JP6689202B2 - 癌免疫治療のためのｃｄ１２３特異的キメラ抗原受容体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、選択された膜抗原へ免疫細胞の特異性および反応性を向け直すことができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（CAR）、より具体的には、細胞外リガンド結合が、CD123陽性細胞に対する特異的な免疫を付与するCD123モノクローナル抗体に由来するscFVであるCARに関する。インターロイキン3受容体α鎖（CD123）は、正常造血幹細胞と比較して、白血病腫瘍細胞に、特に、急性骨髄白血病（AML）の症例において、高頻度に過剰発現していることが同定されている。本発明によるCARが付与された操作された免疫細胞は、リンパ腫および白血病の処置に関してより高い有効性を示す。
発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫治療は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。
T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティング部分からなる合成受容体である。通常、CARの結合部分は、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合部分も、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示されたが、より長期間の増大および抗腫瘍活性をインビボで提供することはできなかった。CARによって改変されたT細胞の生存を増強し、増殖を増加させるため、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）付加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena, Dotti et al. 2010）。
一方、急性骨髄白血病（AML）の導入処置は、ほぼ50年間概して変化しておらず、AMLは、予後不良疾患のままである。急性骨髄白血病（AML）は、造血機能障害をもたらす、骨髄における未熟骨髄系細胞の急速な増殖を特徴とする疾患である。標準的な導入化学療法が完全寛解を誘導する場合もあるが、多くの患者が、最終的には再発し、疾患に屈するため、AMLのための新規治療薬の開発が必要とされている。
AML細胞の免疫表現型決定における最近の進歩は、将来の治療のための標的となり得る、数種のAML関連細胞表面抗原を明らかにした。インターロイキン3受容体α鎖（IL-3Rα；CD123−NCBIリファレンス：NP_001254642）は、正常造血幹細胞と比較してAML腫瘍細胞において過剰発現されるため、可能性のある免疫治療標的として同定されている。さらに、CD123特異的治療薬についての2件の第I期治験が完了しており、いずれの薬物も良好な安全性プロファイルを示している（ClinicalTrials.gov ID：NCT00401739およびNCT00397579）。残念ながら、これらのCD123標的薬は、限定された効力を有し、そのことから、抗白血病活性を観察するためには、代替的な、より強力かつ特異的なCD123標的治療が必要とされることが示唆された。
白血病の処置のためのおそらくより強力な代替治療は、MHC非依存的にT細胞特異性を細胞表面腫瘍関連抗原（TAA）へ向け直すキメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞の使用であり得る。いくつかのグループが、B細胞悪性疾患の処置のための、様々な抗原を標的とするCARを開発した。しかしながら、AMLの処置のためのCAR操作T細胞は欠如したままである。
具体的には、そのようなCARを発現する細胞が有意な臨床的利点に到達することを可能にするためには、T細胞増殖とのよりよい適合性を示すCARの構築を改善する必要性が未だに存在する。
さらに、増殖し、かつCD123発現細胞を選択的に標的とする能力を有するCD123 CARを改善する必要性が存在する。
さらに、抗癌処置として一般的に利用される処置としての、細胞傷害性化学療法剤と組み合わせた、CD123を標的とするそのようなCAR発現免疫T細胞の使用は、未だに困難である。
代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリン、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、白金化合物、および紡錘体毒のような数種の細胞傷害性薬剤が、癌細胞、具体的には、CD123を発現している癌細胞を死滅させるために開発されている。
これらの化学療法剤は、非特異的な毒性のため、頑強な抗腫瘍免疫担当細胞の確立にとって有害であり得る。細胞増殖経路を標的とする低分子に基づく治療も、抗腫瘍免疫の確立を妨げる可能性がある。
従って、特異的であり、かつ薬物、具体的には、細胞増殖に影響するもののような抗癌化学療法の使用と適合性であろう、CD123を標的とするT細胞を開発する必要性も存在する。
従って、「既製の」同種治療用細胞を化学療法と共に使用するため、本発明者らは、比較的非同種（less allogenic）になり、化学療法剤に対してより耐性になるよう、同種T細胞を操作する方法を開発する。この戦略によって与えられる治療的利益は、化学療法と免疫治療との間の相乗効果によって増強されるはずである。さらに、薬剤耐性は、操作されたT細胞を選択的に増大させ、それによって、これらの細胞への非効率的な遺伝子移入による問題を回避する能力からも利益を得ることができる。
本発明者らは、異なる設計を有し、CD123特異的抗体に由来する異なるscFVを含むCD123特異的CARを生成した。これらのCD123特異的CARは、CD123特異的CARまたは抗CD123 CARまたは123 CARまたは「本発明のCAR」と区別なく表記され得る。
具体的には、本発明者らは、異なる構成を有するKlon43に由来するscFVを含むCD123特異的CARを開発し、CD123発現細胞に結合し、CD123発現癌細胞を選択的に破壊する、高度に特異的で極めて選択的なCAR構築を同定した。
（例えば、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2による）インビトロの非特異的な活性化の後、ドナー由来のT細胞をウイルス形質導入を使用してこれらのCARを発現するポリヌクレオチドによって形質転換した。ある種の場合において、非アロ反応性T細胞を作出するため、より具体的には、移植片対宿主反応を防止するため、TCRの成分（αβT細胞受容体）の妨害によって、T細胞をさらに操作した。
古典的な抗癌薬と組み合わせて使用するため、抗癌薬に対して耐性のT細胞を作出するため、T細胞をさらに操作した。
得られた操作されたT細胞は、様々な程度に、CD123陽性細胞に対してインビトロで反応性を示し、このことから、本発明のCARは、T細胞の抗原依存的な活性化に寄与し、その増殖にも寄与し、従って、免疫治療のために有用であることが示された。
得られた操作されたT細胞は、CD123陽性細胞に対してインビボで反応性を示し、インビボで癌細胞の数を有意に低下させる。
本発明の操作されたT細胞は、CD123陽性細胞に対してインビボで反応性を示すよう設計されており、抗癌薬と同時に使用され得、高い耐容性を有する。具体的な態様において、本発明の操作されたT細胞は、数回の投与の後ですら効率的なままであり、従って、第一処置（導入）として、コンソリデーション処置として、古典的な抗癌化学療法との組み合わせ処置として、免疫治療のために有用である。本発明のCARをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列は、本明細書中に詳述される。
本発明の操作された免疫細胞は、B細胞リンパ腫または白血病の処置のような治療的な適用のために特に有用である。
[本発明1001]
図2に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有する、CD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）であって、
該構造が、モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、
該123 CARが、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、またはSEQ ID NO：46のいずれかと少なくとも80％の配列同一性を有する、
CD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
[本発明1002]
図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：44と少なくとも80％の配列同一性を有する、本発明1001のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
[本発明1003]
図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、
該構造が、以下のCDR配列：
Figure 0006689202
を含むモノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLを含み、かつヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、
本発明1001または1002のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
[本発明1004]
細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLがヒト化されている、本発明1001〜1003のいずれかのCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
[本発明1005]
モノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLが、以下の配列：
Figure 0006689202
を含み、ここでXはアミノ酸である、本発明1001〜1004のいずれかのCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
[本発明1006]
モノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLが、以下の配列：
Figure 0006689202
Figure 0006689202
、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つを含む、本発明1001〜1005のいずれかのCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
[本発明1007]
構造V3がCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む、本発明1001〜1006のいずれかのCD123特異的CAR。
[本発明1008]
VHおよびVLが、SEQ ID NO：19および20より選択されるポリペプチド配列と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1001〜1007のいずれかのCD123特異的CAR。
[本発明1009]
CD123に特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかのCD123特異的CAR。
[本発明1010]
シグナルペプチド、好ましくは、SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2のシグナルペプチドをさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかのCD123特異的CAR。
[本発明1011]
本発明1001〜1010のいずれかのCD123特異的キメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1012]
本発明1011のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1013]
本発明1001〜1010のいずれかのCD123特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現している、操作された免疫細胞。
[本発明1014]
Tリンパ球に由来し、任意で抗癌薬に対して耐性であり、かつαTCRまたはβTCRをコードする遺伝子の欠失を保持している、本発明1013の操作された免疫細胞。
[本発明1015]
前記操作された免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、本発明1013または1014のいずれかの操作された免疫細胞。
[本発明1016]
前記免疫細胞において少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、本発明1013〜1015のいずれかの操作された細胞。
[本発明1017]
少なくとも1種の免疫抑制薬、化学療法薬、または抗癌薬に対する耐性を付与するために変異させた、本発明1013〜1016のいずれかの操作された細胞。
[本発明1018]
治療において使用するための、本発明1013〜1017のいずれかの操作された細胞。
[本発明1019]
患者がヒトである、本発明1018の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1020]
状態がCD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態である、本発明1018または1019の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1021]
状態が、過剰量のCD123発現細胞を特徴とする状態である、本発明1018〜1020のいずれかの治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1022]
悪性癌状態が血液癌状態である、本発明1020〜1021のいずれかの治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1023]
血液癌状態が白血病または悪性リンパ増殖性障害である、本発明1022の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1024]
白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、本発明1023の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1025]
白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、本発明1023または1024の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1026]
血液癌が悪性リンパ増殖性障害である、本発明1023の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1027]
悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、本発明1026の治療において使用するための操作された細胞。
[本発明1028]
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、本発明1027の操作された細胞。
[本発明1029]
癌細胞の傷害を引き起こすために有効な量の本発明1013〜1017のいずれかの操作された細胞と血液癌細胞を接触させる工程を含む、血液癌細胞に傷害を与える方法。
[本発明1030]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）本発明1001〜1010のいずれかの少なくとも1種のCD123特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
[本発明1031]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD123特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程
を含む、本発明1030の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1032]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD123特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）CD123に特異的でない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、本発明1030の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1033]
（a）本発明1001〜1010のいずれかのCD123特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
（b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法。
[本発明1034]
前記免疫細胞がドナーから提供される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記免疫細胞が患者自身から提供される、本発明1033の方法。
本発明による操作された免疫細胞の模式図。この図に提示された操作された免疫細胞は、CARをコードするレトロウイルスポリペプチドによって形質導入されたT細胞である。このT細胞は、本発明の範囲内で任意である、患者へのより良好でより安全な生着を可能にするため、さらに操作されている。X遺伝子は、例えば、TCRの成分（TCRαまたはTCRβ）を発現する遺伝子であり得、Yは、（Campathに関して）CD52または（6-チオグアニンに関して）HPRTのような免疫抑制薬に対するT細胞の感受性に関与する遺伝子であり得る。 本発明（123 CAR）の異なるCAR構成（V1〜V6）の模式図。 各々、使用されたヒンジ領域が異なる、本発明によるCARについての異なる構成を示す。 CAR+T細胞をCD123発現細胞（RPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と6時間共培養した時の、単一の構成（v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通）についての6種の異なるscFvの脱顆粒活性を脱顆粒の率（％）で示す。白色のバーは、単独で培養されたT細胞において観察された脱顆粒シグナルに相当し、黒色のバーは、T細胞がRPMI8226細胞と共培養された時に観察されたシグナルを表し、灰色のバーは、K562細胞と共培養されたT細胞の脱顆粒シグナルを示す。 CD123陰性細胞（K562）または高レベルもしくは低レベルのCD123を発現する細胞（それぞれ、RPMI8226およびKG1a）との6時間の共培養の後のCAR T細胞の脱顆粒活性（CD107a+細胞）を平均蛍光強度（MFI）で示す。 異なるレベルのCD123を発現する細胞（KG1aもしくはRPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と6時間共培養された時の、様々な抗CD123 CAR T細胞の脱顆粒の率（％）を示す。 異なるレベルのCD123を発現する細胞（KG1aもしくはRPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と24時間共培養された時の、様々な抗CD123 CAR T細胞によって放出されたIFNガンマ（IFNγ）の量を示す。 様々な抗CD123 CAR T細胞の特異的細胞溶解活性を示す。CAR mRNAトランスフェクションの48時間後にアッセイを行った。T細胞を、K562＋KG1a細胞またはK562＋RPMI8226細胞と共培養した。細胞株の各々についての細胞生存率を共培養の終わりに決定し、特異的細胞溶解率を計算した。 T細胞の形質導入のために使用された概略的な構築、およびフローサイトメトリーによって分析された2人の異なるドナーについての形質導入後8日目または10日目のCARまたはBFPを発現するT細胞の率（％）を示す。CARは、CAR構築、Klon 43-v3 CARおよび32716-V3 CARに相当する。 異なる細胞株（CD123を発現しないDaudi細胞およびK562細胞、増加するレベルのCD123を発現するKG1a、MOLM13、およびRPMI8226（KG1a＜MOLM13＜RPMI8226））に対する、Klon 43-v3 CARおよび32716-V3 CARを発現するT細胞の脱顆粒活性を表す。3人の独立のドナーについての（CD8+細胞の中の）CD107a+細胞の％が、上パネルに与えられ、代表的なドナーについてのCD107a染色の強度が、下パネルに示される。NTDは非形質導入細胞を表す。 Klon 43-v3 CARおよび32716-V3 CARを発現するT細胞の異なる細胞株との24時間の共培養によるIFNγ放出を示す。 Klon 43-v3 CARおよび32716-V3 CARを発現するT細胞の特異的細胞溶解活性を示す。特異的細胞溶解率を計算した。結果は、少なくとも2人の独立のドナーにおいて得られた結果を表す。 Klon 43-v3 CARおよび32716-V3 CARを発現するT細胞の脱顆粒活性を（脱顆粒の率（％）で）示す。 Klon 43-v3 CARおよび32716-V3 CARを発現するT細胞の脱顆粒活性を（MFIで）示す。 NOG免疫不全マウスにおけるKlon 43-v3 CARを発現するT細胞のインビボ活性を示す。マウスにMOLM13ルシフェラーゼ細胞を注射し、その2日後または7日後に、非形質導入ヒトT細胞および異なる用量の抗CD123 CAR+T細胞を注射した。結果は、T細胞注射後の異なる時点で観察された生物発光シグナルを表す（4匹のマウスのうち1匹が21〜28日目に死亡したG12を除き、各群4匹のマウスの平均）。
（表１）様々なCAR成分の配列
Figure 0006689202
（表２）様々なCAR成分の配列
Figure 0006689202
Figure 0006689202
（表３）構造V-1のCAR
Figure 0006689202
（表４）構造V-2のCAR
Figure 0006689202
（表５）構造V-3のCAR
Figure 0006689202
（表６）構造V-4のCAR
Figure 0006689202
（表７）構造V-5のCAR
Figure 0006689202
（表８）構造V-6のCAR
Figure 0006689202
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、第154巻および第155巻(Wu et al.eds.)および第185巻、「Gene Expression Technology」(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。
本発明は、図2に図示されるV1〜V6より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有するCD123特異的キメラ抗原受容体（「123 CAR」または「CAR」）を開示し、該構造は、モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、、該123 CARは、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：29、またはSEQ ID NO：48のいずれかとの少なくとも80％の配列同一性を有する。
本発明は、図2に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有するCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示し、該構造は、モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、CD3ζシグナリングドメインを含む細胞質ドメイン、ならびに4-1BB由来の共刺激ドメインを含み、該123 CARは、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、またはSEQ ID NO：46のいずれかとの少なくとも80％の配列同一性を有する。
本発明は、図2に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有するCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示し、該構造は、モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、該123 CARは、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77のいずれかとの少なくとも80％の配列同一性を有する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：42との少なくとも80％の配列同一性を有する、前記の特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：44との少なくとも80％の配列同一性を有する、前記の特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：46との少なくとも80％の配列同一性を有する、前記の特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：75との少なくとも80％の配列同一性を有する、前記の特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：76との少なくとも80％の配列同一性を有する、前記の特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有し、SEQ ID NO：77との少なくとも80％の配列同一性を有する、前記の特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、図2に図示されるポリペプチド構造V3を有する前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）を開示し、該構造は、以下のCDR配列：
Figure 0006689202
を含むモノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLを含み、かつヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
本発明は、細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLがヒト化されている、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、細胞外リガンド結合ドメインがヒト化されている、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、ヒト化されている前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示する。
本発明は、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）を開示し、モノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLは、以下の配列
Figure 0006689202
を含み、ここでXはアミノ酸であり、アミノ酸は、アミノ酸のいずれか、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸であり得る。
本発明は、モノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLが、それぞれ、以下の配列
Figure 0006689202
Figure 0006689202
Figure 0006689202
、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つを含む、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）を開示する。
本発明は、モノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLが、それぞれ以下の配列
Figure 0006689202
Figure 0006689202
、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つを含む、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）を開示する。
有利には、本発明は、モノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLが、それぞれ以下の配列：
Figure 0006689202
のうちの少なくとも一つ、および以下の配列：
Figure 0006689202
のうちの少なくとも一つを含む、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）を開示する。
本発明は、構造V3がCD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、構造V3がCD8αヒンジ、41BBB細胞質ドメイン、およびCD8α膜貫通ドメインを含む、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、構造V3がCD8αヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、VHおよびVLがSEQ ID NO：19およびSEQ ID NO：20より選択されるポリペプチド配列との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、VHおよびVLがSEQ ID NO：19および／またはSEQ ID NO：20のポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、CD123に特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、シグナルペプチド、好ましくは、SEQ ID NO 1またはSEQ ID NO 2のシグナルペプチドをさらに含む、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、SEQ ID NO 10のリンカーがVHとVLとの間に挿入されている、前記のCD123特異的CARを開示する。
本発明は、前記のCD123特異的CARのいずれか一つによるCD123特異的キメラ抗原受容体をコードし、シグナルペプチド、好ましくは、SEQ ID NO 1またはSEQ ID NO 2のシグナルペプチドをさらに含むポリヌクレオチドを開示する。
本発明は、前記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを開示する
本発明は、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する操作された免疫細胞、好ましくは、前記のCD123特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現することができる操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、Tリンパ球に由来し、任意で、抗癌薬に対して耐性であり、αTCRまたはβTCRをコードする遺伝子の欠失を保持している、前記の操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、TCRの発現が抑制されている、前記の操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくは、β2mまたはHLAの発現が抑制されている、前記の操作された免疫細胞を開示する。β2mはβ2ミクログロブリンを表し、HLAはヒト白血球抗原を表す。MHCタンパク質は、クラスIまたはクラスIIのMHCタンパク質である。
本発明は、少なくとも1種の免疫抑制薬、化学療法薬、または抗癌薬に対する耐性を付与するために変異させられている、前記の操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、治療において使用するための、前記の操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、患者がヒトである、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、状態がCD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、状態が過剰量のCD123発現細胞を特徴とする状態である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、悪性癌状態が血液癌状態である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、血液癌状態が白血病または悪性リンパ増殖性障害である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、血液癌が悪性リンパ増殖性障害である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を開示する。
本発明は、癌細胞の傷害を引き起こすために有効な量の請求項13〜17のいずれか一項記載の操作された細胞と血液癌細胞を接触させる工程を含む、血液癌細胞に傷害を与える方法を開示する。
本発明は、
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）請求項1〜10のいずれか一項記載の少なくとも1種のCD123特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法を開示する。
本発明は、
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD123特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程
を含む、前記の免疫細胞を操作する方法を開示する。
本発明は、
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD123特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）CD123に特異的でない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、前記の免疫細胞を操作する方法を開示する。
本発明は、
（a）請求項1〜10のいずれか一項記載のCD123特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
（b）免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法を開示する。
本発明は、免疫細胞がドナーから提供される、前記のその必要のある対象を処置する方法を開示する。
本発明は、免疫細胞が患者自身から提供される、前記のその必要のある対象を処置する方法を開示する。
CD123特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング伝達ドメインを含む、抗CD123キメラ抗原受容体（CAR）の新しい設計に関する。
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するよう選択され得る。好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗CD-123抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。VLおよびVHは、好ましくは、表1〜8に示される、7G3、Old4、26292、32716、Klon43、および12F1と文献中で呼ばれる抗体、より好ましくは、Old4、Klon43、および12F1より選択され、さらに好ましくは、Klon43である。それらは、好ましくは、配列SEO ID NO：10を含むフレキシブルリンカーによって共に連結されている。換言すると、CARは、優先的には、SEQ ID NO:11〜SEQ ID NO:22からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも90％、95％、97％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む（表2を参照すること）。
より好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:13、14、19、20、21〜SEQ ID NO:22からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含み、さらに好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:19および／または20からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む。
さらに好ましくは、CARは、SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:22からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含み、さらに好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:20からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、バクテリオファージ、酵母発現系、または哺乳動物細胞発現系によって発現された抗体または抗体断片のような、組換えDNAテクノロジーを使用して生成された抗体または抗体断片を意味する。その用語は、抗体もしくは抗体断片をコードしかつ抗体もしくは抗体断片のタンパク質を発現するDNA分子の合成によって生成された抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片を特定するアミノ酸配列も意味するものと解釈されるべきであり、DNAおよびアミノ酸は、当技術分野において入手可能であり周知であるDNAまたはアミノ酸配列の組換えまたは合成のテクノロジーを使用して入手されたものである。
本明細書において使用されるように、「保存的配列修飾」または「ヒト化」という用語は、CARの結合特徴に有意に影響を与えず変更もしない、かつ／または修飾されたアミノ酸配列を含有しているCARの活性に有意に影響を与えず、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を低下させるかまたは消失させるアミノ酸修飾をさすものとする。そのような保存的修飾には、CAR内の抗体断片および／またはCAR分子の他の部分におけるアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発、PCRによって媒介される変異誘発のような当技術分野において公知の標準的な技術によって、または最適化された生殖系列配列を利用することによって、抗体、抗体断片、または本発明のCAR分子の他の部分のいずれかへ導入され得る。
保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と交換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のCAR内の1個以上のアミノ酸残基を、同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と交換することができ、改変されたCARを、本明細書に記載された機能アッセイを使用して、CD123に結合する能力について試験することができる。
本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1種の活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。
CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、免疫受容活性化チロシンモチーフであるITAMとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、CARのシグナリング伝達ドメインには、SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインが含まれ得る。
具体的な態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が含まれる。
好ましい態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133）およびCD28（NP_006130.1）の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。具体的には、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
本発明によるCARは、細胞の表面膜上に発現される。従って、そのようなCARは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色には、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予定された標的細胞に対する免疫細胞の細胞性応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通型ポリペプチドは、α、β、γ、または?のようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、またはγ鎖、Fc受容体、具体的には、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質のサブユニット鎖であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含んでいてもよい。好ましい態様において、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は通常、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの可動性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えば、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全合成ヒンジ配列であってもよい。好ましい態様において、ヒンジドメインは、本明細書において、それぞれ、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5と呼ばれる、ヒトCD8α鎖、FcγRIIIα受容体、もしくはIgG1の一部、またはこれらのポリペプチドとの好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、もしくは99％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。
本発明によるcarは概して、膜貫通ドメイン（TM）、より具体的には、SEQ ID NO：6または7のポリペプチドとの同一性を示すCD8αおよび4-1BBより選択される膜貫通ドメイン（TM）をさらに含む。
本発明によるCARは概して、膜貫通ドメイン（TM）、より具体的には、CD8αおよび4-1BBより選択されるTM、さらに具体的には、SEQ ID NO：6または7のポリペプチドとの同一性を示すものをさらに含む。
好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：6を有するか、またはSEQ ID NO：6との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を示す、CD8α由来のTMドメインをさらに含む。
標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異は、癌細胞において一般的に観察され、抗原損失エスケープバリアントを作出する。従って、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするため、本発明によるCD123特異的CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するための、他の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれてもよく、任意で、リンカーによって隔てられていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を該細胞の表面に発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離された免疫細胞にも関する。
好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：19のポリペプチドおよび／またはSEQ ID NO：20のポリペプチドを含み、より好ましくは、本発明によるCARは、SEQ ID NO：19との少なくとも80％の同一性、好ましくは、80％〜99％の同一性を有するポリペプチド、および／またはSEQ ID NO：20との80〜99％の同一性を有するポリペプチドを含む。さらに好ましくは、本発明によるCARは、SEQ ID NO：19および／またはSEQ ID NO：20のポリペプチドとの85〜99％の同一性を有するポリペプチドを含む。
より好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む：
Figure 0006689202
。
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを少なくとも含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列を有するポリペプチドを含む。
Figure 0006689202
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列：
Figure 0006689202
より選択される少なくとも1種のポリペプチド、および以下の配列
Figure 0006689202
より選択される少なくとも1種の配列を含む。
一つの好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、およびSEQ ID NO：66より選択される少なくとも1種のポリペプチドを含む。
より好ましい態様において、本発明によるCARは、以下の配列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59より選択される1種のポリペプチド、ならびに以下の配列：SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、およびSEQ ID NO：66より選択されるペプチドを含む。
一つの態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、およびSEQ ID NO：46からなるリストより選択されるポリペプチド、好ましくは、SEQ ID NO：42のポリペプチドとの80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むCAR、SEQ ID NO：44のポリペプチドとの80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むCAR、およびSEQ ID NO：46のポリペプチドとの80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むCARを含む。
より好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：42との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むポリペプチドを含む。
別の好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：42のポリペプチド、さらに好ましくは、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：42との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むCAR、具体的には、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：42との85％〜99％の同一性を含むCARを含む。
より好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むポリペプチドを含む。
さらに好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：44のポリペプチド、さらに好ましくは、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：44との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むCAR、具体的には、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：44との85％〜99％の同一性を含むCARを含む。
より好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：46との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むポリペプチドを含む。
さらに好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：46のポリペプチド、さらに好ましくは、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：46との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含むCAR、具体的には、SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：46との85％〜99％の同一性を含むCARを含む。
別の好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：42のポリペプチドからなり、さらに好ましくは、CARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：42との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性からなる。
別の好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：44のポリペプチドからなり、さらに好ましくは、CARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：44との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性からなる。
別の好ましい態様において、本発明によるCARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：46のポリペプチドからなり、さらに好ましくは、CARは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：10＋SEQ ID NO：46との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性からなる。
本発明によると、本発明の抗CD123 CARを発現する免疫細胞は、抗癌免疫応答を誘発する。好ましい態様において、本発明の抗CD123 CARを付与された本発明のCARを発現する免疫細胞は、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を含まない免疫応答を誘発する。
本発明によると、効率的な量の操作された免疫細胞を、その必要のある患者へ、少なくとも1回、2回、または数回、単独でまたは別の処置と組み合わせて、投与することができる。
本発明は、モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示されるV1〜V6より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有するCD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）に関する。
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明は、上記の本発明によるCARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。
具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、2種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列SEQ ID NO:1および2を含むか、またはSEQ ID NO:1および／もしくは2と少なくとも90％、95％、97％、もしくは99％の配列同一性を含む。
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において概して高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
細胞
本発明による細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による細胞は、好ましくは、ドナーから入手されたT細胞である。本発明によるT細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。好ましい態様において、細胞は、ヒト細胞、具体的には、ヒト幹細胞である。
代表的なヒト幹細胞は、CD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子修飾の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、好ましくは、健常ドナーに由来する。別の態様において、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部である。
好ましくは、幹細胞の単離および調製は、少なくとも一つのヒト胚の破壊を必要としない。免疫細胞は、自己処置の実施を考慮して、患者に起因してもよいし、または同種処置において使用され得る同種細胞の作製を考慮して、ドナーに起因してもよい。
より好ましくは、本発明の免疫細胞は、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、またはSEQ ID NO 46に相当する抗CD123 CARを発現し、さらに好ましくは、本発明の免疫細胞は、ヒト化されたSEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、またはSEQ ID NO 46に相当するヒト化された抗CD123 CARを発現する。
CARが付与されるよう免疫細胞を操作する方法：
本発明は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2014/130635、WO2013176916、WO2013176915に以前に記載されたCD123 CARをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを免疫細胞へエクスビボで導入する工程を含む、免疫治療のための免疫細胞を調製する方法を包含する。
好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、免疫細胞において安定的に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含まれている。
さらなる態様によると、方法は、同種移植のためにより適当なものにするため、細胞を遺伝子修飾する工程をさらに含む。
T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによるT細胞の修飾
第1の局面によると、免疫細胞は、例えば、HLAまたはβ2mのタンパク質発現をコードするかまたは制御する遺伝子の不活性化と組み合わせられてもよい、WO 2013/176915に記載されたようなT細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、比較的非同種にされ得る。従って、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは有意に低下する。
従って、免疫細胞がT細胞である時、本発明は、比較的非同種となるようT細胞を操作する方法も提供する。
細胞を比較的非同種にする方法は、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子、特に、TCRα遺伝子、TCRβ遺伝子を不活性化する工程を含むことができる。
T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を不活性化することによって、同種移植のために適当なCAR発現免疫細胞を調製するための、WO2013/176915に開示された方法は、全て、参照によって本明細書に組み入れられる。
本発明は、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されている抗CD123 CAR発現免疫細胞を包含する。従って、本発明は、CARがKlon 43に由来し、具体的には、SEQ ID NO：44との少なくとも80％の同一性を有し、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されている、抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。
本発明によると、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分が不活性化されている抗CD123 CAR免疫細胞は、医薬として使用するためのものである。
TCR遺伝子の不活性化とは、関心対象の遺伝子が、機能性のタンパク質の形態で発現されないことを意味する。具体的な態様において、方法の遺伝子修飾は、レアカットエンドヌクレアーゼが1種の標的遺伝子において特異的に切断を触媒し、それによって、標的遺伝子を不活性化するよう、1種のレアカットエンドヌクレアーゼを、操作すべき準備された細胞において発現させることに頼る。レアカットエンドヌクレアーゼによって引き起こされた核酸鎖破断は概して、相同組換えまたは非相同末端結合（NHEJ）の別の機序を通して修復される。しかしながら、NHEJは、切断の部位においてDNA配列に変化をもたらすことが多い不完全な修復過程である。機序は、直接再連結（Critchlow and Jackson 1998）を通した、またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Betts,Brenchley et al.2003；Ma,Kim et al.2003）を介した、2個のDNA末端のうち残っているものの再結合を含む。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は、小さい挿入または欠失をもたらすことが多く、特異的な遺伝子ノックアウトの作出のために使用され得る。その修飾は、少なくとも1個のヌクレオチドの置換、欠失、または付加であり得る。切断によって誘導された変異誘発イベント、即ち、NHEJのイベントに続く変異誘発イベントが起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって同定されかつ／または選択され得る。具体的な態様において、個々の各試料の細胞においてT細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化する工程は、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を妨害することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞へ導入する工程を含む。より具体的な態様において、個々の各試料の細胞は、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を妨害することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸によって形質転換され、レアカットエンドヌクレアーゼが細胞において発現させられる。
レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、またはMBBBDヌクレアーゼであり得る。好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼとは、TAL（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来するDNA結合ドメインと核酸標的配列を切断する1個のヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を表す（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Cermak,Doyle et al.2011；Geissler,Scholze et al.2011；Huang,Xiao et al.2011；Li,Huang et al.2011；Mahfouz,Li et al.2011；Miller,Tan et al.2011；Morbitzer,Romer et al.2011；Mussolino,Morbitzer et al.2011；Sander,Cade et al.2011；Tesson,Usal et al.2011；Weber,Gruetzner et al.2011；Zhang,Cong et al.2011；Deng,Yan et al.2012；Li,Piatek et al.2012；Mahfouz,Li et al.2012；Mak,Bradley et al.2012）。本発明において、新しいTALEヌクレアーゼが、養子免疫治療戦略のための関連する遺伝子を正確に標的とするために設計された。
標的配列を認識し切断する好ましいTALEヌクレアーゼは、PCT/EP2014/075317に記載されている。具体的には、標的遺伝子を不活性化する能力を増強するため、変異誘発を増加させるため、レアカットエンドヌクレアーゼと共に、付加的な触媒ドメインをさらに細胞に導入することができる。より具体的には、付加的な触媒ドメインは、DNA末端プロセシング酵素である。DNA末端プロセシング酵素の非限定的な例には、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリエキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素、および鋳型非依存性DNAポリメラーゼが含まれる。そのような触媒ドメインの非限定的な例には、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大腸菌（E.coli）ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、TdT（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ）、ヒトDNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）からなる群より選択されるタンパク質ドメインまたはタンパク質ドメインの触媒活性誘導体が含まれる。好ましい態様において、付加的な触媒ドメインは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、より好ましい態様において、付加的な触媒ドメインは、TREX、より好ましくは、TREX2触媒ドメイン（WO2012/058458）である。別の好ましい態様において、触媒ドメインは、単鎖TREX2ポリペプチドによってコードされる。付加的な触媒ドメインは、任意で、ペプチドリンカーによって、本発明によるヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に融合され得る。
ヌクレオチド鎖切断による破断は、相同組換えの割合を刺激することが公知である。従って、別の態様において、方法の遺伝子修飾工程は、標的核酸配列と外来性核酸との間で相同組換えが起こるよう、標的核酸配列の一部分に相同の配列を少なくとも含む外来性核酸を、細胞へ導入する工程をさらに含む。具体的な態様において、外来性核酸は、それぞれ、標的核酸配列の5'および3'の領域に相同である第1部分および第2部分を含む。これらの態様において、外来性核酸は、標的核酸配列の5'および3'の領域との相同性を含まない、第1部分と第2部分との間に位置する第3部分も含む。標的核酸配列の切断の後、相同組換えイベントが、標的核酸配列と外来性核酸との間で刺激される。好ましくは、少なくとも50bpの、好ましくは、100bpより長く、より好ましくは、200bpより長い相同配列が、ドナーマトリックス内に使用される。具体的な態様において、相同配列は、200bp〜6000bp、より好ましくは、1000bp〜2000bpであり得る。実際、共有された核酸相同性は、破断の部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入すべき核酸配列は、2つのアームの間に位置するべきである。
免疫チェックポイント
本発明は、T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されており、かつ／または遺伝子CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1（またはblimp1）、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3より選択される1種の遺伝子がWO2014/184741において言及されるように不活性化されている、抗CD123 CAR、具体的には、SEQ ID N°44またはSEQ ID N°1＋SEQ ID N°44の抗CD123 CARを発現する同種T細胞を提供する。
薬剤耐性T細胞
別の局面によると、本発明の抗CD123 CAR発現T細胞は、CD123陽性悪性細胞を処置するための標準治療として使用される免疫抑制薬または化学療法処置に対する耐性を改善するため、さらに遺伝子操作され得る。
代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリン、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、白金化合物、および紡錘体毒のような数種の細胞傷害性薬剤（抗癌薬）が、癌細胞を死滅させるため、開発されている。しかしながら、免疫治療のような新規治療と共にこれらの薬剤を導入することには問題がある。例えば、化学療法剤は、薬剤の非特異的な毒性プロファイルのため、頑強な抗腫瘍免疫担当細胞の確立にとって有害であり得る。細胞増殖経路を標的とする低分子に基づく治療も、抗腫瘍免疫の確立を妨げる可能性がある。一過性に有効である化学療法計画を、新規の免疫担当細胞治療と組み合わせることができれば、抗新生物治療の有意な改善が達成され得る（概説について（Dasgupta,McCarty et al.2011））。
癌治療および同種T細胞の選択的生着を改善するため、化学療法剤の毒性副作用から保護するための薬剤耐性が同種T細胞に付与される。薬剤耐性遺伝子を発現するT細胞は、薬剤感受性細胞と比べて、生存し、繁殖するため、T細胞の薬剤耐性は、インビボまたはエクスビボでのそれらの濃縮も可能にする。
化学療法剤に対して耐性となるようT細胞を操作する方法は、参照によって本明細書に完全に組み入れられるPCT/EP2014/075317に開示されている。
具体的には、本発明は、免疫治療のために適当であるよう同種細胞を操作する方法に関し、ここで、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子が不活性化されており、薬剤耐性を付与するために1種の遺伝子が修飾されており、本方法は、以下の工程を含む：
・抗CD123 CAR発現T細胞；具体的には、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46の抗CD123 CAR、好ましくは、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46のヒト化123 CARを発現するT細胞を準備する工程、
・T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・抗CD123 CAR発現T細胞へ薬剤耐性を付与するために抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・操作された抗CD123 CAR発現T細胞を薬物の存在下で増大させる工程。
代替として、本発明は、以下の工程を含む方法に関する：
・抗CD123 CAR発現T細胞；具体的には、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46の抗CD123 CAR、好ましくは、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46のヒト化123 CARを発現するT細胞を準備する工程、
・抗CD123 CAR発現T細胞へ薬剤耐性を付与するために抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・操作された抗CD123 CAR発現T細胞を薬物の存在下で増大させる工程。
具体的には、本発明は、免疫治療のために適当であるよう同種細胞を操作する方法にも関し、ここで、T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子が不活性化されており、薬剤耐性を付与するために1種の遺伝子が修飾されており、本方法は以下の工程を含む：
・抗CD123 CAR発現T細胞；具体的には、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77の抗CD123 CAR、好ましくは、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77のヒト化123 CAR、より好ましくは、SEQ ID NO：75のヒト化123 CARを発現するT細胞を準備する工程、
・T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・抗CD123 CAR発現T細胞へ薬剤耐性を付与するために抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・操作された抗CD123 CAR発現T細胞を薬物の存在下で増大させる工程。
代替として、本発明は、以下の工程を含む方法に関する：
・抗CD123 CAR発現T細胞；具体的には、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77の抗CD123 CAR、好ましくは、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77のヒト化123 CAR、より好ましくは、SEQ ID NO：75のヒト化123 CARを発現するT細胞を準備する工程、
・抗CD123 CAR発現T細胞へ薬剤耐性を付与するために抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・T細胞受容体（TCR）成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、抗CD123 CAR発現T細胞を修飾する工程、
・操作された抗CD123 CAR発現T細胞を薬物の存在下で増大させる工程。
抗CD123 CAR発現免疫細胞における薬剤耐性遺伝子の発現
具体的な態様において、少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子の発現によって、薬剤耐性をT細胞に付与することができる。薬剤耐性遺伝子とは、化学療法剤（例えば、メトトレキサート）のような薬剤に対する「耐性」をコードする核酸配列をさす。換言すると、細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤耐性遺伝子なしの対応する細胞の増殖より大きな程度に薬剤の存在下で細胞の増殖を可能にする。細胞における薬剤耐性遺伝子の発現は、薬剤の存在下での細胞の増殖を可能にし、その活性には影響を与えない。本発明の薬剤耐性遺伝子は、代謝拮抗薬、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞傷害性抗生物質、抗イムノフィリン、それらの類似体または誘導体等に対する耐性をコードしていてよい。
一つの態様において、本発明の薬剤耐性遺伝子は、薬物（または薬剤）、具体的には、アラシチン（Aracytine）、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸の組み合わせ、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、シタラビン、アントラサイクリン、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、およびそれらの組み合わせより選択される抗癌薬に対する耐性を付与することができる。
標的細胞に薬剤耐性を付与するために使用される可能性のある数種の薬剤耐性遺伝子が同定されている（Takebe,Zhao et al.2001；Sugimoto,Tsukahara et al.2003；Zielske,Reese et al.2003；Nivens,Felder et al.2004；Bardenheuer,Lehmberg et al.2005；Kushman,Kabler et al.2007）。
薬剤耐性遺伝子の一例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）の変異型または修飾型でもあり得る。DHFRは、細胞内のテトラヒドロ葉酸の量の制御に関与する酵素であって、DNA合成のために必須である。メトトレキサート（MTX）のような葉酸類似体は、DHFRを阻害し、従って、抗新生物剤として臨床的に使用されている。治療において使用される葉酸代謝拮抗薬による阻害に対して増加した耐性を有するDHFRの異なる変異型が記載されている。具体的な態様において、本発明による薬剤耐性遺伝子は、メトトレキサートのような葉酸代謝拮抗薬処置に対する耐性を付与する少なくとも1個の変異を含むヒト野生型DHFR（GenBank：AAH71996.1）の変異型をコードする核酸配列であり得る。具体的な態様において、DHFRの変異型は、位置G15、L22、F31、またはF34、好ましくは、位置L22またはF31に少なくとも1個の変異型アミノ酸を含む（Schweitzer,Dicker et al.1990；国際出願WO94/24277；米国特許US6,642,043）。具体的な態様において、DHFR変異型は、位置L22およびF31に2個の変異型アミノ酸を含む。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、GenBank：AAH71996.1に示された野生型DHFRポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。具体的な態様において、位置15のセリン残基が、好ましくは、トリプトファン残基に交換される。別の具体的な態様において、位置22のロイシン残基が、好ましくは、変異体DHFRの葉酸代謝拮抗薬との結合を妨害するであろうアミノ酸、好ましくは、フェニルアラニンまたはチロシンのような無電荷アミノ酸残基に交換される。別の具体的な態様において、位置31または34のフェニルアラニン残基が、好ましくは、アラニン、セリン、またはグリシンのような小さい親水性アミノ酸に交換される。
本明細書において使用されるように、「葉酸代謝拮抗剤」または「葉酸類似体」とは、何らかのレベルで葉酸代謝経路に干渉するための分子をさす。葉酸代謝拮抗剤の例には、例えば、メトトレキサート（MTX）；アミノプテリン；トリメトレキサート（Neutrexin（商標））；エダトレキサート；N10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸（CB3717）；ZD1694（Tumodex）、5,8-ジデアザイソ葉（dideazaisofolic）酸（IAHQ）；5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸（DDATHF）；5-デアザ葉酸；PT523（Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン）；10-エチル-10-デアザアミノプテリン（DDATHF、ロマトレキソール（lomatrexol））；ピリトレキシム（piritrexim）；10-EDAM；ZD1694；GW1843；ペメトレキサート（Pemetrexate）、およびPDX（10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン）が含まれる。
薬剤耐性遺伝子の別の例は、グアノシンヌクレオチドのデノボ合成における律速酵素であるイノシン-5'-一リン酸脱水素酵素II（IMPDH2）の変異型または修飾型でもあり得る。IMPDH2の変異型または修飾型は、IMPDH阻害剤耐性遺伝子である。IMPDH阻害剤は、ミコフェノール酸（MPA）、またはそのプロドラッグ、ミコフェノール酸モフェチル（MMF）であり得る。変異体IMPDH2は、IMPDH阻害剤に対する有意に増加した耐性をもたらす変異を、少なくとも1個、好ましくは、2個、野生型ヒトIMPDH2（NP_000875.2）のMAP結合部位に含み得る。変異は、好ましくは、位置T333および／またはS351にある（Yam,Jensen et al.2006；Sangiolo,Lesnikova et al.2007；Jonnalagadda,Brown et al.2013）。具体的な態様において、位置333のトレオニン残基は、イソロイシン残基に交換され、位置351のセリン残基は、チロシン残基に交換される。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、NP_000875.2に示された野生型ヒトIMPDH2ポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。
別の薬剤耐性遺伝子は、カルシニューリンの変異型である。カルシニューリン（PP2B）は、多くの生物学的過程に関与しており、T細胞活性化の中心である、広範に発現されているセリン／トレオニンプロテインホスファターゼである。カルシニューリンは、触媒サブユニット（CnA；3種のアイソフォーム）および制御サブユニット（CnB；2種のアイソフォーム）から構成されたヘテロ二量体である。T細胞受容体の会合の後、カルシニューリンは、転写因子NFATを脱リン酸し、NFATが核に移行し、IL2のような重要な標的遺伝子を活性化することを可能にする。FKBP12との複合体のFK506、またはCyPAとの複合体のシクロスポリンA（CsA）は、カルシニューリン活性部位へのNFATの到達を阻止し、その脱リン酸を防止し、それによって、T細胞活性化を阻害する（Brewin,Mancao et al.2009）。本発明の薬剤耐性遺伝子は、FK506および／またはCsAのようなカルシニューリン阻害剤に対して耐性のカルシニューリンの変異型をコードする核酸配列であり得る。具体的な態様において、変異型は、位置：V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360に野生型カルシニューリンヘテロ二量体の少なくとも1個の変異型アミノ酸を含み得、好ましくは、位置T351およびL354またはV314およびY341に二重変異を含み得る。具体的な態様において、GenBank：ACX34092.1に相当する配列において、位置341のバリン残基は、リジン残基またはアルギニン残基に交換され得、位置341のチロシン残基は、フェニルアラニン残基に交換され得；位置347のメチオニンは、グルタミン酸残基、アルギニン残基、またはトリプトファン残基に交換され得；位置351のトレオニンは、グルタミン酸残基に交換され得；位置352のトリプトファン残基は、システイン残基、グルタミン酸残基、またはアラニン残基に交換され得、位置353のセリンは、ヒスチジン残基またはアスパラギン残基に交換され得、位置354のロイシンは、アラニン残基に交換され得；位置360のリジンは、アラニン残基またはフェニルアラニン残基に交換され得る。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、（GenBank：ACX34092.1）に示された野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体aポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。
別の具体的な態様において、変異型は、位置：V120、N123、L124、またはK125に野生型カルシニューリンヘテロ二量体bの少なくとも1個の変異アミノ酸を含み得、好ましくは、位置L124およびK125に二重変異を含み得る。具体的な態様において、GenBank：ACX34095.1に相当するアミノ酸配列において、位置120のバリンは、セリン残基、アスパラギン酸残基、フェニルアラニン残基、またはロイシン残基に交換され得；位置123のアスパラギンは、トリプトファン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジン、またはセリンに交換され得；位置124のロイシンは、トレオニン残基に交換され得；位置125のリジンは、アラニン、グルタミン酸、トリプトファンに交換され得、またはロイシン-アルギニンもしくはイソロイシン-グルタミン酸のような2個の残基が、位置125のリジンの後に付加されてもよい。本明細書に記載されたアミノ酸位置の対応は、（GenBank：ACX34095.1）に示された野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体bポリペプチドの型のアミノ酸の位置でしばしば表される。
別の薬剤耐性遺伝子は、ヒトアルキルグアニントランスフェラーゼ（hAGT）をコードする0(6)-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（MGMT）である。AGTは、ニトロソウレアおよびテモゾロミド（TMZ）のようなアルキル化剤の細胞傷害効果に対する耐性を付与するDNA修復タンパク質である。6-ベンジルグアニン（6-BG）は、ニトロソウレアの毒性を強化するAGTの阻害剤であり、この薬剤の細胞傷害効果を強化するためにTMZと同時投与される。AGTのバリアントをコードするMGMTの数種の変異型は、6-BGによる不活性化に対して高度に耐性であるが、DNA傷害を修復する能力を保持している（Maze,Kurpad et al.1999）。具体的な態様において、AGT変異型は、アミノ酸配列SEQ ID NO:18（UniProtKB：P16455）において、野生型AGT位置P140に変異型アミノ酸を含み得る。好ましい態様において、位置140のプロリンはリジン残基に交換される。
別の薬剤耐性遺伝子は、多剤耐性タンパク質1（MDR1）遺伝子であり得る。この遺伝子は、細胞膜を介した代謝副産物の輸送に関与するP-糖タンパク質（P-GP）として公知の膜糖タンパク質をコードする。P-Gpタンパク質は、数種の構造的に無関係な化学療法剤に対して広い特異性を示す。
多剤耐性タンパク質1の過剰発現は、ミトキサントロンのような薬物に対する耐性を付与することが記載されている（Charles S.Morrow,Christina Peklak-Scott,Bimjhana Bishwokarma,Timothy E.Kute,Pamela K.Smitherman,and Alan J.Townsend.多剤耐性タンパク質1（MRP1、ABCC1）はグルタチオン依存性薬物排出を介してミトキサントロンに対する耐性を媒介する（Multidrug Resistance Protein 1(MRP1,ABCC1) Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux）Mol Pharmacol April 2006 69:1499-1505）。
従って、MDR-1（NP_000918）をコードする核酸配列の発現によって、薬剤耐性を細胞に付与することができる。
薬剤耐性細胞を調製するさらに別の方式は、アムサクリンに対する耐性を付与するため、ヒトトポイソメラーゼII遺伝子のArg486およびGlu571における変異のような特異的な変異を有する細胞を調製することである（S.PATEL,B.A.KELLER,and L.M.FISHER.2000.MOLECULAR PHARMACOLOGY.Vol 57:p784-791(2000)）。
薬剤耐性細胞を調製するさらに別の方式は、ダウノルビシンに対する耐性を付与するため、マイクロRNA-21を過剰発現する細胞を調製することである（白血病K562細胞株におけるPTEN発現の制御によるダウノルビシンに対する耐性におけるmiR-21の関与（Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562 cell line）Bai,Haitao et al.FEBS Letters,Volume 585,Issue 2,402-408）。
好ましい態様において、そのような薬剤耐性を付与するmRNAまたはタンパク質を保持している細胞は、薬物の存在下でまたは薬物の投与時に薬剤耐性細胞の選択的な破壊を可能にする、発現が条件付きである阻害性のmRNAまたは遺伝子も含む。
薬剤耐性遺伝子は、細胞傷害性抗生物質に対する耐性を付与することもでき、ble遺伝子またはmcrA遺伝子であり得る。免疫細胞におけるble遺伝子またはmcrAの異所発現は、化学療法剤、それぞれ、ブレオマイシンまたはマイトマイシンCに曝された時の選択有利性を与得る。
遺伝子治療のための最も実用的なアプローチは、ベクター、好ましくは、ウイルスベクターによる効率的な遺伝子送達を使用することによる、T細胞を操作するための遺伝子の付加である。従って、具体的な態様において、薬剤耐性遺伝子は、好ましくは、少なくとも1種のベクターによってコードされたトランスジーンを、細胞へ導入することによって、細胞において発現させられ得る。
一つの態様において、薬剤耐性遺伝子または薬物に対する耐性を付与する修飾型遺伝子を保持する細胞は、その誘導が細胞死を誘発し、選択的な破壊を可能にする誘導可能な自殺遺伝子も含む。
ゲノムへの遺伝子のランダム挿入は、挿入された遺伝子または挿入部位の近くの遺伝子の不適切な発現をもたらす場合がある。ゲノム内の特定の部位へ遺伝子をターゲティングするための、内在性配列を含む外来性核酸の相同組換えを使用した特異的遺伝子治療は、確実なT細胞の操作を可能にする。前記のように、方法の遺伝子修飾工程は、内在性遺伝子と外来性核酸との間に相同組換えが起こるよう、薬剤耐性遺伝子をコードする配列および内在性遺伝子の一部分を少なくとも含む外来性核酸を細胞へ導入する工程を含み得る。具体的な態様において、内在性遺伝子は、相同組換えの後、野生型遺伝子が、薬物に対する耐性を付与する遺伝子の変異型に交換されるような、野生型「薬剤耐性」遺伝子であり得る。
ヌクレオチド鎖切断による破断は、相同組換えの割合を刺激することが公知である。従って、具体的な態様において、本発明の方法は、内在性遺伝子内の標的配列を切断することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞において発現させる工程をさらに含む。内在性遺伝子は、例えば、DHFR、IMPDH2、カルシニューリン、またはAGTをコードすることができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼであり得る。
抗CD123 CAR発現免疫細胞における薬剤感作遺伝子の不活性化
別の具体的な態様において、薬剤感作遺伝子の不活性化によって、本発明の細胞（抗CD123 CAR発現免疫細胞）へ薬剤耐性を付与することができる。
本発明者らは、免疫治療のためにT細胞を操作するため、具体的には、治療剤（抗癌薬）と組み合わせて使用され得るよう抗CD123 CAR発現免疫細胞を操作するため、可能性のある薬剤感作遺伝子を不活性化しようと努力した。
遺伝子の不活性化とは、関心対象の遺伝子が機能性のタンパク質の形態で発現されないことを意味する。具体的な態様において、方法の遺伝子修飾は、レアカットエンドヌクレアーゼが1種の標的遺伝子において特異的に切断を触媒し、それによって、標的遺伝子を不活性化するよう、1種のレアカットエンドヌクレアーゼを、操作すべき準備された細胞において発現させることに頼る。具体的な態様において、少なくとも1種の薬剤感作遺伝子を不活性化する工程は、少なくとも1種の薬剤感作遺伝子を妨害することができるレアカットエンドヌクレアーゼを細胞へ導入する工程を含む。より具体的な態様において、細胞は、薬剤感作遺伝子を妨害することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸によって形質転換され、レアカットエンドヌクレアーゼが細胞において発現される。レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、またはTALEヌクレアーゼであり得る。好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。
好ましい態様において、T細胞へ薬剤耐性を付与するために不活性化され得る薬剤感作遺伝子は、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（dCK）遺伝子である。この酵素は、デオキシリボヌクレオシド、デオキシシチジン（dC）、デオキシグアノシン（dG）、およびデオキシアデノシン（dA）のリン酸化のために必要とされる。プリンヌクレオチド類似体（PNA）は、dCKによって、一リン酸PNA、二リン酸PNA、および三リン酸PNAに代謝される。三リン酸型、具体的には、クロファラビン三リン酸は、DNA合成についてATPと競合し、アポトーシス促進剤として働き、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（RNR）の強力な阻害剤である。
好ましくは、T細胞におけるdCKの不活性化は、TALEヌクレアーゼによって媒介される。この目標を達成するため、数種のdCK TALEヌクレアーゼの対が、設計され、ポリヌクレオチドレベルで組み立てられ、配列決定によってバリデートされている。本発明に従って使用され得るTALEヌクレアーゼ対の例は、PCT/EP2014/075317に示される。
T細胞におけるこのdCK不活性化は、クロファラビンおよびフルダラビンのようなプリンヌクレオシド類似体（PNA）に対する耐性を付与する。
別の好ましい態様において、T細胞におけるdCK不活性化は、TRAC遺伝子の不活性化と組み合わせられ、これらの二重ノックアウト（KO）T細胞は、クロファラビンのような薬物に対して耐性になり、かつ比較的非同種になる。この二重特色は、免疫治療のための「既製の」同種細胞が、化学療法と共に、癌を有する患者を処置することを可能にする、治療的な目標のために特に有用である。この二重KO不活性化dCK/TRACは、同時にまたは連続的に実施され得る。本発明において成功を与えたTALEヌクレアーゼdCK/TRAC対の一例、具体的には、2種の遺伝子座（dCKおよびTRAC）における標的配列は、PCT/EP2014/075317に記載されている。
不活性化され得る酵素の別の例は、ヒトヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子（Genbank：M26434.1）である。具体的には、HPRTは、癌、具体的には、白血病を有する患者を処置するために現在使用されている、HPRTによって細胞傷害性チオグアニンヌクレオチドに変換される細胞分裂阻害性代謝物質6-チオグアニン（6TG）に対する耐性を付与するため、操作T細胞において不活性化され得る（Hacke,Treger et al.2013）。グアニン類似体は、ホスホリボシル部分の付加を触媒し、6メルカプトプリン（6MP）および6チオグアニン（6TG）を含むTGMPグアニン類似体の形成を可能にするHPRTトランスフェラーゼによって代謝され、ALLを処置するためのリンパ枯渇（lymphodepleting）薬として一般的に使用される。それらは、HPRT（ホスホリボシル部分の付加を触媒し、TGMPの形成を可能にするヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）によって代謝される。その後のリン酸化は、三リン酸化型の形成をもたらし、それは、最終的にはDNAに組み込まれる。DNAへ組み入れられた後、チオGTPは、チオレート基を介してDNA複製のフィデリティーを損ない、細胞完全性にとって高度に有害であるランダム点変異を生成する。
別の態様において、T細胞の表面に通常発現されているCD3の不活性化は、テプリズマブのような抗CD3抗体に対する耐性を付与することができる。
「治療剤」、「化学療法剤」または「薬物」または「抗癌薬」という用語は、本明細書において使用されるように、医薬、好ましくは、癌細胞と相互作用し、それによって、細胞の増殖状態を低下させかつ／または細胞を死滅させることができる化合物またはそれらの誘導体をさす。化学療法剤または「抗癌薬」の例には、アルキル化剤（例えば、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン（Uramustine）、テモゾロミド、ホテムスチン）、代謝拮抗物質（例えば、クロファラビン、フルダラビン、または2'-デオキシアデノシン、メトトレキサート（MTX）、5-フルオロウラシル、もしくはそれらの誘導体、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセドのようなプリンヌクレオシド代謝拮抗薬）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン）、植物由来抗腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、ビンブラスチン、（ビノレルビン）、ドセタキセル、パクリタクセル）、トポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン、トポテカン、エトポシド）が含まれるが、これらに限定されない。
好ましい態様において、治療剤、化学療法薬とは、本明細書において使用されるように、癌を処置するため、具体的には、造血癌細胞、さらに具体的には、AMLを処置し、それによって、癌細胞の増殖状態を低下させかつ／または癌細胞を死滅させるために使用され得る化合物またはそれらの誘導体をさす。化学療法剤の例には、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の他の態様において、本発明の細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、シタラビン、アントラサイクリン、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、およびそれらの組み合わせより選択される薬物（または薬剤）と共に患者へ投与される。
そのような薬剤には、抗癌剤、TRIMETHOTRIXATE（商標）（TMTX）、TEMOZOLOMIDE（商標）、RALTRITREXED（商標）、S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン（NBMPR）、6-ベンジルグアニジン（6-BG）、ビスクロロニトロソウレア（BCNU）、およびCAMPTOTHECIN（商標）、またはそれらのいずれかの治療用誘導体がさらに含まれ得るが、これらに限定されない。
より好ましい態様において、SEQ ID N°44の抗CD123 CARを発現するT細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも1種の治療剤と組み合わせて、患者へ投与される。
本明細書において使用されるように、薬剤に対して「耐性または抵抗性」である細胞とは、修飾なしの細胞の増殖を阻害するかまたは防止する量の薬剤の存在下で、増殖するよう、遺伝子修飾されている細胞を意味する。
抗CD123 CAR発現免疫細胞の多剤耐性
別の具体的な態様において、本発明者らは、患者が異なる薬物によって処置された時の操作されたT細胞の選択を媒介するため、複数の薬物に対して耐性の同種T細胞、具体的には、同種抗CD123 CAR発現T細胞を使用して、「既製の」免疫治療戦略を開発しようと努力した。治療効率は、多剤耐性同種T細胞を遺伝子操作することによって有意に増強され得る。そのような戦略は、相乗効果を示す薬物組み合わせに応答する腫瘍の処置において特に有効であり得る。さらに、操作された多剤耐性T細胞は、増大することができ、最小限の用量の薬剤を使用して選択され得る。
従って、本発明による方法は、T細胞へ多剤耐性を付与するため、T細胞を修飾する工程を含み得る。多剤耐性は、複数の薬剤耐性遺伝子を発現させるか、または複数の薬剤感作遺伝子を不活性化することによって、付与され得る。別の具体的な態様において、多剤耐性は、少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子を発現させ、少なくとも1種の薬剤感作遺伝子を不活性化することによって、T細胞に付与され得る。具体的には、多剤耐性は、DHFRの変異型、IMPDH2の変異型、カルシニューリンの変異型、MGMTの変異型、ble遺伝子、およびmcrA遺伝子のような少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子を発現させ、HPRT遺伝子のような少なくとも1種の薬剤感作遺伝子を不活性化することによって、T細胞に付与され得る。好ましい態様において、多剤耐性は、HPRT遺伝子を不活性化し、DHFRの変異型を発現させることによって；またはHPRT遺伝子を不活性化し、IMPDH2の変異体を発現させることによって；またはHPRT遺伝子を不活性化し、カルシニューリンの変異体を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活性化し、MGMTの変異型を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活性化し、ble遺伝子を発現させることによって；HPRT遺伝子を不活性化し、mcrA遺伝子を発現させることによって、付与され得る。
一つの態様において、本発明は、複数の薬剤耐性遺伝子を発現するか、または複数の薬剤感作遺伝子が不活性化されている、同種抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。
−抗CD123 CAR発現免疫細胞における自殺遺伝子
いくつかの場合において、操作されたT細胞は投与後数年にわたり増大し存続することができるため、投与されたT細胞の選択的除去を可能にする安全機序を含むことが望ましい可能性がある。従って、いくつかの態様において、本発明の方法は、組換え自殺遺伝子によるT細胞の形質転換を含み得る。組換え自殺遺伝子は、対象へ投与された後、T細胞の直接毒性および／または調節されない増殖のリスクを低下させるため、使用される（Quintarelli C,Vera F,blood 2007；Tey SK,Dotti G.,Rooney CM,boil blood marrow transplant 2007）。自殺遺伝子は、インビボで形質転換細胞の選択的除去を可能にする。具体的には、自殺遺伝子は、無毒のプロドラッグを細胞傷害性薬物へ変換するかまたは毒性遺伝子発現産物を発現する能力を有する。換言すると、「自殺遺伝子」とは、単独でまたは他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす産物をコードする核酸である。
そのような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードするものである。付加的な例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ、および5-フルオロシトシンを高度に毒性の化合物5-フルオロウラシルに変換することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼである。自殺遺伝子には、非限定的な例として、カスパーゼ9またはカスパーゼ8またはシトシンデアミナーゼも含まれる。カスパーゼ9は、特異的な化学的二量化誘導因子（CID）を使用して活性化され得る。自殺遺伝子は、細胞の表面に発現され、細胞を治療用モノクローナル抗体に対して感受性にすることができるポリペプチドであってもよい。本明細書において使用されるように、「プロドラッグ」とは、毒性生成物へ変換され得る本発明の方法において有用な任意の化合物を意味する。プロドラッグは、本発明の方法において自殺遺伝子の遺伝子産物によって毒性生成物へ変換される。そのようなプロドラッグの代表例は、HSVチミジンキナーゼによってインビボで毒性化合物へ変換されるガンシクロビルである。ガンシクロビル誘導体は、その後、腫瘍細胞に対して毒性となる。プロドラッグの他の代表例には、アシクロビル、FIAU[1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル]、VZV-TKのための6-メトキシプリンアラビノシド、およびシトシンデアミナーゼのための5-フルオロシトシンが含まれる。
一つの好ましい自殺遺伝子系は、抗CD20 mAb、リツキシマブによって認識される抗原性モチーフ、具体的には、WO2013153391に記載されたいわゆるRQR8ポリペプチドに含まれるようなQBen10を含む、組換え抗原性ポリペプチドを利用する。次いで、必要とされた時に、認可されている抗体薬リツキシマブが、細胞枯渇のために使用され得る。
一つの態様において、本発明は、複数の薬剤耐性遺伝子を発現するかまたは複数の薬剤感作遺伝子が不活性化されており、自殺遺伝子が細胞の破壊を可能にする、同種抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。
クロファラビン耐性抗CD123 CAR発現免疫細胞
本発明は、クロファラビンのような薬物に対して耐性である、治療的に使用するためのT細胞の製造を包含する。それらは、以前に説明されたようなdCK遺伝子の不活性化によって入手され得る。好ましい態様によると、T細胞は、以前に記載されたように、dCK遺伝子およびTCR遺伝子の不活性化を組み合わせることによって、化学療法に対して耐性となり、比較的非同種になる。
従って、本発明は、抗CD123 CAR発現細胞、具体的には、抗CD123 CARを発現するT細胞であって、このCARが（SEQ ID NO 42またはSEQ ID NO：44を含み、任意でヒト化されている）Klon 43に由来しかつdCK遺伝子が不活性化されている、T細胞を提供する。
薬剤耐性同種CAR T細胞の細胞傷害性の試験のためのCD123+/luc+薬剤耐性Daudi細胞
本発明は、CAR T細胞に特異的な表面受容体および耐性遺伝子の両方を発現する標的細胞を製造する方法も包含する。これらの標的細胞は、具体的には、CAR T細胞の細胞傷害性の試験のために有用である。これらの細胞は、臨床的に関連する用量のクロファラビンに対して容易に耐性であり、ルシフェラーゼ活性を保有している。この特色の組み合わせは、マウスモデルにおけるインビボの追跡を可能にするか、または必要とされた時にそれらを破壊する。
より具体的には、それらは、クロファラビンまたはその他のPNAの存在下で、マウスにおける薬剤耐性T細胞の細胞傷害特性を査定するために使用され得る。クロファラビン耐性Daudi細胞は、薬剤耐性B細胞悪性疾患を保有している導入治療から再発した急性リンパ芽球性白血病（ALL）患者の生理学的状態を模倣する。従って、これらの細胞は、薬剤耐性CAR T細胞の信頼性および細胞傷害性を評価するために非常に興味深い。好ましくは、これらの標的細胞は、CD123+ルシフェラーゼ+Daudi細胞である。
単離された細胞
本発明は、CD123に結合するCARを発現する単離された細胞に関する。従って、本発明は、抗CD123 CAR発現細胞に関する。具体的な態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、少なくとも1種の薬物に対して耐性であり、かつ／またはT細胞受容体成分をコードする少なくとも1種の妨害された遺伝子を含む。
好ましい態様において、本発明は、CD123に結合するCARを発現する単離されたT細胞に関する。本発明は、抗CD123 CAR発現T細胞に関する。具体的な態様において、抗CD123 CAR発現T細胞は、少なくとも1種の薬物に対して耐性であり、かつ／またはT細胞受容体成分をコードする少なくとも1種の妨害された遺伝子を含む。
具体的な態様において、抗CD123 CAR T細胞は、少なくとも1種の薬剤耐性遺伝子、好ましくは、ble遺伝子もしくはmcrA遺伝子、または変異体DHFR、変異体IMPDH2、変異体AGT、もしくは変異体カルシニューリンをコードする遺伝子を発現する。
別の具体的な態様において、抗CD123 CAR発現T細胞は、少なくとも1種の妨害されたdCK遺伝子またはHPRT遺伝子のような薬剤感作遺伝子を含む。より具体的な態様において、単離された抗CD123 CAR T細胞は、妨害されたHPRT遺伝子を含み、DHFR変異体を発現する；単離された抗CD123 CAR T細胞は、妨害されたHPRT遺伝子を含み、IMPDH2変異体を発現する；単離された抗CD123 CAR T細胞は、妨害されたHPRT遺伝子を含み、カルシニューリン変異体を発現する；単離された抗CD123 CAR T細胞は、妨害されたHPRT遺伝子を含み、AGT変異体を発現する。
免疫治療において使用するための薬物に対して耐性の同種抗CD123 CAR T細胞
具体的には、本発明は、同種T細胞、具体的には、同種抗CD123 CAR発現T細胞、好ましくは、Klon 43由来のscfvとの80％〜100％の同一性を有するペプチドを含む同種抗CD123 CAR発現T細胞に関し、Klon 43由来のscfvとの80％〜100％の同一性を有するペプチドを含む同種抗CD123 CAR発現T細胞は、より具体的には、薬物に対して耐性であり、免疫治療のために特に適当である。
好ましい態様において、同種抗CD123 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO：44との80％〜100％の同一性を有するペプチドを含み、より具体的には、薬物に対して耐性であり、免疫治療のために特に適当である。
薬物に対する耐性は、薬剤感作遺伝子の不活性化または薬剤耐性遺伝子の発現によって付与され得る。本発明に適した薬物のいくつかの例は、クロファラビンもしくはフルダラビンのようなプリンヌクレオシド類似体（PNA）、または6-メルカプトプリン（6MP）および6チオグアニン（6TG）のようなその他の薬物である。
一つの局面において、本発明は、クロファラビンまたはフルダラビンのようなプリンヌクレオチド類似体（PNA）に対して耐性にし、これらの従来の化学療法によって予め処置された患者における癌免疫治療処置において使用することができるよう、免疫細胞を操作する方法を提供する。
薬物に対する耐性は、dcK遺伝子および／またはHPRT遺伝子のような、薬物に対する細胞の感受性を担う1種以上の遺伝子（薬剤感作遺伝子）を不活性化することによって、T細胞に付与され得る。
別の局面によると、薬物に対する耐性は、薬剤耐性遺伝子を発現させることによって、T細胞に付与され得る。ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、イノシン一リン酸脱水素酵素2（IMPDH2）、カルシニューリン、またはメチルグアニントランスフェラーゼ（MGMT）のような数種の遺伝子のバリアント対立遺伝子は、本発明による細胞へ薬剤耐性を付与することが同定されている。
例えば、キャンパス（アレムツズマブ）またはリツキシマブおよびグルココルチコイドによる処置の薬物標的であるCD52およびグルココルチコイド受容体（GR）を、これらの処置に対して細胞を耐性にし、特異的なCD123 CARを付与されていない患者自身のT細胞と比べて競争有利性を与えるため、不活性化することができる。別の免疫抑制薬であるテプリズマブに対する耐性を付与するため、CD3遺伝子の発現を抑制するかまたは低下させることもできる。化学療法において、具体的には、急性リンパ芽球性白血病の処置のため、一般的に使用される細胞分裂阻害剤である6-チオグアニンに対する耐性を付与するため、HPRTの発現を本発明に従って抑制するかまたは低下させることもできる。
本発明のさらなる局面によると、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1（またはblimp1）、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3より選択される遺伝子のようなT細胞活性化の制御因子として働く「免疫チェックポイント」として働くタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、より高活性にするためまたは消耗を制限するため、免疫細胞をさらに操作することができ、好ましくは、遺伝子はPDCD1またはCTLA-4である。発現を低下させるかまたは抑制することができる遺伝子の例は、表9に示される。
一つの態様において、遺伝子は、β2ミクログロブリンタンパク質をコードするT細胞活性化の制御因子として働く遺伝子である。
本発明のさらなる局面によると、薬物、具体的には、癌、具体的には、AMLのようなCD123発現細胞によって媒介される癌に対する化学療法において使用される薬物に対して耐性にするため、本発明の抗CD123 CAR免疫細胞をさらに操作することができる。これは、薬物に対する耐性を付与する遺伝子を導入することによって達成され得る。この同一の遺伝子は、以前に記載されたような遺伝子誘導可能阻害／発現系を使用することによってオンオフされ得る（Garcia EL,Mills AA(2002)誘導可能Creによって媒介される切り出しによる致死の回避（Getting around lethality with inducible Cre-mediated excision.）Semin Cell Dev Biol 13:151-8、Lewandoski M(2001)マウスにおける遺伝子発現の条件的調節（Conditional control of gene expression in the mouse.）Nat Rev Genet 2:743-55；Scharfenberger L,Hennerici T,Kirly G et al.(2014)皮膚生物学におけるトランスジェニックマウステクノロジー：完全または組織特異的ノックアウトマウスの生成（Transgenic mouse technology in skin biology:Generation of complete or tissue-specific knockout mice.）J Invest Dermatol 134:e16；Schwenk F,Kuhn R,Angrand PO et al.(1998)マウスにおける時間的にかつ空間的に制御された体細胞変異誘発（Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.）Nucleic Acids Res 26:1427-32）。
従って、（i）T細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子が不活性化されており、（ii）薬物に対する耐性を付与する少なくとも1種の遺伝子が組み入れられているか、または薬物に対する感受性を付与する遺伝子が不活性化のために欠失もしくは変異しており、（iii）任意で、表9に開示された遺伝子より選択される別の遺伝子が不活性化されている、抗CD123 CAR発現薬剤耐性免疫細胞が、本発明の目的である。
本発明は、単離された抗CD123 CAR免疫細胞、または本発明の方法によって入手可能な細胞株、より具体的には、本明細書に記載されたタンパク質、ポリペプチド、対立遺伝子バリアント、変更されたもしくは欠失させられた遺伝子、またはベクターのいずれかを含む単離された細胞を包含する。
本発明の免疫細胞または細胞株は、外来性の組換えポリヌクレオチド、具体的には、CARもしくは自殺遺伝子をさらに含んでいてもよいし、または治療用生成物としての、理想的には「既製の」生成物としてのそれらの効率に寄与するチェックポイントタンパク質もしくはそれらのリガンドをコードする変更されたもしくは欠失させられた遺伝子を含んでいてもよい。別の局面において、本発明は、上記の方法によって入手可能な操作された免疫細胞を少なくとも一回投与することによって、患者における癌を処置するかまたは防止する方法に関する。
（表９）免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト
Figure 0006689202
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（表１０）様々なヒト化抗体断片の配列
Figure 0006689202
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好ましい態様において、免疫細胞をさらに操作する方法は、DNA切断によって前述の遺伝子を選択的に不活性化する特異的なレアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、具体的には、mRNAを、T細胞へ導入する工程を含む。より好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。TALヌクレアーゼは、他の型のレアカットエンドヌクレアーゼより高い特異性および切断効率を有することが従来立証されているため、一定のターンオーバーで大規模に操作された免疫細胞を作製するための選り抜きのエンドヌクレアーゼである。
送達方法
前記の異なる方法は、薬剤耐性遺伝子、レアカットエンドヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体（CAR）、具体的には、抗CD123 CAR、より具体的には、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44を含むCAR、および自殺遺伝子のような関心対象のタンパク質を細胞において発現させる工程を含む。
非限定的な例として、関心対象のタンパク質は、好ましくは、少なくとも1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとしての導入によって、細胞において発現させられ得る。ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞において発現させられ得る。あるいは、細胞外でポリペプチドを作製し、次いで、細胞へ導入してもよい。
ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であって、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を含む。
ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔または微粒子銃、細胞融合が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれていてもよい。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含み得る。
異なるトランスジーンが1個のベクターに含まれていてもよい。ベクターは、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含むことができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2個のアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、コドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly et al.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007)を参照すること）。
「コドン」とは、リボソームによって1個のアミノ酸残基へ翻訳される、mRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームの2Aオリゴペプチド配列によって分離されている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2種のポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であって、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。
本発明のより好ましい態様において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、電気穿孔によって、細胞へ直接導入されるmRNAであり得る。本発明者らは、T細胞におけるmRNA電気穿孔のための最適条件を決定した。本発明者らは、細胞への材料の送達のため、生細胞を一時的に透過性にすることをパルス電場の使用によって可能にするcytoPulseテクノロジーを使用した。PulseAgile（BTX Havard Apparatus,84 October Hill Road,Holliston,MA 01746,USA）電気穿孔波形の使用に基づくテクノロジーは、パルスの継続時間、強度、およびパルス間隔の正確な調節を与える（米国特許第6,010,613号および国際PCT出願WO2004083379）。これらのパラメーターは、全て、最小の死亡率での高いトランスフェクション効率のための最良の条件に到達するために修飾され得る。基本的には、最初の高電場パルスが孔形成を可能にし、その後のより低い電場パルスが細胞へのポリヌクレオチドの移動を可能にする。
上記の様々な方法は、CARを細胞へ導入する工程を含む。非限定的な例として、CARは、1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとして導入され得る。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。
ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞外で作製され、次いで、細胞へ導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれ得る。
操作した免疫細胞
本発明は、細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の上記のCARを含む。別の態様において、単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む。具体的には、単離された細胞は、CARをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖する。
既に記載された方法のいずれか一つによって入手された単離された免疫細胞、好ましくは、T細胞も、本発明の範囲に包含される。免疫細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。既に記載された方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性であり、以前の方法によって入手可能である改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。
好ましい態様として、本発明は、患者への同種移植のための、機能性のTCRを発現せず、CD123陽性細胞に対して反応性である、前記のCD123 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団を提供する。
より好ましい態様として、本発明は、選択された薬物によって処置された患者への同種移植のための、前記のCD123陽性細胞に対して反応性であり、機能性のTCRを発現せず、選択された薬物に対して耐性である、CD123 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団を提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44のポリペプチドを含む抗CD123 CAR、さらに好ましくは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44との80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む抗CD123 CAR、具体的には、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44との85％〜99％の同一性を含む抗CD123 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団を提供する。
T細胞の活性化および増大
本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖するが、本発明の免疫細胞、具体的には、T細胞は、T細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法を一般に使用して、さらに活性化させ増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。
概して本発明のT細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。
非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の増殖のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、対象へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）で維持される。様々な刺激時間に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。
別の具体的な態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させることができる。細胞は、細胞を対象へ投与した後、インビボで、例えば、対象の血液中で増大させてもよい。
治療的適用
別の態様において、既に記載されたような異なる方法によって入手された単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。
別の態様において、医薬は、その必要のある患者において、癌を処置するため、具体的には、B細胞リンパ腫およびB細胞白血病の処置のため、使用され得る。
別の態様において、本発明による単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者における癌の処置のための医薬の製造において使用され得る。
具体的な態様において、抗CD123 CAR発現T細胞は、AML、AML亜型 、AML関連合併症、AML関連状態の処置のための医薬として提供される。好ましい態様において、SEQ ID NO 44を含む抗CD123 CARを発現するT細胞が、医薬として提供される。
別の態様において、医薬は、CD123発現細胞によって媒介される病理学的状態またはCD123発現細胞の直接もしくは間接の活性を特徴とする状態を処置するために使用され得る。換言すると、本発明は、CD123発現細胞の有害な活性に関連した状態を処置するための、具体的には、AML、AML亜型、AML関連合併症、AML関連状態より選択される状態を処置するための医薬として使用するための、SEQ ID NO 44の80％〜100％を含む抗CD123 CAR発現T細胞に関する。
別の局面において、本発明は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に依る：
（a）既に記載された方法のいずれかによって入手可能な免疫細胞を準備する工程、
（b）形質転換された免疫細胞を患者へ投与する工程。
一つの態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。
処置は、寛解的、治癒的、または予防的であり得る。それは、自己免疫治療の一部または同種異系免疫治療処置の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合性ドナーに起因することを意味する。同種異系とは、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。
開示された方法によって使用され得る細胞は、以前のセクションに記載されている。処置は、CD123発現細胞、具体的には、過剰量のCD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。そのような状態は、白血病または悪性リンパ増殖性障害のような血液癌において見出される。リンパ増殖性障害は、リンパ腫、具体的には、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）であり得る。
処置され得る癌には、プレB ALL（小児適応症）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大B細胞型リンパ腫等を含むが、これらに限定されない、血液腫瘍のような非固形腫瘍が含まれ得る。本発明のCARによって処置される癌の型には、白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も含まれる。
一つの態様において、本発明は、CD123発現細胞によって媒介される疾患、具体的には、CD123発現細胞によって媒介される血液癌の処置において使用するための、本発明の抗CD123 CAR発現T細胞を含む組成物を提供し、好ましくは、抗CD123 CARは、SEQ ID NO：44またはSEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44である。
本明細書に開示された他のCD123によって媒介されるかまたはCD123が関与しているリンパ増殖性障害も、本発明の抗CD123 CAR発現細胞によって改善され得る。
好ましい態様において、本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使用して処置され得る癌は、白血病、白血病に関連した疾患、またはそれらの合併症である。
本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使用して処置され得る白血病は、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群であり得る。
本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使用して処置され得るAMLまたはAML亜型は、具体的には、CD123陽性細胞が関与している、急性骨髄芽球性白血病、最小分化型（minimally differentiated）急性骨髄芽球性白血病、成熟を伴わない急性骨髄芽球性白血病、顆粒球成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病（APL）、急性骨髄単球性白血病、骨髄好酸球増加を伴う骨髄単球性白血病、急性単芽球性白血病（M5a）または急性単球性白血病（M5b）、急性赤白血病（M6a）および極めて稀な純赤血球性（pure erythroid）白血病（M6b）を含む急性赤血球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基球性白血病、骨髄繊維症を伴う急性汎骨髄症であり得る。
AMLの亜型には、毛様細胞性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病も含まれる。
AMLは、特異的な遺伝的異常を含むAMLとして分類され得る。分類は、導入治療に対する応答、再発リスク、生存を予測する核型の能力に基づく。
従って、本発明の抗CD123 CAR発現細胞を使用して処置され得るAMLは、8番染色体と21番染色体との間の転座を伴うAML、16番染色体における転座または反転を伴うAML、9番染色体と11番染色体との間の転座を伴うAML、15番染色体と17番染色体との間の転座を伴うAPL（M3）、6番染色体と9番染色体との間の転座を伴うAML、3番染色体における転座または反転を伴うAML、1番染色体と22番染色体との間の転座を伴うAML（巨核芽球性）であり得る。
本発明は、これらの特定の細胞遺伝学的マーカーに関連したAMLの処置のために特に有用である。
本発明は、オールトランス型レチノイン酸（ATRA）16-19を使用して同定されたt(15;17)(q22;q21)を有する患者のようなAMLの特定の細胞遺伝学的サブセットを有する患者の処置のため、および高用量シタラビンの反復投与を使用して同定されたt(8;21)(q22;q22)またはinv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)を有する患者の処置のための、抗CD123CAR発現T細胞も提供する。
好ましくは、本発明は、低い完全寛解率および生存率を有することが示されている-5/del(5q),-7、3qの異常、または複合核型のような異常を有する患者の処置のための抗CD123 CAR発現T細胞を提供する。
患者の群
好ましい態様において、本発明は、60歳を超える患者または20歳未満の患者におけるAMLの処置を提供する。より好ましい態様において、本発明は、小児処置、特に、AMLまたはAMLに関連する疾患もしくは合併症に対する小児処置を提供する。
さらに別の好ましい態様において、本発明は、低いか、不良であるか、または不利な状況を有する、即ち、5年生存率未満の予測生存を有するAML患者において、処置として使用される。この群において、以下の細胞遺伝学的特徴：-5；5q；-7；7q-；11q23；non t(9;11)；inv(3)；t(3;3)；t(6;9)；t(9;22)を有するAMLに罹患している患者は、不良リスク状態に関連しており（Byrd J.C.et al.,December 15,2002;Blood:100(13)）、本発明に従ってまたは本発明の目的によって処置されることが特に企図される。
一つの態様において、本発明の抗CD123 CAR発現T細胞は、AMLを有する患者において、導入治療、AMLの寛解後治療、またはコンソリデーション治療として使用され得る。好ましくは、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44の少なくとも1種の抗CD123 CARを発現する細胞は、AMLを有する患者において、AMLの寛解後治療またはコンソリデーション治療として使用される。
一つの態様において、本発明の抗CD123 CAR発現T細胞は、AML再発の症例または難治性もしくは耐性のAMLの症例において使用され得る。好ましくは、本発明のSEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44の少なくとも1種の抗CD123 CARを含む細胞は、より好ましくは、少なくとも1種の他の抗癌薬と組み合わせて、AML再発を有するかまたは難治性もしくは耐性のAMLを有する患者において使用される。
別の好ましい態様において、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44の少なくとも1種の抗CD123 CARを発現する細胞は、具体的には、抗癌処置の後、骨髄枯渇の間、または骨髄移植の前、骨髄破壊の後に起こる癌細胞発達を防止するために使用される。
AML合併症
一つの具体的な態様において、本発明は、患者、具体的には、AMLに関係する合併症を起こしている患者の健康状態を改善する医薬を提供する。より好ましくは、本発明の操作された抗CD123 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44の少なくとも1種の抗CD123 CARを発現しており、AMLに関係する合併症の処置のための医薬として使用される。
AMLに関係する合併症または疾患には、先行する骨髄異形成期、二次性白血病、具体的には、二次性AML、高白血球数、およびアウエル小体の欠如が含まれ得る。とりわけ、白血球停滞および中枢神経系（CNS）の関与、白血球増加症、残存疾患も、AMLに関係する合併症または疾患と見なされる。
AML関連疾患
一つの態様において、本発明は、AMLに関係する病理学的状態の処置のための抗CD123 CAR発現T細胞も提供する。好ましくは、本発明は、AMLに関係する病理学的状態の処置のためのSEQ ID NO：1＋SEQ ID NO：44の少なくとも1種の抗CD123 CARを発現する細胞を提供する。本発明は、AML関連骨髄新生物、急性骨髄白血病、および骨髄異形成症候群の治療、再発したまたは難治性の急性骨髄白血病の処置、成人における再発したまたは難治性の急性前骨髄球性白血病の処置、急性前骨髄（promyeloid）白血病の処置、60歳を超える成人における急性骨髄白血病の処置を提供する。
別の局面によると、本発明は、AML関連疾患、具体的には、AMLに関係する血液悪性疾患の処置のための組成物を提供する。
AML状態に関係する血液悪性疾患には、無効な骨髄系血液細胞の産生（または異形成）、およびAMへの形質転換のリスクと合併した血液状態の多様なコレクションである骨髄異形成症候群（MDS、以前は「前白血病」として公知であった）が含まれる。
別の態様において、本発明は、多発性骨髄腫に罹患している患者の健康状態を改善する医薬を提供する。
AMLのリスクに関連した他の病理学的状態または遺伝的症候群も、本発明の適切な使用によって改善され得、それらの遺伝的症候群には、ダウン症、トリソミー、ファンコニー貧血、ブルーム症候群、毛細血管拡張性運動失調、ダイヤモンド・ブラックファン貧血、シュワックマン・ダイヤモンド症候群、リー・フラウメニ症候群、1型神経繊維腫症、重度先天性好中球減少症（コストマン症候群とも呼ばれる）が含まれる。
他のCD123によって媒介される病理学的状態
別の局面によると、本発明は、CD123+細胞によって媒介される疾患の処置のための組成物を提供する。これらのCD123+細胞によって媒介される疾患には、炎症、自己免疫疾患が含まれる。
具体的には、本発明は、胃腸粘膜の炎症、より具体的には、炎症性腸疾患、鼻アレルギー、若年性皮膚筋炎のような皮膚の炎症、血液皮膚疾患（hematodermia）のようなCD123+細胞によって媒介される疾患の処置のために使用され得る。
本発明は、自己免疫疾患、具体的には、キクシ（Kikushi）病のような、CD123+細胞によって媒介される疾患の処置のための医薬として使用され得る。
好ましくは、本発明は、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、具体的には、腫瘍ウイルス、HHV-8、HHV-6、HTLV、またはHIVのようなウイルスによる感染、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、または四日熱マラリア原虫による感染のような寄生虫感染を含む再発性感染の処置を提供する。
具体的には、本発明は、エプスタイン・バーウイルスリンパ節炎、単純ヘルペスウイルスリンパ節炎の処置を提供する。
別の局面において、本発明は、全身性エリテマトーデスリンパ節炎、結核、嚢胞性繊維症、肝炎、胆道閉鎖症、具体的には、子供におけるウイルスによって誘導された肝炎または胆道閉鎖症、自己免疫性肝炎；原発性胆汁性肝硬変の処置のための組成物を提供する。
医薬として使用するための本発明による操作されたT細胞を含む組成物および方法
本発明は、疾患を処置するために使用するための組成物、またはその方法も提供する。一つの局面において、疾患は、血液癌、具体的には、幹細胞癌であり、（急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群のような）白血病、ならびに（多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型および大細胞型の濾胞性リンパ腫のような）リンパ腫を含む悪性リンパ増殖性状態、またはそれらの合併症を含むが、これらに限定されない。
本発明は、患者におけるCD123発現細胞集団の増殖を阻害するかもしくはその活性を低下させるために使用するための組成物、またはその方法も提供する。例示的な方法は、CD123発現細胞を含む細胞の集団を、CD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞と接触させる工程を含む。
より具体的な局面において、本発明は、患者におけるCD123を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するかもしくはそれを低下させるために使用するための組成物、または本発明のCD123 CART細胞のCD123発現癌細胞との結合がCD123発現癌細胞の破壊をもたらすよう、CD123発現癌細胞集団をCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞と接触させる工程を含む、その方法を提供する。
ある種の局面において、本発明のCD123 CART細胞は、骨髄白血病またはCD123発現細胞に関連した別の癌を有する対象またはその動物モデルにおいて、細胞および／または癌細胞の含量、数、量、または率を、陰性対照と比べて、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも65％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも95％、または少なくとも99％（検出不可能なレベルにまで）低下させる。
本発明は、（例えば、血液癌に関連した）CD123発現細胞に関連した障害もしくは状態を防止し、処置し、かつ／もしくは管理するために使用するための組成物、またはCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞をその必要のある対象へ投与する工程を含む、その方法を提供する。一つの局面において、対象はヒトである。CD123発現細胞に関連した障害の非限定的な例には、（ループスのような）自己免疫障害、（アレルギー、IBD、および喘息のような）炎症性障害、ならびに（血液癌、具体的には、AMLまたはAML合併症のような）癌が含まれる。
本発明は、CD123発現細胞に関連した疾患を防止し、処置し、かつ／もしくは管理するために使用するための組成物、またはCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞をその必要のある対象へ投与する工程を含む、その方法も提供する。一つの局面において、対象はヒトである。CD123発現細胞に関連した疾患の非限定的な例には、急性骨髄白血病（AML）、骨髄異形成、B細胞急性リンパ性白血病、T細胞急性リンパ性白血病、毛様細胞性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、慢性骨髄白血病、ホジキンリンパ腫が含まれる。
本発明は、CD123発現細胞に関連した癌の再発を処置するかもしくは防止するために使用するための組成物、またはCD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞をその必要のある対象へ投与する工程を含む、その方法を提供する。別の局面において、本発明は、有効量の別の治療と組み合わせて、CD123発現細胞に結合する本発明のCD123 CART細胞を、有効量、その必要のある対象へ投与する工程を含む。
一つの局面において、CD123は、AMLにおける「癌幹細胞」マーカーであると考えられている。従って、本発明のCD123 CART細胞は、AMLの再発を防止することができるか、または大部分がCD123陰性であるがCD123+細胞（CD123発現細胞）の「幹」集団を含むAMLを処置することすらできる。
一つの局面において、本発明は、CD19の発現レベルの上昇に関連した疾患または障害のための処置を受けたことがあって、CD123のレベルの上昇に関連した疾患または障害を示す対象を処置するための組成物および方法を提供する。
一つの局面において、B細胞急性リンパ性白血病（ALL）は、CART細胞を使用した連続処置を必要とする疾患の例である。例えば、抗CD19 CAR T細胞による処置は、時に、CD19陰性再発をもたらす場合があり、それは本発明の抗CD123 CAR T細胞によって処置され得る。あるいは、本発明は、抗CD19 CARおよび抗CD123 CARを含むCART細胞を使用したB-ALLの二重ターゲティングを含む。
本発明による操作された免疫細胞による処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせられてもよい。
好ましくは、本発明による操作された免疫細胞による処置は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸の組み合わせ、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせより選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）投与され得る。
本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して抵抗性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するべきである。
本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。
細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり104〜109個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり105〜106個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。
別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。
本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。
本発明のある種の態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、アラシチン、シトシンアラビノシド、アムサクリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ノバントロン、ミトキサントロン、ベプシド、エトポシド（VP16）、亜ヒ酸、トランス型レチノイン酸、メクロレタミン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせより選択される薬物と共に（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者へ投与される。これらの態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、抗CD123 CAR発現細胞と共に投与される特定の薬物または薬物の組み合わせに対して耐性であり得る。
本発明の他の態様において、抗CD123 CAR発現細胞は、シタラビン、アントラサイクリン、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、およびそれらの組み合わせより選択される薬物と共に患者へ投与される。
他の定義
他に特記されない限り、「a」、「an」、「the」、および「少なくとも1」は、交換可能に使用され、1または複数を意味する。ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。
アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。
ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：anはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基部分の修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。CARは通常、細胞外単鎖抗体（scFvFc）がT細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（scFvFc:ζ）からなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。本発明において使用されるCARの一例は、CD123抗原に対するCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：SEQ ID NO:23〜48を含み得る。
「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素またはバリアント酵素をさす。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列においてDNA分子またはRNA分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、12塩基対（bp）より長い、より好ましくは、14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時、レアカットエンドヌクレアーゼとして分類され得る。レアカットエンドヌクレアーゼは、定義された場所においてDNA二本鎖切断（DSB）を誘導することによって、HRを有意に増加させる（Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin et al.1995；Pingoud and Silva 2007）。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Paques and Duchateau 2007）、操作したジンクフィンガードメインとFoklのような制限酵素の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Porteus and Carroll 2005）、 CRISPR系に由来するCas9エンドヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいては、化学的なまたはペプチド性の切断剤が、核酸のポリマーまたは特定の標的配列を認識する他のDNAのいずれかにコンジュゲートされ、それによって、切断活性を特定の配列へターゲティングする。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のDNA配列に結合することが公知の、オルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される（Kalish and Glazer 2005）。そのような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。
「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）とは、典型的には、転写活性化因子様（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断する1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を表す。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、I-Tevl、ColE7、NucA、Fok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。具体的な態様において、TALEドメインは、例えば、I-CrelおよびI-Onulまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい態様において、ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALEヌクレアーゼとは、WO2012138927に記載された、操作されたTALリピートとI-Tevlの触媒ドメインとの融合のような、特異的な認識および切断のために二量化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、各リピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な2残基（RVD）を12位および13位に含む。類似したモジュラー塩基対塩基核酸結合（modular base-per-base nucleic acid binding）特性を有する結合ドメイン（MBBBD）も、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TALリピートより多くの配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、Tを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の態様において、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性をモジュレートするため、具体的には、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に変異させてもよい。TALEヌクレアーゼは、既に記載され、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するために使用されている（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.2011）。操作されたTALヌクレアーゼは、商標TALEN（商標）の下で市販されている（Cellectis,8 rue de la Croix Jarry,75013 Paris,France）。
本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼでもあり得る。最近、II型原核生物CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）適応免疫系（概説については（Sorek,Lawrence et al.2013）を参照されたい）から、RNAガイド（RNA-guided）Cas9ヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）に基づき、新しいゲノム操作ツールが開発された。CRISPR関連（Cas）系は、細菌において最初に発見され、外来DNA、ウイルスまたはプラスミドに対する防御として機能する。CRISPRによって媒介されるゲノム操作は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフがしばしば隣接している標的配列の選択によって進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特異的なcrRNAが操作される。CRISPR II型系において必要とされるトランス活性化crRNA（tracrRNA）は、crRNAと対合し、供給されたCas9タンパク質へ結合する。Cas9は、tracRNAのcRNAとの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Deltcheva,Chylinski et al.2011）。この三元複合体において、二重tracrRNA:crRNA構造は、同族標的配列にエンドヌクレアーゼCas9を差し向けるガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性について標的配列を走査することによって開始される。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−PAM）の存在を必要とする。その後、二重RNAと標的配列との間の対合に続き、Cas9が、PAMモチーフの3塩基上流に平滑末端二本鎖切断を導入する（Garneau,Dupuis et al.2010）。
レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野において周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖の切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、12〜45塩基対（bp）長、通常14〜40bp長の範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-Crelバリアントであり得る。
「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのようなその他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達方法も表す。
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。
「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。
細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。
「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。
非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。
これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。
「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。
「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1個の残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。
「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。
「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。
「類似性」とは、2種以上のポリペプチドのアミノ酸配列の間の関係を記載する。BLASTPも、BLOSUM45、BLOSUM62、またはBLOSUM80のような類似性マトリックスを使用して、参照アミノ酸配列との少なくとも70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示し；BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されたアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似したポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって入手され得る。例えば、pTαの機能的バリアントは、SEQ ID NO：107のアミノ酸配列と70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有し得る。そのような機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって作製されるであろう。
「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。
「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。
「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。
「再発」という用語は、治療後、癌の寛解を有していた対象または哺乳動物が癌細胞の復帰を有する状況をさす。
「難治性または耐性」という用語は、対象または哺乳動物が、集中的な処置の後ですら、体内に残存癌細胞を有する環境をさす。
「薬剤耐性」という用語は、疾患が薬物の処置に応答しない状態をさす。薬剤耐性は、内因性（もしくは一次耐性）（疾患が薬物に全く応答性でないことを意味する）、または獲得型（二次耐性）（疾患が以前は応答した薬物に応答しなくなることを意味する）のいずれかであり得る。ある種の態様において、薬剤耐性は内因性である。ある種の態様において、薬剤耐性は獲得型である。
「血液悪性疾患」または「血液癌」という用語は、身体の血液-骨髄および／またはリンパ組織の癌をさす。血液悪性疾患の例には、例えば、急性リンパ球性白血病（ALL）、急性骨髄白血病（AML）、急性前骨髄球性白血病（APL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄白血病（CML）、慢性好中球性白血病（CNL）、急性未分化白血病（AUL）、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、前リンパ球性白血病（PML）、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、成人T細胞ALL、三血球系骨髄異形成を伴うAML（AML/TMDS）、混合系統白血病（MLL）、骨髄異形成症候群（MDS）、骨髄増殖性障害（MPD）、および多発性骨髄腫（MM）のような、皮膚リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病（ホジキンリンパ腫とも呼ばれる）、および骨髄腫のような、骨髄異形成、白血病、リンパ腫が含まれる。
「白血病」という用語は、造血組織の悪性新生物をさし、慢性リンパ球性白血病または慢性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄白血病または急性骨髄性白血病（AML）、および急性骨髄芽球性白血病を含むが、これらに限定されない。
上記の本発明の説明は、当業者が本発明を作成し使用することが可能になるよう、本発明を作成し使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。
本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。
上記の説明は、当業者が本発明を作成し使用することを可能にするために提示され、特定の適用およびその必要条件に関して提供される。好ましい態様に対する様々な改変は、当業者に容易に明白になり、本明細書において定義された一般原理は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の態様および適用に適用され得る。従って、本発明は、示された態様に限定されず、本明細書に開示された原理および特色と一致する最も広い範囲を与えられるものとする。
本発明を全般的に説明したが、ある種の具体例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。それらの具体例は、例示目的のために本明細書に提供されるに過ぎず、他に特記されない限り、限定するためのものではない。
概略法
初代T細胞培養物
フィコール勾配密度媒体を使用して、EFS（Etablissement Francais du Sang,Paris,France）によって提供されたバフィーコート試料から、T細胞を精製した。PBMC層を回収し、T細胞を市販されているT細胞濃縮キットを使用して精製した。精製されたT細胞を、20ng/mLヒトIL-2、5％ヒト、およびビーズ:細胞比1:1のDynabeads Human T activator CD3/CD28（Life Technologies）が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において活性化した。
CAR mRNAトランスフェクション
T細胞の精製および活性化の後、4日目または11日目に、トランスフェクションを行った。5百万個の細胞を、異なるCAR構築物をコードする15μgのmRNAによってトランスフェクトした。最終体積200μlの「Cytoporation buffer T」（BTX Harvard Apparatus）において、0.4cmギャップキュベットにおいて、3000V/cmで0.1mSパルスを2回適用した後、325V/cmで0.2mSパルスを4回適用することによって、Cytopulseテクノロジーを使用して行われたT7 mRNAポリメラーゼトランスフェクションを使用して、CAR mRNAを作製した。細胞をX-Vivo（商標）-15培地で直ちに希釈し、5％CO2と共に37℃でインキュベートした。IL-2を、20ng/mLで、電気穿孔の2時間後に添加した。
脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
96穴プレートにおいて、様々なレベルのCD123タンパク質を発現する等量の細胞と共に、T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO2で37℃で6時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。共培養の開始時に、1μg/mlの抗CD49d、1μg/mlの抗CD28、および1×モネンシン溶液と共に蛍光性抗CD107a抗体を添加することによって、細胞刺激中にCD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生死細胞判定色素および蛍光色素結合型抗CD8によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD8+/CD107a+細胞の％として、そしてCD8+細胞におけるCD107a染色についての平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって、脱顆粒活性を決定した。脱顆粒アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に実施された。
IFNγ放出アッセイ
96穴プレートにおいて、様々なレベルのCD123タンパク質を発現する細胞株と共に、T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO2で37℃で24時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。このインキュベーション期間の後、プレートを5分間1500rpmで遠心分離し、上清を新しいプレートに回収した。細胞培養上清中のIFNγ検出をELISAアッセイによって行った。IFNγ放出アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に細胞共培養を始めることによって実施された。
細胞傷害アッセイ
96穴プレートにおいて、同一のウェルにおいて、10,000個の標的細胞（CD123発現）および10,000個の対照細胞（CD123陰性）と共に、T細胞をインキュベートした（100,000細胞/ウェル）。標的細胞および対照細胞は、CAR+T細胞との共培養の前に、蛍光性の細胞内色素（CFSEまたはCell Trace Violet）によって標識された。共培養物を5％CO2で37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を固定可能な生死細胞判定色素によって標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはCD123陰性対照細胞）の生存率を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。細胞傷害アッセイは、mRNAトランスフェクションの48時間後に実施された。
−T細胞形質導入
CARの発現のための組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を、T細胞精製／活性化の3日後に実施した。T細胞の表面のCAR検出を、ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインのマウスIgG1 Fc断片との融合からなる組換えタンパク質を使用して行った。このタンパク質のCAR分子との結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とする蛍光色素結合型二次抗体によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。
−抗腫瘍マウスモデル
AML異種移植片マウスモデルとして、免疫不全NOGマウスに、CD123発現MOLM13-ルシフェラーゼ細胞を静脈内（iv）注射した。任意で、マウスは抗癌処置を受容した。次いで、異なる用量の試験されるCAR+T細胞、またはCARレンチウイルスベクターによって形質導入されていないT細胞を、（腫瘍細胞株の注射の2日後または7日後のいずれかに）マウスにiv注射した。異なる動物における腫瘍進行を追跡するため、T細胞注射の当日（D0）、T細胞注射後7日目、14日目、21日目、28日目、および40日目に生物発光シグナルを決定した。
実施例1：CD123-CARを発現するTCRα不活性化細胞の増殖
T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC）遺伝子内の15bpスペーサーによって分離された2個の17bp長配列（半標的と呼ばれる）を標的とする異種二量体TALEヌクレアーゼを設計し作製した。各半標的は、表10にリストされた半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。
（表１０）TCRα遺伝子を標的とするTALヌクレアーゼ
Figure 0006689202
各TALEヌクレアーゼ構築物を、T7プロモーターの調節下で、制限酵素消化を使用して哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、T7プロモーターの下流にコード配列を保持しているプラスミドから合成した。
抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって72時間予め活性化された精製されたT細胞を、両方の半TRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2種のmRNAの各々によってトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、同一のドナーに由来するT細胞の異なる群を、以前に記載されたCD-123 CAR（SEQ ID NO:23〜48）のうちの1種をコードするレンチウイルスベクターによってそれぞれ形質導入した。形質導入の2日後、CD3陰性細胞を抗CD3磁気ビーズを使用して精製し、形質導入の5日後、細胞を可溶性抗CD28（5μg/ml）によって再活性化した。
週に2回、細胞を計数することによって、再活性化の30日後まで細胞増殖を追跡した。特に、抗CD28によって再活性化された時、非形質導入細胞と比較して、TCRα不活性化CD-123 CAR発現細胞の増殖の増加が観察された。
CD123-CAR発現ヒトT細胞が活性化状態を示すか否かを調査するため、活性化マーカーCD25の発現を、形質導入の7日後に、FACSによって分析する。CD-123 CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入された精製された細胞を、非形質導入細胞と比較して、活性化を査定するため、表面におけるCD25発現についてアッセイする。CD28再活性化条件または非再活性化条件の両方において、CD25発現の増加が予想される。
実施例2：
様々な抗CD123抗体断片を使用したCD123 CARの構築
初代T細胞培養物
フィコール勾配密度媒体（Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences）を使用して、EFS（Etablissement Francais du Sang,Paris,France）によって提供されたバフィーコート試料から、T細胞を精製した。PBMC層を回収し、市販されているT細胞濃縮キット（Stem Cell Technologies）を使用して、T細胞を精製した。20ng/mLヒトIL-2（Miltenyi Biotec）、5％ヒト血清（Sera Laboratories）、およびビーズ:細胞比1:1のDynabeads Human T activator CD3/CD28（Life Technologies）が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において、精製されたT細胞を活性化した。活性化後、20ng/mLヒトIL-2（Miltenyi Biotec）および5％ヒト血清（Sera Laboratories）が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において、細胞を増殖させ維持した。
CAR mRNAトランスフェクション
T細胞の精製および活性化の後、4日目または11日目に、トランスフェクションを行った。5百万個の細胞を、異なるCAR構築物をコードする15μgのmRNAによってトランスフェクトした。mMESSAGE mMACHINE T7キット（Life Technologies）を使用してCAR mRNAを作製し、Rneasy Mini Spin Columns（Qiagen）を使用して精製した。最終体積200μlの「Cytoporation buffer T」（BTX Harvard Apparatus）において、0.4cmギャップキュベットにおいて、3000V/cmで0.1mSパルスを2回適用した後、325V/cmで0.2mSパルスを4回適用することによって、Cytopulseテクノロジーを使用してトランスフェクションを行った。細胞をX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）で直ちに希釈し、5％CO2と共に37℃でインキュベートした。電気穿孔の2時間後に、20ng/mLのIL-2（Miltenyi Biotec）を添加した。
脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
96穴プレートにおいて、等量のCD123タンパク質を発現する細胞または発現しない細胞と共に、T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO2で37℃で6時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。共培養の開始時に、1μg/mlの抗CD49d（BD Pharmingen）、1μg/mlの抗CD28（Miltenyi Biotec）、および1×モネンシン溶液（eBioscience）と共に蛍光性抗CD107a抗体（APC結合型、Miltenyi Biotec）を添加することによって、細胞刺激中にCD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生死細胞判定色素（eFluor 780、eBioscience）および蛍光色素結合型抗CD8（PE結合型、Miltenyi Biotec）によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD8+/CD107a+細胞の％として、そしてCD8+細胞におけるCD107a染色についての平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって、脱顆粒活性を決定した。脱顆粒アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に実施された。
IFNγ放出アッセイ
96穴プレートにおいて、CD123タンパク質を発現する細胞株または発現しない細胞株と共に、T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO2で37℃で24時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。このインキュベーション期間の後、プレートを5分間1500rpmで遠心分離し、上清を新しいプレートに回収した。細胞培養上清中のIFNγ検出をELISAアッセイ（Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit、R&D Systems）によって行った。IFNγ放出アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に細胞共培養を始めることによって実施された。
細胞傷害アッセイ
96穴プレートにおいて、同一のウェルにおいて、10,000個の標的細胞（CD123発現）および10,000個の対照細胞（CD123陰性）と共に、T細胞をインキュベートした（100,000細胞/ウェル）。標的細胞および対照細胞は、CAR+T細胞との共培養の前に蛍光性の細胞内色素（CFSEまたはCell Trace Violet、Life Technologies）によって標識された。共培養物を5％CO2で37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を固定可能な生死細胞判定色素（eFluor 780、eBioscience）によって標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはCD123陰性対照細胞）の生存率を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。細胞傷害アッセイは、mRNAトランスフェクションの48時間後に実施された。
結果
キメラ抗原受容体（CAR）を生成し、CD123+細胞に対する脱顆粒活性についてスクリーニングするため、7G3、32716、Klon 43、12F1、26292、およびOld4に由来する6種の異なるscFvを使用した。
異なる構成を設計し（図2および図3）、ヒトT細胞における一過性発現によって活性を決定した（図5、図6、図7、および図8）。
バフィーコート試料からT細胞を精製し、CD3/CD28ビーズを使用して活性化した。活性化の4日後に、（PulseAgile電気穿孔を使用して）異なるCAR分子をコードするmRNAによって細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後に脱顆粒活性を査定した。
図4および図5に図示された結果は、CAR+T細胞をCD123発現細胞（RPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と共に6時間共培養した時の単一構成（v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通）についての6種の異なるscFvの脱顆粒活性を示す。白色のバーは、単独で培養されたT細胞において観察された脱顆粒シグナルに相当し、黒色のバーは、T細胞をRPMI8226細胞と共培養した時に観察されたシグナルを表し、灰色のバーは、K562細胞と共培養されたT細胞の脱顆粒シグナルを示す。
図4は、CAR+T細胞をCD123発現細胞（RPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と6時間共培養した時の単一構成（v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通）についての6種の異なるscFvの脱顆粒活性を脱顆粒の率（％）で示す。
図5は、CD123陰性細胞（K562）または高レベルもしくは低レベルのCD123を発現する細胞（それぞれ、RPMI8226およびKG1a）と6時間共培養した後のCAR T細胞の脱顆粒活性（CD107a+細胞）を平均蛍光活性（MFI）で示す。結果は、3回の独立の実験の平均値を表す。
驚くべきことに、7G3は、強力な親和性およびアビディティおよびインビボの有効性を示す抗CD123抗体であるが（Jin et al.,2009;Cell Stem Cell 5,31-42）、結果は、7G3に由来するCD123 CAR T細胞が、本実験環境において活性でなかったことを示している。26292-CAR、32716-CAR、およびKlon43-CARを発現する細胞は、対照（モック）と比較して強力な活性を示し、Klon43 CAR発現細胞が最も高活性であった。
興味深いことに、26292 CAR発現細胞および32716 CAR発現細胞は、CD123を発現しない細胞（K562）に対してわずかに活性であり（灰色のバー）、CD123を発現しない細胞に対するKlon43の活性は、モックT細胞のものと比較可能であった。
図2に図示されるように生成されたCAR分子のうち、8種をさらなる活性試験のために選択した（図6、図7、および図8）。
Klon43、12F1、32716、および26292に由来する抗CD123 scFv抗体断片を使用したCD123 CARの構築、ならびに機能分析
このため、バフィーコート試料からT細胞を単離し、CD3/CD28ビーズを使用して活性化した。細胞を、活性化の後、11日目に、異なる候補をコードするmRNAによって一過性トランスフェクトした。CD123を発現する細胞または発現しない細胞と共培養された時の脱顆粒能力、IFNγ放出、および細胞傷害活性を測定することによって、CAR活性を査定した。
図6は、CD123陰性細胞（K562）または高レベルもしくは低レベルのCD123を発現する細胞（それぞれ、RPMI8226およびKG1a）と6時間共培養した後のCAR T細胞の脱顆粒活性（CD107a+細胞）を示す。共培養は、CAR mRNA電気穿孔の24時間後に開始された。結果は、3回の独立の実験の平均値を表す。
図7は、異なるレベルのCD123を発現する細胞（KG1aもしくはRPMI8226）またはCD123を発現しない細胞（K562）と24時間共培養された時のT細胞によって放出されたIFNγの量を示す。共培養と同一の条件で単独で培養されたT細胞からのIFNγ放出も示される。実験は3人の独立のドナーについて行われ、代表的なドナーからの結果がここに示される。
図8は、CAR-T細胞の特異的細胞溶解活性を示す。アッセイは、CAR mRNAトランスフェクションの48時間後に行われた。T細胞を、4時間、K562＋KG1a細胞またはK562＋RPMI8226細胞と共培養した。細胞株の各々についての細胞生存率を、共培養の終わりに決定し、特異的細胞溶解率を計算した。
全ての構成が活性を有し、Klon 43 V3 CARおよび32716V3 CARが、対照と比較して他のCARSより高い活性を示した。
T細胞形質導入
T細胞の精製／活性化の3日後に、CARの発現のための組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を実施した。レンチウイルスベクターは、HEK-293細胞におけるゲノムプラスミドおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションによって、Vectalys SA（Toulouse,France）によって作製された。形質導入は、形質導入1回当たり106個の細胞を使用して、5の感染多重度で実施された。T細胞の表面のCAR検出は、（LakePharmaによって作製された）ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインのマウスIgG1 Fc断片との融合からなる組換えタンパク質を使用して行われた。このタンパク質のCAR分子との結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とするPE結合型二次抗体（Jackson Immunoresearch）によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。
次いで、2種のCAR候補、即ち、CAR Klon 43 V3およびCAR 32716V3を選択し、CAR発現が2Aペプチドを通してBFPと共役しており、EF1aプロモーターによって駆動されるレンチウイルスベクターへクローニングした。レンチウイルスベクターの模式図は、図9上パネルに示される。T細胞をバフィーコート試料から単離し、CD3/CD28ビーズによって活性化し、活性化の3日後に、5のMOIでレンチウイルスベクターによって形質導入した。
CAR検出は、ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインがマウスIgG1由来Fc断片に融合した融合タンパク質を使用して行われた。細胞表面のCARの融合タンパク質のCD123部分との結合を、抗Fc PE結合型抗体によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。図9は、2人の異なるドナーについての形質導入後8日目または10日目の（FACS分析によって測定された）CAR+細胞または青色蛍光タンパク質（BFP+）細胞の％を表す。
活性試験は形質導入後10〜12日目に実施された。
図10は、形質導入された細胞の異なる細胞株に対する脱顆粒活性を表す。Daudi細胞およびK562細胞はCD123を発現せず、KG1a、MOLM13、およびRPMI8226は異なるレベルのCD123を発現する（KG1a＜MOLM13＜RPMI8226）。3人の独立のドナーついての（CD8+細胞の中の）CD107a+細胞の％が上パネルに与えられ、代表的なドナーついてのCD107a染色の強度が下パネルに示される。NTDは非形質導入細胞を表す。
再び、データは、Klon 43 V3に由来する抗CD123 CARを発現する細胞の活性（脱顆粒（図10）またはCD123+細胞の溶解（図11））が32716V3のものと等価であることを示している（図10および図11）。
最も驚くべきことに、32716V3由来CAR発現細胞は、Klon 43 V3由来CAR発現細胞より強力なバックグラウンド活性（CD123を発現しない細胞、DAUDIおよびK562に対する活性）を示した（図10および図11）。
Klon 43 V3由来CAR発現細胞は、特に、より高いレベルのCD123を発現する細胞、RPMI8226細胞に対して、32716V3由来CAR発現細胞より特異的な活性を有し、わずかではあるが有意に高い活性を有していた（図10、図11、および図12）（図13および図14を参照すること）。
図11は、異なる細胞株とのCAR T細胞の24時間の共培養によるIFNγ放出を示す。
図12は、CAR-T細胞の特異的細胞溶解活性を示す。T細胞を、4時間、Daudi＋KG1a細胞、Daudi＋MOLM13細胞、またはDaudi＋RPMI8226細胞と共培養した。細胞株の各々についての細胞生存率を共培養の終わりに決定し、特異的細胞溶解率を計算した。結果は、少なくとも2人の独立のドナーにおいて入手された結果を表す。
結果は、全ての活性試験において、CARを安定的に発現するT細胞において、Klon43-v3が32716-v3よりわずかに高い活性を示すことを示す。さらに、32716-v3 CAR発現T細胞を単独で培養するかまたはCD123を発現しない細胞の存在下で培養した時、バックグラウンド活性が脱顆粒アッセイおよびIFNγ放出アッセイにおいて観察された。これは、Klon43-v3 CAR発現T細胞においては観察されなかった。これらの理由のため、Klon43-v3 CARを、マウスモデルにおける抗腫瘍インビボ実験を実施するために選択した。
図13および図14は、使用されたCARの各々についての用量応答脱顆粒活性を示す。96穴プレートを、異なる用量のCD123-Fcタンパク質（CAR+T細胞の検出のために使用されたものと同一。図5の説明を参照すること）によってコーティングし、細胞を蛍光性CD107a抗体の存在下でこのプレートにおいて6時間培養した。結果は、脱顆粒活性（それぞれ、CD8+細胞の中のCD107a+細胞の％（図13）およびCD107aシグナルの強度（図14））を示す。
実施例3 抗腫瘍マウスモデル
AML異種移植片マウスモデルとして、免疫不全雌NOGマウスに、MOLM13-ルシフェラーゼ細胞を静脈内（iv）注射した。6〜8週齢のNOG（NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicTac）マウスをTaconic（Ry,Danemark）から入手した。MOLM13-Luc細胞株を確立するため、MOLM13細胞（DSMZ ACC 554）を、GFPおよびホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルス（amsbio LVP438-PBS）によって形質導入した。GFP陽性細胞を、ネオマイシン（ref 10131-027、Gibco,Life Technologies,Saint-Aubin,France）によって選択した。参考までに、MOLM13細胞株は、初期骨髄異形成症候群（MDS、芽球増加を伴う不応性貧血、RAEB）の後に1995年に再発した急性骨髄白血病AML FAB M5aを有する20歳男性の末梢血から確立された。
次いで、（腫瘍細胞株の注射後2日目または7日目のいずれかに）異なる用量のCAR+T細胞（Klon43-v3 CAR）またはCARレンチウイルスベクターによって形質導入されていないT細胞を、マウスにiv注射した。T細胞注射の当日（0日目）またはT細胞注射後7日目、14日目、21日目、28日目、および40日目に、異なる動物における腫瘍の進行を追跡するため、生物発光シグナルを決定した。
動物の飼育および実験の手法は、French and European Regulations and NRC Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従い、Oncodesign（Dijon,France；http://www.oncodesign.com/）によって実施された。
結果
図15は、Klon43-v3 CAR発現T細胞のインビボ活性を示す。
非形質導入ヒトT細胞の注射の2日前または7日前のいずれかに、免疫不全マウスに、MOLM13ルシフェラーゼ細胞を注射するか、または異なる用量の抗CD123 CAR+T細胞を注射した。結果は、T細胞注射後の異なる時点で観察された生物発光シグナルを表す（4匹のマウスのうち1匹が21〜28日目に死亡したG12を除き、各群4匹のマウスの平均）。
データは、本発明の目的が、CD123+癌ヒト白血病細胞の処置のため、CD123+癌細胞に対して使用され得ることを示す。
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参考文献
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Claims (23)

  1. モノクローナル抗CD123抗体由来の重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む細胞外リガンド結合ドメイン、
    FcγRIIIαヒンジ、CD8αヒンジ、またはIgG1ヒンジ、
    CD8α膜貫通ドメイン、ならびに
    CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
    を含むポリペプチド構造を有し、
    該VHが、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、およびSEQ ID NO：69のCDR配列を含み、かつ該VLが、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、およびSEQ ID NO：72のCDR配列を含み、
    (i)該VHおよび該VLが、それぞれSEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:19と少なくとも90％の同一性を有するか、または
    (ii)該VHが、以下の配列：
    Figure 0006689202
    から選択されるポリペプチド配列を有し、かつ該VLが、以下の配列：
    Figure 0006689202
    から選択されるポリペプチド配列を有する、
    CD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
  2. CARが、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、またはSEQ ID NO：46とそれぞれ少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項1記載のCD123特異的CAR。
  3. CARが、CD8αヒンジを含み、かつSEQ ID NO：44と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項1記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
  4. 細胞外リガンド結合ドメインのVHおよびVLがヒト化されている、請求項1〜3のいずれか一項記載のCD123特異的キメラ抗原受容体（123 CAR）。
  5. CD123に特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のCD123特異的CAR。
  6. シグナルペプチドをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のCD123特異的CAR。
  7. SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2のシグナルペプチドをさらに含む、請求項6記載のCD123特異的CAR。
  8. 請求項1〜7のいずれか一項記載のCD123特異的キメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
  9. 請求項8記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  10. 請求項1〜7のいずれか一項記載のCD123特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現している、操作された免疫細胞。
  11. Tリンパ球に由来し、かつαTCRまたはβTCRをコードする遺伝子の欠失を保持している、請求項10記載の操作された免疫細胞。
  12. 抗癌薬に対して耐性である、請求項11記載の操作された免疫細胞。
  13. 前記操作された免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、請求項10〜12のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
  14. 前記免疫細胞において少なくとも1種のMHCタンパク質の発現が抑制されている、請求項10〜13のいずれか一項記載の操作された細胞。
  15. 前記少なくとも1種のMHCタンパク質が、β2mまたはHLAである、請求項14記載の操作された細胞。
  16. 少なくとも1種の免疫抑制薬、化学療法薬、または抗癌薬に対する耐性を付与するために変異させた、請求項10〜15のいずれか一項記載の操作された細胞。
  17. CD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態の治療のための医薬の製造のための、請求項10〜16のいずれか一項記載の操作された細胞の使用。
  18. 白血病または悪性リンパ増殖性障害の治療のための医薬の製造のための、請求項10〜16のいずれか一項記載の操作された細胞の使用。
  19. 白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、請求項18記載の使用。
  20. 白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、請求項18または19記載の使用。
  21. 悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、請求項18記載の使用。
  22. リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、請求項21記載の使用。
  23. （a）免疫細胞を準備する工程、
    （b）請求項1〜7のいずれか一項記載の少なくとも1種のCD123特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
    を含む、エクスビボで免疫細胞を操作する方法。
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