞、より一般的には約１０９個より多いＴ細胞、さらにより一般的には約１０１０個より多いＴ細胞、通常には１０１１個より多いＴ細胞に達する操作型細胞の集団という結果になる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、少なくとも２つの異なる座において遺伝子編集される。
したがって、そのような操作型細胞の組成物又は集団は、とりわけ本明細書における癌のいずれかを処置するための、特に、メラノーマ、神経芽細胞腫、グリオーマ、又は肺、乳房、結腸、前立腺、若しくは卵巣腫瘍などの癌腫などの患者における固形腫瘍の処置のための、治療用物質として、それを必要としている患者において用いることができる。
本発明は、より特には、単一ドナーが起源であるプライマリーＴＣＲネガティブＴ細胞の集団に関心があり、その場合、上記集団における細胞の少なくとも２０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％が、少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる座において配列特異的試薬を用いて改変されている。
「ＴＣＲネガティブ免疫細胞」とは、ＴＣＲの発現が天然で欠如している（すなわち、この細胞ＴＣＲネガティブを生成するために細胞を操作する必要がなく）か、又はその細胞が操作されてＴＣＲネガティブになっている場合には、非操作型細胞と比較して少なくとも５０％、低下しているかのいずれかである、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である。ＴＣＲネガティブ免疫細胞には、遺伝子改変（例えば、破壊）されているＴ細胞の受容体のコンポーネントをコードする内因性アレルの少なくとも１つを有し、その結果、上記操作型細胞におけるＴＣＲ発現が抑圧又は抑制されている免疫細胞が挙げられる。ＴＣＲネガティブ免疫細胞にはまた、ＮＫ細胞の場合であるなど、それらの天然の操作されていない状態で、一般的にＴＣＲ遺伝子を発現しない免疫細胞も挙げられる。
本発明による操作型プライマリー免疫細胞を含む処置は、寛解、治癒、又は予防であり得る。
いくつかの実施形態において、患者は、操作型Ｔ細胞の投与前に、準備的リンパ球除去 － 免疫系の一時的消失 － を受けることができる。いくつかの実施形態において、リンパ球除去は、患者の免疫系の部分的な消失のみであり、完全な消失ではない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２処置及び準備的リンパ球除去の併用が、細胞治療の持続を増強することができる。
いくつかの実施形態において、操作型抗ＦＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞は、例えばシクロホスファミドを投与することによる、リンパ球除去のコース有り又は無しで、約１０６～１０９細胞／ｋｇの量で投与することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載された操作型抗ＦＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞又は細胞集団は、体重１ｋｇあたり約１０４～１０９細胞、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（それらの範囲内の全ての整数値の細胞数を含む）の量で投与される。ＣＡＲ－Ｔ細胞治療における投薬は、例えばシクロホスファミドでのリンパ球除去のコース有り又は無しで、例えば、１０５又は１０６細胞／ｋｇから１０９細胞／ｋｇまでの投与を含み得る。
細胞又は細胞集団は、１つ又は複数の用量で投与することができる。別の実施形態において、有効量の細胞が単一用量として投与される。別の実施形態において、有効量の細胞が、ある期間にわたって１つより多い用量として投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞又は細胞集団は、血液バンク又はドナーなどの任意の源から入手され得る。個々のニーズは様々であるが、特定の疾患又は状態についての所定の細胞型の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の能力の範囲内である。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントアンタゴニストは、約２００ｍｇ～４００ｍｇ（それらの範囲内の全ての整数値を含む）の量で静脈内に投与することができる。免疫チェックポイントアンタゴニストは、１つ又は複数の用量で投与することができる。ある実施形態において、有効量の免疫チェックポイントアンタゴニストが単一用量として投与される。別の実施形態において、有効量の免疫チェックポイントアンタゴニストが、ある期間にわたって１つより多い用量として投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。免疫チェックポイントアンタゴニストの投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後１週間目又は２週間目、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後約１週間目若しくは２週間目から約３～１０カ月目の間、２週間目から８カ月目の間、又は２週間目から４カ月目の間に始まり得る。免疫チェックポイントアンタゴニストは、精製されたタンパク質として、又は上記免疫チェックポイントアンタゴニストを発現する操作型細胞を投与することにより間接的に、投与され得る。個々のニーズは様々であるが、特定の疾患又は状態についてのチェックポイントアンタゴニスト又はそれを発現する操作型細胞の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の能力の範囲内である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞エンゲージャーは、ある期間の間、一定流速での持続静脈内注入として、１日あたり約１０～５０マイクログラム（それらの範囲内の全ての整数値を含む）、例えば、約３０マイクログラム／日の用量で投与することができる。免疫細胞エンゲージャーは、１つ又は複数の用量で投与することができる。ある実施形態において、有効量の免疫細胞エンゲージャーが単一用量として投与される。別の実施形態において、有効量の免疫細胞エンゲージャーが、ある期間にわたって１つより多い用量として投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。免疫細胞エンゲージャーの投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後１週間目又は２週間目、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後約１週間目若しくは２週間目から約３～１０カ月目の間、２週間目から８カ月目の間、又は２週間目から４カ月目の間に始まり得る。
免疫細胞エンゲージャーは、精製されたタンパク質として、又は上記免疫細胞エンゲージャーを発現する操作型細胞を投与することにより間接的に、投与され得る。個々のニーズは様々であるが、特定の疾患又は状態についての免疫細胞エンゲージャー又はそれを発現する操作型細胞の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の能力の範囲内である。
ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイントアンタゴニスト、又は免疫細胞エンゲージャーの有効量は、治療的又は予防的ベネフィットを与える量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、及び体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、並びに望まれる効果の性質に依存する。
本発明による操作型Ｔ細胞と免疫療法での併用処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光治療、及び放射線療法の群から選択される、癌に対する１つ又は複数の治療とさらに併用して行われ得る。
不活性化ＴＣＲを含みかつＦＡＰ－ＣＡＲを発現する操作型Ｔ細胞に関して本明細書で記載されていることは、ＦＡＰ－ＣＡＲを発現する操作型ナチュラルキラー細胞にも等しく当てはめることができる。
そのような操作型ＮＫ細胞は、天然でＴＣＲネガティブである。本発明によるＮＫ細胞は、ドナー又はＮＫ９２細胞株などの細胞株が起源である。
任意選択で、上記操作型ＮＫ細胞は、遺伝子不活性化、及び／又は遺伝子サイレンシング、及び／又は上記ＮＫ細胞のゲノムのβ２Ｍ座へと、本明細書で定義されるＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを挿入することにより、媒介されたβ２Ｍ遺伝子の発現の低下を生じている。
上記操作型ＮＫ細胞は、遺伝子不活性化、及び／又は遺伝子サイレンシング、及び／又は上記ＮＫ細胞のゲノムのＣＤ５２座へと、本明細書で定義されるＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを挿入することにより、媒介されるＣＤ５２遺伝子の発現の低下を生じ得る。
一実施形態において、上記操作型ＮＫ細胞は、不活性化されたＣＤ５２か又は不活性化されたβ２Ｍ遺伝子のいずれかを含む。
したがって、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型ＮＫ細胞であって、ＣＡＲが
（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジアミノ酸配列、
（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインアミノ酸配列、並びに
（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインからのアミノ酸配列を含む細胞質ドメイン
を含み；
任意選択で、ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞において、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍ又はＨＬＡの発現を抑制又は抑圧するように遺伝子改変されている、操作型ＮＫ細胞もまた提供される。
本明細書で記載されているような類似したＦＡＰ－ＣＡＲを、上記ＮＫ細胞において発現させて、操作型ＣＡＲ－ＮＫ－ＦＡＰを生じさせることができ、それは、本明細書で記載されているように患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置と併用して、固形腫瘍の処置の方法において用いることができる。
したがって、（ｉ）任意選択で不活性化β２Ｍ遺伝子を含み、かつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型ＮＫ細胞（ＵＣＡＲＮＫ－ＦＡＰ）、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む医薬組成物であって、コンポーネント（ｉ）と（ｉｉ）の両方が別々の投与のために製剤化されている、医薬組成物もまた本明細書で記載される。
それを必要としている患者における固形腫瘍の処置での使用のための、任意選択で不活性化β２Ｍ遺伝子を含み、かつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型ＮＫ細胞（ＵＣＡＲＮＫ－ＦＡＰ）を含む組成物であって、上記操作型ＮＫ細胞が、上記患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置と併用して投与される、組成物。
患者における固形腫瘍の処置での使用のための患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む組成物であって、上記免疫療法処置が、任意選択で不活性化β２Ｍ遺伝子を含み、かつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型ＮＫ細胞（ＵＣＡＲＮＫ－ＦＡＰ）と併用して投与される、組成物。
本発明の上で書かれた説明は、当業者が、それを作製しかつ使用することが可能になるように、それを作製しかつ使用する様式及び方法を提供し、この実施可能化は、特に、その最初の説明の一部を構成する、添付の特許請求の範囲の主題について、提供されている。
数値的限度又は範囲が本明細書で述べられている場合、その端点が含まれる。また、数値的限度又は範囲内の全ての値及び部分的範囲が、あたかも明確に書き出されているかのように、具体的に含まれる。
この発明を一般的に記載してきたが、ある特定の具体的な例を参照することにより、さらなる理解を得ることができ、その例は、例証のみを目的として本明細書に提供され、主張された発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１．レンチウイルス形質導入によるＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞作製
この実施例において、プライマリーＴ細胞は、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子をノックアウトするようにＴＡＬＥＮをトランスフェクトされ、ＦＡＰタンパク質に対するＣＡＲを発現するようにレンチウイルスを形質導入され得ることが示されている。
ＦＡＰ－ＣＡＲの発現
ＦＡＰ－ＣＡＲをプライマリーＴ細胞の表面に発現させるために、凍結保存されたＰＢＭＣを３７℃で解凍し、洗浄し、５％ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃での一晩のインキュベーションのために、ＡＢヒト血清（５％）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中に再懸濁した。その後、細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいてＡＢヒト血清（５％）及び組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２、３５０ＩＵ／ｍＬ）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（培養培地）中、Ｔｒａｎｓａｃｔで活性化した。活性化から３日後、Ｔ細胞に、配列番号１０の抗ＦＡＰ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有するレンチウイルス粒子を１５のＭＯＩで形質導入した。この実施例で用いられたヌクレオチド配列は配列番号１２９であった。
ＴＲＡＣ及びβ２Ｍのノックアウト
形質導入から２日後、抗ＦＡＰ－ＣＡＲ－Ｔ細胞に、ＴＲＡＣ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１０８及び配列番号１０９）の５μｇ及びβ２Ｍ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１１２及び配列番号１１３）の５μｇを電気穿孔した。トランスフェクションは、Ｐｕｌｓｅ Ａｇｉｌｅテクノロジーを用いて、０．４ｃｍギャップキュベットにおけるＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎバッファーＴ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中、８００Ｖにおける２回の０．１ｍＳパルス、続いて、１３０Ｖにおける４回の０．２ｍＳパルスを加えることにより実施された。その後、電気穿孔された細胞を、予熱されたＯｐｔｍｉｚｅｒ無血清培地中へすぐに移し、３７℃で１５分間、その後、３０℃で１６時間、インキュベートした。その後、細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養した。５日後、細胞を、抗ＦＡＰ－ＣＡＲ発現並びにＴＲＡＣ及びβ２Ｍノックアウトについて分析した。
結果は、操作型Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞が抗ＦＡＰ ＣＡＲを発現し、ＴＣＲα／β及びＨＬＡ－ＡＢＣの発現が欠損していたが、ｍｏｃｋトランスフェクトＴ細胞においてはＣＡＲ発現も遺伝子ノックアウトも検出することができなかったことを示した（図２）。
実施例２．ＡＡＶ６形質導入によるＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞作製
この実施例において、プライマリーＴ細胞は、ＴＲＡＣをノックアウトするようにＴＡＬＥＮをトランスフェクトされ得、ＦＡＰタンパク質に対するＣＡＲを発現させるようにＡＡＶ６を形質導入され得ることが示されている。
ＴＲＡＣのノックアウト及び抗ＦＡＰ－ＣＡＲのターゲット化発現
凍結保存されたＰＢＭＣを３７℃で解凍し、洗浄し、５％ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃での一晩のインキュベーションのために、ＡＢヒト血清（５％）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中に再懸濁した。その後、細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいてＡＢヒト血清（５％）及び組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２、３５０ＩＵ／ｍＬ）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（培養培地）中、Ｔｒａｎｓａｃｔで活性化した。活性化から３日後、増幅されたＴ細胞に、ＴＲＡＣ ＴＡＬＥＮアームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１０８及び配列番号１０９）の５μｇを電気穿孔した。トランスフェクションは、Ｐｕｌｓｅ Ａｇｉｌｅテクノロジーを用いて、０．４ｃｍギャップキュベットにおけるＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎバッファーＴ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中、８００Ｖにおける２回の０．１ｍＳパルス、続いて、１３０Ｖにおける４回の０．２ｍＳパルスを加えることにより実施された。その後、電気穿孔された細胞を、予熱されたＯｐｔｍｉｚｅｒ無血清培地中へすぐに移し、３７℃で１５分間、及び３０℃でさらに１５分間、インキュベートした。その後、細胞を、濃縮し、図２に描かれたドナーマトリックスのうちの１つを含むＡＡＶ６粒子（ＭＯＩ＝２．５Ｅ５ｖｇ／細胞）の存在下でインキュベートした。これらのドナーマトリックスは、３００ｂｐのＴＲＡＣ左及び右相同性アーム、配列番号１０の抗ＦＡＰ ＣＡＲの発現を可能にする自己切断性２Ａペプチドで構成される。３０℃での２時間の培養後、１０％ＡＢ血清及びＩＬ－２を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地を、細胞懸濁液へ加え、その混合物を、同じ培養条件下で１６時間、インキュベートした。引き続いて、細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養し、５日後、ＴＲＡＣノックアウト及び抗ＦＡＰ ＣＡＲ発現について分析した。
操作型ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の５９％より多くは、ＴＣＲα／βの発現が欠損し、かつ抗ＦＡＰ ＣＡＲを発現していたが、ｍｏｃｋトランスフェクトＴ細胞においてはＣＡＲ発現も遺伝子ノックアウトも検出することができなかった（図３）。
実施例３．トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者由来の癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に対するＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の特異的細胞溶解活性
実施例１において操作されたＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の細胞溶解活性を研究するために、関連ＣＡＦ（ＢｉｏＩＶＴから供給された）を、ＣＦＳＥ（０．５ｍＭ）で蛍光標識し、１：０、１：０．５、及び１：１のＣＡＦ：Ｔ細胞比でのｍｏｃｋ細胞か又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞かのいずれかと３７℃、５％ＣＯ２で１日間、共インキュベートした（図４Ａ）。ＣＦＳＥ標識ＣＡＦを収集し、固定可能な生死判別色素で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。生死判別色素が陽性であるＣＦＳＥ－ＣＡＦ細胞を、死細胞として定量化し、ＣＡＦ溶解のパーセンテージを、条件ごとに決定した（図４Ｂ）。
３つの異なるドナーに実施されたＣＡＦ生存定量化（図４Ｃ）は、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞が、ＣＡＦ標的細胞に対して溶解活性を成功裏に示したことを表している。
実施例４．トリプルネガティブ乳癌のＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ及びＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯでの組合せターゲティング
この実施例は、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置を他の腫瘍細胞抗原ターゲティングＵＣＡＲＴ、この実施例では、抗メゾテリンＵＣＡＲＴ（ＭＥＳＯ－ＵＣＡＲＴ）細胞と併用することの治療的優位性を実証している。
腫瘍－ＣＡＦスフェロイド播種
Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞の添加がＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞の全体的な抗腫瘍細胞傷害性を増強するかどうかを決定するために、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の３次元スフェロイドモデルを確立した。このモデルは、実際の腫瘍の空間的構成及び性質を含む腫瘍微小環境を模倣することを可能にする。ＧＦＰ及びレポーター遺伝子ナノルシフェラーゼを発現するように形質導入された１０４個のトリプルネガティブ乳房腫瘍細胞ＨＣＣ７０（ＨＣＣ７０－ＮＬ－ＧＦＰ）を、低接着性９６ウェル丸底プレートにおいてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中、単独か、又は１：１比でＴＮＢＣ由来ＣＡＦと共にかのいずれかで播種した。これらの条件下で、腫瘍細胞及びＣＡＦ細胞は、インビボ腫瘍性質を模倣するスフェロイドへと自分自身を組織化する。
Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ作製
メゾテリン－ＣＡＲ（ＭＥＳＯ－ＣＡＲ）をプライマリーＴ細胞の表面に発現させるために、凍結保存されたＰＢＭＣを３７℃で解凍し、洗浄し、５％ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃での一晩のインキュベーションのために、ＡＢヒト血清（５％）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中に再懸濁した。その後、細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいてＡＢヒト血清（５％）及び組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２、３５０ＩＵ／ｍＬ）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（培養培地）中、Ｔｒａｎｓａｃｔで活性化した。活性化から３日後、Ｔ細胞に、配列番号１０６のアミノ酸配列の抗ＭＥＳＯ ＣＡＲをコードする配列番号１２８の核酸配列を含有するレンチウイルス粒子を１５のＭＯＩで形質導入した。
形質導入から２日後、細胞に、ＴＲＡＣ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１０８及び配列番号１０９）の５μｇ及びβ２Ｍ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１１２及び配列番号１１３）の５μｇを電気穿孔した。トランスフェクションは、Ｐｕｌｓｅ Ａｇｉｌｅテクノロジーを用いて、０．４ｃｍギャップキュベットにおけるＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎバッファーＴ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中、８００Ｖにおける２回の０．１ｍＳパルス、続いて、１３０Ｖにおける４回の０．２ｍＳパルスを加えることにより実施された。その後、電気穿孔された細胞を、予熱されたＯｐｔｍｉｚｅｒ無血清培地中へすぐに移し、３７℃で１５分間、その後、３０℃で１６時間、インキュベートした。その後、細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養した。
腫瘍ＣＡＦスフェロイドに対するＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞及びＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰの併用の細胞溶解活性
腫瘍－ＣＡＦスフェロイドにおけるＨＣＣ７０－ＮＬ－ＧＦＰ腫瘍細胞に対するＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞の溶解活性を、スフェロイド播種から２日後、上記のようにプレーティングされたスフェロイドへＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯを、１：５の腫瘍細胞：ＣＡＲ－Ｔ比で加えることにより決定した。Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞との併用の潜在的優位性を決定するために、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰもまた、腫瘍－ＣＡＦスフェロイドへ５：１の腫瘍細胞：ＣＡＲ－Ｔ比で、単独か又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞と共にかのいずれかで加えた。ｍｏｃｋトランスフェクトされた非形質導入細胞を対照として用いた。ＵＣＡＲＴ細胞との共インキュベーションから７２時間後、ＨＣＣ７０－ＮＬ－ＧＦＰ溶解を、残存する生きているＨＣＣ７０－ＮＬ－ＧＦＰ細胞におけるナノルシフェラーゼ活性を決定するためのアッセイを製造会社の使用説明書（カタログ番号Ｎ１１１０、Ｐｒｏｍｅｇａ）の通り実施することにより決定した。Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ、加えてＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞は、腫瘍細胞の約５０％生存率を誘導することができた。最も重要なことには、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞のＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞との併用が、腫瘍細胞生存率を２６％へさらに低下させることができた。
全体的には、これらの結果は、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞とのＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞併用が、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ処置単独と比べて、腫瘍細胞溶解及び腫瘍－ＣＡＦスフェロイド退縮を有意に増強したことを示している（図５）。
これらの結果から、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰが、「冷たい」腫瘍（すなわち、Ｔ細胞殺滅に対して抵抗性）を「熱い」腫瘍（すなわち、Ｔ細胞殺滅を受けやすい）へ転換させ得ることが明らかにされている。したがって、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰは、より強い免疫応答を誘発するために他の免疫療法処置と併用するという可能性をもつ。
実施例５．マウスモデルにおけるＣＡＲ－Ｔ－ＦＡＰ及び抗ＰＤ－１抗体の併用
この実施例は、インビボで乳癌を処置するためにＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置を抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤と併用することの治療的優位性を実証する。
乳癌のマウスモデルの作製
インビボでＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置を抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤と併用することの治療的優位性を評価するために、ＴＩＬレベル及びチェックポイント阻害影響を評価するための無傷免疫系を有する腫瘍モデルが必要とされる。代替としてマウスＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞を有するマウス乳房腫瘍モデルを、概念実証のために作製した。
０．５×１０６個の４－Ｔ１マウス乳癌細胞（ＡＴＣＣ）を、週齢８週間の雌の免疫適格ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの左鼠径部乳腺脂肪体に正所性に移植した。生じた、樹立された乳腺腫瘍は、ヒト乳房腫瘍の生理機能を厳密に再現し、腫瘍微小環境における癌関連線維芽細胞及びＴ細胞浸潤の欠乏を有する（Ｌｉａｏ Ｄら ２００９、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、４：１１）。したがって、それは、ＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞のＣＡＦへの細胞傷害性活性及びＴ細胞腫瘍浸潤へのその後の効果を研究するための適切なモデルである。それは、ＣＡＲＴ－ＦＡＰと抗ＰＤ－１治療を併用することの潜在的優位性も実証する。
マウスＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞作製
プライマリーマウス脾臓Ｔ細胞を、「ＥａｓｙＳｅｐマウスＴ細胞単離キット」（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離し、ＤｙｎａｂｅａｄｓマウスＴ細胞アクチベーター（Ｇｉｂｃｏ）で、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２と共に一晩、活性化した。２４時間後、レトロネクチン（５０ｕｇ／ｍＬ；Ｔａｋａｒａ）でコーティングされた２４ウェルプレートにおいて、細胞（１×１０６細胞／ウェル）に、ヒト及びマウスＦＡＰに対して方向づけられた配列番号３１のアミノ酸配列のＣＬＳＦＡＰ３－ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有するレンチウイルス粒子を２５のＭＯＩで形質導入し、１２００ｇで、室温、４５分間、遠心分離した。一晩のインキュベーション後、細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２で、５％ＣＯ２の存在下、３７℃でさらに１４日間、増殖し、７日目にＤｙｎａｂｅａｄｓを用いて再活性化した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。その結果は、増殖後、Ｔ細胞の約３０％がＣＬＳＦＡＰ３－ＣＡＲを発現したことを示している（図６Ａ）。
正所性乳房腫瘍マウスモデルにおけるマウスＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞及び抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤の併用の抗腫瘍活性
抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤と併用したＣＡＲＴ－ＦＡＰの抗腫瘍効力を評価するために、上記のようにモデル化された４－Ｔ１乳房腫瘍を有するマウスを、腫瘍が約５０ｍｍ３の体積に達した時点で、１０×１０６個のマウスＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞か又は抗マウスＰＤ－１抗体（ＩｎＶｉｖｏＭａｂ抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）、クローン：ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）かのいずれかで処置した（図６Ｂ）。８日後（Ｄ１７）、これらのマウスのサブセットを安楽死させ、腫瘍を切除し、Ａｃｃｕｔａｓｅでの３７℃、１５分間の消化により単一細胞懸濁液へと処理した。腫瘍細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析により、ｍｏｃｋ又は抗ＰＤ－１処置コホートと比べて、ＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置腫瘍においてＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤（図６Ｃ）及び活性化（図６Ｄ）の有意な増加が明らかにされた。残りのマウスサブセットを、抗マウスＰＤ－１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、図６Ｂに概要が示されている通り）でさらに処置した。この追加の抗ＰＤ１処置は、ＣＡＲＴ－ＦＡＰで前処置されているだけのマウスコホートと比較してプライマリー乳房腫瘍の有意な退縮を生じた（図６Ｅ）。
したがって、これらの結果は、腫瘍においてＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤を促進し、かつさらに、腫瘍退縮の増強のために抗ＰＤ－１チェックポイント遮断との相乗作用を与えるＣＡＲＴ－ＦＡＰの能力を実証している。
実施例６．Ｂ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞、ＣＤ５２ ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞、及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体でのトリプルネガティブ乳癌の組合せターゲティング
この実施例は、インビボでトリプルネガティブ乳癌を処置するために、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置をＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ及び抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤と併用することの治療的優位性を実証する。
ヒトＵＣＡＲＴ細胞作製
Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞を、実施例１に記載されているように作製した。ＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯの作製を、以下の通り、実施した。凍結保存されたＰＢＭＣを３７℃で解凍し、洗浄し、５％ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃での一晩のインキュベーションのために、ＡＢヒト血清（５％）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中に再懸濁した。その後、細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいてＡＢヒト血清（５％）及び組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２、３５０ＩＵ／ｍＬ）を追加したＯｐＴｍｉｚｅｒ培地（培養培地）中、Ｔｒａｎｓａｃｔで活性化した。活性化から３日後、Ｔ細胞に、配列番号１０６の抗ＭＥＳＯ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有するレンチウイルス粒子を１５のＭＯＩで形質導入した。この実施例で用いられたヌクレオチド配列は配列番号１２８であった。
ＴＲＡＣ、ＣＤ５２、及びＴＧＦＢＲＩＩのノックアウト
形質導入から３日後、抗ＭＥＳＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞に、１００万個の細胞あたりＴＲＡＣ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１０８及び配列番号１０９）の０．２５μｇ及びＣＤ５２ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１１０及び配列番号１１１）の０．２５μｇを電気穿孔した。トランスフェクションは、Ｐｕｌｓｅ Ａｇｉｌｅテクノロジーを用いて、０．４ｃｍギャップキュベットにおけるＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎバッファーＴ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中、８００Ｖにおける２回の０．１ｍＳパルス、続いて、１３０Ｖにおける４回の０．２ｍＳパルスを加えることにより実施された。その後、電気穿孔された細胞を、予熱されたＯｐｔｍｉｚｅｒ無血清培地中へすぐに移し、３７℃で１５分間、その後、３０℃で１６時間、インキュベートした。その後、細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養した。
電気穿孔から３日後、ＣＤ５２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯに、ＴＧＦＢＲＩＩ ＴＡＬＥＮ（登録商標）アームをコードするｍＲＮＡ（配列番号１４１及び配列番号１４２）を電気穿孔した。トランスフェクションは、Ｐｕｌｓｅ Ａｇｉｌｅテクノロジーを用いて、０．４ｃｍギャップキュベットにおけるＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎバッファーＴ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中、８００Ｖにおける２回の０．１ｍＳパルス、続いて、１３０Ｖにおける４回の０．２ｍＳパルスを加えることにより実施された。その後、電気穿孔された細胞を、予熱されたＯｐｔｍｉｚｅｒ無血清培地中へすぐに移し、３７℃で１５分間、その後、３０℃で１６時間、インキュベートした。その後、細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養した。
インビボマウスモデルにおけるＢ２Ｍ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞、ＣＤ５２ ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞、及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂの併用の抗腫瘍活性
インビボで、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置をＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞及び抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤と併用することの治療的優位性を決定するために、週齢８週間の雌ＮＳＧマウスに、３×１０６個のヒトトリプルネガティブ乳房腫瘍由来の癌関連線維芽細胞と混合した３×１０６個のヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＨＣＣ７０－ＮａｎｏＬｕｃ－ＧＦＰを、左鼠径部乳腺脂肪体に正所性に移植した。腫瘍移植から２４日後、担癌マウスに、８×１０６個のｍｏｃｋトランスフェクト細胞又はＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ細胞を静脈内に注射した。４日後、これらのマウスに、１０×１０６個のＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞を静脈内注射した。図７に示されているように、次の日、抗ｈＰＤ－１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、カタログ番号ＳＩＭ０００３）処置を、開始した。
単独で又はＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞と併用しての、担癌マウスの抗ＰＤ－１処置は、腫瘍進行に影響しなかった（図８）。腫瘍はまた、ＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞での単一処置に対して無応答であった。Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ処置のＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ細胞との併用は、有意な腫瘍退縮を生じ、ＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ抗腫瘍活性を増強することにおいてＣＡＦのＢ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ媒介性除去の優位性を示している。さらに、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ前処置、続いて、抗ＰＤ－１とＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯ併用処置が、最も高いレベルの腫瘍退縮をもたらし、マウス生存を有意に増強した。したがって、本発明者らの結果は、ＣＤ５２ＫＯ ＴＧＦｂＲ２ＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＭＥＳＯの浸潤を増強しかつ抗ＰＤ－１チェックポイント遮断に対してポジティブな応答を誘導するための、Ｂ２ＭＫＯ ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ媒介性腫瘍微小環境リプログラミングの重要な役割を実証している。

Claims (47)

  1. それを必要としている患者において固形腫瘍を処置する方法であって、（ｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型ＴＣＲネガティブ免疫細胞の有効量、及び（ｉｉ）前記患者において免疫応答を誘発する免疫療法処置の有効量を前記患者へ投与するステップを含む方法。
  2. ＴＣＲネガティブ免疫細胞が、（ｉ）不活性化ＴＣＲを含む操作型Ｔ細胞又は（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 線維芽細胞活性化タンパク質に対して方向づけられたＣＡＲ（ＦＡＰ－ＣＡＲ）が
    （ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジアミノ酸配列、
    （ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインアミノ酸配列、並びに
    （ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインからのアミノ酸配列を含む細胞質ドメイン
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ヒンジがＣＤ８αヒンジであり、膜貫通ドメインがＣＤ８α膜貫通ドメインであり、共刺激ドメインが４－１ＢＢ由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ヒンジがＣＤ８αヒンジであり、膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメインであり、共刺激ドメインがＣＤ２８由来である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＣＡＲが、
    配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲを含み、かつ、配列番号７のアミノ酸配列のＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一性を有し；
    配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４のＨ－ＣＤＲ、並びに配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７のＬ－ＣＤＲを含み、かつ、配列番号１８のアミノ酸配列のＶＨ及び配列番号１９のアミノ酸配列のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一性を有し；
    配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５のＨ－ＣＤＲ、並びに配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８のＬ－ＣＤＲを含み、かつ、配列番号２９のアミノ酸配列のＶＨ及び配列番号３０のアミノ酸配列のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一性を有し；並びに／又は、
    配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６のＨ－ＣＤＲ、並びに配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９のＬ－ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４０のアミノ酸配列のＶＨ及び配列番号４１のアミノ酸配列のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一性を有する
    細胞外結合ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＣＡＲが、配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 操作型Ｔ細胞が、前記Ｔ細胞においてβ２ｍ及びＨＬＡから選択される少なくとも１つのＭＨＣタンパク質の発現を抑制又は抑圧するように遺伝子改変されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 操作型Ｔ細胞が、前記Ｔ細胞において免疫チェックポイントタンパク質及び／又はその受容体の発現を抑制又は抑圧するように遺伝子改変されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 操作型Ｔ細胞が、少なくとも１つの免疫抑制薬又は化学療法薬に対する抵抗性を与えるように、及び任意選択で、自殺遺伝子を含むように、遺伝子改変されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 操作型Ｔ細胞が、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球から派生したものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 操作型Ｔ細胞の起源がヒトであり、任意選択で、前記ヒトがドナーであり、患者ではない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記免疫療法処置が、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストの有効量を投与するステップを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記免疫チェックポイントアンタゴニストが、免疫チェックポイントタンパク質及び／又はその受容体に対して方向づけられた抗体であり、前記免疫チェックポイントタンパク質又はその受容体が、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＧＩＴＲ、及びＢＴＬＡからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記免疫チェックポイントアンタゴニストが抗ＰＤ１抗体又は抗ＰＤＬ１抗体である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記免疫チェックポイントアンタゴニストが、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、及びスパルタリズマブからなる群から選択される抗ＰＤ１抗体、又はデュルバルマブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブからなる群から選択される抗ＰＤＬ１抗体である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記免疫チェックポイントアンタゴニストが、イピリムマブである抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  18. 前記免疫療法処置が、少なくとも２つの結合部位を含む免疫細胞エンゲージャーの有効量を投与するステップであって、第１の結合部位が免疫細胞に結合し、第２の結合部位が固形腫瘍に関連した抗原に結合する、ステップを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第１の結合部位が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＡＰＣ／マクロファージの表面抗原に結合する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第１の結合部位が、ＣＤ３、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、及び／又はＴＣＲデルタなどのＴ細胞活性化受容体複合体（すなわち、ＴＣＲ）のコンポーネントに結合する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記第１の結合部位が、ＣＤ３に結合し、配列番号５３及び配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記第１の結合部位が、ＣＤ１６表面抗原などの、ＮＫ細胞の表面抗原に結合する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  23. 前記第１の結合部位が、ＣＤ４０表面抗原などの、ＡＰＣ／マクロファージの表面抗原に結合する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  24. 前記第２の結合部位が、癌に関連した抗原に結合し、前記抗原が、メゾテリン、Ｔｒｏｐ２、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記免疫細胞エンゲージャーが、配列番号１０３、配列番号１０４、及び配列番号１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８～２１及び請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 操作型Ｔ細胞、及び患者の免疫応答を伴う免疫療法処置の投与が、同時に（concurrently）、同時に（simultaneously）、又は逐次的に行われる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 患者の免疫応答を伴う前記免疫療法処置が、操作型Ｔ細胞の投与後、例として、操作型Ｔ細胞の投与後の１週間目又は２週間目、例えば、操作型Ｔ細胞の投与後の約１週間目又は２週間目から約３～１０カ月目の間に始まる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 患者の免疫細胞のリンパ球除去の予備的ステップを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. （ｉ）不活性化ＴＣＲを含み、かつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ）、及び（ｉｉ）患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む医薬組成物であって、コンポーネント（ｉ）と（ｉｉ）の両方が別々の投与のために製剤化されている、医薬組成物。
  30. それを必要としている患者における固形腫瘍の処置での使用のための、不活性化ＴＣＲを含みかつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ）を含む組成物であって、前記操作型Ｔ細胞が、前記患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置と併用して投与される、組成物。
  31. 患者における固形腫瘍の処置での使用のための、患者において免疫応答を誘発するための免疫療法処置を含む組成物であって、前記免疫療法処置が、不活性化ＴＣＲを含みかつ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ－ＦＡＰ）と併用して投与される、組成物。
  32. 前記免疫療法処置及び操作型Ｔ細胞が、別々の投与のために製剤化され、同時に又は逐次的に投与される、請求項３０又は３１に記載の組成物。
  33. 前記免疫療法処置が、操作型Ｔ細胞の投与後、例として、操作型Ｔ細胞の投与後の１週間目又は２週間目に、例えば、操作型Ｔ細胞の投与後の約１週間目又は２週間目から約３～１０カ月目の間に投与される、請求項３１又は３２に記載の使用のための組成物。
  34. 線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して方向づけられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に発現する操作型Ｔ細胞であって、
    前記ＣＡＲが
    （ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
    （ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジアミノ酸配列、
    （ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインアミノ酸配列、並びに
    （ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインからのアミノ酸配列を含む細胞質ドメイン
    を含み；並びに
    前記Ｔ細胞が、前記Ｔ細胞において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現をＴＣＲの不活性化により抑制又は抑圧するように、及び任意選択で、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍ又はＨＬＡの発現を抑制又は抑圧するように、遺伝子改変されている、操作型Ｔ細胞。
  35. 前記ＣＡＲが、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む、請求項３４に記載の操作型Ｔ細胞。
  36. 前記ＣＡＲが、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む、請求項３４に記載の操作型Ｔ細胞。
  37. 前記ＣＡＲが、配列番号７と配列番号８；配列番号１８と配列番号１９；配列番号２９と配列番号３０；及び配列番号４０と配列番号４１から選択されるＶＨとＶＬのアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  38. 前記ＣＡＲが、配列番号９、配列番号２０、配列番号３１、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外結合ドメインを含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  39. 前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、Ｔ細胞のゲノムにおける内因性ＴＲＡＣ、β２ｍ、又はＣＤ５２座へ組み込まれている、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  40. ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、及び／又はＣＤ３、並びに任意選択で、β２ｍをコードする少なくとも１つの遺伝子が変異によって不活性化されている、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  41. 少なくとも１つの免疫抑制薬又は化学療法薬に対する抵抗性を与えるように、及び任意選択で、自殺遺伝子を含むように、さらに遺伝子改変されている、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  42. ＣＤ５２遺伝子及び／又はＤＣＫ遺伝子が前記操作型Ｔ細胞において不活性化されている、請求項４１に記載の操作型Ｔ細胞。
  43. ＰＤ１及びＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイントタンパク質及び／又はその受容体をコードする少なくとも１つの遺伝子が、前記操作型Ｔ細胞において不活性化されている、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  44. 炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球から派生したものである、請求項３４～４３のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  45. ヒトドナーが起源である、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞。
  46. 以下のステップを含む、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の操作型Ｔ細胞の集団を産生する方法：
    （ｉ）Ｔ細胞受容体遺伝子の発現が不活性化されている、ドナーが起源である遺伝子操作型Ｔ細胞の集団を用意するステップ；又はドナーが起源であるＴ細胞の集団を用意し、前記Ｔ細胞においてＴ細胞受容体遺伝子の発現を不活性化させるステップ；
    （ｉｉ）前記Ｔ細胞の集団において、（ａ）モノクローナル抗ＦＡＰ抗体由来の重鎖可変断片（ＶＨ）及び軽鎖可変断片（ＶＬ）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、及びＩｇＧ１ヒンジから選択されるヒンジ、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン、並びに（ｄ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ又はＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップ；
    （ｉｉｉ）任意選択で、細胞表面にＴＣＲを発現しないＴ細胞を単離するステップ。
  47. ステップ（ｉ）において、ドナーが起源であるＴ細胞の集団が用意され、前記Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体遺伝子の発現が、請求項３４に定義されるＣＡＲをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを前記Ｔ細胞のゲノムのＴＲＡＣ座へ挿入することにより不活性化される、請求項４６に記載の操作型Ｔ細胞の集団を産生する方法。
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Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
AU6704794A (en) 1993-04-13 1994-11-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Protection of human bone marrow from high dose antifolate therapy using mutated human dihydrofolate reductase dna
AU696455C (en) 1994-03-23 2006-03-02 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6010613A (en) 1995-12-08 2000-01-04 Cyto Pulse Sciences, Inc. Method of treating materials with pulsed electrical fields
US6642043B1 (en) 1996-03-12 2003-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Double mutants of dihydrofolate reductase and methods of using same
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
ATE373078T1 (de) 2000-02-24 2007-09-15 Xcyte Therapies Inc Gleichzeitige stimulation und konzentration von zellen
EP2522723B1 (en) 2003-01-28 2014-12-03 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
JP4753119B2 (ja) 2003-03-14 2011-08-24 セレクティス ソシエテ アノニム 大量処理の生体外エレクトロポレーション法
AU2011281062B2 (en) 2010-07-21 2015-01-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for modification of a HLA locus
EP3279315A3 (en) 2012-05-25 2018-02-28 Cellectis Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
PT2893004T (pt) 2012-09-04 2019-01-21 Cellectis Recetor de antígeno quimérico de cadeia múltipla e utilizações do mesmo
US9365641B2 (en) * 2012-10-01 2016-06-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
RU2725542C2 (ru) 2013-05-13 2020-07-02 Селлектис Способы конструирования высокоактивных т-клеток для иммунотерапии
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
KR102348577B1 (ko) 2013-11-22 2022-01-06 셀렉티스 면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 ｔ―세포들의 조작 방법
PT3116902T (pt) 2014-03-11 2020-04-03 Cellectis Método para gerar células t compatíveis para transplante alogénico
US20180298068A1 (en) * 2015-04-23 2018-10-18 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
JOP20180040A1 (ar) 2017-04-20 2019-01-30 Gilead Sciences Inc مثبطات pd-1/pd-l1
EP4227302A1 (en) 2018-02-13 2023-08-16 Gilead Sciences, Inc. Pd-1/pd-l1 inhibitors
CN110526991A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 靶向fap的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
ES2962674T3 (es) 2018-07-13 2024-03-20 Gilead Sciences Inc Inhibidores PD-1/PD-L1
AU2019387482A1 (en) 2018-11-30 2021-06-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Heterodimeric tetravalency and specificity antibody compositions and uses thereof
KR20220066312A (ko) * 2019-09-23 2022-05-24 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 섬유아세포 활성화 단백질 (fap)의 표적화에 의한 종양 조직 파괴
WO2021120526A1 (zh) * 2019-12-16 2021-06-24 四川大学华西医院 同时靶向间皮素和fap的双靶点嵌合抗原受体及其用途

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