ES2740903T3

ES2740903T3 - Receptores antigénicos quiméricos específicos de CD123 para inmunoterapia del cáncer

Info

Publication number: ES2740903T3
Application number: ES15712105T
Authority: ES
Inventors: Roman Galetto
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: US20210163612A1; AU2015233461B2; TR201910814T4; RU2727290C2; EP3569619A1; WO2015140268A1; EP3119807B1; RU2016140855A; US10988541B2; EP3119807A1; JP6942217B2; IL247172B; KR20170002389A; IL247172A0; US11919961B2; AU2015233461A1; DK3119807T3; JP6689202B2; CN106103490B; DK3569619T3

Abstract

Un receptor antigénico quimérico (CAR) específico de CD123, que tiene una estructura polipeptídica que comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal anti-CD123, una bisagra de FcyRIIIα, CD8α o IgG1, un dominio transmembrana CD8α, y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 ζ y un dominio coestimulador de 4-1BB, en donde dicha VH comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 67, 68 y 69 y dicha VL comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores antigénicos quiméricos específicos de CD123 para inmunoterapia del cáncer

La presente invención se refiere a receptores antígenos quiméricos (CAR, por sus siglas en inglés Chimeric Antigen Receptors) que son proteínas quiméricas recombinantes capaces de redirigir la especificidad y reactividad de las células inmunitarias hacia antígenos de membrana seleccionados, y más particularmente, en los que el dominio de unión a ligando extracelular es un scFV procedente de un anticuerpo monoclonal CD123, que confiere inmunidad específica contra células positivas para CD123. La cadena alfa del receptor de interleucina 3 (CD123) se ha identificado como que se sobreexpresa frecuentemente en células tumorales de leucemia, especialmente en el caso de leucemia mieloide aguda (LMA), en comparación con células madre hematopoyéticas normales. Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética dotadas de los CAR según la invención, muestran mayor eficacia en cuanto al tratamiento de linfomas y de leucemia.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de linfocitos T específicos de antígeno autólogos generados ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones víricas y cáncer. Los linfocitos T utilizados para inmunoterapia adoptiva pueden generarse mediante expansión de linfocitos T específicos de antígeno o redireccionamiento de linfocitos T mediante modificación por ingeniería genética (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de linfocitos T específicos de antígeno vírico es un procedimiento bien establecido utilizado para el tratamiento de infecciones víricas asociadas a trasplante y tumores malignos relacionados con virus poco frecuentes. De manera similar, se ha mostrado que el aislamiento y la transferencia de linfocitos T específicos de tumor tienen éxito en el tratamiento de melanoma.

A través de la transferencia genética de receptores de linfocitos T transgénicos o receptores antigénicos quiméricos (CAR), en los linfocitos T se han generado con éxito nuevas especificidades (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sintéticos que constan de una porción de direccionamiento que está asociada a uno o más dominios de señalización en una sola molécula de fusión. En general, la porción de unión de un CAR consta de un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal interconectados por un enlazador flexible. También se han utilizado con éxito porciones de unión basadas en dominios de receptores o ligandos. Los dominios de señalización de los CAR de primera generación proceden de la región citoplasmática del dominio de señalización CD3zeta o de las cadenas gamma de receptores de Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de linfocitos T, sin embargo, no consiguen proporcionar expansión prolongada y actividad antitumoral in vivo. Para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de linfocitos T modificados con CAR, se han añadido dominios de señalización de moléculas coestimuladoras, incluyendo CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137), solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación). Los CAR han permitido que los linfocitos T se redirijan con éxito contra antígenos expresados en la superficie de linfocitos Tumorales de diversos tumores malignos incluyendo linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010).

Por el momento, los tratamientos de inducción para la leucemia mieloide aguda (LMA) han permanecido mayoritariamente sin cambios durante casi 50 años y la LMA sigue siendo una enfermedad de mal pronóstico. La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad caracterizada por la rápida proliferación de células mieloides inmaduras en la médula ósea lo que produce hematopoyesis disfuncional. Aunque la quimioterapia de inducción estándar puede inducir remisiones completas, muchos pacientes finalmente recaen y sucumben a la enfermedad, demandando el desarrollo de nuevas terapias para la LMA.

Avances recientes en la inmunofenotipificación de células de LMA, han revelado que varios antígenos de la superficie celular asociados a la LMA pueden actuar como dianas para futuras terapias. La cadena alfa del receptor de interleucina 3 (IL-3Ra; CD123 - Referencia del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica): NP_OO 1254642) ha sido identificada como una posible diana inmunoterapéutica ya que se sobreexpresa en células tumorales de LMA en comparación con células madre hematopoyéticas normales. Adicionalmente, se llevaron a cabo dos ensayos clínicos en fase I para terapias específicas de CD123, presentando ambos fármacos buenos perfiles de seguridad (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 y NCT00397579). Por desgracia, estos fármacos dirigidos a CD123 tenían una eficacia limitada, lo que sugiere que, para observar actividad antileucémica, se requieren alternativas y terapias más fuertes y específicas dirigidas a CD123.

Una terapia alternativa posiblemente más fuerte para el tratamiento de la leucemia, sería el uso de linfocitos T que expresen receptores antigénicos quiméricos (CAR) que redirigen la especificidad de los linfocitos T hacia antígenos asociados a tumores (AAT) de la superficie celular de una manera independiente del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, siglas del inglés major histocompatibility complex). Varios grupos han desarrollado CAR dirigidos a varios antígenos para el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B. Sin embargo, sigue habiendo escasos linfocitos T modificados por ingeniería genética con CAR para el tratamiento de la LMA.

El documento WO 2012/079000 describe receptores antigénicos quiméricos anti-CD19.

S. Gill et al. en Preclinical targeting of human acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells", Blood, vol. 123, no. 15, 2014, páginas 2343-2354, describen construcciones de receptores antigénicos quiméricos que se dirigen a CD123 que comprenden un scFV del clon 32716 o del clon 26292.

En particular, aún existe la necesidad de mejorar construcciones de los CAR que muestren una mejor compatibilidad con la proliferación de linfocitos T, para permitir que las células que expresan dichos CAR alcancen una ventaja clínica significativa.

Además, existe la necesidad de mejorar los CAR específicos de CD123 que tengan la capacidad de proliferar y de dirigirse selectivamente a células que expresan CD123.

Adicionalmente, el uso de dichos linfocitos T inmunitarios que expresan CAR que se dirigen a CD123 en combinación con agentes quimioterapéuticos citotóxicos como tratamiento habitualmente empleado como tratamiento contra el cáncer sigue siendo un problema.

Se han desarrollado diversos agentes citotóxicos, tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, inhibidores de ADN metiltransferasa, compuestos de platino y venenos de huso, para destruir células cancerosas, en particular, células cancerosas que expresan CD123.

Estos agentes quimioterapéuticos pueden ser perjudiciales para el establecimiento de células inmunocompetentes antitumorales robustas debido a su toxicidad inespecífica. Las terapias basadas en moléculas pequeñas dirigidas a las rutas de proliferación celular también pueden obstaculizar el establecimiento de la inmunidad antitumoral.

Por tanto, también existe la necesidad de desarrollar linfocitos T dirigidos a CD123 que sean específicos y compatibles con el uso de fármacos, en particular de quimioterapias contra el cáncer, como las que afectan a la proliferación celular.

Por tanto, para utilizar células terapéuticas alogénicas "listas para usar" junto con la quimioterapia, los inventores desarrollan un método de modificación por ingeniería genética de linfocitos T alogénicos, menos alogénicos y resistentes a agentes quimioterapéuticos. Los beneficios terapéuticos que ofrece esta estrategia deben potenciarse por los efectos sinérgicos entre la quimioterapia y la inmunoterapia. Por otra parte, la resistencia a fármacos también puede beneficiarse de la capacidad de expandir selectivamente los linfocitos T modificados por ingeniería genética para impedir que se produzcan problemas debidos a la transferencia ineficaz de genes a estas células.

Sumario de la invención

Los inventores han generado un CAR específico de CD123 que tiene un diseño diferente y que comprende diferentes scFV procedentes de anticuerpos específicos de CD123. Estos CAR específicos de CD123 se denominan CAR específicos de CD123 o CAR anti-CD123, o CAR 123 o "CAR de la invención" indistintamente.

En particular, los inventores han desarrollado un CAR específico de CD123 que comprende un scFV procedente de Klon43 con diferentes arquitecturas e identificaron construcciones de CAR altamente específicas y muy selectivas que se unen a células que expresan CD123 y que destruyen selectivamente células cancerosas que expresan CD123.

Tras la activación inespecífica in vitro (por ejemplo, con perlas revestidas con anti CD3/CD28 e IL2 recombinante), los linfocitos T de donantes se han transformado con polinucleótidos que expresan estos CAR utilizando transducción vírica. En determinados casos, adicionalmente, los linfocitos T se modificaron por ingeniería genética para crear linfocitos T no alorreactivos, más especialmente por la alteración de un componente de TCR (receptores ap de linfocitos T) para impedir la reacción de injerto contra hospedador.

Adicionalmente, los linfocitos T se modificaron por ingeniería genética para crear linfocitos T resistentes a fármacos contra el cáncer, para su uso en combinación con dichos fármacos clásicos contra el cáncer.

Los linfocitos T modificados por ingeniería genética resultantes mostraron reactividad in vitro contra células positivas para CD123 a varias extensiones, lo que demuestra que los CAR de la presente invención contribuyen a la activación dependiente de antígeno, y también a la proliferación, de los linfocitos T, haciéndolos útiles para la inmunoterapia.

Los linfocitos T modificados por ingeniería genética resultantes mostraron reactividad in vivo contra células positivas para CD123 y redujeron significativamente el número de células cancerosas in vivo.

Los linfocitos T modificados por ingeniería genética de la invención están diseñados para mostrar reactividad in vivo contra células positivas para CD123, pueden utilizarse en simultáneo con fármacos contra el cáncer, y se toleran bien. En una realización particular, los linfocitos T modificados por ingeniería genética según la invención siguen siendo eficaces incluso después de varias administraciones, haciéndolos útiles para la inmunoterapia como primer tratamiento (inducción), como tratamiento de consolidación, como tratamiento en combinación con quimioterapia clásica contra el cáncer. En la presente memoria descriptiva se detallan secuencias de polipéptidos y de polinucleótidos que codifican los CAR de la presente invención.

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética de la presente invención son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas tales como para tratamientos de linfoma de linfocitos B o de leucemia.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la invención. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética en esta figura es un linfocito T transducido con un polipéptido retrovírico que codifica un CAR. Adicionalmente, este linfocito T se modificada por ingeniería genética para permitir una mejor injertación, y más segura, en el paciente, que es opcional dentro del marco de la presente invención. El gen X puede ser, por ejemplo, un gen que exprese un componente del TCR (TCRalfa o TCRbeta), Y puede ser un gen implicado en la sensibilidad de linfocitos T a fármacos inmunosupresores como CD52 (con respecto a Campath) o HPRT (con respecto a 6-tioguanina).

Figura 2: Representación esquemática de las diferentes arquitecturas (VI a V6) de los CAR de la invención (CAR 123)

Figura 3: Muestra las diferentes arquitecturas del CAR según la invención, cada una de las cuales difiere en la región de bisagra utilizada.

Figura 4: muestra la actividad de desgranulación en porcentaje (%) de la desgranulación de los 6 scFv diferentes para una sola arquitectura (v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana), cuando los linfocitos T CAR+ se cultivaron conjuntamente durante 6 horas con células que expresaban CD123 (RPM18226), o con células que no expresaban CD123 (K562). Las barras blancas corresponden a señales de desgranulación observadas en linfocitos T que se cultivaron solos, las barras negras representan las señales observadas cuando los linfocitos T se cultivaron conjuntamente con células RPMI8226, y las barras grises muestran señales de desgranulación de linfocitos T cultivados conjuntamente con células K562.

La figura 5: muestra la actividad de desgranulación (linfocitos CD107a+) en intensidad de fluorescencia media (IFM) de linfocitos T CAR después de 6 h de cultivo conjunto con linfocitos CD123neg (K562) o con linfocitos que expresan niveles altos o bajos de CD123 (RPMI8226 y KG1a, respectivamente).

La figura 6: muestra el porcentaje (%) de desgranulación, de diversos linfocitos T CAR anti-CD123 cuando se cultivan conjuntamente durante 6 h con células que expresan diferentes niveles de CD123 (KG1a o RPMI8226), o con células que no expresan CD123 (K562).

Figura 7: muestra la cantidad de IFN gamma (IFNy) liberada por varios linfocitos T CAR anti-CD123 cuando se cultivan conjuntamente durante 24 h con células que expresan diferentes niveles de CD123 (KG1a o RPMI8226), o con células que no expresan CD123 (K562).

Figura 8: muestra la actividad citolítica específica de varios linfocitos T CAR anti-CD123. Los ensayos se realizaron 48 h después de la transfección de ARNm de CAR. Los linfocitos T se cultivaron conjuntamente con células K562+KG1a o K562+RPMI8226. Al final del cocultivo, se determinó la viabilidad celular de cada una de las líneas celulares y se calculó un porcentaje específico de lisis celular.

Figura 9: muestra la construcción general utilizada para la transducción de linfocitos T y el porcentaje (%) de linfocitos T que expresan el CAR o la BFP (Blue Fluorescent Protein, proteína fluorescente azul) el Día 8 o 10 después de la transducción de dos donantes diferentes, que se analizó mediante citometría de flujo. Los CAR corresponden a construcciones CAR Klon 43-v3 y CAR 32716-V3.

Figura 10: representa la actividad de desgranulación de linfocitos T que expresan CAR Klon 43-v3 y CAR 32716-V3, contra diferentes líneas celulares (células Daudi y K562 que no expresan CD123, KG1a, MOLM13 y RPMI8226 que expresan niveles crecientes de CDl23 (KG1a<MOLM13<RPMI8226). En el panel superior se da el % de linfocitos CDl07a+ (entre los linfocitos CD8+) de tres donantes independientes y en el panel inferior se muestra la intensidad de la tinción de CD107a de un donante representativo. NTD significa células No Transducidas.

Figura 11: muestra la liberación de IFN gamma después de 24 horas de cultivo conjunto de linfocitos T que expresan CAR Klon 43-v3 y CAR 32716-V3 con diferentes líneas celulares.

Figura 12: muestra la actividad citolítica específica de linfocitos T que expresan CAR Klon 43-v3 y CAR 32716-V3. Se calculó un porcentaje específico de lisis celular. Los resultados representan resultados obtenidos en al menos dos donantes independientes.

Figura 13: muestra una actividad de desgranulación (en porcentaje (%) de desgranulación) de linfocitos T que expresan CAR Klon 43-v3 y CAR 32716-V3.

Figura 14: muestra una actividad de desgranulación (en IFM) de linfocitos T que expresan CAR Klon 43-v3 y CAR 32716-V3.

Figura 15: muestra la actividad in vivo de linfocitos T que expresan el CAR Klon43-v3 en ratones NOG inmunodeficientes. Los ratones recibieron una inyección de células MOLM13-Luciferasa 2 o 7 días antes de la inyección de linfocitos T humanos no transducidos, y con diferentes dosis de linfocitos T CAR+ anti-CD123. Los resultados representan la señal bioluminiscente observada en diferentes puntos de tiempo después de la inyección de linfocitos T (media de 4 ratones en cada grupo, excepto para G12, donde 1 de los 4 ratones murieron entre los días 21 y 28).

Tabla 1: Secuencia de los diferentes com onentes CAR

Tabla 2: Secuencia de los diferentes com onentes CAR

(continuación)

Tabla 3: CAR de estructura V-1

Tabla 4: CAR de estructura V-2

Tabla 5: CAR de estructura V-3

Tabla 6: CAR de estructura V-4

Tabla 7: CAR de estructura V-5

Tabla 8: CAR de estructura V-6

Descripción detallada de la invención

Salvo que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia en los campos de la terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o el ensayo de la presente invención, con métodos y materiales adecuados que se describen en el presente documento. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos, son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique otra cosa.

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las habilidades en la técnica. Dichas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. a Us UBEl , 2000, Wiley y son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, (Sambrook et aI, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente de Estados Unidos No 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1984)]; Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZ^yM^oL^oG^y(J. Abelson y M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, Vols.154 y 155 (Wu et al. eds.) y Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986).

La presente invención proporciona un CAR específico de CD123 que comprende un scFV procedente de Klon43. La presente invención describe un receptor antigénico quimérico específico de CD123 ("CAR 123" o "CAR") que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 y V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal anti-CD123, una bisagra de FcyRIIIa, CD8a o IgG1, un dominio transmembrana CD8a, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización zeta CD3 y un dominio coestimulador de 4-1BB, en donde dicha VH comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 67, 68 y 69 y dicha VL comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico de CD123 (CAR 123) que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 y V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal anti-CD123, una bisagra de FcyRIIIa, CD8a o IgG1, un dominio transmembrana CD8a, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización zeta CD3 y un dominio coestimulador de 4-1BB, en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46, respectivamente, y en donde dicha VH comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 67, 68 y 69 y dicha VL comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico de CD123 (CAR 123) que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 y V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena pesada (VL) de un anticuerpo monoclonal anti-CD123, una bisagra de FcyRIIIa, CD8a o IgG1, un dominio transmembrana CD8a, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización zeta CD3 y un dominio coestimulador de 4-1BB, en donde dicho 123 CAR tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 o SEQ ID NO. 77, respectivamente, y en donde dicha VH comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 67, 68 y 69 y dicha VL comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico (CAR 123) que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente, en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 42.

La presente invención describe un receptor antigénico quimérico específico (CAR 123) que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente, en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 44.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico (CAR 123) que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 46.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico (CAR 123) que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 75.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico (CAR 123) que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 76.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico (CAR 123) que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente en donde dicho CAR 123 tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 77.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico (CAR) específico de CD123, que tiene una estructura polipeptídica V3 como se ilustra en la Figura 2, y se describe anteriormente, comprendiendo dicha estructura un dominio VH y VL de unión a ligando extracelular de un anticuerpo anti-CD123 monoclonal que comprende las siguientes secuencias: - GFTFTDYY (SEQ ID NO: 67),

RSKADGYTT (SEQ ID NO: 68),

ARDAAYYSYYSPEGAMDY (SEQ ID NO: 69), y

QNVDSA (SEQ ID NO: 70),

SAS (SEQ ID NO: 71),

QQYYSTPWT (SEQ ID NO: 72),

- y dicha estructura que comprende:

una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización zeta CD3 y un dominio coestimulador de 4-1BB.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico de CD123 (CAR 123) como se ha indicado anteriormente, donde dicho dominio VH y VL de unión a ligando extracelular está humanizado.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico de CD123 (CAR 123) como se ha indicado anteriormente, donde dicho dominio de unión a ligando extracelular está humanizado.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico de CD123 (CAR 123) como se ha indicado anteriormente, dicho receptor antigénico quimérico específico de CD123 está humanizado.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico específico de CD123 (CAR 123) como se ha indicado anteriormente, donde dichos dominio VH y VL de unión a ligando extracelular de un anticuerpo anti-CD123 monoclonal comprende las siguientes secuencias

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGFTFTDYYXXXXXXXXXXXXXXXXXIRSKADGYTTXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXARDAAYYSYYSPEGAMDYXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 73) y

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQNVDSAXXXXXXXXXXXXXXXXXSASXXXXXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQQYYSJPWIXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 74), respectivamente, donde X es un aminoácido,

que puede ser cualquiera de los aminoácidos, por ejemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, ácido aspártico, ácido glutámico.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico (CAR) específico de CD123 como se describe anteriormente, donde dicho dominio VH y VL de unión a ligando extracelular de un anticuerpo anti-CD123 monoclonal respectivamente comprende al menos una de las siguientes secuencias:

(Variante VH1: SEQ ID NO: 60):

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYM5WVRQ.APGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSA5 VKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, (Variante VH2: SEQID NO: 61):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS VKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, (Variante VH3: SEQ ID NO: 62):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

(Variante VH4: SEQ ID NO: 63):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, (Variante VH5: SEQ ID NO: 64):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, (Variante VH6: SEQ ID NO: 65):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, (Variante VH7: SEQ ID NO: 66):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, (Variante VL1: SEQ ID NO: 54):

MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS RFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

(Variante VL2: SEQ ID NO: 55):

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS RFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

(Variante VL3: SEQ ID NO: 56):

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

(Variante VL4: SEQ ID NO: 57):

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

(Variante VL5: SEQ ID NO: 58):

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, y

(Variante VL6: SEQ ID NO: 59):

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYGQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYQQQYYPPTFGQGTKVEIKR, o una de sus combinaciones.

La presente invención desvela un receptor antigénico quimérico (CAR) específico de CD123 como se describe anteriormente, donde dichos dominio VH y VL de unión a ligando extracelular de un anticuerpo anti-CD123 monoclonal comprende respectivamente al menos una de las siguientes secuencias:

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS VKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS VKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQ.PEDFATYYCQ.QYYSTPWTFGQ.GTKVEIKR,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRYSGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, y MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYGQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYQQQYYPPTFGQGTKVEIKR, o una de sus combinaciones.

De manera ventajosa, la presente invención desvela un receptor antigénico quimérico (CAR) específico de CD123 como se describe anteriormente, donde dichos dominio VH y VL de unión a ligando extracelular de un anticuerpo anti-CD123 monoclonal comprende respectivamente al menos una de las siguientes secuencias:

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS

VKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS

VKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQ.LVESGGGLVQ.PGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSAS

VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQ.LVESGGGLVQ.PGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSAS

VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAAS

VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQ.LVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQ.APGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAAS

VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS,

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAAS VKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, y al menos una de las siguientes secuencias:

MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS

RFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS

RFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRQSGVP

SRFSGSGSGTDFTLTISSLQ.PEDFATYYCQ.QYYSTPWTFGQ.GTKVEIKR,

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYGQSGVP

SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se describe anteriormente, en donde dicha estructura V3 comprende una bisagra CD8 alfa y un dominio transmembrana CD8 alfa.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se describe anteriormente, en donde dicha estructura V3 comprende una bisagra de ^cD8 alfa, un dominio citoplasmático 41BBB y un dominio transmembrana CD8 alfa.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se ha indicado anteriormente, en donde dichos VH y VL tienen una identidad de al menos 80 % con una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se ha indicado anteriormente, en donde dichos VH y VL tienen una identidad de al menos 80 % con un polipéptido de SEQ ID NO: 19 y/o de SEQ ID NO: 20.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se ha indicado anteriormente, que comprende además otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico de CD123.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se ha indicado anteriormente, que adicionalmente comprende un péptido señal, preferentemente de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

La presente invención desvela un CAR específico de CD123 como se ha indicado anteriormente, donde se inserta un enlazador de SEQ ID NO 10 entre VH y VL.

La presente invención desvela un polinucleótido que codifica un receptor antigénico quimérico específico de CD123 según uno cualquiera de los CAR específicos de CD123 descritos anteriormente, comprendiendo dicho polinucleótido adicionalmente un péptido señal, preferentemente de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

La presente invención desvela un vector de expresión que comprende un polinucleótido como se ha indicado anteriormente.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa, en la membrana de la superficie celular, un receptor antigénico quimérico específico de CD123 como se describe anteriormente, preferentemente una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que puede expresar, en la membrana de la superficie celular, un receptor antigénico quimérico específico de CD123 como se describe anteriormente.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se ha indicado anteriormente, procedente de linfocitos T, opcionalmente resistente a un fármaco contra el cáncer y que lleva una deleción en un gen que codifica un TCR alfa o un TCR beta.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se ha indicado anteriormente, en donde se suprime la expresión de TCR.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se ha indicado anteriormente, en donde la expresión de al menos una proteína del MHC, preferentemente p2m o HLA, se suprime en dicha célula inmunitaria modificada por ingeniería genética. p2m representa a la beta 2 microglobulina y HLA al antígeno leucocitario humano (siglas del inglés, human leukocyte antigen). La proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I o de clase II.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se ha indicado anteriormente, donde dicha célula inmunitaria modificada por ingeniería genética se muta para conferir resistencia a al menos un fármaco inmunosupresor, un fármaco quimioterapéutico o un fármaco contra el cáncer.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética como se ha indicado anteriormente para su uso en terapia.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde el paciente es un ser humano.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde la afección es una afección de cáncer pre-maligno o maligno caracterizada por células que expresan CD123.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde la afección es una afección que se caracteriza por una sobreabundancia de células que expresan CD123.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde la afección de cáncer maligno es una afección de cáncer hematológico.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde la afección de cáncer hematológico es leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde la leucemia es leucemia mielógena aguda (LMA).

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, donde dicho cáncer hematológico es un trastorno linfoproliferativo maligno. La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, donde dicho trastorno linfoproliferativo maligno es linfoma.

La presente invención desvela una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia como se ha indicado anteriormente, en donde dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (células pequeñas y células grandes).

La presente invención desvela un método para dañar una célula cancerosa hematológica que comprende poner en contacto dicha célula cancerosa hematológica con una célula modificada por ingeniería genética según la invención, en una cantidad eficaz para causar el deterioro de dicha célula cancerosa.

La presente invención desvela un método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria que comprende:

(a) Proporcionar una célula inmunitaria,

(b) Expresar, en la superficie de dicha célula, al menos un receptor antigénico quimérico específico de CD123 según la invención.

La presente invención desvela un método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria como se ha indicado anteriormente, que comprende:

(a) Proporcionar una célula inmunitaria,

(b) Introducir, en dicha célula, al menos un polinucleótido que codifique dicho receptor antigénico quimérico específico de CD123,

(c) Expresar dicho polinucleótido en dicha célula.

(a) Proporcionar una célula inmunitaria,

(b) Introducir, en dicha célula, al menos un polinucleótido que codifique un receptor antigénico quimérico específico de CD123 de la presente invención,

(c) Introducir al menos otro receptor antigénico quimérico que no sea específico de CD123.

Además, se describe un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite que comprende:

(a) Proporcionar una célula inmunitaria que exprese, en la superficie, un receptor antigénico quimérico específico de CD123 según la invención;

(b) Administrar dichas células inmunitarias a dicho paciente.

Se desvela un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite como se ha indicado anteriormente, en el que dicha célula inmunitaria la proporciona un donante.

Se desvela un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite como se ha indicado anteriormente, en el que dicha célula inmunitaria la proporciona el propio paciente.

Receptores antigénicos quiméricos específicos de CD123

La presente invención se refiere a nuevos diseños del receptor antigénico quimérico (CAR) anti-CD123, que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señalización.

La expresión "dominio de unión a ligando extracelular", como se usa en el presente documento, se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferentemente, el dominio será capaz de interaccionar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede seleccionarse para que reconozca un ligando que actúe como un marcador de superficie celular en células diana asociadas a una patología particular. En una realización preferida, dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (V ^l ) y el fragmento variable pesado (V ^h ) de un anticuerpo monoclonal anti CD-123 específico de antígeno diana interconectados por un enlazador flexible. Preferentemente, dichos V^ly V^hse seleccionan de los anticuerpos mencionados en la bibliografía, tales como 7G3, Old4, 26292, 32716, Klon43 y 12F1 como se indica en las Tablas 1 a 8, más preferentementeOld4, Klon43 y 12F1, e incluso más preferentemente, Klon43. Preferentemente, están unidos entre sí por un enlazador flexible que comprende la secuencia SEQ ID NO:10. En otras palabras, dichos CAR comprenden, preferentemente, un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en de la SEQ ID NO: 11 a la SEQ ID NO: 22 (véase la Tabla 2).

Más preferentemente, dichos CAR comprenden, preferentemente, un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, o 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 14, 19, 20 y de la SEQ ID NO: 21 a la SEQ ID NO: 22 e incluso más preferentemente dichos CAR comprenden, preferentemente, un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99% de identidad con las SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente.

Aún más preferentemente, dichos CAR comprenden un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 22 e incluso más preferentemente dichos CAR comprenden, preferentemente, un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 20. La expresión "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento de anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo expresado por un bacteriófago, un sistema de expresión de levadura o un sistema de expresión de células de mamífero. La expresión también debe interpretarse como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y qué molécula de ADN expresa un anticuerpo o una proteína de un fragmento de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido utilizando tecnología de secuencias de aminoácidos o ADN recombinante o sintética que está disponible y que es muy conocida en la técnica.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "modificaciones de secuencia conservativas" o "humanización" pretenden referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del CAR y/o que no afectan significativamente a la actividad del CAR que contiene la secuencia de aminoácidos modificada y que reducen o anulan una respuesta de anticuerpos humanos antimurinos (HAMA, human anti-mouse antibody). Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos en dicho fragmento de anticuerpo en dicho CAR y/o en cualquier otra parte de dicha molécula CAR. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo, en un fragmento de anticuerpo o en cualquier otra parte de la molécula CAR de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida, mutagénesis mediada por PCR o empleando secuencias de línea germinal optimizadas.

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más restos de aminoácidos dentro de un CAR de la invención pueden reemplazarse por otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el CAR alterado puede someterse a ensayo para determinar la capacidad de unirse a CD 123 utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

El dominio de transducción de señal o dominio de señalización intracelular de un CAR según de la presente invención es responsable de la señalización intracelular después de la unión del dominio de unión a ligando extracelular con la diana dando como resultado la activación de la célula inmunitaria y de la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transducción de señal es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de un linfocito T puede ser una actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas. Por tanto, la expresión "dominio de transducción de señal" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal efectora a señal funcional y dirige la célula para realizar una función especializada.

Los ejemplos preferidos de dominio de transducción de señal para su uso en un CAR pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor y correceptores de linfocitos T que actúan al unísono para iniciar la transducción de señal después de la interacción con el receptor antigénico, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señal comprende dos clases distintas de secuencia de señalización citoplasmática, la que inician la activación primaria dependiente de antígeno y las que actúan de una manera dependiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. La secuencia de señalización citoplasmática primaria puede comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM, por las siglas del inglés Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs). Los ITAM son motivos de señalización bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmática de una diversidad de receptores que actúan como sitios de unión de tirosina cinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM utilizados en la invención pueden incluir, como ejemplos no limitantes, los procedentes de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRépsilon, CD3 gamma, CD3delta, CD3épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realización preferida, el dominio de transducción de señalización del CAR comprende el dominio de señalización CD3zeta que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9.

El dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una molécula señal coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor antigénico o sus ligandos que es necesaria para una respuesta inmunitaria eficaz. "Ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígenos que se une específicamente con una molécula coestimuladora afín en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, a través de la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, actúa como mediadora en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, un ligando coestimulador inducible (ICOS-L), una molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también incluye, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitación, CD27, c D28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83. Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, actuando así como mediadora en una respuesta coestimuladora en la célula, tal como, pero sin limitación, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando de Toll. Los ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares.

En una realización preferida, el dominio de transducción de señal del CAR de la presente invención comprende una parte de molécula señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en el fragmento de 4-1BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1). En particular, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97 % o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8.

Un CAR según la presente invención se expresa en la membrana superficial de la célula. Por tanto, dicho CAR comprende además un dominio transmembrana. Las características distintivas de dominios transmembrana apropiados, comprenden la capacidad para expresarse en la superficie de una célula, preferentemente, en la presente invención, una célula inmunitaria, en particular células linfocíticas o linfocitos citolíticos naturales (NK, Natural Killer), y para interaccionar entre sí para dirigir la respuesta celular de células inmunitarias contra °una célula diana predefinida. El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o sintética. El dominio transmembrana puede proceder de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitantes, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de linfocitos T, tal como a, (3, y o H, un polipéptido que constituye el complejo de CD3, el receptor p55 (cadena a), p75 (cadena p) de IL-2, o cadena y, cadena subunitaria de receptores de Fc, en particular proteínas del receptor de Fcy III o c D. Como alternativa, el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender restos tales como leucina y valina, predominantemente hidrófobos. En una realización preferida, dicho dominio transmembrana del CAR de la presente invención procede de la cadena CD8 alfa humana (por ejemplo, NP_001139345.1). El dominio transmembrana comprende además una región bisagra entre dicho dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. La expresión "región bisagra" utilizada en el presente documento, significa en general cualquier oligo o polipéptido que actúe para unir el dominio transmembrana con el dominio de unión a ligando extracelular. En particular, la región bisagra se utiliza para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad al dominio de unión a ligando extracelular. Una región bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente de 10 a 100 aminoácidos y lo más preferentemente de 25 to 50 aminoácidos. La región bisagra puede proceder de toda o de parte de las moléculas de origen natural, tal como de toda o de parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de toda o de parte de una región constante de anticuerpo. Como alternativa, la región bisagra puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia bisagra de origen natural o puede ser una secuencia bisagra completamente sintética. En una realización preferida, dicho dominio bisagra del CAR de la presente invención comprende una parte de la cadena CD8 alfa humana, del receptor FcYRllla o IgG1, respectivamente, mencionados en esta memoria descriptiva como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:5, o polipéptidos bisagra que presentan, preferentemente, una identidad de secuencia de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 90 %, 95 %, 97 % o 99 % con estos polipéptidos.

Un CAR según la invención, generalmente comprende además un dominio transmembrana (TM), más particularmente seleccionado de CD8a y 4-1BB, que muestra identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 6 o 7.

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende además un dominio TM de CD8a con SEQ ID NO: 6 o que muestra una identidad de secuencia de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 6.

En células cancerosas se observa habitualmente regulación negativa o mutación de antígenos diana, creando variantes de escape de pérdida de antígeno. Por tanto, para compensar el escape tumoral y hacer que las células inmunitarias sean más específicas contra la diana, el CAR específica de CD123 según la invención puede comprender otros dominios de unión a ligando extracelular, para unir simultáneamente diferentes elementos en la diana aumentando de este modo la activación y la función de las células inmunitarias. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelular pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana y opcionalmente pueden separarse por un enlazador. En otra realización, dichos dominios de unión a ligando extracelular diferentes pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR. En otra realización, la presente invención se refiere a una población de CAR que comprenden, cada uno de ellos, diferentes dominios de unión a ligando extracelular. En particular, la presente invención se refiere a un método de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar, en la superficie de dicha célula, una población de CAR que comprenden, cada uno de ellos, diferentes dominios de unión a ligando extracelular. En otra realización particular, la presente invención se refiere a un método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir, en dicha célula, polinucleótidos que codifiquen polipéptidos que componen una población de CAR que comprenden, cada uno de ellos, diferentes dominios de unión a ligando extracelular. Por población de CAR, se entiende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR, que comprenden, cada uno de ellos, diferentes dominios de unión a ligando extracelular. Los diferentes dominios de unión a ligando extracelular según la presente invención, pueden unir simultáneamente de forma preferente diferentes elementos en la diana aumentando de este modo la activación y función de células inmunitarias. La presente invención también se refiere a una célula inmunitaria aislada que comprende una población de CAR que comprenden, cada uno de ellos, diferentes dominios de unión a ligando extracelular.

En una realización preferida, un CAR según la invención, comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 19 y/o un polipéptido de SEQ ID NO: 20, más preferentemente, un CAR según la invención comprende un polipéptido con una identidad de al menos 80%, preferentemente una identidad de 80% a 99% con la SEQ ID NO: 19 y/o un polipéptido que tiene una identidad de 80 a 99% con la SEQ ID NO: 20. Incluso más preferentemente, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene una identidad de 85 a 99 % con un polipéptido de SEQ ID NO: 19 y/o SEQ ID NO: 20.

En una realización más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene las siguientes secuencias:

EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLALIRSKADGYTTEYSASVKGRF TLSRDDSQSILYLQMNALRPEDSATYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO. 19) y MADYKDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQNVDSAVAWYQQKPGQSPKAUYSASYRYSGVPDRFT GRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSTPWTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO. 20).

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende al menos un polipéptido que tiene la siguiente secuencia:

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRF TISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 60 ), En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGR FTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO.61 )

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 62) En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 63) En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 64) En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 65) En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO.

66).

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: MADYKDIVMTQ.SPSSVSASVGDRVTITCRASQ.NVDSAVAWYQ.Q.KPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSG RGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 54)

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia:

MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPSRFSG RGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 55)

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 56)

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRYSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCOOYYSTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 57),

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 58),

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que tiene la siguiente secuencia: MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYGQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO. 59)

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende al menos un polipéptido seleccionado de las siguientes secuencias:

EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRF TISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, EVOLVESGGGLVOPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVROAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGR FTISRDDSKSILYLOMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGOGTLVTVSS, EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS, EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGR FTISRDDSKSIAYLQ.MNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQ.GTLVTVSS and EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGR FTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS

y al menos una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPSRFSG RGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPSRFSG RGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKAUYSASYRYSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRYSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR, MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYRQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQ.PEDFATYYCQ.Q.YYSTPWTFGQ.GTKVEIKR and MADYKDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKLUYSASYGQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR.

En una realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido seleccionado de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, y SEQ ID NO: 66.

En una realización más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido seleccionado de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:59 y un polipéptido seleccionado de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, y SEQ ID NO: 66.

En una realización, un CAR según la invención comprende un polipéptido seleccionado de la lista que consiste en SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 46, preferentemente un CAR que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con un polipéptido de SEQ ID NO: 42, un CAR que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con un polipéptido de SEQ ID NO: 44 y un CAR que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con un polipéptido de SEQ ID NO: 46.

En una realización más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 42.

En otra realización preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 42, aún más preferentemente un CAR que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 42, en particular, un CAR que comprende de 85 % a 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 42. En una realización más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44.

En una realización aún más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 44, aún más preferentemente un CAR que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 44, en particular, un CAR que comprende de 85 % a 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 44.

En una realización más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 46.

En una realización aún más preferida, un CAR según la invención comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 46, aún más preferentemente un CAR que comprende 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 46, en particular, un CAR que comprende de 85 % a 99 % de identidad con SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 46.

En otra realización preferida, un CAR según la invención consta de un polipéptido de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 42, aún más preferentemente un CAR que consiste en 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 42.

En otra realización preferida, un CAR según la invención consta de un polipéptido de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:10 s Eq ID NO: 44 aún más preferentemente un CAR que consiste en 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 44.

En otra realización preferida, un CAR según la invención consta de un polipéptido de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:10 ^sE^qID NO: 46 aún más preferentemente un CAR que consiste en 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 46.

Según la invención, las células inmunitarias que expresan el CAR anti-CD123 de la invención desencadenan una respuesta inmunitaria contra el cáncer. En una realización preferida, las células inmunitarias que expresan el CAR de la invención, dotadas del CAR anti-CD123 de la invención, desencadenan una respuesta inmunitaria que no comprende una respuesta de anticuerpos humanos antimurinos (HAMA).

Según la invención, se puede administrar una cantidad eficaz de la célula inmunitaria modificada por ingeniería genética a un paciente que lo necesite al menos una vez, dos veces, o varias veces, sola o en combinación con otro tratamiento.

Polinucleótidos, vectores:

La presente invención también se refiere a polinucleótidos, a vectores que codifican el CAR descrito anteriormente según la invención.

El polinucleótido puede consistir en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido para la introducción en una célula hospedadora bacteriana, o un vector vírico, tal como un vector de baculovirus para la transfección de una célula hospedadora de insecto, o un plásmido o un vector vírico, tal como un lentivirus para la transfección de una célula hospedadora de mamífero).

En una realización particular, las diferentes secuencias de ácido nucleico pueden incluirse en un polinucleótido o vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de salto ribosómico, tal como una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de Aftovirus de los picornavirus, causa un "salto" ribosómico de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase (Donnelly y Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)). Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena en sentido de una molécula de ADN) que un ribosoma traduce en un resto de aminoácido. Por tanto, a partir de un solo marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm, pueden sintetizarse dos polipéptidos cuando los polipéptidos están separados por una secuencia oligopeptídica 2A que está en marco. Dichos mecanismos de salto ribosómico son muy conocidos en la técnica y se sabe varios vectores los utilizan para la expresión de varias proteínas codificadas por un solo ARN mensajero.

Para dirigir el polipéptido transmembrana a la ruta secretora de una célula hospedadora, en la secuencia de polinucleótidos o secuencia vectorial se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre). La secuencia señal secretora está unida operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos transmembrana, es decir, las dos secuencias están interconectadas en el marco de lectura correcto y se colocan para dirigir el polipéptido recién sintetizado en la ruta secretora de la célula hospedadora. las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en 5' respecto a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden colocarse en otros lugares de la secuencia de ácidos nucleicos de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente de Estados Unidos N° 5 037 743; Holland et al., patente de Estados Unidos N° 5 143 830). En una realización preferida, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 2 o al menos una con 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o 2.

Los expertos en la materia reconocerán que, dada la degeneración del código genético, es posible que entre estas moléculas polinucleotídicas haya una variación de secuencia considerable. Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención están optimizadas con codones para la expresión en células de mamífero, preferentemente para la expresión en células humanas. La optimización con codones se refiere al intercambio de codones en una secuencia de interés que son generalmente raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de dicha especie, codificando dichos codones los aminoácidos como los codones que se están intercambiando.

Células

La célula según la presente invención, se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en el inicio y/o ejecución de la respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. La célula según la presente invención es, preferentemente, un linfocito T obtenido de un donante. Dicho linfocito T según la presente invención, puede proceder de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias, más particularmente, células madre no humanas, células madre de sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre totipotentes no humanas o células madre hematopoyéticas. En una realización preferida, las células son células humanas, en particular células madre humanas.

Las células madre humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica destructora, un mastocito, un linfocito citolítico natural (NK, naturalkiller), un linfocito B o un linfocito T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realización, dicha célula puede proceder del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, a través de una variedad de métodos no limitativos puede obtenerse una fuente de células de un sujeto. Las células pueden obtenerse de diversas fuentes no limitantes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo, y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invención, puede utilizarse cualquier número de líneas de linfocitos T disponibles y conocidas por los expertos en la materia. En otra realización, dicha célula procede, preferentemente, de un donante sano. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan características fenotípicas diferentes.

El aislamiento y la preparación de células madre no requieren la destrucción de al menos un embrión humano. Las células inmunitarias pueden originarse en el paciente, dada la operativa de tratamientos autólogos, o de donantes dada la producción de células alogénicas, que puede utilizarse en tratamientos alogénicos.

Más preferentemente la célula inmunitaria de la invención expresa un CAR anti-CD123 correspondiente a SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46, incluso más preferentemente la célula inmunitaria de la invención expresa un CAR anti-CD123 humanizado correspondiente a S^eQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46 humanizadas. Métodos de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias dotadas de los CAR:

La presente invención incluye el método de preparación de células inmunitarias para inmunoterapia, que comprende introducir ex vivo, en dichas células inmunitarias, los polinucleótidos o vectores que codifican el CAR CD123, como se describió anteriormente en los documentos WO2014/130635, WO2013/176916 y WO2013/176915.

En un ejemplo preferido, dichos polinucleótidos se incluyen en vectores de lentivirus dado que se expresan de manera estable en las células inmunitarias.

Según ejemplos adicionales, dicho método comprende además la etapa de modificar genéticamente dichas células para hacerlas más adecuadas para el trasplante alogénico.

Modificación de linfocitos T inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR).

Según un primer aspecto, la célula inmunitaria puede hacerse menos alogénica, por ejemplo, inactivando al menos un gen que exprese uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR, del inglés T-cell receptor) como se describe en el documento WO 2013/176915, que se puede combinar con la inactivación de un gen que codifica o regula la expresión de la proteína HLA o p2m. En consecuencia, el riesgo de síndrome de injerto contra hospedador y el rechazo del injerto se reducen significativamente.

En consecuencia, cuando las células inmunitarias son linfocitos T, la presente divulgación también proporciona métodos para diseñar linfocitos T que sean menos alogénicos.

Los métodos para hacer que las células sean menos alogénicas pueden comprender la etapa de inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR), en particular genes TCRalpha, TCRbeta. En el documento WO2013/176915 se desvelan métodos para preparar células inmunitarias que expresen CAR, adecuadas para el trasplante alogénico, a través de la inactivación de uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR).

La presente invención incluye una célula inmunitaria que expresa CAR anti-CD123 en la que al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) se ha inactivado. Por tanto, la presente invención proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CD123 donde el CAR procede de Klon 43, que tiene, en particular, una identidad de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 44 y en la que al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivado.

Según la invención, las células inmunitarias CAR anti-CD123 con uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) inactivados, pretenden utilizarse como un medicamento.

Al inactivar un gen TCR se pretende que el gen de interés no se exprese en una forma de proteína funcional. En realizaciones particulares, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para diseñar, de una endonucleasa de corte raro, de tal manera que dicha endonucleasa de corte raro cataliza específicamente la escisión en un gen diana inactivando de ese modo dicho gen diana. Las roturas de la cadena de ácido nucleico causadas por la endonucleasa de corte raro normalmente se reparan a través de los distintos mecanismos de recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ, siglas del inglés nonhomologous end joining). Sin embargo, la NHEJ es un proceso de reparación imperfecto que a menudo da como resultado cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escisión. Los mecanismos implican volver a conectar lo que queda de los dos extremos de ADN a través de religamiento directo (Critchlow y Jackson 1998) o a través de la denominada unión de extremos mediada por microhomología (Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003). La reparación a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) a menudo da como resultado pequeñas inserciones o eliminaciones, y puede utilizarse para la creación de supresiones génicas específicas. Dicha modificación puede ser una sustitución, deleción o adición de al menos un nucleótido. Las células en las que se ha producido un evento de mutagénesis inducida por escisión, es decir, un evento de mutagénesis consecutivo a un evento NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante un método bien conocido en la técnica. En una realización particular, la etapa de inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) en las células de cada muestra individual, comprende introducir en la célula una endonucleasa de corte raro capaz de alterar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR). En una realización más particular, dichas células de cada muestra individual se transforman con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de alterar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR), y dicha endonucleasa de corte raro se expresa en dichas células.

Dicha endonucleasa de corte raro puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa argonauta, una nucleasa TALE o una nucleasa MBBBD. En una realización preferida, dicha endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE. Por nucleasa TALE se entiende una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ADN procedente de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE, siglas del inglés Transcription Activator Like Effector) y en un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al.

2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012). En la presente invención, se han diseñado nuevas nucleasas TALE para dirigir con precisión genes relevantes para estrategias de inmunoterapia adoptiva.

En el documento PCT/EP2014/075317 se describen nucleasas TALE preferidas que reconocen y escinden la secuencia diana. En particular, para aumentar la mutagénesis con el fin de potenciar su capacidad para inactivar genes dirigidos, puede introducirse, además, un dominio catalítico adicional en la célula con dicha endonucleasa de corte raro. Más particularmente, dicho dominio catalítico adicional es una enzima de procesamiento de ADN terminal. Los ejemplos no limitantes de enzimas de procesamiento de ADN terminal incluyen exonucleasas 5-3', exonucleasas 3-5', exonucleasas alcalinas 5-3', endonucleasas colgajo 5', helicasas, fosfatasas, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de molde. Los ejemplos no limitantes de dicho dominio catalítico comprenden un dominio de proteína o un derivado catalíticamente activo del dominio de proteína seleccionado del grupo que consiste en hExol (EXO1_HUMAN), Exol de levadura (EXO1_YEAST), Exol de E. coli, TREX2 de ser humano, TREX1 de ratón, TREX1 de ser humano, TREX1 de bovino, TREX1 de rata, ADN2 humana TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal), ADN2 de Levadura (DNA2_YEAST). En una realización preferida, dicho dominio catalítico adicional tiene una actividad 3'-5'-exonucleasa, y en una realización más preferida, dicho dominio catalítico adicional es TREX, más preferentemente el dominio catalítico es TREX2 (documento WO2012/058458). En otra realización preferida, dicho dominio catalítico está codificado por un polipéptido TREX2 monocatenario. Dicho dominio catalítico adicional puede fusionarse a una proteína de fusión nucleasa o proteína quimérica según la invención, opcionalmente mediante un enlazador peptídico.

Se sabe que las roturas endonucleolíticas estimulan la tasa de recombinación homóloga. Por tanto, en otra realización, la etapa de modificación genética del método comprende además una etapa de introducción, en las células, de un ácido nucleico exógeno que comprende al menos una secuencia homóloga en una parte de la secuencia de ácidos nucleicos diana, de modo que se produzca dicha recombinación homóloga entre la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico exógeno. En realizaciones particulares, dicho ácido nucleico exógeno comprende una primera parte y una segunda parte que son homólogas a las regiones 5' y 3' de la secuencia de ácidos nucleicos diana, respectivamente. Dicho ácido nucleico exógeno en estas realizaciones también comprende una tercera parte colocada entre la primera y la segunda parte, que no comprende homología con las regiones 5' y 3' de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Después de la escisión de la secuencia de ácidos nucleicos diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico exógeno. Preferentemente, dentro de dicha matriz donante, se utilizan secuencias homólogas de al menos 50 pb, preferentemente de más de 100 pb y más preferentemente de más de 200 pb. En una realización particular, la secuencia homóloga puede tener de 200 pb a 6000 pb, más preferentemente de 1000 pb a 2000 pb. De hecho, las homologías compartidas de ácidos nucleicos se localizan en regiones flanqueantes cadena arriba y cadena abajo del sitio de la rotura y la secuencia de ácidos nucleicos que se introducirá debe localizarse entre los dos brazos.

PUNTOS DE CONTROL INMUNITARIO

La presente invención proporciona linfocitos T alogénicos que expresan un anti-CD123, en particular un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 44 o de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44, en donde al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivado y/o un gen seleccionado de los genes CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIG IT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, se inactiva como se indica en el documento WO2014/184741.

Linfocitos T resistentes a fármacos

Según otro aspecto, el CAR anti-CD123 que expresa los linfocitos T de la invención, pueden modificarse por ingeniería genética para mejorar su resistencia a fármacos inmunosupresores o a tratamientos quimioterapéuticos, que se utilizan como norma asistencial para el tratamiento de células malignas positivas para CD123.

Varios agentes citotóxicos (fármacos contra el cáncer), tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, inhibidores de ADN metiltransferasa, compuestos de platino y venenos de huso, se han desarrollado para destruir a las células cancerosas. Sin embargo, la introducción de estos agentes con nuevas terapias, tales como inmunoterapias, es problemática. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos pueden ser perjudiciales para el establecimiento de células inmunocompetentes antitumorales robustas debido a perfiles de toxicidad inespecíficos de los agentes. Las terapias basadas en moléculas pequeñas que se dirigen a las rutas de proliferación celular también pueden obstaculizar el establecimiento de inmunidad antitumoral. Si los regímenes de quimioterapia que son transitoriamente eficaces pueden combinarse con nuevas terapias de células inmunocompetentes, entonces podría lograrse una mejora significativa en la terapia antineoplásica (para una revisión (Dasgupta, McCarty et al.

2011)).

Para mejorar la terapia del cáncer y la injertación selectiva de linfocitos T alogénicos, a dichos linfocitos T alogénicos se les confiere resistencia a fármacos para protegerlos de los efectos secundarios tóxicos del agente quimioterapéutico. La resistencia a fármacos de los linfocitos T también permite su enriquecimiento in vivo o ex vivo, ya que los linfocitos T que expresan el gen de resistencia a fármacos sobrevivirán y se multiplicarán en relación con las células sensibles al fármaco.

En el documento PCT/EP2014/075317 se desvelan métodos de modificación por ingeniería genética de linfocitos T resistentes a agentes quimioterapéuticos.

En particular, la presente divulgación se refiere a un método de modificación por ingeniería genética de células alogénicas adecuadas para inmunoterapia en donde al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivado y un gen se modifica para conferir resistencia a un fármaco que comprende: o Proporcionar un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123; en particular, un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, preferentemente un ^cA^r123 humanizado de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46

o Modificar dicho linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 inactivando al menos un gen que codifique un componente del receptor de linfocitos T (TCR);

o Modificar dicho linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 para conferir resistencia a un fármaco a dicho linfocito T que exprese un CAR anti-CD123;

o Expandir dicho linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 modificado por ingeniería genética en presencia de dicho fármaco.

Como alternativa, la presente divulgación se refiere a un método que comprende:

o Proporcionar un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123; en particular, un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, preferentemente un CAR 123 humanizado de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46

En particular, la presente divulgación también se refiere a un método de modificación por ingeniería genética de células alogénicas adecuadas para inmunoterapia en donde al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivado y un gen se modifica para conferir resistencia a un fármaco que comprende:

o Proporcionar un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123; en particular, linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 75, s Eq ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, preferentemente un CAR 123 humanizado de SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, más preferentemente un CAR 123 humanizado de SEQ ID NO: 75,

o Proporcionar un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123; en particular, un linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, preferentemente un ^cA^r123 humanizado de SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, más preferentemente un CAR 123 humanizado de SEQ ID NO: 75,

Expandir dicho linfocito T que exprese un CAR anti-CD123 modificado por ingeniería genética en presencia de dicho fármaco.

Expresión de genes de resistencia a fármacos en células inmunitarias que expresan un CAR anti-CD123

En una realización particular, dicha resistencia a fármacos puede conferirse a los linfocitos T mediante la expresión de al menos un gen de resistencia a fármacos. Dicho gen de resistencia a fármacos se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica "resistencia" a un agente, tal como un agente quimioterapéutico (por ejemplo, metotrexato). En otras palabras, la expresión del gen de resistencia a fármacos en una célula permite la proliferación de las células en presencia del agente en mayor medida que la proliferación de una célula correspondiente sin el gen de resistencia a fármacos. La expresión del gen de resistencia a fármacos en una célula permite la proliferación de las células en presencia del agente y no afecta a su actividad. Un gen de resistencia a fármacos de la invención puede codificar resistencia a antimetabolitos, metotrexato, vinblastina, cisplatino, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos citotóxicos, antiinmunofilinas, sus análogos o derivados, y similares.

En una realización, un gen de resistencia a fármacos de la invención puede conferir resistencia a un fármaco (o a un agente), en particular a un fármaco contra el cáncer seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico, combinación de trióxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, citarabina, antraciclinas, 6-tioguanina, hidroxiurea, prednisona, y combinaciones de las mismas.

Se han identificado varios genes de resistencia a fármacos que posiblemente pueden utilizarse para conferir resistencia a fármacos a células diana (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007).

Un ejemplo de un gen de resistencia a fármacos también puede ser una forma mutante o modificada de la dihidrofolato reductasa (DHFR). La DHFR es una enzima implicada en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula y es esencial para la síntesis de ADN. Análogos de folato, tal como metotrexato (MTX), inhiben la DHFR y, por lo tanto, se utilizan como agentes antineoplásicos en el ámbito clínico. Se han descrito diferentes formas mutantes de DHFR que tienen mayor resistencia a la inhibición por los antifolatos utilizados en la terapia. En una realización particular, el gen de resistencia a fármacos según la presente invención puede ser una secuencia de ácidos nucleicos que codifique una forma mutante de la DHFR de tipo silvestre humana (GenBank: AAH71996.1) que comprenda al menos una mutación que confiera resistencia a un tratamiento con antifolato, tal como metotrexato. En una realización en particular, la forma mutante de la DHFR comprende al menos un aminoácido mutado en la posición G15, L22, F31 o F34, preferentemente en las posiciones ^l22 o F31 (Schweitzer, Dicker et al. 1990); solicitud internacional W094/24277; patente de Estados Unidos US 6 642 043). En una realización particular, dicha forma mutante de la DHFR comprende dos aminoácidos mutados en las posiciones L22 y F31. La correspondencia de las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido de la DHFR de tipo silvestre expuestas en GenBank: AAH71996.1. En una realización particular, el resto de serina en la posición 15 se reemplaza preferentemente con un resto de triptófano. En otra realización particular, el resto de leucina en la posición 22 se reemplaza preferentemente con un aminoácido que alterará la unión de la DHFR mutante con antifolatos, preferentemente con restos de aminoácidos no cargados, tales como fenilalanina o tirosina. En otra realización particular, el resto de fenilalanina en las posiciones 31 o 34 se reemplaza preferentemente con un pequeño aminoácido hidrófilo tal como alanina, serina o glicina.

Como se usa en el presente documento, un "agente antifolato" o "análogos de folato" se refiere a una molécula dirigida a interferir con la ruta metabólica del folato en algún nivel. Los ejemplos de agentes antifolato incluyen, por ejemplo, metotrexato (MTX); aminopterina; trimetrexato (Neutrexin™); edatrexato; ácido N10-propargil-5,8-dideazafólico (CB3717); ZD1694 (Tumodex), ácido 5,8-dideazaisofólico (IAHQ); ácido 5,10-dideazatetrahidrofólico (DDATHF); ácido 5-deazafólico; PT523 (N alfa-(4-amino-4-desoxipteroil)-N delta-hemiftaloil-L-ornitina); 10-etil-10-deazaaminopterina (DDATHF, lomatrexol); piritrexim; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; pemetrexato y PDX (10-propargil-10-deazaaminopterina).

Otro ejemplo de un gen de resistencia a fármacos también puede ser una forma mutante o modificada de la ionisina-5'-monofosfato deshidrogenasa II (IMPDH2), una enzima limitante de la velocidad en la síntesis de novo de nucleótidos de guanosina. La forma mutante o modificada de la IMPDH2 es un gen de resistencia a inhibidores de la IMPDH. Los inhibidores de la IMPDH pueden ser el ácido micofenólico (MPA) o su profármaco mofetilo micofenolato (MMF). La IMPDH2 mutante puede comprender al menos una, preferentemente dos mutaciones en el sitio de unión a MAP de la IMPDH2 humana de tipo silvestre (NP_000875.2) que conducen a una resistencia significativamente mayor a inhibidores de la IMPDH. Las mutaciones están preferentemente en las posiciones T333 y/o S351 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013). En una realización particular, el resto de treonina en la posición 333 se reemplaza con un resto de isoleucina y el resto de serina en la posición 351 se reemplaza con un resto de tirosina. La correspondencia de las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido de la IMPDH2 humana de tipo silvestre expuesta en NP_000875.2.

Otro gen de resistencia a fármacos es la forma mutante de la calcineurina. La calcineurina (PP2B), una serina/treonina proteína fosfatasa expresada de forma ubicua que participa en muchos procesos biológicos y que es fundamental para la activación de linfocitos T. La calcineurina es un heterodímero compuesto por una subunidad catalítica (CnA; tres isoformas) y una subunidad reguladora (CnB; dos isoformas). Después de la participación del receptor de linfocitos T, la calcineurina desfosforila el factor de transcripción NFAT, lo que le permite translocarse al núcleo y activar al gen diana clave activo, tal como IL2. FK506 en complejo con FKBP12, o ciclosporina A (CsA) en complejo con CyPA bloquean el acceso de NFAT al sitio activo de la calcineurina, impidiendo su desfosforilación e inhibiendo por lo tanto la activación de linfocitos T (Brewin, Mancao et al. 2009). El gen de resistencia a fármacos de la presente invención puede ser una secuencia de ácidos nucleicos que codifique una forma mutante de calcineurina resistente a un inhibidor de calcineurina tal como FK506 y/o CsA. En una realización particular, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoácido mutado del heterodímero de calcineurina de tipo silvestre en las posiciones: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360, preferentemente mutaciones dobles en las posiciones T351 y L354 o V314 e Y341. En una realización particular, el resto de valina en la posición 341 puede reemplazarse con un restos de lisina o arginina, el resto de tirosina en la posición 341 puede reemplazarse con un resto de fenilalanina; la metionina en la posición 347 puede reemplazarse con el resto de ácido glutámico, arginina o triptófano; la treonina en la posición 351 puede reemplazarse con el resto de ácido glutámico; el resto de triptófano en la posición 352 puede reemplazarse con un resto de cisteína, ácido glutámico o alanina, la serina en la posición 353 puede reemplazarse con un resto de histidina o asparagina, la leucina en la posición 354 puede reemplazarse con un resto de alanina; la lisina en la posición 360 puede reemplazarse con un resto de alanina o fenilalanina de una secuencia correspondiente a GenBank: ACX34092.1. La correspondencia de las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido del heterodímero de calcineurina humana de tipo silvestre expuesto en (GenBank: ACX34092.1).

En otra realización particular, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoácido mutado del heterodímero b de calcineurina de tipo silvestre en las posiciones: V120, N123, L124 o K125, preferentemente mutaciones dobles en las posiciones L124 y K125. En una realización particular, la valina en la posición 120 puede reemplazarse con un resto de serina, ácido aspártico, fenilalanina o leucina; la asparagina en la posición 123 puede reemplazarse con un resto de triptófano, lisina, fenilalanina, arginina, histidina o serina; la leucina en la posición 124 puede reemplazarse con un resto de treonina; la lisina en la posición 125 puede reemplazarse con un resto de alanina, ácido glutámico, triptófano, o pueden añadirse dos restos, tales como leucina-arginina o isoleucina-ácido glutámico después de la lisina en la posición 125 en la secuencia de aminoácidos que corresponde al GenBank: ACX34095.1. La correspondencia de las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido del heterodímero b de calcineurina humana de tipo silvestre expuesto en (GenBank: ACX34095.1).

Otro gen de resistencia a fármacos es la 0(6)-metilguanina metiltransferasa (MGMT) que codifica la alquil guanina transferasa humana (hAGT). La AGT es una proteína reparadora de ADN que confiere resistencia a los efectos citotóxicos de agentes alquilantes, tales como nitrosoureas y temozolomida (TMZ). La 6-bencilguanina (6-BG) es un inhibidor de la AGT que potencia la toxicidad de la nitrosourea y se administra de forma conjunta con TMZ para potenciar los efectos citotóxicos de este agente. Varias formas mutantes de MGMT que codifican variantes de AGT son altamente resistentes a la inactivación por 6-BG, pero conservan su capacidad para reparar daños en el ADN (Maze, Kurpad et al. 1999). En una realización particular, la forma mutante de AGT puede comprender un aminoácido mutado de la posición P140 de AGT de tipo silvestre, en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 (UniProtKB: P16455). En una realización preferida, dicha prolina en la posición 140 se reemplaza con un resto de lisina.

Otro gen de resistencia a fármacos puede ser el gen de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MDR1). Este gen codifica una glicoproteína de membrana, conocida como glucoproteína P (P-GP, P-glycoprotein) implicada en el transporte de subproductos metabólicos a través de la membrana celular. La proteína P-Gp muestra una amplia especificidad hacia varios agentes quimioterapéuticos no relacionados estructuralmente.

Se ha descrito que la sobreexpresión de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos confiere resistencia a fármacos tales como la mitoxantrona (Charles S. Morrow, Christina Peklak-Scott, Bimjhana Bishwokarma, Timothy E. Kute, Pamela K. Smitherman y Alan J. Townsend. Multidrug Resistance Protein 1 (MRP1, ABCC1) Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux Mol Pharmacol Abril de 200669:1499-1505).

Por tanto, la resistencia a fármacos puede conferirse a las células mediante la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica MDR-1 (NP_000918).

Otra forma más de preparar células resistentes a fármacos es preparar células una o más mutaciones específicas, tales como mutaciones en Arg486 y Glu571 en el gen de la Topoisomerasa II humana, para conferir resistencia a la amsacrina (S. PATEL, BA KELLER, y LM FISHER. 2000. MOLECULAR PHARMACOLOGY. Vol 57: p784-791 (2000).

Otra forma más de preparar células resistentes a fármacos es preparar células que sobreexpresen microARN-21 para conferir resistencia a la daunorrubicina (implicación de miR-21 en la resistencia a la daunorrubicina mediante la regulación de la expresión de PTEN en la línea celular K562 de leucemia Bai, Haitao et al. FEBS Letters, Volumen 585, publicación 2, 402 - 408).

En una realización preferida, las células que llevan dicho ARNm o proteína que confiere resistencia a fármacos, también comprenden un ARNm inhibidor o un gen cuya expresión está condicionada, permitiendo la destrucción selectiva de dichas células resistentes al fármaco en presencia de dicho fármaco o después de la administración de dicho fármaco.

El gen de resistencia a fármacos también puede conferir resistencia a antibióticos citotóxicos, y puede ser el gen ble o el gen mcrA. La expresión ectópica del gen ble o mcrA en una célula inmunitaria ofrece una ventaja selectiva cuando se expone al agente quimioterapéutico, respectivamente, la bleomicina o la mitomicina C.

El enfoque más práctico de la terapia génica es la adición de un gen para diseñar linfocitos T utilizando un suministro de genes eficaz con vectores, preferentemente vectores víricos. Por tanto, en una realización particular, dicho gen de resistencia a fármacos puede expresarse en la célula introduciendo un transgén codificado preferentemente por al menos un vector en una célula.

En una realización, las células que llevan un gen de resistencia a un fármaco o un gen modificado que confiere resistencia a un fármaco también comprenden un gen suicida inducible, cuya inducción provoca la muerte celular, lo que permite su destrucción selectiva.

La inserción aleatoria de genes en el genoma puede conducir a la expresión inapropiada del gen insertado o del gen cerca del sitio de inserción. La terapia génica específica utilizando recombinación homóloga de ácido nucleico exógeno que comprende secuencias endógenas para dirigir genes diana a sitios específicos dentro del genoma, puede permitir la modificación por ingeniería genética segura de linfocitos T. Como se describe anteriormente, la etapa de modificación genética del método puede comprender una etapa de introducir en células un ácido nucleico exógeno que comprenda al menos una secuencia que codifique el gen de resistencia a un fármaco y una parte de un gen endógeno de tal manera que se produzca una recombinación homóloga entre el gen endógeno y el ácido nucleico exógeno. En una realización particular, dicho gen endógeno puede ser el gen de "resistencia a fármacos" de tipo silvestre, de tal manera que, después de la recombinación homóloga, el gen de tipo silvestre se reemplace por la forma mutante del gen que confiere resistencia al fármaco.

Se sabe que las roturas endonucleolíticas estimulan la tasa de recombinación homóloga. Por tanto, en una realización particular, el método de la invención comprende además la etapa de expresar en la célula una endonucleasa de corte raro que sea capaz de escindir una secuencia diana dentro de un gen endógeno. Dicho gen endógeno puede codificar, por ejemplo, DHFR, IMPDH2, calcineurina o AGT. Dicha endonucleasa de corte raro puede ser una nucleasa TALE, una nucleasa de dedo de zinc, una endonucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa o una meganucleasa MBBBD.

Inactivación de genes sensibilizadores de fármacos en células inmunitarias que expresan CAR anti-CD123

En otra realización particular, dicha resistencia a fármacos puede conferirse a la célula de la invención (célula inmunitaria que expresa un CAR anti-CD123), mediante la inactivación de un gen sensibilizador de fármacos.

El inventor buscó inactivar el posible gen sensibilizador de fármacos para diseñar linfocitos T para inmunoterapia, en particular para diseñar células inmunitarias que expresan CAR anti-CD123 que pueden utilizarse en combinación con un agente terapéutico (fármaco contra el cáncer).

Al inactivar un gen se pretende que el gen de interés no se exprese en una forma de proteína funcional. En una realización en particular, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas, para diseñar, una endonucleasa de corte raro, de tal manera que dicha endonucleasa de corte raro cataliza específicamente la escisión en un gen diana inactivando de ese modo dicho gen diana. En una realización particular, la etapa de inactivar al menos un gen sensibilizador de fármacos comprende introducir en la célula una endonucleasa de corte raro capaz de alterar al menos un gen sensibilizador de fármacos. En una realización más particular, dichas células se transforman con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte raro capaz de alterar un gen sensibilizador de fármacos, y dicha endonucleasa de corte raro se expresa en dichas células. Dicha endonucleasa de corte raro puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa MBBBD o una nucleasa TALE. En una realización preferida, dicha endonucleasa de corte raro es una nucleasa TALE.

En una realización preferida, el gen sensibilizador de fármacos que puede inactivarse para conferir resistencia a fármacos a los linfocitos T es el gen de la desoxicitidina cinasa (dCK) humana. Esta enzima es necesaria para la fosforilación de los desoxirribonucleósidos desoxicitidina (dC), desoxiguanosina (dG) y desoxiadenosina (dA). Los análogos de nucleótidos de purina (PNA, del inglés Purine Nucleotide Analogs ) se metabolizan mediante dCK en mono-, di- y tri-fosfato de PNA. Sus formas de trifosfato, y particularmente el trifosfato de clofarabina, compiten con el ATP para la síntesis de ADN, actúan como agentes proapoptóticos y son fuertes inhibidores de la ribonucleótido reductasa (RNR) que participa en la producción de trinucleótidos.

Preferentemente, la inactivación de dCK en linfocitos T está mediada por la nucleasa TALE. Para conseguir este objetivo, se han diseñado varios pares de dCK nucleasa TALE, ensamblados a nivel de polinucleótidos y validados por secuenciación. En el documento PCT/EP2014/075317, se muestran ejemplos de pares de nucleasas TALE que pueden utilizarse según la invención.

Esta inactivación de dCK en linfocitos T confiere resistencia a los análogos de nucleósidos de purina (PNA), tales como clofarabina y fludarabina.

En otra realización preferida, la inactivación de dCK en linfocitos T se combina con una inactivación de genes TRAC, lo que hace que estos linfocitos T de doble desactivación (KO, knock out) sean resistentes a fármacos tales como la clofarabina y sean menos alogénicos. Esta doble característica es particularmente útil para un objetivo terapéutico, permitiendo que las células alogénicas "listas para usar" se administren en inmunoterapia junto con quimioterapia para tratar a los pacientes con cáncer. Esta doble inactivación KO dCK/TRAC puede realizarse de manera simultánea o secuencial. En el documento PCT/EP2014/075317 se describe un ejemplo de pares dCK/TRAC de nucleasa TALE que tuvieron éxito en la invención, en particular, las secuencias diana en los 2 locus (dCK y TRAC). Otro ejemplo de enzima que puede inactivarse es el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HPRT) humana (Genbank: M26434.1). En particular, la HPRT puede inactivarse en linfocitos T modificados por ingeniería genéticas para conferir resistencia a un metabolito citostático, la 6-tioguanina (6TG) que se convierte por HPRT en nucleótido de tioguanina citotóxica y que actualmente se utiliza para tratar pacientes con cáncer, en particular leucemias (Hacke, Treger et al. 2013). Los análogos de guaninas se metabolizan por la HPRT transferasa que cataliza la adición de la porción de fosforibosilo y permite la formación de TGMP. Los análogos de guanina, que incluyen 6 mercaptopurina (6MP) y 6 tioguanina (6TG), se utilizan normalmente como fármacos linforreductores para tratar la LLA. Se metabolizan por HPRT (hipoxantina fosforribosil transferasa que cataliza la adición de la porción de fosforibosilo y permite la formación de TGMP. Sus posteriores fosforilaciones conducen a la formación de sus formas trifosforiladas que finalmente se integran en el ADN. Una vez incorporado en el ADN, la tio GTP deteriora la fidelidad de la replicación del ADN a través de su agrupación de tiolatos y genera mutaciones puntuales aleatorias que son altamente perjudiciales para la integridad celular.

En otra realización, la inactivación de CD3 normalmente expresado en la superficie del linfocito T puede conferir resistencia a anticuerpos anti-CD3 tales como teplizumab.

Las expresiones "agente terapéutico", "agente quimioterapéutico", "fármaco" o "fármaco anticanceroso", tal y como se utilizan en este documento, se refieren a un medicamento, preferentemente un compuesto o un derivado del mismo que pueda interaccionar con una célula cancerosa, reduciendo así el estado proliferativo de la célula y/o destruyendo la célula. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos o "fármacos contra el cáncer" incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes (por ejemplo, Busulfán • Carboplatino • Clorambucilo • Cisplatino • Ciclofosfamida • Ifosfamida • Melfalán • Mecloretamina • Oxaliplatino • Uramustina • Temozolomida • Fotemustina), antagonistas metabólicos (por ejemplo, antimetabolito de nucleósido de purina, tal como clofarabina, fludarabina o 2'-desoxiadenosina, metotrexato (MTX), 5-fluorouracilo o derivados de los mismos, Azatioprina • Capecitabina • Citarabina • Floxuridina • Fluorouracilo • Gemcitabina • Metotrexato • Pemetrexed), antibióticos antitumorales (por ejemplo, mitomicina, Adriamicina, Bleomicina • Daunorrubicina • Doxorrubicina • Epirrubicina • Hidroxiurea • Idarrubicina • Mitomicina C • Mitoxantrona), agentes antitumorales procedentes de plantas (por ejemplo, vincristina, vindesina, Taxol, Vinblastina • (Vinorrelbina) • Docetaxel • Paclitaxel), inhibidor de topoisomerasa (Irinotecán • Topotecán • Etopósido),

En una realización preferida, un agente terapéutico, un fármaco quimioterapéutico, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o a un derivado del mismo que puede utilizarse para tratar el cáncer, en particular para tratar una célula cancerosa hematopoyética y más particularmente LMA, reduciendo así el estado proliferativo de la célula cancerosa y/o destruyendo la célula cancerosa. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitación, aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trióxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, y combinaciones de los mismos.

En otras realizaciones de la presente invención, las células de la invención se administran a un paciente junto con un fármaco (o un agente) seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico, citarabina, antraciclinas, 6-tioguanina, hidroxiurea, prednisona, y combinaciones de las mismas.

Dichos agentes pueden incluir, además, pero sin limitación, los agentes contra el cáncer TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), 6-benziguanidina (6-BG), bis-cloronitrosourea (BCNU) y CAMPTOTHECIN™, o un derivado terapéutico de cualquiera de ellos.

En una realización más preferida, un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 44 es para la administración a un paciente, en combinación con al menos un agente terapéutico seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trióxido de arsénico, ácido transretinoico y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, una célula que es "resistente o tolerante" a un agente, significa una célula que se ha modificado genéticamente de manera que la célula prolifera en presencia de una cantidad de un agente que inhibe o impide la proliferación de una célula sin la modificación.

Resistencia a múltiples fármacos de células inmunitarias que expresan CAR anti-CD123

En otra realización particular, los inventores buscaron desarrollar una estrategia de inmunoterapia "comercial", utilizando linfocitos T alogénicos, en particular, linfocitos T alogénicos que expresan CAR anti-CD123 resistentes a múltiples fármacos para mediar en la selección de linfocitos T modificados por ingeniería genética cuando el paciente se trata con diferentes fármacos. La eficacia terapéutica puede mejorarse significativamente modificando por ingeniería genética linfocitos T alogénicos resistentes a múltiples fármacos. Dicha estrategia puede ser particularmente eficaz en el tratamiento de tumores que responden a combinaciones de fármacos que muestran efectos sinérgicos. Por otra parte, los linfocitos T modificados por ingeniería genética resistentes a múltiples fármacos, pueden expandirse y seleccionarse utilizando una dosis mínima de agentes farmacológicos.

Por tanto, el método según la presente divulgación puede comprender la modificación del linfocito T para conferir a dicho linfocito T resistencia a múltiples fármacos. Dicha resistencia a múltiples fármacos puede conferirse ya sea expresando más de un gen de resistencia a un fármaco o inactivando más de un gen sensibilizador de un fármaco. En otra realización particular, la resistencia a múltiples fármacos puede conferirse a dichos linfocitos T expresando al menos un gen de resistencia a fármacos e inactivando al menos un gen sensibilizador de fármacos. En particular, la resistencia a múltiples fármacos puede conferirse a dichos linfocitos T expresando al menos un gen de resistencia a fármacos, tal como la forma mutante de DHFR, la forma mutante de IMPDH2, la forma mutante de calcineurina, la forma mutante de MGMT, el gen ble y el gen mcrA gen e inactivando al menos un gen sensibilizador de fármacos, tal como el gen HPRT. En una realización preferida, se puede conferir resistencia a múltiples fármacos inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de DHFR; o inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de IMPDH2; o inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de calcineurina; inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de MGMT; inactivando el gen HPRT y expresando el gen ble; inactivando el gen HPRT y expresando el gen mcrA.

En una realización, la presente invención proporciona linfocitos T alogénicos que expresan CAR anti-CD123 que expresan más de un gen de resistencia a fármacos o en el está inactivado más de un gen sensibilizador de fármacos.

- Genes suicidas en células inmunitarias que expresan CAR anti-CD123

En algunos casos, dado que los linfocitos T modificados por ingeniería genética pueden expandirse y persistir durante años después de la administración, puede ser deseable incluir un mecanismo de seguridad para permitir la eliminación selectiva de linfocitos T administrados. Por tanto, en algunas realizaciones, el método de la divulgación puede comprender la transformación de dichos linfocitos T con un gen suicida recombinante. Dicho gen suicida recombinante se utiliza para reducir el riesgo de toxicidad directa y/o la proliferación no controlada de dichos linfocitos T una vez administrados en un sujeto (Quintarelli C, Vera F, blood 2007; Tey SK, Dotti G., Rooney CM, boil blood marrow transplant 2007). Los genes suicidas permiten la eliminación selectiva de células transformadas in vivo. En particular, el gen suicida tiene la capacidad de convertir un profármaco no tóxico en un fármaco citotóxico o de expresar el producto de expresión génica tóxico. En otras palabras, el "gen suicida" es un ácido nucleico que codifica un producto, en el que el producto causa la muerte celular por sí mismo o en presencia de otros compuestos.

Un ejemplo representativo de dicho gen suicida es el que codifica la timidina cinasa del virus del herpes simple. Ejemplos adicionales son la timidina cinasa del virus de la varicela zóster y el gen bacteriano de citosina desaminasa que puede convertir la 5-fluorocitosina en el compuesto 5-fluorouracilo altamente tóxico. Los genes suicidas también incluyen, como ejemplos no limitantes, caspasa-9 o caspasa-8 o citosina desaminasa. La caspasa-9 puede activarse utilizando un inductor químico específico de dimerización (CID, por las siglas del inglés chemical inducer of dimerization). Los genes suicidas también pueden ser polipéptidos que se expresan en la superficie de la célula y pueden hacer que las células sean sensibles a anticuerpos monoclonales terapéuticos. Como se usa en este documento, "profármaco" significa cualquier compuesto útil en los métodos de la presente invención que se puede convertir en un producto tóxico. El profármaco se convierte en un producto tóxico por el producto génico del gen suicida en el método de la presente invención. Un ejemplo representativo de dicho profármaco es el ganciclovir que se convierte in vivo en un compuesto tóxico mediante la timidina cinasa del VHS. El derivado de ganciclovir posteriormente es tóxico para las células tumorales. Otros ejemplos representativos de profármacos incluyen aciclovir, FIAU [1-(2-desoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo], arabinósido de 6-metoxipurina para VZV-TK, y 5-fluorocitosina para citosina desaminasa.

Un sistema génico suicida preferido emplea un polipéptido antigénico recombinante que comprende un motivo antigénico reconocido por Rituximab, un mAb (anticuerpo monoclonal) anti-CD20, especialmente QBen10, tal como en el polipéptido denominado RQR8 descrito en el documento WO2013153391. Rituximab, un fármaco autorizado de anticuerpos, puede utilizarse por tanto para la depleción celular cuando sea necesario.

En una realización, la presente invención proporciona linfocitos T alogénicos que expresan CAR anti-CD123 que expresan más de un gen de resistencia a fármacos o en los que se inactiva más de un gen sensibilizador de fármacos, y un gen suicida que permite que se destruyan dichas células.

Células inmunitarias que expresan CAR anti-CD123 resistentes a clofarabina

La divulgación incluye la fabricación de linfocitos T para uso terapéutico, que son resistentes a fármacos tal como a Clofarabina. Se pueden obtener por inactivación del gen dCK como se explicó anteriormente. Según una realización preferida, los linfocitos T se hacen resistentes a la quimioterapia y menos alogénicos al combinar la inactivación de los genes dCK y TCR como se describió anteriormente.

Por tanto, la presente invención proporciona una célula que expresa un CAR anti-CD123, en particular, un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 donde el CAR deriva de Klon 43 (que comprende una SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, opcionalmente humanizada) y donde el gen dCK está inactivado.

Células Daudi resistentes fármacos CD123+/luc+ para ensayar la citotoxicidad de linfocitos T CAR alogénicos resistentes a fármacos

La presente divulgación también incluye un método para fabricar células diana que expresan tanto un receptor de superficie específico para linfocitos T CAR como un gen de resistencia. Estas células diana son particularmente útiles para ensayar la citotoxicidad de los linfocitos T CAR. Estas células son fácilmente resistentes a la dosis clínicamente relevante de clofarabina y albergan actividad luciferasa. Esta combinación de características permite rastrearlas. in vivo en un modelo de ratones o destruirlas cuando sea necesario.

Más particularmente, pueden utilizarse para evaluar las propiedades de citotoxicidad de los linfocitos T resistentes a fármacos en ratones en presencia de clofarabina u otros p Na . Las células Daudi resistentes a clofarabina, imitan el estado fisiológico de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) en recaída de la terapia de inducción, que albergan neoplasias malignas de linfocitos B resistentes a fármacos. Por tanto, estas células son de gran interés para evaluar la confiabilidad y la citotoxicidad de los linfocitos T CAR resistentes a fármacos. Preferentemente, estas células diana son células CD123+ Luciferasa Daudi.

Célula aislada

La presente invención se refiere a una célula aislada que expresa un CAR que se une a CD123. Por tanto, la invención se refiere a una célula que expresa un CAR anti-CD123. En una realización particular, dicha célula que expresa un CAR anti-CD123 es resistente a al menos un fármaco y/o comprende al menos un gen alterado que codifica un componente del receptor de linfocitos T.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un linfocito T aislado que expresa un CAR que se une a CD123. La invención se refiere a un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123. En una realización particular, dicho linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 es resistente a al menos un fármaco y/o comprende al menos un gen alterado que codifica un componente del receptor de linfocitos T.

En una realización particular, dicho linfocito T CAR anti-CD123 expresa al menos un gen de resistencia a fármacos, preferentemente el gen ble o el gen mcrA o un gen que codifica un DHFR mutante, un IMPDH2 mutante, un AGT mutante o una calcineurina mutante.

En otra realización particular, dicho linfocito T que expresa CAR anti-CD123 comprende al menos un gen sensibilizador de fármaco alterado tal como el gen dCK o HPRT. En una realización más particular, dicho linfocito T CAR anti-CD123 aislado comprende un gen HPRT alterado y expresa un mutante de DHFR; dicho linfocito T CAR anti-CD123 aislado comprende un gen HPRT alterado y expresa un mutante de IMPDH2; dicho linfocito T CAR anti-CD123 aislado comprende un gen HPRT alterado y expresa un mutante de calcineurina; dicho linfocito T CAR anti-CD123 aislado comprende un gen HPRT alterado y expresa un mutante de AGT.

Linfocitos T CAR anti-CD123 alogénicos resistentes a un fármaco para su uso en inmunoterapia

En particular, la presente invención se refiere a un linfocito T alogénico, en particular un linfocito T alogénico que expresa un CAR anti-CD123 y preferentemente un linfocito T alogénico que expresa un CAR anti-CD123 que comprende un péptido que tiene una identidad del 80 % al 100 % con scfv de Klon 43, dicho linfocito T alogénico que expresa un CAR anti-CD123 que comprende un péptido que tiene una identidad del 80 % al 100 % con scfv de Klon 43 es más particularmente resistente a un fármaco, y es específicamente adecuado para la inmunoterapia.

En una realización preferida, dicho linfocito T alogénico que expresa un CAR anti-CD123 comprende un péptido que tiene una identidad del 80 % al 100 % con la SEQ ID NO:44 y es más particularmente resistente a un fármaco, y específicamente adecuado para inmunoterapia.

La resistencia de un fármaco puede conferirse a través de la inactivación de genes sensibilizadores de fármacos o a través de la expresión de genes de resistencia a fármacos. Algunos ejemplos de fármacos que se adaptan a la invención son los análogos nucleosídicos de purina (PNA, siglas del inglés purine nucleoside analogues), tales como clofarabina o fludarabina, u otros fármacos tales como 6-mercaptopurina (6MP) y 6 tioguanina (6TG).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para modificar por ingeniería genética células inmunitarias para hacerlas resistentes a análogos nucleosídicos de purina (PNA), tales como clofarabina o fludarabina, de modo que puedan utilizarse en tratamientos de inmunoterapia del cáncer en pacientes previamente tratados con estas quimioterapias convencionales.

La resistencia a los fármacos puede conferirse a los linfocitos T inactivando uno o más genes responsables de la sensibilidad de las células al fármaco (gen o genes sensibilizadores de fármacos), tales como los genes dcK y/o HPRT.

Según otro aspecto, la resistencia a los fármacos puede conferirse a un linfocito T expresando un gen de resistencia a fármacos. Se han identificado alelos variantes de varios genes, tales como dihidrofolato reductasa (DHFR), inosina monofosfato deshidrogenasa 2 (IMPDH2), calcineurina o metilguanina transferasa (MGMT) que confieren resistencia a fármacos a una célula según la invención.

Por ejemplo, CD52 y receptores de glucocorticoides (RG), que son dianas farmacológicas de tratamientos con Campath (alemtuzumab) o rituximab y con glucocorticoides, se pueden inactivar para hacer que las células sean resistentes a estos tratamientos y otorgarlas una ventaja competitiva sobre los propios linfocitos T del paciente no dotados de los CAR específicos de CD123. La expresión del gen CD3 también puede suprimirse o reducirse para conferir resistencia a Teplizumab, que es otro fármaco inmunosupresor. La expresión de HPRT también puede suprimirse o reducirse según la invención para conferir resistencia a la 6-tioguanina, un agente citostático comúnmente utilizado en quimioterapia, especialmente para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.

Según un aspecto adicional de la invención, las células inmunitarias también pueden manipularse para hacerlas más activas o limitar su agotamiento, inactivando genes que codifican proteínas que actúan como "puntos de control inmunitarios" que actúan como reguladores de la activación de linfocitos T, tales como los siguientes genes seleccionados de CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, preferentemente, dicho gen es PDCD1 o CTLA-4. En la Tabla 9 se indican ejemplos de genes cuya expresión podría reducirse o suprimirse.

En una realización, dicho gen es un gen que actúa como un regulador de la activación de linfocitos T que codifica la proteína beta 2 microglobulina.

Según un aspecto adicional de la invención, las células inmunitarias CAR anti-CD123 de la invención también pueden manipularse para hacerlas resistentes a un fármaco, en particular a un fármaco utilizado durante la quimioterapia contra el cáncer, en particular, un cáncer, tal como LMA, mediado por células que expresan CD123. Esto puede realizarse introduciendo un gen que confiere resistencia a dicho fármaco. Este mismo gen puede activarse y desactivarse utilizando un sistema de inhibición/expresión inducible por genes como se describió anteriormente (Garcia EL, Mills AA (2002) Getting around lethality with inducible Cre-mediated excision. Semin Cell Dev Biol 13:151-8, Lewandoski M (2001) Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet 2:743-55g; Scharfenberger L, Hennerici T, Kirly G et al. (2014) Transgenic mouse technology in skin biology: Generation of complete or tissue-specific knockout mice. J Invest Dermatol 134:e16; Schwenk F, Kuhn R, Angrand PO et al. (1998) Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Res 26:1427-32.

Por tanto, células inmunitarias resistentes a fármacos que expresan un CAR anti-CD123, en donde (i) se inactiva al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) (ii) se incorpora al menos un gen que confiere resistencia a un fármaco o un gen que confiere sensibilidad a dicho fármaco se elimina o muta a estar inactivado (iii) opcionalmente, otro gen seleccionado del gen descrito en la tabla 9 está inactivado, es un objeto de la presente invención.

La presente invención incluye las células inmunitarias o líneas celulares CAR anti-CD123 aisladas que pueden obtenerse mediante el método de la invención, más particularmente células aisladas que comprenden cualquiera de las proteínas, polipéptidos, variantes alélicas, genes o vectores alterados o eliminados descritos en el presente documento.

Las células inmunitarias o las líneas celulares de la presente invención pueden comprender además polinucleótidos recombinantes exógenos, en particular CAR o genes suicidas o pueden comprender genes alterados o eliminados que codifican proteínas de punto de control o sus ligandos que contribuyen a su eficacia como un producto terapéutico, idealmente como un producto "comercial". En otro aspecto, la presente invención se refiere al método para tratar o prevenir cáncer en el paciente, administrando al menos una vez una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética obtenible a través de los métodos anteriores.

Tabla 9: Lista de genes que codifican proteínas de punto de control inmunitarias.

Tabla 10: Secuencia de^ los diferentes fra mentos de anticuer os humanizados

(continuación)

(continuación)

En una realización preferida, dicho método de diseño adicional de células inmunitarias implica la introducción de linfocitos T en dichos polinucleótidos, en particular ARNm, que codifican una endonucleasa específica de corte raro para inactivar selectivamente los genes mencionados anteriormente mediante escisión de ADN. En una realización más preferida, dichas endonucleasas de corte raro son nucleasas TALE o endonucleasas Cas9. Las nucleasas TAL han demostrado hasta ahora mayor especificidad y eficacia de escisión sobre los otros tipos de endonucleasas de corte raro, convirtiéndolas en las endonucleasas de elección para la producción a gran escala de células inmunitarias modificadas por ingeniería genética con una renovación constante.

Métodos de suministro

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la expresión de una proteína de interés tal como un gen de resistencia a fármacos, endonucleasas de corte raro, receptores antigénicos quiméricos (CAR), en particular, un CAR anti-CD123 y, más particularmente, un CAR que comprende una SEQ ID NO: 1+ s Eq ID NO: 44, y un gen suicida en una célula.

Como ejemplo no limitante, dicha proteína de interés puede expresarse en la célula mediante su introducción como un transgén preferentemente codificado por al menos un vector plasmídico. Los polipéptidos pueden expresarse en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos en la célula. Como alternativa, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y después introducirse en ella.

En la técnica se conocen métodos para introducir una construcción polinucleotídica en las células e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en los que la construcción polinucleotídica está integrada en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción polinucleotídica no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus.

Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula, por ejemplo, a través de vectores víricos recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas, fusión celular. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente en plásmidos o virus, dado que se expresan en células. Dicho vector plasmídico puede comprender un marcador de selección que proporciona la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

En un vector pueden incluirse diferentes transgenes. Dicho vector puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de salto ribosómico, tal como una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de Aftovirus de los picornavirus, ocasionan un "salto" ribosomal de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. de Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)).

Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena en sentido de una molécula de ADN) que un ribosoma traduce en un resto de aminoácido. Por tanto, a partir de un solo marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm, pueden sintetizarse dos polipéptidos cuando los polipéptidos están separados por una secuencia oligopeptídica 2A que está en marco. Dichos mecanismos de salto ribosómico son muy conocidos en la técnica y se sabe varios vectores los utilizan para la expresión de varias proteínas codificadas por un solo ARN mensajero.

En una realización más preferida de la invención, los polinucleótidos que codifican polipéptidos según la presente invención pueden ser ARNm que se introducen directamente en las células, por ejemplo, por electroporación. Los inventores determinaron las condiciones óptimas de la electroporación de ARNm en linfocitos T. El inventor utilizó la tecnología cytoPulse que permite, utilizando campos eléctricos pulsados, permeabilizar transitoriamente células vivas para el suministro de material al interior de las células. La tecnología, basada en el uso de formas de onda de electroporación PulseAgile (BTX Havard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, MA 01746, Estados Unidos), garantiza el control exacto de la duración del pulso, de la intensidad así como del intervalo entre los pulsos (patente de Estados Unidos 6010613 y solicitud internacional PCT W02004083379). Todos estos parámetros pueden modificarse para obtener las mejores condiciones para una alta eficacia de transfección con una mortalidad mínima. Básicamente, los primeros pulsos de campo eléctrico alto permiten la formación de poros, mientras que los pulsos posteriores de campo eléctrico bajo permiten llevar el polinucleótido al interior de la célula.

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la introducción del CAR en una célula. Como ejemplo no limitante, dicho CAR puede introducirse como transgenes codificados por un vector plasmídico. Dicho vector plasmídico también puede contener un marcador de selección que proporciona la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

Como resultado de la introducción de los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos en la célula, los polipéptidos pueden sintetizarse in situ en la célula. Como alternativa, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y después introducirse en ella. En la técnica se conocen métodos para introducir una construcción polinucleotídica en las células e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en los que la construcción polinucleotídica está integrada en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción polinucleotídica no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula, por ejemplo, a través de vectores víricos recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente en plásmidos o virus, dado que se expresan en células.

Células inmunitarias modificadas por ingeniería genética

La presente invención también se refiere a células aisladas o a líneas celulares susceptibles de obtenerse por dicho método para modificar por ingeniería genética las células. En particular, dicha célula aislada comprende al menos un CAR como se describe anteriormente. En otra realización, dicha célula aislada comprende una población de CAR comprendiendo cada uno de ellos diferentes dominios de unión a ligando extracelular. En particular, dicha célula aislada comprende una secuencia de polinucleótidos exógena que codifica un CAR. Las células inmunitarias modificadas genéticamente de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión al antígeno.

En el alcance de la presente invención también se incluye una célula inmunitaria aislada, preferentemente un linfocito T obtenido según uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Dicha célula inmunitaria se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en el inicio y/o ejecución de una respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. Dicha célula inmunitaria según la presente invención puede proceder de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente, células madre no humanas, células madre de sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes no humanas o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica destructora, un mastocito, un linfocito citolítico natural (NK, natural killer), un linfocito B o un linfocito T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realización, dicha célula puede proceder del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, a través de una variedad de métodos no limitativos puede obtenerse una fuente de células de un sujeto. Las células pueden obtenerse de diversas fuentes no limitantes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo, y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invención, puede utilizarse cualquier número de líneas de linfocitos T disponibles y conocidas por los expertos en la materia. En otra realización, dicha célula puede proceder de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan características fenotípicas diferentes. En el alcance de la presente invención también se incluye una línea celular obtenida a partir de un linfocito T transformado según el método descrito anteriormente. En el alcance de la presente invención se incluyen células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de obtenerse por el método anterior.

Como una realización preferida, la presente invención proporciona linfocitos T o una población de linfocitos T dotados de un CAR específico de CD123, como se describe anteriormente, que no expresan un TCR funcional y que son reactivos hacia células positivas para CD123, para su trasplante alogénico en pacientes.

Como una realización más preferida, la presente invención proporciona linfocitos T o una población de linfocitos T dotados de un CAR específico de CD123 y que son reactivos hacia células positivas para CD123 como se ha descrito anteriormente, que no expresan un TCR funcional y que son resistentes a un fármaco seleccionado, para su trasplante alogénico en pacientes tratados con dicho fármaco seleccionado.

En una realización aún más preferida, la presente invención proporciona linfocitos T o una población de linfocitos T dotados de un CAR anti-CD123 que comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44, incluso más preferentemente un CAR anti-CD123 que comprende 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44, en particular, un CAR anti CD123 que comprende del 85 % al 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 44.

Activación y expansión de linfocitos T

Ya sea antes o después de la modificación genética de los linfocitos T, incluso si las células inmunitarias modificadas genéticamente de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión al antígeno, las células inmunitarias, en particular, los linfocitos T de la presente invención, pueden activarse y expandirse adicionalmente en general utilizando los métodos descritos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 6352 694; 6534055; 6 905680; 6692 964; 5858358; 6 887466; 6905 681; 7144575; 7 067318; 7 172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 20060121005. Los linfocitos T pueden expandirse in vitro o in vivo.

Generalmente, los linfocitos T de la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo CD3 TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T para crear una señal de activación para los linfocitos T. Por ejemplo, productos químicos, tales como ionóforo de calcio A23187, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) o lectinas mitogénicas como fitohemaglutinina (PHA), pueden utilizarse para crear una señal de activación para los linfocitos T.

Como ejemplos no limitantes, las poblaciones de linfocitos T pueden estimularse in vitro tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o su fragmento de unión a antígeno, o con un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que une la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y con un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Esencial Mínimo o medio R^pMⁱ1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp y TNF o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero sin limitación, un tensioactivo, plasmanato, y agentes reductores tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, un mejorador, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementado con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad suficiente de citocinas para el crecimiento y la expansión de linfocitos T. Antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir a un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire y CO2 al 5 %) apropiadas. Los linfocitos T que se han expuesto a diferentes tiempos de estimulación pueden presentar características diferentes.

En otra realización particular, dichas células pueden expandirse co-cultivando con tejidos o células. Dichas células también pueden ser para su uso en expansión in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula en el sujeto.

Aplicaciones terapéuticas

En otra realización, la célula aislada obtenida por los diferentes métodos o la línea celular procedente de dicha célula aislada como se describió anteriormente, puede utilizarse como un medicamento.

En otra realización, dicho medicamento puede utilizarse en el tratamiento de cáncer, particularmente para el tratamiento de linternas de linfocitos B y leucemia en un paciente que lo necesite.

En otra realización, dicha célula aislada según la invención o línea celular procedente de dicha célula aislada puede utilizarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesite. En una realización particular, se proporciona un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 como un medicamento para el tratamiento de LMA, de un subtipo de LMA, de una complicación relacionada con LMA, de una afección relacionada con LMA. En una realización preferida, como un medicamento, se proporciona un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 en el que dicho CAR anti-CD123 comprende la SEQ ID NO 44.

En otra realización, dicho medicamento puede utilizarse en el tratamiento de una afección patológica mediada por células que expresan CD123 o una afección caracterizada por la actividad directa o indirecta de una célula que expresa CD123. En otras palabras, la invención se refiere a un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 que comprende del 80% al 100% de la SEQ ID NO: 44 para su uso como medicamento para tratar una afección relacionada con la actividad perjudicial de células que expresan CD123, en particular para tratar una afección seleccionada de LMA, un subtipo de LMA, complicaciones relacionadas con LMA y afecciones relacionadas con LMA;

En otro aspecto, la presente invención se basa en métodos de tratamiento de pacientes que lo necesiten, comprendiendo dicho método al menos una de las siguientes etapas:

(a) proporcionar una célula inmunitaria obtenible por uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente; (b) administrar a dicho paciente dichas células inmunitarias transformadas,

En una realización, dichos linfocitos T de la invención pueden experimentar una fuerte expansión de linfocitos T in vivo y puede persistir durante un período de tiempo prolongado.

Dicho tratamiento puede ser mejorativo, curativo o profiláctico. Puede formar parte de un tratamiento de inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autóloga, se entiende que las células, la línea celular o la población de células utilizadas para tratar pacientes, se originan en dicho paciente o en un donante compatible con los antígenos leucocitarios humanos (HLA, Human Leucocyte Antigen). Por alogénica se entiende que las células o la población de células utilizadas para tratar pacientes, no se originan en dicho paciente sino en un donante.

En el apartado anterior se describen células que pueden utilizarse con los métodos desvelados. Dicho tratamiento puede utilizarse para tratar pacientes diagnosticados en los que una afección de cáncer pre-maligno o maligno se caracteriza por células que expresan CD123, especialmente por una sobreabundancia de células que expresan CD123. Dichas condiciones se encuentran en cánceres hematológicos, tales como leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos. El trastorno linfoproliferativo puede ser linfoma, en particular mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (células pequeñas y células grandes).

Los cánceres que pueden tratarse pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, incluyendo, pero sin limitación, LLA pre-B (indicación pediátrica), LLA en adultos, linfoma de células del manto, linfoma difuso de linfocitos B grandes y similares. Los tipos de cánceres a tratar con los CAR de la invención incluyen, pero sin limitación, leucemia o neoplasias linfoides. También se incluyen tumores/cánceres en adultos y tumores/cánceres en niños.

La presente divulgación proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por células que expresan CD123, en particular un cáncer hematológico mediado por células que expresan CD123, comprendiendo dicha composición dicho linfocito T anti-CD123 que expresa el linfocito T de la invención, preferentemente dicho CAR anti-CD123 es de SEQ ID NO: 44 o de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44.

Cualquier otro trastorno linfoproliferativo maligno mediado por CD123 o que implique CD123 desvelado en el presente documento, puede mejorarse con las células que expresan CAR anti-CD123 de la presente invención. En una realización preferida, el cáncer que puede tratarse utilizando las células que expresan CAR anti-CD123 de la presente invención es leucemia, una enfermedad asociada a leucemia o una complicación de la misma.

Las leucemias que pueden tratarse con las células que expresan CAR anti-CD123 de la presente invención, pueden ser leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.

La LMA o los subtipos de LMA que pueden tratarse utilizando las células que expresan CAR anti-CD123 de la presente invención, pueden ser, en particular, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda mínimamente diferenciada, leucemia mieloblástica aguda sin maduración, leucemia mieloblástica aguda con maduración granulocítica, leucemia promielocítica o promielocítica aguda (LPA), leucemia mielomonocítica aguda, mielomonocítica junto con eosinofilia de médula ósea, leucemia monoblástica aguda (M5a) o leucemia monocítica aguda (M5b), leucemias eritroides agudas, incluyendo eritroleucemia (M6a) y leucemia eritroide pura (M6b) muy rara, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia basófila aguda, panmielosis aguda con mielofibrosis, si intervienen células positivas para CD123.

Los subtipos de LMA también incluyen, tricoleucemia, leucemia linfoblástica aguda con cromosoma Filadelfia positivo.

La LMA puede clasificarse como LMA con anomalías genéticas específicas. La clasificación se basa en la capacidad del cariotipo para predecir respuestas a la terapia de inducción, a los riesgos de recaída, a la supervivencia.

En consecuencia, la LMA que puede tratarse utilizando las células que expresan CAR anti-CD123 de la presente invención, puede ser LMA con una translocación entre los cromosomas 8 y 21, LMA con una translocación o inversión en el cromosoma 16, LMA con una translocación entre los cromosomas 9 y 11, APL (M3) con una translocación entre los cromosomas 15 y 17, LMA con una translocación entre los cromosomas 6 y 9, LMA con una translocación o inversión en el cromosoma 3, LMA (megacarioblástica) con una translocación entre los cromosomas 1 y 22.

La presente invención es particularmente útil para el tratamiento de LMA asociada a estos marcadores citogenéticos particulares.

La presente invención también proporciona un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 para el tratamiento de pacientes con subconjuntos citogenéticos específicos de AML, tales como pacientes con t(15; 17)(q22; q21) identificados utilizando ácido holo transretinoico (ATRA)16-19 y para el tratamiento de pacientes con t(8; 21)(q22; q22) o inv(16)(pl3q22)/t(16; 16)(pl3; q22) identificados utilizando dosis repetitivas de citarabina a dosis altas.

Preferentemente, la presente invención proporciona un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 para el tratamiento de pacientes con aberraciones, tales como -5/del(5q), -7, anomalías de 3q, o un cariotipo complejo, que han demostrado tener tasas de remisión completa y supervivencia inferiores.

GRUPOS DE PACIENTES

En una realización preferida, la invención se proporciona para su uso en un tratamiento para la LMA en pacientes mayores de 60 años o en pacientes menores de 20 años.

En una realización más preferida, la presente invención se proporciona para su uso en un tratamiento pediátrico, en particular, un tratamiento pediátrico contra la LMA o enfermedades o complicaciones relacionadas con la AML. Aún en otra realización preferida, la presente invención se proporciona para su uso en un tratamiento en pacientes con LMA con un estado bajo, pobre o desfavorable, es decir, con un índice de supervivencia esperado inferior a 5 años. En este grupo, los pacientes que padecen LMA con las siguientes características citogenéticas: -5; 5q; -7; 7q-; 11q23; no t(9;11); inv(3); t(3;3); t(6;9); t(9; 22) se asocian a un estado de riesgo pobre (Byrd JC et al., 15 de diciembre de 2002; Blood: 100 (13) y están especialmente contemplados para tratarse según la presente invención o con un objeto de la presente invención.

En una realización, el linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 de la presente invención puede utilizarse como terapia de inducción, como terapia posterior a la remisión de la LMA o como terapia de consolidación en pacientes con LMA. Preferentemente, las células que expresan al menos un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44 son para uso como terapia posterior a la remisión de la LMA o como terapia de consolidación en pacientes con LMA.

En una realización, el linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 de la presente invención, puede utilizarse en caso de recaída de LMA, o en caso de LMA refractaria o resistente. Preferentemente, las células que comprenden al menos un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44 de la invención, son para su uso en pacientes con recaída de LMA o con LMA refractaria o resistente, más preferentemente, en combinación con al menos otro fármaco contra el cáncer

En otra realización preferida, al menos una célula que expresa un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44, es para uso en la prevención del desarrollo de células cancerosas que aparecen, en particular, después de un tratamiento contra el cáncer, durante la depleción de la médula ósea o antes de un trasplante de médula ósea, después de la destrucción de la médula ósea.

COMPLICACIONES DE LMA

En una realización particular, la invención proporciona un medicamento que mejora el estado de salud de un paciente, en particular, un paciente que padece una complicación relacionada con la LMA. Más preferentemente, dicho linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 modificado por ingeniería genética expresa al menos un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID NO: 44 y es para uso como un medicamento para el tratamiento de una complicación relacionada con LMA.

Una complicación o enfermedad relacionada con LMA puede incluir una fase previa de mielodisplasia, leucemia secundaria, en particular LMA secundaria, una cifra alta de leucocitos y ausencia de bastones de Auer. Entre otras, la leucostasis y la afectación del sistema nervioso central (SNC), la hiperleucocitosis, la enfermedad residual, también se consideran como una complicación o enfermedad relacionada con la LMA.

ENFERMEDADES ASOCIADAS A LMA

En una realización, la presente invención también proporciona un linfocito T que expresa un CAR anti-CD123 para el tratamiento de una afección patológica relacionada con LMA. Preferentemente, la presente invención proporciona una célula que expresa al menos un CAR anti-CD123 de SEQ ID NO: 1+ SEQ ID ⁿO: 44 para el tratamiento de una afección patológica relacionada con LMA. La presente invención se proporciona para su uso en una terapia para neoplasias mieloides relacionadas con la LMA, para leucemia mieloide aguda y síndrome mielodisplásico, un tratamiento de leucemia mieloide aguda recidivante o refractaria, un tratamiento de leucemia promielocítica aguda recidivante o refractaria en adultos, un tratamiento para la leucemia promielocítica aguda, un tratamiento de leucemia mieloide aguda en adultos mayores de 60 años.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de enfermedades asociadas a LMA, en particular neoplasia maligna hematológica relacionada con LMA.

La neoplasia maligna hematológica relacionada con afecciones de LMA incluye síndromes mielodisplásicos (SMD, antes conocido como "preleucemia"), que son una colección diversa de afecciones hematológicas reunidas por una producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides y el riesgo de transformación a AM.

En otra realización, la invención proporciona un medicamento que mejora el estado de salud de un paciente que padece mieloma múltiple.

Otras afecciones patológicas o síndromes genéticos asociados al riesgo de LMA pueden mejorarse con el uso adecuado de la presente invención, dichos síndromes genéticos incluyen síndrome de Down, trisomía, anemia de Fanconi, síndrome de Bloom, Ataxia-telangiectasia, Anemia de Diamond-Blackfan, Síndrome de Schwachman-Diamond, Síndrome de Li-Fraumeni, Neurofibromatosis de tipo 1, neutropenia congénita grave (también denominada síndrome de Kostmann)

Otras afecciones patológicas mediadas por CD123

Según otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de enfermedades mediadas por células CD123+. Estas enfermedades mediadas por células CD123+ incluyen inflamación, enfermedades autoinmunitarias.

En particular, la presente invención puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades mediadas por células CD123+ tales como inflamación de la mucosa gastrointestinal y más particularmente, enfermedades inflamatorias intestinales, alergia nasal, inflamación de la piel, como dermatomiositis juvenil, hematodermia.

La presente invención puede ser para su uso como un medicamento para el tratamiento de enfermedades mediadas por células CD123+, tales como enfermedades autoinmunitarias, en particular, enfermedad de Kikushi.

Preferentemente, la presente invención es para uso en un tratamiento para una infección recurrente que incluye infección debida a virus tales como el virus de Epstein-Barr, virus del herpes simple, en particular virus oncogénicos, HHV-8, HHV-6, HTLV o VIH, infecciones parasitarias, tales como infección por Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale o Plasmodium malariae.

En particular, la presente invención proporciona el uso en un tratamiento para la linfadenitis asociada al virus de Epstein-Barr, linfadenitis asociada al virus del herpes simple.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición para el tratamiento de la linfadenitis asociada a lupus eritematoso sistémico, tuberculosis, fibrosis quística, hepatitis, atresia biliar, en particular, hepatitis inducida por virus o atresia biliar en niños, hepatitis autoinmunitaria; cirrosis biliar primaria.

Composición que comprende linfocitos T modificados por ingeniería genética según la invención para uso como un medicamento y método

La presente divulgación también proporciona una composición para su uso o un método para tratar una enfermedad. En un aspecto, la enfermedad es un cáncer hematológico, en particular, un cáncer de células madre que incluye, pero sin limitación, leucemia (tal como leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico) y afecciones linfoproliferativas malignas, incluyendo linfoma (tal como mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular de células pequeñas y de células grandes), o una complicación de los mismos.

La presente divulgación también proporciona una composición para su uso o un método para inhibir la proliferación o reducir en un paciente una población o actividad de células que expresan CD123. Un método ejemplar incluye poner en contacto una población de células que comprende una célula que expresa CD123 con un linfocito T CAR CD123 de la invención que se une a la célula que expresa CD123.

En un aspecto más específico, la presente divulgación proporciona una composición para su uso o un método para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD123 en un paciente, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD123 con un linfocito T CAR CD123 de la invención que se une a la célula que expresa CD123, unir un linfocito T CAR CD123 de la invención con la célula cancerosa que expresa CD123, dando como resultado la destrucción de las células cancerosas que expresan CD123.

En determinados aspectos, el linfocito T CAR CD123 de la invención reduce la cantidad, el número, la cifra o el porcentaje de células y/o de células cancerosas en al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 65 %, al menos 75 %, al menos 85 %, al menos 95 % o al menos 99 % (a un nivel indetectable) en un sujeto con, o modelo animal para, leucemia mieloide u otro cáncer asociado a células que expresan CD123, en relación con un control negativo.

La presente divulgación también proporciona una composición para su uso o un método para prevenir, tratar y/o gestionar un trastorno o una afección asociado a células que expresan CD123 (por ejemplo, asociado a un cáncer hematológico), comprendiendo los métodos administrar, a un sujeto que lo necesite, un linfocito T CAR CD123 de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de trastornos asociados a células que expresan CD123 incluyen trastornos autoinmunitarios (tales como lupus), trastornos inflamatorios (tales como alergias, EII y asma) y cánceres (tales como cánceres hematológicos, en particular, LMA o complicaciones de LMA).

La presente divulgación también proporciona una composición para su uso o un método para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada a células que expresan CD123, comprendiendo el método, administrar a un sujeto que lo necesite, un linfocito T CAR CD123 de la invención que se una a la célula que exprese CD123. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de enfermedades asociadas a células que expresan CD123 incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), mielodisplasia, leucemia linfocítica aguda de linfocitos B, leucemia linfocítica aguda de linfocitos T, tricoleucemia, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas, leucemia mieloide crónica, linfoma de Hodgkin.

La presente divulgación proporciona una composición para su uso o un método para tratar o prevenir una recaída de cáncer asociado a células que expresan CD123, comprendiendo el método, administrar a un sujeto que lo necesite, un linfocito T CAR CD123 de la invención que se una a la célula que exprese CD123. En otro aspecto, los métodos comprenden administrar, al sujeto que lo necesite, una cantidad eficaz de un linfocito T CAR CD123 de la invención que se une a la célula que expresa CD123 en combinación con una cantidad eficaz de otra terapia.

En un aspecto, se considera que CD123 es un marcador de "células madre de cáncer" en la LMA. Por lo tanto, un linfocito T CAR CD123 de la invención puede impedir una recaída de LMA, o incluso tratar una LMA que sea principalmente CD123 negativa, aunque con una población de células CD123+ "madre" (células que expresan CD123).

En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones y métodos para tratar a sujetos que se han sometido a un tratamiento para una enfermedad o un trastorno asociado a niveles de expresión elevados de CD 19, y muestran una enfermedad o un trastorno asociado a niveles elevados de CD123.

En un aspecto, la leucemia linfocítica aguda (LLA) de linfocitos B es un ejemplo de enfermedad que requiere un tratamiento en serie utilizando linfocitos T CAR. Por ejemplo, el tratamiento con linfocitos T CAR anti-CD19 a veces puede producir una recaída negativa para CD19, que puede tratarse con los linfocitos T CAR anti-CD123 de la invención. Como alternativa, la presente invención incluye el doble direccionamiento de LLA-B utilizando linfocitos T CAR que comprenden un CAR anti-CD 19 y un CAR anti-CD 123.

El tratamiento con las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética según la invención puede ser en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

Preferentemente, el tratamiento con las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética según la invención puede administrarse en combinación con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) una o más terapias contra el cáncer seleccionadas de Aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trióxido de arsénico, ácido transretinoico, combinación de trióxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, y combinaciones de los mismos.

Según una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse en pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención se basa preferentemente en células o en poblaciones de células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de los linfocitos T según la invención en el paciente.

La administración de las células o de la población de células según la presente invención, puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo inhalación con aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en este documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intraganglionar, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática, o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones de células de la presente invención se administran preferentemente por inyección intravenosa.

La administración de las células o de las poblaciones de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como una sola dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración depende del criterio del médico tratante y de la afección clínica del paciente. Las células o población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como de un banco de sangre o de un donante. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficaces de un tipo de célula determinado para una enfermedad o afección particular, se incluye dentro de la experiencia de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, de la salud y del peso del receptor, del tipo de tratamiento concurrente, caso de haberlo, de la frecuencia del tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado.

En otra realización, dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende esas células, se administra por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En determinadas realizaciones de la presente invención, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como terapia antivírica, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizimab para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. Los linfocitos T de la invención pueden utilizarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos, u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la calcineurina fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factores de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). Las composiciones celulares pueden ser para la administración a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T utilizando agentes quimioterapéuticos tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida, o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. Las composiciones celulares pueden ser para la administración después de terapia ablativa de linfocitos B, tales como los agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de trasplante de células madre de sangre periférica. Después del trasplante, los sujetos pueden recibir una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas son para su administración antes o después de cirugía.

En determinadas realizaciones de la presente invención, las células que expresan CAR anti-CD123 se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) un fármaco seleccionado de Aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, y combinaciones de los mismos. En estas realizaciones, las células que expresan CAR anti-CD123 pueden ser resistentes al fármaco particular o a la combinación de fármacos que se administra (o administran) junto con células que expresan CAR anti-CD123.

En otras realizaciones de la presente invención, las células que expresan CAR anti-CD123 son para su administración a un paciente junto con un fármaco seleccionado de citarabina, antraciclinas, 6-tioguanina, hidroxiurea, prednisona, y combinaciones de las mismas.

Otras definiciones

- A menos que se especifique lo contrario, "uno(a)", "un", "el", "la", y "al menos uno(a)" se usan indistintamente y significan uno(a) o más de uno(a). En el presente documento, los restos de aminoácido en una secuencia polipeptídica se designan según el código de una letra, en donde, por ejemplo, Q significa resto de Gln o de glutamina, R significa resto de Arg o de arginina y D significa resto de Asp o de ácido aspártico.

- Sustitución de aminoácidos significa el reemplazo de un resto de aminoácido por otro, por ejemplo, el reemplazo de un resto de arginina con un resto de glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácido.

- Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: para designar la base de un nucleósido se utiliza el código de una letra: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

- Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" o "polinucleótidos" se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquier ligamiento, escisión, acción endonucleasa, y acción exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos de origen natural (tal como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos de origen natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en porciones de azúcar y/o en porciones de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones en azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Por otra parte, la porción de azúcar completa puede reemplazarse con estructuras que, desde el punto de vista estérico y electrónico, son similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en una porción de bases incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

- Por receptor antigénico quimérico (CAR) se entiende moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, un antígeno tumoral) con un dominio intracelular activador de receptores de linfocitos T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular anti-diana específica. Generalmente, el CAR consta de un anticuerpo monocatenario extracelular (scFv Fc) fusionado con el dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor antigénico de linfocitos T (scFv Fc:Z) y, cuando se expresa en linfocitos T, tiene la capacidad de redirigir el reconocimiento antigénico basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal. Un ejemplo de CAR utilizado en la presente invención es un CAR que se dirige contra el antígeno CD123 y puede comprender, como ejemplo no limitativo, las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 23 a 48. - El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo silvestre o variante capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferentemente una molécula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molécula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, pero reconocen y escinden la molécula de ADN o ARN en secuencias de polinucleótidos específicas, también se hace referencia a "secuencias diana" o "sitios diana". Por lo general, las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte raro cuando tienen un sitio de reconocimiento de polinucleótidos con una longitud de más de 12 pares de bases (pb), más preferentemente una longitud de 14-55 pb. Las endonucleasas de corte raro aumentan significativamente la HR induciendo roturas de doble cadena en el ADN (DSB, siglas del inglés double-strand breaks) en un locus definido (Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte raro pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa de dedo de cinc (ZFN, siglas del inglés Zinc-Finger nuclease) quimérica resultante de la fusión de dominios de dedos de cinc modificados por ingeniería genética con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005), una endonucleasa Cas9 del sistema CRISPR (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006). En las endonucleasas químicas, un cortador químico o peptídico se conjuga con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo así la actividad de escisión en una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también incluyen nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de escisión de ADN y oligonucleótidos formadores de triple hélices (TFO, siglas del inglés triplexforming oligonucleotides), que se sabe que se unen a secuencias específicas de ADN (Kalish y Glazer 2005). Dichas endonucleasas químicas están incluidas en el término "endonucleasa" según la presente invención.

- Por "nucleasa TALE" (NTALE) se entiende que es una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácido nucleico por lo general procedente de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. El dominio catalítico es preferentemente un dominio de nucleasa y más preferentemente un dominio que tiene actividad endonucleasa, como por ejemplo I-Tevl, ColE7, NucA y Fok-I. En una realización particular, el dominio TALE puede fusionarse con una meganucleasa como por ejemplo l-Crel y l-Onul o una variante funcional de las mismas. En una realización más preferida, dicha nucleasa es una Nucleasa TALE monomérica. Una Nucleasa TALE monomérica es una Nucleasa TALE que no requiere dimerización para un reconocimiento y escisión específicos, tales como las fusiones de las repeticiones TAL modificadas por ingeniería genética con el dominio catalítico de I-Tevl descritas en el documento WO2012138927. Un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) son proteínas de especies bacterianas del género Xanthomonas que comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, comprendiendo cada repetición direstos en la posición 12 y 13 (RVD) que son específicos para cada base de nucleótido de la secuencia dirigida al ácido nucleico. También pueden obtenerse dominios de unión con propiedades modulares de unión al ácido nucleico base por base (MBBBD, siglas del inglés modular base-per-base nucleic acid binding) similares de nuevas proteínas modulares recientemente descubiertas por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de mostrar más variabilidad de secuencia que las repeticiones TAL. Preferentemente, los RVD (siglas del inglés repeat variable-diresidue, direstos variables de repetición) asociados al reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD que reconocen C, NG que reconocen T, Nl que reconocen A, NN que reconocen G o A, NS que reconocen A, C, G o T, HG que reconocen T, IG que reconocen T, NK que reconocen G, HA que reconocen C, ND que reconocen C, HI que reconocen C, HN que reconocen G, NA que reconocen G, SN que reconocen G o A e YG que reconocen T, Tl que reconocen A, VT que reconocen A o G y SW que reconocen A. En otra realización, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutarse hacia otros restos de aminoácidos para modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y, en particular, para mejorar esta especificidad. La nucleasa TALE ya se ha descrito y utilizado para estimular el direccionamiento de genes y modificaciones génicas (Boch, Scholze et al.

2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). Las nucleasas TAL modificadas por ingeniería genética están disponibles en el comercio con el nombre TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 París, Francia).

La endonucleasa de corte raro según la presente invención también puede ser una endonucleasa Cas9. Recientemente, se ha desarrollado una nueva herramienta de diseño del genoma basada en la nucleasa Cas9 guiada por ARN (Gasiunas, Barrangou et al., 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) del sistema inmunoadaptativo CRISPR (grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares) procariota (para una revisión véase (Sorek, Lawrence et al. 2013)). El sistema asociado a CRISPR (Cas, siglas del inglés CRISPR Associated) se descubrió primero en bacterias y actúa como defensa contra ADN extraño, ya sea vírico o plasmídico. El diseño del genoma mediado por CRISPR se realiza primero mediante la selección de la secuencia diana a menudo flanqueada por un motivo de secuencia corta, denominado motivo adyacente al protoespaciador (PAM, siglas del inglés proto-spacer adjacent motif). Después de la selección de la secuencia diana, se diseña un crARN específico, complementario a esta secuencia diana. El crARN transactivador (tracrARN) requerido en los sistemas CRISPR de tipo II se emparejan con el crARN y se unen a la proteína Cas9 proporcionada. Cas9 actúa como un anclaje molecular que facilita el emparejamiento de bases de tracARN con ^cARⁿ(Deltcheva, Chylinski et al. 2011). En este complejo ternario, la doble estructura tracrARN:crARN actúa como un ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 a la secuencia diana afín. El reconocimiento de la diana por el complejo Cas9-tracrARN:crARN se inicia analizando la secuencia diana en busca de homología entre la secuencia diana y el crARN. Además de la complementariedad de la secuencia diana-crARN, el direccionamiento al ADN requiere la presencia de un motivo corto adyacente al protoespaciador (motivo adyacente al protoespaciador - PAM). Después del emparejamiento entre el ARN doble y la secuencia diana, seguidamente Cas9 introduce una rotura bicatenaria roma 3 bases cadena arriba del motivo PAM (Garneau, Dupuis et al., 2010).

La endonucleasa de corte raro puede ser una endonucleasa de asentamiento, también conocida con el nombre de meganucleasa. Estas endonucleasas de asentamiento se conocen bien en la técnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas de asentamiento reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura mono o bicatenaria. Las endonucleasas de asentamiento son muy específicas, reconocen sitios de ADN que varían de 12 a 45 pares de bases (pb) de longitud, variando generalmente de 14 a 40 pb de longitud. La endonucleasa de asentamiento según la invención puede corresponder, por ejemplo, a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH, o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa de asentamiento preferida según la presente invención puede ser una variante de I-Crel.

- Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" se entiende cualquier vector de suministro que pueda utilizarse en la presente invención para poner en contacto la célula (es decir, "contactar") o suministrar dentro de las células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducir") agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero sin limitación, vectores de suministro liposomal, vectores de suministro vírico, vectores de suministro de fármacos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipocomplejos, policomplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonido), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten suministrar moléculas, sustancias químicas, macromoléculas (genes, proteínas), u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de suministro son portadores de moléculas. Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" también se entiende que son métodos de suministro para realizar la transfección.

- Los términos "vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en la presente invención incluye, pero sin limitación, un vector vírico, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en un ácido nucleico cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles en el comercio.

Los vectores víricos incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa, como el ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva como el picornavirus y el alfavirus, y virus de ADN bicatenario que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, virus de la variolovacuna, de la viruela aviar y de la viruela del canario). Otros virus incluyen el virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: virus de la leucosis - sarcoma aviar, virus de mamífero de tipo C, de tipo B, de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por "vector de lentivirus" se entiende vectores de lentivirus basados en VIH que son muy prometedores para el suministro de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y a su capacidad para transducir de forma estable con alta eficacia una amplia gama de diferentes tipos de células. Los vectores de lentivirus generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Al igual que el VIH, los vectores de lentivirus entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas de la superficie vírica con receptores en la superficie celular. En la entrada, el ARN vírico sufre transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa vírico. El producto de la transcripción inversa es un ADN vírico lineal bicatenario, que es el sustrato para la integración vírica en el ADN de las células infectadas. Por "vectores de lentivirus (o VL) integradores", se entiende, como ejemplo no limitante, vectores que son capaces de integrarse en el genoma de una célula diana. Al contrario, por "vectores de lentivirus no integradores (o VLNI)" se entiende que son vectores eficaces de suministro de genes que no se integran el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores de suministro y los vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular, tal como la sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariota, células primarias y líneas celulares procedentes de estos organismos para el cultivo in vitro.

- Por "célula primaria" o "células primarias" se entiende células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para el crecimiento in vitro, que han sufrido muy pocas duplicaciones poblacionales y, por lo tanto, son más representativas de los principales componentes funcionales y características de los tejidos de los que proceden, en comparación con las líneas celulares tumorigénicas o inmortalizadas artificialmente continuas.

Como ejemplos no limitativos, las líneas celulares pueden seleccionarse del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también pueden utilizarse para detectar moléculas de interés biológicamente activas en investigación y producción y en varios campos, tal como el de las sustancias químicas, biocombustibles, agentes terapéuticos y en agronomía, como ejemplos no limitantes.

- Por "mutación" se entiende la sustitución, deleción, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar a la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o a la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- Por "variante(s)", se entiende una variante de repetición, una variante, una variante de unión al ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante polipeptídica obtenida por mutación o reemplazo de al menos un resto en la secuencia de aminoácidos de la molécula precursora.

- Por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o de un dominio de proteína; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína precursora o dominio de proteína o propiedades adicionales, o mayor o menor actividad.

- "Identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Para calcular la identidad entre dos secuencias, pueden utilizarse varios algoritmos y/o programas de alineamiento, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden utilizarse, por ejemplo, con parámetros predeterminados. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 70 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que muestran con preferencia sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

- La "similitud" describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. BLASTP también puede utilizarse para identificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia utilizando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique lo contrario, la puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación positiva de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. Las "Identidades" de BLASTP muestran el número y la fracción del total de restos en los pares de secuencias con alta puntuación que son idénticos; y la puntuación "Positiva" de BLASTP muestra el número y la fracción de restos para los cuales las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento se contemplan e incluyen en esta descripción. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares se deducen utilizando el código genético y pueden obtenerse por medios convencionales. Por ejemplo, una variante funcional de pTalfa puede tener un 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107. Un polinucleótido que codifica dicha variante funcional se produciría mediante la traducción inversa de su secuencia de aminoácidos utilizando el código genético.

- "Dominio de transducción de señal" o "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígenos que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, a través de la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, actúa como mediadora en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero sin limitación, CD7, B7-1 (^cD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, un ligando coestimulador inducible (ICOS-L), una molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también incluye, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitación, CD27, ^cD28, 4-IBB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, actuando así como mediadora en una respuesta coestimuladora en la célula, tal como, pero sin limitación, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando de Toll.

Una "señal coestimuladora" como se usa en este documento se refiere a una señal, que en combinación con una señal primaria, tal como ligamiento de TCR/CD3, conduce a la proliferación de linfocitos T y/o a la regulación positiva o negativa de moléculas clave.

La expresión "dominio de unión a ligando extracelular", como se usa en el presente documento, se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferentemente, el dominio será capaz de interaccionar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede seleccionarse para que reconozca un ligando que actúe como un marcador de superficie celular en células diana asociadas a una patología particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones causadas por virus, bacterias y parásitos, enfermedades autoinmunitarias y células cancerosas.

El término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, incluye a todos los miembros del reino animal, incluidos los primates no humanos y los seres humanos.

El término "recidivante" se refiere a una situación en la que un sujeto o un mamífero, quien ha tenido una remisión de cáncer después de una terapia tiene un retorno de células cancerosas.

La expresión "refractario o resistente" se refiere a una circunstancia en la que un sujeto o un mamífero, incluso después de un tratamiento intensivo, tiene células cancerosas residuales en su cuerpo.

La expresión "resistencia a fármacos" se refiere a la situación en la que una enfermedad no responde al tratamiento con uno o más fármacos. La resistencia al fármaco puede ser intrínseca (o resistencia primaria), lo que significa que la enfermedad nunca ha respondido al fármaco, o fármacos, o puede ser adquirida, lo que significa que la enfermedad deja de responder a uno o más fármacos a los que la enfermedad había respondido anteriormente (resistencia secundaria). En ciertas realizaciones, la resistencia al fármaco es intrínseca. En ciertas realizaciones, la resistencia al fármaco es adquirida.

La expresión "neoplasia maligna hematológica" o "cáncer hematológico" se refiere a un cáncer de la médula ósea y/o tejido linfático del cuerpo. Como ejemplos de neoplasias malignas hematológicas se incluyen, por ejemplo, mielodisplasia, leucemia, linfomas, tales como linfomas cutáneos, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin (también denominada linfoma de Hodgkin) y mieloma, tal como la leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia neutrofílica crónica (LNC), leucemia indiferenciada aguda (LIA), linfoma anaplásico de células grandes (LACG), leucemia prolinfocítica (LPL), leucemia mielomonocítica juvenil (LMMJ), LLA de linfocitos T en adulto, LMA con mielodisplasia de tres linajes (LMA/TMDS), leucemia de linaje mixto (LLM), síndromes mielodisplásicos (SMD), trastornos mieloproliferativos (TMP) y mieloma múltiple (MM).

El término "leucemia" se refiere a neoplasias malignas de los tejidos formadores de sangre, incluyendo, pero sin limitación, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica o leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda o leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia mieloblástica aguda.

La descripción de la invención, escrita anteriormente, proporciona una manera y un proceso para realizarla y utilizarla de tal manera que cualquier experto en esta materia pueda fabricarla y utilizarla, proporcionándose esta implementación en particular para la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas, que constituyen una parte de la descripción original.

Cuando en el presente documento se indique un límite o un intervalo numérico, se incluyen los extremos. Asimismo, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si se escribieran explícitamente.

Habiendo descrito la presente invención en general, se puede obtener una comprensión adicional por referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento con fines únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos a menos que se especifique lo contrario.

MÉTODO GENERAL

- Cultivos de linfocitos T primarios

Los linfocitos T se purificaron de muestras de capa leucocitaria proporcionadas por el EFS (Etablissement Fran^ais du Sang, París, Francia) utilizando medio de densidad de gradiente Ficoll. La capa de CMSP (células mononucleares de sangre periférica) se recuperó y los linfocitos T se purificaron utilizando un kit de enriquecimiento de linfocitos T disponible en el comercio. Los linfocitos T purificados se activaron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con IL-2 humana 20 ng/ml, suero humano al 5 % y activador de linfocitos T CD3/CD28 humanos con Dynabeads a una relación de perlas:células de 1: 1 (Life Technologies).

- Transfección de ARNm de CAR

Las transfecciones se realizaron el día 4 o el día 11 después de la purificación y activación de los linfocitos T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 pg de ARNm que codificaba las diferentes construcciones de CAR. Los ARNm de CAR se produjeron utilizando transfecciones de ARNm polimerasa de T7 realizadas con tecnología Cytopulse, aplicando dos pulsos de 0,1 mS a 3000 V/cm seguido de cuatro pulsos de 0,2 mS a 325 V/cm en cubetas con un espacio de 0,4 cm en un volumen final de 200 j l de "tampón T Cytoporation" (Aparato BTX Harvard). Las células se diluyeron inmediatamente en medio X-Vivo™-15 y se incubaron a 37 °C con CO2.al 5 %. Dos horas después de la electroporación, se añadió IL-2 a 20 ng/ml.

- Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)

Los linfocitos T se incubaron en placas de 96 pocillos (40000 células/pocillo), junto con una misma cantidad de células que expresaban varios niveles de proteína CD123. Los co-cultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 j l de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 6 horas a 37 °C con CO2 al 5%. La tinción de CD107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo anti-CD107a fluorescente al comienzo del co cultivo, junto con 1 jg/ml de anti-CD49d, 1 jg/ml de anti-CD28 y solución de Monensina 1x. Después de un período de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable y anti-CD8 conjugado con fluorocromo y se analizaron mediante citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (IFM) para la tinción de CD107a entre células ^cD8+. Los ensayos de desgranulación se realizaron 24 h después de la transfección de ARNm.

- Ensayo de liberación de IFN gamma

Los linfocitos T se incubaron en placas de 96 pocillos (40000 células/pocillo), junto con líneas celulares que expresaban varios niveles de la proteína CD123. Los co-cultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 j l de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este período de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes se recuperaron en una nueva placa. La detección de IFN gamma en los sobrenadantes de los cultivos celulares se realizó mediante un ensayo ELISA. Los ensayos de liberación de IFN gamma se realizaron iniciando los co-cultivos celulares 24 h después de la transfección de ARNm.

- Ensayo de citotoxicidad

Los linfocitos T se incubaron en placas de 96 pocillos (100000 células/pocillo), junto con 10000 células diana (que expresaban CD123) y 10000 células de control (CD123neg) en el mismo pocillo. Las células diana y las de control se marcaron con colorantes intracelulares fluorescentes (CFSE o violeta Cell Trace) antes de cultivarlas conjuntamente con los linfocitos T CAR+. Los co-cultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este período de incubación, las células se marcaron con un colorante de viabilidad fijable y se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control CD123neg) y se calculó el % específico de lisis celular. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron 48 h después de la transfección de ARNm.

- Transducción de linfocitos T

La transducción de linfocitos T con vectores de lentivirus recombinantes para la expresión de CAR, se realizó tres días después de la purificación/activación de los linfocitos T. La detección de CAR en la superficie de los linfocitos T se realizó utilizando una proteína recombinante que consistía en la fusión del dominio extracelular de la proteína CD123 humana, junto con un fragmento de Fc de IgG1 de murino. La unión de esta proteína con la molécula CAR se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo que se dirige a la parte Fc de la proteína de ratón, y se analizó mediante citometría de flujo.

- Modelo de ratón antitumoral

Como un modelo de ratón de xenoinjerto de LMA, a ratones NOG inmunodeficientes se les inyectó por vía intravenosa (iv) células MOLM13-Luciferasa que expresaban CD123. Opcionalmente, los ratones recibieron un tratamiento contra el cáncer. Después, a los ratones se les inyectó por vía iv (ya sea 2 o 7 días después de la inyección de la línea de células tumorales) diferentes dosis de linfocitos T CAR+ a analizar, o linfocitos T que no se transdujeron con el vector de lentivirus CAR. Las señales bioluminiscentes se determinaron el día de la inyección de los linfocitos T (DO), en D7,14, 21, 28 y 40 después de la inyección de linfocitos T para seguir la progresión tumoral en los diferentes animales.

Ejemplos

Ejemplo 1: Proliferación de células inactivadas con TCRalfa que expresan un CAR CD123.

Se diseñaron y produjeron nucleasas TALE heterodiméricas que se dirigían a dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas semidianas) separadas por un espaciador de 15 pb dentro del gen de la región de la cadena constante alfa del receptor de linfocitos T (TRAC). Cada semidiana se reconoce mediante repeticiones de las seminucleasas TALE enumeradas en la Tabla 10.

T l 1 l TAL iri i l n T R lf

Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó utilizando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor de T7. El ARNm que codifica la secuencia genómica de TRAC que escinde la nucleasa TALE se sintetizó a partir del plásmido que llevaba la secuencia codificante cadena abajo del promotor de T7.

Linfocitos T purificados, preactivados durante 72 horas con perlas recubiertas con antiCD3/CD28, se transfectaron con cada uno de los 2 ARNm que codificaban ambas seminucleasas TALE TRAC_T01. Cuarenta y ocho (48) horas después de la transfección, diferentes grupos de linfocitos T del mismo donante se transdujeron respectivamente con un vector lentivírico que codificaba uno de los CAR CD-123 descritos anteriormente (SEQ ID NO: 23 a 48). Dos (2) días después de la transducción, las células CD3neg se purificaron utilizando perlas magnéticas anti-CD3 y 5 días después de la transducción las células se reactivaron con anti-CD28 soluble (5 pg/ml).

La proliferación celular se siguió hasta 30 días después de la reactivación contando las células 2 veces a la semana. En comparación con las células no transducidas, se observó un aumento de la proliferación en células inactivadas con TCR alfa que expresaban los CAR CD-123, especialmente cuando se reactivaban con anti-CD28.

Para investigar si los linfocitos T humanos expresaban el estado activado de presentación de CAR CD123, se analizó la expresión del marcador de activación CD25 mediante FACS, 7 días después de la transducción. Las células purificadas transducidas con el vector lentivírico que codificaba el CAR CD-123, se sometieron a ensayo para determinar la expresión de CD25 en su superficie para evaluar su activación en comparación con las células no transducidas. Se esperaba expresión aumentada de CD25 en condiciones tanto de reactivación como de no reactivación de CD28.

EJEMPLO 2:

Construcción de CAR CD123 utilizando varios fragmentos de anticuerpos anti-CD123

- Cultivos de linfocitos T primarios

Los linfocitos T se purificaron de muestras de capa leucocitaria proporcionadas por el EFS (Etablissement Fran^ais du Sang, París, Francia) utilizando un medio de densidad de gradiente Ficoll (Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences). La capa de CMSP se recuperó y los linfocitos T se purificaron utilizando un kit de enriquecimiento de linfocitos T disponible en el comercio (Stem Cell Technologies). Los linfocitos T purificados se activaron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con IL-2 humana 20 ng/ml (Miltenyi Biotech), suero humano al 5% (Sera Laboratories) y activador de linfocitos T CD3/CD28 humanos con Dynabeads a una relación de perlas:células de 1: 1 (Life Technologies). Después de la activación, las células se cultivaron y se mantuvieron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con IL-2 humana 20 ng/ml (Miltenyi Biotec) y suero humano al 5 % (Sera Laboratories) - Transfección de ARNm de CAR

Las transfecciones se realizaron el día 4 o el día 11 después de la purificación y activación de los linfocitos T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 pg de ARNm que codificaba las diferentes construcciones de CAR. Los ARNm de CAR se produjeron utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (Life Technologies) y se purificaron utilizando columnas RNeasy Mini Spin (Qiagen). Las transfecciones se realizaron utilizando tecnología Cytopulse, aplicando dos pulsos de 0,1 mS a 3000 V/cm seguido de cuatro pulsos de 0,2 mS a 325 V/cm en cubetas con un espacio de 0,4 cm en un volumen final de 200 pl de "tampón T Cytoporation" (Aparato BTX Harvard). Las células se diluyeron inmediatamente en medio X-Vivo™-15 (Lonza) y se incubaron a 37 °C con CO2.al 5%. Dos (2) horas después de la electroporación, se añadió IL-2 (de Miltenyi Biotec) a 20 ng/ml.

- Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)

Los linfocitos T se incubaron en placas de 96 pocillos (40000 células/pocillo), junto con una misma cantidad de células que expresaban o no la proteína CD123. Los co-cultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 6 horas a 37 °C con CO2 al 5%. La tinción de CD107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo anti-CD107a fluorescente (conjugado con APC, de Miltenyi Biotec) al comienzo del co-cultivo, junto con 1 pg/ml de anti-CD49d (BD Pharmingen), 1 pg/ml de anti-CD28 (Miltenyi Biotec) y solución de Monensina 1x (eBioscience). Después de un período de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable (eFluor 780, de eBioscience) y anti-CD8 conjugado con fluorocromo (Miltenyi Biotec conjugado con PE) y se analizaron mediante citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (IFM) para la tinción de CD107a entre células CD8+. Los ensayos de desgranulación se realizaron 24 h después de la transfección de ARNm.

- Ensayo de liberación de IFNgamma

Los linfocitos T se incubaron en placas de 96 pocillos (40000 células/pocillo), junto con líneas celulares que expresaban o no la proteína CD123. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este período de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes se recuperaron en una nueva placa. La detección de IFN gamma en los sobrenadantes de los cultivos celulares se realizó mediante un ensayo ELISA (kit ELISA Quantikine de IFN-gamma humano, de R&D Systems). Los ensayos de liberación de IFN gamma se realizaron iniciando los co-cultivos celulares 24 h después de la transfección de ARNm.

- Ensayo de citotoxicidad

Los linfocitos T se incubaron en placas de 96 pocillos (100000 células/pocillo), junto con 10000 células diana (que expresaban CD123) y 10000 células de control (CD123neg) en el mismo pocillo. Las células diana y las de control se marcaron con colorantes intracelulares fluorescentes (CFSE o violeta Cell Trace, de Life Technologies) antes de cultivarlas conjuntamente con los linfocitos T CAR+. Los co-cultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este período de incubación, las células se marcaron con un colorante de viabilidad fijable (eFluor 780, de eBioscience) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control CD123neg) y se calculó el % específico de lisis celular. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron 48 h después de la transfección de ARNm.

RESULTADOS

Para generar receptores antigénicos quiméricos (CAR) y para explorar su actividad de desgranulación hacia células CD123+, se utilizaron 6 scFv diferentes de 7G3, 32716, Klon 4312F1, 26292 y Old4.

Se diseñaron diferentes arquitecturas (Figura 2 y Figura 3) y su actividad se determinó después de la expresión transitoria en linfocitos T humanos (Figura 5, Figura 6, Figura 7 y Figura 8).

Los linfocitos T se purificaron de muestras de capa leucocitaria y se activaron utilizando perlas de CD3/CD28. Cuatro (4) días después de la activación, las células se transfectaron con los ARNm que codificaban las diferentes moléculas cAr (utilizando electroporación PulseAgile) y 24 h después de la transfección se evaluó la actividad de desgranulación.

Los resultados ilustrados en las Figuras 4 y 5 muestran la actividad de desgranulación de los 6 scFv diferentes de una sola arquitectura (v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana), cuando los linfocitos T CAR+ se cultivaron conjuntamente durante 6 horas con células que expresaban CD123 (RPMI8226), o con células que no expresaban CD123 (K562). Las barras blancas corresponden a señales de desgranulación observadas en linfocitos T que se cultivaron solos, las barras negras representan las señales observadas cuando los linfocitos T se cultivaron conjuntamente con células RPMI8226 y las barras grises muestran las señales de desgranulación de los linfocitos T cultivados conjuntamente con células K562.

La figura 4 muestra la actividad de desgranulación en porcentaje (%) de la desgranulación de los 6 scFv diferentes de una sola arquitectura (v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana), cuando los linfocitos T CAR+ se cultivaron conjuntamente durante 6 horas con células que expresaban CD123 (RPMI8226), o con células que no expresaban CD123 (K562).

La figura 5 muestra la actividad de desgranulación (linfocitos CD107a+) en intensidad de fluorescencia media (IFM) de linfocitos T CAR después de 6 h de cultivo conjunto con linfocitos CD123neg (K562) o con linfocitos que expresan niveles altos o bajos de CD123 (RPMI8226 y KG1a, respectivamente). Los resultados representan los valores medios de tres experimentos independientes.

Sorprendentemente, los resultados muestran que, aunque 7G3 es un anticuerpo anti-CD123 que muestra una fuerte afinidad y avidez y eficacia in vivo (Jin et al., 2009; Cell Stem Cell 5, 31-42), los linfocitos T CAR CD123 procedentes de 7G3, no eran activos en la presente configuración experimental.

Las células que expresaban CAR de 26292, 32716 y Klon43, mostraron una fuerte actividad en comparación con el control ficticio, siendo las células que expresaban el CAR de Klon43 las más activas.

Curiosamente, mientras que las células que expresan CAR 26292 y las células que expresan CAR 32716 fueron ligeramente activas hacia células que no expresan CD123 (K562) (barras grises), la actividad de las células que no expresan CD123 hacia Klon43 fue comparable a la de los linfocitos T ficticios.

Entre las moléculas de CAR generadas como se ilustra en la figura 2, 8 de ellas se seleccionaron para realizar ensayos de actividad adicionales (figura 6, figura 7 y figura 8).

Construcción de CAR CD123 utilizando fragmentos de anticuerpo scFv anti-CD123 procedentes de Klon43, 12F1,32716 y 26292, y análisis funcional

Para ello, linfocitos T se aislaron de muestras de capa leucocitaria y se activaron utilizando perlas de CD3/CD28. Las células se transfectaron transitoriamente con los ARNm que codificaban los diferentes candidatos en Dll después de la activación. La actividad CAR se evaluó midiendo su capacidad de desgranulación, la liberación de IFN gamma y la actividad citotóxica cuando se cultivan conjuntamente con células que expresan o no CD123.

La figura 6 muestra la actividad de desgranulación (linfocitos CD107a+) de linfocitos T CAR después de 6 h de cultivo conjunto con linfocitos CD123neg (K562) o con linfocitos que expresaban niveles altos o bajos de CD123 (RPMI8226 y KG1a, respectivamente). Los co-cultivos se iniciaron 24 h después de la electroporación de ARNm de CAR. Los resultados representan los valores medios de tres experimentos independientes.

La figura 7 muestra la cantidad de IFN gamma liberada por los linfocitos T cuando se cultivan conjuntamente durante 24 horas con células que expresan diferentes niveles de CD123 (KG1a o RPMI8226), o con células que no expresan CD123 (K562). También se muestra, la liberación de IFN gamma de los linfocitos T cultivados solos, en las mismas condiciones que los cocultivos. Los experimentos se realizaron con tres donantes independientes, y aquí se muestran los resultados de un donante representativo.

La figura 8 muestra la actividad citolítica específica de linfocitos T CAR. Los ensayos se realizaron 48 h después de la transfección de ARNm de CAR. Los linfocitos T se cultivaron conjuntamente con células K562+KG1a o K562+RPMI8226 durante 4 horas. Al final del cocultivo, se determinó la viabilidad celular de cada una de las líneas celulares y se calculó un porcentaje específico de lisis celular.

Todas las construcciones eran activas, presentando el CAR de Klon 43 V3 y el CAR 32716V3 la mayor actividad en comparación con el control que otros ^cA^rS.

- Transducción de linfocitos T

La transducción de linfocitos T con vectores de lentivirus recombinantes para la expresión de CAR, se realizó tres días después de la purificación/activación de los linfocitos T. Los vectores de lentivirus se produjeron en Vectalys SA (Toulouse, Francia) mediante transfección de plásmidos genómicos y auxiliares en células HEK-293. Las transducciones se realizaron a una multiplicidad de infección de 5, utilizando 106 células por transducción. La detección de CAR en la superficie de los linfocitos T se realizó utilizando una proteína recombinante que consistía en la fusión del dominio extracelular de la proteína CD123 humana junto con un fragmento de Fc de IgG1 de murino (producido por LakePharma). La unión de esta proteína con la molécula CAR se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con PE (Jackson Immunoresearch) que se dirige a la parte Fc de la proteína de ratón, y se analizó mediante citometría de flujo.

Dos candidatos CAR, es decir, CAR Klon 43 V3 y CAR 32716V3, se seleccionaron y clonaron en un vector de lentivirus, en el cual la expresión del CAR se acopla a la BFP (Blue Fluorescent Protein, proteína fluorescente azul) a través de un péptido 2A, y es impulsada por un promotor EF1a. En la figura 9, panel superior, se muestra una representación esquemática del vector de lentivirus. Los linfocitos T se aislaron de muestras de capa leucocitaria, se activaron con perlas de CD3/CD28 y se transdujeron 3 días después de la activación con los vectores de lentivirus, a una MOI (siglas del inglés multiplicity ofinfection, multiplicidad de infección) de 5.

La detección del CAR se realizó utilizando una proteína de fusión en la que el dominio extracelular de la proteína CD123 humana se fusionó con un fragmento de Fc procedente de IgG1 de ratón. La unión del CAR en la superficie celular con la parte CD123 de la proteína de fusión se detectó con un anticuerpo anti-Fc conjugado con PE y se analizó mediante citometría de flujo. La figura 9 representa el % de células que expresan CAR+ o proteína fluorescente azul (BFP+, Blue Fluorescent Protein) (medido mediante análisis FACS) el Día 8 o 10 después de la transducción de dos donantes diferentes.

Los ensayos de actividad se realizaron entre D10 y 12 después de la transducción:

La figura 10 representa la actividad de desgranulación contra diferentes líneas celulares de células transducidas. Las células Daudi y K562 no expresan CD123, mientras que KG1a, MOLM13 y RPMI8226 expresan diferentes niveles de CD123 (KG1a<MOLM13<RPMI8226). En el panel superior se da el % de linfocitos cD107a+ (entre los linfocitos CD8+) de tres donantes independientes y en el panel inferior se muestra la intensidad de la tinción de CD107a de un donante representativo. NTD significa células No Transducidas.

De nuevo, los datos muestran que la actividad (desgranulación figura 10 o lisis de linfocitos CD123+ figura 11) de las células que expresan CAR anti-CD123 procedentes de Klon 43 V3, es equivalente a la de 32716V3 (figura 10 y figura 11).

Lo que es más sorprendente, las células que expresan CAR procedentes de 32716V3 mostraron una actividad de fondo más fuerte (actividad contra células que no expresan CD123, DAUDI y K562) que las células que expresan CAR procedentes de Klon 43 V3 (figura 10 y figura 11).

Las células que expresan CAR procedentes de Klon 43 V3, tenían una actividad más específica y una actividad ligeramente, aunque significativamente, más alta que la de las células que expresan CAR procedentes de 32716V3 (figura 10, figura 11 y figura 12) en particular hacia células RPMI8226 que expresan el nivel más alto de CD123. (Véase la figura 13 y la figura 14)

La figura 11 muestra la liberación de IFN gamma después de 24 horas de cultivo conjunto de linfocitos T CAR con diferentes líneas celulares.

La figura 12 muestra la actividad citolítica específica de linfocitos T CAR. Los linfocitos T se cultivaron conjuntamente con células Daudi+MOLM13 o Daudi+RPMI8226 durante 4 horas. Al final del cocultivo, se determinó la viabilidad celular de cada una de las líneas celulares y se calculó un porcentaje específico de lisis celular. Los resultados representan resultados obtenidos en al menos dos donantes independientes.

Los resultados indican que, en los linfocitos T que expresan de manera estable el CAR, Klon43-v3 muestra una actividad ligeramente más alta que la de 32716-v3 en todos los ensayos de actividad. Además, se observó actividad de fondo en los ensayos de desgranulación y liberación de IFNgamma, cuando los linfocitos T que expresan el CAR 32716-v3 se cultivaron solos o en presencia de células que no expresaron CD123. Esto no se observó en linfocitos T que expresaban el CAR Klon43-v3. Por estos motivos, el CAR Klon43-v3 se seleccionó para realizar experimentos antitumorales in vivo en un modelo de ratón.

Las figuras 13 y 14 muestran una actividad de desgranulación de respuesta a la dosis para cada uno de los CAR utilizados. Placas de 96 pocillos se recubrieron con diferentes dosis de proteína CD123-Fc (la misma que la utilizada para la detección de linfocitos T CAR+, véase la leyenda de la figura 5), y las células se cultivaron durante 6 h en esta placa en presencia de anticuerpo CD107a fluorescente. Los resultados muestran la actividad de desgranulación (de células CD107a+ (figura 13) y la intensidad de la señal CD107a (figura 14) en células CD8+, respectivamente). EJEMPLO 3 Modelo de ratón antitumoral

Como un modelo de ratón de xenoinjerto de LMA, a ratones NOG inmunodeficientes se les inyectó por vía intravenosa (iv) células M0LM13-Luciferasa. Para establecer la línea celular MOLM13-Luc, se adquirieron ratones NOG (NOD.Cg-Prkdcscidll2rgtmlSug/JicTac) de 6-8 semanas de vida en Taconic (Ry, Dinamarca), células MOLM13 (DSMZ ACC 554) se transdujeron con un lentivirus que codifica la GFP y la luciferasa de luciérnaga (amsbio LVP438-PBS). Las células positivas para GFP se seleccionaron con neomicina (ref. 10131-027, Gibco, Life Technologies, Saint-Aubin, Francia). Para información, la línea celular MOLM13 se ha establecido a partir de la sangre periférica de un hombre de 20 años con leucemia mieloide aguda LMA FAB M5a en la recaída en 1995 después de síndromes mielodisplásicos iniciales (SMD, anemia refractaria con exceso de blastos, AREB).

A los ratones se les inyectó después, por vía iv (2 o 7 días después de la inyección de la línea celular tumoral), diferentes dosis de linfocitos T CAR+ (CAR Klon43-v3) o de linfocitos T que no se transdujeron con el vector de lentivirus de CAR. Las señales bioluminiscentes se determinaron el día de la inyección de linfocitos T (DO) o en D7, 14, 21, 28 y 40 después de la inyección de linfocitos T para seguir la progresión tumoral en los diferentes animales. La instalación de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron en Oncodesign (Dijon, Francia; http://www.oncodesign.com/), según el Reglamento francés y europeo y la Guía NRC para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

RESULTADOS

La figura 15 muestra la actividad in vivo de los linfocitos T que expresan el CAR de Klon43-v3.

A ratones inmunodeficientes se les inyectó células MOLM13-Luciferasa 2 o 7 días antes de la inyección de linfocitos T humanos no transducidos, o diferentes dosis de linfocitos T CAR+ anti-CD123. Los resultados representan la señal bioluminiscente observada en diferentes puntos de tiempo después de la inyección de linfocitos T (media de 4 ratones en cada grupo, excepto para G12, donde 1 de los 4 ratones murieron entre los días 21 y 28).

Los datos muestran que el objeto de la presente invención puede utilizarse contra células cancerosas CD123+, para el tratamiento de células de leucemia humana con cáncer CD123+.

7G3-4 (S E Q ID NO: 1 S E Q ID NO: 26 )

G3-6 (SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 28)

Old4-3 (SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 29)

MALPVTALLLPLALLLHAARP WTWRFLFVVAAATGVQSQVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFST YAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGG SGPDVLDIWGQGTMVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSMDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQ SPSLLSASTGDRVTISCRMSQGIRSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ SEDFATYYCQQYYSFPYTFGQGTKLEIKRTVrrTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVK FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

26292-2 (S E Q ID NO: 1 S E Q ID NO : 31)

26292-5 (SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 34)

32716-2 (S E Q ID NO: 1 S E Q ID NO : 37)

32716-5 (SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 40)

Klo43-5 (SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 46)

Ċ

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor antigénico quimérico (CAR) específico de CD123, que tiene una estructura polipeptídica que comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (V^l) de un anticuerpo monoclonal anti-CD123, una bisagra de FcyRIIIa, CD8a o IgG1, un dominio transmembrana CD8a, y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 Z y un dominio coestimulador de 4-1BB, en donde dicha Vh comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 67, 68 y 69 y dicha Vl comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72.

2. El CAR específico de CD123 según la reivindicación 1, en donde dicho CAR tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46, respectivamente.

3. El CAR específico de CD123 según la reivindicación 1, en donde dicho CAR comprende una bisagra de CD8a y tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 44.

4. El receptor antigénico quimérico específico de CD123 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas V^hy V^lcomprenden las secuencias

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGFTFTDYYXXXXXXXXXXXXXXXXXIRSKAD GYTTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXARDAAYYSYYSPEGAMDYXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 73) y XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQNVDSAXXXXXXXXXXXXXXXXXSASXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQQYYSTPWTXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 74), respectivamente, en donde X es un aminoácido.

5. El CAR específico de CD123 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas Vh y Vl tienen una identidad de al menos 80 % con las SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente.

6. El receptor antigénico quimérico específico de CD123 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha V^htiene una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 65 y 66 y dicha V^ltiene una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 y 59.

7. El CAR específico de CD123 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que adicionalmente comprende un péptido señal, preferentemente de SEQ ID ⁿO: 1 o SEQ ID NO: 2.

8. Un polinucleótido que codifica un receptor antigénico quimérico específico de CD123 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa en la membrana de la superficie celular un receptor antigénico quimérico específico de CD123 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la reivindicación 9, procedente de linfocitos T, opcionalmente resistente a un fármaco contra el cáncer y que lleva una deleción en un gen que codifica un TCR alfa o un TCR beta.

11. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la reivindicación 9 o 10, en donde la expresión de al menos una proteína del MHC, preferentemente p2m o HLA, se suprime en dicha célula inmunitaria.

12. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicha célula está mutada para conferir resistencia a al menos un fármaco inmunosupresor, un fármaco quimioterapéutico o un fármaco contra el cáncer.

13. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para su uso en terapia.

14. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para su uso en terapia de leucemia, en donde dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.

15. La célula modificada por ingeniería genética para su uso en terapia según la reivindicación 14, en donde la leucemia es leucemia mielógena aguda (LMA).

16. La célula modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para uso en terapia de linfoma, en donde dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (células pequeñas y células grandes).