CN106103490B

CN106103490B - 用于癌症免疫疗法的cd123特异性嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN106103490B
Application number: CN201580014940.9A
Authority: CN
Inventors: 罗曼·加莱托
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: US10988541B2; MX370272B; IL247172B; KR20170002389A; EP3119807B1; CA2943008A1; AU2015233461A1; CN106103490A; WO2015140268A1; US20170183413A1; MX2019012244A; EP3119807A1; US11919961B2; JP6942217B2; JP2020156482A; US20190002573A1; US20210163612A1; AU2015233461B2; DK3119807T3; JP2017509342A

Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够重新定向免疫细胞针对选定的膜抗原的特异性和反应性的重组嵌合蛋白，并且更具体地，其中胞外配体结合是源自CD123单克隆抗体的scFV，赋予针对CD123阳性细胞的特异性免疫性。赋予这种CAR的工程化免疫细胞特别适用于治疗淋巴瘤和白血病。

Description

用于癌症免疫疗法的CD123特异性嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够针对选定的膜抗原重新定向免疫细胞特异性和反应性的重组嵌合蛋白，并且更具体地其中胞外配体结合是源自CD123单克隆抗体的scFV，赋予对于CD123阳性细胞的特异性免疫性。已经确定与正常的造血干细胞相比，白细胞介素3受体α链(CD123)经常在白血病肿瘤细胞上过表达(特别是在急性骨髓性白血病(AML)的情况下)。根据本发明的被赋予CAR的工程化免疫细胞在治疗淋巴瘤和白血病方面显示出更高的效力。

背景技术

过继性免疫疗法(adoptive immunotherapy)(其涉及体外生成的自体抗原特异性T细胞的转移)，是治疗病毒感染和癌症的有希望的策略。可以通过抗原特异性T细胞的扩增或T细胞的重新定向(通过基因工程)来产生用于过继性免疫疗法的T细胞(Park,Rosenberget al.2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关的病毒感染和罕见的病毒相关的恶性肿瘤的已建立的程序。类似地，在治疗黑色素瘤中，肿瘤特异性T细胞的分离和转移已显示是成功的。

通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的基因转移，已成功地产生在T细胞中的新型特异性(Jena,Dotti et al.2010)。CAR是合成受体，其由与单融合分子中的一个或多个信号结构域相关联的靶向部分组成。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包含通过柔性接头(linker)结合的单克隆抗体的轻片段和可变片段。也已成功地使用基于受体或配体结构域的结合部分。第一代CAR的信号结构域(signalingdomain)是源自CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。第一代CAR已显示出成功地重新定向T细胞的细胞毒性，然而，它们未能提供体内长期扩增和抗肿瘤活性。已单独地(第二代)或组合地(第三代)加入来自共刺激分子(包括CD28、OX-40(CD134)、和4-1BB(CD137))的信号结构域，以增强生存率和增加CAR修饰T细胞的增殖。CAR已成功地使得T细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面上表达的抗原重新定向(Jena,Dotti etal.2010)。

同时，用于急性骨髓性白血病(AML)的诱导治疗已经大体保持不变近50年并且AML仍然是预后不良的疾病。急性骨髓性白血病(AML)是其特征为在骨髓中不成熟的骨髓细胞的快速增殖，从而导致不正常的造血功能的疾病。虽然标准的诱导化疗可以诱导完全缓解，但许多患者最终复发和死于该疾病，从而要求开发针对AML的新疗法。

在AML细胞的免疫表型分型的最新进展已经揭示了若干AML相关的细胞表面抗原，其可以作为用于未来疗法的靶。白细胞介素3受体α链(IL-3Rα；CD123–NCBI参考：NP_001254642)已被确定为潜在的免疫治疗靶，因为，与正常造血干细胞相比，它在AML肿瘤细胞上过表达。另外，已经完成对于CD123特异性疗法的两个I期临床试验，其中两种药物均显示良好的安全性曲线(ClinicalTrials.gov ID:NCT00401739和NCT00397579)。不幸的是，这些CD123靶向药物具有有限的功效，表明需要替代的并且更有效和特异性的靶向CD123的疗法来观察到抗白血病活性。

用于治疗白血病的可能更有效的替代疗法可以是使用表达以MHC非依赖性方式针对细胞表面肿瘤相关抗原(TAA)重新定向T细胞特异性的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。已经开发了用于治疗B细胞恶性肿瘤的靶向各种抗原的几组CAR。然而，用于治疗AML的CAR工程化T细胞仍然是很少的。

具体地，仍然存在对于改进显示更好的与T细胞增殖的相容性的CAR的构建的需要，以允许表达这种CAR的细胞达到显著的临床优势。

此外,存在改进具有增殖和选择性地靶向表达CD123的细胞的能力的CD123 CAR的需要。

进一步地，使用表达靶向CD123的免疫T细胞的这种CAR结合细胞毒性化疗剂作为通常用作抗癌治疗的治疗仍然是问题。

已开发多种细胞毒性剂如抗代谢物、烷化剂、蒽环类(anthracycline)、DNA甲基转移酶抑制剂、铂化合物和纺锤体毒物(spindle poison)来杀死癌细胞，特别是表达CD123的癌细胞。

由于它们的非特异性毒性，这些化疗剂可能不利于强健的抗肿瘤免疫活性T细胞的建立。靶向细胞增殖途径的基于小分子的疗法也可能妨碍抗肿瘤免疫性的建立。

因此，还存在开发具有特异性并与药物，特别是抗癌化疗剂，如影响细胞增殖的那些的使用相容的靶向CD123的T细胞的需要。

因此，为了连同化疗一起来使用“现成的(off-the shelf)”异基因(allogeneic)治疗性细胞，本发明人开发了将异基因T细胞工程化为较少异源性且耐化疗剂的方法。此策略提供的治疗益处可以由化疗和免疫疗法之间的协同效应而强化。此外，耐药性还可以受益于选择性地扩增工程化T细胞的能力从而避免由低效率的基因转移到这些细胞所引起的问题。

发明内容

本发明人已经生成了CD123特异性CAR，其具有不同的设计并且包含源自CD123特异性抗体的不同的scFv。这些CD123特异性CAR被无差别地指定为CD123特异性CAR或抗CD123 CAR、或123CAR、或“本发明的CAR”。

具体地，本发明人已经开发了CD123特异性CAR，其包含源自具有不同结构的Klon43的scFV，以及确定高度特异性的和非常有选择性的CAR结构，其结合于表达CD123的细胞并选择性地破坏表达CD123的癌细胞。

在体外非特异性活化(例如，用抗CD3/CD28涂覆珠和重组IL2)之后，使用病毒转导用表达这些CAR的多核苷酸转化来自供体的T细胞。在某些情况下，进一步工程化T细胞以产生非同种异体反应性(non-alloreactive)T细胞，更具体地通过破坏(disruption)TCR(αβ–T细胞受体)的组件来防止移植物(graft)相对于宿主反应。

进一步工程化T细胞以产生对抗癌药物具有耐受性的T细胞，以结合所述经典的抗癌药物使用。

得到的工程化T细胞在不同程度上显示出针对CD123阳性细胞的体外反应性，表明本发明的CAR有助于T细胞的抗原依赖性活化以及增殖，使得它们可用于免疫疗法。

得到的工程化T细胞显示出针对CD123阳性细胞的体内反应性并显著减少体内癌细胞的数目。

设计本发明的工程化T细胞以显示出针对CD123阳性细胞的体内反应性，可以连同抗癌药物一起使用，并且耐受良好。在具体实施方式中，即使在多次给予以后，本发明的工程化T细胞仍然是有效的，使得它们可以作为第一治疗(诱导(induction))、作为巩固(consolidation)治疗、作为与经典的抗癌化疗结合的治疗用于免疫疗法。在本说明书中详细说明编码本发明的CAR的多肽和多核苷酸序列。

本发明的工程化免疫细胞特别可用于治疗应用，如B细胞淋巴瘤或白血病治疗。

附图说明

图1：根据本发明的工程化免疫细胞的示意图。在此图中呈现的工程化免疫细胞是用编码CAR的逆转录病毒多肽转导的T细胞。进一步工程化这种T细胞以允许更好和更安全地植入患者，其在本发明的框架内是可选的。X基因可以是例如表达TCR的组件(TCRα或TCRβ)的基因，Y可以是涉及T细胞对于免疫抑制药物如CD52(对于Campath)或HPRT(对于6-硫鸟嘌呤)的敏感性的基因。

图2：本发明(123CAR)的不同的CAR结构(V1至V6)的示意图。

图3：示出根据本发明的CAR的不同结构，其各自在使用的铰链区中有所不同。

图4：示出当用表达CD123的细胞(RPMI8226)、或用不表达CD123的细胞(K562)来共培养CAR+T细胞6小时时，对于一种单一结构(v3：CD8-铰链/CD8-跨膜)，以6种不同scFv的脱粒的百分数(％)计的脱粒活性。白色条棒对应于在单独培养的T细胞中观测到的脱粒信号，黑色条棒表示当T细胞与RPMI8226细胞共培养时观测到的信号，以及灰色条棒示出与K562细胞共培养的T细胞的脱粒信号。

图5：示出在用CD123阴性细胞(K562)或表达高或低水平的CD123的细胞(分别为RPMI8226和KG1a)共培养6小时以后，以CAR T细胞的平均荧光强度(MFI)计的脱粒活性(CD107a+细胞)。

图6：示出当用表达不同水平的CD123的细胞(KG1a或RPMI8226)、或用不表达CD123的细胞(K562)共培养6小时时，各种抗CD123 CAR T细胞的脱粒的百分数(％)。

图7：示出当用表达不同水平的CD123的细胞(KG1a或RPMI8226)、或用不表达CD123的细胞(K562)共培养24小时时，由各种抗CD123 CAR T细胞释放的IFNγ的量。

图8：示出各种抗CD123 CAR T细胞的特异性细胞溶解活性。在CAR mRNA转染以后48小时进行试验。用K562+KG1a或K562+RPMI8226细胞共培养T细胞。在共培养结束时，确定每种细胞系的细胞活力，并计算特异性细胞溶解百分数。

图9：示出用于转导T细胞的一般结构，以及在转导后的第8天或第10天，两种不同供体的通过流式细胞术分析的表达CAR或BFP的T细胞的百分数(％)。CAR对应于CAR结构Klon 43-v3CAR和32716-V3CAR。

图10：表示针对不同的细胞系(Daudi和K562细胞(其不表达CD123)，KG1a、MOLM13和RPMI8226(其表达增加水平的CD123)(KG1a<MOLM13<RPMI8226))，表达Klon 43-v3CAR和32716-V3CAR的T细胞的脱粒活性。三种独立的供体的CD107a+细胞(在CD8+细胞中)的％示于上图，并且代表性供体的CD107a染色的强度示于下图。NTD表示未转导细胞。

图11：示出在用不同细胞系共培养表达Klon 43-v3CAR和32716-V3CAR的T细胞24小时后的IFNγ释放。

图12：示出表达Klon 43-v3CAR和32716-V3CAR的T细胞的特异性细胞溶解活性。计算特异性细胞溶解百分数。结果表示在至少两个独立的供体中获得的结果。

图13：示出表达Klon 43-v3CAR和32716-V3CAR的T细胞的脱粒活性(以脱粒的百分数(％)计)。

图14：示出表达Klon 43-v3CAR和32716-V3CAR的T细胞的脱粒活性(以MFI计)。

图15：示出在NOG免疫缺陷小鼠中，表达Klon43-v3CAR的T细胞的体内活性。用MOLM13-荧光素酶细胞(在注射未转导人T细胞以前的2或7天)和用不同剂量的抗CD123 CAR+T细胞注射小鼠。结果表示在T细胞注射以后在不同时间点观测到的生物发光信号(除了G12，每组中平均4只小鼠，其中4只小鼠中的1只在21天至28天之间死亡)。

表1：不同CAR组件的序列

表2：不同CAR组件的序列

表3：结构V-1的CAR

表4：结构V-2的CAR

表5：结构V-3的CAR

表6：结构V-4的CAR

表7：结构V-5的CAR

表8：结构V-6的CAR

具体实施方式

除非在本文中明确定义，使用的所有技术和科学术语具有与基因疗法、生物化学、遗传学、和分子生物学领域的技术人员通常理解的相同的含义。

类似或等同于本文描述的那些方法和材料的所有方法和材料可以用于本发明的实施或测试，其中本文描述了适宜的方法和材料。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献的全部内容通过引证结合于本文。在冲突的情况下，将以本说明书，包括定义为准。进一步地，除非另有规定，材料、方法、和实施例仅是说明性的而并不意在是限制性的。

除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA、和免疫学的常规技术，它们是在本领域的技术范围内。在文献中充分解释了这样的技术。见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,ColdSpring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullis等美国专利号4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)，具体地，Vol.154和155(Wu et al.eds.)以及Vol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；以及Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。

本发明公开了CD123特异性嵌合抗原受体(“123CAR”或“CAR”)，其具有选自如图2所示的V1至V6的多肽结构的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD123抗体的VH和VL的胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、胞质结构域(包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域)，所述123CAR与SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.48具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有选自如图2所示的V1、V3和V5的多肽结构的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD123抗体的VH和VL的胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、胞质结构域(包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域)，所述123CAR与SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.46具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有选自如图2所示的V1、V3和V5的多肽结构的一种，所述结构包括含有来自单克隆抗CD123抗体的VH和VL的胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、胞质结构域(包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域)，所述123CAR与SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有如图2所示的和上文描述的多肽结构V3，其中所述123CAR与SEQ ID NO.42具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有如示于图2和上文描述的多肽结构V3，其中所述123CAR与SEQ ID NO.44具有至少80％序列一致性。

本发明公开了特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有如图2所示的和上文描述的多肽结构V3，其中所述123CAR与SEQ ID NO.46具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有如图2所示和上文描述的多肽结构V3，其中所述123CAR与SEQ ID NO.75具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有如图2所示和上文描述的多肽结构V3，其中所述123CAR与SEQ ID NO.76具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其具有如图2所示和上文描述的多肽结构V3，其中所述123CAR与SEQ ID NO.77具有至少80％的序列一致性。

本发明公开了CD123特异性嵌合抗原受体(CAR)，其具有如图2所示的和上文描述的多肽结构V3，所述结构包括来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL(该单克隆抗CD123抗体包括以下CDR序列)：

GFTFTDYY(SEQ ID NO 67)，

RSKADGYTT(SEQ ID NO 68)，

ARDAAYYSYYSPEGAMDY(SEQ ID NO 69)，以及

QNVDSA(SEQ ID NO 70)，

SAS(SEQ ID NO 71)，

QQYYSTPWT(SEQ ID NO 72)，

并且所述结构包括：

铰链、跨膜结构域以及包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域的胞质结构域。

本发明公开了如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中所述胞外配体结合结构域VH和VL是人源化的。

本发明公开了如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中所述胞外配体结合结构域是人源化的。

本发明公开了如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，所述CD123特异性嵌合抗原受体是人源化的。

本发明公开了如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中所述来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL包含以下序列

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGFTFTDYYXXXXXXXXXXXXXXXXXIRSKADGYTTXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXARDAAYYSYYSPEGAMDYXXXXXXXXXXX(SEQ ID N°73)和

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQNVDSAXXXXXXXXXXXXXXXXXSASXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQQYYSTPWTXXXXXXXXX(SEQ ID N°74)，其中X是氨基酸，

氨基酸可以是以下氨基酸的任何一种，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

本发明公开了如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL分别包含以下序列的至少一种：

(变体VH1：SEQ ID NO.60)：

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

(变体VH2：SEQ ID NO.61)：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

(变体VH3：SEQ ID NO.62)：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

(变体VH4：SEQ ID NO.63)：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

(变体VH5：SEQ ID NO.64)：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

(变体VH6：SEQ ID NO.65)：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

(变体VH7：SEQ ID NO.66)：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，

变体VL1：SEQ ID NO.54)：

MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，

变体VL2：SEQ ID NO.55)：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，

变体VL3：SEQ ID NO.56)：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，

变体VL4：SEQ ID NO.57)：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，

变体VL5：SEQ ID NO.58)：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，以及

变体VL6：SEQ ID NO.59)：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYGQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，或它们的组合。

有利地，本发明公开了如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL分别包含以下序列的至少一种：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，以及以下序列的至少一种：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYGQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链和CD8α跨膜结构域。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链、41BBB胞质结构域和CD8α跨膜结构域。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，其中所述结构V3包含CD8α铰链和4-1BB跨膜结构域。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，其中所述VH和VL具有与选自SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20的多肽序列至少80％的一致性。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，其中所述VH和VL具有与SEQ ID NO.19和/或SEQ ID NO.20的多肽至少80％的一致性。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，进一步包含对CD123不具有特异性的另一种胞外配体结合结构域。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，进一步包含优选SEQ ID NO 1或SEQID NO 2的信号肽。

本发明公开了如上所述的CD123特异性CAR，其中SEQ ID NO 10的接头插入在VH和VL之间。

本发明公开了一种多核苷酸，其编码根据任一种上述CD123特异性CAR的CD123特异性嵌合抗原受体，所述多核苷酸进一步包含优选SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的信号肽。

本发明公开了一种表达载体，其包含如上所述的多核苷酸。

本发明公开了一种工程化免疫细胞，其在细胞表面膜上表达如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体，优选可以在细胞表面膜上表达如上所述的CD123特异性嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。

本发明公开了一种如上所述的工程化免疫细胞，其源自T淋巴细胞，可选地耐抗癌药物，并且在编码αTCR或βTCR的基因中带有缺失。

本发明公开了一种如上所述的工程化免疫细胞，其中抑制TCR的表达。

本发明公开了如上所述的工程化免疫细胞，其中，在所述工程化免疫细胞中，抑制至少一种MHC蛋白，优选β2m或HLA的表达。β2m表示β2微球蛋白并且HLA为人白细胞抗原。MHC蛋白是I型(Class I)或II型(Class II)的MHC蛋白。

本发明公开了如上所述的工程化免疫细胞，其中使所述工程化免疫细胞突变以赋予对免疫抑制药物、化疗药物、或抗癌药物的至少一种的抗性。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中患者是人类。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中病症是以表达CD123的细胞为特征的恶化前或恶性癌症病症。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中病症是以表达CD123的细胞过量为特征的病症。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中恶性癌症病症是血液癌病症。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中血液癌病症是白血病或恶性淋巴增殖性疾病。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述白血病选自由急性髓性白血病、慢性髓性白血病、脊髓发育不良综合征、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、和脊髓发育不良综合征组成的组。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中白血病是急性髓性白血病(AML)。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述血液癌是恶性淋巴增殖性疾病。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述恶性淋巴增殖性疾病是淋巴瘤。

本发明公开了如上所述的用于治疗的工程化免疫细胞，其中所述淋巴瘤选自由多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)组成的组。

本发明公开了消弱血液癌细胞的方法，包括使根据权利要求13至17中任一项所述的工程化细胞以有效地导致所述癌细胞消弱的量与所述血液癌细胞接触。

本发明公开了工程化免疫细胞的方法，包括：

(a)提供免疫细胞，

(b)在所述细胞的表面上表达至少一种根据权利要求1至10中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体。

本发明公开了工程化如上所述的免疫细胞的方法，包括：

(a)提供免疫细胞，

(b)将编码所述CD123特异性嵌合抗原受体的至少一种多核苷酸引入所述细胞，

(c)将所述多核苷酸表达于所述细胞。

本发明公开了工程化如上所述的免疫细胞的方法，包括：

(a)提供免疫细胞，

(c)引入至少一种对CD123不具有特异性的其它嵌合抗原受体。

本发明公开了用于治疗需要其的受试者的方法，包括：

(a)提供在表面上表达根据权利要求1至10中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体的免疫细胞

(b)将所述免疫细胞给予所述患者。

本发明公开了用于治疗如上所述的需要其的受试者的方法，其中所述免疫细胞提供自供体。

本发明公开了用于治疗如上所述的需要其的受试者的方法，其中所述免疫细胞提供自患者自身。

CD123特异性嵌合抗原受体

本发明涉及抗CD123嵌合抗原受体(CAR)的新设计，其包含胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域。

如在本文中所使用的，术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，该结构域能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别用作在靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标记物的配体。在优选的实施方式中，所述胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗CD123抗体的轻(V_L)和重(V_H)可变片段。所述V_L和V_H优选选自在文献中称为7G3、Old4、26292、32716、Klon43和12F1的抗体，如在表1至8中所示，更优选Old4、Klon43和12F1，并且更加优选Klon43。它们优选地通过包含序列SEQ ID NO.10的柔性接头连接在一起。换句话说，所述CAR优选地包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含表现出与选自由SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:22组成的组(见表2)的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％的一致性的多肽序列。

更优选地，所述CAR优选地包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含显示出与选自由SEQ ID NO:13、14、19、20、21至SEQ ID NO:22组成的组的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的多肽序列，并且更加优选地，所述CAR优选地包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含显示出与由SEQ ID NO:19和/或20组成的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的多肽序列。

更加优选地，所述CAR包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含表现出与选自由SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1+SEQID NO:19、SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:21以及SEQ ID NO:1+SEQID NO:22组成的组的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的多肽序列，并且更加优选地，所述CAR优选地包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含表现出与由SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:19以及SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:20组成的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的多肽序列。

如在本文中所使用的，术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体或抗体片段，如，例如由噬菌体、酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统表达的抗体或抗体片段。该术语还应该被解释为是指通过编码抗体或抗体片段的DNA分子的合成生成的抗体或抗体片段，并且该DNA分子表达抗体或抗体片段蛋白、或指定抗体或抗体片段的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域中可得到的且众所周知的重组或合成DNA或氨基酸序列技术来获得的。

如在本文中所使用的，术语“保守序列修饰”或“人源化”旨在指并不显著影响或改变CAR的结合特性和/或并不显著影响含有修饰氨基酸序列的CAR的活性并且减少或消除人抗鼠抗体(HAMA)反应的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括在所述CAR和/或所述CAR分子的任何其它部分中所述抗体片段中的氨基酸取代、添加和缺失。通过在本领域中已知的标准技术，如定位诱变、PCR介导诱变或通过采用优化的种系(germline)序列，可以将修饰引入抗体、引入抗体片段或引入本发明的CAR分子的任何其它部分。

保守氨基酸替代是用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的替代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换在本发明的CAR内的一种或多种氨基酸残基并且可以使用在本文中描述的功能性试验测试改变的CAR结合CD 123的能力。

根据本发明的CAR的信号转导结构域或胞内信号结构域负责在胞外配体结合结构域与靶的结合以后的细胞内信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换句话说，信号转导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助物活性(helper activity)，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号转导结构域”是指转导效应子信号功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。

用于CAR的信号转导结构域的优选实例可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两种不同类型的细胞质信号序列：引发抗原依赖性初级活化的那些，以及以不依赖抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级细胞质信号序列可以包含信号基序，其被称为ITAM，基于免疫受体酪氨酸的活化基序。ITAM是在充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的细胞质内尾(intracytoplasmatic tail)中发现的明确限定的信号基序。在本发明中使用的ITAM的实例，作为非限制实例，可以包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，CAR的信号转导结构域可以包含CD3ζ信号结构域，该信号结构域具有与选自由SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列一致性的氨基酸序列。

在特定实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是抗原受体或它们的配体(其是有效的免疫反应所需要的)之外的细胞表面分子。“共刺激配体”是指在抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合在T细胞上的同源(cognate)共刺激分子，从而提供信号，其除了由例如TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合所提供的初级信号之外，介导T细胞应答，包括但不限于增殖活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、激动剂或与Toll配体受体结合的抗体以及特异性地与B7-H3结合的配体。除此之外，共刺激配体还包括特异性地与呈现在T细胞上的共刺激分子结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地与CD83结合的配体。“共刺激分子”是指在T细胞上的同源结合配偶体(binding partner)，其特异性地与共刺激配体结合，从而介导细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I型分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地与CD83结合的配体等。

在优选的实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子的部分，其选自由4-1BB(GenBank:AAA53133)和CD28(NP_006130.1)的片段组成的组。具体地，本发明的CAR的信号转导结构域包含氨基酸序列，其包含与选自由SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％的序列一致性。

根据本发明的CAR表达在细胞的表面膜上。因此，这样的CAR进一步包含跨膜结构域。适当的跨膜结构域的区别特征包括在细胞表面上表达的能力，在本发明中优选为免疫细胞，特别是淋巴细胞或天然杀伤(NK)细胞，并且一起相互作用以引导免疫细胞针对预定靶细胞的细胞应答。跨膜结构域可以源自天然或合成来源。跨膜结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基，如α、β、γ或？、构成CD3复合体的多肽、IL2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链、Fc受体的亚基链，特别是Fcγ受体III或CD蛋白。可替换地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在优选的实施方式中，所述跨膜结构域源自人CD8α链(例如NP_001139345.1)。跨膜结构域可进一步包含在所述胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。本文中使用的术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至胞外配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为胞外配体结合结构域提供更大的灵活性和可达性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以源自全部或部分的自然发生的分子，如源自全部或部分的CD8、CD4或CD28的胞外区，或源自全部或部分的抗体恒定区。可替换地，铰链区可以是对应于自然发生的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链结构域包含人CD8α链、FcγRIIIα受体或IgG1的部分，其在本说明书中分别被称为SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5，或铰链多肽，其显示出与这些多肽优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％的序列一致性。

根据本发明的car通常进一步包含跨膜结构域(TM)，更具体地选自CD8α和4-1BB，其显示出与SEQ ID NO.6或7的多肽的一致性。

根据本发明的CAR通常进一步包含跨膜结构域(TM)，更具体地，选自CD8α和4-1BB的TM，并且更加具体地显示出与SEQ ID NO.6或7的多肽的一致性。

在优选的实施方式中，根据本发明的CAR进一步包含具有SEQ ID NO.6的来自CD8α的TM结构域，或显示出与SEQ ID NO.6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

在癌细胞中通常观测到靶抗原的下调或突变，产生抗原损失逃逸变体(antigen-loss escape variant)。因此，为了抵消肿瘤逃逸和使得免疫细胞对靶更具特异性，根据本发明的CD123特异性CAR可以包含另一胞外配体结合结构域，以同时结合在靶中的不同元件，从而增加免疫细胞活化和功能。在一种实施方式中，可以使胞外配体结合结构域串联地置于相同跨膜多肽上，并且可选地可以通过接头隔开。在另一实施方式中，可以使所述不同的胞外配体结合结构域置于构成CAR的不同的跨膜多肽上。在另一实施方式中，本发明涉及包含每一种不同的胞外配体结合结构域的CAR的群体。具体地，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞以及在所述细胞的表面上表达每一种包含不同的胞外配体结合结构域的CAR的群体。在另一具体的实施方式中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞以及将编码构成每一种包含不同的胞外配体结合结构域的CAR的群体的多肽的多核苷酸引入所述细胞。CAR的群体是指至少二、三、四、五、六或更多种CAR，每一种包含不同的胞外配体结合结构域。根据本发明的不同的胞外配体结合结构域可以优选同时结合在靶中的不同元件，从而增加免疫细胞活化和功能。本发明还涉及包含每一种包含不同的胞外配体结合结构域的CAR的群体的分离的免疫细胞。

在优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含SEQ ID NO.19的多肽和/或SEQ IDNO.20的多肽，更优选地，根据本发明的CAR包含与SEQ ID NO.19具有至少80％一致性，优选80％至99％一致性的多肽，和/或与SEQ ID NO.20具有80至99％一致性的多肽。更加优选地，根据本发明的CAR包含与SEQ ID NO.19和/或SEQ ID NO.20的多肽具有85至99％一致性的多肽。

在更优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含具有以下序列的多肽：

EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLALIRSKADGYTTEYSASVKGRFTLSRDDSQSILYLQMNALRPEDSATYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.19)以及

MADYKDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQNVDSAVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSTPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.20)。

在一种优选的实施方式中，根据本发明的CAR至少包含具有以下序列的多肽：

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.60)。

在一种优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含具有以下序列的多肽：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.61)。

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.62)。

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.63)。

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.64)。

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.65)。

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.66)。

MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.54)。

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.55)。

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.56)。

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.57)。

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.58)。

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYGQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO.59)。

在一种优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含至少一种选自以下序列的多肽：

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS以及

以及至少一种选自以下序列的序列：

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR以及

在一种优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含选自以下序列的一种多肽：SEQID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、和SEQ ID NO.66。

在更优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含选自以下序列的一种多肽：SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59，以及选自以下序列的多肽：SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.65、和SEQ ID NO.66。

在一种实施方式中，根据本发明的CAR包含选自由SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、和SEQ ID NO.46组成的列表的多肽，优选地包含与SEQ ID NO.42的多肽80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的CAR，包含与SEQ ID NO.44的多肽80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的CAR，以及包含与SEQ ID NO.46的多肽80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的CAR。

在更优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含含有与SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.42具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的多肽。

在另一种优选实施方式中，根据本发明的CAR包含SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.42的多肽，更加优选地，含有与SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.42 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的CAR，特别是含有与SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.42 85％至99％的一致性的CAR。

在更优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含含有与SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.44 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的多肽。

在更加优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.44的多肽，更加优选地，含有与SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.44 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的CAR，特别是含有与SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.44 85％至99％的一致性的CAR。

在更优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含含有与SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.46 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的多肽。

在更加优选的实施方式中，根据本发明的CAR包含SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.46的多肽，更加优选地，含有与SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.46 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的CAR，特别是含有与SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.46 85％至99％的一致性的CAR。

在另一种优选实施方式中，根据本发明的CAR包括SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.10+SEQ ID NO.42的多肽，更加优选地，CAR包括与SEQ ID NO.SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.10+SEQID NO.42 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性。

在另一种优选实施方式中，根据本发明的CAR包括SEQ ID NO.SEQ ID NO.1+SEQID NO.10+SEQ ID NO.44的多肽，更加优选地，CAR包括与SEQ ID NO.SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.10+SEQ ID NO.44 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性。

在另一种优选实施方式中，根据本发明的CAR包括SEQ ID NO.SEQ ID NO.1+SEQID NO.10+SEQ ID NO.46的多肽，更加优选地，CAR包括与SEQ ID NO.SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.10+SEQ ID NO.46 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性。

根据本发明，表达本发明的抗CD123 CAR的免疫细胞触发抗癌免疫应答。在优选的实施方式中，被赋予本发明的抗CD123 CAR，表达本发明的CAR的免疫细胞确实触发免疫应答，其不包括人抗小鼠抗体(HAMA)应答。

根据本发明，可以单独地或与另一种治疗结合，将有效量的工程化免疫细胞给予需要其的患者至少一次、两次、或多次。

本发明涉及CD123特异性嵌合抗原受体(CAR)，其具有选自如示于图2的V1至V6的多肽结构的一种，所述结构包含胞外配体结合结构域(其包含来自单克隆抗CD123抗体的VH和VL)、铰链、跨膜结构域以及包括CD3ζ信号结构域和共刺激结构域(来自4-1BB)的胞质结构域。

多核苷酸，载体：

本发明还涉及多核苷酸，编码上述根据本发明的CAR的载体。

多核苷酸可以包括表达盒(expression cassette)或表达载体(例如，用于引入细菌宿主细胞的质粒，或病毒载体如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体，或质粒或病毒载体如用于转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒)。

在具体的实施方式中，在一种多核苷酸或载体(其包含编码核糖体跳跃(ribosomal skip)序列的核酸序列如编码2A肽的序列)中可以包括不同的核酸序列。2A肽(其识别于微小核糖核酸病毒(picornavirus)的口蹄疫病毒亚组(Aphthovirus)中)，导致核糖体从一个密码子“跳跃”至下一个密码子而没有在由密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(见(Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu etal.2008))。“密码子”是指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的三个核苷酸，其由核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽被在框中的2A寡肽序列分开时，两个多肽可以由mRNA内的单一的、连续的开放阅读框合成。这样的核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的并且已知由多种载体用于表达由单信使RNA编码的多种蛋白质。

为了将跨膜多肽引导进入宿主细胞的分泌路径，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(还被称为前导序列，前序序列(prepro sequence)或前序列(presequence))。将分泌信号序列可操作地连接到跨膜核酸序列，即，在正确的阅读框中连接两个序列并定位以将新合成的多肽引导进入宿主细胞的分泌路径。通常将分泌信号序列定位于编码感兴趣的多肽的核酸序列的5'处，尽管可以将某些分泌信号序列定位在感兴趣的核酸序列中的别处(见，例如Welch等的美国专利第5,037,743号；Holland等的美观专利第5,143,830号)。在优选的实施方式中，信号肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和2，或与SEQID NO:1和/或2至少90％、95％、97％或99％的序列一致性。

本领域技术人员将认识到，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能有相当多的序列变异。优选地，密码子优化本发明的核酸序列用于在哺乳动物细胞中表达，优选用于在人类细胞中表达。密码子优化是指将感兴趣的序列中的在给定物种的高度表达的基因中一般是罕见的密码子由在这类物种的高度表达的基因中一般是常见的密码子替换，这样的密码子将氨基酸编码为被替换的密码子。

细胞

根据本发明的细胞是指造血起源的细胞，其功能上参与先天性和/或适应性免疫应答的起始和/或运行。根据本发明的细胞优选是获得自供体的T细胞。所述根据本发明的T细胞可以源自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞，更具体地非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、全能性干细胞或造血干细胞。在优选的实施方式中，细胞是人类细胞，特别是人类干细胞。

代表性的人类干细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组的T细胞。在另一种实施方式中，所述细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在本发明的细胞的扩增和基因修饰之前，可以通过各种非限制性方法，由受试者获得细胞源。细胞可以获得自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域技术人员可得到的和已知的任何数目的T细胞系。在另一种实施方式中，所述细胞优选源自健康供体。在另一种实施方式中，所述细胞是呈现不同的表型特征的细胞的混合群体的一部分。

优选地，干细胞的分离和制备不需要破坏至少一个人胚胎。免疫细胞可以源自患者(鉴于进行自体治疗)，或源自供体(鉴于产生可以用于异基因治疗的异基因细胞)。

更优选地，本发明的免疫细胞表达对应于SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、或SEQ IDNO 46的抗CD123 CAR，更加优选地，本发明的免疫细胞表达对应于人源化SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 44、或SEQ ID NO 46的人源化抗CD123 CAR。

工程化赋予CAR的免疫细胞的方法

本发明包括制备用于免疫治疗的免疫细胞的方法，包括将编码CD123CAR的多核苷酸或载体离体引入所述免疫细胞(先前在WO2014/130635、WO2013176916、WO2013176915中描述的并通过引证并入本文)。

在优选的实施方式中，鉴于在免疫细胞中的稳定表达，将所述多核苷酸包括在慢病毒载体中。

根据进一步的实施方式，所述方法进一步包括基因修饰所述细胞以使它们更适用于异基因移植的步骤。

通过失活至少一种编码T细胞受体(TCR)组分的基因来修饰T细胞

根据第一方面，可以通过例如失活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组分的基因(如在WO 2013/176915中描述的)来使免疫细胞较少异基因化，这可以与编码或调节HLA或β2m蛋白表达的基因的失活相结合。因此，显著减小移植物抗宿主综合征和移植物排斥反应的风险。

因此，当免疫细胞是T细胞时，本发明还提供了工程化具有较少异基因的T细胞的方法。

使细胞具有较少异基因的方法可以包括失活至少一种编码T细胞受体(TCR)组分的基因(特别是TCRα、TCRβ基因)的步骤。

在WO2013/176915中公开的通过失活T细胞受体(TCR)的一种或多种组分来制备表达适用于异基因移植的免疫细胞的CAR的方法均通过引证并入本文。

本发明包括表达抗CD123 CAR的免疫细胞，其中已失活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组分的基因。因此，本发明提供了表达抗CD123 CAR的T细胞，其中CAR源自Klon 43，特别是具有与SEQ ID N°44至少80％的一致性，以及其中失活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组分的基因。

根据本发明，具有一种或多种失活的T细胞受体(TCR)的组分的抗CD123 CAR免疫细胞旨在用作药物。

通过失活TCR基因，旨在不以功能性蛋白质的形式来表达感兴趣的基因。在具体的实施方式中，该方法的基因修饰依靠，在提供用于工程化的细胞中，一种稀切核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)的表达，使得所述稀切核酸内切酶特异性地催化在一种靶基因中的切割，从而失活所述靶基因。通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同的机制来修复由稀切核酸内切酶引起的核酸链断裂。然而，NHEJ是不完美的修复过程，其经常导致在切割的位点处DNA序列的改变。机制涉及通过直接再连接(Critchlow andJackson 1998)或通过所谓的微同源性介导的末端连接(Betts,Brenchley et al.2003；Ma,Kim et al.2003)来再结合两个DNA末端的残余。通过非同源末端连接(NHEJ)的修复经常导致较小的插入或缺失并且可以用于产生特定的基因敲除。所述修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失、或添加。通过本领域众所周知的方法可以确定和/或选择其中已经发生切割诱导的诱变事件(即与NHEJ事件连续的诱变事件)的细胞。在具体的实施方式中，使编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一个基因失活进入每个单独的样品的细胞的步骤包括将能够破坏编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一种基因的稀切核酸内切酶引入细胞。在更具体的实施方式中，用编码能够破坏编码T细胞受体(TCR)的组分的至少一种基因的稀切核酸内切酶的核酸来转化每个单独的样品的所述细胞，以及将所述稀切核酸内切酶表达在所述细胞中。

所述稀切核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、Argonaute核酸酶、TALE核酸酶或MBBBD核酸酶。在优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE核酸酶。TALE核酸酶意指由源自转录活化因子样效应子(TALE)的DNA结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的融合蛋白，以切割核酸靶序列(Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Cermak,Doyle etal.2011；Geissler,Scholze et al.2011；Huang,Xiao et al.2011；Li,Huang etal.2011；Mahfouz,Li et al.2011；Miller,Tan et al.2011；Morbitzer,Romer etal.2011；Mussolino,Morbitzer et al.2011；Sander,Cade et al.2011；Tesson,Usal etal.2011；Weber,Gruetzner et al.2011；Zhang,Cong et al.2011；Deng,Yan et al.2012；Li,Piatek et al.2012；Mahfouz,Li et al.2012；Mak,Bradley et al.2012)。在本发明中，已设计新TALE核酸酶，用于精确地靶向用于过继性免疫疗法策略的相关基因。

在PCT/EP2014/075317中描述了识别和切割靶序列的优选的TALE核酸酶。具体地，可以用所述稀切核酸内切酶将另外的催化结构域进一步引入细胞，以增加诱变，从而增强它们失活靶基因的能力。更具体地，所述另外的催化结构域是DNA末端处理酶。DNA末端处理酶的非限制性实例包括5-3’核酸外切酶、3-5’核酸外切酶、5-3’碱性核酸外切酶、5’侧翼核酸内切酶(5’flap endonuclease)、解旋酶、磷酸酶(hosphatase)、水解酶和不依赖模板的DNA聚合酶。这样的催化结构域的非限制性实例包括蛋白质结构域或蛋白质结构域的催化活性衍生物，其选自由hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT(末端脱氧核苷酸基转移酶)、人DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)组成的组。在优选的实施方式中，所述另外的催化结构域具有3’-5’-核酸外切酶活性，并且在更优选的实施方式中，所述另外的催化结构域是TREX，更优选TREX2催化结构域(WO2012/058458)。在另一种优选实施方式中，所述催化结构域是由单链TREX2多肽编码的。可选地通过肽接头，可以将所述另外的催化结构域融合到根据本发明的核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。

已知内源性核酸断裂会刺激同源重组的速率。因此，在另一种实施方式中，所述方法的基因修饰步骤进一步包括将至少包含同源于靶核酸序列的一部分的序列的外源性核酸引入细胞的步骤，使得在靶核酸序列和外源性核酸之间发生同源重组。在具体的实施方式中，所述外源性核酸包含第一和第二部分，其分别同源于靶核酸序列的区域5’和3’。在这些实施方式中，所述外源性核酸还包含位于第一和第二部分之间的第三部分，其不包含与靶核酸序列的区域5’和3’的同源性。在靶核酸序列的切割以后，在靶核酸序列和外源性核酸之间刺激同源重组事件。优选地，在所述供体基质(donor matrix)内使用至少50bp，优选大于100bp以及更优选大于200bp的同源序列。在具体实施方式中，同源序列可以是200bp至6000bp，更优选1000bp至2000bp。实际上，共享的核酸同源性是位于断裂位点的上游和下游的侧翼区域中，并且待引入的核酸序列应位于两臂之间。

免疫检查点

本发明提供了表达抗CD123 CAR，具体地SEQ ID N°44、或SEQ ID N°1+SEQ ID N°44的抗CD123 CAR的异基因T细胞，其中失活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组分的基因，和/或如在WO2014/184741中提及的，失活选自以下基因中的一种基因，CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1(orblimp1)、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3。

耐药T细胞

根据另一个方面，本发明的表达抗CD123 CAR的T细胞可以被进一步基因工程化以改善它对用作用于治疗CD123阳性恶性细胞的标准护理的免疫抑制药物或化疗治疗的抗性。

已开发多种细胞毒性剂(抗癌药物)如抗代谢物、烷化剂、蒽环类、DNA甲基转移酶抑制剂、铂化合物和纺锤体毒物，以杀死癌细胞。然而，以新疗法，如免疫治疗引入这些药剂是有问题的。例如，由于化疗剂的非特异性毒性曲线，化疗剂可能不利于强健的抗肿瘤免疫活性T细胞的建立。基于小分子的靶向细胞增殖途径的疗法也可能妨碍抗肿瘤免疫性的建立。如果短暂有效的化疗方案可以与新型免疫活性细胞疗法结合，那么可以显著改善抗肿瘤治疗(参见(Dasgupta,McCarty et al.2011)。

为了改善癌症治疗和异基因T细胞的选择性移植，将耐药性赋予所述异基因T细胞，以保护它们免受化疗剂的有毒副作用。T细胞的耐药性还允许它们在体内或体外富集，因为相对于药物敏感细胞，表达耐药性基因的T细胞将存活和增殖。

在PCT/EP2014/075317中公开了用于工程化耐化疗剂的T细胞的方法，其全部内容通过引证结合于本文。

具体地，本发明涉及工程化适用于免疫治疗的异基因细胞的方法，其中失活至少一种编码T细胞受体(TCR)组分的基因以及修饰一种基因以赋予耐药性，包括：

○提供表达抗CD123 CAR的T细胞；具体地表达SEQ ID NO°42、SEQ ID NO°44、SEQID NO 46的抗CD123 CAR的T细胞，优选SEQ ID NO°42、SEQ ID NO°44、SEQ ID NO 46的人源化123 CAR；

○通过失活至少一种编码T细胞受体(TCR)组分的基因来修饰所述表达抗CD123CAR的T细胞；

○修饰所述表达抗CD123 CAR的T细胞以将耐药性赋予所述表达抗CD123 CAR的T细胞；

○在所述药物的存在下，扩增所述表达工程化的抗CD123 CAR的T细胞，

可替换地，本发明涉及包括以下的方法：

○提供表达抗CD123 CAR的T细胞；具体地表达SEQ ID NO°42、SEQ ID NO°44、SEQID NO 46的抗CD123 CAR的T细胞，优选SEQ ID NO°42、SEQ ID NO°44、SEQ ID NO 46的人源化123CAR；

○在所述药物的存在下，扩增所述表达工程化的抗CD123 CAR的T细胞。

具体地，本发明还涉及工程化适用于免疫治疗的异基因细胞的方法，其中失活至少一种编码T细胞受体(TCR)组分的基因以及修饰一种基因以赋予耐药性，包括：

○提供表达抗CD123 CAR的T细胞；具体地表达SEQ ID NO°75、SEQ ID NO°76、SEQID NO 77的抗CD123 CAR的T细胞，优选SEQ ID NO°75、SEQ ID NO°76、SEQ ID NO 77的人源化123CAR，更优选SEQ ID NO°75的人源化123 CAR；

可替换地，本发明涉及包括以下的方法：

○在所述药物的存在下，扩增所述表达工程化抗CD123 CAR的T细胞。

在表达抗CD123 CAR的免疫细胞中耐药性基因的表达

在具体的实施方式中，可以通过至少一种耐药性基因的表达，将所述耐药性赋予T细胞。所述耐药性基因是指编码对药剂，如化疗剂(例如，甲氨蝶呤)具有“耐药性”的核酸序列。换句话说，耐药性基因在细胞中的表达允许在药剂的存在下细胞增殖比没有耐药性基因的相应细胞的增殖程度更大。耐药性基因在细胞中的表达允许在药剂的存在下细胞增殖并且不影响其活性。本发明的耐药性基因可以编码对抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷化剂、蒽环类、细胞毒性抗生素、抗免疫亲和蛋白、它们的类似物或衍生物等的耐受性。

在一种实施方式中，本发明的耐药性基因可以赋予对药物(或药剂)，具体地选自阿糖胞苷(Aracytine)、胞嘧啶(Cytosine)、阿拉伯糖苷(Arabinoside)、安吖啶(amsacrine)、柔红霉素(Daunorubicine)、伊达比星(Idarubicine)、诺消灵(Novantrone)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、足叶乙苷(Vepeside)、依托泊苷(Etoposide)(VP16)、三氧化二砷(arsenic trioxyde)、反式维甲酸(transretinoic acid)、三氧化二砷和反式维甲酸的组合、氮芥(mechlorethamine)、丙卡巴肼(procarbazine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、阿糖胞苷(cytarabine)、蒽环类(anthracycline)、6-硫鸟嘌呤、羟基脲、泼尼松、以及它们的组合的抗癌药物的抗性。

已经确定了可以潜在地用于赋予对靶定细胞耐药性的多种耐药性基因(Takebe,Zhao et al.2001；Sugimoto,Tsukahara et al.2003；Zielske,Reese et al.2003；Nivens,Felder et al.2004；Bardenheuer,Lehmberg et al.2005；Kushman,Kabler etal.2007)。

耐药性基因的一个实例还可以是二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变或修饰形式。DHFR是参与调节四氢叶酸在细胞中的量的酶并且是DNA合成必不可少的。叶酸类似物如甲氨蝶呤(MTX)抑制DHFR并且因此在临床中用作抗肿瘤剂。已描述了对于在治疗中使用的抗叶酸的抑制具有增加的抗性的DHFR的不同的突变形式。在具体的实施方式中，根据本发明的耐药性基因可以是编码人野生型DHFR(GenBank:AAH71996.1)的突变形式的核酸序列，其包含至少一种赋予对抗叶酸处理，如甲氨蝶呤的耐受性的突变。在具体的实施方式中，DHFR的突变形式包含至少一个在位置G15、L22、F31或F34处，优选在位置L22或F31处的突变氨基酸(Schweitzer,Dicker et al.(1990)；国际申请WO94/24277；美国专利US6,642,043)。在具体的实施方式中，所述DHFR突变形式包含两个在位置L22和F31处的突变氨基酸。本文中描述的氨基酸位置的对应经常以在GenBank:AAH71996.1中阐述的野生型DHFR多肽的形式的氨基酸的位置表达。在具体的实施方式中，优选用色氨酸残基取代位置15处的丝氨酸残基。在另一种具体实施方式中，优选用氨基酸(其将破坏突变DHFR与抗叶酸物的结合)，优选用不带电荷的氨基酸残基如苯丙氨酸或酪氨酸取代位置22处的亮氨酸残基。在另一种具体实施方式中，优选用较小的亲水性氨基酸如丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸取代位置31或34处的苯丙氨酸残基。

如在本文中所使用的，“抗叶酸剂”或“叶酸类似物”是指在一定程度上涉及干扰叶酸代谢途径的分子。抗叶酸剂的实例包括，例如，甲氨蝶呤(MTX)；氨基蝶呤；三甲曲沙(trimetrexate)(Neutrexin^TM)；依达曲沙(edatrexate)；N10-炔丙基-5,8-二脱氮叶酸(dideazafolic acid)(CB3717)；ZD1694(Tumodex)、5,8-二脱氮异叶酸(IAHQ)；5,10-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)；5-脱氮叶酸；PT523(Nα-(4-氨基-4-脱氧蝶酰)-Nδ-半苯二甲酰-L-鸟氨酸)；10-乙基-10-脱氮氨基蝶呤(DDATHF，洛美曲索(lomatrexol))；吡曲克辛(piritrexim)；10-EDAM；ZD1694；GW1843；培美曲塞(Penetrexate)和PDX(10-炔丙基-10-脱氮氨基蝶呤)。

耐药性基因的另一个实例还可以是肌苷-5’-单磷酸脱氢酶II(IMPDH2)，在鸟苷核苷酸的从头合成中的限速酶的突变或修饰形式。IMPDH2的突变或修饰形式是IMPDH抑制剂抗性基因。IMPDH抑制剂可以是霉酚酸(MPA)或它的前体药物霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)(MMF)。突变IMPDH2可以包含在野生型人IMPDH2(NP_000875.2)的MAP结合位点的至少一个，优选两个突变，其导致显著增加的对IMPDH抑制剂的抗性。突变优选在位置T333和/或S351(Yam,Jensen et al.2006；Sangiolo,Lesnikova et al.2007；Jonnalagadda,Brown et al.2013)。在具体的实施方式中，在位置333处的苏氨酸残基被异亮氨酸残基替换并且在位置351处的丝氨酸残基被酪氨酸残基替换。在本文中描述的氨基酸位置的对应经常以NP_000875.2中阐述的野生型人IMPDH2多肽的形式的氨基酸的位置表达。

另一种耐药性基因是钙调磷酸酶(calcineurin)的突变形式。钙调磷酸酶(PP2B)，一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其参与许多生物过程并且对于T细胞活化是重要的。钙调磷酸酶是由催化亚基(CnA；三种同工型)和调节亚基(CnB；两种同工型)组成的异源二聚体。在T细胞受体的结合以后，钙调磷酸酶去磷酸化转录因子NFAT，使得其转运到核和活性关键靶基因如IL2。与FKBP12复合的FK506、或与CyPA嵌段NFAT复合的环孢素A(CsA)进入钙调磷酸酶的活性位点，防止其脱磷酸化并从而抑制T细胞活化(Brewin,Mancao etal.2009)。本发明的耐药性基因可以是核酸序列，其编码耐钙调磷酸酶抑制剂(如FK506和/或CsA)的钙调磷酸酶的突变形式。在具体实施方式中，所述突变形式可以包含至少一种在位置V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360处的野生型钙调磷酸酶异源二聚体a的突变氨基酸，优选在位置T351和L354或V314和Y341处的双突变。在具体实施方式中，在位置341处的缬氨酸残基可以被赖氨酸或精氨酸残基替换；在位置341处的酪氨酸残基可以被苯丙氨酸残基替换；在位置347处的蛋氨酸可以被谷氨酸、精氨酸或色氨酸残基替换；在位置351处的苏氨酸可以被谷氨酸残基替换；在位置352处的色氨酸残基可以被半胱氨酸、谷氨酸或丙氨酸残基替换；在位置353处的丝氨酸可以被组氨酸或天冬酰胺残基替换；在位置354处的亮氨酸可以被丙氨酸残基替换；在位置360处的赖氨酸可以被对应于GenBank:ACX34092.1的序列的丙氨酸或苯丙氨酸残基替换。本文中描述的氨基酸位置的对应经常以(GenBank:ACX34092.1)中阐述的野生型人钙调磷酸酶异源二聚体多肽的形式的氨基酸的位置表达。

在另一种具体实施方式中，所述突变形式可以包含在位置V120、N123、L124或K125处的野生型钙调磷酸酶异源二聚体b的至少一个突变氨基酸，优选在位置L124和K125处的双突变。在具体实施方式中，在位置120处的缬氨酸可以被丝氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基替换；在位置123处的天冬酰胺可以被色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸或丝氨酸替换；在位置124处的亮氨酸可以被苏氨酸残基替换；在位置125处的赖氨酸可以被丙氨酸、谷氨酸、色氨酸替换，或在在对应于GenBank:ACX34095.1的氨基酸序列中的位置125处的赖氨酸之后可以添加两个残基如亮氨酸-精氨酸或异亮氨酸-谷氨酸。在本文中描述的氨基酸位置的对应经常以(GenBank:ACX34095.1)中阐述的野生型人钙调磷酸酶异源二聚体b多肽的形式的氨基酸的位置表达。

另一种耐药性基因是编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hAGT)的0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)。AGT是赋予对烷化剂(如亚硝基脲和替莫唑胺(TMZ))的细胞毒性效应的耐受性的DNA修复蛋白。6-苄基鸟嘌呤(6-BG)是AGT的抑制剂，其增强亚硝基脲毒性并连同TMZ一起共同给予以增强该药剂的细胞毒性效应。编码AGT的变体的MGMT的多种突变形式对6-BG的失活是高度耐受性的，但保留它们修复DNA损伤的能力(Maze,Kurpad et al.1999)。在具体的实施方式中，AGT突变形式可以包含在氨基酸序列SEQ ID NO:18(UniProtKB:P16455)中的野生型AGT位置P140的突变氨基酸。在优选的实施方式中，所述位置140处的脯氨酸被赖氨酸残基替换。

另一种耐药性基因可以是多药耐药蛋白1(MDR1)基因。此基因编码参与代谢副产物穿过细胞膜的传输的膜糖蛋白，称为P糖蛋白(P-GP)。P-Gp蛋白显示出对于多种结构上无关的化疗剂的较宽的特异性。

已经描述了过表达多药耐药蛋白1会赋予对药物如米托蒽醌(Mitoxantrone)的抗性(Charles S.Morrow,Christina Peklak-Scott,Bimjhana Bishwokarma,TimothyE.Kute,Pamela K.Smitherman,and Alan J.Townsend.Multidrug Resistance Protein 1(MRP1,ABCC1)Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-DependentDrug Efflux Mol Pharmacol April 2006 69:1499-1505)。

因此，通过表达编码MDR-1(NP_000918)的核酸序列，可以赋予细胞耐药性。

用于制备耐药细胞的又一种方式是制备具有特定突变，如在人拓扑异构酶II基因中的Arg486和Glu571处的突变的细胞，以赋予对安吖啶的耐受性(S.PATEL,B.A.KELLER,and L.M.FISHER.2000.MOLECULAR PHARMACOLOGY.Vol 57:p784–791(2000)。

用于制备耐药细胞的又一种方式是制备过表达微RNA-21的细胞，以赋予对柔红霉素的抗性(Involvement of miR-21in resistance to daunorubicin by regulatingPTEN expression in the leukaemia K562cell line Bai,Haitao et al.FEBS Letters,Volume 585,Issue 2,402–408)。

在一种优选实施方式中，携带这样的赋予耐药性的mRNA或蛋白质的细胞还包含抑制性mRNA或基因，调节其表达，从而在所述药物的存在下或在给予所述药物后使得所述耐药细胞选择性破坏。

耐药性基因还可以赋予对细胞毒性抗生素的抗性，并且可以是ble基因或mcrA基因。在免疫细胞中ble基因或mcrA的异位表达在暴露于化疗剂(分别为博来霉素或丝裂霉素C)时提供了选择性优势。

基因治疗的最实用的方法是通过使用利用载体，优选病毒载体的高效基因递送来将基因加入工程化T细胞。因此，在具体的实施方式中，可以通过将优选由至少一种载体编码的转基因引入细胞来在细胞中表达所述耐药性基因。

在一种实施方式中，携带赋予对药物的抗性的耐药性基因或修饰基因的细胞还包含可诱导自杀基因(其诱导会激起细胞死亡)，使得它们选择性破坏。

基因随机插入基因组可能导致插入基因或在插入位点附近的基因的不恰当的表达。使用包含内源性序列的外源性核酸(以将基因靶向基因组内的特定位点)的同源重组的特定基因治疗可以允许工程化安全的T细胞。如上所述，该方法的基因修饰步骤可以包括将至少包含编码耐药性基因的序列和内源性基因的一部分的外源性核酸引入细胞的步骤，使得在内源性基因和外源性核酸之间发生同源重组。在具体的实施方式中，所述内源性基因可以是野生型“耐药性”基因，使得在同源重组以后，野生型基因被赋予对药物具有抗性的基因的突变形式替换。

已知内切核酸降解断裂会刺激同源重组的速率。因此，在具体实施方式中，本发明的方法进一步包括以下步骤：在细胞中表达能够切割内源性基因内的靶序列的稀切核酸内切酶。所述内源性基因可以编码例如DHFR、IMPDH2、钙调磷酸酶或AGT。所述稀切核酸内切酶可以是TALE核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9内切核酸酶、MBBBD核酸酶或大范围核酸酶。

在表达抗CD123 CAR的免疫细胞中药物敏感性基因的失活

在另一种具体的实施方式中，可以通过药物敏感基因的失活赋予本发明的细胞(表达抗CD123 CAR的免疫细胞)所述的耐药性。

本发明人寻求失活潜在的药物敏感基因以工程化用于免疫治疗的T细胞，具体地工程化可以与治疗剂(抗癌药物)结合使用的表达抗CD123CAR的免疫细胞。

失活基因旨在不以功能性蛋白质的形式来表达感兴趣的基因。在具体的实施方式中，该方法的基因修饰依靠在提供的用于工程化的细胞中表达一种稀切核酸内切酶，使得所述稀切核酸内切酶特异性地催化在一种靶基因中的切割，从而失活所述靶基因。在具体的实施方式中，失活至少一种药物敏感基因的步骤包括将能够破坏至少一种药物敏感基因的稀切核酸内切酶引入细胞。在更具体的实施方式中，用编码能够破坏药物敏感基因的稀切核酸内切酶的核酸来转化所述细胞，并将所述稀切核酸内切酶表达进入所述细胞。所述稀切核酸内切酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、A MBBBD核酸酶或TALE核酸酶。在优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE核酸酶。

在优选的实施方式中，可以被失活以赋予T细胞耐药性的药物敏感基因是人脱氧胞苷激酶(dCK)基因。这种酶是脱氧核糖核苷脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧腺苷(dA)的磷酸化所需要的。通过dCK，嘌呤核苷酸类似物(PNA)被代谢成单、二和三磷酸PNA。它们的三磷酸形式并且特别是三磷酸氯法拉滨(clofarabine triphosphate)与用于DNA合成的ATP竞争，作用为促凋亡剂并且是参与三核苷酸生产的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂。

优选地，在T细胞中dCK的失活由TALE核酸酶来介导。为了实现此目标，已在多核苷酸水平上设计，组装了多对dCK TALE核酸酶，并通过测序证实。在PCT/EP2014/075317中描述了根据本发明可以使用的TALE核酸酶对的实例。

在T细胞中的该dCK失活赋予对嘌呤核苷类似物(PNA)如氯法拉滨和氟达拉滨(fludarabine)的耐受性。

在另一种优选实施方式中，在T细胞中的dCK失活与TRAC基因的失活结合，使得这些双敲除(KO)T细胞均对药物如氯法拉滨具有耐受性并且具有较少异基因性。这种双重特征特别可用于治疗目的，使得用于免疫治疗的“现成的”异基因细胞连同化疗一起来治疗患有癌症的患者。可以同时或依次进行这种双KO失活dCK/TRAC。在PCT/EP2014/075317中描述了在本发明中取得成功的TALE核酸酶dCK/TRAC对的一个实例，具体地，在2种基因座(dCK和TRAC)中的靶序列。

可以被失活的酶的另一个实例是人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因(Genbank:M26434.1)。具体地在工程化T细胞中HPRT可以被失活以赋予对抑制细胞的代谢产物，6-硫鸟嘌呤(6TG)，的抗性，其被HPRT转化成细胞毒性硫鸟嘌呤核苷酸并且目前用来治疗患有癌症，特别是白血病的患者(Hacke,Treger et al.2013)。鸟嘌呤类似物被HPRT转移酶所代谢，该HPRT转移酶催化磷酸核糖基部分的加入并且使得能够形成TGMP。鸟嘌呤类似物，包括6巯基嘌呤(6MP)和6硫鸟嘌呤(6TG)，通常用作用来治疗ALL的淋巴细胞缺失药物(lymphodepleting drug)。它们被HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)所代谢，其催化磷酸核糖基部分的加入并且使得能够形成TGMP。它们随后的磷酸化导致形成它们的三磷酸化形式，其最终被整合到DNA。在并入DNA中以后，通过其硫醇盐群聚，硫代GTP会损害DNA复制的保真度，并产生随机点突变，其对于细胞完整性是高度有害的。

在另一种实施方式中，通常表达在T细胞的表面上的CD3的失活可以赋予对CD3抗体如teplizumab的耐受性。

如在本文中所使用的，术语“治疗剂”、“化疗剂”、或“药物”或“抗癌药物”是指药物(medicament)，优选可以与癌细胞相互作用，从而降低细胞的增殖状态和/或杀死细胞的化合物或其衍生物。化疗剂或“抗癌药物”的实例包括但不限于烷化剂(例如，白消安(Busulfan)、卡铂(Carboplatine)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂(Cisplatine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(Ifosfamide)、美法仑(Melphalan)、氮芥(Mechlorethamine)、奥沙利铂(Oxaliplatine)、乌拉莫司汀(Uramustine)、替莫唑胺(Temozolomide)、福莫司汀(Fotemustine))、代谢拮抗剂(例如，嘌呤核苷抗代谢物如氯法拉滨、氟达拉滨或2’-脱氧腺苷、甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或它们的衍生物、硫唑嘌呤(Azathioprine)、卡培他滨(Capecitabine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶 (Fluorouracile)、吉西他滨(Gemcitabine)、甲氨蝶呤、培美曲塞(Pemetrexed))、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、多柔比星、博来霉素、柔红霉素(Daunorubicine)、阿霉素(Doxorubicine)、表柔比星(Epirubicine)、羟基脲、伊达比星(Idarubicine)、丝裂霉素C、米托蒽醌)、源自植物的抗肿瘤剂(例如，长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉酚、长春碱(Vinblastine)、(长春瑞滨(Vinorelbine))、多西他赛(Docetaxel)、紫杉醇(Paclitaxel))、拓扑异构酶抑制剂(伊立替康(Irinotecan)、托泊替康(Topotecan)、依托泊苷(Etoposide))。

在优选的实施方式中，如在本文中所使用的治疗剂、化疗药物是指可以用来治疗癌症，具体地用来治疗造血癌细胞，并且更具体地AML，从而降低癌细胞的增殖状态和/或杀死癌细胞的化合物或其衍生物。化疗剂的实例包括但不限于阿糖胞苷(Aracytine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosine Arabinoside)、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、足叶乙苷、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式维甲酸、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、以及它们的组合。

在本发明的其它实施方式中，将本发明的细胞连同药物(或药剂)一起给予患者，该药物(或药剂)选自阿糖胞苷(Aracytine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、足叶乙苷、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式维甲酸、阿糖胞苷(cytarabine)、蒽环类、6-硫鸟嘌呤、羟基脲、泼尼松、以及它们的组合。

这样的药剂可以进一步包括但不限于抗癌剂TRIMETHOTRIXATE^TM(TMTX)、TEMOZOLOMIDE^TM、RALTRITREXED^TM、S-(4-硝基苄基)-6-硫代肌苷(NBMPR)、6-苄胍(6-BG)、二氯亚硝基脲(BCNU)和CAMPTOTHECIN^TM、或任何它们的治疗性衍生物。

在更优选的实施方式中，将表达SEQ ID N°44的抗CD123 CAR的T细胞与至少一种治疗剂结合给予患者，该治疗剂选自阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、足叶乙苷、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式维甲酸以及它们的组合。

如在本文中所使用的，对药剂具有“耐受性或耐受”的细胞是指已被基因修饰从而该细胞在一定量的抑制或防止没有修饰的细胞的增殖的药剂的存在下增殖的细胞。

表达抗CD123 CAR的免疫细胞的多药耐药性

在另一种具体实施方式中，本发明人寻求开发“现成的”免疫治疗策略，使用异基因T细胞，特别是当用不同的药物来治疗患者时，使用耐多种药物的表达异基因抗CD123CAR的T细胞来介导工程化T细胞的选择。通过基因工程化多药耐药性异基因T细胞，可以显著增强治疗效率。这样的策略可以特别有效地治疗响应于呈现协同效应的药物组合的肿瘤。此外，可以使用最小剂量的药剂扩展和选择多耐受性的工程化T细胞。

因此，根据本发明的方法可以包括修饰T细胞以将多药耐药性赋予所述T细胞。可以通过表达一种以上的耐药性基因或通过失活一种以上的药物敏感基因来赋予所述多药耐药性。在另一种具体实施方式中，可以通过表达至少一种耐药性基因和失活至少一种药物敏感基因来将多药耐药性赋予所述T细胞。具体地，可以通过表达至少一种耐药性基因如DHFR的突变形式、IMPDH2的突变形式、钙调磷酸酶的突变形式、MGMT的突变形式、ble基因、和mcrA基因以及失活至少一种药物敏感基因如HPRT基因，来将多药耐药性赋予所述T细胞。在优选的实施方式中，可以通过失活HPRT基因和表达DHFR的突变形式；或通过失活HPRT基因和表达IMPDH2的突变形式；或通过失活HPRT基因和表达钙调磷酸酶的突变形式；通过失活HPRT基因和表达MGMT的突变形式；通过失活HPRT基因和表达ble基因；通过失活HPRT基因和表达mcrA基因，来赋予多药耐药性。

在一种实施方式中，本发明提供了表达异基因抗CD123 CAR的T细胞。其表达一种以上的耐药性基因或其中一种以上的药物敏感基因被失活。

表达抗CD123 CAR的免疫细胞中的自杀基因

在一些情况下，因为在给予之后工程化T细胞可以扩展和持续数年，所以可以期望包括安全机制以使得可以选择性删除给予的T细胞。因此，在一些实施方式中，本发明的方法可以包括用重组自杀基因来转化所述T细胞。在给予受试者以后，所述重组自杀基因用来减少所述T细胞的直接毒性和/或失控增殖的风险(Quintarelli C,Vera F,blood 2007；Tey SK,Dotti G.,Rooney CM,boil blood marrow transplant 2007)。自杀基因使得能够体内选择性缺失转化细胞。具体地，自杀基因具有将无毒性前体药物转化成细胞毒性药物或表达毒性的基因表达产物的能力。换句话说，“自杀基因”是编码其本身或在其它化合物的存在下引起细胞死亡的产物的核酸。

这样的自杀基因的代表性实例是一种编码单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus)的胸苷激酶的自杀基因。另外的实例是水痘带状疱疹病毒(varicella zostervirus)的胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，其可以将5-氟胞嘧啶转化成高度毒性的化合物5-氟尿嘧啶。作为非限制实例，自杀基因还包括半胱天冬酶(caspase)-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化的化学诱导剂(CID)来活化半胱天冬酶-9。自杀基因还可以是表达在细胞表面上并且使细胞对治疗性单克隆抗体敏感的多肽。如在本文中所使用的，“前体药物”是指可以被转化成有毒产物的可用于本发明的方法的任何化合物。在本发明的方法中，通过自杀基因的基因产物，将前体药物转化成有毒产物。这样的前体药物的代表性实例是更昔洛韦，其通过HSV-胸苷激酶体内转化成毒性化合物。更昔洛韦衍生物随后对于肿瘤细胞是毒性的。前体药物的其它代表性实例包括阿昔洛韦、FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶]、VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿糖苷、和胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶。

一种优选的自杀基因系统采用重组抗原多肽，其包含由抗CD20mAb利妥昔单抗，具体地QBen10识别的抗原基序，如在描述于WO2013153391中的所谓的RQR8多肽。那么可以将利妥昔单抗(一种经授权的抗体药物)，用于细胞耗竭(当需要的时候)。

在一种实施方式中，本发明提供了表达异基因抗CD123CAR的T细胞，其表达一种以上的耐药性基因或其中一种以上的药物敏感基因被失活，以及使得所述细胞被破坏的自杀基因。

耐氯法拉滨的表达抗CD123CAR的免疫细胞

本发明包括用于治疗用途的耐药物如氯法拉滨的T细胞的制造。它们可以通过dCK基因的失活(如先前解释的)来获得。根据优选的实施方式，通过结合dCK和TCR基因的失活(先前描述的)，使T细胞对化疗具有耐受性并且具有较少异基因性。

因此，本发明提供了表达抗CD123CAR的细胞，具体地表达抗CD123CAR的T细胞，其中CAR源自Klon 43(包含SEQ ID NO42或SEQ ID NO.44，可选地人源化的))并且其中dCK基因被失活。

用于测试耐药性异基因CAR T细胞的细胞毒性的CD123+/luc+耐药性Daudi细胞

本发明还包括用于制造表达对于CAR T细胞具有特异性的表面受体和抗性基因的靶T细胞的方法。这些靶细胞特别可用于测试CAR T细胞的细胞毒性。这些细胞容易耐受临床相关剂量的氯法拉滨并且含有荧光素酶活性。该特征的组合使得能够在小鼠模型中体内追踪它们或在需要时破坏它们。

更具体地，它们可以用来评估在氯法拉滨或其它PNA的存在下在小鼠中耐药T细胞的细胞毒性。耐氯法拉滨的Daudi细胞模拟含有耐药性B细胞恶性肿瘤的，复发形式诱导治疗的急性成淋巴细胞白血病(ALL)患者的生理状态。因此，这些细胞非常利于评估耐药性CAR T细胞的可靠性和细胞毒性。优选地，这些靶细胞是CD123+荧光素酶+Daudi细胞。

分离的细胞

本发明涉及表达结合于CD123的CAR的分离的细胞。因此，本发明涉及表达抗CD123CAR的细胞。在具体的实施方式中，所述表达抗CD123CAR的细胞是耐受至少一种药物的和/或包含至少一种被破坏的编码T细胞受体组分的基因。

在优选的实施方式中，本发明涉及分离的表达结合于CD123的CAR的T细胞。本发明涉及表达抗CD123CAR的T细胞。在具体的实施方式中，所述表达抗CD123CAR的T细胞是耐受至少一种药物的和/或包含至少一种被破坏的编码T细胞受体组分的基因。

在具体的实施方式中，所述抗CD123CAR T细胞表达至少一种耐药性基因，优选ble基因或mcrA基因或编码突变DHFR、突变IMPDH2、突变AGT或突变钙调磷酸酶的基因。

在另一种具体实施方式中，所述表达抗CD123CAR的T细胞包含至少一种被破坏的药物敏感基因如dCK或HPRT基因。在更具体的实施方式中，所述分离的抗CD123CAR T细胞包含被破坏的HPRT基因并表达DHFR突变体；所述分离的抗CD123 CAR T细胞包含被破坏的HPRT基因并表达IMPDH2突变体；所述分离的抗CD123CAR T细胞包含被破坏的HPRT基因并表达钙调磷酸酶突变体；所述分离的抗CD123CAR T细胞包含被破坏的HPRT基因并表达AGT突变体。

耐药物的异基因抗CD123CAR T细胞在免疫治疗中的用途

具体地，本发明涉及异基因T细胞，具体地表达异基因抗CD123CAR的T细胞，并且优选包含具有与来自Klon 43的scfv 80％至100％的一致性的肽的，表达异基因抗CD123CAR的T细胞，所述包含具有与来自Klon 43的scfv 80％至100％的一致性的肽的，表达异基因抗CD123CAR的T细胞更特别地耐药物，并且特别适用于免疫治疗。

在优选的实施方式中，所述表达异基因抗CD123CAR的T细胞包含具有与SEQ IDNO.44 80％至100％的一致性的肽并且更特别地耐药物，并且特别适用于免疫治疗。

可以通过药物敏感基因的失活或通过耐药性基因的表达，来赋予药物的抗性。适合本发明的药物的一些实例是嘌呤核苷类似物(PNA)如氯法拉滨或氟达拉滨、或其它药物如6-巯嘌呤(6MP)和6硫鸟嘌呤(6TG)。

在一个方面中，本发明提供了用于工程化免疫细胞以使它们耐受嘌呤核苷酸类似物(PNA)，如氯法拉滨或氟达拉滨的方法，从而使它们可以在用这些常规化疗剂预先治疗的患者中用于癌症免疫疗法治疗。

可以通过失活一种或多种负责细胞对药物的敏感的基因(药物敏感基因)，如dcK和/或HPRT基因来赋予T细胞耐药性。

根据另一个方面，可以通过表达耐药性基因将耐药性赋予T细胞。已经确定了多种基因，如二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)的变体等位基因会赋予根据本发明的细胞耐药性。

例如，可以将CD52和糖皮质激素受体(GR)(其是Campath(阿仑单抗)或利妥昔单抗和糖皮质激素治疗的药物靶)失活以使得细胞耐受这些治疗并给予它们相对于患者自身的没有被赋予特定CD123CAR的T细胞的竞争优势。还可以抑制或减少CD3基因的表达以赋予对另一种免疫抑制药物Teplizumab的抗性。根据本发明，还可以抑制或减少HPRT的表达以赋予对6-硫鸟嘌呤的抗性，其是在化疗中常用的一种细胞抑制剂，特别是用于急性成淋巴细胞白血病的治疗。

根据本发明进一步的方面，可以通过失活编码作为充当T细胞活化的调节剂的“免疫检查点(immune checkpoint)”的蛋白的基因，如选自以下基因来进一步操作免疫细胞以使它们更具活性或限制衰竭：关卡CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1(orblimp1)、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3，优选地，所述基因是PDCD1或CTLA-4。其表达可以被减少或抑制的基因的实例显示在表9中。

在一种实施方式中，所述基因是作用为编码β2微球蛋白的T细胞活化的调节剂的基因。

根据本发明的进一步的方面，可以进一步操作本发明的抗CD123CAR免疫细胞以使它们耐药物，特别是耐受在针对癌症，特别是表达CD123的细胞介导的癌症如AML的化疗期间使用的药物。这可以通过引入赋予对所述药物的抗性的基因来实现。可以通过使用如先前描述的基因可诱导抑制/表达系统打开和关闭该基因(Garcia EL,Mills AA(2002)Getting around lethality with inducible Cre-mediated excision.Semin Cell DevBiol 13:151–8,Lewandoski M(2001)Conditional control of gene expression in themouse.Nat Rev Genet 2:743–55；Scharfenberger L,Hennerici T,Kirly G et al.(2014)Transgenic mouse technology in skin biology:Generation of complete ortissue-specific knockout mice.J Invest Dermatol 134:e16；Schwenk F,Kuhn R,Angrand PO et al.(1998)Temporally and spatially regulated somatic mutagenesisin mice.Nucleic Acids Res 26:1427–32)。

因此，本发明的目的是表达抗CD123CAR的、耐药性免疫细胞，其中(i)失活至少一种表达T细胞受体(TCR)的一种或多种组分的基因；(ii)结合至少一种赋予对药物的抗性的基因或删除或突变赋予对所述药物的敏感性的基因以被失活；(iii)可选地失活选自在表9中公开的基因的另一种基因。

本发明包括通过本发明的方法可获得的分离的抗CD123CAR免疫细胞或细胞系，更具体地包含在本文中描述的任何蛋白质、多肽、等位基因变体、更改或删除的基因或载体的分离的细胞。

本发明的免疫细胞或细胞系可进一步包含外源性重组多核苷酸，具体地CAR或自杀基因，或它们可以包含更改或删除的编码检查点蛋白或其配体的基因，其有助于它们作为治疗产物，理想地作为“现成的”产品的效率。在另一个方面，本发明涉及用于通过至少一次给予通过上述方法可获得的工程化免疫细胞来治疗或预防患者的癌症的方法。

表9：编码免疫检查点蛋白的基因的列表

表10：不同的人源化抗体片段的序列

在优选的实施方式中，进一步工程化免疫细胞的所述方法包括将多核苷酸引入所述T细胞，具体地mRNA，编码特异性稀切核酸内切酶，以通过DNA切割来选择性地失活上述基因。在更优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE核酸酶或Cas9核酸内切酶。迄今已证明，相比于其它类型的稀切核酸内切酶，TAL核酸酶具有更高的特异性和切割效率，从而使它们成为为大规模地以恒定转化率(turn-over)产生工程化免疫细胞所选择的核酸内切酶。

递送方法

上述不同的方法涉及在细胞中表达感兴趣的蛋白质如耐药性基因、稀切核酸内切酶、嵌合抗原受体(CAR)，尤其是抗CD123CAR，以及更特别地，包含SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.44的CAR，以及自杀基因。

作为非限制性实例，可以将所述感兴趣的蛋白质通过它作为优选由至少一种质粒载体编码的转基因的引入来表达在细胞中。由于编码所述多肽的多核苷酸引入细胞的结果，可以将多肽表达在细胞中。可替换地，可以在细胞外产生所述多肽，然后引入其中。

用于将多核苷酸构建体引入细胞的方法在本领域中是已知的，并且，作为非限制实例，包括稳定的转化方法，其中将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组，瞬时转化方法，其中不将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组，以及病毒介导的方法。

可以通过例如，重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等，将所述多核苷酸引入细胞。例如，瞬时转化方法包括例如微注射。电穿孔或粒子轰击、细胞融合。对于在细胞中表达，可以将所述多核苷酸包括在载体中，更具体地质粒或病毒中。所述质粒载体可以包含提供接受所述载体的细胞的识别和/或选择的选择标记。

在一种载体中可以包括不同的转基因。所述载体可以包含编码核糖体跳跃序列的核酸序列，如编码2A肽的序列。2A肽(其确定于微小RNA病毒的口蹄疫病毒亚组中)，引起核糖体从一个密码子“跳跃”至下一个密码子，而没有在两个由密码子编码的氨基酸之间形成肽键(见Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly etal.,J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.,RNA 13:803-810(2007))。

“密码子”是指在mRNA上(或在DNA分子的有义链上)的三个核苷酸，所述mRNA由核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽由在框中的2A寡肽序列分开时，两个多肽可以合成自mRNA内的单一的、连续的开放阅读框。这样的核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的并且已知由用于表达由单一信使RNA编码的多种蛋白质的多种载体使用。

在本发明的更优选的实施方式中，编码根据本发明的多肽的多核苷酸可以是mRNA，通过例如电穿孔将其直接引入细胞。本发明人确定了用于在T细胞中mRNA电穿孔的最佳条件。本发明人使用了cytoPluse技术，其通过使用脉冲电场，使得可以瞬时透过活细胞，用于将材料递送进入细胞。基于使用PulseAgile(BTX Havard Apparatus,84October HillRoad,Holliston,MA 01746,USA)电穿孔波形的技术允许精确控制脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔(美国专利6,010,613和国际PCT申请WO2004083379)。可以修改所有这些参数以达到在最小死亡率的情况下获得高转染效率的最好条件。基本上，第一高电场脉冲使得孔形成，而后来的较低的电场脉冲则使得多核苷酸移动进入细胞。

上述不同的方法涉及将CAR引入细胞。作为非限制性实例，可以将所述CAR作为由一种质粒载体编码的转基因引入。所述质粒载体还可以含有提供用于接受所述载体的细胞的识别和/或选择的选择标记。

由于将编码所述多肽的多核苷酸引入细胞，可以在细胞中原位合成多肽。可替换地，可以在细胞外产生所述多肽，然后引入其中。用于将多核苷酸构建体引入细胞的方法在本领域中是已知的，并且，作为非限制实例，包括稳定转化方法，其中将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组，瞬时转化方法，其中不将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组，以及病毒介导的方法。可以通过例如，重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等，将所述多核苷酸引入细胞。例如，瞬时转化方法包括例如微注射、电穿孔或粒子轰击。对于在细胞中表达，可以将所述多核苷酸包括在载体中，更具体地质粒或病毒中。

工程化的免疫细胞

本发明还涉及能够通过所述方法工程化细胞而获得的分离的细胞或细胞系。具体地，所述分离的细胞包含至少一种如上所述的CAR。在另一种实施方式中，所述分离的细胞包含各自包含不同的胞外配体结合结构域的CAR的群体。具体地，所述分离的细胞包含编码CAR的外源性多核苷酸序列。本发明的基因修饰免疫细胞不依赖抗原结合机制来活化和增殖。

在本发明的范围内，还包含分离的免疫细胞，优选根据先前描述的任何一种方法所获得的T细胞。所述免疫细胞是指造血起源的细胞，其功能上参与先天性和/或适应性免疫反应的起始和/或运行。所述根据本发明的免疫细胞可以源自干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导的多能性干细胞、全能性干细胞或造血干细胞。代表性的人类细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞还可以是树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组的T细胞。在另一种实施方式中，所述细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在本发明的细胞的扩增和基因修饰之前，可以通过多种非限制性方法由受试者获得细胞来源。细胞可以获得自多种非限制性的来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域技术人员可用的和已知的任何数目的T细胞系。在另一种实施方式中，所述细胞可以源自健康供体，源自确诊患有癌症的患者或源自诊断患有感染的患者。在另一种实施方式中，所述细胞是呈现不同的表型特征的细胞的混合群体的一部分。在本发明的范围内还包含根据先前描述的方法获得自转化的T细胞的细胞系。在本发明的范围中包括耐受免疫抑制治疗并且能够通过先前的方法来获得的修饰的细胞。

作为优选的实施方式，本发明提供了如上所述的T细胞或被赋予CD123CAR的T细胞的群体，其不表达功能性TCR以及对CD123阳性细胞具有反应性，用于它们异基因移植进入患者。

作为更优选的实施方式，本发明提供了如上所述的T细胞或被赋予CD123CAR的T细胞的群体，以及对CD123阳性细胞的反应性，其不表达功能性TCR并且耐受选择的药物，用于它们异基因移植进入用所述选择的药物治疗的患者。

在更加优选的实施方式中，本发明提供了T细胞或被赋予包含SEQ ID NO.1+SEQID NO.44的多肽的抗CD123CAR的T细胞的群体，甚至更优选包含与SEQ ID NO.1+SEQ IDNO.44 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性的抗CD123CAR，具体地具有与SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44 85％至99％的一致性的抗CD123-CAR。

T细胞的活化和扩增

不论T细胞的基因修饰之前或之后，即使不依赖抗原结合机制来活化和增殖本发明的基因修饰免疫细胞，通常可以使用如在例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041、和美国专利申请公开第20060121005号中描述的方法进一步活化和扩增免疫细胞，特别是本发明的T细胞。可以在体外或体内扩增T细胞。

通常，通过与药剂接触来扩展本发明的T细胞，该药剂刺激在T细胞表面上的CD3TCR复合体和共刺激分子，以产生T细胞的活化信号。例如，可以使用化学品如钙离子载体(calcium ionophore)A23187、佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate13-acetate)(PMA)、或有丝分裂凝集素如植物血凝素(PHA)来生成T细胞的活化信号。

作为非限制性实例，可以通过如与抗CD3抗体、或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过连同钙离子载体一起与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素(bryostatin))接触来体外刺激T细胞群体。为了共刺激T细胞的表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激T细胞的增殖的条件下使T细胞的群体接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。适合于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640、或X-vivo 5(Lonza))，其可以含有增殖和存活所必要的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、和TNF-或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)、和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM,、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、和X-Vivo 20、Optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，不含血清或补充有适量的血清(或血浆)或限定组的激素，和/或一定量的足够用于T细胞的生长和扩增的细胞因子。仅在实验培养物中包括，但在待注入受试者的细胞的培养物中不包括抗生素，例如，青霉素和链霉素。将靶细胞保持在为支持生长所必要的条件下，例如，适宜的温度(例如，37°C)和气氛(例如，空气加上5％CO2)。暴露于不同的刺激时间的T细胞可以呈现不同的特征。

在另一种具体实施方式中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增所述细胞。还可以体内，例如在将所述细胞给予受试者以后在受试者的血液中扩增所述细胞。

治疗应用

在另一种实施方式中，如先前描述的通过不同的方法所获得的分离的细胞或源自所述分离的细胞的细胞系可以用作药物。

在另一种实施方式中，所述药物可以用于治疗癌症,特别是在需要其的患者中用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病。

在另一种实施方式中，源自所述分离的细胞的所述根据本发明的分离的细胞或细胞系可以用于制造用于在需要其的患者中治疗癌症的药物。

在具体实施方式中，提供表达抗CD123CAR的T细胞作为用于治疗AML、AML亚型、AML相关并发症、AML相关病症的药物。在优选的实施方式中，提供表达抗CD123CAR的T细胞作为药物，其中所述抗CD123CAR包含SEQ ID NO 44。

在另一种实施方式中，所述药物可以用于治疗表达CD123的细胞介导的病理状态或以表达CD123的细胞的直接或间接活性为特征的病症。换句话说，本发明涉及表达包含SEQ ID NO44的80％至100％的抗CD123CAR的T细胞，用作药物来治疗与表达CD123的细胞的有害活性相关的病症，特别是治疗选自AML、AML亚型、AML相关并发症、和AML相关病症的病症的用途。

在另一个方面中，本发明依靠用于治疗需要其的患者的方法，所述方法包括至少一种以下步骤：

(a)提供通过先前描述的任何一种方法可获得的免疫细胞；

(b)将所述转化的免疫细胞给予所述患者，

在一种实施方式中，本发明所述的T细胞可以经历强健的体内T细胞扩增并且可以持续延长的时间。

所述治疗可以是减轻、治疗或预防性的。其可以是自体免疫治疗的一部分或异基因免疫治疗的一部分。自体的是指，用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞的群体是源自所述患者或源自人白细胞抗原(HLA)相容的供体。异基因的是指，用于治疗患者的细胞或细胞的群体不是源自所述患者而是源自供体。

在前面部分中描述了可以以公开的方法使用的细胞。所述治疗可以用来治疗确诊的患者，其中恶化前或恶性肿瘤病症的特征为表达CD123的细胞，特别是过量的表达CD123的细胞。这样的病症发现在血液癌中，如白血病或恶性淋巴增殖性疾病中。淋巴增生性疾病可以是淋巴瘤，具体地多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。

可以治疗的癌症可以包括非实体瘤(如血液肿瘤，包括但不限于前B ALL(儿科指征)、成年ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤等。用本发明的CAR来治疗的癌症的类型包括但不限于白血病或淋巴系统恶性肿瘤。还包括成年肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。

在一种实施方式中，本发明提供了用于治疗表达CD123的细胞介导的疾病，特别是表达CD123的细胞介导的血液癌的组合物，所述组合物包含本发明所述的表达抗CD123CAR的T细胞，优选地所述抗CD123CAR具有SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44。

用本发明的表达抗CD123CAR的细胞可以改善本文公开的任何其它CD123介导或涉及CD123的恶性淋巴增殖性疾病。

在优选的实施方式中，利用本发明的表达抗CD123CAR的细胞可以治疗的癌症是白血病、与白血病相关的疾病或它们的并发症。

使用本发明的表达抗CD123CAR的细胞可以治疗的白血病可以是急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病、脊髓发育不良综合征、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、和脊髓发育不良综合征。

使用本发明的表达抗CD123CAR的细胞可以治疗的AML或AML亚型可以具体地是急性成髓细胞白血病、最小分化的急性成髓细胞白血病、没有成熟的急性成髓细胞白血病、具有粒细胞成熟的急性成髓细胞白血病、前髓细胞或急性前髓细胞白血病(APL)、急性骨髓单核细胞白血病、骨髓单核细胞以及骨髓嗜伊红细胞增多、急性成单核细胞白血病(M5a)或急性单核细胞白血病(M5b)、急性红细胞系白血病，包括红白血病(M6a)和非常稀有的纯红细胞系白血病(M6b)、急性成巨核细胞白血病、急性嗜碱细胞白血病、带有骨髓纤维化的急性全骨髓增生，不论是否包括CD123阳性细胞。

AML的亚型还包括多毛细胞白血病、费城染色体阳性的急性成淋巴细胞白血病。

AML可被分类为具有特定基因异常的AML。分类是基于核型预测对诱导治疗的响应、复发风险、存活的能力。

因此，使用本发明的表达抗CD123CAR的细胞可以治疗的AML可以是在8号染色体和21号染色体之间具有易位的AML、在16号染色体中具有易位或倒位的AML、在9号染色体和11号染色体之间具有易位的AML、在15号染色体和17号染色体之间具有易位的APL(M3)、在6号染色体和9号染色体之间具有易位的AML、在3号染色体中具有易位或倒位的AML、在1号染色体和22号染色体之间具有易位的AML(成巨核细胞的)。

本发明特别可用于治疗与这些特定的细胞遗传学标记相关的AML。

本发明还提供了表达抗CD123CAR的T细胞，用于治疗具有AML的特定的细胞遗传学亚型的患者，如使用全反式视黄酸(ATRA)16-19确定的具有t(15；17)(q22；q21)的患者，以及用于治疗使用重复剂量的高剂量阿糖胞苷确定的具有t(8；21)(q22；q22)或inv(16)(p13q22)/t(16；16)(p13；q22)的患者。

优选地，本发明提供了表达抗CD123CAR的T细胞，用于治疗具有畸变(aberration)，如-5/del(5q)、-7、3q的异常、或复合核型(complex karyotype)的，已经显示出具有较低的完全缓解率和存活率的患者。

患者组

在优选的实施方式中，本发明提供了治疗在60岁以上的患者中或在小于20岁的患者中的AML。

在更优选的实施方式中，本发明提供了儿科治疗，具体地针对AML、或AML相关疾病或并发症的儿科治疗。

在又一种优选实施方式中，本发明用作在具有低、差的或不利的状态，也就是说具有小于5年存活率的预测存活的AML患者中的治疗。在此组中，患有具有以下细胞遗传学特征：-5；5q；-7；7q-；11q23；non t(9；11)；inv(3)；t(3；3)；t(6；9)；t(9；22)的AML的患者与风险较差的状态相关(Byrd J.C.et al.,December 15,2002；Blood:100(13)并且特别考虑根据本发明或用本发明的一个目的治疗。

在一种实施方式中，本发明的表达抗CD123CAR的T细胞可以用作诱导治疗、作为AML的缓解后治疗或作为在具有AML的患者中的巩固治疗。优选地，表达至少一种SEQ IDNO.1+SEQ ID NO.44的抗CD123CAR的细胞用作AML的缓解后治疗或用作具有AML的患者中的巩固治疗。

在一种实施方式中，在AML复发的情况下，或在难治性或耐药AML的情况下，可以使用本发明的表达抗CD123CAR的T细胞。优选地，在具有AML复发、或具有难治性或耐药AML的患者中，使用本发明的包含至少一种SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44的抗CD123CAR的细胞，更优选地，与至少一种其它抗癌药物结合。

在另一种优选实施方式中，表达至少一种SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44的抗CD123CAR的细胞用于防止特别是在抗癌治疗以后、在骨髓去除期间或在骨髓移植以前、在骨髓破坏以后发生的癌细胞发育。

AML并发症

在一种具体实施方式中，本发明提供了改善患者，具体地经历与AML相关的并发症的患者的健康状况的药物。更优选地，本发明的所述表达工程化的抗CD123CAR的T细胞表达至少一种SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44的抗CD123CAR并且用作药物用于治疗与AML相关的并发症。

与AML相关的并发症或疾病可以包括脊髓发育不良前期(precedingmyelodysplasia phase)、继发性白血病(secondary leukemia)，尤其是继发性AML(secondary AML)、高白血细胞计数、和缺乏Auer杆(Auer rod)。在其他之中，白细胞淤滞(leukostasis)和中枢神经系统(CNS)的混乱(involvement of the central nervoussystem)、白细胞过多、残留疾病也被认为是与AML相关的并发症或疾病。

AML相关疾病

在一种实施方式中，本发明还提供了表达抗CD123CAR的T细胞，用于治疗与AML相关的病理状态。优选地，本发明提供了表达至少一种SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44的抗CD123CAR的细胞，用于治疗与AML相关的病理状态。本发明提供对于与AML相关的髓性肿瘤、急性骨髓性白血病和脊髓发育不良综合征的治疗、复发或难治性急性骨髓性白血病的治疗、在成人中复发性或难治性急性前髓细胞白血病的治疗、急性前髓细胞白血病的治疗、在60岁以上的成人中急性骨髓性白血病的治疗。

根据另一个方面，本发明提供了用于治疗AML相关疾病，特别是与AML相关的恶性血液病的组合物。

与AML病症相关的恶性血液病包括脊髓发育不良综合征(MDS，以前被称为“白血病前期”)，其是由髓样血细胞的无效生产(或发育不良(dysplasia))和转化到AM的风险所统一的血液学病症的各种集合。

在另一种实施方式中，本发明提供了改善多发性骨髓瘤患者的健康状况的药物。

通过本发明的适当利用可以改善与AML的风险相关的其它病理状态或遗传性综合征，所述遗传性综合征包括唐氏综合征、染色体三倍体症(trisomy)、范可尼贫血、布卢姆综合征、毛细血管扩张性共济失调、Diamond-Blackfan贫血、Schwachman-Diamond综合征、Li-Fraumeni综合征、1型神经纤维瘤病、严重先天性中性白细胞减少(还被称为格斯特曼综合征)。

其它CD123介导的病理状态

根据另一个方面，本发明提供了用于治疗CD123+细胞介导的疾病的组合物。这些CD123+细胞介导的疾病包括炎症、自身免疫病。

具体地，本发明可以用于治疗CD123+细胞介导的疾病如胃肠道粘膜的炎症，以及更特别地，炎性肠病、鼻变态反应、皮肤的炎症如青少年型皮肌炎、血液型皮肤病(hematodermia)。

本发明可以用作药物来治疗CD123+细胞介导的疾病如自身免疫病，尤其是菊池病。

优选地，本发明提供了用于复发性感染，包括起因于病毒如EB病毒、单纯疱疹病毒，尤其是致癌病毒、HHV-8、HHV-6、HTLV或HIV的感染，寄生虫感染如起因于镰状疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、或三日疟原虫的感染的治疗。

尤其是，本发明提供了对于EB病毒淋巴结炎、单纯疱疹病毒淋巴结炎的治疗。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗系统性红斑狼疮淋巴结炎、肺结核、囊性纤维化、肝炎、胆道闭锁，特别是在儿童中的病毒诱导的肝炎或胆道闭锁、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化的组合物。

包含根据本发明的工程化T细胞的组合物用作药物和方法。

本发明还提供了组合物用于治疗疾病的用途或方法。在一个方面中，该疾病是血液癌，特别是干细胞癌，包括但不限于白血病(如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病和脊髓发育不良综合征)和恶性淋巴增殖病症，包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)、或它们的并发症。

本发明还提供了组合物用于在患者中抑制增殖或减少表达CD123的细胞群体或活性的用途或方法。一种示例性的方法包括使包含表达CD123的细胞的细胞群体与本发明的结合至表达CD123的细胞的CD 123CAR T细胞接触。

在更具体的方面中，本发明提供了组合物用于在患者中抑制增殖或减少表达CD123的癌细胞的群体的用途或方法，该方法包括使表达CD123的癌细胞群体与本发明的结合至表达CD123的细胞的CD 123CAR T细胞接触，本发明的CD 123CAR T细胞与表达CD123的癌细胞结合，从而导致表达CD123的癌细胞的破坏。

在某些方面中，在患有与表达CD123的细胞相关的骨髓性白血病或另一种癌症的受试者或与表达CD123的细胞相关的骨髓性白血病或另一种癌症的动物模型中，相对于阴性对照，本发明的CD 123CAR T细胞减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％(至不可检测的水平)的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分数。

本发明还提供了组合物用于防止、治疗和/或管理与表达CD123的细胞(例如，与血液癌相关)相关的疾病或病症的用途或方法，该方法包括给予需要的受试者本发明的结合至表达CD123的细胞的CD 123CAR T细胞。在一个方面中，受试者是人。与表达CD123的细胞相关的疾病的非限制性实例包括自身免疫性疾病(如狼疮)、炎症性疾病(如变态反应、IBD、和哮喘)和癌症(如血癌，尤其是AML或AML并发症)。

本发明还提供了组合物用于防止、治疗和/或管理与表达CD123的细胞相关的疾病的用途或方法，该方法包括给予需要的受试者本发明的结合至表达CD123的细胞的CD123CAR T细胞。在一个方面中，受试者是人。与表达CD123的细胞相关的疾病的非限制性实例包括急性骨髓性白血病(AML)、脊髓发育不良、B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、多毛细胞白血病、母细胞型浆细胞样树突状细胞肿瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)、慢性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤。

本发明提供了组合物用于治疗或防止与表达CD123的细胞相关的癌症的复发的用途或方法，该方法包括给予需要其的受试者本发明的结合至表达CD 123的细胞的CD123CAR T细胞。在另一个方面中，该方法包括，与有效量的另一种治疗结合，给予需要其的受试者有效量的本发明的结合至表达CD123的细胞的CD 123CAR T细胞。

在一个方面中，CD 123被认为是AML中的“癌干细胞”标记。因此，本发明的CD123CAR T细胞可以预防AML的复发，或甚至治疗主要是CD123阴性的但具有CD 123+细胞(表达CD123的细胞)的“干”群体的AML。

在一个方面中，本发明提供了用于治疗经历针对与升高的表达水平的CD 19相关的疾病或病症的治疗，并且展现出与升高水平的CD123相关的疾病或病症的受试者的组合物和方法。

在一个方面中，B细胞急性淋巴性白血病(ALL)是需要使用CAR T细胞的系列治疗的疾病的一个实例。例如，用抗CD 19CAR的T细胞治疗有时可能会导致CD19阴性复发，其可以用本发明的抗CD123CAR T细胞来治疗。可替换地，本发明包括使用包含抗CD 19CAR和抗CD 123CAR的CAR T细胞来双重靶向B-ALL。

用根据本发明的工程化免疫细胞的治疗可以结合一种或多种针对癌症的治疗，其选自抗体治疗、化疗、细胞因子治疗、树突状细胞治疗、基因治疗、激素治疗、激光治疗和辐射治疗的组。

优选地，用根据本发明的工程化免疫细胞的治疗可以结合(例如，以前，同时或以后)选自以下的一种或多种针对癌症的治疗来给予：阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、足叶乙苷、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式维甲酸、三氧化二砷、反式维甲酸的组合、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、以及它们的组合。

根据本发明优选的实施方式，可以将所述治疗给予经历免疫抑制治疗的患者。实际上，本发明优选依靠由于使编码上述免疫抑制剂的受体的基因失活，已经使其耐受至少一种免疫抑制剂的细胞或细胞的群体。在此方面，免疫抑制治疗应该有助于在患者内根据本发明的T细胞的选择和扩增。

可以以任何方便的方式来给予根据本发明的细胞或细胞群体，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以在皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴管内注射、或腹腔内将在本文中描述的组合物给予患者。在一种实施方式中，优选通过静脉内注射来给予本发明的细胞组合物。

细胞或细胞群体的给予可以由以下构成：给予10⁴-10⁹个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括在这些范围内细胞数目的所有整数值。可以以一次或多次给药来给予细胞或细胞群体。在另一种实施方式中，作为单次给药来给予所述有效量的细胞。在另一种实施方式中将所述有效量的细胞作为一次以上的给药在一段时间内给予。给予时间在主治医师判断内并且取决于患者的临床状况。细胞或细胞群体可以获得自任何来源，如血库或供体。虽然个体需求各不相同，但针对特定疾病或病症的有效量的给定细胞类型的最佳范围的确定在本领域的技术内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康状态和体重、同时治疗(如果有的话)的种类、治疗的频率以及所希望效果的特性。

在另一种实施方式中，胃肠道外给予所述有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。所述给予可以是静脉内给予。可以通过在肿瘤内的注射来直接进行所述给予。

在本发明的某些实施方式中，连同(例如，以前、同时或以后)任何数目的相关治疗方式一起来将细胞给予患者，该相关治疗方式包括但不限于用药剂的治疗如抗病毒治疗、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(还被称为ARA-C)或用于MS患者的那他珠单抗治疗或用于银屑病患者的依法珠单抗治疗或用于PML患者的其它治疗。在进一步的实施方式中，可以与化疗、辐射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯、和FK506、抗体、或其它免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子、和辐射结合来使用本发明的T细胞。这些药物抑制钙依赖磷酸酶、钙调磷酸酶(环孢素和FK506)，或抑制对于生长因子诱导信号(雷帕霉素)重要的p70S6激酶(Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993)。在进一步的实施方式中，将本发明的细胞组合物连同(例如，以前、同时或以后)骨髓移植，使用化疗剂如氟达拉滨、外部射束辐射治疗(XRT)、环磷酰胺、或抗体如OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法一起给予患者。在另一种实施方式中，在B细胞消融疗法如与CD20反应的药剂(例如Rituxan)之后给予本发明的细胞组合物。例如，在一种实施方式中，受试者可以经历使用高剂量化疗随后外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方式中，在移植以后，受试者接收本发明的扩展免疫细胞的输注。在一种另外的实施方式中，在手术以前或以后，给予扩展细胞。

在本发明的某些实施方式中，连同(例如，以前、同时或以后)药物一起将表达抗CD123CAR的细胞给予患者，该药物选自阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、安吖啶、柔红霉素、伊达比星、诺消灵、米托蒽醌、足叶乙苷、依托泊苷(VP16)、三氧化二砷、反式维甲酸、氮芥、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、以及它们的组合。在这些实施方式中，表达抗CD123CAR的细胞可以耐受连同表达抗CD123CAR的细胞一起给予的特定药物或药物的组合。

在本发明的其它实施方式中，将表达抗CD123CAR的细胞连同选自阿糖胞苷、蒽环类、6-硫鸟嘌呤、羟基脲、泼尼松、以及它们的组合的药物一起给予患者。

其它定义

-除非另有规定，“一个”、“一种”、“该”、以及“至少一种”可互换使用并且是指一个或一个以上。的本文中，依据单字母代码来指定在多肽序列中的氨基酸残基，其中，例如，Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，以及D表示Asp或天冬氨酸残基。

-氨基酸取代是指用另一个氨基酸残基替代一个氨基酸残基，例如，用在肽序列中的谷氨酰胺残基替代精氨酸残基是一种氨基酸取代。

-核苷酸被指定如下：单字母代码用于指定核苷的碱基；a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，以及g是鸟嘌呤。对于兼并核苷酸，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y代表t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，以及n代表g、a、t或c。

-如在本文中所使用的，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段、以及通过任何连接、切割、核酸内切酶作用、和核酸外切酶作用所产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)、或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)、或两者的组合的单体组成。修饰核苷酸可以具有在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中的变更。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺、和叠氮基团来替代一个或多个羟基，或糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子上类似的结构，如氮杂糖和碳环糖类似物替换。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它众所周知的杂环取代物。可以通过磷酸二酯键或上述键的类似物来连接核酸单体。核酸可以是单链或双链。

-嵌合抗原受体(CAR)是指将针对在靶细胞上存在的组分的结合结构域，例如对所希望的抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性，与活化T细胞受体的胞内结构域结合，以产生展现出特异性抗靶细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。通常，CAR由融合到T细胞抗原受体复合体ζ链的胞内信号结构域的胞外单链抗体(scFv Fc)(scFv Fc:ζ)组成，并且当在T细胞中表达时，具有基于单克隆抗体的特异性来重新定向抗原识别的能力。在本发明中使用的CAR的一个实例是针对CD123抗原的CAR并且，作为非限制性实例，可以包含氨基酸序列：SEQ ID NO:23至48。

-术语“核酸内切酶”是指任何能够催化在DNA或RNA分子，优选DNA分子内核酸之间的键的水解(切割)的野生型或变体的酶。核酸内切酶不切割与其序列无关的DNA或RNA分子，但识别和切割在特定的多核苷酸序列处的DNA或RNA分子(进一步称为“靶序列”或“靶位点”)。当通常具有长度为大于12个碱基对(bp)，更优选14-55bp的多核苷酸识别位点时，核酸内切酶可以分类为稀切核酸内切酶。通过诱导在限定基因座处的DNA双链断裂(DSB)，稀切核酸内切酶显著增加HR(Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin et al.1995；Pingoud and Silva 2007)。稀切核酸内切酶可以例如是归巢内切核酸酶(homing endonuclease)(Paques and Duchateau 2007)，来自工程化的锌指域与限制酶如FokI的催化结构域的融合(Porteus and Carroll 2005)的嵌合锌指核酸酶(ZFN)，来自CRISPR系统的Cas9核酸内切酶(Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013)，或化学核酸内切酶(Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006)。在化学核酸内切酶中，将化学或肽切割剂结合于核酸的聚合物或结合于识别特定靶序列的另一种DNA，从而将切割活性靶向至特定序列。化学核酸内切酶还包括合成核酸酶如邻菲咯啉、DNA切割分子、和形成三重物的寡核苷酸(TFO)的结合物，其已知结合特定的DNA序列(Kalish and Glazer2005)。根据本发明，这样的化学核酸内切酶包含在术语“核酸内切酶”中。

-“TALE核酸酶”(TALEN)意指由通常源自转录活化因子样效应子(TALE)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的融合蛋白，以切割核酸靶序列。催化结构域优选是核酸酶结构域以及更优选具有核酸内切酶活性的结构域，如例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在具体实施方式中，可以将TALE结构域融合到大范围核酸酶如例如I-CreI和I-OnuI或它们的功能变体。在更优选的实施方式中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE核酸酶是不需要用于特异性识别和切割的二聚化，如工程化的TAL重复序列与在WO2012138927中描述的I-TevI的催化结构域的融合的TALE核酸酶。转录活化因子样效应子(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属的蛋白质，其包含多个重复序列，每个重复序列在位置12和13处包含对于核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异的二残基(RVD)。具有类似的模块化碱基-碱基核酸结合特性(modular base-per-base nucleic acid binding property)的结合结构域(MBBBD)还可以源自最近由本申请人在不同的细菌物种中发现的新模块蛋白。新的模块蛋白具有显示比TAL重复序列更大的序列变异性的优势。优选地，与不同的核苷酸的识别相关的RVD是用于识别C的HD，用于识别T的NG，用于识别A的NI，用于识别G或A的NN，用于识别A、C、G或T的NS，用于识别T的HG，用于识别T的IG，用于识别G的NK，用于识别C的HA，用于识别C的ND，用于识别C的HI，用于识别G的HN，用于识别G的NA，用于识别G或A的SN，以及用于识别T的YG，用于识别A的TL，用于识别A或G的VT，以及用于识别A的SW。在另一种实施方式中，关键的氨基酸12和13可以向其它氨基酸残基突变以调节它们对核苷酸A、T、C和G的特异性，并且特别是以增强这种特异性。TALE核酸酶已被描述和用来刺激基因靶向和基因修饰(Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.2011)。工程化TAL核酸酶是在商品名TALEN^TM下可商购的(Cellectis,8rue dela Croix Jarry,75013Paris,France)。

根据本发明的稀切核酸内切酶还可以是Cas9核酸内切酶。最近已经开发了基于来自II型原核生物CRISPR(成簇规律间隔短回文重复(Clustered Regularly InterspacedShort palindromic Repeat))适应性免疫系统(参见(Sorek,Lawrence et al.2013))的RNA引导的Cas9核酸酶(Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013)的新的基因组工程化工具。CRISPR相关(Cas)系统是在细菌中被首先发现并且起针对外源病毒或质粒的DNA的防御作用。通过选择经常侧翼有短序列基序(被称为原间隔相邻基序(PAM))的靶序列，首先进行CRISPR介导基因组工程化。在靶序列选择以后，工程化与此靶序列互补的特异性crRNA。在CRISPR II型系统中需要的反式活化crRNA(tracrRNA)于crRNA配对并结合于提供的Cas9蛋白。Cas9作用为分子锚，促使tracRNA与cRNA的碱基配对(Deltcheva,Chylinski et al.2011)。在这种三元复合体中，二元tracrRNA:crRNA结构作用为指导RNA，将核酸内切酶Cas9引导到关联靶序列。通过扫描在靶序列和crRNA之间的靶序列的同源性来引发Cas9-tracrRNA:crRNA复合体的靶识别。除靶序列-crRNA互补性之外，DNA靶向需要存在与前间区序列(protospacer)相邻的短基序(前间区序列相邻基序，PAM)。在双重RNA和靶序列之间配对以后，Cas9随后在PAM基序的上游引入钝性双链断裂3个碱基(Garneau,Dupuis et al.2010)。

稀切核酸内切酶可以是归巢核酸内切酶，还称为大范围核酸酶。这样的归巢核酸内切酶是本领域中众所周知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并产生单或双链断裂。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别长度为12至45碱基对(bp)范围内，通常长度为14至40bp范围内的DNA靶位点。根据本发明的归巢内切核酸酶可以例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶，对应于HNH核酸内切酶，或对应于GIY-YIG核酸内切酶。根据本发明的优选的归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。

-“递送载体(delivery vector)”或“递送载体(delivery vectors)”是指任何可以在本发明中用来进行细胞接触(即“接触”)或在细胞或亚细胞区宝内递送(即“引入”)在本发明中需要的试剂/化学品和分子(蛋白质或核酸)的递送载体。它包括但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、脂质复合体、多聚物复合体、树枝状聚合物、微泡(超声造影剂)、纳米颗粒、乳剂或其它适当的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学品、大分子(基因，蛋白质)、或其它载体如由Diatos开发的质粒、肽。在这些情况下，递送载体是分子载体。“递送载体(delivery vector)”或“递送载体(delivery vectors)”还意指进行转染的递送方法。

-术语“载体(vector)”或“载体(vectors)”是指能够运送其所连接的另一种核酸的核酸分子。在本发明中的“载体”包括但不限于病毒载体、质粒、可以由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成的RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子。优选的载体是能够自主复制(附加型载体(episomal vector))和/或表达它们所连接的核酸(表达载体)的那些载体。大量的适宜载体是本领域技术人员已知的并且是可商购的。

病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)、正链RNA病毒如微小RNA病毒和α病毒、以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、EB病毒、巨细胞病毒)、以及痘苗病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺瓦克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽类白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:Theviruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。

-“慢病毒载体”是指基于HIV的慢病毒载体，其因为它们的相对较大的包装容量、降低的免疫原性以及它们以高效率稳定转导大范围的不同的细胞类型的能力，对于基因递送是非常有前途的。通常在三种(包装、包膜和转移)或更多种质粒瞬时转染进入生产细胞以后产生慢病毒载体。和HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与在细胞表面上的受体的相互作用进入靶细胞。在进入以后，病毒RNA经历由病毒逆转录酶复合体所介导的反转录。反转录的产物是双链线性病毒DNA，其是用于感染细胞的DNA中的病毒整合的底物。“整合慢病毒载体(或LV)”是指，作为非限制性实例，能够整合靶细胞的基因组的载体。相反，“非整合慢病毒载体(或NILV)”是指不通过病毒整合酶的作用来整合靶细胞的基因组的有效的基因递送载体。

-递送载体(vector)和载体(vectors)可以与任何细胞渗透技术如超声穿孔或电穿孔或这些技术的衍生技术关联或结合。

-细胞(cell)或细胞(cells)是指由用于体外培养这些生物体衍生的任何真核活细胞、原代细胞和细胞系。

“原代细胞(primary cell)”或“原代细胞(primary cells)”意指直接获得自活组织(即活检材料)和为体外生长建立的细胞，其经历很少的群体倍增，并且因此相比于连续致瘤或人工永生化的细胞系，更代表它们所源自的组织的主要功能成分和特性。

作为非限制性实例，细胞系可以选自由CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞；U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞组成的组。

可以通过本发明的方法来修饰所有这些细胞系以提供细胞系模型，以产生、表达、量化、检测、研究感兴趣的基因或蛋白质；这些模型还可以用来在研究和生产中以及各个领域如，作为非限制性实例，化学、生物燃料、治疗剂和农学中筛选感兴趣的生物活性分子。

-“突变”是指在多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中最高达一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、二十、二十五、三十、四十、五十、或更多个核苷酸/氨基酸的取代、缺失、插入。突变可以影响基因的编码序列或它的调节序列。其还可能会影响基因组序列的结构或编码mRNA的结构/稳定性。

-“变体”意指通过在母体分子的氨基酸序列中突变或替代至少一个残基所获得的重复变体、变体、DNA结合变体、TALE核酸酶变体、多肽变体。

-“功能变体”意指蛋白质或蛋白质结构域的催化活性突变体；相比于它的母体蛋白或蛋白质结构域或另外的性能，这种突变体可以具有同样的活性、或较高或较低的活性。

-“一致性”是指在两种核酸分子或多肽之间的序列一致性。可以通过比较为比较目的而对齐的每个序列中位置来确定一致性。当比较的序列中的位置被相同碱基占据时，那么在该位置处分子是相同的。在核酸或氨基酸序列之间相似性或一致性的程度是在由核酸序列共享的位置处相同或匹配核苷酸的数目的函数。可使用各种比对算法和/或程序来计算两个序列之间的一致性，包括可获得为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的一部分，并且可以以例如默认设置使用的FASTA或BLAST。例如，设想了与在本文中描述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性并且优选展现出基本上相同的功能的多肽，以及编码上述多肽的多核苷酸。

-“相似性”描述在两个或更多个多肽的氨基酸序列之间的关系。使用相似性矩阵如BLOSUM45、BLOSUM62或BLOSUM80，BLASTP还可以用来确定与参照氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％的序列相似性的氨基酸序列。除非另有说明，相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分数相似性是基于BLASTP阳性得分并且百分数序列一致性基于BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”显示在一致的高得分序列对中的总残基的数目和分数，并且BLASTP“正数”显示比对得分具有正值并且彼此相似的残基的数目和分数。本发明设想和涵盖相对于本文公开的氨基酸序列具有这些程度的一致性或相似性或任何中间程度的一致性或相似性的氨基酸序列。使用遗传密码来推导并且可以通过常规方式获得类似多肽的多核苷酸序列。例如，pTα的功能变体可以与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％的序列相似性。使用遗传密码通过反向翻译其氨基酸序列，将会产生编码这样的功能变体的多核苷酸。

-“信号转导结构域”或“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的分子，其特异性地结合在T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除通过例如，TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合所提供的原始信号之外的信号，其介导T细胞反应，包括但不限于增殖活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及特异性地与B7-H3结合的配体。共刺激配体还尤其包括特异性地与呈现在T细胞上的共刺激分子，如但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地与CD83结合的配体结合的抗体。

“共刺激分子”是指在T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地与共刺激配体结合，从而介导细胞的共刺激响应，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I型分子、BTLA和Toll配体受体。

如在本文中所使用的，“共刺激信号”是指与原始信号结合，如TCR/CD3连接导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

如在本文中所使用的术语“胞外配体结合结构域”被定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地该结构域能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别作用为在与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记物的配体。因此，可以作为配体的细胞表面标记物的实例包括那些细胞表面标记物，其与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫病和癌细胞相关。

如在本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，包括非人灵长类和人类。

术语“复发的”是指其中治疗后已获得癌症缓解的受试者或哺乳动物具有癌细胞的复发的状况。

术语“难治的或抗性的”是指其中受试者或哺乳动物即使在强化治疗以后在其体内仍然具有残留癌细胞的情况。

术语“耐药性”是指当疾病并不响应药物的治疗时的状态。耐药性可以是固有的(或原发性抗性(primary resistance))，其意味着疾病从来没有响应药物，或其可以是获得的，意味着疾病停止响应该疾病曾经响应的药物(继发性抗性(secondaryresistance))。在某些实施方式中，耐药性是固有的。在某些实施方式中，耐药性是获得的。

术语“恶性血液病(hematologic malignancy)”或“血液癌(hematologiccancer)”是指身体的血液-骨髓和/或淋巴组织的癌症。恶性血液病的实例包括，例如，脊髓发育不良、白血病、淋巴瘤，如皮肤淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病(还被称为霍奇金淋巴瘤)、和骨髓瘤，如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性前髓细胞白血病(APL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜中性粒细胞白血病(CNL)、急性未分化白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞白血病(PML)、少年髓细胞单核细胞白血病(JMML)、成体T细胞ALL、具有三谱系脊髓发育不良的AML(AML/TMDS)、混合谱系白血病(MLL)、脊髓发育不良综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、和多发性骨髓瘤(MM)。

术语“白血病”是指造血组织的恶性肿瘤，包括但不限于慢性淋巴细胞白血病或慢性淋巴性白血病、慢性髓细胞白血病、或慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病或急性髓性白血病(AML)以及急性成髓细胞白血病。

本发明的上述书面说明提供了制造和使用它的方式和过程，使得在本领域中的任何技术人员能够制造和使用它，该实现是特别提供用于所附权利要求(其构成原始描述的一部分)的主题。

在本文中陈述数值极限或范围的情况下，包括端点。此外，具体包括在数值极限或范围内的所有值和子范围，如同明确地写出。

提供以上的描述以使得本领域技术人员能够制造和使用本发明，并且在特殊应用及其要求的情况下加以提供。对于本领域技术人员而言，对于优选的实施方式的各种改进将是显而易见的，以及本文中所定义的通用原则可应用于其它实施方式和应用，而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明并非旨在被限定于所描述的实施方式，而是被赋予与本文公开的原理和特征一致的最宽范围。

已经一般地描述了本发明，可以通过参照某些具体实施例来获得进一步理解，其中本文提供的实施例仅是为了说明的目的，而并不意在限制性的(除非另有规定)。

一般方法

原代T细胞培养

使用菲可梯度密度培养基(Ficoll gradient density medium)将T细胞纯化自由EFS(Etablissement

du Sang,Paris,France)提供的白细胞层(Buffy coat)样品。回收PBMC层并使用可商购的T细胞富集试剂盒来纯化T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2、5％人、和Dynabeads人T活化子CD3/CD28的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中，在1:1的珠：细胞比率(Life Technologies)下，活化纯化的T细胞。

CAR mRNA转染

在T细胞纯化和活化以后的第4天或第11天进行转染。用15μg的编码不同的CAR构建物的mRNA来转染5百万个细胞。使用T7mRNA聚合酶转染(使用细胞脉冲技术完成转染)，通过在0.4cm空隙的比色杯中在200μl的最终体积的“细胞穿孔缓冲液T”(BTX HarvardApparatus)中施加3000V/cm下的两个0.1mS脉冲，接着325V/cm下的四个0.2mS脉冲，来产生CAR mRNA。将细胞立即稀释在X-Vivo^TM-15培养基中并37℃和5％CO₂下温育。在电穿孔以后两小时以20ng/mL添加IL-2。

脱粒试验(CD107a移动)

连同等量的表达各种水平的CD123蛋白的细胞一起，在96孔板(40,000个细胞/孔)中温育T细胞。在37℃和5％CO₂下，将共培养物保持在最终体积为100μl的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中6小时。通过在共培养开始时，连同1μg/ml的抗CD49d、1μg/ml的抗CD28、和1x莫能菌素(Monensin)溶液一起添加荧光抗CD107a抗体，在细胞刺激期间进行CD107a染色。在6小时温育期以后，用可固定的活性染料和荧光染料结合的抗CD8来染色细胞，并通过流式细胞术分析。脱粒活性被确定为CD8+/CD107a+细胞的％，并且通过在CD8+细胞中确定CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)。在mRNA转染以后24小时进行脱粒试验。

IFNγ释放试验

连同表达各种水平的CD123蛋白的细胞系一起，在96孔板(40,000个细胞/孔)中温育T细胞。在37℃和5％CO₂下，将共培养物保持在最终体积为100μl的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中24小时。在此温育期以后，在1500rpm下离心该孔板5分钟，然后在新孔板中回收上清液。通过ELISA试验，在细胞培养上清液中进行IFNγ检测。通过在mRNA转染以后24小时开始细胞共培养来进行IFNγ释放试验。

细胞毒性试验

连同在相同孔中的10,000个靶细胞(表达CD123)和10,000个对照(CD123阴性)细胞一起，在96孔板(100,000个细胞/孔)中温育T细胞。在将它们与CAR+T细胞共培养以前，用荧光细胞内染料(CFSE或Cell Trace Violet)来标记靶和对照细胞。在37℃和5％CO₂下温育共培养物4小时。在此温育期以后，用可固定的活性染料来标记细胞，并且通过流式细胞术分析。确定每个细胞群体(靶细胞或CD123阴性对照细胞)的活力并计算特异性细胞溶解的％。在mRNA转染以后48小时进行细胞毒性试验。

T细胞转导

在T细胞纯化/活化以后三天，用表达CAR的重组慢病毒载体进行T细胞的转导。使用包含人CD123蛋白的胞外结构域的融合，连同鼠IgG1Fc片段一起的重组蛋白，进行在T细胞的表面上的CAR检测。用靶向蛋白质的小鼠Fc部分的荧光染料结合的第二抗体来检测此蛋白与CAR分子的结合，然后通过流式细胞术分析。

抗肿瘤小鼠模型

用(CD123表达_MOLM13-荧光素酶细胞静脉内(iv)注射免疫缺陷NOG小鼠作为AML异种移植小鼠模型。可选地，小鼠接收抗癌治疗。然后用不同剂量的待测试的CAR+T细胞，或用没有用CAR慢病毒载体转导的T细胞，iv注射小鼠(在注射肿瘤细胞系以后的2天或7天)。在T细胞注射的当天(D0)，在T细胞注射以后的第7、14、21、28和40天确定生物发光信号，以在不同的动物中跟踪肿瘤进展。

实施例

实施例1：表达CD123-CAR的TCRα失活细胞的增殖

设计和生产靶向由在T细胞受体α恒定链区(TRAC)基因内的15-bp间隔区所分开的两个17-bp长序列(所谓的半靶)的异源二聚体TALE核酸酶。通过在表10中列出的半TALE核酸酶的重复序列来识别每个半靶。

表10：靶向TCRα基因的TAL核酸酶

在哺乳动物表达载体中，在T7启动子的控制下，使用限制酶消化来亚克隆每个TALE核酸酶构建体。编码切割TRAC基因组序列的TALE核酸酶的mRNA合成自携带T7启动子下游的编码序列的质粒。

用编码两个半TRAC_T01TALE核酸酶的2种mRNA各自转染在72小时期间用抗CD3/CD28涂覆的珠预先活化的纯化的T细胞。转染后48小时，用编码先前描述的CD-123CAR(SEQID NO:23至48)之一的慢病毒载体来分别转导来自相同供体的不同组的T细胞。转导后2天，使用抗CD3磁珠来纯化CD3阴性细胞，并且转导后5天用可溶性抗CD28(5μg/ml)来再活化细胞。

在再活化以后，通过2次/周计数细胞来跟踪细胞增殖最长达30天。相比于未转导的细胞，特别是当用抗CD28来再活化时，观测到在表达CD-123CAR的TCRα失活细胞中增加的增殖。

为了研究表达CD123-CAR的人T细胞是否表现出活化状态，转导后7天，通过FAC分析了活化标记CD25的表达。试验用编码CD-123CAR的慢病毒载体转导的纯化的细胞在它们的表面上的CD25表达，以相比未转导细胞来评估它们的活化。在CD28再活化或没有再活化的条件下，均预期增加的CD25表达。

实施例2：

使用各种抗CD123抗体片段构建CD123CAR

原代T细胞培养

使用菲可梯度密度培养基(Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare LifeSciences)，将T细胞纯化自由EFS(Etablissement

du Sang,Paris,France)提供的白细胞层样品。回收PBMC层并使用可商购的T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来纯化T细胞。在补充有20ng/mL人IL-2(Miltenyi Biotech)、5％人血清(SeraLaboratories)、和Dynabeads人T活化子CD3/CD28在珠：细胞比率1:1下(LifeTechnologies)的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中活化纯化的T细胞。在活化以后，在补充有20ng/mL人IL-2(Miltenyi Biotec)和5％人血清(Sera Laboratories)的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中生长和保持细胞。

CAR mRNA转染

在T细胞纯化和活化以后的第4天或第11天进行转染。用15μg的编码不同的CAR构建体的mRNA来转染5百万个细胞。使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒(Life Technologies)来产生CAR mRNA，然后使用RNeasy Mini Spin Columns(Qiagen)纯化。通过在0.4cm空隙的比色杯中，在200μl的最终体积的“细胞穿孔缓冲液T”(BTX Harvard Apparatus)中施加3000V/cm下的两个0.1mS脉冲，随后325V/cm下的四个0.2mS脉冲，使用细胞脉冲技术进行转染。将细胞立即稀释在X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中并37℃和5％CO₂在下温育。在电穿孔以后2小时，以20ng/mL添加IL-2(来自Miltenyi Biotec)。

脱粒试验(CD107a移动)

连同等量的表达或不表达CD123蛋白的细胞一起，在96孔板(40,000个细胞/孔)中温育T细胞。在37℃和5％CO₂下，将共培养物保持在100μl的最终体积的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中6小时。通过在共培养开始时，连同1μg/ml的抗CD49d(BD Pharmingen)、1μg/ml的抗CD28(Miltenyi Biotec)、和1x莫能菌素溶液(eBioscience)一起添加荧光抗CD107a抗体(APC结合的，来自Miltenyi Biotec)，在细胞刺激期间进行CD107a染色。在6小时温育期以后，用可固定的活性染料(eFluor 780，来自eBioscience)和荧光染料结合的抗CD8(PE结合的，Miltenyi Biotec)来染色细胞，然后通过流式细胞术分析。将脱粒活性确定为CD8+/CD107a+细胞的％，并且通过在CD8+细胞中确定CD107a染色的平均荧光强度信号(MFI)。在mRNA转染以后24小时进行脱粒试验。

IFNγ释放试验

连同表达或不表达CD123蛋白的细胞系一起，在96孔板(40,000个细胞/孔)中温育T细胞。在37℃和5％CO₂下，将共培养物保持在100μl的最终体积的X-Vivo^TM-15培养基(Lonza)中24小时。在此温育期以后，在1500rpm下离心孔板5分钟并在新孔板中回收上清液。通过ELISA试验(人IFN-γQuantikine ELISA试剂盒，来自R&D Systems)，在细胞培养上清液中进行IFNγ检测。通过在mRNA转染以后24小时开始细胞共培养来进行IFNγ释放试验。

细胞毒性试验

连同在相同孔中10,000个靶细胞(表达CD123)和10,000个对照(CD123阴性)细胞一起，在96孔板(100,000个细胞/孔)中温育T细胞。在与CAR+T细胞共培养以前，用荧光细胞内染料(CFSE或Cell Trace Violet，来自Life Technologies)来标记靶细胞和对照细胞。在37℃和5％CO₂下温育共培养物4小时。在此温育期以后，用可固定的活性染料(eFluor780，来自eBioscience)来标记细胞，然后通过流式细胞术分析。确定每个细胞群体(靶细胞或CD123阴性对照细胞)的活力并计算特异性细胞溶解的％。在mRNA转染以后48小时进行细胞毒性试验。

结果

将来自7G3、32716、Klon 43 12F1、26292、和Old4的6种不同的scFv用于生成嵌合抗原受体(CAR)以及用来筛选它们的对CD123+细胞的脱粒活性。

设计了不同结构(图2和图3)并且当在人T细胞中瞬时表达时确定了它们的活性(图5、图6、图7和图8)。

将T细胞纯化自白细胞层样品并使用CD3/CD28珠活化。在活化以后4天，用编码不同的CAR分子的mRNA来转染细胞(利用PulseAgile电穿孔)并在转染以后24小时评估脱粒活性。

在图4和在图5中所示的结果示出了在CAR+T细胞与表达CD123的细胞(RPMI8226)、或与不表达CD123的细胞(K562)共培养6小时时，6种不同的scFv对于一种单一结构(v3：CD8铰链/CD8跨膜)的脱粒活性。白色条对应于在单独培养的T细胞中观测到的脱粒信号，黑色条表示当用RPMI8226细胞来共培养T细胞时观测到的信号，并且灰色条表明用K562细胞共培养的T细胞的脱粒信号。

图4示出在CAR+T细胞与表达CD123的细胞(RPMI8226)、或与不表达CD123的细胞(K562)共培养6小时时，6种不同的scFv对于一种单一结构((v3：CD8-铰链/CD8-跨膜)的脱粒以百分数(％)计脱粒活性。

图5示出在与CD123阴性细胞(K562)或表达高或低水平的CD123的细胞(分别为RPMI8226和KG1a)共培养6小时以后，以CAR T细胞的平均荧光活性(MFI)计脱粒活性(CD107a+细胞)。结果代表三次独立实验的平均值。

出乎意料地，结果表明，虽然7G3是展现出强亲和性(affinity)和亲和力(avidity)以及体内效力的抗CD123抗体(Jin et al.,2009；Cell Stem Cell 5,31–42)，但源自7G3的CD123CAR T细胞在目前的实验设置中并不是活性的。

与对照–模拟物(mock))相比，表达26292-、32716-、和Klon43-CAR的细胞呈现强活性，其中表达Klon43CAR的细胞是最具活性的。

感兴趣的是，然而表达26292CAR的细胞和表达32716CAR的细胞对于不表达CD123的细胞(K562)是稍微活性的(灰色条)，Klon43对于不表达CD123的细胞的活性可以比较于模拟T细胞。

在如示于图2的产生的CAR分子中，选择它们的8种用于进一步的活性测试(图6、图7和图8)。

使用源自Klon43、12F1、32716、和26292的抗CD123scFv抗体片段的CD123CAR的构建以及功能分析

为此，将T细胞分离自白细胞层样品并利用CD3/CD28珠活化。在活化以后的第11天，用编码不同候选物的mRNA来瞬时转染细胞。通过测量它们在与表达或不表达CD123的细胞共培养时的脱粒能力、IFNγ释放、和细胞毒性活性来评估CAR活性。

图6示出在与CD123阴性细胞(K562)或表达高或低水平的CD123的细胞(分别为RPMI8226和KG1a)共培养6小时以后CAR T细胞的脱粒活性(CD107a+细胞)。在CAR mRNA电穿孔以后24小时开始共培养。结果代表三次独立实验的平均值。

图7示出当与表达不同水平的CD123的细胞(KG1a或RPMI8226)，或与不表达CD123的细胞(K562)共培养24小时时，由T细胞释放的IFNγ的量。还示出，在共培养的相同的条件下，由单独培养的T细胞释放的IFNγ。对三个独立的供体进行实验，并且这里示出来自代表性供体的结果。

图8示出CAR-T细胞的特异性细胞溶解活性。在CAR mRNA转染以后48小时进行试验。将T细胞与K562+KG1a或K562+RPMI8226细胞共培养4小时。在共培养的结束时确定每种细胞系的细胞活力并计算特异性细胞溶解百分数。

所有结构是活性的，其中当与不同于CARS的对照相比时，Klon 43V3CAR和32716V3CAR呈现更高的活性。

T细胞转导

在T细胞纯化/活化以后三天，用表达CAR的重组慢病毒载体来进行T细胞的转导。通过在HEK-293细胞中基因组和辅助质粒的转染，由Vectalys SA(Toulouse,France)生产慢病毒载体。使用10⁶个细胞/转导，以5的感染复数(multiplicity of infection)进行转导。使用包含人CD123蛋白的胞外域的融合的重组蛋白连同鼠IgG1Fc片段(由LakePharma生产)，进行在T细胞的表面上的CAR检测。用靶向蛋白质的小鼠Fc部分的PE-结合的第二抗体(Jackson Immunoresearch)来检测此蛋白与CAR分子的结合，并通过流式细胞术分析。

然后选择两种CAR候选物，即CAR Klon 43V3和CAR 32716V3，并克隆入慢病毒载体，其中CAR表达通过2A肽连接到BFP，并由EF1a启动子驱动。慢病毒载体的示意图示于图9 上图。将T细胞分离自白细胞层样品，用CD3/CD28珠活化，并且在活化以后3天，用慢病毒载体以5的MOI转导。

使用其中人CD123蛋白的胞外域融合到小鼠IgG1衍生的Fc片段的融合蛋白来进行CAR检测。用抗Fc PE-结合的抗体来检测在细胞表面上的CAR与融合蛋白的CD123部分的结合，并且通过流式细胞术分析。图9表示，在转导后第8或10天，两种不同供体的CAR+或蓝色荧光蛋白(BFP+)细胞的％(通过FACS分析测量)。

在转导以后的第10和12天之间进行活性测试。

图10表示针对转导细胞的不同的细胞系的脱粒活性。Daudi和K562细胞不表达CD123，而KG1a、MOLM13和RPMI8226则表达不同水平的CD123(KG1a<MOLM13<RPMI8226)。在上图中示出三种独立的供体的CD107a+细胞的％(在CD8+细胞中)，并且在下图中示出代表性供体的CD107a染色的强度。NTD表示未转导细胞。

再一次，数据显示，源自Klon 43V3的表达抗CD123CAR的细胞的活性(脱粒，图10，或CD123+细胞的溶解，图11)等同于32716V3的活性(图10和图11)。

最出乎意料地，表达源自32716V3的CAR的细胞展现出比表达源自Klon 43V3的CAR的细胞更强的背景活性(针对不表达CD123、DAUDI和K562的细胞的活性)(图10和图11)。

表达源自Klon 43V3的CAR的细胞比表达源自32716V3的CAR的细胞具有更特异性的活性以及略微但显著更高的活性(图10、图11和图12)，特别是对于表达更高水平的CD123的RPMI8226细胞(见图13和图14)。

图11示出CAR T细胞与不同的细胞系共培养24小时后的IFNγ释放。

图12示出CAR-T细胞的特异性细胞溶解活性。T细胞与Daudi+KG1a、Daudi+MOLM13、或Daudi+RPMI8226细胞共培养4小时。在共培养的结束时确定每种细胞系的细胞活力并计算特异性细胞溶解百分数。结果代表在至少两个独立的供体中获得的结果。

结果表明，在所有活性测试中，在稳定表达CAR的T细胞中Klon43-v3显示比32716-v3稍微更高的活性。此外，当单独或在不表达CD123的细胞的存在下培养表达32716-v3CAR的T细胞时，在脱粒和IFNγ释放试验中观测到背景活性。在表达Klon43-v3CAR的T细胞中没有观测到这种情况。由于这些原因，选择Klon43-v3CAR以在小鼠模型中进行抗肿瘤体内实验。

图13和图14示出每种使用的CAR的剂量响应脱粒活性。用不同剂量的CD123-Fc蛋白涂覆96孔板(其用于CAR+T细胞的检测，见图5中的图例)，并且在荧光CD107a抗体的存在下在此孔板中培养细胞6小时。结果显示脱粒活性(分别为CD8+细胞中CD107a+细胞的％(图13)和CD107信号的强度(图14))。

实施例3抗肿瘤小鼠模型

用MOLM13-荧光素酶细胞静脉内(iv)注射免疫缺陷的雌性NOG小鼠作为AML异种移植小鼠模型。6-8周龄的NOG(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicTac)小鼠获得自Taconic(Ry,Danemark)。为了建立MOLM13-Luc细胞系，用编码GFP和萤火虫荧光素酶的慢病毒(amsbio LVP438-PBS)来转导MOLM13细胞(DSMZ ACC554)。用新霉素选择GFP阳性细胞(ref10131-027,Gibco,Life Technologies,Saint-Aubin,France)。供参考，MOLM13细胞系建立自在初始脊髓发育不良综合征(MDS，难治性贫血，具有过量的胚细胞，RAEB)以后，在1995年复发时患有急性骨髓性白血病AML FAB M5a的20岁男人的外周血。

然后用不同剂量的CAR+T细胞(Klon43-v3CAR)、或用没有用CAR慢病毒载体转导的T细胞iv注射小鼠(在注射肿瘤细胞系以后的2天或7天)。在T细胞注射的当天(D0)或在T细胞注射以后的第7、14、21、28和40天确定生物发光信号，以跟踪在不同的动物中的肿瘤进展。

根据关于实验室动物的护理和使用的法国和欧洲法规和NRC指南，由Oncodesign(Dijon,France；http://www.oncodesign.com/)进行动物收容和实验程序。

结果

图15示出表达Klon43-v3CAR的T细胞的体内活性。

在注射未转导人T细胞前的2天或7天用MOLM13-荧光素酶细胞，或用不同剂量的抗CD123CAR+T细胞注射免疫缺陷的小鼠。结果表示在T细胞注射以后在不同时间点观测到的生物发光信号(在每个组中，除了G12，平均4只小鼠，其中在21天和28天之间4只小鼠中的1只小鼠死亡)。

数据显示，本发明的目的可以针对CD123+癌细胞来使用，用于治疗CD123+癌人白血病细胞。

7G3-1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.23)

7G3-2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.24)

7G3-3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.25)

7G3-4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.26)

7G3-5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.27)

7G3-6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.28)

Old4-3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.29)

26292-1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.30)

26292-2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.31)

26292-3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.32)

26292-4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.33)

26292-5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.34)

26292-6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.35)

32716-1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.36)

32716-2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.37)

32716-3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.38)

32716-4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.39)

32716-5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.40)

32716-6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.41)

Klo43-1(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.42)

Klo43-2(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.43)

Klo43-3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.44)

Klo43-4(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.45)

Klo43-5(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.46)

Klo43-6(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.47)

12F1-3(SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.48)

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Claims

1.一种CD123特异性嵌合抗原受体，具有选自以下(i)和(ii)的多肽结构：(i)由以下构成的多肽结构：含有来自单克隆抗CD123抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的胞外配体结合结构域、结合所述VH和VL的柔性接头、FcγRIIIα、CD8α或IgG1铰链、CD8α跨膜结构域、包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域的胞质结构域，其中所述VH包含SEQID NO. 67、68和69的CDR序列且所述VL包含SEQ ID NO. 70、71和72的CDR序列；以及(ii)由以下构成的多肽结构：信号肽、含有来自单克隆抗CD123抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的胞外配体结合结构域、结合所述VH和VL的柔性接头、FcγRIIIα、CD8α或IgG1铰链、CD8α跨膜结构域、包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域的胞质结构域，其中所述VH包含SEQ ID NO. 67、68和69的CDR序列且所述VL包含SEQ ID NO. 70、71和72的CDR序列。

2.根据权利要求1所述的CD123特异性嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体分别具有SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 44或SEQ ID NO. 46的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的CD123特异性嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体具有SEQID NO. 44的氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的CD123特异性嵌合抗原受体，其中，所述胞外配体结合结构域VH和VL是人源化的。

5.根据权利要求1或2所述的CD123特异性嵌合抗原受体，其中，所述VH具有选自以下序列的多肽序列：

（变体VH1：SEQ ID NO.60）：

（变体VH2：SEQ ID NO.61）：

（变体VH3：SEQ ID NO.62）：

（变体VH4：SEQ ID NO.63）：

（变体VH5：SEQ ID NO.64）：

（变体VH6：SEQ ID NO.65）：

（变体VH7：SEQ ID NO.66）；

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS；

且所述VL具有选自以下序列的多肽序列：

（变体VL1：SEQ ID NO.54）：

（变体VL2：SEQ ID NO.55）：

（变体VL3：SEQ ID NO.56）：

（变体VL4：SEQ ID NO.57）：

（变体VL5：SEQ ID NO.58）：

（变体VL6：SEQ ID NO.59）：

6.根据权利要求1或2所述的CD123特异性嵌合抗原受体，其中，所述VH和VL分别具有SEQ ID NO. 19和20的氨基酸序列。

7.一种编码根据权利要求1至6中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体的多核苷酸。

8.一种包含权利要求7所述的多核苷酸的表达载体。

9.一种在细胞表面膜处表达根据权利要求1至6中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。

10.根据权利要求9所述的工程化免疫细胞，源自可选地耐抗癌药物的T淋巴细胞，并且在编码αTCR或βTCR的基因中带有缺失。

11.根据权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中，在所述工程化免疫细胞中抑制TCR的表达。

12.根据权利要求9所述的工程化细胞，其中，在所述免疫细胞中，抑制至少一种MHC蛋白的表达。

13.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中，所述至少一种MHC蛋白是β2m或HLA。

14.根据权利要求9所述的工程化细胞，其中，使所述细胞突变以赋予对至少一种免疫抑制药物、化疗药物、或抗癌药物的耐受性。

15.根据权利要求9所述的工程化细胞在制备用于治疗特征在于过表达CD123的细胞的恶化前或恶性癌病症的药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其中，接受所述治疗的患者是人类。

17.根据权利要求15所述的应用，其中，所述恶性癌病症是血液癌病症。

18.根据权利要求17所述的应用，其中，所述血液癌病症是白血病或恶性淋巴增殖性疾病。

19.根据权利要求18所述的应用，其中，所述白血病选自由急性髓性白血病、慢性髓性白血病、脊髓发育不良综合征、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、和脊髓发育不良综合征组成的组。

20.根据权利要求18所述的应用，其中，所述白血病是急性髓性白血病（AML）。

21.根据权利要求18所述的应用，其中，所述血液癌是恶性淋巴增殖性疾病。

22.根据权利要求21所述的应用，其中，所述恶性淋巴增殖性疾病是淋巴瘤。

23.根据权利要求22所述的应用，其中，所述淋巴瘤选自由多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤和大细胞滤泡性淋巴瘤组成的组。

24.一种工程化免疫细胞的方法，包括：

(a) 提供免疫细胞，

(b) 在所述细胞的表面表达根据权利要求1至6中任一项所述的至少一种CD123特异性嵌合抗原受体。

25.根据权利要求24所述的工程化免疫细胞的方法，包括：

(a) 提供免疫细胞，

(b) 将编码所述CD123特异性嵌合抗原受体的至少一种多核苷酸引入所述细胞，

(c) 在所述细胞中表达所述多核苷酸。

26.根据权利要求24所述的工程化免疫细胞的方法，包括：

(a) 提供免疫细胞，

(c) 引入对CD123不具有特异性的至少一种其它嵌合抗原受体。