WO2011002258A2 - 아르기닌 기제 양친성 펩티드 마이셀 - Google Patents

아르기닌 기제 양친성 펩티드 마이셀 Download PDF

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WO2011002258A2
WO2011002258A2 PCT/KR2010/004310 KR2010004310W WO2011002258A2 WO 2011002258 A2 WO2011002258 A2 WO 2011002258A2 KR 2010004310 W KR2010004310 W KR 2010004310W WO 2011002258 A2 WO2011002258 A2 WO 2011002258A2
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drug
nucleic acid
hydrophobic
micelle
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이민형
김현아
류동욱
박지환
이지영
현혜선
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한양대학교 산학협력단
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]

Definitions

  • the present invention relates to micelles useful as nonviral drug carriers. More specifically, the present invention relates to micelles formed of peptides useful as nonviral in vivo drug carriers.
  • gene therapy which is a method of manipulating genes in a specific cell of a patient for the treatment of a disease caused by abnormality of a specific gene of a patient
  • gene therapy has been proposed as a new treatment method of a disease and researches on various means of gene delivery for the past decades. Is being done.
  • Various methods for gene therapy have been reported. (See, eg, Mountain, Trends in Biotech., 18: 119-128, 2000; Romano et al. Stem Cells, 18: 19-39, 2000, etc.)
  • genes or delivery agents or systems
  • the key elements of gene therapy are genes (or delivery agents or systems) that can deliver therapeutic and therapeutic genes to the human body safely and efficiently.
  • the selection of a gene delivery system is related to the problem of effectively delivering a therapeutic gene to a target organ, and the gene being accepted by a suitable cell without rejection and causing expression to achieve a desired therapeutic effect.
  • developing new delivery systems for the success of gene therapy is recognized as a major problem in the field of gene therapy.
  • Such gene carriers or systems are sometimes referred to as 'vectors'. It may also be referred to using terms.
  • Viral vectors produced by modifying a virus whose infectivity to the host is its property to remove pathogenicity and inserting a transfer gene are classified into adenovirus, retrovirus, and AAV (adeno-associated virus) depending on the type of the parent virus. Vector and so on. Although these viral vectors are highly infectious because of their infectious nature, they are highly mutagenic when inserted into the host's chromosome. Many uses are limited. (See, eg, Kremer et al., British Medical Bulletin 51: 31-44, 1995; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807-838, 1995).
  • non-viral gene delivery system has been developed as an alternative to a viral vector, which introduces genes into cells by physicochemical delivery methods, including (cationic) lipid transporters including liposomes and (cationic). Sex carriers are typical examples.
  • Such non-viral vectors are biodegradable and thus have high biosafety, non-immunity, and ease of use because there is no restriction on the size of the transfer gene.
  • non-viral vectors are degraded in lysosomes after transfection into cells, resulting in a low efficiency of gene transport into the cytoplasm and thus a low rate of gene transport into the nucleus, resulting in low gene transfer efficiency compared to viral vectors. have.
  • Cationic lipid transporters utilize the principle that gene therapy drugs, which are mainly negatively charged DNA or RNA, are easily combined and introduced into cells because they form stable micelles and have cationic properties on their surfaces.
  • Xin Dong Guo et al., Biomaterials 29, 4838-4846, 2008 disclose cationic micelles in which molecules conjugated with cholesterol and oligopeptides are self-assembled.
  • the cholesterol moiety the lipid that forms one end of the conjugate, contributes to micelle formation and stabilization and cationic peptides contribute to binding to the gene.
  • Korean Patent Publication No. 10-2003-0078115 discloses a gene delivery method using a peptide having a specific sequence that can be used for gene binding and delivery. Although it has the advantage of being safer than viral vectors, there is a disadvantage in that the structural stability in the cell to be provided for gene delivery is weak.
  • viral vectors are highly infectious because of their infectious nature, but are highly mutagenic when they are inserted into the host chromosome. There is a lot of use is limited.
  • the cationic polymer, cationic peptide, or cationic liposomes which are frequently used due to the improvement of low gene transfer efficiency, which is a disadvantage of non-viral vectors used to improve such a problem, have different aspects from viral vectors. There is a problem of cytotoxicity, and the delivery efficiency is still low to commercialize.
  • the present inventors predicted that micelles composed of amphiphilic peptides having a stable structure and easy to penetrate into a cell would be useful as gene carriers.
  • the present invention has been completed by discovering that peptides of relatively short lengths, which are included at the other end, are capable of forming self-assembled micelles, and successfully forming conjugates with nucleic acids, thereby delivering genes.
  • the present invention is to provide a non-viral vector with high cytotoxicity and low cytotoxicity that can solve the conventional problems
  • the main object of the present invention is to provide an arginine-based peptide micelle for the preparation of the non-viral vector.
  • Another object of the present invention to provide a drug carrier comprising the arginine-based peptide micelles.
  • Another object of the present invention to provide a nucleic acid binding complex comprising the drug carrier and the nucleic acid bound thereto.
  • the present invention to solve the above problems,
  • R is arginine
  • the hydrophobic amino acid may be selected from isoleucine, valine, leucine, phenylalanine, cysteine, methionine or alanine, most preferably valine.
  • n is preferably an integer of 2 to 5
  • m is preferably an integer of 5 to 10.
  • the peptide micelle may be any one selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the present invention is characterized in that the peptide further comprises a peptide bound to the target ligand to the arginine terminal, the following general formula (II)
  • R is arginine
  • X is a hydrophobic amino acid that may be a different amino acid
  • n 1 to 7
  • m 2 to 20
  • Y is a targeting ligand
  • the targeted ligand can be any ligand that can be used for targeted drug treatment.
  • the present invention also provides a drug delivery agent comprising the peptide micelles described above.
  • the drug is a nucleic acid, protein, polypeptide, carbohydrates, inorganic substances, antibiotics, anticancer agents, antibacterial agents, steroids, anti-inflammatory drugs, sex hormones, immunosuppressants, antiviral agents, anesthetics, antiemetic agents.
  • the drug is preferably a hydrophobic drug.
  • hydrophobic drugs such as prostaglandins can be loaded into the hydrophobic portion of the micelles. At this time, when the hydrophobic drug is loaded, the delivery efficiency of the drug carrier is further improved.
  • the present invention also provides a nucleic acid binding complex comprising the drug carrier and the nucleic acid bound thereto.
  • the nucleic acid is not limited, but preferably DNA or RNA.
  • the RNA is preferably iRNA, more preferably siRNA of the iRNA.
  • the hydrophobic drug may be further included in the hydrophobic interior of the micelle forming the nucleic acid binding complex.
  • Peptide micelles and gene-binding complexes of the present invention are useful for the development of low-toxic, high-efficiency genes or siRNA carriers for the treatment of various diseases and can be developed and used as clinically applicable gene therapeutics and siRNA therapeutics.
  • Peptide micelles composed of arginine-based short peptides according to the invention are less toxic and have higher or similar nucleic acid delivery efficiency than polymer vectors contemplated for use in the prior art, and thus are useful as safer nucleic acid therapeutics.
  • the peptide micelle of the present invention is useful as a nucleic acid therapeutic agent having low side effects and excellent therapeutic efficiency since it is possible to deliver a target-directed gene and siRNA using a ligand.
  • 1 is a schematic diagram of complex formation of peptide micelles and nucleic acids of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram of complex formation of peptide micelles and nucleic acid therapeutic agents comprising a peptide bound to a target-oriented ligand in accordance with an embodiment of the present invention.
  • 3 is a photograph showing gel retardation analysis. The number is the weight ratio of peptide to DNA.
  • Figure 4 is a graph showing the results of measuring the transfection efficiency according to the composition ratio in the complex of peptide and DNA.
  • Figure 5 is a graph showing the results of the MTT assay for assessing toxicity at the peptide / DNA complex ratio with the highest gene transfer efficiency.
  • 6 is a graph showing the measurement of siRNA silencing ratio using peptide micelles.
  • FIG. 7 shows a gel retardation assay of peptide micelles, the number representing the weight ratio of peptide to DNA.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
  • FIG. 9 is a FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) measurement showing the intracellular delivery efficiency of the RV peptide and FITC-antagomir complex The result graph.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
  • Figure 11 shows the results of VEGF-ELISA measurement of intracellular delivery efficiency of peptide micelles and VEGF-siRNA complex.
  • FIG. 13 shows MTT analysis of cytotoxicity of peptide micelles and VEGF-siRNA complexes.
  • FIG. 14 is a schematic diagram of peptide micelles when the hydrophobic drug dexamethasone is enclosed.
  • 15 is a graph showing the quench effect of hydrophobic dyes encapsulated in peptide micelles (-DNA and + DNA, respectively).
  • FIG. 16 is a graph showing the transformation efficiency of R3V6-dexamethasone peptide according to the amount of dexamethasone encapsulated.
  • 17 is a graph showing the transformation efficiency of R3V6-dexamethasone peptide in HEK293 cells and N2A cells.
  • Subject or “patient” means any single individual in need of treatment, including humans, cattle, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects, and the like. Also included are any subjects who participated in clinical research trials showing no disease clinical findings or subjects who participated in epidemiologic studies or who used as controls. In one embodiment of the present invention, humans were targeted.
  • tissue or cell sample means a collection of similar cells obtained from a tissue of a subject or patient.
  • Sources of tissue or cell samples may include solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue samples or biopsies or aspirates; Blood or any blood component; Cells at any time of pregnancy or development in the subject. Tissue samples may also be primary or cultured cells or cell lines.
  • Gene means any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in protein coding or transcription or in the regulation of other gene expression.
  • the gene may consist of any nucleic acid encoding a functional protein or only a portion of a nucleic acid encoding or expressing a protein.
  • Nucleic acid sequences may include gene abnormalities in exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or unique sequences adjacent to genes.
  • Protein polypeptide
  • oligopeptide and “protein” can be used equally when referring to peptides or protein drugs and are not limited to particular molecular weight, peptide sequence or length, bioactivity or therapeutic field.
  • Nucleic acid is meant to include genes, DNA, RNA, oligonucleotides, polynucleotides, aptamers, plasmids, small interfering ribonucleic acids (siRNA), and the like.
  • the nucleic acid also includes derivatives in which oxygen atoms and the like contained in the phosphoric acid portion, ester portion, and the like in the nucleic acid structure are substituted with other atoms such as sulfur atoms or fluorine atoms or alkyl groups such as methyl groups.
  • the nucleic acid of the invention is a plasmid and small interfering RNA (siRNA).
  • nucleic acid includes both RNA, cDNA, genomic DNA, synthetic forms and hybrid polymers, sense and antisense strands, and are chemically or biochemically modified, as will be apparent to those skilled in the art. Or may include unnatural or derivatized nucleotide bases.
  • Antisense polynucleotide sequences are useful, for example, for silencing transcripts of the gene of interest. Expression of such antisense constructs in cells interferes with gene transcription and / or translation.
  • mechanisms and co-inhibitions that induce RNAi such as with siRNAs, can also be used.
  • antisense or sense molecules can be administered directly.
  • the antisense or sense molecule may also be formulated into a composition and administered to the target cell by any of a number of means or via an expression construct.
  • Ligand refers to any suitable targeting moiety that may be chemically conjugated to the peptides of the invention or may be directly associated / form a complex.
  • Ligands exemplified for use in the practice of the present invention include, but are not limited to, proteins, peptides, antibodies, antibody fragments (including Fab 'fragments and single chain Fv fragments) and sugars as well as other targeting molecules.
  • RNA refers to a double-stranded RNA molecule that prevents translation of a target mRNA, using standard techniques for introducing siRNA into cells, including DNA as a template to which RNA is transcribed, which can be either dsRNA or shRNA.
  • 'DsRNA' refers to two RNA molecule constructs consisting of one strand and the other with complementary sequences, and since the two molecules have complementary sequences, they bind to each other to form a double-stranded RNA molecule.
  • the two stranded nucleic acid sequences may include RNA molecules selected from the non-coding region of the target gene as well as the "sense" or "antisense” sequences of the RNA selected from the protein coding sequence of the target gene sequence.
  • the term 'shRNA' refers to an siRNA having a stem-loop structure comprising first and second regions complementary to each other, namely sense and antisense strands. If the degree of complementarity and orientation of the complementarity site is sufficient, sufficient base pair binding occurs between the regions, the first site and the second site are linked by the loop site, and the loop site is the nucleic acid (or nucleic acid analog) of the loop site. By the absence of base pairs in the liver The loop region of the shRNA is a single stranded region between the sense and antisense strands, and may also be referred to as an “interposed single strand”.
  • a “carrier” may be a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer that is nontoxic to a cell or mammal that is exposed to the carrier at the dosages and concentrations employed.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an aqueous pH buffer.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers such as phosphate, citrate and other organic acids, antioxidants such as ascorbic acid, low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues), proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins, Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, amino acids such as glycine glutamine, asparagine, arginine or lysine, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrins, chelating agents such as EDTA, sugars such as mannitol or sorbitol Salts, salt-forming counterions such as alcohols, sodium, and / or nonionic surfactants such
  • Therapeutic effect means any improvement in the disease of a subject, human or animal treated according to the method, and means a prophylactic or preventive effect, or a disease that can be detected by physical investigation, laboratory or mechanical methods And obtaining any alleviation in the severity of the signs and symptoms of the disease or illness.
  • treatment means (i) an animal that is susceptible to disease, disease and / or disease but has not yet been diagnosed with disease or To prevent the occurrence of a disease, illness or illness in a human; (ii) inhibit a disease, disorder or condition, ie inhibit its progression; And / or (iii) alleviate a disease, disorder or condition, ie cause disease, disease and / or disease regression.
  • the present invention relates to delivery techniques of genes, nucleic acids, drugs and the like.
  • cationic liposomes or cationic polymers in the non-viral vector have been studied as gene carriers because they have a characteristic of forming a complex by binding to the anionic charge of a gene by positive charges due to structural features. This improves low gene transfer efficiency, which is a disadvantage of non-viral vectors, but still has a problem of cytotoxicity, and also has a problem that the transfer efficiency is still low to commercialize.
  • the present inventors have recognized these problems, and have attempted to produce non-viral vectors having no cytotoxicity without an immune response by using peptide micelles of short length based on arginine among natural amino acids.
  • R is arginine
  • It relates to a peptide micelle formed of a peptide represented by.
  • the invention features a "arginine" base that is a specific amino acid.
  • arginine has high efficiency of delivering nucleic acid into cells by electrostatically binding to negatively charged nucleic acid molecules.
  • the number of arginine residues is an integer of 1 to 7, even when arginine is composed of only one, it is comparable to poly-L-lysine (PLL), a conventional cationic polymer carrier.
  • PLL poly-L-lysine
  • the number of arginine residues exceeds 7, the total length of the unit peptide forming the micelle is too long, leading to an increase in intracellular toxicity.
  • toxicity may increase due to the fact that the peptide is not degraded after gene transfer but adheres to some cell membranes or organelle membranes and interferes with cellular function.
  • gene transfer is also easy, so it is important to design a peptide sequence to minimize the number of arginine as possible within the above range and to form a stable micelle while loading the gene and / or drug.
  • the arginine number is 2-5.
  • the hydrophobic amino acid binding to arginine may be made of any composition of hydrophobic amino acids different from each other within a range in which peptides containing the same may spontaneously aggregate in a buffer to form micelles.
  • the degree of hydrophobicity of each amino acid residue is well known to those skilled in the art.
  • a representative criterion for indicating the degree of hydrophobicity of amino acid residues used is the hydropathy index proposed by Jack Kyte and Russell Doolittle in 1982. The larger the number, the greater the degree of hydrophobicity.
  • the 20 standard amino acids are arranged in order from smallest hydrophobicity index to smallest:
  • hydrophobicity index proposed by Eisenberg in 1984 also differs slightly in terms of numbers and order, but identifying hydrophobic amino acids by such criteria is a very common task for those skilled in the art.
  • Isoleucine, valine, leucine, phenylalanine, cysteine, methionine and alanine generally classified as very hydrophobic amino acids, or alanine, tyrosine, classified as less hydrophobic or less hydrophobic or indifferent amino acids.
  • the hydrophobic portion of this embodiment ie the peptide portion to be located inside the micelle, can be constructed.
  • the hydrophobic amino acid is preferably selected from isoleucine, valine, leucine, phenylalanine, cysteine, methionine and alanine. Most preferably, valine can be used.
  • the length of the hydrophobic moiety may be too short to form a stable peptide micelle, and therefore, the length should be at least 2 amino acids.
  • the length of the hydrophobic amino acid moiety is also preferably composed of a minimum length for forming stable micelles, since the cytotoxicity and size of the peptide micelles may affect the delivery efficiency.
  • m is 5 to 10.
  • the peptide micelle of the present invention may have the following sequence.
  • peptide micelles composed of arginine and valine form a self-assembled amphiphilic peptide micelle by forming a shell of the surface of the micelle with a hydrophobic valine inside the micelle and a positively charged arginine in the aqueous solution.
  • a schematic diagram of this micelle is shown in FIG. 14.
  • the arginine is electrostatically coupled to the negatively charged nucleic acid as a cationic amino acid can transfer the nucleic acid into the cell.
  • the peptide micelle may further contain a targeting ligand.
  • R is arginine
  • X is a hydrophobic amino acid that may be a different amino acid
  • n 1 to 7
  • m 2 to 20
  • Y is a targeting ligand
  • Peptide micelle complex formed of a peptide represented by relates to a peptide micelle complex characterized in that it further comprises a peptide coupled to the target-directed ligand to the peptide arginine terminal.
  • Arginine residues on the surface of the peptide micelles of the present invention have a high positive charge density to form stable complexes through electrostatic bonding with nucleic acids such as DNA and siRNA.
  • Targeted ligands can be any ligand that can be used for targeted drug treatment, and FIG. 2 exemplarily shows binding of a VEGF receptor binding peptide to a ligand as a representative targeted ligand.
  • target-directed ligands are bound to an arginine terminus to be located externally and cells and / or tissues are selectively delivered to specific targets in need of treatment, resulting in systemic or undesired delivery.
  • Various drug side effects can be avoided.
  • Targeted ligands are generally ligands that bind to specific proteins such as cell and / or tissue specific receptors.
  • the ligand to which the ligand is bound and the peptide to which it is not bound are mixed in an appropriate ratio to form micelles by a self-assembly process in a buffer.
  • the completed micelle is composed of a mixture of peptide-bound peptides and two non-binding monomers, and partially exposes the arginine residues of the peptide to which the ligand is not bound, and also exposes the ligand to the outside.
  • the present invention relates to a gene delivery complex comprising a drug carrier comprising the micelle and a binding gene bound thereto.
  • Drug means an organic or inorganic compound or substance that is bioactive and is used or modified for therapeutic purposes. Proteins, oligonucleotides, DNA and gene therapeutics are broadly included in the drug definition.
  • Drug substances include, for example, proteins, polypeptides, carbohydrates, inorganic substances, antibiotics, antineoplastic agents, local anesthetics, antiangiogenic agents, vasoactive agents, anticoagulants, immunomodulators, cytotoxic agents, antiviral agents, antibodies, neurotransmitters Substances, psychoagonists, oligonucleotides, lipids, cells, tissues, tissues or cell aggregates, and combinations thereof.
  • cancer chemotherapeutic agents such as cytokines, chemokines, lymphokines and indeed purified nucleic acids, and vaccines such as attenuated influenza viruses.
  • hexanes that may be incorporated include genomic nucleic acid sequences, cDNA encoding proteins, expression vectors, antisense molecules and ribozymes that bind to complementary nucleic acid sequences to inhibit translation or transcription.
  • local anesthetics such as amethokine, articaine, benzocaine, bupivacaine, chloroprocaine, dibucaine, diclonin, ethidocaine, levobupivacaine, lidocaine, mepivacaine, oxetazaine Pramoxin, prilocaine, procaine, proparacaine and ropivacaine; Narcotic analgesics such as alfentanil, alphaprodine, buprenorphine, butorpanol, codeine, codeine phosphate, cyclazosin, dextomorphamide, dezosin, diamorphine, dihydrocodeine, dipyanone, fedodozin , Fentany
  • suitable salicylates include aminosalicylic sodium, val salazide, choline salicylate, mesalazine, olsalazine, para-amino salicylic acid, salicylic acid, salicylic salicylic acid, and sulfasalazine.
  • suitable phenylpropionic acid derivatives are ibuprofen, phenopropene, flurbiprofen, ketopropene and naproxen and the like.
  • Preferred drugs for the drug carrier of the present invention are hydrophobic drugs.
  • the hydrophobic drugs that can be used may be any drug having a water solubility of 10 mg / ml or less, for example, anticancer drugs, antibacterial drugs, steroids, anti-inflammatory drugs, sex hormones, immunosuppressants, antiviral drugs, anesthetics, antiemetic agents or antihistamines. And the like can be used.
  • anticancer agents such as paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, cisplatin, carboplatin, 5-FU, etoposide, camptothecin; Sex hormones such as testosterone, estrogen and estradiol; Steroid derivatives such as triamcinolone acetonide, hydrocortisone, dexamethasone, prednisolone, betamethasone; Cyclosporin; Or prostaglandins and the like can be used.
  • a drug delivery characterized in that it further comprises a drug in the hydrophobic interior of the micelle.
  • Drugs contained in the hydrophobic interior is any drug that can enhance the effect of treatment, alleviation, etc. desired by the gene carried by the micelle of the present invention, the drug is preferably hydrophobic electrostatically, at least the structure of the micelles The drug may be spontaneously located during micelle formation without impairing the stability thereof.
  • the content of the hydrophobic drug is 0.1 to 100% by weight, preferably 1 to 50% by weight based on the micelle peptide of the present invention.
  • the hydrophobic drug when the hydrophobic drug is loaded on the hydrophobic amino acid, which is a component of the micelle peptide of the present invention, the drug delivery efficiency is improved. This is because the structure of micelles is further stabilized by the loading of hydrophobic drugs.
  • the present invention relates to a gene (nucleic acid) binding complex comprising a gene (nucleic acid) bound to the drug carrier.
  • Binding genes generally consist of nucleic acids, and any gene drug that can be used for gene therapy can be applied thereto.
  • Representative gene drugs including DNA, RNA, RNAi and the like can be combined.
  • an RNAi reagent comprising siRNA.
  • RNAi reagents comprise sequences complementary to the target gene.
  • a target gene in the context of the present invention means that the sequence is complementary to RNA transcribed from the DNA sequence of the target gene, including pre-mRNA, mRNA, cDNA.
  • “Target gene” is meant to include any DNA sequence expressed in a cell, tissue or organism, ie, transcribed into RNA. The expressed sequence need not necessarily be translated into a protein and includes, for example, pre-mRNA, regulatory RNA, rRNA and the like. Sequences complementary to the target gene are generally about 19-23 nucleotides in length, but may be longer.
  • RNAi reagent used for RNAi is preferably double-stranded and may consist of two separate strands, but may also consist of one strand forming a hairpin loop.
  • RNAi mediating RNAi are, for example, siRNA or miRNA (microRNA) or small hairpin RNA (shRNA). In one embodiment of the invention siRNA was used.
  • SiRNA has been widely studied as a method for inhibiting gene expression and use in the treatment of diseases.
  • SiRNA included in the composition of the present invention can be appropriately designed by finding a target site in a gene with reference to methods known in the art.
  • siRNA target sites for example, the following method can be used.
  • SiRNAs included in the gene binding complexes of the invention include isolated siRNAs comprising short double-stranded RNA consisting of about 17 nucleotides to about 29 nucleotides, preferably about 19 to about 25 nucleotides, targeting the target mRNA. do.
  • siRNAs include antisense RNA strands complementary to the sense RNA strands.
  • the sense and antisense strands of the siRNA of the present invention may comprise two complementary and single stranded RNA molecules, or two complementary moieties may form a base pair and comprise a single molecule covalently bound by a single strand of hairpin region.
  • SiRNA included in the present invention can be obtained using a number of techniques known to those skilled in the art.
  • siRNA can be chemically synthesized using a method known in the art, or produced by recombinant methods.
  • Such a gene-binding complex provides a means for delivering a nucleic acid drug to genes or siRNAs, such as gene therapy, without cytotoxicity using amphiphilic peptide micelles, and safely delivering nucleic acids into cells.
  • peptide micelles were prepared using each of four different peptides (R 1-4 V 6 ) consisting of one to four arginine and six valine linked from N-terminus to C-terminus.
  • the preparation of micelles was carried out by incorporating 0.5-15 ⁇ g of DNA and 1 ⁇ g of R1V6, R2V6, R3V6, and R4V6 into 5% glucose solution, and then incubated and incubated with self-assembled amphiphiles.
  • Peptide micelles were formed and prepared.
  • the table below shows the amino acid sequences of the four different peptides prepared in this example. These are represented by SEQ ID NOs: 1-4, respectively.
  • Example 1 0.5-15 ⁇ g and 1 ⁇ g of the R2V6 peptide in the peptide used in Example 1 were added to the 5% glucose solution and stirred to form a micelle-DNA complex. Gel retardation assay was performed on 1% agarose gel to confirm complex formation.
  • transfection efficiency was performed with HEK293 cells, and the composition ratio of the peptide / DNA complex showing the optimal transfection efficiency was investigated.
  • reporter gene luciferase was used to express activity as RLU / mg protein to measure efficiency.
  • transfection efficiency when poly-L-lysine (PLL), which is generally used as a vector was measured and compared.
  • MTT assay MTT assay
  • the results of the MTT assay in Figure 5 are shown as cell viability.
  • the complex of peptide micelle and DNA according to the present invention was shown to have lower toxicity than the complex of PEI, which is a cationic polymer, which is a gene carrier, and PLL, which is a cationic peptide.
  • the data indicates that when the expression rate of the control group that does not occur at all is expressed as 100, the lower the expression rate, the higher the silencing effect, the peptide micelles used showed higher siRNA delivery than PEI. The results showed that the gene silencing effect was excellent.
  • FITC-siRNA transfection into HEK293 cells was performed, and peptide / siRNA complexes showing optimal transformation efficiency were subjected to FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). It was investigated using.
  • PEI Polyethylenimine
  • the intracellular delivery efficiency of the FITC-siRNA / R3V6 peptide complex was similar to that of the FITC-siRNA / PEI 25kDa complex.
  • Antagomir is a short oligonucleotide (22base) that has the function of inhibiting micro RNA.
  • the delivery efficiency of FITC-antagomir and R3V6 complexes to U87 cells was measured using FACS.
  • the intracellular delivery efficiency of the FITC-antagomir / R3V6 peptide complex was found to be higher than 90% at a 1:20 ratio.
  • Dual luciferase analysis was used to measure the intracellular delivery effect of siRNA using optimized R3V6 peptide and RNA interference by the delivered siRNA.
  • HEK293 cells were previously transformed with a psiCHECK-2 vector expressing firefly luciferase and renilla luciferase, and then transfected with luc-siRNA that inhibits the expression of firefly luciferase.
  • luc-siRNA that inhibits the expression of firefly luciferase.
  • only Luc-siRNA was transformed without the carrier to be compared.
  • siRNA only siRNA delivered to R3V6 was confirmed that the silencing of about 50% (silencing).
  • VEGF-ELISA method In order to measure the intracellular delivery effect of VEGF-siRNA using optimized R3V6 peptide and RNA interference by the delivered siRNA, VEGF-ELISA method was used.
  • VEGF-siRNA that inhibits VEGF expression was transformed with R3V6 peptide in CT-26 cells overexpressing VEGF.
  • the transfection efficiency of the VEGF-siRNA / R3V6 peptide complex was similar to that of the FITC-siRNA / PEI 25kDa complex.
  • GFP-siRNA transformation efficiency and RNA interference phenomena by 25 kDa of Polyethylenimine (PEI), Poly-L-lysine, and Lipofectamine were also measured and compared.
  • the transfection efficiency of the GFP-siRNA / R3V6 peptide complex and the inhibition of GFP expression by the delivered GFP-siRNA were lower than those of the PLL complex, the lipofectamine complex, and similar to the GFP-siRNA / PEI 25kDa complex. It showed an aspect.
  • PEI 25 kDa showed high cytotoxicity, while RV peptide showed little cytotoxicity.
  • dexamethasone As a hydrophobic drug, dexamethasone (Dxamethasone) was used to encapsulate in the hydrophobic core of micelles, and designed as shown in FIG.
  • the hydrophobic dye significantly reduced the fluorescence regardless of the presence or absence of DNA. This confirmed that the inclusion of a hydrophobic substance such as dexamethasone into the R3V6 peptide.
  • dexamethasone was encapsulated in the R3V6 peptide by a W / O emulsion method and a lyophilization method.
  • the transfection efficiency was investigated by varying the amount of dexamethasone encapsulated while the amount of the R3V6 peptide was fixed, and the weight ratio of R3V6 and dexamethasone showing the optimal transfection efficiency was determined.
  • the R3V6-dexamethasone peptide of the present invention has higher DNA transfer efficiency than the PLL which is widely used as well as the dexamethasone unsealed R3V6 peptide (FIG. 16).
  • the ratio of DNA: R3V6-dexamemethasone in HEK293 cells has a high DNA transfer efficiency at 1:30 and a high DNA transfer efficiency at 1:20 in N2A cells (FIG. 17).
  • the peptide micelle of the present invention is a short-length peptide based on arginine among natural amino acids, an immune response does not occur and there is no cytotoxicity.
  • the cation density is increased by the micelle formation to form a stable complex with the gene or siRNA, and when the hydrophobic drug is encapsulated, the structure of the micelle is further strengthened to increase the drug and / or nucleic acid delivery efficiency.

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Abstract

본 발명은 일정 수의 아르기닌와 소수성 아미노산을 포함하는 펩티드로 형성된 펩티드 마이셀을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드 마이셀을 포함하는 약물전달체, 결합 핵산를 더 포함하는 핵산 결합 복합체를 제공한다. 본 발명에 따르는 아르기닌 기반의 짧은 펩티드로 이루어진 펩티드 마이셀은 독성이 적고, 핵산 전달 효율은 종래 기술에서 사용이 고려되는 고분자 벡터보다 높거나 유사해서, 보다 안전한 핵산 치료제로 유용하다.

Description

아르기닌 기제 양친성 펩티드 마이셀
본 발명은 비바이러스성 약물 전달체로 유용한 마이셀에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은 비바이러스성 체내 약물 전달체로 유용한 펩타이드로 형성되는 마이셀에 관한 것이다.
DNA 재조합 기술의 발달로 외래의 핵산을 세포 내 또는 시험관 내에서 발현시키는 기술이 상용화되었으며, 이 같은 기술을 이용하여 세포 제어의 관찰, 재조합 단백질의 대량 생산, 유전자의 클로닝, 결실되거나 존재하지 않는 유전자의 교체 또는 세포 제어의 저해나 활성화 등 다양한 활용이 가능하게 되었다.
그 중에서도 환자가 가진 특정 유전자의 이상으로 인한 질병의 치료를 위하여 환자의 특정 세포 내에 있는 유전자를 조작하는 치료법인 유전자 치료는 질병의 새로운 치료 방법으로서 제시되어 지난 십 수년간 다양한 방법의 유전자 전달 수단의 연구가 이루어지고 있다. 유전자 치료를 위한 다양한 방법들이 보고되어 있다. (예를 들어, Mountain, Trends in Biotech., 18:119-128, 2000; Romano et al. Stem Cells, 18:19-39, 2000 등 참조)
유전자 치료의 핵심적인 요소는 치료 효과를 나타내는 치료 유전자와 치료 유전자를 안전하고 효율적으로 인체에 전달해 줄 수 있는 유전자 전달체 (또는 전달 물질 또는 시스템)이다. 그 중 유전자 전달 시스템의 선택은 치료 유전자를 표적기관에 효과적으로 전달하는 문제와 그 유전자가 적당한 세포에 거부반응 없이 받아들여져 발현을 일으켜 목적하는 치료 효과를 거두는 문제에 관한 것이다. 실제로 유전자 치료의 성공을 위하여 새로운 전달 시스템을 개발하는 것이 유전자 치료 분야에서 주요 문제로 인식되어 있다. (예를 들어, Wilson et al. Nature, 365, 691, 1993; Rolland, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 15:143-198, 1998 등 참조) 이러한 유전자 전달체 또는 시스템은 경우에 따라 '벡터'라는 용어를 사용하여 지칭되기도 한다.
숙주에 대한 감염성이 그 속성인 바이러스를 변형하여 병원성을 제거하고 전달 유전자를 삽입하여 제조되는 바이러스성 벡터는 그 모체가 되는 바이러스의 종류에 따라, 아데노 바이러스, 레트로바이러스, AAV (adeno-associated virus) 벡터 등이 있다. 이들 바이러스성 벡터는 바이러스의 속성이 감염성이기 때문에 유전자를 전달하는 효율은 우수하지만 숙주의 염색체 내에 삽입되었을 때 돌연변이 유발 가능성이 높고, 따라서 감염성 바이러스의 생성 가능성 및 숙주 내 염증 반응 유발 등의 위험요소가 많아 그 사용이 제한적이다. (예를 들어, Kremer et al., British Medical Bulletin 51:31-44, 1995; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807-838, 1995 참조)
이 같은 문제점을 피하기 위하여 바이러스성 벡터에 대한 대안으로 개발되어 온 비바이러스성 유전자 전달 시스템은 물리화학적 전달 방법에 의하여 세포 내로 유전자를 이입하는 방법으로서, 리포좀을 비롯한 (양이온성) 지질 전달체 및 (양이온성) 고분자 전달체가 대표적인 예이다. 이 같은 비바이러스성 벡터들은 생분해성이 있어 생체 안전성이 높고, 비면역성이며, 전달 유전자의 크기에 따른 제한이 없어 사용이 간편하다는 장점이 있다. 그러나, 비바이러스성 벡터는 세포 내 이입 후 용해소체내에서 분해되어 유전자가 세포질로 운반되는 효율이 낮고 따라서 핵으로 유전자가 수송되는 비율도 낮아서 바이러스성 벡터와 비교하여 유전자 전달 효율이 낮다는 문제점이 있다.
리포좀을 비롯하여 양이온성 지질로 이루어진 전달체의 경우 조작, 보관, 품질관리가 비교적 간편하며, 생체 외 전달효율이 양호하고 바이러스성 벡터에 비하면 항원성도 낮으며 안전성이 높다는 장점이 있는 반면, 생체내 유전자 전달효율이 낮고 발현 기간 자체가 짧아 실효성이 떨어지는 단점이 있고 임상 사례도 축적되어 있지 않다. 양이온성 지질 전달체는 지질이 안정된 마이셀(micelle)을 형성하고 표면에 양이온성을 띠고 있어 주로 음전하를 띠는 DNA 또는 RNA인 유전자 치료 약물이 용이하게 결합하여 세포 내로 이입되는 원리를 이용한 것이다.
한편, Xin Dong Guo 등, Biomaterials 29, 4838-4846, 2008은 콜레스테롤과 올리고펩티드가 접합된 분자들이 자기-조립(self-assemble)되어 형성되는 양이온성 마이셀을 개시한다. 접합체의 한쪽 말단을 형성하는 지질인 콜레스테롤 부분은 마이셀 형성 및 안정화에 기여하며 양이온성 펩티드가 유전자와의 결합에 기여한다.
대한민국 특허공개 제 10-2003-0078115 호에서는 유전자 결합 및 전달에 이용할 수 있는 특정 서열을 갖는 펩티드를 사용한 유전자 전달 방법을 개시한다. 바이러스성 벡터에 비하여 안전하다는 이점이 있지만, 유전자 전달을 위해서 갖추어야 할 세포 내 구조적 안정성이 약하다는 단점이 있다.
즉, 바이러스성 벡터는 바이러스의 속성이 감염성이기 때문에 유전자를 전달하는 효율은 우수하지만 숙주의 염색체 내에 삽입되었을 때 돌연변이 유발 가능성이 높고, 따라서 감염성 바이러스의 생성 가능성 및 숙주 내 염증 반응 유발 등의 위험요소가 많아 그 사용이 제한적이다. 또한, 이와 같은 문제점을 개선하고자 사용되는 비바이러스성 벡터가 갖는 단점인 낮은 유전자 전달 효율이 다소 개선되어 많이 사용되는 양이온성 고분자, 양이온성 펩티드 또는 양이온성 리포좀은 바이러스성 벡터와는 또 다른 측면에서의 세포독성을 띠는 문제가 있고, 전달 효율 또한 상용화하기에는 아직 낮은 수준이다.
이에, 본 발명자들은 세포 내부로의 침투가 용이하고 안정적인 구조를 갖는 양친성 펩티드로 이루어진 마이셀이 유전자 전달체로서 유용할 것으로 예측하여, 1 내지 7 아미노산 잔기라는 비교적 짧은 길이의 아르기닌과 하나 이상의 소수성 아미노산을 다른 말단에 포함하는 비교적 짧은 길이의 펩티드를 제조하여, 이로부터 자기-조립된 마이셀 형성이 가능하고, 핵산과의 결합체를 성공적으로 형성하여 유전자 전달이 이루어지는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 종래 문제점들을 해결할 수 있는 세포독성이 낮으면서 전달효율이 높은 비바이러스성 벡터의 제공을 위한 것으로,
본 발명의 주된 목적은 상기 비바이러스성 벡터의 제조를 위한 아르기닌 기반의 펩티드 마이셀을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 아르기닌 기반의 펩티드 마이셀을 포함하는 약물 전달체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약물전달체 및 이에 결합된 핵산을 포함하는, 핵산 결합 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명은 상기 과제들을 해결하기 위하여,
하기의 일반식 I:
RnXm (I)
(식 중, R은 아르기닌, X는 서로 다른 아미노산일 수 있는 소수성 아미노산, n = 1 내지 7의 정수, m = 2 내지 20의 정수이다)
로 표현되는 펩티드로 형성된 펩티드 마이셀을 제공한다.
이 때, 상기 소수성 아미노산은 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 시스테인, 메티오닌 또는 알라닌으로부터 선택될 수 있는데, 가장 바람직하게는 발린을 사용한다.
특히, 상기 일반식 (I)에서, n은 2 내지 5의 정수인 것이 바람직하며, m은 5 내지 10의 정수인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 펩티드 마이셀은 서열번호 1 내지 4로 표시되는 서열 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드 아르기닌 말단에 표적지향 리간드가 결합된 펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 하기 일반식 (II)
RnXmY (II)
(식 중, R은 아르기닌, X는 서로 다른 아미노산일 수 있는 소수성 아미노산, n = 1 내지 7의 정수, m = 2 내지 20의 정수이며, Y는 표적지향 리간드이다)
로 표현되는 펩티드 마이셀(복합체)을 제공한다. 상기 표적지향 리간드는 표적화 약물 치료에 사용할 수 있는 임의의 리간드일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 설명한 펩티드 마이셀을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
이 때, 상기 약물은 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질일 수 있다.
특히, 상기 약물은 소수성 약물인 것이 바람직하다. 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신의 항암제; 테스토스테론, 에스트로젠, 에스트라다이올의 성호르몬; 트리암시놀론 아세토나이드, 하이드로코티손, 덱사메타손, 프레드니솔론, 베타메타손의 스테로이드 유도체; 사이클로스포린; 또는 프로스타글란딘 등의 소수성 약물을 마이셀의 소수성 부분에 로딩할 수 있다. 이 때, 소수성 약물이 로딩되면 해당 약물전달체의 전달효율이 더욱 향상된다.
또한, 본 발명은 상기 약물전달체 및 이에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 결합 복합체를 제공한다.
이 때, 상기 핵산은 제한은 없으나, 바람직하게는 DNA 또는 RNA이다. 특히, 상기 RNA는 iRNA인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 iRNA 중 siRNA인 것이 좋다.
그리고, 상기 핵산 결합 복합체를 이루는 마이셀의 소수성 내부에 소수성 약물을 더 포함하여 사용할 수 있다.
본 발명의 펩티드 마이셀 및 유전자 결합 복합체는 다양한 질병의 치료를 위한 저독성 고효율의 유전자 또는 siRNA 전달체 개발에 유용하며 임상 적용 가능한 유전자 치료제 및 siRNA 치료제로 개발되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 아르기닌 기반의 짧은 펩티드로 이루어진 펩티드 마이셀은 독성이 적고, 핵산 전달 효율은 종래 기술에서 사용이 고려되는 고분자 벡터보다 높거나 유사해서, 보다 안전한 핵산 치료제로 유용하다.
또한, 본 발명의 펩티드 마이셀은 리간드를 이용한 표적지향 유전자 및 siRNA 전달이 가능하므로, 부작용이 적으며, 치료 효율이 우수한 핵산 치료제로 유용하다.
도 1은 본 발명의 펩티드 마이셀과 핵산의 복합체 형성 모식도이다.
도 2는 본 발명의 한 구체예에 따라 표적지향 리간드가 결합된 펩티드를 포함하는 펩티드 마이셀과 핵산치료제의 복합체 형성 모식도이다.
도 3은 겔 리타데이션 분석을 나타내는 사진이다. 숫자는 펩티드와 DNA의 중량비.
도 4는 펩티드와 DNA의 복합체 내 조성 비율에 따른 트랜스펙션 효율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 유전자 전달 효율이 가장 우수한 펩티드/DNA 복합체 비율에서 독성을 평가하기 위한 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 펩티드 마이셀을 이용한 siRNA 사일런싱 비율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 펩티드 마이셀의 겔 지연 분석(Gel retardation assay)를 나타낸 것으로, 숫자는 펩타이드와 DNA의 무게 비를 나타낸다.
도 8은 펩티드와 FITC-siRNA 복합체의 세포내 전달 효율을 나타낸 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 측정 결과 그래프이다.
도 9는 RV 펩타이드와 FITC-antagomir 복합체의 세포내 전달 효율을 나타낸 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 측정 결과 그래프이다.
도 10은 펩티드 마이셀로 전달된 siRNA의 사일런싱 효율에 대한 Dual luciferase 분석결과이다.
도 11은 펩티드 마이셀과 VEGF-siRNA 복합체의 세포내 전달 효율에 대한 VEGF-ELISA 측정 결과이다.
도 12는 펩티드 마이셀과 GFP-siRNA 복합체의 세포내 전달 효율에 대한 형광현미경 사진이다.
도 13은 펩티드 마이셀과 VEGF-siRNA 복합체의 세포 독성에 대한 MTT 분석 결과이다.
도 14는 소수성 약물인 덱사메타손이 봉입된 경우의 펩티드 마이셀의 모식도이다.
도 15는 펩티드 마이셀(각각 -DNA, +DNA)에 봉입된 소수성 dye의 quench효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 봉입된 덱사메타손의 양에 따른 R3V6-덱사메타손 펩티드의 형질전환 효율을 나타낸 그래프이다.
도 17은 HEK293 세포와 N2A세포에서의 R3V6-덱사메타손 펩티드의 형질전환 효율을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"펩티드" "폴리펩티드" "올리고펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 또는 단백질 약물을 말할 때 동일하게 사용될 수 있으며 특정 분자량, 펩티드 서열 또는 길이, 생활성 또는 치료분야에 국한되지 않는다.
"핵산"은 유전자, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), 플라스미드 및 작은 간섭 리보핵산 (siRNA) 등을 포함하는 의미한다. 또한 상기 핵산은 핵산 구조 중의 인산부, 에스테르부 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 황 원자 또는 불소 원자 등의 다른 원자나 메틸기 등의 알킬기로 치환된 유도체를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 상기 핵산은 플라스미드 및 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA, siRNA)이다.
상기 "핵산", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태 및 혼성 중합체, 센스 및 안티센스 스트랜드 모두를 포함하며, 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질 될 수 있거나, 또는 비천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 해당 유전자의 전사물을 사일런싱하는데 유용하다. 세포 내의 이러한 안티센스 구조물의 발현은 해당 유전자 전사 및/또는 번역을 방해한다. 또한, 예컨대 siRNA를 이용하여 RNAi를 유도하는 기작 및 공동억제도 사용될 수 있다. 따라서, 안티센스 또는 센스 분자는 직접 투여될 수 있다. 후자의 구체예에서, 안티센스 또는 센스분자는 또한 조성물로 제형화되어 표적 세포에 임의의 다수 수단으로 투여되거나 발현 구조체를 통해 투여될 수 있다.
"리간드"는 본 발명의 펩티드와 화학적으로 접합될 수 있거나 또는 직접적으로 연합되고/복합체를 형성할 수 있는, 적합한 모든 표적화 부분을 지칭한다. 본 발명의 실시에 사용하기 위해 예시되는 리간드에는 단백질, 펩티드, 항체, 항체 단편 (Fab' 단편 및 단일 쇄 Fv 단편 포함) 및 당 뿐만 아니라 기타 표적화 분자가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
“siRNA" 용어는 표적 mRNA의 번역을 막는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. RNA가 전사되는 주형으로 DNA를 포함하는, siRNA를 세포에 도입하는 표준기술이 사용된다. 상기 siRNA는 dsRNA 또는 shRNA 모두 가능하다. 'dsRNA'는 한 개 가닥과 이에 상보적인 서열을 가지는 다른 가닥으로 구성된 두 개의 RNA 분자 컨스트럭트를 지칭하며, 두 분자는 상보적 서열을 가지므로 서로 결합하여 이중-가닥의 RNA 분자를 형성한다. 두 가닥의 핵산 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열에서 선택된 RNA의 "센스" 또는 “안티센스”서열 뿐만 아니라 표적 유전자의 비암호화 영역(non-coding region)에서 선택된 RNA 분자도 포함될 수 있다. 'shRNA' 용어는 서로 상보적인 첫 번째 및 두 번째 영역, 즉 센스 및 안티센스 가닥을포함하는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 가지는 siRNA를 지칭한다. 상보성의 정도와 상보성 부위의 방위가 충분하면 상기 영역간의 충분한 염기쌍의 결합이 일어나고, 첫 번째 부위와 두 번째 부위는 루프 부위에 의해 연결되고, 루프 부위는 루프 부위의 핵산(또는 핵산 유사체)간의 염기쌍의 부재에 의해 이루어진다. 상기 shRNA의 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥의 사이의 단일 가닥 부위이며, 또한, “개입한 단일 가닥”로 지칭될 수 있다.
"담체"는, 사용되는 복용량 및 농도에서 담체에 드러나는 세포 또는 포유류에 대해 무독성인, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제일 수 있다. 때때로, 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충용액이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드(약 10 잔기 미만), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(salt-forming counterion), 및/또는 TWEEN®, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS®같은 무이온 계면활성제를 포함한다.
"치료적 효과"란 당해 방법에 따라 치료된 피검체, 사람 또는 동물의 병에서의 임의의 개선을 의미하며, 예방 또는 방지 효과, 또는 물리적 조사, 실험실용 또는 기계적 방법에 의해 탐지될 수 있는 질병, 질환 또는 병의 징후 및 증상의 중증도에 있어서의 임의의 경감을 수득하는 것을 포함한다.
특정 질병 또는 질환과 관련하여 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"이란 (i) 질병, 질환 및/또는 병에 걸리기 쉬우나 아직 병에 걸린 것으로 진단되지 않은 동물 또는 사람에서 질병, 질환 또는 병이 발생하는 것을 예방하고; (ii) 질병, 질환 또는 병을 억제하고, 즉 이의 진행을 억제하고; 및/또는 (iii) 질병, 질환 또는 병을 경감시키고, 즉 질병, 질환 및/또는 병의 퇴화를 야기하는 것을 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 유전자, 핵산, 약물 등의 전달기술에 관한 것이다.
각종 세포내로 유전자를 전달하기 위하여 다양한 기술 및 운반체, 특히 벡터들이 제안되어 왔으나, 핵산의 전달 또는 발현을 위해 사용되는 기술은 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터를 이용한 방법으로 구분할 수 있다.
특히, 상기 비바이러스성 벡터 중 양이온성 리포좀 또는 양이온성 고분자들은 구조적인 특징에 의한 양하전으로 유전자의 음이온성 하전과 결합하여 복합체를 형성하는 특징이 있어 유전자 전달체로서 연구되어 왔다. 이는 비바이러스성 벡터가 갖는 단점인 낮은 유전자 전달 효율을 개선하였으나, 여전히 세포독성을 띠는 문제가 있고, 전달 효율 또한 상용화하기에는 아직 낮은 수준이라는 문제를 가지고 있다.
본 발명자들은, 이러한 문제점들을 인식하고, 천연 아미노산 중 아르기닌을 기반으로 짧은 길이의 펩타이드 마이셀(micelle)을 이용하여, 면역반응이 일어나지 않으면서 세포독성도 가지고 있지 않은 비바이러스성 벡터를 제조하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 하기의 일반식 I:
RnXm (I)
(식 중, R은 아르기닌, X는 서로 다른 아미노산일 수 있는 소수성 아미노산, n = 1 내지 7의 정수, m = 2 내지 20의 정수이다)
로 표현되는 펩티드로 형성된 펩티드 마이셀에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 특정 아미노산인 "아르기닌"기반을 특징으로 한다.
양이온성 아미노산 가운데에서도 아르기닌은 음전하를 띠는 핵산 분자와 정전기적으로 결합하여 핵산을 세포 내로 전달하는 효율이 높다.
[규칙 제26조에 의한 보정 09.09.2010]　
Figure WO-DOC-FIGURE-186
본 발명에서 아르기닌 잔기의 수는 1 내지 7의 정수를 취하는데, 아르기닌이 한 개만으로 구성된 경우에도 종래의 양이온성 고분자 전달체인 폴리-L-리신(Poly-L-lysine: PLL)과 비견할 정도의 전달 효율을 나타내어 유효하며(도 4 참조), 아르기닌 잔기 수가 7개를 초과하는 경우는 마이셀을 형성하는 단위 펩티드의 전체 길이가 너무 길어져 세포 내 독성이 증가하는 문제점이 있다.
마이셀을 형성하는 단위 펩티드의 전체 길이가 길어지면 유전자 전달 후 펩티드가 분해되지 않고 일부 세포막이나 소기관 막에 부착되어 세포기능을 방해하는 등의 이유로 독성이 증가할 수 있으며 전체 펩티드 마이셀의 크기가 작을수록 일반적으로 유전자 전달도 용이하므로, 상기 범위 내에서 가능한 한 아르기닌 수를 최소화 하면서도 전달 유전자 및/또는 약물을 적제하고도 안정적인 마이셀 형성을 할 수 있도록 펩티드 서열을 디자인하는 것이 중요하다. 바람직하게는 아르기닌 수는 2 내지 5이다.
상기 아르기닌에 결합하는 소수성 아미노산은 그것을 포함하는 펩티드가 완충액 내에서 자발적으로 집합하여 마이셀을 형성할 수 있는 범위 내에서 서로 다른 소수성 아미노산의 어떤 조성으로 이루어져도 무방하다.
각 아미노산 잔기의 소수성 정도는 당업자에게 주지의 사실이다. 대표적으로 사용되는 아미노산 잔기의 소수성 정도를 나타내는 기준은 1982년 Jack Kyte 및 Russell Doolittle에 의하여 제안된 소수성 지수(hydropathy index)로서, 숫자가 클수록 소수성 정도가 크다. 20 가지 표준 아미노산을 소수성 지수가 작은 것부터 큰 순서로 배열하면 다음과 같다:
R K N D Q E H P Y W S T
-4.5 -3.9 -3.5 -3.5 -3.5 -3.5 -3.2 -1.6 -1.3 -0.9 -0.8 -0.7
G A M C F L V I
-0.4 1.8 1.9 2.5 2.8 3.8 4.2 4.5
1984년에 Eisenberg에 의하여 제안된 소수성 지수 또한 수치나 순서 면에서 약간의 차이는 있으나, 이와 같은 기준에 의하여 소수성 아미노산을 판별하는 것은 당업자에게 매우 일상적인 작업이다.
일반적으로 매우 소수성인(very hydrophobic) 아미노산으로 분류되는 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 시스테인, 메티오닌 및 알라닌 또는 덜 소수성이거나 소수성과 친수성 중간 성질의(less hydrophobic or indifferent) 아미노산으로 분류되는 알라닌, 티로신, 히스티딘, 트레오닌, 세린, 프롤린 및 글리신 중에서 선택되는 아미노산의 적당한 조합에 의하여 이 구체예의 소수성 부분, 즉 마이셀의 내부에 위치할 펩티드 부분이 구성될 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 시스테인, 메티오닌 및 알라닌으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 발린을 사용할 수 있다.
다만, 펩티드 마이셀의 단위체 길이가 짧을수록 일반적으로 세포 독성이 약하게 나타나므로 소수성 아미노산 부분(X)의 길이가 20 아미노산 이내(m ≤ 20)가 되도록 구성된다.
여기서 m이 2 미만인 경우에는 소수성 부분의 길이가 너무 짧아 안정한 펩지드 마이셀을 구성하지 못할 수 있으므로 최소한 2 아미노산 이상의 길이여야 한다. 소수성 아미노산 부분의 길이도 안정한 마이셀을 형성을 위한 최소한의 길이로 구성되는 것이 바람직하며, 이는 펩티드 마이셀의 세포 독성 및 크기에 따라 전달 효율에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 바람직하게는 m은 5 내지 10이다.
일 구체예에서 본 발명의 펩티드 마이셀은 이하와 같은 서열을 가질 수 있다.
서열번호 1 : Arg-Val-Val-Val-Val-Val-Val
서열번호 2 : Arg-Arg-Val-Val-Val-Val-Val-Val
서열번호 3 : Arg-Arg-Arg-Val-Val-Val-Val-Val-Val
서열번호 4 : Arg-Arg-Arg-Arg-Val-Val-Val-Val-Val-Val
이처럼, 아르기닌과 발린으로 이루어진 펩티드 마이셀은 수용액 상에서 소수성인 발린이 마이셀 내부를 이루고 양전하를 띄는 아르기닌이 마이셀 표면의 껍질을 형성하여 자가조립된 양친성 펩티드 마이셀(self-assembled amphiphilic peptide micelle)을 형성한다. 이러한 마이셀의 모식도를 도 14에 나타내었다. 이 때, 아르기닌은 양이온성 아미노산으로 음전하를 띠는 핵산과 정전기적 결합을 하여 핵산을 세포내부로 전달할 수 있다.
한편, 상기 펩티드 마이셀은 표적지향 리간드를 추가로 더 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 하기의 일반식 II:
RnXmY (II)
(식 중, R은 아르기닌, X는 서로 다른 아미노산일 수 있는 소수성 아미노산, n = 1 내지 7의 정수, m = 2 내지 20의 정수이며, Y는 표적지향 리간드이다)
로 표현되는 펩티드로 형성된 펩티드 마이셀 복합체로서, 상기 펩티드 아르기닌 말단에 표적지향 리간드가 결합된 펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드 마이셀 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드 마이셀 표면에는 아르기닌 잔기들에 의하여 국소적으로 양전하 밀도가 높아 DNA, siRNA 등과 같은 핵산과 정전기적 결합을 통하여 안정한 복합체를 형성한다.
표적지향 리간드는 표적화 약물 치료에 사용할 수 있는 어떤 리간드일 수 있으며, 도 2에서는 대표적 표적지향 리간드로서 VEGF 리셉터 결합 펩티드를 리간드로 결합한 것을 예시적으로 도시한다.
펩티드 마이셀을 형성할 때 외부에 위치할 아르기닌 말단에 표적지향 리간드를 결합하여 세포 및/또는 조직 선택적으로 핵산을 치료를 필요로 하는 특정 표적에만 전달하여 전신적인 전달이나 목적하지 않은 부분으로의 전달로 인한 각종 약물 부작용을 피할 수 있다.
표적지향 리간드는 일반적으로 세포 및/또는 조직 특이적인 리셉터 등의 특이적 단백질에 결합하는 리간드이다. 이 구체예에서 리간드가 결합된 펩티드와 결합되지 않은 펩티드를 적당한 비율로 혼합하여 완충액 중에서 자기-조립 과정에 의하여 마이셀을 형성시킨다. 즉, 완성된 마이셀은 리간드가 결합된 펩티드와 결합되지 않은 펩티드 2 종류의 단위체가 혼합되어 구성되는 것이며 외부에는 리간드가 결합되지 않은 펩티드의 아르기닌 잔기 부분이 일부 노출되고 리간드도 외부를 향하여 노출된 형태를 띠게 된다.
또 다른 관점에서 본 발명은 상기 마이셀을 포함하는 약물전달체 및 이에 결합된 결합 유전자를 포함하는 유전자 결합 복합체에 관한 것이다.
"약물"은 생활성을 가지며 치료용으로 사용 또는 개조되는 유기 또는 무기 화합물이나 물질을 의미한다. 단백질, 올리고누클레오티드, DNA 및 유전자 치료제가 광의의 약물 정의에 포함된다.
약물 물질로는 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항신생물제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항바이러스제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 조직 또는 세포 응집물, 및 이들의 조합물이 있다. 뿐만 아니라, 암 화학요법제, 예컨대 시토킨, 케모킨, 림포킨 및 실제로 정제된 핵산, 및 백신, 예컨대 약독화된 인플루엔자 바이러스가 있다. 혼입될 수 있는 실제로 정제된 헥산은 게놈 핵산 서열, cDNA 엔코딩 단백질, 발현 벡터, 상보적인 핵산 서열과 결합하여 번역 또는 전사를 억제하는 안티센스 분자 및 리보자임을 포함한다. 또한, 국소 마취제, 예컨대 아메토카인, 아르티카인, 벤조카인, 부피바카인, 클로로프로카인, 디부카인, 디클로닌, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 옥세타자인, 프라목신, 프릴로카인, 프로카인, 프로파라카인 및 로피바카인; 마약성 진통제, 예컨대 알펜타닐, 알파프로딘, 부프레노르핀, 부토르파놀, 코데인, 코데인 포스페이트, 시클라조신, 덱스토모라미드, 데조신, 디아모르핀, 디히드로코데인, 디피아논, 페도토진, 펜타닐, 히드로코돈, 히드로모르폰, 케토베미돈, 레보르파놀, 메프타지놀, 메타돈, 메타딜 아세테이트, 모르핀, 날부핀, 노르프로폭시펜, 노스카핀, 옥시코돈, 옥시모르폰, 파레고릭, 펜타조신, 페티딘, 페나조신, 피리트라미드, 프로폭시펜, 레미펜타닐, 수펜타닐, 틸리딘 및 트라마돌; 및 비마약성 진통제, 예컨대 살리실레이트 또는 페닐프로피온산 유도체가 있다. 적합한 살리실레이트의 예로는 아미노살리실릭 나트륨, 발살라지드, 콜린 살리실레이트, 메살라진, 올살라진, 파라-아미노 살리실산, 살리실산, 살리실살리실산, 및 설파살라진 등이 있다. 적합한 페닐프로피온산 유도체의 예로는 이부프로펜, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜 및 나프록센 등이 있다.
본 발명의 약물 전달체에 바람직한 약물은 소수성 약물이다.
사용가능한 소수성 약물은 수용해도가 10 ㎎/㎖ 이하인 어떠한 약물이라도 사용될 수 있으며, 예를들어, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신등의 항암제; 테스토스테론, 에스트로젠, 에스트라다이올 등의 성호르몬; 트리암시놀론 아세토나이드, 하이드로코티손,덱사메타손, 프레드니솔론, 베타메타손 등의 스테로이드 유도체; 사이클로스포린; 또는 프로스타글란딘 등이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예로서, 마이셀의 소수성 내부에 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체를 제공한다.
소수성 내부에 포함되는 약물은 본 발명의 마이셀이 운반하는 유전자가 목적하는 치료, 경감 등의 효과를 상승시킬 수 있는 임의의 약물로서, 약물은 정전기적으로는 소수성인 것이 바람직하며, 최소한 마이셀의 구조의 안정성을 해치지 않고, 마이셀 형성시 자발적으로 내부에 위치할 수 있는 약물이면 특별히 제한되지 않는다.
소수성 약물의 함량은 본 발명의 마이셀 펩티드에 대하여 0.1～100 중량%, 바람직하게는, 1～50 중량%이다.
특히, 본 발명의 마이셀 펩타이드의 구성성분인 소수성 아미노산에 소수성 약물을 로딩하는 경우 오히려 약물 전달 효율이 향상된다. 소수성 약물의 로딩으로 인해 마이셀의 구조가 더욱 안정화되기 때문이다.
또한, 본 발명의 다른 구체예로서, 상기 약물전달체에 결합된 유전자(핵산)를 포함하는 유전자(핵산) 결합 복합체에 관한 것이다.
결합 유전자는 핵산으로 이루어진 것이 일반적이며, 유전자 치료에 사용될 수 있는 어떤 유전자 약물도 이에 적용될 수 있다. 대표적으로 DNA, RNA, RNAi 등을 포함하는 유전자 약물이 결합될 수 있다. 바람직하게는 siRNA를 포함하는 RNAi시약이다.
이러한 RNAi 시약은 표적 유전자에 대해 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명과 관련하여 표적 유전자에 대해 상보적이라는 것은 그 서열이 프리-mRNA, mRNA, cDNA를 포함한, 표적 유전자의 DNA 서열로부터 전사된 RNA에 대해 상보적인 것을 의미한다. "표적 유전자"는 세포, 조직 또는 유기체 내에서 발현되는, 즉 RNA로 전사되는 어떤 DNA 서열이라도 포함하는 것을 의미한다. 발현된 서열은 단백질로 반드시 번역될 필요는 없으며, 예를 들어, 프리-mRNA, 조절성 RNA, rRNA 등을 포함한다. 표적 유전자에 대해 상보적인 서열은 일반적으로 길이가 약 19-23 뉴클레오타이드이지만, 더 길 수도 있다.
RNAi를 위해서 사용된 RNAi 시약은 바람직하게는 이중-스트랜드화 된 것이며, 두개의 별개의 스트랜드로 구성될 수 있지만, 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 스트랜드로 구성될 수도 있다. RNAi를 매개하는 RNAi 시약의 타입에 대한 예로는 예를 들어, siRNA 또는 miRNA (마이크로RNA) 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)가 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 siRNA를 사용하였다.
유전자 발현을 저해하여 질병치료에 활용하는 것으로 siRNA가 널리 연구되고 있는데, 본 발명의 조성물에 포함되는 siRNA는 이 분야에 공지된 방법을 참조하여 유전자 내의 표적부위를 찾아 적절히 디자인할 수 있다.
siRNA 표적 부위의 선정은 예를 들어, 이하와 같은 방법을 이용할 수 있다.
(i) 전사체의 AUG 시작 암호를 시작으로, AA 디뉴클레오티드 서열에 대하여 아래로 스캔한다. 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 각 AA 및 3'에 인접한 19개 뉴클레오티드가 나타나는 것을 기록한다. 투스츨 등 (Tuschl et al.,gene Dev 13(24): 3191-7 (1999))은 5' 및 3'의 비번역 영역(untranslated regions (UTRs)) 및 시작 코돈 근처 영역(75 염기 내)에 대한 siRNA를 고안하는 것은 권고하지 않았는데, 왜냐하면 이들은 조절 단백질 결합 부위에 더 많이 존재하기 때문이다. UTR 결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체가 siRNA의 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 방해할 수 있다.
(ii) 잠재적 표적 부위들을 적합한 유전체 데이터베이스(인간, 마우스, 래트 등)와 비교하여 다른 암호화 서열과 상당한 상동성이 있는 표적 서열에 대한 고려를 배제한다. 상기 단계는 NCBI 서버의 블라스트(BLAST)를 이용하는 것을 제안한다: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
(iii) 합성을 위한 표적 서열의 대상을 선택한다. 평가하기위해 유전자의 길이에 따라 평가할 수 있는 몇 가지 표적 서열을 선택하는 것이 일반적이다.
본 발명의 유전자 결합 복합체에 포함되는 siRNA는 표적 mRNA를 표적화하는 약 17개의 뉴클레오티드 내지 약 29개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 19 내지 약25개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 이중쇄 RNA를 포함하는 분리된 siRNA 를 포함한다. siRNA는 센스 RNA가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. 본 발명의 siRNA 의 센스 및 안티센스 가닥은 두 개의 상보적이고 단일쇄인 RNA 분자를 포함하거나, 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 형성하고 단일쇄의 hairpin 영역에 의해서 공유결합된 단일 분자를 포함할 수 있다
본 발명에 포함되는 siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 많은 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 예를 들면, siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법에 의해서 생산될 수 있다.
이와 같은 본 발명에 따르는 유전자 결합 복합체는 유전자 또는 siRNA 등의 유전자 치료용 핵산 약물을 양친성 펩타이드 마이셀을 이용하여 세포독성이 없고, 안전하게 핵산을 세포내부로 전달할 수 있는 수단을 제공한다.
실시예
이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 자기-조립된 양친성 펩티드 마이셀의 제조
N-말단에서 C-말단 순으로 아르기닌 1개 내지 4개와 발린 6개가 연결되어 이루어진 4 종의 서로 다른 펩티드(R1-4V6) 각각을 사용하여 4 종의 펩티드 마이셀을 제조하였다. 마이셀 제조는 5 % 포도당 용액에 각 펩티드((주)펩트론으로부터 주문 생산하여 구입) R1V6, R2V6, R3V6, R4V6 0.5-15 ㎍과 1 ㎍의 DNA를 넣어 교반한 후 인큐베이션하여 자기-조립된 양친성 펩티드 마이셀을 형성, 제조하였다. 하기 표에서는 이 실시예에서 제조한 4 종의 서로 다른 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이를 각각 서열번호 1 내지 4로 표시하였다.
표 1
Figure PCTKR2010004310-appb-T000001
실시예 2: 펩티드 마이셀과 DNA의 복합체 형성 확인
실시예 1에서 사용한 펩티드 중 R2V6 펩티드 0.5-15 ㎍과 1 ㎍의 DNA를 5% 포도당 용액에 가하여 교반하여 마이셀-DNA 복합체를 형성시켰다. 복합체 형성의 확인을 위하여 1% 아가로스겔 상에서 겔 리타데이션 분석(gel retardation assay)을 수행하였다.
도 3에서 나타낸 결과와 같이 펩티드 대 DNA 비율이 1:10 이상에서 펩티드와 DNA의 완전한 복합체가 형성되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 3: 펩티드 마이셀을 이용한 DNA 전달 효과 및 독성 측정
본 발명의 펩티드 마이셀의 DNA 세포 내 전달 효과를 측정하기 위하여, HEK293 세포로 트랜스펙션(transfection)을 수행하고, 최적의 트랜스펙션 효율을 보이는 펩타이드/DNA 복합체의 조성비를 조사하였다. 리포터 유전자로는 루시퍼라제를 사용하여 활성을 RLU/mg 단백질로 표시하여 효율을 측정하였다. 트랜스펙션 효율을 종래 사용되고 있는 벡터와 비교하기 위하여 일반적으로 사용되는 폴리-L-리신(Poly-L-lysine: PLL)을 벡터로 사용한 경우의 트랜스펙션 효율도 측정하여 비교하였다.
도 4에서 나타나는 바와 같이 아르기닌의 잔기 수가 하나(R1V6) 또는 둘(R2V6)인 경우에도 트랜스펙션 효율이 동등하거나 비교할만한 수준이었으며, 아르기닌 수가 셋 이상인 경우에는 수 배에서 수십 배 높은 트랜스펙션 효율을 기록하였다.
또한, 세포내 독성의 정도를 확인하기 위하여 트랜스펙션 수행 후, MTT 분석(MTT assay)을 실시하여 일반적으로 사용되고 있는 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine: PEI) 25k, PLL 20k와 독성을 비교 분석하였다.
도 5에서 MTT 분석의 결과를 세포 생존율로 나타냈다. 그 결과, 본 발명에 따르는 펩티드 마이셀과 DNA의 복합체는 종래 사용되고 있는 유전자 전달체인 양이온성 고분자인 PEI, 양이온성 펩타이드인 PLL과 DNA의 복합체보다 낮은 독성을 가지는 것으로 나타났다.
실시예 4: 펩티드 마이셀의 siRNA 전달 효과 측정
전통적으로 유전자 약물로 고려되는 DNA 외에도 최근 유전자 약물로서 고려되고 있는 siRNA를 전달 약물로 사용하는 경우, 상기 실시예 1의 구성을 갖는 펩타이드 마이셀의 세포내 전달 효과와 siRNA 사일런싱(silencing) 효과를 측정하였다. 요약하면, HEK293 세포 내로 R3V6 및 R4V6 펩티드 10~30 ㎍과 루시퍼레이즈 siRNA 0.4 ㎍을 사용하여 형성시킨 마이셀을 트랜스펙션 수행하고, 최적의 트랜스펙션 효율을 나타내는 펩타이드/siRNA 복합체 비율을 조사하였다. 비교를 위하여 종래 기술로 사용되고 있는 폴리에틸렌 이민 (PEI)을 사용한 복합체의 트랜스펙션 효율도 측정하여 비교하였다.
도 6에서 나타내는 바와 같이, 데이터는 사일런싱이 전혀 일어나지 않는 대조군의 발현율을 100으로 나타내었을 때 발현율이 낮을 수록 사일런싱 효과가 높음을 의미하는데, 상기 사용된 펩티드 마이셀은 PEI 보다 높은 siRNA 전달을 나타내어, 우수한 유전자 사일런싱 효과를 가지는 결과를 나타냈다.
실시예 5: 펩타이드 마이셀과 siRNA의 복합체형성 확인.
아르기닌 세 개와 발린 여섯 개가 연결된 펩타이드 (R3V6) 와 DNA의 복합체 형성을 겔 지연 분석(gel retardation assay)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 보이는 바와 같이 펩타이드와 siRNA의 무게비가 1:20 이상에서 완전한 복합체가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 펩타이드 마이셀을 이용한 siRNA 전달 효율 측정
(1) FITC-siRNA와 RV 펩타이드의 복합체의 세포내 전달효율 확인
RV 펩타이드를 이용한 siRNA의 세포내 전달 효과를 측정하기 위하여, HEK293 cell로의 FITC-siRNA 형질전환(transfection)을 실시하고, 최적의 형질전환 효율을 보이는 펩타이드/siRNA 복합체를 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)를 이용하여 조사하였다.
이와 비교하기 위하여, 대조군으로 일반적으로 사용되어지고 있는 Polyethylenimine (PEI) 25 kDa과의 세포내 전달 효율도 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 8에서 보이는 바와 같이 FITC-siRNA/R3V6 펩타이드 복합체의 세포내 전달 효율은 FITC-siRNA/PEI 25kDa 복합체와 비슷한 양상을 보였다.
(2) FITC-antagomir와 RV 펩타이드의 복합체의 세포내 전달효율 확인
다음으로, R3V6 펩타이드의 antagomir전달 효율을 확인하였다. Antagomir는 짧은 길이의 올리고뉴클레오티드로(22base) micro RNA를 억제하는 기능을 가진다. R3V6를 이용한 antagomir의 세포내 전달 효율를 측정하기 위하여, U87 cell로 FITC-antagomir 와 R3V6복합체의 전달효율을 FACS를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 9에서 보이는 바와 같이 FITC-antagomir/R3V6 펩타이드 복합체의 세포내 전달 효율이 1:20 비율에서 90%이상으로 높게 나타나는것을 확인하였다.
(3) R3V6로 전달된 siRNA의 silencing 효율확인
최적화 된 R3V6 펩타이드를 이용한 siRNA의 세포내 전달 효과 및 전달된 siRNA에 의한 RNA 간섭현상을 측정하기 위하여, Dual luciferase 분석을 이용하였다.
HEK293 cell에 firefly luciferase와 renilla luciferase를 동시 발현하는 psiCHECK-2 벡터를 미리 형질전환한 후, firefly luciferase의 발현을 억제하는 luc-siRNA를 transfection 하였다. 전달체의 유무에 따른 효율을 측정하기 위해 전달체 없이 Luc-siRNA만을 형질전환하여 비교 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 으며(siRNA only),R3V6로 전달된 siRNA는 50%정도의 사일런싱(silencing)하는 것을 확인하였다.
(4) VEGF-siRNA와 RV 펩타이드의 복합체를 이용한 RNA 간섭현상 측정.
최적화 된 R3V6 펩타이드를 이용한 VEGF-siRNA의 세포내 전달 효과 및 전달된 siRNA에 의한 RNA 간섭현상을 측정하기 위하여, VEGF-ELISA 방법을 사용하였다.
우선, VEGF를 과발현하는 CT-26 cell에 VEGF의 발현을 억제하는 VEGF-siRNA를 R3V6 펩타이드와 함께 형질전환하였다. 그리고, 대조군으로, 일반적으로 사용되어지고 있는 Polyethylenimine (PEI) 25 kDa과 Poly-L-lysine의 형질전환 효율도 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 11에서 보이는 바와 같이 VEGF-siRNA/R3V6 펩타이드 복합체의 transfection 효율은 FITC-siRNA/PEI 25kDa 복합체와 비슷한 양상을 보였다
(5) GFP-siRNA와 RV 펩타이드의 복합체를 이용한 RNA 간섭현상 측정
이번에는 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.
최적화 된 R3V6 펩타이드를 이용한 GFP-siRNA의 세포내 전달 효과 및 전달된 siRNA에 의한 RNA 간섭현상을 측정하기 위하여, HEK293 cell에 GFP를 발현하는 DNA를 미리 형질전환한 후, GFP 발현을 억제하는 GFP-siRNA를 R3V6 펩타이드와 함께 무게 비 1:20의 비율로 형질전환하였다. 대조군으로, 일반적으로 사용되어지고 있는 Polyethylenimine (PEI) 25 kDa과 Poly-L-lysine, 그리고 Lipofectamine에 의한 GFP-siRNA 형질전환 효율 및 RNA 간섭 현상도 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 12에서 보이는 바와 같이 GFP-siRNA/R3V6 펩타이드 복합체의 transfection 효율 및 전달된 GFP-siRNA에 의한 GFP 발현 억제 효율은 PLL 복합체, lipofectamine 복합체 보다 낮았으며, GFP-siRNA/PEI 25kDa 복합체와 비슷한 양상을 보였다.
실시예 7: RV 펩타이드/siRNA 복합체의 cell viability 측정
설계된 RV 펩타이드의 세포내 독성을 측정하기 위하여, 아르기닌 한 개부터 네 개까지 연결된 RV 펩타이드를 siRNA와 복합체를 이루어 HEK293 cell에 형질전환하였다. 이후 MTT assay를 통하여 cell viability를 측정하였다. 이와 비교하기 위하여, 대조군으로, 일반적으로 사용되어지고 있는 Polyethylenimine (PEI) 25 kDa의 형질전환에 의한 cell viability도 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 13에서 알 수 있듯이 PEI 25 kDa는 높은 세포독성을 보인 반면, RV 펩타이드는 세포 독성이 거의 없는 특징을 보였다.
실시예 8: 덱사메타손이 봉입된 자가조립된 양친성 펩티드 마이셀 제조
소수성 약물로, 덱사메타손(Dxamethasone)을 사용하여, 마이셀의 소수성 코어에 봉입시켜 마이셀을 보다 안정화 시키고 핵산의 전달 효율을 높일 수 있도록 도 14와 같이 디자인하였다.
우선, 소수성 약물인 덱사메타손의 R3V6 펩티드로의 봉입 가능성을 확인하기 위하여 소수성과 친수성 dye 봉입에 따른 형광의 감소 정도를 측정하였다. DNA와 복합체를 형성시킨 R3V6 펩티드와 DNA가 포함되지 않은 R3V6 펩티드에 각각 소수성 dye와 친수성 dye를 R3V6 펩티드에 봉입시켰다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, DNA의 존재 유무에 관계없이 소수성 dye는 형광을 크게 감소시켰다. 이를 통해 덱사메타손과 같은 소수성 물질의 R3V6 펩티드로의 봉입이 가능함을 확인하였다.
그 후, 덱사메타손을, W/O 에멀젼 방법과 동결건조 방법으로 R3V6 펩티드에 봉입하였다.
실시예 9: DNA 전달 효과 측정.
R3V6-덱사메타손 펩티드를 이용한 DNA의 세포내 전달 효과를 측정하기 위하여, HEK293 cell로의 transfection을 실시하였다.
R3V6 펩티드의 양은 고정한 채 봉입하는 덱사메타손의 양을 달리하여 형질전환 효율을 조사하였고 최적의 형질전환 효율을 보이는 R3V6와 덱사메타손의 무게 비율을 결정하였다.
또한 HEK293 cell과 N2A cell에서 각각 최적의 형질전환 효율을 보이는 R3V6-덱사메타손/DNA 복합체 비율을 조사하였다. 각각의 실험에서 형질전환에 일반적으로 많이 사용되는 Poly-L-lysine (PLL)과 덱사메타손이 봉입되지 않은 R3V6 펩티드를 비교군으로 설정하였다.
그 결과를 도 16 및 도 17에 도시하였다.
본 발명의 R3V6-덱사메타손 펩티드는 기존에 많이 사용되고 있는 PLL 뿐만 아니라 덱사메타손이 봉입되지 않은 R3V6 펩티드 보다 높은 DNA 전달 효율을 가짐을 확인하였다(도 16). 그리고, HEK293 cell에서는 DNA:R3V6-덱사메타손의 비율이 1:30에서 높은 DNA 전달 효율을 가지고, N2A cell에서는 1:20에서 높은 DNA 전달 효율을 가지는 것이 확인되었다(도 17).
이처럼, 본 발명의 펩티드 마이셀은 천연 아미노산 중 아르기닌을 기반으로 한 짧은 길이의 펩타이드이기 때문에, 면역반응이 일어나지 않고, 세포독성도 없다. 또한, 마이셀 형성에 의해 양이온 밀도가 높아져 유전자 또는 siRNA와 안정된 복합체를 형성하고, 소수성 약물이 봉입되면 마이셀의 구조가 더욱 강해져 약물 및/또는 핵산 전달 효율을 높여 줄 수 있음을 알 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기의 일반식 I:
    RnXm (I)
    (식 중, R은 아르기닌, X는 서로 다른 아미노산일 수 있는 소수성 아미노산, n = 1 내지 7의 정수, m = 2 내지 20의 정수이다)
    로 표현되는 펩티드로 형성된 펩티드 마이셀.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 이소류신, 발린, 류신, 페닐알라닌, 시스테인, 메티오닌 및 알라닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 마이셀.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 발린인 것을 특징으로 하는 펩티드 마이셀.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 일반식 (I)에서, n은 2 내지 5의 정수인 것을 특징으로 하는 펩티드 마이셀.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 일반식 (I)에서, m은 5 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 펩티드 마이셀.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩티드 마이셀은 서열번호 1 내지 4로 표시되는 서열 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩티드 마이셀.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 펩티드 아르기닌 말단에 표적지향 리간드가 결합된 펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 하기 일반식 (II)로 표현되는 펩티드 마이셀:
    RnXmY (II)
    (식 중, R은 아르기닌, X는 서로 다른 아미노산일 수 있는 소수성 아미노산, n = 1 내지 7의 정수, m = 2 내지 20의 정수이며, Y는 표적지향 리간드이다)
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 펩티드 마이셀을 포함하는 약물 전달체.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 약물은 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 약물은 소수성 약물인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 소수성 약물은 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 캄토테신의 항암제; 테스토스테론, 에스트로젠, 에스트라다이올의 성호르몬; 트리암시놀론 아세토나이드, 하이드로코티손, 덱사메타손, 프레드니솔론, 베타메타손의 스테로이드 유도체; 사이클로스포린; 및 프로스타글란딘으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 소수성 약물은
    펩티드 마이셀의 소수성 아미노산에 의한 소수성 부분에 로딩되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  13. 제 8 항의 약물전달체 및 이에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 결합 복합체.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 결합 복합체.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 RNA는 iRNA인 것을 특징으로 하는 핵산 결합 복합체.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 iRNA는 siRNA인 것을 특징으로 하는 핵산 결합 복합체.
  17. 제 13 항에 있어서, 복합체 중 마이셀의 소수성 내부에 소수성 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 결합 복합체.
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