DE69822176T2 - Peptid/lipid-komplexbildung durch co-lyophilisation - Google Patents

Peptid/lipid-komplexbildung durch co-lyophilisation Download PDF

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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Bildung von Peptid/Lipid-Vesikeln und Komplexen mittels Co-Lyophilisierung von Peptiden, vorzugsweise solchen, die eine amphipathische alpha-Helixkonformation annehmen können, und einem oder mehreren Lipiden. Es können eine einzige Lösung, die sowohl die Peptide als auch die Lipide solubilisiert, oder zwei getrennte Lösungen lyophilisiert werden, Die Verfahren werden dazu verwendet, stabile Peptid/Lipid-Vesikel und -Komplexe zu erzeugen, die, ohne darauf beschränkt zu sein, micellare, sphärische und discoidale Komplexe einschließen, und zwar in Massenpräparationen und in kleineren Einheiten, wie sie beispielsweise für Dosierungen geeignet sind.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Liposomen sind Vesikel, die aus wenigstens einer Lipid-Doppelschichtmembran, die einen wässrigen Kern umschließt, zusammengesetzt sind. Im allgemeinen bilden Phospholipide die Lipid-Doppelschicht, wobei die Doppelschicht jedoch auch aus anderen Lipiden zusammengesetzt sein kann. Die wässrige Lösung innerhalb des Liposoms wird als "gefangenes Volumen" bezeichnet.
  • Liposomen wurden als Vehikel zur Zufuhr von, unter anderen Anwendungen, Arzneimitteln, Kosmetika, bioaktiven Verbindungen entwickelt. Die Lipid-Doppelschicht verkapselt das Arzneimittel, das kosmetische Mittel, die bioaktive Verbindung und dergleichen innerhalb des gefangenen Volumens des Liposoms, und das Mittel wird aus dem Liposomenkern ausgestoßen, wenn die Lipid-Doppelschicht mit einer Zell-Oberflächenmembran in Kontakt kommt. Das Liposom gibt seinen Inhalt an die Zelle durch Lipidaustausch, Fusion, Endocytose oder Adsorption ab. Ostro et al., 1989, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576. Alternativ dazu können das Arzneimittel, das kosmetische Mittel, die bioaktive Verbindung und dergleichen mit der Lipid-Doppelschichtmembran des Vesikels assoziiert sein oder darin eingebaut sein.
  • Zusätzlich zu Vesikeln wurden lipidhaltige Komplexe dazu verwendet, Mittel in Teilchenform zuzuführen. Beispielsweise haben zahlreiche Forscher festgestellt, daß es nützlich ist, rekonstituierte lipoproteinartige Teilchen oder Komplexe herzustellen, die eine ähnliche Größe und Dichte wie Lipoproteinteilchen hoher Dichte (HDL) aufweisen. Diese rekonstituierten Komplexe bestehen üblicherweise aus gereinigten Apoproteinen (üblicherweise Apoprotein A-1) und Phospholipiden wie beispielsweise Phosphatidylcholin. Manchmal ist auch ein nichtverestertes Cholesterin beteiligt. Die üblichsten Verfahren zur Herstellung dieser Teilchen sind (1) die gemeinsame Ultraschallbehandlung der Bestandteile, entweder durch Chargen-Beschallung oder mit einem Sonden-Beschaller, (2) die spontane Wechselwirkung des Proteinbestandteils mit vorgebildeten Lipidvesikeln, (3) die detergens-vermittelte Rekonstitution, gefolgt von der Entfernung des Detergens durch Dialyse. Jonas, 1986, Meth. in Enzymol. 128: 553–582; Lins et al., 1993, Biochimica et Biophysica Acta, 1151: 137–142; Brouillette & Anantharamaiah, 1995, Biochimica et Biophysica Acta 1256: 103–129; Jonas, 1992, Structure & Function of Apoproteines, Chapter 8: 217–250. Ähnliche Komplexe wurden auch dadurch gebildet, daß man die Apoprotein-Komponenten durch arnphipathische Helix-bildende Peptide ersetzte.
  • Unglücklicherweise führen alle diese Methoden zu ernsthaften Problemen bei der Bildung von großen Mengen reiner Komplexe auf einer annehmbar kosteneffektiven Basis. Außerdem offenbart keine dieser Veröffentlichungen die Co-Lyophilisierung von Peptiden/oder Peptidanalogen, die in der Lage sind, eine arnphipathische alpha-Helix-Konformation anzunehmen, und eines Lipids.
  • Es ist ein Bereich von Technologien zur Herstellung von Lipidvesikeln und Komplexen bekannt. Vesikel, oder Liposomen, wurden unter Anwendung einer Vielzahl von Arbeitsweisen hergestellt, wobei unterschiedliche Vesikeltypen gebildet werden. Die unterschiedlichen Typen von Liposomen schließen ein: multilamellare Vesikel, kleine unilamellare Vesikel und große unilamellare Vesikel.
  • Die Hydration von Phospholipiden (oder anderen Lipiden) durch eine wässrige Lösung kann auch zu der Dispergierung von Lipiden und zur spontanen Bildung von multilamellaren Vesikeln ("MLVs") führen. Eine MLV ist ein Liposom mit zahlreichen Lipid-Doppelschichten, die den zentralen wässrigen Kern umgeben. Diese Typen von Liposomen sind größer als kleine unilamellare Vesikel (SUVs) und können einen Durchmesser von 350 bis 400 nm aufweisen. MLVs wurden ursprünglich dadurch hergestellt, daß man Lipide in Chloroform in einem Rundbodenkolben solubilisierte und das Chloroform verdampfte, bis das Lipid eine dünne Schicht auf der Wand des Kolbens bildete. Dann wurde die wässrige Lösung zugesetzt, und man ließ die Lipidschicht rehydratisieren. Vesikel bildeten sich, wenn der Kolben geschleudert oder verwirbelt wurde. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (unter Verweis auf Bangham et al., 1965, J. Mol. Biol. 13: 238). Johnson et al. berichteten anschließend, daß dieses Verfahren auch einzel-lamellare Vesikel erzeugte. Johnson et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 233: 820.
  • Eine kleine unilamellare Vesikel (SUV) ist ein Liposom mit einer einzigen Lipid-Doppelschicht, die einen wässrigen Kern umschließt. In Abhängigkeit von dem zur Erzeugung der SUV's angewandten Verfahren können sie im Durchmesser Größen von 25 bis 110 nm aufweisen. Die ersten SUV's wurden dadurch hergestellt, daß man eine Phospholipid-Präparation in Chloroform unter Stickstoff trocknete, die wässrige Schicht zugab, um eine Lipidkonzentration im millimolaren Bereich zu erzeugen, und die Lösung bei 45°C bis zur Klarheit mit Ultraschall behandelte.
  • Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. SUV's, die auf diese Weise hergestellt worden waren, lieferten Liposomen mit Durchmessern im Bereich von 25 bis 50 nm.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung von SUV's besteht im raschen Injizieren einer Ethanol/Lipidlösung in die zu verkapselnde wässrige Lösung. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (unter Verweis auf Batzri et al., 1973, Biochim. Biophys. Acta 298: 1015). Nach diesem Verfahren hergestellte SUV's weisen Durchmesser im Größenbereich von 30 bis 110 nm auf.
  • SUV's können auch dadurch hergestellt werden, daß man multilamellare Vesikel vier mal bei 20.000 psi durch eine French-Presse hindurchführt. Die auf diese Weise hergestellten SUV's weisen Durchmesser in einem Größenbereich von 30 bis 50 nm auf. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (unter Verweis auf Barenholz et al., 1979, FEBS Letters 99: 210).
  • Multilamellare und unilamellare Phospholipidvesikel können auch durch Extrusion von wässrigen Präparaten von Phospholipiden bei hohem Druck durch kleinporige Membranen gebildet werden (Hope et al., 1996, Chemistry and Physics of Lipids, 40: 89–107).
  • Eine große unilamellare Vesikel (LUV) ist insoweit SUV's ähnlich, als beide einzelne Lipiddoppelschichten darstellen, die den zentralen wässrigen Kern umgeben, wobei LUV's jedoch sehr viel größer sind als SUV's. In Abhängigkeit von ihren konstituierenden Teilen und den zu ihrer Herstellung verwendeten Verfahren können LUV's Durchmesser in einem Größenbereich von 50–1000 nm aufweisen. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. LUV's werden üblicherweise dadurch hergestellt, daß man eine von drei Verfahrensweisen anwendet: eine Detergens-Verdünnung, eine Umkehrphasenverdampfung und eine Infusion.
  • Bei der Detergens-Verdünnungstechnik werden Detergenslösungen wie Cholat, Desoxycholat, Octylglucosid, Heptylglucosid und Triton X-100 dazu verwendet, um aus der Lipidpräparation Mizellen zu bilden. Die Lösung wird dann dialysiert, um das Detergens zu entfernen, und führt zur Bildung von Liposomen. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York. Dieses Verfahren ist zeitaufwändig, und die Entfernung des Detergens ist im allgemeinen unvollständig. Die Anwesenheit von Detergens in der fertigen Präparation kann zu einer gewissen Toxizität der Liposomenpräparation und/oder zu einer Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften der Liposomenpräparation führen.
  • Die Umkehrphasen-Verdampfungstechnik solubilisiert Lipid in wässrig-unpolaren Lösungen, wobei invertierte Mizellen gebildet werden. Das unpolare Lösemittel wird verdampft, und die Mizellen aggregieren unter Bildung von LUV's. Dieses Verfahren erfordert im allgemeinen eine erhebliche Menge Lipid.
  • Das Infusionsverfahren injiziert ein Lipid, das in einer unpolaren Lösung solubilisiert ist, in die zu verkapselnde wässrige Lösung. Im Zuge der Verdampfung der unpolaren Lösung sammeln sich Lipide an der Grenzfläche Gas/Wasser. Die Lipidblätter bilden LUV's und oligolamellare Liposomen, während das Gas durch die wässrige Lösung hindurchblubbert. Die Liposomen werden durch Filtration klassiert. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (unter Verweis auf Deamer et al., 1976, Biochim. Biophys. Acta 443: 629 und Schieren et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 542: 137). Infusionsverfahren erfordern eine ziemlich. hohe Temperatur für die Infusion und können eine relativ geringe Verkapselungswirksamkeit aufweisen. Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York.
  • Es war ein Ziel der Liposomenforschung, Liposomenpräparate zu entwickeln, die vor ihrer Verwendung für lange Zeiträume gelagert werden können. Beispielsweise beschreibt das US Patent Nr. 4,229,360 (Schneider et al.) ein Verfahren zur Dehydratisierung von Liposomen durch Zusatz einer hydrophilen Verbindung zu einer kolloidalen Dispersion von Liposomen in einer wässrigen Flüssigkeit und durch Dehydratisierung der Lösung, vorzugsweise durch Lyophilisierung. Beispiele für hydrophile Verbindungen sind hochmolekulargewichtige hydrophile Polymere oder niedermolekulargewichtige Verbindungen wie Saccharose.
  • US Patent Nr. 4,411,894 (Shrank et al.) beschreibt die Verwendung von hohen Konzentrationen von Saccharose in ultraschallbehandelten Liposomenpräparaten. Die Liposomen enthalten fettlösliche Produkte im gefangenen Volumen, und obwohl die Präparate lyophilisiert werden konnten, konnte das Verfahren nicht den Verlust einer erheblichen Menge des gefangenen Inhalts verhindern, trotz der hohen Saccharosekonzentration.
  • Crowe et al., U.S. Patent Nr. 4,857,319 offenbarte die Verwendung von Disacchariden wie Saccharose, Maltose, Lactose und Trehalose zur Stabilisierung von Liposomen, wenn Liposomen gefriergetrocknet werden. Die Menge an Disaccharid bezogen auf den Lipidgehalt der Komponente (Gewicht/Gewicht) liegt innerhalb von 0,1 : 1 bis 4 : 1. Crowe hatte bei der Anwendung dieses Verfahrens einen größeren Erfolg im Hinblick auf die Erhaltung der liposomalen Integrität als durch das Verfahren gewährleistet wurde, das von Shrank in U.S. Patent Nr. 4,441,894 beschrieben wurde.
  • Janoff et al, U.S. Patent Nr. 4,880,635 offenbart ein Verfahren zur Dehydratisierung von Liposomen, bei dem Liposomen in Gegenwart von schützenden Zuckern wie Trehalose und Saccharose lyophilisiert wurden, vorzugsweise sowohl an den inneren und äußeren Blättchen der Lipid-Doppelschicht. Bei dem Verfahren von Janoff et al. wird ausreichend Wasser zurückbehalten, so daß die Rehydratisierung der getrockneten Liposomen Liposomen mit einer erheblichen strukturellen Integrität liefert.
  • Lerch et al., U.S. Patent Nr. 5,652,339 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung, im industriellen Maßstab, von rekonstituierten Lipoproteinen hoher Dichte aus Apolipoproteinen und Lipiden.
  • Es besteht jedoch ein Bedarf auf dem Fachgebiet nach einem einfachen und kosteneffizienten Verfahren zur Bildung von lyophilisierten Peptid/Lipid-Komplexen, die dann rehydratisiert werden können. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert Peptid/Lipid-Mischungen als ein stabiles, lyophilisiertes Pulver, das gelagert werden kann, als Pulver verwendet werden kann oder nach der Rehydratisierung unter Bildung von Peptid/-Lipid-Komplexen verwendet werden kann.
  • 3. Kurzdarstellung der Erfindung
  • Die Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Peptid- oder Protein-(Phospho)lipid-Komplexen oder -Vesikeln, die Eigenschaften aufweisen, die denen von Lipoprotein hoher Dichte (HDL) ähnlich sind. Das Verfahren nützt ein Lösemittelsystem, in dem wenigstens ein Peptid in einer Lösung solubilisiert ist, und wenigstens ein Lipid in einer anderen Lösung ohne Zuhilfenahme eines Detergens solubilisiert ist. Die beiden Lösungen sind so gewählt, daß sie miteinander mischbar sind. Die Lösungen werden dann kombiniert, und die resultierende Lösung wird lyophilisiert.
  • Das Verfahren kann auch mit einem zweiten Typ von Lösemittelsystem praktiziert werden, das eine Lösung umfaßt, in der sowohl das Protein oder Peptid als auch das Lipid solubilisiert werden können. Diese Lösung kann eine einzige Lösung sein, oder sie kann eine zusammengesetzte Lösung sein, die durch Kombinieren von zwei oder mehr Lösungen bereitet wurde, bevor Peptide und Lipide zugegeben werden. Peptide und Lipide werden in der Lösung oder zusammengesetzten Lösung solubilisiert, und die Peptid/Lipid-Lösung wird dann lyophilisiert.
  • Vorzugsweise sind die Peptide der vorliegenden Erfindung Peptide, die in der Lage sind, eine amphipathische Helix-Konformation anzunehmen. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid ein Lipid-bindendes Protein. Gemäß einer anderen Ausführungsform werden Peptidanaloge von ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoE, andere Apolipoprotein-Analoge und dergleichen anstelle von oder in Kombination mit den Peptiden verwendet. Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform wird das Verfahren dazu verwendet, ApoA1-Analog/(Phospho)lipid-Komplexe herzustellen, die HDL ähnlich sind. Die ApoA1/Lipid-Komplexe sind nützlich zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien assoziiert sind, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, gehören Hypercholesterolämie, Hypertriglyceridämie, HDL-Mangel, und Apolipoprotein A-1-Mangel, septischer Schock, sowie Assays für die in vitro Diagnostik als Marker für HDL-Populationen, sowie zur Verwendung in der Bilderzeugungstechnologie.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung von Peptid/Lipid-Komplexen für eine parenterale Verabreichung, die, ohne darauf beschränkt zu sein, intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre und Bolusinjektionen an Tiere und Menschen umfaßt. Außerdem können die Peptid/Lipid-Komplexe auch für die orale, rektale, mukosale (z. B. über die Mundhöhle) oder topische Verabreichung an Tiere oder Menschen formuliert werden, oder für in vitro-Experimente.
  • Das Verfahren kann für die Produktion von Komplexen aus amphipathischen Peptid/Phospholipid-Komplexen aus Lipid bindendem Protein/Phospholipid und/oder von Komplexen ApoA1-Peptid-analog/Phospholipid im großen Maßstab verwendet werden. Das lyophilisierte Material kann für Massenpräparate hergestellt werden, oder alternativ dazu kann die gemischte Peptid/Lipid-Lösung in kleineren Behältern portioniert werden (beispielsweise Einzeldosis-Einheiten), bevor die Lyophilisierung erfolgt, und derartige kleinere Einheiten können als sterile Einheitsdosisformen hergestellt werden.
  • Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte lyophilisierte Pulver kann zu einer teilchenfreien sterilen Lösung unmittelbar vor einer Injektion rehydratisiert werden, oder, alternativ dazu, kann das lyophilisierte Pulver zu einer geeigneten festen Dosierungsform verarbeitet und direkt verabreicht werden.
  • Das Verfahren kann auch für die Speicherung von Verbindungen nützlich sein, die anderweitig instabil wären oder in der Abwesenheit von Lipiden unlöslich wären.
  • Das Verfahren kann zur Formulierung von Produkten zur Behandlung oder Prävention von menschlichen Erkrankungen verwendet werden, wozu solche Verwendungen gehören wie die Co-Präsentation von Antigenen in Impfstoffen, die Behandlung oder Prävention von Dyslipoproteinämien, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, Hypercholesterinämie, Hypertriglyceridämie, HDL-Mangel, Apolipoprotein A-1-Mangel gehören, cardiovasculäre Erkrankungen wie Atherosclerose, septischer Schock oder Infektionserkrankungen.
  • Das Verfahren kann zur Herstellung von Komplexen angewandt werden, die als Träger für Arzneimittel, als Vektoren (für die Zufuhr von Arzneimitteln, DNA, Genen) beispielsweise an die Leber oder extrahepatische Zellen, oder als Fängersubstanzen, um ein Toxin einzufangen (z. B. Pestizide, LPS usw.) verwendet werden können.
  • 3.1. Definitionen
  • Bei der Verwendung hierin bezeichnet ein "Lösemittelsystem" eines oder mehrere Lösemittel, die in der Lage sind Peptide und/oder Lipide zu solubilisieren und, wenn mehr als eines verwendet wird, die miteinander mischbar sind.
  • Bei der Verwendung hierin bezeichnet "Peptid/Lipid-Komplexe" eine Aggregation von Lipideinheiten und Peptiden, die Teilchen innerhalb eines Teilchengrößenbereichs von Lipoproteinen hoher Dichte (HDLs) bilden.
  • Bei der Verwendung hierin bezeichnet "co-lyophilisiert" die Lyophilisation, Gefriertrocknung oder Vakuumtrocknung von mehr als einer Verbindung (z. B. Peptid, Protein, Lipid, Phospholipid) in Lösungen im selben Behälter. Beispielsweise kann eine Lipidlösung mit einer Peptidlösung in dem gleichen Behälter kombiniert werden, und die resultierende Kombination von Lösungen wird gemeinsam lyophilisiert, wodurch die Peptide und Lipide gleichzeitig lyophilisiert werden.
  • Bei der Verwendung hierin bezeichnen "amphipathisches Peptid" oder "amphipathische alpha-Helix-Peptide" Peptide, die in der Lage sind, eine amphipathische bzw. amphipathische Helixkonformation anzunehmen. Die amphipathische alpha-Helix trifft man häufig als sekundäres strukturelles Motiv in biologisch aktiven Peptiden und Proteinen an. Vgl. Amphipathic helix motif: classes and properties von Jere P. Segrest, Hans de Loof, Jan G. Dohlman, Christie G. Brouillette, und G. M. Anantharamaiah, PROTEINS: Structure Functions and Genetics 8: 103–117 (1990). Eine amphipathische alpha-Helix ist eine alpha-Helix mit entgegengesetzten polaren und unpolaren Außenseiten, die längs der Längsachse der Helix orientiert sind. Eine spezifische Verteilung von geladenen Resten ist längs der polaren Seitenflächen evident. Amphipathische Helices, wie sie definiert wurden, sind komplementär zur polar-unpolaren Grenzfläche von hydratisiertem Massen-Phospholipid; es wurde postuliert, daß diese Lipid-assoziierenden Domänen mit dem Phospholipid dadurch wechselwirken, daß sie teilweise selbst an der Grenzfläche zwischen den Fettsäureketten und die polaren Kopfgruppen eintauchen. Jere P. Segrest. Febs letters 1976, 69 (1): 111– 114.
  • Der Begriff "Peptid" und "Protein" kann hierin austauschbar verwendet werden. Außerdem können die Peptidanalogen der vorliegenden Erfindung Peptide, Proteine und Nicht-Peptide sein, z. B. Peptidomimetics. Alle Analogen sind jedoch vorzugsweise bioaktive Moleküle.
  • Der Begriff "Lipid", wie er hierin verwendet wird, schließt ein, ohne darauf beschränkt zu sein, natürliche und synthetische Phospholipide. Außerdem können die Begriffe "Lipid" und "Phospholipid" hierin austauschbar verwendet werden.
  • 4. Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Superose-6-Chromatographie von HDL, hergestellt durch Dichte-Ultrazentrifugation aus 200 μl Humanserum.
  • 2 (unten): Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1) (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO: 1)-Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 1 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 2 (oben): Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1) Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 2 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 3 (unten): Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1)-Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 3 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 3 (oben): Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1) Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 4 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 4 (unten): Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1)-Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 5 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 4 (oben): Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1) Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 7,5 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 5: Superose-6-Chromatographie von (DPPC: Peptid 1) Komplexen, hergestellt in einem Verhältnis von 10 : 1 (Gewicht : Gewicht).
  • 6: Superose-6-Chromatographie von Komplexen von 14C-markiertem Peptid 1 bei Ri = 3 : 1
  • 7: Superose-6-Chromatographie von Komplexen von 14C-markiertem Peptid 1 bei Ri = 4 : 1
  • 8: Superose-6-Chromatographie von Komplexen von 14C-markiertem Peptid 1 bei Ri = 5 : 1
  • 5. Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die amphipathischen Alpha-Helix-Peptide oder Proteine, Lipid bindenden Proteine, ApoA-I-Agonistenpeptide, Apoproteinanalogen und dergleichen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können nach irgendeiner dem Fachmann bekannten Technik synthetisiert oder hergestellt werden. Stabile Peptidpräparate, die eine lange Lagerdauer aufweisen, können dadurch hergestellt werden, daß man die Peptide lyophilisiert – entweder um eine Masse zur Reformulierung herzustellen, oder um individuelle Teilmengen oder Dosiseinheiten herzustellen, die durch Rehydratation mit sterilem Wasser oder einer geeigneten sterilen Pufferlösung rekonstituiert werden können, bevor sie einem Patienten verabreicht werden.
  • Nach Wissen des Erfinders ist die vorliegende Erfindung das erste Beispiel für ein Verfahren zur Co-Lyophilisierung eines amphipathischen Alpha-Helix-Peptids oder Peptidanalogen mit einem Lipid, um eine Mischung zu bilden, die zu einem sterilen Peptid/Lipid-Komplex rekonstituiert werden kann.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, die ApoA-I Analoge(n), die, ohne darauf beschränkt zu sein, ApoA-I Agonisten einschließen, in einem Peptid-Lipid Komplex zu formulieren und zu verabreichen. Dieser Ansatz weist verschiedene Vorteile auf, da der Komplex eine erhöhte Halbwertszeit in der Zirkulation aufweisen sollte, insbesondere dann, wenn der Komplex eine ähnliche Größe und Dichte aufweist wie die HDL-Klasse von Proteinen, insbesondere die pre-beta-HDL-Populationen. Die HDL-Klasse von Lipoproteinen kann in eine Anzahl von Unterklassen aufgeteilt werden, basierend auf Eigenschaften wie Größe, Dichte und elektrophoretische Mobilität. Einige Beispiele sind, in der Reihenfolge einer zunehmenden Größe, micellares pre-beta-HDL mit einem Durchmesser von 50 bis 60 Angström, discoidale HDL einer mittleren Größe, d. h., mit einer Masse von 65 kDa (etwa 70 Angström), sphärische HDL3 oder HDL2 mit einem Durchmesser von 90 bis 120 Angström. (J. Kane, 1996 in V. Fuster, R. Ross und E. Topol (Herausgeber), Atherosclerosis and Coronary Artery Disease, Seite 99; A. Tall und J. Breslow, ibid., Seite 106; Barrans et al., Biochemica et Biophysica Acta 1300, Seite 73–85; und Fielding et al., 1995, J. Lipid Res 36, Seite 211–228). Gemäß der Erfindung können jedoch auch Peptid-Lipid-Komplexe mit einer kleineren oder größeren Größe als HDL gebildet werden.
  • Die Peptid-Lipid-Komplexe der vorliegenden Erfindung können bequemerweise als stabile Präparate hergestellt werden, die eine lange Lagerdauer aufweisen, und zwar gemäß der Co-Lyophilisations-Arbeitsweise, die nachfolgend beschrieben wird. Die lyophilisierten Peptid-Lipid-Komplexe können dazu verwendet werden, ein Massen-Arzneimittelmaterial für die pharmazeutische Reformulierung herzustellen, oder um individuelle Teilmengen oder Dosiseinheiten herzustellen, die durch Rehydratation mit sterilem Wasser oder einer geeigneten gepufferten Lösung rekonstituiert werden können, bevor sie einem Patienten verabreicht werden.
  • Die Anmelder haben ein einfaches Verfahren zur Herstellung von Peptid- oder Protein-(Phospho)lipid-Komplexen entwickelt, die Eigenschaften aufweisen, die HDL ähnlich sind. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, die ApoA-I Peptid-Lipid-Komplexe herzustellen, und weist die folgenden Vorteile auf: (1) Die meisten oder alle der betroffenen Bestandteile werden dazu verwendet, die bezeichneten Komplexe zu bilden, wodurch eine Verschwendung von Ausgangsmaterial vermieden wird, die den anderen Verfahren gemeinsam ist. (2) Es werden lyophilisierte Verbindungen gebildet, die während der Lagerung sehr stabil sind. Die resultierenden Komplexe können unmittelbar vor der Verwendung rekonstituiert werden. (3) Die resultierenden Komplexe erfordern üblicherweise keine weitere Reinigung nach ihrer Bildung oder vor ihrer Verwendung. (4) Es werden toxische Verbindungen, einschließlich Detergenien wie Cholat, vermieden. Darüberhinaus kann das Herstellungsverfahren leicht in einem größeren Maßstab umgesetzt werden und ist geeignet für die GMP-Herstellung (i. e., in einer endotoxinfreien Umgebung).
  • Gemäß dem bevorzugten Verfahren werden das Peptid und Lipid in einem Lösemittelsystem kombiniert, das jeden der Bestandteile co-solubilisiert. Zu diesem Zweck müssen Lösungsmittelpaare sorgfältig ausgewählt werden, um eine Co-Solubilität von sowohl dem amphipathischen Peptid als auch dem hydrophoben Lipid zu gewährleisten. Bei einer Ausführungsform können das/die Protein e) oder Peptid(e), die in die Partikel eingeführt werden sollen, in einem wässrigen oder organischen Lösemittel oder einer Mischung von Lösemitteln (Lösemittel 1) gelöst werden. Die (Phospho)lipid-Komponente wird in einem wässrigen oder organischen Lösemittel oder einer Lösemittelmischung gelöst (Lösemittel 2), die mit Lösemittel 1 mischbar ist, und die beiden Lösungen werden kombiniert. Alternativ dazu wird die (Phospho)lipid-Komponente direkt in der Peptid-(Protein) Lösung aufgelöst. Alternativ dazu können das Peptid und Lipid in einem Co-Lösemittelsystem incorporiert werden, d. h., einer Mischung der mischbaren Lösemittel. In Abhängigkeit von den Lipid bindenden Eigenschaften des Peptids oder Proteins, verstehen die Fachleute, daß eine erhöhte oder sogar vollständige Solubilisierung (und/oder ein verstärktes Mischen) vor der Lyophilisierung erforderlich sein kann; demzufolge können die Lösemittel entsprechend ausgewählt werden.
  • Ein geeignetes prozentuales Verhältnis von Peptid (Protein) zu Lipiden wird zuerst empirisch bestimmt, so daß die resultierenden Komplexe die geeigneten physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisen, was üblicherweise, jedoch nicht immer, bedeutet, daß sie eine ähnliche Größe wie HDL2 oder HDL3 aufweisen. Das Mol-Verhältnis von Lipid zu Protein/Peptid sollte im Bereich von 2 zu etwa 200, und vorzugsweise von 5 zu 50 liegen, in Abhängigkeit vom gewünschten Typ von Komplexen. Beispiele für derartige Größenklassen von Peptid/Lipid oder Protein/Lipid-Komplexen schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, micellare oder discoidale Teilchen (die üblicherweise kleiner als HDL3 oder HDL2 sind), sphärische Teilchen mit einer ähnlichen Größe wie HDL2 oder HDL3 und größere Komplexe, die größer sind als HDL2. Die von uns als Standard während der Chromatographie verwendeten HDL's (1) sind überwiegend sphärisches reifes HDL2. Pre-β-1-HDL sind micellare Komplexe von Apolipoprotein und wenigen Molekülen von Phospholipiden. Pre-β-2-HDL sind discoidale Komplexe von Apolipoprotein und Molekülen von Phospholipiden. Je mehr Lipide (Triglyceride, Cholesterin, Phospholipide) incorporiert werden, desto größer wird das HDL, und seine Form ändert sich. (Pre-β1 HDL (Micellar-Komplex) → Pre-β2 HDL (discoidaler Komplex) → HDL3 (sphärischer Komplex) → HDL2 (sphärischer Komplex)).
  • Wenn das Lösemittel einmal ausgewählt ist und das Peptid und das Lipid eingearbeitet wurden, wird die resultierende Mischung gefroren und zur Trockne lyophilisiert. Manchmal wird der Mischung ein zusätzliches Lösemittel zugesetzt, um die Lyophilisierung zu erleichtern. Dieses lyophilisierte Produkt kann lange Zeiträume gelagert werden und bleibt stabil.
  • In den Ausführungsbeispielen, die weiter unten beschrieben werden, wurden das Peptid 1 PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ. ID Nr.: 1) und das (Phospho)lipid getrennt in Methanol aufgelöst, kombiniert, und dann vor der Lyophilisation mit Xylol vermischt. Das Peptid und das Lipid können beide einer Mischung der beiden Lösemittel zugesetzt werden. Alternativ kann eine Lösung des Peptids, das in Methanol aufgelöst ist, mit einer Lösung des Lipids vermischt werden, das in Xylol aufgelöst ist. Es ist dabei darauf zu achten, daß ein Aussalzen des Peptids vermieden wird. Die resultierende Lösung, die das in Methanol/-Xylol co-solubilisierte Peptid und Lipid enthält, wird unter Bildung eines Pulvers lyophilisiert.
  • Das lyophilisierte Produkt kann rekonstituiert werden, um eine Lösung oder Suspension des Peptid-Lipid-Komplexes zu erhalten. Zu diesem Zweck wird das lyophilisierte Pulver mit einer wässrigen Lösung auf ein geeignetes Volumen rehydratisiert (häufig etwa 5 mg Peptid/ml was für eine intravenöse Injektion geeignet ist). Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das lyophilisierte Pulver mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung oder einer physiologischen Salzlösung rehydratisiert. Es kann erforderlich sein, die Mischung zu rühren oder zu verwirbeln, um die Rehydratisierung zu erleichtern, und in den meisten Fällen sollte der Rekonstitutionsschritt bei einer Temperatur durchgeführt werden, die gleich ist oder höher liegt als die Phasenübergangstemperatur (Tm) der Lipidkomponente des Komplexes. Innerhalb von Minuten resultiert eine Lösung von rekonstituierten Lipid-Protein-Komplexen (eine klare Lösung, wenn die Komplexe klein sind).
  • Eine Teilmenge der resultierenden rekonstituierten Präparation kann charakterisiert werden, um zu bestätigen, daß die Komplexe in der Präparation die gewünschte Größenverteilung aufweisen, z. B. die Größenverteilung von HDL. Zu diesem Zweck kann eine Gelfiltrationschromatographie angewandt werden. In den unten beschriebenen Ausführungsbeispielen wurde ein Pharmacia Superose 6-FPLC-Gelfiltrationschromatographiesystem verwendet. Das verwendete Elutionsmittel enthält 150 mM NaCl in entionisiertem Wasser. Ein typisches Probenvolumen ist 20 bis 200 μl Komplexe, die 5 mg Peptid/ml enthalten. Die Säulendurchflußgeschwindigkeit beträgt 0,5 ml/min. Eine Reihe von Proteinen von bekanntem Molekulargewicht und Stokes' Durchmesser sowie humane HDL werden als Standards verwendet, um die Säule zu eichen. Die Proteine und Lipoproteinkomplexe werden durch Absorption oder Streuung von Licht einer Wellenlänge von 254 oder 280 nm überwacht.
  • Die Lösemittel, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, unpolare, polare, aprotische und protische organische Lösemittel und dergleichen wie beispielsweise Ethanol, Methanol, Cyclohexan, 1-Butanol, Isopropylalkohol, Xylol, THF, Ether, Methylenchlorid, Benzol und Chloroform. Die Erfindung schließt auch die Verwendung von Lösemittelmischungen sowie einzelnen Lösemitteln ein. Außerdem können vor einer Verwendung im Rahmen der vorliegenden Verfahren die organischen Lösemittel getrocknet werden, um Wasser zu entfernen; es können jedoch auch hydratisierte Lösemittel oder Wasser gemeinsam mit bestimmten Lipiden, Peptiden oder Proteinen verwendet werden. Mit anderen Worten kann Wasser ein geeignetes Lösemittel sein, oder es können hydratisierte Lösemittel oder Mischungen aus organischem Lösemittel/Wasser verwendet werden, wobei jedoch Wasser, wenn es verwendet wird, detergensfrei sein muß. Wie oben erwähnt sind die Lösemittel vorzugsweise von reinster Qualität (um eine Konzentrierung von Verunreinigungen nach der Lyophilisation zu vermeiden), und die Lösemittel sollten salzfrei und frei von teilchenförmigen Bestandteilen sein. Die Lösemittel müssen jedoch nicht steril sein, da das resultierende Produkt vor, während oder nach der Lyophilisation sterilisiert werden kann, und zwar gemäß bekannten Techniken der Pharmazie wie sie beschrieben werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th Eds., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980 und 1990), wobei dieses Werk in seiner Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird und in der United States Pharmacopeia/National Formulary (USP/NF) XVII, wobei dieses werk in seiner Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Die Lipide, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, natürliche und synthetisierte (synthetische) Lipide und Phospholipide, einschließlich Phospholipid mit einer kurzen Alkylkette, Eiphosphatidylcholin, Sojaphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, 1-Myristoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2-myristoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2-stearoylphosphatidylcholin, 1-Stearoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dilauroylphosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Spingolipide, Phosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Distearoylphosphatidylglycerin, Dioleoylphosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatitserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Gehirn-Phosphatidylserin, Gehirn-Sphingomyelin, Dipalmitoylsphingomyelin, Distearoylsphingomyelin, Phosphatidsäure, Galactocerebrosid, Ganglioside, Cerebroside, Dilaurylphosphatidylcholin, (1,3)-D-Mannosyl(1,3)diglycerid, Aminophenylglycosid, 3-Cholesteryl-6'-(glycosylthio)hexyletherglycolipide und Cholesterin und seine Derivate.
  • Die Peptide, die für eine Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen ein, die in den drei parallelen anhängigen US Patentanmeldungen mit den Serial No. 08/940,095, angemeldet am 29. September 1997, jetzt US Patent Nr. 6,004,925; US Serial No. 08/940,096, angemeldet am 29. September 1997, jetzt US Patent Nr. 6,046,166; und Serial No. 08/940,093, angemeldet am 29. September 1997, jetzt US Patent Nr. 6,037,323 beschrieben werden.
  • Es ist bevorzugt, wenn auch nicht in jedem Falle erforderlich, daß Niederschläge vor dem Mischen oder Rühren der Lipid- und Peptidlösungen oder vor der Lyophilisation solubilisiert oder entfernt werden.
  • Das Verfahren kann für die Produktion von Peptid/Lipid-Komplexen, Komplexen ausamphiphatischem Peptid/(Phospho)Lipid, Komplexen aus Lipid-bindendem Protein/(Phospho)Lipid und/oder Komplexen aus ApoA1-Peptidanalog/(Phospho)Lipid im großen Maßstab verwendet werden. Das lyophilisierte Material kann für Massenzubereitungen hergestellt werden, oder, alternativ dazu, kann die gemischte Peptid/Lipid-Lösung auf kleinere Behälter (beispielsweise Einzeldosiseinheiten) aufgeteilt werden, bevor lyophilisiert wird, und solche kleineren Einheiten können als sterile Einzeldosisformen hergestellt werden.
  • Die vakuumgetrockneten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Einzeldosis- oder Mehrfachdosis-Behälterformen bereitgestellt werden, indem geeignete Behälter bis zu einem vorgeschriebenen Inhalt mit der sterilen Lösung vor dem Vakuumtrocknen befällt werden; durch Herstellen der gewünschten vakuumgetrockneten Zusammensetzungen; und dann durch das hermetische Abdichten der Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehälter. Beabsichtigt ist, daß diese gefüllten Behälter eine rasche Auflösung der getrockneten Zusammensetzung bei Rekonstitution mit geeigneten sterilen Verdünnungsmitteln in situ ermöglichen, was zu einer geeigneten sterilen Lösung einer gewünschten Konzentration zur Verabreichung führt. Bei der Verwendung hierin bedeutet der Begriff "geeignete Behälter" einen Behälter, der in der Lage ist, eine sterile Umgebung aufrecht zu erhalten, wie beispielsweise eine Ampulle, die in der Lage ist, ein vakuumgetrocknetes Produkt hermetisch durch einen Stopfen verschlossen bereitzustellen. Zusätzlich impliziert "geeignete Container" eine geeignete Größe, und zwar unter Berücksichtigung des Volumens an Lösung, die bei der Rekonstitution der vakuumgetrockneten Zusammensetzung aufgenommen werden muß; sowie ein geeignetes Behältermaterial, im allgemeinen Glas vom Typ I. Die verwendeten Stopfen, z. B. sterile Kautschukverschlüsse oder etwas entsprechendes, verstehen sich so, daß es solche sind, die die erwähnte Abdichtung gewährleisten, die jedoch einen Zugang zum Zweck der Einführung eines Verdünnungsmittels gestatten, beispielsweise von sterilem Wasser zur Injektion, USP, Normalsalzlösung, USP, oder 5% Dextrose in Wasser, USP, zum Zwecke der Rekonstitution der gewünschten Lösung. Diese und andere Aspekte der Geeignetheit von Behältern für pharmazeutische Produkte wie die der vorliegenden Erfindung sind Fachleuten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technik gut bekannt. Bei spezifischen Ausführungsformen können die Größen der Produkt-Einheitsdosierungen im Bereich von etwa 10 mg bis 2 g Peptid liegen, vorzugsweise im Bereich von etwa 100 mg bis 1 g, wobei die Konzentration nach der Rekonstitution etwa 1 bis 50 mg/ml, vorzugsweise etwa 2 bis 25 mg/ml beträgt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Protein- oder Peptid/Lipid-Komplexen für die parenterale Verabreichung, einschließlich intravenöser, intraperitonealer, subkutaner, intramuskulärer oder Bolusinjektionen an Tiere oder Menschen, oder für eine orale, rektale, mukosale (z. B. Mundhöhle) oder topische Verabreichung an Tiere oder Menschen, oder für in vitro Experimente.
  • Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte lyophilisierte Pulver kann unmittelbar vor der Injektion rehydratisiert werden, oder, alternativ dazu, kann das lyophilisierte Pulver direkt verabreicht werden. Das lyophilisierte Pulver beeinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, Lipid und Peptide, die in der Lage sind, Komplexe in der Form von Vesikeln, Liposomen, Teilchen zu bilden, einschließlich sphärischer oder discoidaler Teilchen, Mizellen und dergleichen. Um das lyophilisierte Pulver zu rekonstituieren oder rehydratisieren, wird eine Lösung in Abhängigkeit von der gewünschten Endverwendung gewählt. Für eine pharmazeutische Verwendung kann irgendeine sterile Lösung verwendet werden. Außerdem werden für bestimmte Verwendungen gepufferte Lösungen bevorzugt, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lösungen von Phosphat, Citrat, Tris, Baribital, Acetat, Glycin-HCl, Succinat, Cacodylat, Borsäure-Borax, Ammediol und Carbonat gehören.
  • Das erfindungsgemäße lyophilisierte Pulver kann nach irgendeinem dem Fachmann bekannten Lyophilisationsverfahren gebildet werden, wozu, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Gefriertrocknung gehört, bei der die Peptid/Lipid-haltige Lösung eingefroren wird, woran sich eine Verdampfung bei vermindertem Druck anschließt.
  • Das Verfahren kann auch für die Lagerung von Verbindungen geeignet sein, die anderweitig in Abwesenheit von Lipiden instabil oder unlöslich wären.
  • Das Verfahren kann zur Formulierung von Produkten für die Behandlung oder Prävention von menschlichen Erkrankungen angewandt werden, zu denen Anwendungen gehören wie die Co-Präsentation von Antigenen in Impfstoffen, die Behandlung oder Prävention von Dyslipoproteinämien, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, Hypercholesterinämie, Hypertriglyceridämie, HDL-Mangel und Apolipoprotein A-1-Mangel gehören, von kardiovasculären Erkrankungen wie Atherosklerose, septischem Schock oder Infektionserkrankungen.
  • Das Verfahren kann zur Herstellung von Komplexen angewandt werden, die als Träger für Arzneimittel verwendet werden können, als Vektoren (zur Zufuhr von Arzneimitteln, DNA, Genen), beispielsweise an die Leber oder extrahepatische Zellen, oder als Fängersubstanzen zum Fangen von Toxin (z. B. Pestiziden, LPS usw.). Alternativ kann das Verfahren zur Herstellung von Komplexen für in vitro Assay Systeme angewandt werden, oder für eine Anwendung in einer Bilduntersuchungstechnologie.
  • Bei spezifischen Ausführungsformen kann das Verfahren zur Herstellung von Komplexen von ApoA-I-Analogen (die, ohne darauf beschränkt zu sein, Agonisten einschließen) angewandt werden, die in diagnostischen in vitro Assays und als Marker für HDL Populationen und Subpopulationen verwendet werden können. Gemäß anderen spezifischen Ausführungsformen können Komplexe mit Apo-I-Agonisten für Immunoassays oder für eine Bilduntersuchungstechnologie angewandt werden (z. B. CAT-Scanning oder MRI-Scanning).
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende illustrieren und sind nicht in irgendeiner Form als Beschränkung der Erfindung auszulegen.
  • 6. Beispiel: Herstellung eines Peptid-Lipid-Komplexes gemäß dem Co-Lyophilisationsansatz
  • Das folgende Protokoll wurde zur Herstellung von Peptid-Lipid-Komplexen angewandt.
  • Peptid 1 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO: 1) (22,4 mg) wurde in Methanol in einer Konzentration von 3,5 mg/ml dadurch gelöst, daß man einige Minuten inkubierte und wiederholt verwirbelte. Dieser Lösung wurde Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) in Methanol (100 mg/ml Vorratslösung) zugesetzt, so daß das endgültige Verhältnis von DPPC/Peptid 2,5 : 1 betrug (Gewicht/Gewicht). Diese Lösung wurde durch Verwirbeln vermischt. Der Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 36% Xylol zugesetzt. Teilmengen der resultierenden Lösung wurden für eine spätere Analyse durch Gelfiltrationschromatographie entfernt. Die Lösungen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und unter Vakuum zur Trockne lyophilisiert. Eine Teilmenge, die 20 mg Peptid 1 (SEQ ID NO: 1) und 50 mg DPPC enthielt, wurde in einer sterilen Salzlösung (0,9% NaCl) rehydratisiert, gemischt und einige Minuten auf 41°C erwärmt, bis eine klare Lösung von rekonstituierten Peptid/Phospholipid-Komplexen erhalten waren.
  • 6.1. Beispiel: Gelfiltration und Phospholipidnutzung
  • 6.1.1. Materialien und Methoden
  • Zum Zwecke des Testens von Bedingungen für die Herstellung von Komplexen ist es häufig bequem, kleine Mengen von Komplexen zur Charakterisierung herzustellen. Diese Präparate enthielten 1 mg Peptid und wurden wie folgt hergestellt: 1 mg Peptid 1 (SEQ ID NO: 1) wurde in 250 ml Methanol von HPLC Qualität (Perkin Eimer) in einer 1,0 ml Ampulle aus klarem Glas mit einem Deckel gelöst (Waters #WAT025054). Die Auflösung des Peptids wurde durch gelegentliches Verwirbeln innerhalb eines Zeitraums von 10 Minuten bei Raumtemperatur unterstützt. Nach dieser Zeit war noch eine kleine Menge an ungelöster teilchenförmiger Materie zu sehen, die jedoch die Ergebnisse nicht negativ beeinflußte. Zu dieser Mischung wurde eine Teilmenge zugesetzt, die entweder 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10 oder 15 mg DPPC (Avanti Polar Lipids, 99% Reinheit, Produkt # 850355) enthielt, und zwar aus einer 100 mg/ml Vorratslösung in Methanol. Das Volumen der Mischung wurde durch Zugabe von Methanol auf 400 μl gebracht, und die Mischung wurde innerhalb eines Zeitraums von 10 min bei Raumtemperatur mit Unterbrechungen verwirbelt. Zu diesem Zeitpunkt war in den Röhrchen nur sehr wenig ungelöstes Material zu erkennen. Zu jedem Röhrchen wurden 200 μl Xylol (Sigma-Aldrich 99% rein, HPLC-Qualität) zugesetzt, und die Röhrchen wurden jeweils für 10 Sekunden verwirbelt. In die Deckel eines jeden Röhrchens wurden mit einer 20 Gauge-Spritzennadel kleine Löcher gestochen, die Röhrchen wurden jeweils für 15 Sekunden in flüssigem Stickstoff eingefroren, und dann wurden die Röhrchen über Nacht unter Vakuum lyophilisiert. Jedem Röhrchen wurden 200 ml 0,9% NaCl-Lösung zugesetzt. Die Röhrchen wurden jeweils 20 Sekunden verwirbelt. Zu diesem Zeitpunkt wiesen die Lösungen in den Röhrchen ein milchiges Aussehen auf. Die Röhrchen wurden dann 30 Minuten bei 41°C in einem Wasserbad inkubiert. Die Lösungen in allen Röhrchen wurden klar (d. h. wasserähnlich), mit Ausnahme des Röhrchens, das 15 mg DPPC enthielt, das milchig blieb.
  • Um zu bestimmen, ob alle Phospholipide, die bei den Komplexherstellungen verwendet wurden, tatsächlich in denjenigen Säulenfraktionen erschienen, die den Chromatogramm-Absorptions- Peaks entsprachen, wurde das Säuleneluat von rekonstituierten Peptid/Lipid-Komplexen in ein- oder zwei-Milliliterfraktionen gesammelt, und die Fraktionen wurden enzymatisch auf den Phospholipidgehalt untersucht, und zwar mit dem BioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 Kit (#61491), gemäß den vom Hersteller gelieferten Anweisungen.
  • Die Herstellungen von Komplexen können auch in einem größeren Maßstab durchgeführt werden. Ein Beispiel für eine derartige Herstellung wird oben angeführt. Diese Komplexe wurden für in vivo-Versuche verwendet.
  • 6.2 Ergebnisse der Komplexcharakterisierung
  • 1: Superose-6-Chromatographie von reifen HDL2, hergestellt durch Dichte-Ultrazentrifugation von 200 μl Humanserum. Der Chromatograph zeigt eine Absorption bei 254 nm. Elutionsvolumen = 14,8 ml, was einem Stokes-Durchmesser von 108 Angström entspricht (vgl. Tabelle 1).
  • 2 (unten): Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, hergestellt bei einem Inkubationsverhältnis (Ri, definiert als das Verhältnis von gesamtem Phospholipid zu gesamtem Peptid in der Ausgangsmischung) von 1 : 1 (Gewicht : Gewicht), wie oben beschrieben (Herstellung in kleinem Maßstab). Die Elutionsvolumina der Absorptions-Peaks betragen 6,2 ml und 18,1 ml, und zwar entsprechend Teilchen mit Stokes-Durchmesser von 74 und 82 Angström, die kleiner sind als HDL. 87% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen, die die Absorptions-Peaks enthielten, wiedergewonnen (vgl. Tabelle 1).
  • 2 (oben): Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, hergestellt bei einem Ri von 2 : 1 (Gewicht : Gewicht) wie oben beschrieben. Das Elutionsvolumen des Absorptions-Peaks = 16,4 ml, (77 Anström), was Teilchen entspricht, die kleiner als HDL sind. 70% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen wiedergewonnen, die den Absorptions-Peak enthielten (vgl. Tabelle 1).
  • 3 (unten): Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, die bei einem Ri von 3 : 1 (Gewicht : Gewicht) hergestellt wurden, wie oben beschrieben. Das Elutionsvolumen des Absorptions-Peaks = 16,0 ml, (80 Angström), was Teilchen entspricht, die kleiner als HDL sind. 79% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen wiedergewonnen, die den Absorptions-Peak enthielten (vgl. Tabelle 1).
  • 3 (oben): Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, hergestellt bei einem Ri von 4 : 1 (Gewicht : Gewicht) wie oben beschrieben. Das Elutionsvolumen des Absorptions-Peaks = 15,7 ml, (90 Angström), was Teilchen entspricht, die kleiner als HDL sind. 106% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen wiedergewonnen, die den Absorptions-Peak enthielten (vgl. Tabelle 1).
  • 4 (unten): Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, die bei einem Ri von 5 : 1 (Gewicht : Gewicht) hergestellt wurden, wie oben beschrieben. Das Elutionsvolumen des Absorptions-Peaks = 15,1 ml, (104 Angström), was Teilchen entspricht, die kleiner als HDL sind. 103% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen wiedergewonnen, die den Absorptions-Peak enthielten (vgl. Tabelle 1).
  • 4 (oben): Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, hergestellt bei einem Ri von 7,5 : 1 (Gewicht : Gewicht) wie oben beschrieben. Das Elutionsvolumen des Absorptions-Peaks = 13,6 ml, (134 Anström), was Teilchen entspricht, die größer als HDL sind. 92% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen wiedergewonnen, die die Absorptions-Peaks enthielten (vgl. Tabelle 1).
  • 5: Superose-6-Chromatographie von DPPC : Peptid-1-Komplexen, hergestellt bei einem Verhältnis von 10 : 1 (Gewicht : Gewicht), wie oben beschrieben. Das Elutionsvolumen des Absorptions-Peaks = 13,4 ml, (138 Anström), was wiederum Teilchen entspricht, die größer als HDL sind. 103% des auf die Säule aufgetragenen Phospholipids wurden in den Fraktionen wiedergewonnen, die die Absorptions-Peaks enthielten (vgl. Tabelle 1).
  • Die Probe, die Komplexe mit 15 : 1 DPPC : Peptid 1 (Gewicht : Gewicht) enthielt, wurde keiner Superose-6-Chromatographie unterzogen, weil sie trüb war, was auf die Anwesenheit von großen Teilchen hindeutet.
  • Bei jedem der obigen Versuche wurde kein nennenswertes Phospholipid in irgendeiner anderen Fraktion als derjenigen beobachtet, die Material enthielt, das mit den Absorptions-Peaks eluierte (vgl. 2 bis 8). Das deutet darauf hin, daß im wesentlichen alle Phospholipide (innerhalb des experimentellen Fehlers des Assays) in die Komplexe eingebunden waren. Der Versuch zeigt, daß durch Variationen des Ausgangsverhältnisses von Phospholipiden zu Peptiden homogene Komplexe unterschiedlicher Größen (kleiner oder größer als HDL) gebildet werden können.
  • 6.3 Charakterisierung von Komplexen unter Verwendung von 14C-markiertem Peptid 1.
  • Peptid-Phospholipid-Komplexe, die 14C markiertes Peptid 1 enthielten (spezifische Aktivität 159,000 DPM/mg Peptid in Gewicht unter der Annahme eines 50%igen Peptidgehalts) wurden wie oben beschrieben durch Co-Lyophilisation hergestellt. Die Präparationen enthielten jeweils 1 mg Peptid und 3, 4 oder 5 mg DPPC in Gewicht. Nach einer Rekonstitution der Komplexe in 200 μl 0,9% NaCl wurden 20 μl (100 μg) der Komplexe auf eine Pharmacia Superose-6-Säule aufgetragen, unter Verwendung von 0,9% NaCl als flüssige Phase bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Nach einer 5 ml Verzögerung (das Säulen-Leervolumen betrug 7,7 ml) wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Teilmengen, die 20 μl der Fraktionen enthielten, wurden unter Verwendung des BioMerieux-Enzym-Assays auf ihren Phospholipidgehalt untersucht. Der Rest jeder Fraktion wurde 3 min. in einem Wallach 1410-Flüssigscintillation-Counter (Pharmacia) gezählt, unter Verwendung des Easy-Count-Programms. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in den 6 bis 8 gezeigt. Es ist zu erkennen, daß die überwältigende Menge sowohl von Phospholipid als auch Peptid gemeinsam in einigen wenigen Fraktionen mit Peaks bei etwa 16, 16 und 15 ml wiedergewonnen wurden, und zwar für Komplexe, die bei DPPC : Peptidverhältnissen von 3 : 1, 4 : 1 bzw. 5 : 1 hergestellt worden waren. Die UV-Absorptionsprofile für diese Proben zeigen, daß die Komplexe aus der Säule bei Volumen 15,1, 14,7 und 14,4 ml im Falle von Komplexen eluieren, die bei 3 : 1, 4 : 1 und 5 : 1 Verhältnissen DPPC : Peptid hergestellt worden waren (das tote Volumen der Schlauchverbindung zwischen dem Probensammler und der UV-Durchflußzelle beträgt 1,3 ml, was den kleinen Unterschied zwischen den Elutionsvolumina, wie sie mit dem Radioaktivitäts/Phospholipid-Assay gemessen wurden, und der UV Absorption erklärt). Die Elutionsvolumina entsprechen Stokes-Durchmesser von 106, 114 und 120 Angström für die 3 : 1, 4 : 1 und 5 : 1 Komplexe.
  • Figure 00280001

Claims (28)

  1. Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Peptid/Lipid-Produkts, das die Lyophilisation einer solubilisierten Lösung umfaßt, die ein Peptid oder Peptidanaloges, das in der Lage ist, eine amphipatische Konformation anzunehmen, und ein Lipid umfaßt, wobei das Lipid, ohne Zuhilfenahme eines Detergens, in der Lösung aufgelöst ist, und wobei das lyophilisierte Produkt unter Bildung eines Peptid/Lipid-Komplexes rehydratisiert werden kann,
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid ein Protein ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid ein Lipidbindendes Protein ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptidanaloge ein Analoges von ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III oder ApoE ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid ein ApoA-I-Analoges ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lipid ein natürliches Lipid, ein synthetisches Lipid oder eine Mischung daraus ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lipid ein gesättigtes Lipid, ein ungesättigtes Lipid oder irgendeine Mischung daraus ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Ether-Phospholipiden, kurzkettigen Phospholipiden, Cholesterin, Cholesterinderivaten, Phosphatidylcholinen, Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylserinen, Phosphatidylinositen, Sphingolipiden, Phosphatldylglycerinen, Gangliosiden und Cerebrosiden.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Eiphosphatidylcholin, Sojaphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, 1-Myristoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2-myristoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2-stearoylphosphatidylcholin, 1-Stearoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dilauroylphosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Distearoylphosphatidylglycerin, Dioleoylphosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Sphingomyelin, Dipalmitoylsphingomyelin, Distearoylsphingomyelin, Phosphatidsäure, Galactocerebrosid, Dilaurylphosphatidylcholin, (1,3)-D-mannosyl(1,3)diglycerid, Aminophenylglycosid, 3-Cholesteryl-6'-(glycosylthio)hexyletherglycolipiden und Mischungen daraus.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Lipid ein 3-Cholersteryl-6'-(glycosylthio)hexyletherglycolipid ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mol-Verhältnis Lipid : Peptid oder das Mol-Verhältnis Lipid : Peptidanaloges von etwa 2 : 1 bis etwa 200 : 1 beträgt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Mol-Verhältnis Lipid-Peptid oder das Mol-Verhältnis Lipid : Peptidanaloges von etwa 2 : 1 bis etwa 50 : 1 beträgt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Mol-Verhältnis Lipid : Peptid oder das Mol-Verhältnis Lipid : Peptidanaloges von etwa 5 : 1 bis etwa 50 : 1 beträgt.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Lösung unter Verwendung eines organischen Lösemittels hergestellt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das lyophilisierte Produkt eine pharmazeutische Formulierung ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, das außerdem vor dem Lyophilisieren das Aufteilen der genannten solubilisierten Lösung in Teilmengen in individuelle Behälter umfaßt, um eine pharmazeutische Formulierung zu bilden, die in einer Einheitsdosisform vorliegt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, das außerdem das Sterilisieren des Produkts vor, während oder nach der Lyophilisation umfaßt.
  18. Verfahren nach irgendeinem vorausgehenden Anspruch, wobei die solubilisierte Lösung gebildet wird durch: (i) Solubilisieren wenigstens eines amphipatischen Peptids oder amphipatischen Peptidanalogen in einem ersten Lösemittel, um eine erste Lösung zu bilden; (ii) Solubilisieren wenigstens eines Lipids in einem zweiten Lösemittel, ohne Zuhilfenahme eines Detergens, um eine zweite Lösung zu bilden, wobei die zweite Lösung mit der ersten Lösung mischbar ist; und (iii) Kombinieren der ersten Lösung mit der zweiten Lösung unter Bildung der solubilisierten Peptid/Lipid-Lösung.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, das außerdem das Rehydratisieren des lyophilisierten Peptid/Lipid-Produkts unter Bildung eines solubilisierten Peptid/Lipid-Komplexes umfaßt.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das lyophilisierte Peptid/Lipid-Produkt ein dehydratisierter Peptid/Lipid-Kornplex ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 18, das außerdem die Rehydratisierung des dehydratisierten Peptid/Lipid-Komplexes umfaßt, um einen solubilisierten Peptid/Lipid-Komplex zu bilden.
  22. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das erste und das zweite Lösemittel gleich sind.
  23. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das erste Lösemittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasser, Methanol, 1-Butanol und Mischungen daraus.
  24. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das zweite Lösemittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Xylol, Benzol, Methanol, Chloroform und Mischungen daraus.
  25. Peptid/Lipid-Komplex, erhältlich nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 24.
  26. Peptid/Lipid-Komplex nach Anspruch 25, der eine etwa gleiche Größe wie Lipoproteine hoher Dichte aufweist.
  27. Peptid/Lipid-Komplex nach Anspruch 25, wobei der Komplex steril ist.
  28. Peptid/Lipid-Komplex nach Anspruch 25, wobei der Komplex eine sterile pharmazeutische Formulierung ist, die in Einheitsdosisform vorliegt.
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