TW201934575A - 一種分離的嵌合抗原受體以及包含其的修飾t細胞及用途 - Google Patents
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Abstract
本公開涉及一種分離的嵌合抗原受體以及包含其的修飾T細胞及用途。具體地,本公開涉及結合CD19的嵌合抗原受體,基於CRISPR-Cas9系統體外剔除T細胞中TARC、B2M和PD-1基因的方法,該方法中使用的crRNA以及根據本公開的方法獲得的基因剔除的T細胞及其用途。
Description
本公開屬於生物醫藥領域。具體地,涉及一種嵌合抗原受體、包含嵌合抗原受體的細胞以及其用途。
這裡的陳述僅提供與本發明有關的背景信息,而不必然地構成現有技術。
淋巴系統惡性腫瘤包括淋巴細胞白血病和淋巴瘤,是發生在B細胞、T細胞及NK細胞等淋巴細胞上的腫瘤。目前在治療上存在許多困難,特別是臨床上常常遇到的疾病復發和難治。近10多年來,淋巴系統腫瘤的臨床治療取得了很大進展,抗CD20單抗廣泛應用於CD20陽性的B細胞非霍奇金淋巴瘤,取得良好的療效,已經成為臨床一線用藥。但是,由於有部分B淋巴瘤和急慢性B淋巴母細胞白血病的細胞不表達CD20,美羅華一類的抗CD20抗體對其無明顯治療作用,因此迫切需要一種新的治療方法來提高淋巴瘤和急慢性淋巴細胞白血病的治癒率。
嵌合抗原受體T細胞(CAR-T或CART),藉由基因修飾使T淋巴細胞表達特定的CAR,該細胞可以特異性識別靶抗原,殺傷靶細胞。CAR-T細
胞具備針對特定腫瘤抗原的高度親和特性,從而能高效殺傷表達該抗原的腫瘤細胞。CD19在不同分化階段的B淋巴細胞表面均有特異性表達,B細胞淋巴瘤和B淋巴細胞白血病均表達CD19抗原。因此,構建識別CD19嵌合抗原受體的CART細胞,可以達到對B淋巴細胞腫瘤有效治療的目的。
CD19-CART細胞能夠識別B淋巴細胞白血病的特異性CD19靶點,藉由釋放穿孔素及顆粒酶等細胞因子,對表達CD19抗原的B淋巴細胞進行攻擊,從而促使機體清除惡性淋巴細胞。美國斯隆-凱特琳癌症中心在治療難治復發的急性B細胞型淋巴細胞性白血病(B-ALL)中應用了自體19-28zCAR-T技術,16例患者中14例獲得完全緩解(CR),甚至對移植後復發的費城染色體陽性的急性淋巴細胞白血病(費Ph+ALL)也有效。藉由CART治療也為異體基因造血幹細胞移植創造了條件。賓州大學也報告了應用19-CD137zCART治療B細胞腫瘤結果,30例難治復發的B-ALL,27例獲得CR,6個月無病生存率達67%,總生存率達78%。目前與賓州大學合作的諾華已經獲得了全球第一個CART細胞治療藥物的針對兒童的復發/難治ALL的上市許可,其後Kite也獲得第二個CAR-T藥物針對非霍奇金淋巴瘤的上市許可。
目前批准上市的CART產品都是由自體細胞製備生產,但是具有生產週期長、製備成本高、部分病人無法生產製備出合格CAR-T細胞的缺點,導致這一技術不能大面積地方便地應用於患者。而通用型CAR-T細胞(UCART)敲除了T細胞表面的TCR基因,因此可以消除或大大減少GvHD效應,另外剔除了B2M後可以減少宿主對異體細胞的排斥反應,同時異體UCART具有即用即取的特點,可以用固定劑量回輸病人,避免了病人T細胞無法擴增或無法及時製備的缺點,且大規模製備的可以降低製造成本,適合大規模應用。
WO2014186585A2、WO2016057821A2專利涉及剔除內源基因的方法;WO2009091826、WO2012079000A1、WO-2015187528、WO-2015158671、WO2016014789、WO2016014576、WO2017049166、WO2017173349涉及CAR-T細胞的製備及應用;WO2015136001、WO2015140268、WO2015158671、WO2015193406、WO2017032777涉及UCART的製備和應用,但目前只有Cellectis SA、Pfizer Inc和上海邦耀生物公司的UCART處於一期臨床研究階段,並沒有UCART細胞治療藥物上市,因此,需要繼續研究探索新的UCART細胞治療藥物。
本公開的目的在於克服現有技術在免疫治療中存在的問題,提供一種基因修飾的T細胞,所述修飾的T細胞包含結合CD19的嵌合抗原受體的核酸,並藉由CRISPR/Cas9基因編輯技術剔除內源基因TARC、B2M。此外,本公開還提供了剔除內源基因TARC、B2M、PD-1使用的全新序列的crRNA,並提供了根據本公開的方法所獲得的基因剔除的T細胞在治療或預防CD19介導的疾病中的用途。
本公開的一些實施方案提供一種TCR和PD-1或B2M雙陰性T細胞及其構建方法方法。
本公開的另一些實施方案提供一種TCR、B2M和PD-1三陰性T細胞及其構建方法。
更進一步地,藉由磁珠分選出上述TCR陰性T細胞、TCR和PD-1或B2M雙陰性T細胞和TCR/B2M/PD-1三陰性T細胞,用於腫瘤的過繼細胞免疫治療等方面。
在一些實施方案中,提供一種體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法,所述方法包括如下步驟:1)使用靶向該T細胞中的一個或多個靶基因的sgRNA分別與Cas9蛋白接觸,形成蛋白RNA複合體(RNP);2)將RNP與寡聚脫氧核糖核酸(N-oligo)或魚精DNA片段混合後轉化該T細胞,其中該sgRNA將Cas9蛋白分別引導至相應靶基因的靶序列,並且與該靶序列雜交,其中該靶基因被裂解,並且其中該靶基因的裂解效率大於75%。
在一些的實施方案中,該靶基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個、更多個或其任意組合,該sgRNA靶向該靶基因的編碼序列或其表達調控序列。
進一步地,該sgRNA從5’到3’依次由長度為17nt、18nt、19nt或20nt的靶向靶基因的crRNA和與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接而成,其中該crRNA的長度較佳為17nt。
在一些實施方案中,該寡聚脫氧核糖核酸是長度為100bp、250bp及100-250bp之間的任意長度的雙鏈DNA或長度為100nt、250nt及100-250nt之間任意長度的單鏈DNA,較佳序列為SEQ ID NO:55所示的寡聚脫氧核糖核酸。
在一些實施案中,該靶向TRAC基因的crRNA選自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示crRNA中的任意一種或多種,較佳如SEQ ID NO:37所示的crRNA;該靶向B2M基因的crRNA序列如SEQ ID NO:49所示,該靶向PD-1基因的crRNA選自SEQ ID NO:50、51和52所示的crRNA中的任意一種或多種,較佳為SEQ ID NO:52所示的crRNA。
在一些實施方案中,該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白,其胺基酸序列如SEQ ID NO:54所示,該Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO:53所示。
在一些實施方案中,該T細胞選自輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、記憶性T細胞、調節性T細胞、自然殺傷T細胞、γδT細胞、CAR-T細胞和TCR-T細胞。
另一方面,本公開還提供根據上述方法獲得的靶基因剔除的T細胞。
另一方面,本公開還提供一些用於剔除TRAC基因的crRNA,該crRNA靶向人TRAC基因的編碼序列或其表達的調控序列,該crRNA選自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示的crRNA,較佳SEQ ID NO:37。
另一方面,本公開還提供了用於剔除B2M基因的crRNA,其中該crRNA靶向人B2M基因的編碼序列或其表達的調控序列,該crRNA序列如SEQ ID NO:49所示。
另一方面,本公開還提供了用於剔除PD-1基因的crRNA,其中該crRNA靶向人PD1基因的編碼序列或其表達的調控序列,該crRNA選自SEQ ID NO:50、51和52所示的crRNA,較佳SEQ ID NO:52。
在另一方面,本公開提供了一種用於基因剔除的試劑盒,其包含一種或多種選自上述的crRNA分別與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接形成的sgRNA、Cas9蛋白和寡聚脫氧核糖核酸或魚精DNA片段。
在一些實施方案,在該的用於基因剔除的試劑盒中,該寡聚脫氧核糖核酸是為100bp、250bp及100bp-250bp之間的任意長度的雙鏈DNA或100nt、250nt及100-250nt之間的任意長度的單鏈DNA,較佳序列為SEQ ID NO:55所示的寡聚脫氧核糖核酸。
在一些實施案中,在該用於基因剔除的試劑盒中,該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白,其胺基酸序列如SEQ ID NO:54所示,該Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO:53所示。
在一些實施方案中,本公開提供本公開該的基因剔除的T細胞在製備抗腫瘤藥物中的用途。
在一些實施方案中,本公開還提供本公開該的基因剔除的T細胞在製備防治病毒或細菌引起的感染性疾病藥物中的用途。
在一些實施方案中,利用所設計的crRNA及方法,TCR、B2M或PD-1均被有效剔除。TCR及B2M和/或PD-1剔除後的CART細胞的體外殺傷活性不受TCR、B2M和/或PD-1基因剔除的影響。
本公開提供了一種分離的嵌合抗原受體(CAR),其包括CD19抗原結合結構域、共刺激信號傳導區和CD3ζ信號傳導結構域,其中該CD19抗原結合結構包含如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列,較佳SEQ ID NO:20。
在一些實施方案中,該共刺激信號傳導區包括共刺激分子的細胞內結構域,該共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3
和其任意組合,較佳胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信號傳導區。
在一些實施方案中,該CD3ζ信號傳導結構域包含如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:57所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中,本公開所述的CAR進一步包括細胞外鉸鏈結構域,其中該細胞外鉸鏈結構域包含胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示的人CD8α前導信號區和胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示的人CD8α鉸鏈區。
在一些實施方案中,本公開所述的CAR,進一步包含胺基酸序列如SEQ ID:10所示的CD8α跨膜結構域。
在一些實施方案中,本公開所述的CAR,包括SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,較佳SEQ ID NO:28。
本公開進一步提供一系列核酸分子,其編碼如上該的CAR。
在一些實施方式中,該核酸分子包含如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示的核酸序列。
在一些實施方式中,該核酸分子包含編碼共刺激信號轉導區和/或CD3ζ信號傳導結構域的核酸序列,較佳地,該編碼共刺激信號轉導區的核酸序列如SEQ ID NO:11所示,該編碼CD3ζ信號傳導結構域的核酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:56所示。
在一些實施方式中,該核酸分子進一步包含編碼細胞外鉸鏈結構域的核酸序列,較佳的,其中該編碼細胞外鉸鏈結構域的核酸序列包含如SEQ ID NO:5所示的人CD8α前導信號區和如SEQ ID NO:7所示的人CD8α鉸鏈區。
在一些實施方式中,該核酸分子進一步包含如SEQ ID NO:9所示的CD8α跨膜結構域。
在一些實施方案中,本公開所述核酸分子編碼CAR,其中該CAR包含如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,較佳SEQ ID NO:28。
在一種實施方式中,本公開所述核酸分子編碼CAR,其中該核酸分子包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31所示的核酸序列,較佳SEQ ID NO:27。
本公開進一步提供了包括編碼上述CAR的核酸序列的載體。
在一些實施方案中,本公開所述的載體選自DNA、RNA、質粒、慢病毒載體、腺病毒載體和逆轉錄病毒載體,較佳慢病毒載體。
在一些實施方案中,本公開所述的載體進一步包括啟動子,較佳序列如SEQ ID NO:4所示的EF-1啟動子。
本公開進一步提供了一些包含編碼CAR的核酸序列的T細胞。
本公開進一步提供了用於生成包含編碼CAR的核酸序列的T細胞的方法,其包括將編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸引入至該T細胞中的步驟。
本公開進一步提供了一些組合物,其包括選自下述的一項或多項:(i)分離的上述CAR,(ii)編碼上述CAR的核酸分子,(iii)含有編碼上述CAR的核酸分子的載體,和(iv)包含上述CAR的修飾的T細胞。
本公開進一步提供一些修飾的T細胞,其包括:能夠下調內源基因的基因表達的核酸,該內源基因選自TRAC、B2M、PD-1中的一個或更多個及其任意組合;和編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸,該CAR包含CD19抗原結合結構域、共刺激信號傳導區和CD3ζ信號傳導結構域,其中該CD19抗原結合結構包含如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中能夠下調T細胞內源基因表達的核酸選自反義RNA、antigomer RNA、siRNA、shRNA和CRISPR-Cas9系統,較佳CRISPR-Cas9系統。
在一些實施方案中,其中該Cas9蛋白選自釀膿鏈球菌,其胺基酸序列如SEQ ID NO:54所示,所對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO:55所示。
在一些實施方案中,該CRISPR-Cas9系統進一步包含靶向內源基因編碼序列或其表達調控序列的sgRNA,其中該sgRNA從5’到3’依次由長度為17nt、18nt、19nt或20nt的靶向內源基因的crRNA和與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接而成。
在一種實施方式中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該內源基因選自TRAC和B2M。
在一些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該靶向內源基因TRAC的crRNA選自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示crRNA中的任意一種或多種,較佳SEQ ID NO:47;靶向靶向內
源基因B2M的crRNA如SEQ ID NO:49所示,靶向內源基因PD-1的crRNA如序列SEQ ID NO:50、51或52所示,較佳SEQ ID NO:52。
在一些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該共刺激信號傳導區是4-1BB共刺激信號傳導區,其胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在一些些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該CD3ζ信號傳導結構域包括如SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該CAR進一步包括細胞外鉸鏈結構域,其中該細胞外鉸鏈結構域包含如序列SEQ ID NO:6所示的人CD8α前導信號區和如序列SEQ ID NO:8所示的人CD8α鉸鏈區。
在一些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該CAR進一步包括如序列SEQ ID NO:10所示的CD8α跨膜結構域。
在一些實施方案中,本公開所述的修飾的T細胞,其中該CAR包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,較佳包含SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列。
本公開進一步提供一些修飾的T細胞,其包括:能夠下調T細胞內源基因TRAC、B2M的基因表達的核酸,該下調內源基因TRAC的crRNA如序列SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示,較佳SEQ ID NO:47,下調內源基因B2M的crRNA如序列SEQ ID NO:49所示,靶向內源基因PD-1的crRNA如序列SEQ ID NO:50、51或52所示,較佳SEQ ID NO:52;和
編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸,該CAR的包含如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,較佳包含如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列。
本公開進一步提供一些修飾的T細胞,其包括:能夠下調T細胞內源基因TRAC、B2M的基因表達的核酸,該下調T細胞內源基因TRAC的crRNA如序列SEQ ID NO:47所示,下調內源基因B2M的crRNA如序列SEQ ID NO:49所示,下調內源基因PD-1的crRNA如序列SEQ ID NO:52所示;該嵌合抗原受體包括如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,較佳包含如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列;最佳的修飾的T細胞為UCART19TCR-/-(單剔除:剔除TCR)或UCART19TCR-/- B2M-/-(雙剔除:剔除TCR和B2M)或UCART19TCR-/- B2M-/-PD-1-/-(三剔除:剔除TCR、B2M和PD-1)。
本公開進一步提供一些包含上述修飾的T細胞的醫藥組成物。
本公開進一步提供一些製備上述的修飾的T細胞的方法,其包括:(1)將編碼嵌合抗原受體(CAR)核酸引入該T細胞;(2)將能夠下調T細胞內源靶基因表達的sgRNA的核酸藉由CRISPR-Cas9系統引入T細胞,該內源靶基因選自TARC和B2M;在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,其中該CAR包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,其中該靶向內源基因TRAC的crRNA選自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47和48序列所示的任一個、更多個或其任意組合,較佳SEQ ID NO:47,靶向靶向內源基因B2M的crRNA如SEQ ID NO:49所示。
在一些實施方案中,製備修飾的T細胞的方法,其中該T細胞獲得自外周血單核細胞、臍帶血細胞、純化的T細胞群和T細胞系。
在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,其中該方法進一步包括擴展該T細胞。
在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,其中擴展該T細胞的步驟包括使用選自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BBL、IL2、IL21、IL-15、IL-7、PD1-CD28和PD-1的至少一種分子或細胞因子刺激該擴展的T細胞群。
在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,進一步包括冷藏該T細胞。
在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,進一步包括在將該核酸引入該T細胞之前解凍該冷藏的T細胞的步驟。
在一些實施方案中,本公開所述的製備修飾的T細胞的方法,其中引入該核酸選自轉導該擴展的T細胞、轉染該擴展的T細胞和電穿孔該擴展的T細胞。
在一些實施方案中,本公開所述醫藥組成物進一步包括藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施方案中,本公開所述醫藥組成物進一步包括緩衝液。
在一些實施方案中,本公開所述醫藥組成物,其中該緩衝液是中性緩衝鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水。
在一些實施方案中,本公開所述醫藥組成物進一步包括可注入的冷凍培養基。
在一些實施方案中,本公開所述醫藥組成物,其中該可注入的冷凍培養基包括plasmalyte-A、右旋糖、NaCl、DMSO、葡聚糖和人血清白蛋白。
在一些實施方案中,本公開所述醫藥組成物進一步包括一種或多種細胞因子。
本公開進一步提供編碼CAR的核酸分子、包含編碼CAR核酸分子的載體、包含CAR的T細胞、包含能夠下調內源基因TRAC、B2M的基因表達的核酸和編碼CAR的核酸的T細胞或包含上述成分的組成物在製備用於治療或預防CD19介導的疾病的藥物中的用途。
本公開進一步提供編碼CAR的核酸分子、包含編碼CAR核酸分子的載體、包含CAR的T細胞、包含能夠下調內源基因TRAC、B2M的基因表達的核酸和編碼CAR的核酸的T細胞或包含上述成分的組成物在用於治療或預防CD19介導的疾病的藥物中的用途。
本公開進一步提供治療或預防CD19介導的疾病的方法,該方法包括向受試者施用有效量的編碼CAR核酸分子、包含編碼CAR核酸分子的載體、包含CAR的T細胞、包含能夠下調內源基因TRAC、B2M的基因表達的核酸和編碼CAR的核酸的T細胞或包含上述成分的組成物。
在另一些實施方案中,上述方法包括施用給受試者效量的基因修飾以表達CAR的細胞或包含能夠下調內源基因TRAC、B2M的基因表達的核酸,和編碼CAR的核酸的細胞,其中該CAR包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,較佳包含如SEQ ID NO:
28所示的胺基酸序列,其中該下調內源基因TRAC的crRNA選自SEQ ID NO:37、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示序列中的任一種、更多種或其任意組合,較佳SEQ ID NO:47;其中該下調內源基因B2M的crRNA如SEQ ID NO:49所示,其中靶向內源基因PD-1的crRNA選自SEQ ID NO:50、51和52所示crRNA中的任意一種或更多種,較佳SEQ ID NO:52。
在一個實施方案中,其中該的CD19介導的疾病選自癌症、病毒或細菌引起的感染性疾病和自身免疫疾病,較佳癌症,更佳乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、血液學癌症、肺癌和甲狀腺癌,最佳血液學癌症。
在一個實施方案中,其中該血液學癌症選自白血病,包括急性白血病,諸如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓細胞性、前髓細胞性、粒-單核細胞型、單核細胞性和紅白血病;和慢性白血病,諸如慢性髓細胞(粒細胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血病和難治療的CD19+白血病和淋巴瘤;真性紅細胞增多症、淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、擴散大B-細胞淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合症、多毛細胞白血病和脊髓發育不良;較佳急性淋巴細胞白血病或慢性淋巴細胞白血病。
第1圖為篩選後的UCART19細胞的純度鑒定圖。
第2圖為慢病毒轉染效率圖。
第3圖為不同遞送系統剔除效率比較圖,結果顯示RNP遞送方式在Jurkat細胞中基因剔除效率最高。
第4A圖至第4C圖為N-oligo和魚精DNA對CRISPR-Cas9系統對T細胞基因剔除效率的影響圖。第4A圖是在T細胞中基因剔除效率的比較;第4B圖是在CAR-T細胞中基因剔除效率的比較;第4C圖顯示魚精DNA片段對T細胞基因剔除效率的影響。
第5圖為T細胞剔除B2M效率檢測圖,結果顯示B2M的剔除效率高達81.7%。
第6圖為T細胞中剔除PD-1基因效率檢測圖,結果顯示,三條crRNA均能顯著剔除PD-1。
第7A圖至第7B圖為RNP與N-Oligo或魚精DNA造成的基因突變分析圖。第7A圖是針對TRAC的分析結果,第7B圖是針對B2M的分析結果。
第8A圖第8C圖為RNP脫靶率分析圖。第8A圖為TRAC基因脫靶率分析結果;第8B圖為B2M基因脫靶率分析結果;第8C圖為PD1基因脫靶率分析結果。
第9A圖至第9B圖為TRAC基因剔除T細胞的CD25和CD69激活情況分析圖。第9A圖為CD69激活情況比較;第9B圖為CD25激活情況比較。
第10圖為CART19對CD19陽性細胞K562-CD19及K562的殺傷作用圖。
第11圖為CART19對Raji腫瘤細胞的殺傷作用圖。
第12A圖至第12B圖為CART19-N2殺傷Raji和Daudi腫瘤細胞過程中細胞因子釋放圖。
第13圖為CART19和UCART19細胞對腫瘤靶細胞的殺傷能力比較圖。第13A圖顯示的是對Dudi細胞的殺傷作用;第13B圖顯示的是對Raji細胞的殺傷作用;第13C圖顯示的是對Nalm6細胞的殺傷作用。
第14A圖至第14C圖為CART19及UCART19細胞體外殺傷靶細胞的過程中細胞表面CD107a的表達水平測定結果圖。第14A圖表示殺傷Daudi細胞的過程中細胞表面CD107a的表達水平;第14B圖表示殺傷Raji細胞的過程中細胞表面CD107a的表達水平;第14C圖表示殺傷Nalm6細胞的過程中細胞表面CD107a的表達水平。
第15A圖至第15D圖為CART19細胞小鼠體內抗腫瘤活性分析圖。第15A圖顯示的NOG小鼠造模及回輸CART19細胞過程圖;第15B圖顯示是回輸後5周實驗拍照結果;第15C圖顯示是小鼠體內生物發光強度統計結果;第15D圖顯示的是小鼠體內CART19細胞的總生存率。
第16A圖至第16B圖為使用K562細胞刺激後CART19與UCART19細胞的小鼠體內抗腫瘤活性分析結果圖。第16A圖顯示的是NOG小鼠造模回輸CART19和UCART19以及使用K562-CD19細胞二次刺激後的CART19和UCART19後小鼠體內的腫瘤負荷情況;第16B圖顯示的是NOG小鼠造模回輸CART19和UCART19以及使用K562-CD19細胞二次刺激後的CART19和UCART19後小鼠的存活率。
第17A圖至第17B圖為CART回輸後3周內人T細胞在小鼠外周血中數量變化圖。第17A圖顯示的是陰性對照CART-MSN細胞在小鼠體內的增殖情況;第17B圖顯示的是CART19-N2細胞在小鼠體內的增殖情況。
第18A圖至第18D圖為注射T-mock細胞和T-TCR-細胞後小鼠的存活率、體重變化、人T細胞在小鼠體內的增殖情況圖。第18A圖顯示的是注射不同細胞後小鼠的存活率;第18B圖顯示的是小鼠體重的變化情況;第18C圖顯示的是注射CTL-019細胞後小鼠體內CD45+細胞的比例;第18D圖顯示的是注射CTL-019TCR-/-細胞後小鼠體內CD45+細胞的比例。
本公開提供了一些能夠在不同個體間使用的基因修飾的UCART細胞,該細胞具有在體內外特異的殺傷CD19陽性細胞及腫瘤靶細胞的能力,而且大大降低了了GvHD效應和異體的排斥反應。
術語
為了更容易理解本公開,以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義,本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
如本文所用,術語“接觸”(即,使多核苷酸序列與成簇規律間隔的短回文重複序列相關(Cas)蛋白質和/或核糖核酸相接觸)意圖包括在體外孵育Cas蛋白和/或核糖核酸或離體接觸細胞。本文所公開的使靶基因的多核苷酸序列與Cas蛋白和/或核糖核酸相接觸的步驟可以任何適合的方式進行。例如,可以貼壁培養或懸浮培養的形式處理該細胞。如本文所公開與Cas蛋白和/或核糖核酸相接觸的細胞還可同時或隨後與另一種試劑,如生長因子或其他分化劑或環境相接觸以穩定該細胞或使該細胞進一步分化。
當應用於分離的細胞時,術語“處理”包括使該細胞經受任何類型的過程或條件,或對該細胞進行任何類型的操作或工序。當應用於受試者時,該術語是指向個體提供細胞,在該細胞中己根據本文該的方法離體改變靶基因的多核苷酸序列。該個體通常是生病的或受傷的,或相對於群體的平均成員處於增加的生病風險並且需要這種注意、護理或管理。
如本文所用,術語“治療”是指向受試者施用有效量的具有根據本文所述的方法離體改變的靶基因的多核苷酸序列的細胞,以使得該受試者具有該疾病的至少一種症狀的減少或該疾病的改善,例如,有益的或所需的臨床結果。出於本公開的目的,有益的或所需的臨床結果包括但不限於一種或多種症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定(即不惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和,以及緩解(無論是部分緩解還是全部緩解),無論是可檢測的或是不可檢測的。治療可指與未接受治療情況下的預期存活期相比,延長存活期。因此,本領域的技術人員意識到治療可改善疾病狀況,但可能不是疾病的完全治癒。如本文所用,術語"治療"包括預防。或者,治療在疾病的進展減少或停止的情況下是“有效的”。“治療”還可意指與在未接受治療情況下的預期存活期相比,延長存活期。需要治療的病人包括已經被診斷具有與多核苷酸序列的表達相關的病症,以及由於遺傳易感性或其他因素可能發展這種病症。
如本文所用“突變細胞”是指具有與其原始基因型不同的細胞。在一些實例中“突變細胞”表現出突變表型,例如當使用本公開的CRISPR/Cas系統改變功能正常的基因時。在其他實例中“突變細胞”表現出野生型表型,例如當本公開的CRISPR/Cas系統用於修正突變基因型時。在一些實施方案中,改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列以修正或修復基因突變(例如,以恢復該細胞的正常基因型)。在一些實施方案中,改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列以誘導基因突變(例如,以破壞基因或基因組元件的功能)。
在一些實施方案中,該改變是插入和/或缺失。如本文所用“插入缺失”是指由插入、缺失或其組合產生的突變。如本領域的技術人員將理解,除非插入缺失的長度是三的倍數,否則基因組序列的編碼區中的插入缺失將導致
移碼突變。在一些實施方案中,該改變是點突變。如本文所用“點突變”是指核苷酸中的一個的取代。本公開的CRISPR/Cas系統可用於誘導靶基因的多核苷酸序列中的任何長度的插入和/或缺失或點突變。
“寡聚脫氧核糖核酸”或“N-oligo”是指在利用RNP遞送系統進行基因剔除時,與RNP一同轉化至細胞內的隨機序列的脫氧核糖核酸片段,較佳長度為100至250bp的雙鏈DNA或100至250nt的單鏈DNA。
“魚精DNA片段”是指含鮭魚精DNA的溶液經機械剪切,將魚精DNA剪切成的小分子片段。如1%鮭魚精DNA溶液用7號針頭重複抽打以剪切DNA成為小分子,分裝後貯藏。
如本文所用“剔除”包括以干擾靶基因的多核苷酸的功能的方式缺失該靶基因的多核苷酸的全部或一部分。例如,剔除可藉由改變靶基因的多核苷酸序列來實現,該改變是藉由在該靶基因的多核苷酸序列中誘導該靶基因的多核苷酸序列的功能結構域(例如,DNA結合結構域)中的插入缺失來進行的。基於本文所述的細節,本領域的技術人員將容易地理解如何使用本公開的CRISPR/Cas系統來剔除靶基因的多核苷酸或其部分。
在一些實施方案中,該靶基因的裂解導致該靶基因的表達降低。術語“降低”在本文中通常都用於意指降低統計上顯著的量。然而,為避免疑惑“降低”意指與參考水平相比降低至少10%,例如與參考水平相比降低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約90%,或多達且包括100%降低(即與參考樣品相比不存在的水平),或10%-100%之間的任何降低。
術語“統計上顯著的”或“顯著地”是指統計顯著性並且通常意指在正常標記物濃度以下或低於標記物濃度的兩個標准偏差(2SD)。該術語是指存在差異的統計證據。它被定義為當假設實際上為真實時做出拒絕假設的決定的概率。該決定經常使用p值表示。
在一些實施方案中,該靶基因的裂解是純合靶基因的裂解。在一些實施方案中,該靶基因的裂解是雜合靶基因的裂解。
術語“Cas9蛋白”(還被稱為CRISPR相關的核酸內切酶Cas9/Csn1)是包含1368個胺基酸的多肽。Cas9蛋白的示例性胺基酸序列如SEQ ID NO:53所示。Cas9含有2個核酸內切酶結構域,包括RuvC樣結構域(殘基7-22、759-766和982-989),其裂解與crRNA非互補的靶DNA;和HNH核酸酶結構域(殘基810-872),其裂解與crRNA互補的靶DNA。
術語“T細胞受體(TCR)”,是呈遞在主要組織相容性複合體(MHC)上的特異性抗原肽的異源二聚體蛋白受體。在免疫系統中,藉由抗原特異性的TCR與pMHC複合物的結合引發T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸,然後T細胞及APC的其他細胞膜表面分子就發生相互作用,這就引起一系列後續的細胞信號傳遞和其他生理反應,從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發揮免疫效應。
TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。在95%的T細胞中TCR異質二聚體由α和β鏈組成,而5%的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質二聚TCR具有α鏈和β鏈,α鏈和β鏈構成αβ異源二聚TCR的亞單位。廣義上講,α和β鏈包含可變區、連接區和恒定區,β鏈通常還在可變區和連接區之間含有短的多變區,但該多變區
常視作連接區的一部分。各可變區包含嵌合在框架結構(framework regions)中的3個CDR(互補決定區),CDR1、CDR2和CDR3。CDR區決定了TCR與pMHC複合物的結合,其中CDR3由可變區和連接區重組而成,被稱為超變區。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結構域”即可變域和恒定域,可變域由連接的可變區和連接區構成。TCR恒定域的序列可以在國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)的公開數據庫中找到,如TCR分子α鏈的恒定域序列為“TRAC*01”,TCR分子β鏈的恒定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外,TCR的α和β鏈還包含跨膜區和胞質區,胞質區很短。
“B2M”,也稱為β-2微球蛋白,是MHC I類分子的輕鏈,並因此是主要組織相容性複合體的不可缺少的部分。在人類中,由位於15號染色體上、與在6號染色體上以基因簇定位的其他MHC基因相對的b2m基因編碼B2M。人源蛋白由119個胺基酸組成,並具有11800道爾頓的分子量。β-2微球蛋白缺陷的鼠模型已經證明,B2M是MHC I類的細胞表面的表達和肽結合槽的穩定性所必需的。
“PD-1”或“PD1”為50-55kDa的I型跨膜受體,其最初是在經歷激活誘導的細胞凋亡的T細胞系中鑒定的。PD-1表達於T細胞、B細胞和巨噬細胞之上。PD-1的配體為B7家族成員PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。
PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族成員,在其胞外區含有單個IgV-樣結構域。PD-1胞漿結構域含有兩個酪胺酸,其中最接近於膜的酪胺酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位於ITIM(免疫受體酪胺酸的抑制基序)之內。PD-1上ITIM的存在預示著該分子藉由募集胞漿磷酸酶發揮作用以削弱抗原受體的信號傳導。人和鼠PD-1蛋白共有大約60%的胺基酸同一性,具有保守的四個潛在的N-糖基
化位點以及限定Ig-V結構域的殘基。胞漿區中的ITIM以及羧基末端酪胺酸(人和小鼠中的TEYATI)周圍的ITIM-樣基序在人和鼠直系同源物(orthologue)之間也是保守的。
術語“抗體”,指的是與抗原特異性結合的免疫球蛋白分子。抗體可為源於自然源或源於重組源的完整的免疫球蛋白,並可為完整免疫球蛋白的免疫反應部分。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚物。本公開中的抗體可以以多種形式存在,包括多株抗體、單株抗體、Fv、Fab和F(ab)2,以及單鏈抗體和人源化抗體(Harlow等,1999,In:UsingAntibodies:ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY;Harlow等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NewYork;Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;Bird等,1988,Science242:423-426)。
如本文使用的術語術語“抗體片段”指的是完整抗體的一部分,並指的是完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的例子包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段,由抗體片段形成的線性抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
如本文使用的術語“抗體重鏈”指的是以它們自然發生構象存在於所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
如本文使用的術語“抗體輕鏈”指的是以它們自然發生構象存在於所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較小的鏈,κ和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。
如本文使用的術語“合成抗體”的意思是使用重組DNA技術生成的抗體,比如,例如,由噬菌體表達的抗體。該術語也應當解釋為意思是已經由DNA分子──其編碼抗體並且該DNA分子表達抗體蛋白或規定抗體的胺基
酸序列──的合成生成的抗體,其中DNA或胺基酸序列已經使用本領域可獲得和熟知的合成DNA或胺基酸序列技術獲得。
如本文所用的術語“抗原”或“Ag”被定義為激發免疫應答的分子,該免疫應答可涉及抗體產生,或特異性免疫活性細胞的活化。本領域技術人員均可理解任何大分子──包括所有的蛋白質或肽,可用作抗原。此外,抗原可源自重組或基因組DNA。本領域技術人員均可理解任何DNA──其包括編碼引起免疫應答的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列,編碼如本文使用的術語“抗原”。此外,本領域技術人員均可理解抗原不必單獨地由基因的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本公開包括但不限於,多於一個的基因的部分核苷酸序列的用途,並且這些核苷酸序列以不同的組合進行佈置,以引起期望的免疫應答。此外,領域技術人員均可理解抗原根本不必由“基因”進行編碼,抗原可被產生、合成或可源自生物學樣本。這種生物學樣本可包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生物學流體。
術語“自身抗原”意思是由免疫系統識別為異物(foreign)的任何自體抗原。自身抗原包括但不限於細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質、核酸、糖蛋白,其包括細胞表面受體。
如本文使用的術語“嵌合抗原受體”或“CAR”指的是被工程化以在免疫效應細胞上表達和特異性地結合抗原的人工T細胞受體。CAR可以被用作使用過繼細胞轉移的療法。T細胞從患者移出並且進行修飾,使得它們表達特異於具體形式的抗原的受體。CAR還可以包括胞內活化結構域、跨膜結構域和胞外結構域──其包括腫瘤相關抗原結合區。在一些方面,CAR包括融合單鏈可變片段(scFv)衍生的單克隆抗體,其被融合至CD3-ζ跨膜和胞內結構域。CAR
設計的特異性可以源自受體的配體(例如,肽)。在一些實施方式中,藉由重定向表達特異於腫瘤相關抗原的CAR的T細胞的特異性,CAR可以靶向癌症。
如本文所用的術語“抗腫瘤效應”,指的是生物學效應,其可由腫瘤體積的減少、腫瘤細胞數的減少、轉移數的減少、預期壽命的增加或與癌性病症相關的各種生理症狀的改善清楚表示。“抗腫瘤效應”也可由本公開的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預防腫瘤方面能力表示。
如本文所用的術語“自身免疫疾病”被定義為由自身免疫應答產生的紊亂。自體免疫疾病是對自身抗原的不適當和過度應答的結果。自身免疫疾病的例子包括但不限於阿狄森氏疾病、斑禿、強直性脊管柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克羅恩氏疾病、糖尿病(1型)、營養不良性大皰性表皮松解症、附睾炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏疾病、吉蘭-巴雷綜合症、橋本氏疾病、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力、尋常型天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、結節病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合症、脊椎關節病變、甲狀腺炎、血管炎、白癜風、黏液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結腸炎等等。
如本文使用的術語“共刺激配體”包括特異性地結合T細胞上的關聯共刺激分子的抗原呈遞細胞(例如,aAPC、樹突細胞、B細胞等)上的分子,由此除了藉由例如將TCR/CD3複合體與負載有肽的MHC分子結合提供的初級信號之外,還提供了介導T細胞應答的信號,該T細胞應答包括但不限於增殖、活化、分化等。共刺激配體可以包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導的共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、
淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體受體的激動劑或抗體和與B7-H3特異性地結合的配體。共刺激配體也包括,特別是與存在於T細胞上的共刺激分子特異性地結合的抗體,該共刺激分子包括但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與CD83特異性地結合的配體。
“共刺激分子”指的是與共刺激配體特異性結合的T細胞上的關聯結合伴侶,由此介導T細胞的共刺激應答,諸如但不限於增殖,共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、BTLA和Toll配體受體。
如本文所用的,“共刺激信號”指的是與初級信號結合,諸如TCR/CD3連接作用,導致T細胞增殖和/或關鍵分子的上調或下調的信號。
如本文所用的,術語“自體的”指關於源自相同個體的任何物質,它隨後被再次引入該個體。
“同種異基因的(allogeneic)”指的是源自相同物種的不同動物的移植物。
“異種的(xenogeneic)”指的是源自不同物種的動物的移植物。
術語“切割”指的是共價鍵的斷裂,比如在核酸分子的主鏈中。可以藉由各種方法起始切割,其包括但不限於磷酸二酯鍵的酶促或化學水解。單鏈切割和雙鏈切割二者都是可能的。可以由於兩個不同的單鏈切割事件而發生雙鏈切割。DNA切割可以導致產生平頭末端或交錯末端。在某些實施方式中,融合多肽可以用於靶向切割的雙鏈DNA。
術語“CRISPR/CAS”、“成簇的、規律間隔的短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系統”或“CRISPR”指的是包含堿基序列的短重複的DNA基因座。每個重複接著先前暴露於病毒的間隔DNA的短區段。細菌和古細菌已經進化出被稱為CRISPR-CRISPR相關(Cas)系統的適應性免疫防禦,其使用短RNA指導外源核酸的降解。在細菌中,CRISPR系統經由RNA-引導的DNA切割提供了針對侵入的外源DNA的獲得性免疫。
在II型CRISPR/Cas系統中,稱為“間隔區”的外源DNA的短區段被整合在CRISPR基因組基因座內並且轉錄和加工為短的CRISPR RNA(crRNA)。使這些crRNA與反式激活的crRNA(tracrRNA)退火並且藉由Cas蛋白指導致病DNA的序列特異性切割和沉默。近來的工作已經顯示藉由Cas9蛋白的靶標識別需要crRNA內的“種子”序列和crRNA-結合區上游的包含保守的二核苷酸的前間區序列鄰近基序(PAM)序列。
為了指導Cas9切割感興趣的序列,可以從人U6聚合酶III啟動子設計crRNA-tracrRNA融合轉錄物,下文稱為“引導RNA”或“sgRNA”。CRISPR/CAS介導的基因組編輯和調控突顯出其用於基礎科學、細胞工程和治療的變革性潛力。
術語“CRISPRi”指的是用於基因表達的序列特異性基因阻遏或抑制的CRISPR系統,比如在轉錄水平下。
如本文所用的,術語“外源的”指的是任何從有機體、細胞、組織或系統引入的或在有機體、細胞、組織或系統外產生的物質。
如本文使用的“內源的”或“內源”指的是來自生物體、細胞、組織或系統的或在生物體、細胞、組織或系統內產生的任何物質。
如本文使用的術語“下調”指的是一種或多種基因的基因表達的降低或消除。
如本文使用的術語“擴展”指的是數目的增加,如T細胞數目的增加。在一個實施方式中,離體擴展的T細胞的數目相對於培養物中原始存在的數目增加。在另一個實施方式中,離體擴展的T細胞的數目相對於培養物中的其它細胞類型的數目增加。
如本文使用的術語“離體”指的是已經從活的生物體(例如,人)移出,並且在生物體外(例如,在培養皿、試管或生物反應器中)繁殖的細胞。
如本文使用的術語“表達”定義為由它的啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。
“載體”是物質組合物,其包括分離的核酸,並且其可以用於遞送分離的核酸至細胞內部。眾多載體在本領域是已知的,包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關聯的多核苷酸、質粒和病毒。因而,術語“載體”包括自主複製的質粒或病毒。該術語也應當解釋為包括便於將核酸轉移入細胞的非質粒和非病毒化合物,比如,例如,聚賴胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
“表達載體”指的是包括重組多核苷酸的載體,該重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包括足夠的用於表達的順式作用元件;用於表達的其它元件可以由宿主細胞供應或在體外表達系統中供應。表達載體包括所有本領域已知的併入重組多核苷酸的那些,
比如黏粒、質粒(例如,裸露或包含在脂質體中)和病毒(例如,仙台病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
如本文使用的,“同源的”指的是兩個聚合物分子之間,例如,兩個核酸分子,比如兩個DNA分子或兩個RNA分子之間,或兩個多肽分子之間的亞基序列同一性。當兩個分子的二者中的亞基位置被相同的單體亞基佔據時;例如,如果兩個DNA分子的每個中的位置被腺嘌呤佔據,則它們在該位置處是同源的。兩個序列之間的同源性是匹配或同源位置的數目的直接函數;例如,如果兩個序列中的一半位置(例如,長度為十個亞基的聚合物中的五個位置)是同源的,則兩個序列是50%同源的;如果90%的位置(例如,10個中的9個)是匹配的或同源的,則兩個序列是90%同源的。
如本文使用的“同一性”指的是兩個聚合物分子之間,特別是兩個胺基酸分子之間,比如,兩個多肽分子之間的亞基序列同一性。當兩個胺基酸序列在相同位置具有相同殘基時;例如,如果兩個多肽分子中的每個中的位置均被精胺酸佔據,則它們在該位置是同一的。在比對中,兩個胺基酸序列在相同位置具有相同殘基的同一性或程度經常表達為百分數。兩個胺基酸序列之間的同一性是匹配或同一位置的數目的直接函數;例如,如果兩個序列中的一半位置(例如,十個胺基酸長度的聚合物中的五個位置)是同一的,則兩個序列是50%同一的;如果90%的位置(例如,10個中的9個)是匹配的或同一的,則兩個胺基酸序列是90%同一的。
如本文使用的術語“免疫球蛋白”或“Ig”定義為起抗體作用的一類蛋白質。由B細胞表達的抗體有時被稱為BCR(B細胞受體)或抗原受體。包括在此類蛋白質中的五個成員是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在於身體分
泌物,比如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道與生殖泌尿道的黏液分泌物中的初次抗體。IgG是最常見的循環抗體。IgM是在大多數對象中的初次免疫應答中產生的主要免疫球蛋白。它在凝集、補體結合和其它抗體應答中是最有效的免疫球蛋白,並且在抵禦細菌和病毒方面是重要的。IgD是不具有已知抗體功能的免疫球蛋白,但是可以充當抗原受體。IgE是在暴露於過敏原之後,藉由引起從肥大細胞和嗜鹼性粒細胞釋放介體,介導速發過敏性的免疫球蛋白。
如本文使用的術語“免疫應答”定義為當淋巴細胞將抗原分子識別為異物並誘發形成抗體和/或活化淋巴細胞以移除抗原時發生的對抗原的細胞應答。
“分離的”意思是從自然狀態改變或移出。例如,天然存在於活動物中的核酸或肽不是“分離的”,但是部分或完全與它的自然狀態的共存物質分開的相同的核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質可以以基本上純化的形式存在,或可以存在於非自然環境,比如,例如,宿主細胞中。
如本文使用的術語“減量”指的是一種或多種基因的基因表達的降低。
如本文使用的術語“剔除”指的是一種或多種基因的基因表達的消融。
如本文所用的“慢病毒”指的是逆轉錄病毒科的屬。在逆轉錄病毒中慢病毒是唯一能夠感染非分裂細胞的病毒,例如HIV、S1V和FIV;它們可傳遞顯著量的遺傳信息進入宿主細胞的DNA,因此它們是基因傳遞載體的最有效的方法之。源自慢病毒的載體提供了完成顯著水平基因體內轉移的工具。
如本文使用的術語“修飾的”意思是本公開的分子或細胞的改變的狀態或結構。分子可以以許多方式被修飾,包括化學地、結構地和功能地。細胞可以藉由引入核酸進行修飾。
如本文使用的術語“調節”意思是與缺少治療或化合物的對象中的應答水平相比,和/或與在其它方面相同但未治療的對象中的應答水平相比,介導對象中的應答水平中的可檢測的增加或減少。該術語包括擾亂和/或影響天然信號或應答,從而介導對象,較佳地,人中的有益的治療性應答。
除非另外規定,“編碼胺基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的簡並形式並且編碼相同的胺基酸序列的所有的核苷酸序列。短語編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列還可以包括內含子,其程度為編碼該蛋白質的核苷酸序列可以在一些形式中包含內含子(一個或多個)。
術語“可操作地連接”指的是調控序列和異源核酸序列之間的功能連接,其導致異源核酸序列的表達。例如,當第一核酸序列處於與第二核酸序列的功能關係中時,第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如,如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達,則啟動子可操作地連接至編碼序列。通常地,可操作地連接的DNA序列是鄰近的,並且在必要時在同一的閱讀框中接合兩個蛋白編碼區。
術語“過表達的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過表達”意欲指示相對於來自組織或器官的正常細胞的表達水平,來自疾病區如患者的特定組織或器官內的實體瘤的細胞中的腫瘤抗原表達的異常水平。患有以腫瘤抗原過表達表徵的實體瘤或血液學惡性腫瘤的患者可以由本領域已知的標準測定來確定。
如本文使用的,術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”可交換地使用,並且指的是由肽鍵共價連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個胺基酸,並且對可以構成蛋白質或肽的序列的胺基酸的最大數目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質,該肽或蛋白質包括藉由肽鍵相互接合的兩個或更多個胺基酸。如本文使用的,該術語指的是短鏈,其在本領域中也通常被稱為例如肽、寡肽和寡聚物;和較長鏈二者,其在本領域中通常被稱為蛋白質,其具有許多類型。“多肽”包括例如生物學活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
如本文使用的術語“啟動子”定義為起始多核苷酸序列的特異性轉錄需要的,由細胞的合成機器識別,或合成機器(machinery)引入的DNA序列。
如本文使用的,術語“啟動子/調控序列”意思是對於可操作地連接至啟動子/調控序列的基因產物的表達需要的核酸序列。在一些情況下,此序列可以是核心啟動子序列,並且在其它情況下,此序列還可以包括對於基因產物的表達需要的增強子序列和其它調控元件。例如,啟動子/調控序列可以是以組織特異性方式表達基因產物的序列。
“信號轉導途徑”指的是多種信號轉導分子──其在將信號從細胞的一部分傳遞至細胞的另一部分中發揮作用──之間的生物化學關係。
“細胞表面受體”包括分子和分子的複合體,其能夠跨越細胞的質膜接收信號和傳遞信號。
如本文使用的關於抗體的術語“特異性地結合”意思是抗體識別特異性抗原但基本上不識別或結合樣品中的其它分子。例如,特異性地結合至來
自一個物種的抗原的抗體也可以結合至來自一個或多個物種的抗原。但是,這樣的跨物種反應性本身不將抗體的類別改變為特異性的。在一些情況下,特異性地結合至抗原的抗體也可以結合至不同等位基因形式的抗原。然而,這樣的交叉反應性本身不將抗體的類別改變為特異性的。在一些情況下,術語“特異性結合”或“特異性地結合”可以參考抗體、蛋白質或肽與第二化學種類的相互作用使用,意思是該相互作用依賴化學種類上特定結構(例如,抗原決定簇或表位)的存在;例如,抗體識別和結合至特定蛋白結構,而不是一般地識別和結合至蛋白質。如果抗體特異於表位“A”,則在包含標記的“A”和抗體的反應中存在包含表位A(或游離的、未標記的A)的分子將降低結合至抗體的標記的A的量。
“單鏈抗體”指的是藉由重組DNA技術形成的抗體,其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈片段經由工程化跨度的胺基酸連接至Fv區。生成單鏈抗體的多種方法是已知的,包括在美國專利號4,694,778;Bird(1988)Science 242:423-442;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;Ward等(1989)Nature 334:54454;Skerra等(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。
術語“刺激”意思是藉由結合刺激分子(例如,TCR/CD3複合體)與其關聯配體,從而介導信號轉導事件,比如,但不限於經TCR/CD3複合體的信號轉導誘導的初次應答。刺激可以介導某些分子的改變的表達,比如TGF-β的下調、和/或細胞骨架結構的重組等。
“刺激分子”,作為本文使用的術語,意思是與存在於抗原呈遞細胞上的關聯刺激配體特異性地結合的T細胞上的分子。
如本文使用的“刺激配體”意思是如下配體:其當存在於抗原呈遞細胞(例如,aAPC、樹突細胞、B-細胞等)上時,可以與T細胞上的關聯結合配
偶體(在本文稱為“刺激分子”)特異性地結合,從而介導T細胞的初次應答,其包括但不限於活化、免疫應答的起始、增殖等。刺激配體在本領域是熟知的,並且包括,特別是MHC I類分子:負載有肽、抗CD3抗體、超激動劑抗CD28抗體和超激動劑抗CD2抗體。
術語“對象”意欲包括其中可以引發免疫應答的活的生物體(例如,哺乳動物)。如其中使用的“對象”或“患者”可以是人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括,例如,家畜和寵物,比如綿羊、牛科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物和鼠科哺乳動物。較佳地,對象是人。
如本文使用的“基本上純化的”細胞是大體上不含其它細胞類型的細胞。基本上純化的細胞也指的是已經與其它細胞類型在其天然存在狀態中與該其它細胞類型正常相關聯分開的細胞。在一些情況下,基本上純化的細胞群指的是均質細胞群。在其他情況下,此術語簡單地指的是已經與在其天然狀態中與該細胞正常相關聯的細胞分開的細胞。在一些實施方式中,在體外培養細胞。在其他實施方式中,不在體外培養細胞。
“靶位點”或“靶序列”指的是基因組核酸序列,其限定了在足以發生結合的條件下可以與結合分子特異性地結合的核酸部分。
如本文使用的術語“治療性的”意思是治療和/或預防。治療性效果藉由疾病狀態的阻抑、緩解或根除獲得。
如本文使用的術語“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”指的是如下過程:藉由該過程外源性核酸被轉移或引入宿主細胞。“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是已經被轉染、轉化或轉導有外源性核酸的細胞。細胞包括原代對象細胞和其子代。
如本文使用的短語“在轉錄控制下”或“可操作地連接的”意思是啟動子處於與多核苷酸有關的正確的位置和取向,以控制藉由RNA聚合酶的轉錄的起始和多核苷酸的表達。
術語“有效量”或“治療有效量”指的是將引起由研究者、獸醫、醫學醫生或其他臨床醫生正在尋找的組織、系統或對象的生物學或醫學應答的對象化合物的量。術語“治療有效量”包括以下的化合物的量:當被施用時,其足以預防治療的紊亂或疾病的跡象或症狀中的一個或多個的發展,或以一定程度減輕治療的紊亂或疾病的跡象或症狀中的一個或多個。治療有效量將根據化合物、疾病和其嚴重性、和待治療的對象的年齡、重量等而變化。
藉由以下實施例進一步詳細說明本公開。這些實施例僅用於說明性目的,而並不用於限制本公開的範圍。
本公開實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件;或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑,為市場購買的常規試劑。
實施例1. pLVX-EF1-CD19 CAR慢病毒載體的構建
(1)人CD8α前導信號區(SEQ ID NO:5),人CD8α鉸鏈區(SEQ ID NO:7)、人CD8α跨膜區(SEQ ID NO:9)、人4-1BB胞內區(SEQ ID NO:11)和人CD3ζ胞內區基因序列信息(SEQ ID NO:13),從NCBI網站數據庫獲得,CD19 scFv衍生自FMC63抗體(參考Mol Immunol.1997;34:1157-1165.),其核酸序列分別如CD19-N1 scFv(SEQ ID NO:17),CD19-N2 scFv(SEQ ID NO:
19),CD19-N3 scFv(SEQ ID NO:21),CD19-N4 scFv(SEQ ID NO:23)所示。
(2)將以上核苷酸序列交給南京金斯瑞生物科技有限公司進行基因合成,兩端加上酶切位點,得到完整的CD19-CAR基因序列CD19 CAR-N1(SEQ ID NO:25),CD19 CAR-N2(SEQ ID NO:27),CD19 CAR-N3(SEQ ID NO:29),CD19 CAR-N4(SEQ ID NO:31),CD19-CAR結構由5’到3’依次為CD19 scFv、鉸鏈(Hinge)結構、跨膜結構、4-1BB和CD3ζ。
(3)pLVX-EF1-MSC質粒獲得
用ClaI和EcoRI兩種內切酶,切下pLVX-CMV-MCS(Clontech公司pLVX-IRES-ZsGreen1,貨號:632187)的CMV啟動子和pCDH-EF1-MCS(購自System Biosciences公司,貨號CD530A-2)的EF1啟動子(SEQ ID NO:4)。瓊脂糖凝膠電泳回收切除CMV的pLVX-CMV-MCS載體和來自pCDH-EF1-MCS的EF1啟動子片段。使用DNA Ligation Kit(Takara)將EF1啟動子片段連接到載體pLVX-MCS中,得到pLVX-EF1-MSC質粒,然後轉化到感受態大腸桿菌TOP10內。提取質粒,經測序驗證後,得到正確的pLVX-EF1-MCS慢病毒載體,測序引子為:PLVX-PF(SEQ ID NO:1)和PCDHI-R(SEQ ID NO:2),序列如下所示:PLVX-PF:CATTCGATTAGTGAACGGATCT(SEQ ID NO:1)
PCDHI-R:GACGGCAATATGGTGGAA(SEQ ID NO:2)
(4)用EcoRI(NEB)和NotI(NEB)雙酶切CD19-CAR核酸分子,用DNA Ligation Kit(Takara)將其連接插入到慢病毒載體pLVX-EF1-MCS的EcoRI和NotI位點中,得到pLVX-EF1-CD19 CAR慢病毒載體:pLVX-EF1-002A(其CD19
CAR序列為CD19 CAR-N1),CD19-CAR慢病毒載體pLVX-EF1-002B(其CD19 CAR序列為CD19 CAR-N2),CD19-CAR慢病毒載體pLVX-EF1-002C(其CD19 CAR序列為CD19 CAR-N3),CD19-CAR慢病毒載體pLVX-EF1-002D(其CD19 CAR序列為CD19 CAR-N4),然後轉化到感受態大腸桿菌TOP10內。將得到的pLVX-EF1-CD19 CAR慢病毒載體進行測序,測序引子為:pLVX-PF(SEQ ID NO:1)和Xd-SR(SEQ ID NO:3),序列如下所示:pLVX-PF:CATTCGATTAGTGAACGGATCT(SEQ ID NO:1)
Xd-SR:AAAGCCATACGGGAAGCAATA(SEQ ID NO:3)。
選取測序正確的單純株菌落進行活化和接種,用QIAGEN的去內毒素質粒抽提試劑盒提取慢病毒載體。
實施例1中涉及的相關序列如下所示:EF1啟動子:
(SEQ ID NO:4)
人的CD8α前導信號區核苷酸序列:
(SEQ ID NO:5)
人的CD8α前導信號區胺基酸序列:MALPVTALLLPLALLLHAARP SEQ ID NO:6)
人的CD8α鉸鏈區核苷酸序列:
(SEQ ID NO:7)
人的CD8α鉸鏈區胺基酸序列:
(SEQ ID NO:8)
人的CD8α跨膜區核苷酸序列:
(SEQ ID NO:9)
人的CD8α跨膜區胺基酸序列:IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO:10)
人的4-1BB胞內區核苷酸序列:
(SEQ ID NO:11)
人的4-1BB胞內區胺基酸序列:
(SEQ ID NO:12)
人的CD3ζ胞內區核苷酸序列:
(SEQ ID NO:13)
人的CD3ζ胞內區胺基酸序列:
(SEQ ID NO:14)
FMC63抗體重鏈可變區胺基酸序列:
(SEQ ID NO:15)
FMC63抗體輕鏈可變區胺基酸序列:
(SEQ ID NO:16)
CD19-N1 scFv核苷酸序列:
(SEQ ID NO:17)
CD19-N1 scFv胺基酸序列:
(SEQ ID NO:18)
CD19-N2 scFv核苷酸序列:
(SEQ ID NO:19)
CD19-N2 scFv胺基酸序列:
(SEQ ID NO:20)
CD19-N3 scFv核苷酸序列:
(SEQ ID NO:21)
CD19-N3 scFv胺基酸序列:
(SEQ ID NO:22)
CD19-N4 scFv核苷酸序列:
(SEQ ID NO:23)
CD19-N4 scFv胺基酸序列:
(SEQ ID NO:24)
CD19 CAR-N1核苷酸序列:
(SEQ ID NO:25)
CD19 CAR-N1胺基酸序列:
(SEQ ID NO:26)
CD19 CAR-N2核苷酸序列:
(SEQ ID NO:27)
CD19 CAR-N2胺基酸序列:
(SEQ ID NO:28)
CD19 CAR-N3核苷酸序列:
(SEQ ID NO:29)
CD19 CAR-N3胺基酸序列:
(SEQ ID NO:30)
CD19 CAR-N4核苷酸序列:
(SEQ ID NO:31)
CD19 CAR-N4胺基酸序列:
(SEQ ID NO:32)
陽性對照CTL109的製備方法參考專利WO2012079000A1,申請日為2011-12-09,公開日為2012-06-14,其中CD19-CAR的序列如下:陽性對照CTL109的CD19-CAR核苷酸序列:
(SEQ ID:33)
CD3ζ胞內區核苷酸序列:
(SEQ ID NO:56)
CD3ζ胞內區胺基酸序列:
(SEQ ID NO:57)
本公開中陽性對照CTL-019的製備方法參考專利WO2012079000A1,其中陽性對照CTL-109的CD19-CAR核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示,陽性對照CTL-019的CD19-CAR胺基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
陽性對照CTL109的CD19-CAR胺基酸序列:
(SEQ ID NO:34)
陰性對照CART-MSN的製備方法參考專利CN104159909A,其中的SS1CAR的製備過程,在合成SS1-CAR的全基因序列時,去掉了專利中SS1CAR的BamHI酶切位點,該位點位於CD8α前導信號區和SS1 scFv之間,其中MSN-CAR(SS1CAR)的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示,MSN-CAR(SS1CAR)的胺基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
MSN-CAR(SS1CAR)的核苷酸序列:
(SEQ ID NO:35)
MSN-CAR(SS1CAR)的胺基酸序列:
(SEQ ID NO:36)
實施例2. PBMC提取
招募健康志願者,無感冒發燒症狀,簽署知情同意書。由專業醫務人員於靜脈取血100ml到BD抗凝血管(貨號:367886)。血液與等量的PBS緩衝液(含2%的胎牛血清)混合。取PBMC分離管Sepmate-50(STEMCELL Technology,
貨號:86450),加入15ml的Ficoll緩衝液(GE healthcare,17-5442-02),再加入血液PBS的混合液。離心後PBS重新懸浮沉澱細胞。對重新懸浮細胞計數,取10μl混懸液加入10μl 0.1%的台盼藍混勻,計細胞數和存活率。
實施例3. T細胞純化
取PBMC細胞,300g離心5分鐘後,棄去上清,加入相應量的PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%的胎牛血清)重新懸浮細胞,調整細胞密度為5×107個/ml。用EasySepTM Human T Cell Enrichment Kit(STEMCELL,貨號:17951)純化人T細胞,首先加入50μl/ml的Cooktail蛋白酶抑制劑(Biotool,B14001a)到PBMC混懸液中,混勻後室溫靜置10分鐘。然後加入50μl/ml的EasySepTM D Magnetite Particles(STEMCELL,貨號19550)混勻,室溫靜置5分鐘。將細胞懸液加入到5ml流式管中,再放入磁極中5分鐘。快速倒出細胞懸液,補充PBS緩衝液到流式管中並重新懸浮,重複3次。將得到的細胞懸液300g離心5分鐘,棄上清,細胞沉澱用VIVO-15培養基(LONZA)重新懸浮,並調整密度為1×106個/ml,再加入rIL-2(R&D,貨號:202-IL-050)使之濃度為100IU/ml,然後放入37℃細胞培養箱中培養。
實施例4. T細胞激活
抗-CD3/抗-CD28磁珠(Life Technology,貨號:11131D)用PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%的胎牛血清)重新懸浮,後加入磁極中靜置2分鐘後棄去上清。重複4次上述過程。取洗後磁珠,磁珠數量按1:1加入純化好的T細胞中,混勻,放入37℃培養3天。3天後取出磁珠,首先將目的細胞用移液器重新懸浮多次。將細胞懸液置於磁極中,靜置兩分鐘後,棄去管壁上的磁珠。
實施例5. pLVX-EF1-CD19 CAR病毒感染T細胞
(1)pLVX-EF1-CD19 CAR慢病毒包裝和濃縮:
慢病毒質粒pLVX-EF1-CD19 CAR與兩個輔助質粒pCMV-dR8.91(購自addgene)和pCMV-VSV-G(購自addgene)用天根公司的大提質粒試劑盒提取。293T細胞(購自ATCC)在轉染前一天在75cm2培養皿中長滿,按1:3繼代,每個培養皿培養基為15ml。轉染按照Lipo3000(life technologies,貨號L3000008)的步驟進行。示例性的轉染體系如下:
混勻體系1和2,靜置5分鐘後將二者混勻,再靜置10分鐘。小心加入293T細胞中。6小時後換新鮮培養基。48小時後收培養基存於4℃,重新加入新Opti-MEM培養基15ml(Gibco,貨號:51985034),24小時後再收上清。將得到的病毒上清用0.45μm的濾膜過濾,裝入超速離心管中。在4℃條件下50000g離心2小時45分鐘,將上清小心徹底去除,剩下肉眼可見的白色病毒沉澱用百分之一上清體積的PBS緩衝液重新懸浮,病毒重新懸浮後置於4℃溶解30分鐘左右。溶解完成後分裝成小份凍存於-80℃冰箱。
(2)pLVX-EF1-CD19 CAR慢病毒感染T細胞
人原代T細胞在抗-CD3/抗-CD28磁珠激活一天後,重新懸浮細胞,置於磁極中靜置兩分鐘,取細胞懸液。對細胞懸液進行細胞計數。取約1×107個細胞300g離心5分鐘,棄去培養基,加入新培養基1ml重新懸浮。加入濃縮的慢病毒調整MOI為5,混勻,32℃條件下2000g離心90分鐘,棄去上清,加入新培養基Lonza X-VIVO 15(含有100IU/ml的rIL-2,購自R&D,貨號:202-IL-050)調整細胞密度為1×106個/ml,重新懸浮後加入剛分離的抗-CD3/抗-CD28磁珠。37℃培養箱中繼續培養,獲得CD19 CAR-T細胞(CART19):CART19-N2,體外和體內實驗前使用磁力架將磁珠去除。
使永同樣的方式獲得CD19 CAR-T細胞:CART19-N1、CART19-N3、和CART19-N4。
實施例6. CART19細胞中TCR、B2M、PD-1基因的剔除
(1)crRNA的設計
基於TRAC、B2M和PD-1的核苷酸序列選取適當的靶區域,設計長度為17-20nt的crRNA,將crRNA與所使用Cas9蛋白相應的tracrRNA序列連接形成sgRNA,其中crRNA位於tracrRNA的5’端。藉由實驗篩選剔除效率高、脫靶率低的crRNA。所選取部分crRNA序列如下:
Cas9蛋白來自釀膿鏈球菌(Cas9 Nuclease NLS,S.pyogenes(BioLabs)),所對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO:53所示,Cas9(含NLS)蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO:54所示。
SEQ ID NO:53
Cas9(含NLS)蛋白的胺基酸序列:
SEQ ID NO:54
(2)sgRNA體外轉錄:
先進行sgRNA的模板PCR擴增,PCR擴增體系如下表,
再進行PCR產物回收:
參考Tiangen普通DNA產物純化試劑盒DP214說明書。獲得可用於體外轉錄sgRNA的DNA。利用Ambion體外轉錄試劑盒MEGAshortscriptTM Kit(cat#AM1354),轉錄sgRNA。參考Ambion MEGAclearTM Kit說明書(cat#AM1908),純化所獲得的sgRNA,經分光光度計和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測,均達到要求立即進行分裝,備用。
(3)電轉化CRISPR-Cas9剔除CART19細胞中TRAC、B2M、PD-1基因
利用LONZA 4D電轉化儀,電轉化所獲得的CART19細胞(該方法也可用於剔除原代T細胞),採用的試劑盒為:P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X kit(LONZA,V4XP3024)。
首先,配製如下電轉化體系:
將上述電轉體系混勻,室溫孵育10分鐘。CAR-T細胞在激活了三天以後,用磁極去除抗-CD3/抗-CD28磁珠,取5×106細胞/管,300g離心5分鐘,徹底去除上清,加入孵育好的電轉化體系到細胞沉澱中,另外再加72μl的
Nucleofector緩衝液和18μl的Supplement緩衝液,混勻後加入到100μl的LONZA電轉化杯中。放入LONZA-4D電穿孔儀中按E0-115程序電轉化。電轉化完成後,電轉化杯室溫靜置5分鐘。將電轉化杯中細胞移入預熱的X-VIVO-15培養基中,調成細胞密度為1×106個/ml,37℃繼續培養。
實施例7. TCR、B2M陰性CART19細胞篩選
CART19細胞在CRISPR-Cas9剔除TRAC後培養至第10天,做TCR陰性細胞富集。首先把所有細胞300g離心5分鐘,用PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%胎牛血清)洗兩遍。調細胞密度為1×107個/ml,然後加入100μl/ml的Biotin-TCR抗體(購自德國美天旎公司,貨號130-109-918),4℃避光孵育10分鐘。300g離心5分鐘,用PBS緩衝液洗一遍後重新調細胞密度為1×107個/ml,按50μl/ml加入Anti-Biotin Microbeads(購自美天旎,貨號130-090-485),放4℃避光15分鐘。300g離心5分鐘,PBS緩衝液洗一遍後用500μl的緩衝液重新懸浮。將LD column(購自美天旎,貨號130-042-901)放置於磁極中,用2ml的PBS緩衝液潤洗1遍後,加入500μl的細胞懸液,目的細胞從LD管柱底下流出收集,待細胞懸液流完後重複2次加入2ml PBS緩衝液於LD管柱上。將接收的目的細胞懸液300g離5分鐘,重新懸浮於預熱的培養基中,得到剔除TCR CART19細胞,即UCART19TCR-/-。
將富集的TCR陰性細胞用PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%胎牛血清)洗兩遍,調細胞密度為1×107個/ml,然後加入100μl/ml的Biotin-B2M抗體(購自德國美天旎公司,貨號130-090-485),4℃避光孵育10分鐘。300g離心5分鐘,用PBS緩衝液洗一遍後重新調細胞密度為1×107個/ml,按50μl/ml加入Anti-Biotin Microbeads(購自美天旎,貨號130-090-485),放4℃避光15分鐘。
300g離心5分鐘,PBS緩衝液洗一遍後用500μl的緩衝液重新懸浮。LD column(購自美天旎,貨號130-042-901)放置於磁極中,用2ml的PBS緩衝液潤洗1遍後,加入500μl的細胞懸液,目的細胞從LD管柱底下流出收集,待細胞懸液流完後重複2次加入2ml PBS緩衝液於LD管柱上。將接收的目的細胞懸液300g離心5分鐘,重新懸浮於預熱的培養基中進行培養,得到雙剔除TCR和B2M的CD19-CART細胞,即UCART19TCR-/- B2M-/-。以類似的方式篩選三剔除TCR、B2M和PD-1的CD19-CART細胞,即UCARTTCR-/- B2M-/-PD-1-/-,細胞中PD-1的剔除鑒定見測試例5。
將富集的細胞使用BD分選型流式細胞儀進行分選,UCARTTCR-/-和UCARTTCR-/- B2M-/-的純度結果如第1圖所示。從結果可以看出,使用上述篩選方法獲得的UCARTTCR-/-的細胞純度可以達到99%以上,UCARTTCR-/- B2M-/-的細胞純度可以達到90%以上。
測試例
測試例1. pLVX-EF1-CD19 CAR慢病毒轉染T細胞效率測定
將T細胞與慢病毒質粒pLVX-EF1-002B按照MOI=5進行轉染,混合均勻後32℃,1600g離心1.5小時。離心結束小心吸掉病毒上清,使用預熱X-VIVO培養基(含100U/ml rhIL-2)調整密度為5×105個/ml,放入37℃的二氧化碳培養箱培養。四天後使用Biotin-Protein L(金斯瑞,貨號:M00097)藉由流式細胞儀檢測轉染效率,結果如第2圖所示。
由結果可知,轉染效率高達80%,說明上述慢病毒轉染的方法可以用於CART細胞製備。
測試例2. 不同crRNA CRISPR-Cas9剔除TCR效率分析
對實施例6所示針對TRAC設計的crRNA序列進行試驗比較剔除效率。體外轉錄得到sgRNA後,和Cas9蛋白被電轉入激活的原代T細胞,48小時後用流式細胞儀檢測胞外TCR蛋白的表達。設計的crRNA均能不同程度地剔除TRAC基因,其中crRNA-11的剔除效率最高(結果未示出)。
測試例3. 不同遞送系統比較分析
三種遞送系統:質粒、mRNA和RNP(蛋白RNA複合體)。
crRNA-11針對的是TRAC,使用天根公司的大提質粒試劑盒大量提取質粒;Cas9的mRNA體外轉錄:首先用T7引子PCR得到含T7啟動子的DNA模板,然後利用Ambion的T7體外轉錄試劑盒(thermo,AM1345)體外轉錄得到Cas9的mRNA。
sgRNA和Cas9蛋白複合物的參照實施例6製備。
分別取Jurkat細胞(ATCC購買)5×106個離心棄去上清,然後分別用三種不同遞送物質在Invitrogen的電轉系統Neon MPK5000上電轉。48小時後取0.5×106個細胞,用PBS緩衝液洗2遍後用100μl的緩衝液重新懸浮,加入10μl的PE-TCR抗體(eBioscience,貨號H57-597),混勻後4℃孵育30分鐘。PBS緩衝液洗一遍後加入500μl緩衝液重新懸浮細胞,上流式細胞儀檢測TCR表達水平,結果第3圖所示。
結果表明:sgRNA和Cas9蛋白複合物(RNP)的遞送系統可以獲得最高剔除效率,是較佳的方法。
測試例4. 隨機N-oligo或魚精DNA增加CRISPR-Cas9剔除TRAC效率
在利用RNP遞送系統進行基因剔除時,RNP與隨機序列N-oligo(寡聚脫氧核糖核酸)或魚精DNA(R&D,貨號:9610-5-D)混勻後同時電轉化。
示例性的N-oligo序列:
(SEQ ID NO:55)
在實施例5(3)的基礎之上,向RNP複合物中再加入100-200nM的N-oligo DNA,N-oligo DNA為Page級。N-oligo對CRISPR-Cas9剔除TRAC效率影響如第4A圖、第4B圖所示,結果顯示N-oligo無論是對T細胞或是CART19細胞,都能有效的提高CRISPR-Cas9剔除TRAC基因的效率。
在實施例5(3)的基礎之上,向RNP複合物中再加入100-200nM的魚精DNA片段,魚精DNA片段對剔除TRAC效率影響如第4C圖所示,結果顯示添加魚精DNA片段後TARC剔除效率為90.3%,而添加N-oligo的TRAC基因剔除效率為86.3%,說明添加魚精DNA片段可以提高TRAC基因剔除效率。
測試例5. T細胞剔除B2M,PD-1效率檢測
同樣設計多條crRNA,藉由實驗比較,篩選出剔除效率最高,脫靶率最低的crRNA進行B2M基因的剔除。基於實施例5(3)相同的方法,利用RNP遞送系統和N-oligo,對T細胞的B2M和/或PD-1基因進行剔除。
對於B2M蛋白,因B2M基因表達與HLA-ABC在細胞膜上的展示呈緊密聯繫,利用APC-HLA-ABC抗體(eBioscience,貨號12-9983-71)對B2M基因的剔除效率進行檢測。結果(如第5圖)顯示B2M基因的剔除效率大於80%。
對於PD-1基因,RNP和N-oligo混合物電轉化細胞後48小時,分別取1×106個細胞,用PBS緩衝液洗2遍後徹底吸去上清,參照試劑盒GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit(Thermo Fisher)進行T7E1實驗,藉由比較完整野生型基因PCR片段大小與產生突變後生成的兩個小片段的條帶光密度比較,計算出剔除效率,具體的計算公式如下:剔除效率=1-[(1-切割百分比)1/2],其中切割百分比=切割後小片段光密度和/(切割後小片段光密度和+未被切割的片段光密度)。
結果(第6圖所示)顯示所選取的PD-1的三個crRNA能有效的剔除PD-1基因,剔除效率均大於80%,其中crRAN-16的剔除效率最高。
測試例6. CRISPR-Cas9造成的基因突變分析
首先在TRAC,B2M和PD-1基因的打靶位點附近設計引子。T細胞基於CRISPR-Cas9系統,利用RNP+N-oligo或魚精DNA片段剔除TRAC,B2M和PD-1後,分別取正常T和基因剔除T細胞各1×106個提取基因組DNA。將得到的PCR產物DNA片段和T平端載體(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit,北京全式金生物技術有限公司,貨號CB111-01)連接。連接後轉化TOP10感受態細胞,塗Amp抗性的固體培養板。第二天將得到純株進行測序,每板至少測30個以上純株,將得到的測序結果與野生型序列對比分析。結果如第7A圖至第7B圖所示,其中PD-1突變分析結果未示出,MT為純株編號。
由結果可知,TRAC、B2M和PD-1分別在crRNA對應的基因組DNA處發生了基因突變,說明真正在基因水平剔除了TRAC、B2M和PD-1基因。
測試例7. 脫靶分析
在http://crispr.mit.edu/網站上,基於所設計crRNA(crRNA-11,crRNA-13和crRNA-16對可能出現的脫靶位點進行預測,TRAC,B2M和PD-1分別選取8或9個潛在的脫靶位點(OT1-OT9),針對這些潛在的脫靶位點設計引子進行PCR擴增並測序。剔除細胞基因組DNA脫靶位點與對照(目標基因TRAC、B2M或PD-1)的峰圖測序結果在網站https://tide.nki.nl/上進行TIDE比對分析,結果(第8A圖至第8C圖所示)顯示,所採用的剔除方法和所選取的針對TRAC,B2M和PD-1的crRNA脫靶率極低。
測試例8. TCR剔除對細胞信號通路及殺傷活性的影響分析
使用CD3抗體(5μg/ml)或CD28抗體(5μg/ml)包被96孔板,每孔加100μl,37℃包被兩個小時,取出後,用PBS洗兩遍。分別加入TCR陰性T細胞和普通T細胞,細胞密度為1×106個/ml,37℃培養24小時後,取出染流式抗體CD25和CD69,用流式細胞儀檢測其CD25和CD69的表達情況。
結果(第9A圖至第9B圖所示)表明T細胞在TRAC基因剔除後無法被CD3抗體或者CD28抗體誘導表達CD25和CD69,即TCR剔除後的CART細胞不能被CD3抗體或CD28激活。
測試例9. CD19-CART細胞體外細胞毒性分析
材料:K562,Raji和Daudi細胞均購自ATCC,Nalm6購自BD公司,Human IL-2 ELISA Kit II(貨號:550611)和Human IFN-γ ELISA Kit II(貨號:550612)購自BD,anti-human CD107a(貨號555801)抗體購自BD公司。
方法和結果:
9.1 CART細胞對K562-CD19細胞的體外殺傷
K562-CD19細胞構建方法如下,參考NCBI NM_001770.5序列設計CD19抗原,構建至pLVX-EF1-CD19質粒,轉染K562細胞後挑取單純株,獲得K562-CD19細胞系。
調整靶細胞(K562-CD19細胞和K562細胞)密度為5×105/ml,取100μl於96孔圓底板,然後按照效應細胞(CART19)與靶細胞比例E:T ratio=30:1-0.3:1的範圍或某一特定比例加入效應細胞(30:1),吹吸混勻。1000rpm離心2min,培養箱孵育4h後檢測細胞裂解情況。收集150μl上清於-20度凍存,用於後續實驗。每孔留50μl上清,加入100μl檢測液(Promega公司的Steady-Glo® Luciferase Assay System,E2520),室溫孵育5min,吸100μl於黑板中,使用酶標儀檢測生物發光值,並計算殺傷率。
殺傷率=(單純Target讀值-加Effector讀值)/單純Target讀值。
所測殺傷結果如第10圖,其中Mock CART表示含有空載體的T細胞,CART-MSN表示為針對間皮素(mesothelin)的CART細胞。從結果可以看出CART19細胞對K562-CD19細胞具有顯著殺傷能力,而對K562細胞(CD19陰性細胞)沒有殺傷,說明CART19細胞可特異性的殺傷CD19陽性細胞。
9.2 CART細胞對Raji細胞的體外殺傷
取靶細胞(Raji細胞)調整為細胞密度到5×105/ml,取100μl於96孔圓底板,然後按照效應細胞與靶細胞比例E:T ratio=30:1-0.3:1的範圍(30:1,10:1,3:1,1:1和0.3:1)加入效應細胞(CART19細胞),吹吸混勻。取CTL-019作為陽性對照,1000rpm離心2min,培養箱孵育4h後檢測細胞裂解情況。收集150μl上清於-20度凍存,用於後續實驗。每孔留50μl上清,加上100μl檢測液(Promega公司的
Steady-Glo® Luciferase Assay System,E2520)室溫孵育5min,吸100μl於黑板中,使用酶標儀檢測生物發光值,並計算殺傷率。
殺傷率=(單純Target讀值-加Effector讀值)/單純Target讀值。
所測殺傷結果(第11圖)顯示,CART19細胞對白血病腫瘤細胞具有顯著的殺傷能力,而且具有劑量效應,其殺傷能力與陽性對照CTL-019的殺傷能力相當。
測試例10. CART19細胞體外殺傷靶細胞過程中細胞因子的釋放
取CART19-N2細胞分別於靶細胞Raji腫瘤細胞和Daudi細胞共孵育4h(E:T=5:1),取上清150μl,使用BD公司Human IL-2 ELISA Kit II(貨號:550611)和Human IFN-γ ELISA Kit II(貨號:550612)檢測其上清中IL-2及IFN-γ的濃度,所得結果如第12圖。
結果顯示,當與靶細胞共同培養時,CTL-019和CART19-N2細胞均產生了大量的IFN-γ和IL-2的細胞因子,說明CTL-019和CART19-N2均可以表現出殺傷性T細胞的特徵。並且CART19-N2細胞可比CTL-019細胞釋放更多的IFN-γ,說明CART19-N2細胞對靶細胞的殺傷作用更強。
測試例11. CART19及UCART19細胞體外殺傷血液系統癌細胞的能力測定
取靶細胞(Daudi、Raji和Nalm6細胞,均購自ATCC)調整為細胞密度為5×105/ml,取100μl於96孔圓底板,然後按照效應細胞與靶細胞比例E:T ratio=30:1-1:1的範圍(30:1,10:1,3:1和1:1)加入效應細胞:T細胞、CART19-N2、UCARTTCR-/-和UCARTTCR-/- B2M-/-,吹吸混勻。1000rpm離心2min,培養箱孵育4h後檢測細胞裂解情況。收集150μl上清於-20度凍存,用於後續實驗。每孔留50μl上清,加入100μl檢測液(Promega公司的Steady-Glo® Luciferase Assay System,
E2520)室溫孵育5min,吸100μl於黑板中,使用酶標儀檢測生物發光值,並計算殺傷率。
殺傷率=(單純Target讀值-加Effector讀值)/單純Target讀值。
所測殺傷結果如第13A圖至第13C圖。從結果可以看出CART19-N2細胞和UCART19細胞對血液系統腫瘤細胞具有劑量依賴的殺傷活性,其中UCARTTCR-/- B2M-/-和UCARTTCR-/-細胞對腫瘤細胞的殺傷能力均高於CART19。
測試例12. CART19及UCART19細胞體外殺傷靶細胞的過程中細胞表面CD107a的表達水平測定
取靶細胞(Daudi、Raji和Nalm6細胞,均購自ATCC)調整為細胞密度為5×105/ml,取100μl於96孔圓底板,然後按照效應細胞與靶細胞比例E:T ratio=10:1加入效應細胞CTL-019、CART19-N2、UCART19TCR-/-和UCART19TCR-/- B2M-/-,吹吸混勻。1000rpm離心2min,培養箱孵育4h後檢測,取細胞使用anti-humanCD8和anti-human CD107a抗體染色,使用流式細胞儀測定CD107a陽性細胞的比例,結果如第14A圖至第14C圖。
從結果可以看出,CART19-N2細胞和UCART19TCR-/-和UCART19TCR-/- B2M-/-均表現出CD107a的顯著上調表達,且顯著高於CTL-019細胞,說明在CART細胞的殺傷過程中,殺傷性CART細胞起了主要的殺傷作用,而不是輔助性的CART細胞。
測試例13. CART19細胞的小鼠體內抗腫瘤活性分析
Raji-luciferase細胞構建:將螢光素酶(luciferase)的基因序列構建到pLVX-EF1病毒載體中,包裝慢病毒後轉染Raji細胞(購自ATCC),用流式分選儀篩選Raji-luciferase陽性細胞,擴大培養後備用。
NOG小鼠(維通利華公司購買),雌性,6至8週,飼養環境:SPF級。適應性飼養一週後,將小鼠隨機分成6組,每組6隻。每隻小鼠使用3.5×105個Raji-luciferase腫瘤細胞靜脈注射造模,7天後記錄腫瘤細胞生物發光強度,隨後每隻小鼠回輸1×107個CART細胞,每週用PE小動物成像儀記錄小鼠體內Raji-luciferase細胞的生物發光強度,比較不同CART在體內對Raji腫瘤細胞的殺傷情況。NOG小鼠的分組及回輸CART19細胞的情況如下表:
小鼠造模及回輸後5週實驗拍照結果及統計的生物發光強度見第15A圖至第15B圖,總生存率見第15C圖。從圖中可以看出,CART19-N1、CART19-N2和CART19-N3與諾華CTL-019體內抗腫瘤效果相似,均能有效殺滅體內白血病腫瘤Raji細胞。
測試例14. 使用K562細胞刺激後CART19與UCART19細胞的小鼠體內抗腫瘤活性分析
CART19、UCART19細胞培養12天以後,使用K562-CD19細胞刺激,取1×108個K562-CD19細胞,用1640+10% FBS洗一次,然後重新懸浮在10ml的1640+10% FBS中。1:400加入25μl的mytomycin(20mg/ml,R&D公司,貨號3258),使其終濃度為50μg/ml,37℃孵育30min。離心棄上清後用15ml 1640+10% FBS洗三次,最後一次徹底吸掉上清。加入1ml含有100IU/ml rIL-2的X-VIVO培養基調整細胞密度為1×108/ml。按照CAR-T:K562-CD19=5:1加入mytomycin處理過的K562-CD19細胞,放回37℃培養箱繼續培養。
造模及體內回輸方法,NOG小鼠(維通利華公司公司購買,雌性,6至8週),飼養環境:SPF級。適應性飼養一週後,將小鼠隨機分成8組,每組6隻。每隻小鼠使用3.5×105的Raji-luciferase腫瘤細胞靜脈注射NOG小鼠造模,7天後每隻小鼠回輸1×107個CART19細胞,回輸CART細胞後每週用PE小動物成像儀記錄小鼠體內Raji-luciferase細胞的生物發光強度,比較不同CART在體內對Raji腫瘤細胞的殺傷情況。比較不同CART19在體內對Raji腫瘤細胞的殺傷情況。小鼠造模及回輸後5週實驗拍照結果及統計的生物發光強度見第16A圖,總生存率見第16B圖。NOG小鼠的分組情況如下表:
從結果可以發現,回輸CART19細胞和UCART19TCR-/-細胞都可以顯著延長造模小鼠的存活期;使用K562-CD19細胞二次及刺激以後,回輸UCART19TCR-/-細胞的小鼠的存活期比回輸CART19細胞的小鼠更長,參見第16B圖。
測試例15. 小鼠體內CART細胞的增殖分析
NOG小鼠(維通利華公司購買,雌性,6至8週),飼養環境:SPF級。適應性飼養一週後,將小鼠隨機分成8組,每組6隻。每隻小鼠使用3.5×105個Raji腫瘤細胞(購自ATCC)靜脈注射造模,6天後,每隻小鼠回輸1×107個CART19-N2細胞和陰性對照CART-MSN細胞,回輸CART細胞後第二天,眼眶取小鼠血,使用抗人CD45流式抗體(購自BD公司,貨號557748)檢測小鼠外周血中CART細胞量,其後每週(與前一次采血相差7天)測定一次。回輸後3週內人T細胞在小
鼠外周血中數量的變化結果見第17A圖至第17B圖。圖中數字代表小鼠編號及分組如下表:
從圖中結果可以看出,CART19-N2細胞回輸Raji腫瘤細胞造模的小鼠後,人源CART19-N2細胞在小鼠體內獲得顯著擴增,而CART-MSN細胞的數量並沒有顯著變化,說明CART19-N2細胞在小鼠體內受到了Raji腫瘤細胞的特異性刺激,獲得擴增信號。
測試例16. 剔除TCR後的T細胞的同種異體反應性測定
NOG小鼠(維通利華公司購買,雌性,6至8週),飼養環境:SPF級。適應性飼養一週後,隨機分成5組,每組6隻,使用輻照儀1Gy的劑量對小鼠進行輻照處理,第3天分別尾靜脈注射PBS、1×107剔除TCR後的人T細胞(T-TCR-)、1×107模擬剔除TCR的人T細胞(T-mock),1×107的CTL-019細胞和1×107的剔除TCR的CTL-019TCR-/-細胞(製備及篩選過程參照實施例5,實施例6和實施7)。第5天以後小鼠隔天稱重,注射後每週從小鼠眼底靜脈叢取血,測定小鼠外周血中的人CD45陽性T細胞的數量。小鼠分組情況見下表,所得存活、體重、人CD45陽性T細胞在體內的數量結果見第18A圖至第18D圖。
結果顯示,注射T-TCR-細胞組小鼠與注射PBS組的小鼠具有相類似的存活率,均顯著高於回輸人T-mock細胞組的小鼠;並且回輸人T-mock細胞組的小鼠體重下降明顯,而回輸T-TCR-和PBS組的小鼠的體重均未出現體重減輕的現象;T-mock組中小鼠體內T細胞較T-TCR-組有較為顯著的上升,說明TCR剔除後可以降低小鼠的GvHD作用;回輸CTL-019TCR-/-組的小鼠血液中人CD45+細胞的比例顯著低於回輸未剔除TCR的CTL-019組,進一步說明剔除TCR後可以降低小鼠的GvHD作用。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 一種分離的嵌合抗原受體以及包含其的修飾T細胞及用途
<130> 719005CPCT
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
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<220>
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<223> 測序引子PLVX-PF
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<221> 基因
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<212> PRT
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<221> 結構域
<223> FMC63抗體重鏈可變區胺基酸序列
<400> 15
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> FMC63抗體輕鏈可變區胺基酸序列
<400> 16
<210> 17
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19-N1 scFv核苷酸序列
<400> 17
<210> 18
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> CD19-N1 scFv胺基酸序列
<400> 18
<210> 19
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19-N2 scFv核苷酸序列
<400> 19
<210> 20
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> CD19-N2 scFv胺基酸序列
<400> 20
<210> 21
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19-N3 scFv核苷酸序列
<400> 21
<210> 22
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> CD19-N3 scFv胺基酸序列
<400> 22
<210> 23
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19-N4 scFv核苷酸序列
<400> 23
<210> 24
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> CD19-N4 scFv胺基酸序列
<400> 24
<210> 25
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19 CAR-N1核苷酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CD19 CAR-N1胺基酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19 CAR-N2核苷酸序列
<400> 27
<210> 28
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CD19 CAR-N2胺基酸序列
<400> 28
<210> 29
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19 CAR-N3核苷酸序列
<400> 29
<210> 30
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CD19 CAR-N3胺基酸序列
<400> 30
<210> 31
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD19 CAR-N4核苷酸序列
<400> 31
<210> 32
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CD19 CAR-N4胺基酸序列
<400> 32
<210> 33
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> 陽性對照CTL109的CD19-CAR核苷酸序列
<400> 33
<210> 34
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 陽性對照CTL109的CD19-CAR胺基酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> MSN-CAR(SS1CAR)的核苷酸序列
<400> 35
<210> 36
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> MSN-CAR(SS1CAR)的胺基酸序列
<400> 36
<210> 37
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-1
<400> 37
<210> 38
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-2
<400> 38
<210> 39
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-3
<400> 39
<210> 40
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-4
<400> 40
<210> 41
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TARC crRNA-5
<400> 41
<210> 42
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-6
<400> 42
<210> 43
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-7
<400> 43
<210> 44
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-8
<400> 44
<210> 45
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TARC crRNA-9
<400> 45
<210> 46
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-10
<400> 46
<210> 47
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-11
<400> 47
<210> 48
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> TRAC crRNA-12
<400> 48
<210> 49
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> B2M crRNA-13
<400> 49
<210> 50
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> PD-1 crRNA-14
<400> 50
<210> 51
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> PD-1 crRNA-15
<400> 51
<210> 52
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> PD-1 crRNA-16
<400> 52
<210> 53
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> Cas9蛋白對應的tracrRNA序列
<400> 53
<210> 54
<211> 1378
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> Cas9(含NLS)蛋白的胺基酸序列
<400> 54
<210> 55
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 不確定
<223> 示例性的N-oligo序列
<400> 55
<210> 56
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<223> CD3 ζ胞內區核苷酸序列
<400> 56
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> CD3 ζ胞內區胺基酸序列
<400> 57
Claims (39)
- 一種分離的嵌合抗原受體,其包括CD19抗原結合結構域,其中該CD19抗原結合結構域包含如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的分離的嵌合抗原受體,其還包括共刺激信號傳導區和/或CD3ζ信號傳導結構域。
- 如申請專利範圍第2項所述的分離的嵌合抗原受體,其中該共刺激信號傳導區包括共刺激分子的細胞內結構域,該共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或其任意組合。
- 如申請專利範圍第3項所述的分離的嵌合抗原受體,其中該共刺激分子為胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信號傳導區。
- 如申請專利範圍第2至4項中任一項所述的分離的嵌合抗原受體,其中該CD3ζ信號傳導結構域包括如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:57所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2至5項中任一項所述的分離的嵌合抗原受體,其進一步包括細胞外鉸鏈結構域。
- 如申請專利範圍第6項所述的分離的嵌合抗原受體,其中該細胞外鉸鏈結構域包含胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示的人CD8α前導信號區和胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示的人CD8α鉸鏈區。
- 如申請專利範圍第6或7項所述的分離的嵌合抗原受體,進一步包含CD8α跨膜結構域。
- 如申請專利範圍第8項所述的分離的嵌合抗原受體,其中該CD8α跨膜結構域胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的分離的嵌合抗原受體,其包括如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸分子,其編碼根據申請專利範圍第1至10項中任一項所述的嵌合抗原受體。
- 如申請專利範圍第11項所述的分離的核酸分子,其包含如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示的核酸序列。
- 如申請專利範圍第12項所述的分離的核酸分子,其包含編碼共刺激信號轉導區和/或CD3ζ信號傳導結構域的核酸序列。
- 如申請專利範圍第13項所述的分離的核酸分子,其中該編碼共刺激信號轉導區的核酸序列如SEQ ID NO:11所示,該編碼CD3ζ信號傳導結構域的核酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:56所示。
- 如申請專利範圍第13或14項所述的分離的核酸分子,其進一步包含編碼細胞外鉸鏈結構域的核酸序列。
- 如申請專利範圍第15項所述的分離的核酸分子,其中該編碼細胞外鉸鏈結構域的核酸序列包含如SEQ ID NO:5所示的人CD8α前導信號區和如SEQ ID NO:7所示的人CD8α鉸鏈區。
- 如申請專利範圍第15或16項所述的分離的核酸分子,其進一步包含如SEQ ID NO:9所示的CD8α跨膜結構域。
- 如申請專利範圍第11至17項中任一項所述的分離的核酸分子,其包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31所示的編碼CD19嵌合抗原受體的核酸序列。
- 一種載體,其包含申請專利範圍第11至18項中任一項所述的分離的核酸分子。
- 如申請專利範圍第19項所述的載體,其中該載體選自DNA、RNA、質粒、慢病毒載體、腺病毒載體和逆轉錄病毒載體。
- 如申請專利範圍第19項所述的載體,其中該載體進一步包括啟動子。
- 如申請專利範圍第21項所述的載體,其中該載體係如SEQ ID NO:4所示的EF-1啟動子。
- 一種T細胞,其包含如申請專利範圍第11至18項中任一項所述的分離的核酸分子或申請專利範圍第19至22項中任一項所述的載體或被遺傳修飾以表達申請專利範圍第1至10項中任一項所述的嵌合抗原受體。
- 如申請專利範圍第23項所述的T細胞,其為修飾的T細胞,包含能夠下調T細胞內源基因的核酸,其中該內源基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD-1基因中的一個或更多個。
- 如申請專利範圍第24項所述的T細胞,其中該能夠下調T細胞內源基因的核酸選自反義RNA、antigomer RNA、siRNA、shRNA和CRISPR-Cas9系統。
- 如申請專利範圍第24項所述的T細胞,其中該能夠下調T細胞內源基因的核酸選自CRISPR-Cas9系統;其中該CRISPR-Cas9系統進一步包含靶向 T細胞內源基因編碼序列或其表達調控序列的sgRNA,其中所述的sgRNA從5’到3’依次由長度為17nt、18nt、19nt或20nt的靶向內源基因的crRNA和與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接而成。
- 如申請專利範圍第25或26項所述的T細胞,其中該內源基因選自TRAC B2M和PD-1中的一種或更多種,其中該靶向內源基因TRAC的crRNA選自SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48所示crRNA中的任意一種或更多種,靶向內源基因B2M的crRNA如SEQ ID NO:49所示,靶向內源基因PD-1的crRNA選自SEQ ID NO:50、51和52所示crRNA中的任意一種或更多種。
- 如申請專利範圍第27項所述的T細胞,其中該靶向內源基因TRAC的crRNA係SEQ ID NO:47。
- 如申請專利範圍第27項所述的T細胞,其中該靶向內源基因PD-1的crRNA係SEQ ID NO:52。
- 如申請專利範圍第27至29項中任一項所述的T細胞,其中該下調內源基因TRAC的crRNA如序列SEQ ID NO:47所示,下調內源基因B2M的crRNA如序列SEQ ID NO:49所示,下調內源基因PD-1的crRNA如序列SEQ ID NO:52所示;該嵌合抗原受體包括如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第30項所述的T細胞,其中該嵌合抗原受體包含如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列。
- 一種用於製備如申請專利範圍第24至31項中任一項所述的T細胞的方法,其包括:a)將編碼嵌合抗原受體核酸引入所述T細胞;b)將能夠下調T細胞內源靶基因表達的sgRNA的核酸藉由CRISPR-Cas9系統引入T細胞。
- 一種醫藥組成物,其包括選自下述的一項或多項:i)根據申請專利範圍第1至10項中任一項所述的分離的嵌合抗原受體,ii)根據申請專利範圍第11至18項中任一項所述的分離的核酸分子,iii)根據申請專利範圍第19至22項中任一項所述的載體,和iv)根據申請專利範圍第23至31項中任一項所述的T細胞;以及,藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種申請專利範圍第33項所述的醫藥組成物或根據申請專利範圍第23至31項中任一項所述的T細胞的用途,其用在製備治療或預防腫瘤疾病、自身免疫疾病、病毒或細菌引起的感染性疾病的藥物。
- 如申請專利範圍第34項所述的用途,其中該腫瘤疾病是CD19介導的癌症。
- 如申請專利範圍第35項所述的用途,其中該癌症為乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、肺癌和甲狀腺癌或血液學癌症。
- 如申請專利範圍第36項所述的用途,其中該癌症為血液學癌症。
- 如申請專利範圍第37項所述的用途,其中該血液學疾病選自:急性白血病,包括急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性骨髓性白血病 和成髓細胞性、前髓細胞性、粒-單核細胞型、單核細胞性和紅白血病;慢性白血病,包括慢性髓細胞(粒細胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血病和難治療的CD19+白血病和淋巴瘤;真性紅細胞增多症、淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、擴散大B-細胞淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合症、多毛細胞白血病和脊髓發育不良。
- 如申請專利範圍第37項所述的用途,其中該血液學癌症為急性淋巴細胞白血病或慢性淋巴細胞白血病。
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