KR102039661B1 - HDL-ApoM-S1P를 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HDL-ApoM-S1P(스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HDL-ApoM-S1P의 퇴행성 뇌질환(특히, 알츠하이머병), 인지장애, 학습장애 및 기억력 장애의 예방, 개선 또는 치료용도와 HDL-ApoM-S1P의 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진 용도에 관한 것이다.
본 발명의 HDL-ApoM-S1P는 퇴행성 뇌질환(특히, 알츠하이머병) 개체에 대하여 신경염증의 완화뿐만 아니라 현저한 인지장애, 학습 장애 및 기억장애의 개선효과를 나타내며, 아밀로이드 베타 및 타우(tau) 침착이 상당히 감소되는 효과를 나타낸다. 또한 체내 HDL-ApoM-S1P의 증가는 정상개체에 대해서도 우수한 인지, 학습 및 기억능력 증진 효능을 나타낸다.

Description

HDL-ApoM-S1P를 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of neurodegenerative diseases comprising HDL-ApoM-S1P as an active agent}
본 발명은 HDL-ApoM-S1P(스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HDL-ApoM-S1P의 퇴행성 뇌질환(특히 알츠하이머병), 인지장애, 학습장애 및 기억력 장애의 예방, 개선 또는 치료용도와 HDL-ApoM-S1P의 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진 용도에 관한 것이다.
생리활성 스핑고리피드 대사산물인 스핑고신-1-인산(S1P)은 많은 중요한 세포 과정(cell processes)들에 관여되어있다. S1P는 스핑고신 키나아제(sphingosine kinases, SphKs)에 의한 스핑고신의 인산화 과정을 통해 생성되고, Spns2( spinster homolog 2)와 같은 운반체를 통해 세포 밖으로 내보내진다. 선천면역과 적응 면역에 있어서, S1P의 작용은 5개의 G 단백질 결합 수용체인 S1P receptors (S1PRs) 15에 결합함으로써 매개된다. S1P의 차등적인 S1P 농도 구배(differential S1P concentration gradient)는 림프계 기관(lymphoid organs)으로부터 림프구의 탈출을 촉진한다(Masayo Aoki et al., Sphingosine-1-Phosphate Signaling in Immune Cells and Inflammation: Roles and Therapeutic Potential, Mediators of Inflammation Volume 2016 (2016), 11 pages). 게다가 S1P의 세포내 작용은, 전사인자 NF-κB의 활성화에 의하여 염증에 중요한 역할을 하며, 또한 S1P는 염증성 사이토카인인 TNF-α의 효과를 모방한다는 보고가 있다(Wei-Ching Huang et al., Emerging Role of Sphingosine-1-phosphate in Inflammation, Cancer, and Lymphangiogenesis, Biomolecules. 2013 Sep; 3(3): 408-434.). Dania Yaghobian et al,.에 의하면 당뇨병성 신증의 관상 손상에 있어서 증가된 S1P가 염증 및 섬유화를 매개하는 것으로 알려졌다(Dania Yaghobian et al,. Increased sphingosine 1-phosphate mediates inflammation and fibrosis in tubular injury in diabetic nephropathy, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2016) 43, 56-66). 뿐만아니라 S1P-lyase 결핍 하에서 sphingosine-kinase2에 의해 생성된 S1P 축적이 일어날 때 신경의 죽음을 유도하는 것으로 알려지기도 하였다(Sphingosine-1-phosphate links glycosphingolipid metabolism to neurodegeneration via a calpain-mediated mechanism, Cell Death and Differentiation (2011) 18, 1356-1365).
그러나 이러한 S1P는 원래 세포의 증식, 분화, 세포 생존 활성이 있는 것으로 알려졌다. 이처럼 구체적인 질병 환경(기전)에 따라 S1P의 활성이 다양하게 보고되고 있으며, 생체 내에서 함께 작용하는 결합파트너에 따라서도 그 체내 작용방식 또는 효과가 달라지는 것으로 보고되고 있어 S1P에 대한 많은 연구가 필요한 실정이다.
고밀도지단백질은(high density lipoprotein, HDL)은 체내의 주요 콜레스테롤 운반체로서 알려져 있다. HDL은 혈장 지질단백의 주요 분획 중의 한가지로 초원심법(超遠心法)에서 비중 1.063~1.210의 지질단백을 의미한다. HDL은 콜레스테롤, 인지질 및 아포단백질 등으로 이루어지는 것으로 알려져 있으며, 상기 아포단백 중 ApoAI, ApoAII가 주요 단백질이고 ApoC군, ApoE군, 및 ApoM 등을 포함하는 것으로 알려져있다.
한편, 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease, AD) 환자의 뇌에서 상향조절되는 많은 독성 염증단백질들에 근거하여 AD 병리학에 있어서 염증이 기여한다는 것이 알려졌다. Douglas Walker와 Lih-Fen Lue는 염증 억제가 알츠하이머병의 치료에 있어서 유효한 치료 표적인지 여부를 조사하였는데, 정신적 퇴보(mental deterioration)의 진행을 늦추는 것에 대하여 기존에 항염증 효능을 지니는 것으로 알려진 시험약제들의 영향을 평가한 임상시험에서 상기 약제들은 명백히 효과가 없었던 것으로 나타났다(Douglas Walker and Lih-Fen Lue, Anti-inflammatory and Immune Therapy for Alzheimer's Disease: Current Status and Future Directions, Curr Neuropharmacol. 2007 Dec; 5(4): 232-243.). 구체적으로 “Prospective double-blind placebo-controlled trials”는 약제가 특정질병에 효과적인지 여부를 결정하는 표준방법(standard)인데, 상기 방법을 이용하여 AD환자를 대상으로 항염증제를 처리하는 시도가 많이 수행되었다. 경증 내지 중등도의 AD 환자군에서 NSAID(nonsteroidal anti-inflammatory drug)인 다이클로페낙(diclofenac)의 복용(상기 다이클로페낙은 위장관 보호를 위해 미소프로스톨(misoprostol)과 병용됨)을 시범 시행 한 결과, 25주 후에 상기 약물 복용한 환자와 위약 환자군 사이에 인지 기능 감퇴 지수는 유의한 차이가 없었다. NSAID인 니메술리드(nimesulide)를 사용한 24 주간의 소규모 연구에서도 인지 변화의 속도에서 유의 한 차이가 없음을 보여 주었다. 또한 로페콕시브(rofecoxib) 또는 나프록센(naproxen)을 대상으로 한 1년간의 대규모 시험에서, 위약 환자군과 대비하였을 때 인지 쇠퇴를 지연 시키는데 효과적이지 못했다. 경증 내지 중등도의 AD 환자를 대상으로 rofecoxib을 1년동안 사용한 실험에서도, 상기 약물이 효과가 없음이 확인되었다. 그리고 항염증제인 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)도 18개월 동안 수행된 실험에서 기억 기능의 저하를 막는데 있어서 보호효과를 보이지 않았다. 뿐만아니라 강력한 스테로이드 항염증제인 프레드니손(prednisone)을 1년동안 저용량(low-dose)으로 사용한 실험에서 또한 상기 약물의 처리군과 위약군(placebo group) 간에 인지적 감소의 차이가 없음을 보여주었다.
상기 임상 실험결과들은 알츠하이머병에서 단순히 신경염증 현상을 억제한다고 해서 유의미하게 기억력 손상 억제 또는 회복 효과를 나타내는 것은 아님을 보여준다. 즉, 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌(신경)질환의 발생을 억제(예방) 하는 것과 치료하는 것에는 기전적으로 상당한 차이가 있는 것으로 사료된다. 상기한 바와 같이 기존에 신경염증을 억제하는 것을 통하여 퇴행성 뇌(신경)질환의 치료에 응용하고자하는 시도가 있었지만, 이러한 신경염증 억제 물질들이 실질적인 상기 질환의 치료 효과를 나타내는 것은 아니기 때문에, 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 뇌(신경)질환 대한 치료를 위해서는 다른 치료적 전략이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 효과적인 퇴행성 뇌(신경)질환의 치료를 위한 새로운 전략을 연구하던 중, HDL(high density lipoprotein)의 ApoM 영역에 S1P 로딩(loaidng)을 통하여 알츠하이머 동물모델에서 현저한 인지, 학습 및 기억 능력 개선 효과를 확인하였고, 또한 체내 HDL-ApoM-S1P의 증가는 정상개체에 대해서도 인지, 학습 및 기억능력 증진 효능을 나타낼 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이를 포함하는 약학적 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물과 이를 포함하는 약학적 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진용 약학적 조성물과 이를 포함하는 약학적 제제를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 이를 포함하는 약학적 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물과 이를 포함하는 약학적 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진용 약학적 조성물과 이를 포함하는 약학적 제제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어‘스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질’은‘HDL-ApoM-S1P’로 표시될 수 있으며, 본 발명에서 제공하는 HDL(즉, HDL-ApoM-S1P)은 ApoM에 S1P가 담지 되는 것을 특징으로 하며, 체내로 투여된 HDL-ApoM-S1P은 ApoM 과 특이적인 관련성을 가지고 동물의 생체 내에서 퇴행성뇌질환(특히, 알츠하이머병), 인지, 기억 또는 학습능력 등에 대하여 특유의 개선 및 치료 효능을 나타내는 것을 특징으로 한다. HDL과 S1P가 혼합될 때, S1P가 물리적으로 결합하는 주요 혈장 아포지단백질은 대다수가 HDL에 함유되어있는 아포지단백질 M(ApoM)인 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어‘담지(loading)’은 함유(포함), 연결, 결합 또는 컨쥬게이트(conjugate)되는 것을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서 퇴행성 뇌질환은 바람직하게 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병, 피크(Pick)병 및 크로이펠츠-야콥(Creutzfeld-Jacob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 알츠하이머병은 퇴행성 뇌질환으로서, 노인에게 주로 나타나는 치매를 일으키는 대표적인 질환이다. 이 질환은 β-아밀로이드 펩티드(Aβ)의 축적과 과인산화된 타우(tau)단백질로 대부분 구성되어 짝지어진 나선형 필라멘트(paired helical filament, PHF)의 형성을 특징으로 한다. 뇌 전체에 걸쳐 세포외 베타아밀로이드 침착과 세포내 과인산화 타우단백질에 의해 신경세포가 사멸하는 것으로 알려져 있으며 이는 점진적인 기억력 장애, 인지력 결손, 개인 성격의 변화 등을 초래하는 질병이다. 본 발명의 알츠하이머 병은 알츠하이머성 치매를 포함하는 의미이다.
본 발명에서 용어 인지장애는 지식을 획득하고 사용하는 방식에 관한 인지능력에 이상이 발생한 것으로, 인지능력에는 지식, 이해력, 사고력, 문제해결력, 비판력 및 창의력과 같은 정신능력이 포함된다.
또한, 학습장애는 듣기, 말하기, 주의 집중, 지각(知覺), 기억, 문제 해결 등의 학습 기능이나 읽기, 쓰기, 수학 등 학업 성취 영역에서 현저하게 어려움을 나타내는 장애를 말한다.
또한 기억장애 새롭게 알게 된 사실을 기억하지 못하거나, 사물이나 사람의 이름을 기억할 수 없거나, 과거의 경험을 생각해내는 일이 어렵거나 불가능한 상태를 말한다.
이러한, 인지장애, 기억(력)장애, 또는 학습장애는 다양한 원인 및 환경에 의할 수 있으며, 본 발명에서 그 원인이 특별히 제한되지 않는다. 일례로 노화, 알쯔하이머병, 치매, 경도인지장애, 인지 결핍 및 주의력 결핍에 의한 것일 수 있다.
본 발명자들은 알츠하이머병 개체(동물)에 HDL(high density lipoprotein)의 ApoM 영역에 S1P 로딩(loaidng)을 수행하였을 때, 다시말해서 S1P가 ApoM에 담지된 HDL(HDL-ApoM-S1P)를 투여하였을 때 신경염증의 완화 뿐만아니라 현저한 인지장애, 학습 장애 및 기억장애의 개선효과가 나타나며 아밀로이드 베타 및 타우(tau) 침착이 상당히 감소한 것을 확인하였다. 이러한 본 발명의 HDL-ApoM-S1P의 효과는 ApoM에 특별한 관련성을 가지고 ApoM 의존적으로 발휘됨을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 체내 HDL-ApoM-S1P의 증가를 통하여 정상개체에 대해서도 인지, 학습 및 기억능력 증진 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다. HDL-ApoM-S1P의 퇴행성 뇌질환(특히 알츠하이머병), 인지, 학습 및 기억력에 대한 신규한 용도는 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.
따라서 본 발명은 스핑고신 -1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환(특히, 알츠하이머병), 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방, 개선 또는/및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 스핑고신 -1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서‘스핑고신-1-인산(Sphingosine-1-Phosphate, S1P)’은 하기 <화학식 1>로 표시되는 화합물로, 혈장 내 S1P는 주로 혈소판(platelet), 적혈구(erythrocyte) 및 내피세포(endothelial cell)에 의하여 생성 및 공급되는 것으로 알려졌으며, 비만세포(mast cell) 및 대식세포(macrophage)들도 S1P를 생산할 수 있는 것으로 알려졌다. 상기 스핑고신-1-인산은 당업계에 공지된 방법에 따라 동물로부터 분리(채취)된 혈액 및 조직 시료로부터 추출하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법으로 제조한 것을 사용할 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112017073137014-pat00001
본 발명에서‘고밀도지단백질은(high density lipoprotein, HDL)’은 혈장 지질단백의 주요 분획 중의 한가지로 초원심법(超遠心法)에서 비중 1.063~1.210의 지질단백을 의미한다. 고밀도지단백은 분자량 약 2 X 105 성분 중 콜레스테롤 약 17%, 인지질(燐脂質) 약 22%이다. 단백부분은 약 50%를 차지하며 주요 아포단백은 ApoA이다. 즉, ApoAI, ApoAII가 주요 단백질이고 ApoC군, ApoE군, 및 ApoM 등을 포함한다. 본 발명의 HDL은 당업계에 공지된 방법에 따라 자연계(native)에 존재하는 것을 분리하여 사용할 수 있으며 예를 들어 동물로부터 분리(채취)된 혈액 시료로부터 원심분리 등의 방법을 통해 추출(또는 정제)하여 사용할 수 있다. 또한 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 합성 HDL(reconstituted HDL) 제조 방법 또는 HDL-유사 나노구조(HDL-like nanostructure) 제조 방법으로 제조한 것을 사용할 수 있으며, 일례로 BRICARELLO et al., ACS NANO 5(1),42-57 (2010)의 문헌을 참조로 할수 있으며, 또는 대한민국 등록특허 10-1132626, 대한민국 등록특허 10-0588241 등에서 제시하는 고밀도지단백 나노입자의 제조방법을 참조로 할 수 있다. 본 발명에서 HDL은 ApoM을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로하며, ApoM을 포함하는한 자연적 HDL(native HDL) 또는 HDL-유사 나노구조물(HDL-like nanostructure) 등을 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 자연적 HDL(native HDL)은 자연 상태 즉, 동물의 생체 내에서 일반적으로 발견되는 HDL을 의미하는 것으로, 전술한 바와 같이 혈장지질단백의 주요 분획 중 비중 1.063~1.210의 지질단백을 의미한다.
본 발명에서 용어‘HDL-유사 나노구조물(HDL-like nanostructure)’또는‘HDL 나노입자(nanoparticle)’은 자연적 HDL(native HDL)와 크기, 조성 및 특성(예를 들어 체내 지질 운반 성질, 비중(밀도) 등) 등이 유사한 재구성 및 합성된 나노구조(reconstituted and synthetic nanostructure)를 의미한다. 재구성된 HDL-유사 나노구조물들(Reconstituted HDL-like nanostructures)은 일반적으로 직경이 5-15 nm이다. 상기 HDL-유사 나노구조물은 직경 5-15 nm, 더욱 바람직하게 직경 5-8 nm의 나노디스크(nanodisc) 형태일 수 있다. 또한 본 발명의 상기 HDL-유사 나노구조물은 직경 5-15 nm, 더욱 바람직하게 직경 10-15 nm의 나노구체(nanosphere) 형태 일 수 있다.
상기 HDL-유사 나노구조물은 인지질과 아포리포단백질들을 첨가하고 적절한 반응조건하(예를 들어 적절한 계면활성제(detergent) 및 용매 사용하)에서 혼합 또는/ 및 배양(incubation)함으로서 재구성 될 수 있으며, 다음의 문헌을 참조로 할 수 있다: BRICARELLO et al., ACS NANO 5(1), 42-57 (2010); 대한민국 등록특허 10-1132626; 대한민국 등록특허 10-0588241. 또한 상기 HDL-유사 나노 구조물은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 재구성된 HDL-유사 나노 구조물의 인지질 성분은, 한 종류의 인지질만을 사용하거나 둘 이상의 상이한 종류의 혼합물을 사용하는 것일 수있다. 구체적으로 상기 인지질의 종류로는, 당업계에 HDL 제작에 사용되는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 난황 포스파티딜콜린, 콩 포스파티딜콜린, 에테르 인지질, 작은 알킬 사슬 인지질, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디올레포스파티딜에탄올아민, 디라우일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린 스핑고리피드, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딕산, 디팔미토일포스파티딕산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린 및 디라우릴포스파티딜콜린로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 재구성된 HDL-유사 나노 구조물의 아포리포단백질은 본 발명에있어서 ApoM이 반드시 사용되는 것을 특징으로 하며, 추가적으로 공지의 HDL 아포리포단백질 성분을 포함할 수 있으며, 일례로 ApoA-Ⅰ, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-Ⅰ, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoE 및 ApoM에서 선택되는 하나 이상의 것을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 아포리포단백질은 당업계에 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으며, 일례로 인간의 아포리포단백질로서 ApoM은 NCBI Reference Sequenc: NP_061974.2, NP_001243098.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있고, ApoA-Ⅰ은 NCBI Reference Sequence(accession no): NP_001304947.1, NP_001304950.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있고, ApoA-Ⅱ은 NCBI Reference Sequence(accession no): NP_001634.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있으며, ApoA-Ⅳ는 NCBI Reference Sequence(accession no): P06727.3 등으로 공지된 것을 사용할 수 있고, ApoC-Ⅰ는 NCBI Reference Sequence(accession no): NP_001307995.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있고, ApoC-Ⅱ는 NCBI Reference Sequence(accession no): P02655.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있고, ApoC-Ⅲ는 NCBI Reference Sequence(accession no): P02656.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있으며, ApoE는 NCBI Reference Sequence(accession no): P02649.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의‘HDL-ApoM-S1P’의 수득방법 또는 고밀도지단백질에 스핑고신-1-인산을 담지하는 방법은 당업계에 공지되어있으며, 본 발명의‘HDL-ApoM-S1P’을 수득가능한한 그 제조방법이 특별히 제한되지 않는다. HDL과 S1P가 혼합될 때, S1P가 물리적으로 결합하는 주요 혈장 아포지단백질은 대다수가 HDL에 함유되어있는 아포지단백질 M(ApoM)인 것으로 알려져 있다.
일례로 ApoM을 함유하는 자연적 HDL 또는 재구성된 HDL-유사 나노 구조물은 직접적으로(특히, ApoM-S1P 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서) S1P와 직접적으로 함께 혼합 및 배양될 수 있다.
일례로 ApoM을 함유하는 자연적 HDL 또는 재구성된 HDL-유사 나노 구조물은 동물의 체내에서 S1P의 공급원으로 알려진 세포들(한종류 또는 두 종류 이상의 세포 혼합물)과 공배양될 수 있다. 상기 S1P의을 생성할 수 있는 것으로 알려진 세포들은 적혈구(erythrocyte), 혈소판(platelet), 내피세포(endothelial cell), 비만세포(mast cell) 또는 대식세포(macrophage) 등을 포함한다. 상기 공배양시 각각의 세포 종류에 따라서 S1P의 방출이 증가(활성화)되는 배양환경을 조성해 줄 수 있으며, 이러한 배양조건은 당업계에 알려진 방법이라면 그 구체적 방법이 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로 일례로서, 자연적 HDL(native HDL)이 적혈구와 함께 배양(incubation)될 때 적혈구로부터 S1P가 방출되는 것으로 알려져 있으며(Constantin Bode et al., Erythrocytes Serve as a Reservoir for Cellular and Extracellular Sphingosine 1-Phosphate, Journal of Cellular Biochemistry 109:1232-1243 (2010)), 이렇게 적혈구로부터 방출된 S1P는 자연적 HDL에 담지되고 이때 상기 HDL의 ApoM이 주요 결합부위인 것으로 알려져 있다. 또한 상기 Constantin Bode et al.(2010)의 문헌으로부터 자연적 HDL 중 적혈구로부터 S1P의 방출을 유도하는 구체적인 아포리포프로테인은 ApoC-I 및 ApoCII인 것으로 알려져 있기 때문에, ApoC-I 및 ApoCII 단백질을 포함하여 제작된 재구성된 HDL-유사 나노 구조물의 경우에도 적혈구와 공배양될 시에 적혈구로부터 S1P 방출을 유도할 수 있고 이를 상기 구조물에 담지할 수 있다. HDL과 적혈구와의 공배양 시에 적혈구로부터 S1P의 방출을 증가시키는 방법으로는, 일례로 HDL과의 공배양 전에 적혈구에 스핑고신(sphingosine)을 전처리(pre-incubation)하는 방법이 사용될 수 있다.
또 다른 일례로서, 혈소판에 축적된 S1P는 Ca2+ 의 처리에 의하여 혈소판으로부터 S1P의 방출이 촉진되는 것으로 알려져 있기 때문에(Nobuyoshi Kobayashi, Sphingosine 1-phosphate is released from the cytosol of rat platelets in a carrier-mediated manner, The Journal of Lipid Research, 47, 614-621.), 혈소판과 HDL(자연적 HDL 또는 재구성된 HDL-유사 나노 구조물)의 공배양시 Ca2+ 등을 함께 처리할 수 있다.
가장 바람직하게 본 발명에서 HDL-ApoM-S1P을 제작하는 방법은 ApoM을 포함하는 HDL을 적혈구와 공배양하는 방법일 수 있으며, 상기 공배양시 적혈구로부터 S1P 방출 효율을 높이기 위해 스핑고신을 적혈구에 전처리하는 과정이 포함되는 것이 더욱 바람직할 수 있다.
본 발명의 상기 HDL-ApoM-S1P는 가장 바람직하게 다음과 같은 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 제조방법으로 제작되어, 퇴행성뇌질환(특히, 알츠하이머), 인지장애, 학습장애 또는 기억(력) 장애의 치료를 필요로 하는 개체에 제공되는 것일 수 있다:
(a) 개체로부터 채취된 혈액을 혈장 및 혈구 분획으로 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 혈구 분획에 스핑고신(Sphingosin)을 처리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 혈구 분획과 상기 (a) 단계의 혈장 분획을 혼합하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 혼합물 중 혈장 분획을 분리하는 단계.
(a) 단계에서는 개체로부터 분리된 혈액 시료를 혈장 분획 및 혈구 분획으로 분리한다.
상기 (a) 단계의 혈장 분획에는 HDL-ApoM(ApoM이 함유된 HDL)이 포함되며, 상기 혈구 분획에는 적혈구가 포함되는 것을 특징으로 한다. 혈장 분획에 HDL-ApoM이 포함되고 혈구 분획에 적혈구가 포함되는 한 각 분획에서 나머지 혈액 성분의 차이는 당업자가 의도하는 바에 따라 사전에 제거되거나 또는 추가의 성분을 포함할 수 있다.
혈액시료를 혈장과 혈구로 분획하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일례로 원심분리에 의한 방법일 수 있다.
(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 수득된 혈구 분획에 스핑고신(Sphingosin)을 처리하여 배양한다.
상기 혈구분획에 포함된 적혈구는 sphingosine kinases(Sphk1 및 Sphk2)를 포함하고 있으며, 혈구분획에 처리된 스핑고신은 상기 sphingosine kinases에 의해 인산화 됨에 따라 S1P가 다량 생산 및 방출(적혈구로부터)된다. 상기 배양 시의 스핑고신 처리 농도, 배양 온도, 시간 등은 당업자가 의도하는 S1P 방출량 및 방출 속도에 따라 적절히 변화시킬 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
(c) 단계에서는 상기 (b) 단계의 혈구 분획과 상기 (a) 단계의 혈장 분획을 혼합하여 반응(배양)한다.
(b) 단계를 마친 혈구 분획은 다량의 S1P를 보유하고 있으며, 상기 혼합에 의하여 혈장 속에 있던 HDL은 상기 S1P를 담지하게 되고 특히 HDL상의 주요 결합 파트너인 ApoM에 S1P가 다량 결합하게 된다. 상기 반응(배양)의 온도 및 시간 등의 조건은 당업자가 의도하는 HDL-ApoM-S1P 제작 생산성(효율) 정도에 따라 적절히 변화시킬 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
(d) 단계에서는 상기 (c) 단계에서의 반응 혼합물 중, 다시 혈장 분획을 분리한다.
상기 (d) 단계에서 혈장을 분획(분리)하는 방법은 상기 (a) 단계에서 전술한 바와 같다. 본 (d) 단계에서 제작된 혈장 분획에는 HDL-ApoM-S1P이 풍부하게 된다.
상기 (d) 단계에서 제작된 혈장 분획은 상기 (a) 단계에서 혈액시료를 분리한 동일 개체에 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 HDL-ApoM-S1P를 상기와 같은 방법으로 제작하여 상기 (d) 단계의 혈장 분획 상태로 개체에 제공되는 경우, 상기 (d) 단계에서 제공되는 혈장분획이 개체의 원래 혈액성분과 이질적이지 않기 때문에 다른 부작용(예를 들어 비동일 개체간의 면역반응 또는 혈액응집 반응 등)의 발생이 실질적으로 없거나 현저히 감소되는 장점을 가진다.
또한 상기 HDL-ApoM-S1P 제조 방법은, (e) 상기 (d) 단계의 혈장 분획으로부터 HDL-ApoM-S1P을 정제(또는 농축)하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 정제를 통하여 유효성분인 HDL-ApoM-S1P 를 높은 농도로 제공할 수 있다.
상기 정제는 당업계에 공지된 혈액 성분 분리 또는 정제 방법이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 원심분리 또는 크로마토그래피(예를 들어 Liquide chromatography 등) 방법일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 본 발명의 유효성분 이외에 공지의 퇴행성 뇌질환(특히 알츠하이머 병) 또는 치매 치료 효과가 있는 것으로 당업계에 알려진 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 그 예로는 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine), 메만틴 (menantine)등의 물질을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 HDL-ApoM-S1P를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로 부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 혈관내(정맥내 또는 동맥내) 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽 제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 퇴행성뇌질환(특히 알츠하이머병), 인지장애, 학습장애 또는 기억(력) 장애의 개선, 치료 또는 예방에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 HDL-ApoM-S1P의 유효한 양으로는 0.001 내지 1000mg/day/kg 체중일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/day/kg 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 해당 분야의 통상적인 지식을 가진 기술자가 퇴행성 뇌질환(특히 알츠하이머병), 인지장애, 학습장애 또는 기억(력) 장애의 예방 또는 치료의 효과를 내기 위하여 개체의 질환 중증도, 투여가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 식이 및 배설율 등의 다양한 요인을 적절하게 고려하여 본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량(유효량), 투여 횟수, 투여 경로를 결정할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는 퇴행성 뇌질환, 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학적 제제를 제공한다 . 또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진용 약학적 제제를 제공한다.
본 발명의 약학적 제제는 전술한 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 약학적 제제는 본 발명에 의한 효과를 보이는한 그 제형이 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명의 상기 약학적 제제는 투여 방법과 투여 경로에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 약학적 제제의 투여경로, 투여방법, 구체적인 제형화 방법과 제형에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 상기 약학적 조성물에서 전술한 바와 같으며, 다음의 문헌을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 바람직하게 본 발명의 제제는 주사제일 수 있다. 본 발명의 주사제는 바람직하게 혈관내(정맥내 또는 동맥내) 투여될 수 있다. 주사제로 제형화하는 경우의 적합한 담체로는 당분야에 공지된 약학적으로 허용되는 등장제, 가용화제, 무통화제, 안정제, 완충물질 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 적합한 안정제로는 나트륨 비설파이트, 나트륨 설파이트 및 아스코르브산 등이 있으며, 보존제로는 염화벤즈알코늄, 메틸 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 제제의 바람직한 투여량은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다. 약학적 유효성분의 생물학적 이용가능성(bioavailability)은 개인차가 있기 때문에 본 발명의 약학적 제제 투여 초기에는 당업계에 알려져 있는 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 등에 기반한 어세이로 각 약물의 혈중 농도를 확인하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명의 상기 약학적 제제의 치료 또는 예방 적응증의 구체적인 예는 전술한 본 발명의 약학적 조성물의 치료 또는 예방 적응증의 구체적인 예와 같다.
본 발명의 HDL-ApoM-S1P는 퇴행성뇌질환(특히, 알츠하이머병) 개체에 대하여 신경염증의 완화 뿐만아니라 현저한 인지장애, 학습 장애 및 기억장애의 개선효과를 나타내며, 아밀로이드 베타 및 타우(tau) 침착이 상당히 감소되는 효과를 나타낸다. 또한 체내 HDL-ApoM-S1P의 증가는 정상개체에 대해서도 우수한 인지, 학습 및 기억능력 증진 효능을 나타낸다.
도 1은 HDL-ApoM-S1P loading 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 알츠하이머 질환 동물모델(APP/PS1 마우스)에서‘HDL-ApoM-S1P loading’에 의한 치료 효과를 확인하기 위한 실험 스캐줄을 나타낸다.
도 3은 WT(Wild Type, 정상 대조군 마우스), APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스의 혈장에서 S1P, HDL-S1P, ApoM 및 HDL-ApoM 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 티오플라빈 S, Aβ42 및 Aβ40 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스에서의 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 4a)와 정량결과(도 4b)를 나타낸다.
도 5는 AT8 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스에서의 Tau 침착을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 5a)와 정량결과(도 5b)를 나타낸다.
도 6은 Iba1 염색을 이용하여 WT(정상 대조군 마우스), APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스에서의 미세아교세포 활성을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 6a)와 정량결과(도 6b)를 나타낸다.
도 7은 GFAP 염색을 이용하여 WT(정상 대조군 마우스), APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스에서의 성상아교세포 활성을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 7a)와 정량결과(도 7b)를 나타낸다.
도 8은 WT(정상 대조군 마우스), APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스에 대하여 MWM(Morris water maze) 테스트를 수행한 결과를 나타내는 것으로서, 10일동안의 학습 및 기억력 평가 결과(도 8a)와 MWM 테스트 11일째에 표적 플랫폼에서 머무른 시간(도 8b)을 나타낸다.
도 9는 WT(정상 대조군 마우스), APP/PS1 마우스(알츠하이머 질환 동물모델), HDL-ApoM-S1P loading을 실시한 APP/PS1 마우스, S1P를 주입한 APP/PS1 마우스 및 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스에 대하여 fear conditioning을 수행하였을 때 contextual 및 tone task의 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 알츠하이머 질환 동물모델(APP/PS1)에서 낮아진 HDL-ApoM-S1P를 유전적 방법으로 높여주기 위해 APP/PS1 마우스와 ApoM tg 마우스(HDL-ApoM-S1P 과발현 마우스)를 교배시켜 APP/PS1/ApoM tg 마우스를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 11은 WT(Wild Type, 정상 대조군 마우스), ApoM tg(ApoM 과발현 정상 마우스), APP/PS1(알츠하이머 질환 동물모델) 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스(ApoM 과발현 알츠하이머 질환 동물 모델)의 혈장에서 S1P, HDL-S1P, ApoM 및 HDL-ApoM 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 티오플라빈 S, Aβ 42 및 Aβ 40 염색을 이용하여, APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스에서의 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 12a)와 정량결과(도 12b)를 나타낸다.

도 13은 AT8 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스에서의 Tau 침착을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 13a)와 정량결과(도 13b)를 나타낸다.
도 14는 Iba1 염색을 이용하여 WT(Wild Type, 정상 대조군 마우스), ApoM tg(ApoM 과발현 정상 마우스), APP/PS1(알츠하이머 질환 동물모델) 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스에서의 미세아교세포 활성을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 14a)와 정량결과(도 14b)를 나타낸다.
도 15는 GFAP 염색을 이용하여 WT(Wild Type, 정상 대조군 마우스), ApoM tg(ApoM 과발현 정상 마우스), APP/PS1(알츠하이머 질환 동물모델) 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스에서의 성상아교세포 활성을 확인한 결과로서, 이의 현미경 이미지(도 15a)와 정량결과(도 15b)를 나타낸다.
도 16은 WT(Wild Type, 정상 대조군 마우스), ApoM tg(ApoM 과발현 정상 마우스), APP/PS1(알츠하이머 질환 동물모델) 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스에 대하여 MWM(Morris water maze) 테스트를 수행한 결과를 나타내는 것으로서, 10일동안의 학습 및 기억력 평가 결과(도 16a)와 MWM 테스트 11일째에 표적 플랫폼에서 머무른 시간(도 16b)을 나타낸다.
도 17은 WT(Wild Type, 정상 대조군 마우스), ApoM tg(ApoM 과발현 정상 마우스), APP/PS1(알츠하이머 질환 동물모델) 및 APP/PS1/ApoM tg 마우스에 대하여 fear conditioning을 수행하였을 때 contextual 및 tone task의 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1) 알츠하이머 질환 모델 마우스
알츠하이머 질환 모델 마우스는 hAPP695swe(APPswe) 및 presenilin-1M146V (PS1) 돌연변이를 과발현시킨 형질전환 마우스를 사용하였다. 이는 C57BL/6 background(Charles River, UK)에 대한 표준기술로 GlaxoSmithKline(Harlow, UK)에서 생산된 마우스 라인으로서, APPswe 마우스를 순종 C57BL/6 background와 역교배하고 PS1 마우스와 교배하여 이중 이형접합체 돌연변이 마우스(APP/PS1 tg mice)를 생산하였다.
또한 같은 방법으로 상기 APP/PS1 tg mice를 ApoM tg mice와 교배하여, APP/PS1 tg mice가 ApoM을 과발현하도록 형질전환된 삼중 돌연변이 마우스(APP/PS1/ApoM tg mice)를 제작하였으며, 이의 제작과정을 도 10에서 보여준다.
2) HDL-ApoM-S1P loading protocol 및 시험물질 처리 방법
마우스에서 채혈 후, 수득한 혈액을 원심분리를 통하여 적혈구와 혈장으로 분리하였다. 분리되어진 적혈구를 10uM sphingosine과 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 분리되어있던 혈장과 다시 혼합하여 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝난 뒤 원심분리를 통해 적혈구와 혈장을 분리한 뒤 혈장만 다시 모았으며, 이렇게 수득된 혈장에는 HDL에 S1P가 로딩(HDL-ApoM-S1P loading)되어있으며, 이러한 과정을 도 1에서 도시한다.
이렇게 수득된 혈장용액을 도 2에 도시된 실험 개요에 따라서 일주일에 2번씩 4주 동안(총 8번) 마우스에 25μl 씩 정맥주사 되었다. 대조군으로 3μM S1P(Avanti)와 50mM ApoM(Mybiosource, 서열번호 1)을 각각 일주일에 2번씩 4주 동안(총 8번) 마우스에 25μl씩 정맥주사 되었다.
3) 혈액채취 및 혈장분리 프로토콜
동물 모델 마우스(APP/PS1 tg mice 또는 APP/PS1/ApoM tg mice)와 정상 대조군 마우스(WT)에서 혈액을 채취하기 위하여 먼저 상기 마우스들을 마취한 후, 심장 채혈로 500μl 내지 700μl의 혈액을 헤파린 튜브(BD Falcon)에 모았다. 그 다음 각각의 혈액샘플을 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액의 혈장을 분리였다. 이 혈장샘플은 분석에 사용되기 전 -80℃에서 보관하였다.
4) 혈장에서의 HDL(High density lipoprotein) 분획 프로토콜
60μl의 혈장샘플을 초고속원심분리용 튜브에 넣어준 후 동일양의 PBS (Gibco) 용액을 혈장 위에 층이 형성되도록 첨가하고, 초고속 원심분리기(HITACHI cp100wx Centrifuge P70AT rotor)를 이용하여 4℃에서 70,000rpm 3시간 동안 원심분리하였다. 두 층으로 분리된 샘플 중 아래층 60μl를 새로운 초고속원심 분리용 튜브에 옮기고 동일한 양의 NaBr (Sigma-Aldrich) 용액(density = 1.12g/ml)을 첨가 후 피펫을 이용하여 5회 정도 섞어주고 다시 초고속 원심분리기를 이용하여 4℃에서 70,000rpm 18시간 동안 원심분리하였다. 두 층으로 분리된 샘플의 아래층 HDL 60μl를 새로운 튜브에 옮겨주고, 분석에 사용되기 전의 샘플은 -80℃에서 보관하였다.
5) S1P(Sphingosine-1-phosphate) 측정
S1P의 추출 및 정량화는 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 상기 마우스 혈장 또는 이로부터 분획된 HDL에 각각 150μl 디클로로메테인;메탄올, 100μl 디클로로메테인과 10% NaHCl을 첨가 후, 섞어주고 1분 동안 원리분리하였다. 두 층으로 분리된 샘플의 아래층 lipid 100μl를 새로운 튜브에 옮겨주고, speed vacuum (5000rpm, 50℃)을 이용하여 건조하였다. 상기 건조된 지질 추출물을 25㎕의 0.2% Igepal CA-630(Sigma-Aldrich)에 재부유시키고, 각각의 지질의 농도 수준을 컬럼 ACQUITY BEH Shield RP18 1.7μm 2.1x50mm(186002853)과 0.1 % of NH4OH을 이용하는 UPLC 시스템으로 정량화하였다.
6) ApoM(Apolipoprotein M) 측정
상업적 ELISA 키트(CUSABIO Human ApoM ELISA Kit and Mouse ApoM ELISA Kit)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 상기 마우스 혈장 또는 이로부터 분획된 HDL 내에 포함된 아포지단백질 M(ApoM)량을 정량 하였다. 표준 곡선으로는 정제된 아포지단백질 M 표준을 사용하였다.
7) 면역형광법
마우스의 대뇌(특히, 피질) 및 해마를 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 고정 후, 상기 고정된 조직을 0.5% 티오플라빈 S (Sigma-Aldrich) 또는 각각 Aβ42에 대한 항-20G10(마우스, 1:1000), Aβ40에 대한 항-G30(토끼, 1:1000), 항-Iba-1(토끼, 1:500, Wako), 항-GFAP(토끼, 1:500, DAKO)와 함께 배양하였다. 가시화를 위하여, Alexa Fluor 488-컨쥬게이션된 이차 항체와 배양하였다. 상기 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화하였다.
8) 행동실험
학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여, 공지된 방법에 따라 MWM(Morris water maze)와 fear conditioning 실험을 수행하였다. MWM을 위한 수중미로(water maze)는 흰색의 탱크에(반지름 1.0m, 높이 30㎝) 20㎝ 깊이의 물(22-24℃)을 채운 것이 사용되었다. 감춰진 Plexiglas 플렛폼(10 cm diameter; 6-8 mm below the surface of the water)을 트레이닝 기간 동안 고정된 위치에 두었다. MWM는 마우스에 대하여 10일 동안 하루에 4 번씩 과제를 학습시켰고, 11일째 되는 날에 플랫폼을 제거하고, 탐침시험(probe trial)을 수행하였다. Fear conditioning은 첫째 날은 마우스를 conditioning chamber에 넣고, 소리 자극(10 kHz, 70 dB) 및 전기자극(0.3 mA, 1 s)을 주었다. 둘째 날은 첫째 날과 같은 conditioning chamber에서 자극 없이 공간에 대한 기억력을 확인했고, 셋째 날은 다른 conditioning chamber에서 소리자극만 주었을 때 두려움에 대한 기억력 테스트를 수행하였다. 모든 실험을 비디오 모니터와 컴퓨터가 연결된 charge-coupled device (CCD) camera를 사용하여 기록하였다. 테스트는 Image J software를 사용하여 수행하였으며, 모든 장비는 O'Hara & Company (Tokyo, Japan)로부터 제조된 것을 사용하였다.
<실시예 1>
HDL-ApoM-S1P loading에 의한 알츠하이머 질환 치료효과 확인
1-1. 알츠하이머 모델 마우스의 혈장에 HDL-ApoM-S1P loading 후, HDL-ApoM-S1P 수준 확인
도 2에 도시된 실험 스케줄에 따라 APP/PS1 마우스(알츠하이머 모델 마우스)에 HDL-ApoM-S1P loading을 일주일에 2번씩 4주 동안 총 8번의 정맥주사를 통해 실시하였다. 상기 마우스의 혈장에서 S1P 및 ApoM의 수준을 측정한 결과와, 특히 HDL 분획에서의 S1P 및 ApoM 수준(즉, HDL-S1P 및 HDL-ApoM)을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, HDL-ApoM-S1P loading을 수행한 APP/PS1 마우스 혈장에서 S1P 및 ApoM의 수준이 증가되었으며, HDL 분획에서의 HDL-S1P 및 HDL-ApoM 수준도 증가된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 비처리군 APP/PS1 마우스 혈장의 S1P, ApoM, HDL-S1P 및 HDL-ApoM 수준과 비교하여 현저히 높은 수준을 나타내는 것이었다. 그러나 S1P를 주입한 APP/PS1 마우스와 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스의 S1P, ApoM, HDL-S1P 및 HDL-ApoM 수준은 비처리군 APP/PS1 마우스와 비교하여 차이가 나타나지 않았다.
특히 ApoM의 경우에 있어서, 마우스 전체 혈장 상으로는 WT와 비처리군 APP/PS1 마우스에서 괄목할만한 차이를 나타내지 못하였으나 HDL 분획에서는 비처리군 APP/PS1 마우스에서 WT 군에 비하여 상당히 낮은 HDL-ApoM 수치를 보였는데, 이는 S1P 및 HDL-S1P 결과와 종합적으로 보았을 때 비처리군 APP/PS1 마우스에서 HDL-ApoM-S1P(S1P가 ApoM영역에 담지된 HDL) 수준이 감소되어있는 것을 나타낸다. 이에 대하여 HDL-ApoM-S1P을 loading한 APP/PS1 마우스 혈장의 HDL-ApoM-S1P 수준은 APP/PS1 마우스의 혈장의 HDL-ApoM-S1P 수준과 비교하여 현저히 높아짐을 확인하였다(도 3 참조). 또한 상기 실험에서 HDL-ApoM-S1P loading이 개체에서 분리 수득한 혈액을 도 1에 도시된 바와 같이 처리하여 다시 주입되는 것을 고려하였을 때 HDL-ApoM의 증가 현상은 괄목할만하였고, 본 발명의 HDL-ApoM-S1P loading이 ApoM과 특별한 관련성을 가짐을 시사하는 것으로 사료되었다.
1-2. 알츠하이머 모델 마우스의 혈장에 HDL- ApoM - S1P loading 후, 뇌에서 아밀로이드 및 타우 (Tau) 침착 억제 확인
HDL-ApoM-S1P loading이 알츠하이머에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 티오플라빈 S(thioflavin S) 염색 및 면역형광법을 이용하여 각 실험군 마우스의 뇌조직(대뇌피질)에서 아밀로이드 및 타우(tau) 침착을 확인하였다. 티오플라빈 S 염색 및 면역형광법을 이용하여 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과를 도 4(도 4a 및 도 4b)에 나타내었고, 면역현광법을 이용하여 타우 침착을 확인한 결과를 도 5(도 5a 및 도 5b)에 나타내었다. 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 9개월령의 비처리군 APP/PS1 마우스의 뇌조직 부위와 비교하여 S1P 또는 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스는 괄목할만한 차이를 나타내지 못하였으나, HDL-ApoM-S1P을 loading 한 APP/PS1 마우스의 뇌조직에 서는 Aβ42 및 Aβ40와 타우(AT8로 확인) 침작이 현저히 감소함을 확인하였다.
1-3. HDL-ApoM-S1P loading에 의한, 알츠하이머 모델의 신경염증 억제 효과 확인
HDL-ApoM-S1P loading이 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 각 실험군 마우스들에 대하여 미세아교세포와 성상아교세포의 변화를 관찰하였다. 미세아포세포의 활성을 확인한 결과를 도 6(도 6a 및 도 6b)에 나타내었고, 성상아교세포의 활성을 확인한 결과를 도 7(도 7a 및 도 7b)에 나타내었다. 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 비처리군 APP/PS1 마우스의 뇌조직 부위와 비교하여 S1P 또는 ApoM을 주입한 APP/PS1 마우스는 괄목할만한 차이를 나타내지 못하였으나 HDL-ApoM-S1P을 loading 한 APP/PS1 마우스는 미세아교세포와 성상아교세포의 염증성 활성의 현저한 저하를 나타내었다.
1-4. HDL-ApoM-S1P loading에 의한, 알츠하이머 모델의 학습 및 기억능력 향상확인
APP/PS1 마우스의 혈장에 HDL-ApoM-S1P loading을 수행함으로써 증가된 HDL-ApoM-S1P가 학습 및 기억에 어떠한 잠재적 효과를 가지는지 확인하기 위하여, MWM(Morris water maze) 테스트와 Fear conditioning을 수행하였다. 도 8(도 8a 및 도 8b) 및 도 9에 나타난 바와 같이, 비처리군 APP/PS1 마우스와 S1P 또는 ApoM을 주입 한 APP/PS1 마우스는 공간 기억 형성에 심각한 장애를 보였으나, HDL-ApoM-S1P을 loading 한 APP/PS1 마우스는 이러한 학습 및 기억력에 대한 장애가 크게 개선 된 것을 확인하였다.
<실시예 2>
유전적 HDL-ApoM-S1P 증가에 의한 알츠하이머 질환 치료효과 확인
본 발명의 HDL-ApoM-S1P가 ApoM 의존적인 방식으로 그 효과가 나타나는 것인지는, 다음의 실험을 통해서 더욱 확인된다.
2-1. ApoM을 과발현하도록 형질전환 된 알츠하이머 동물 마우스 모델(APP/PS1/ ApoM tg )의 혈장에서 HDL-ApoM-S1P 수준 비교
도 10에서 도시한 것과 같이 알츠하이머 실험동물 모델인 APP/PS1(APP/presenilin) 이중 돌연변이 마우스 및 APP/PS1/ApoM tg 삼중 돌연변이 마우스(HDL-ApoM-S1P 과발현 마우스)를 제조하였다. 상기 마우스들의 혈장에서 S1P, HDL-S1P, ApoM 및 HDL-ApoM 수준을 측정한 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 9개월령의 APP/PS1 마우스의 혈장의 HDL-ApoM-S1P 수준은 야생형 마우스(WT)와 비교해 감소되어 있음을 확인 하였다. 상기 APP/PS1 마우스의 혈장의 HDL-ApoM-S1P 수준과 비교하여, 9개월령의 APP/PS1/ApoM tg 마우스의 혈장의 HDL-ApoM-S1P 수준이 현저히 높아짐을 확인하였다. ApoM tg 마우스에서도 HDL-ApoM-S1P이 높은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다.
2-2. 유전적 HDL-ApoM-S1P 증가에 의한 아밀로이드 및 타우 침착 억제 확인
APP/PS1/ApoM tg 마우스에서 HDL-ApoM-S1P 증가가 알츠하이머에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 티오플라빈(thioflavin)S 염색 및 면역형광법을 이용하여 각 실험군 마우스의 뇌조직(대뇌 피질 및 해마)에서 아밀로이드 및 타우 침착을 확인하였다. 티오플라빈 S 염색 및 면역형광법을 이용하여 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과를 도 12(도 12a 및 도 12b)에 나타내었고, 면역현광법을 이용하여 타우 침착을 확인한 결과를 도 13(도 13a 및 도 13b)에 나타내었다. 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 9개월령의 APP/PS1 마우스의 뇌조직 부위와 비교하여 APP/PS1/ApoM tg 마우스의 뇌조직에 침착된 Aβ42 및 Aβ40과 타우(AT8로 확인) 침착이 현저히 감소함을 확인하였다.
2-3. 유전적 HDL-ApoM-S1P 증가에 의한 APP/PS1 마우스에서 신경 염증억제 효과 확인
본 발명자들은 APP/PS1/ApoM tg 마우스에서 혈장의 증가된 HDL-ApoM-S1P이 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위하여, 각 마우스 실험군들 별로 미세아교세포와 성상아교세포의 변화를 관찰하였다. 미세아교세포의 활성을 확인한 결과를 도 14(도 14a 및 도 14b)에 나타내었고, 성상아교세포의 활성을 확인한 결과를 도 15(도 15a 및 도 15b)에 나타내었다. 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, ApoM tg 마우스의 경우 WT와 동일한 양상을 나타내었으며, APP/PS1 마우스는 WT 및 ApoM tg 마우스와 비교하여 미아교세포와 성상아교세포에서 상당한 염증활성을 보이는 것으로 확인되었다. 이에 대하여 APP/PS1/ApoM tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교하였을 때 미세아교세포와 성상아교세포의 염증성 활성의 현저한 저하를 나타내었다.
2-4. 유전적 HDL-ApoM-S1P 증가에 의한, 학습 및 기억능력 향상확인
유전적 HDL-ApoM-S1P 증가의 학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여, MWM(Morris water maze) 테스트와 Fear conditioning을 수행하였다. 도 16(도 16a 및 도 16b) 및 도 17에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스는 공간 기억 형성에 심각한 장애를 보였고, APP/PS1/ApoM tg 마우스는 이러한 학습 및 기억력에 대한 장애가 크게 개선 된 것을 확인하였다. 또한 도 16에서 보는 바와 같이, ApoM tg 마우스들이 WT군보다 인지, 학습 및 기억력이 뛰어난 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 체내 혈장에서 증가된 HDL-ApoM-S1P는 알츠하이머병 및 인지장애, 학습장애, 기억력 장애등을 가지는 개체에서 뿐만 아니라 정상 개체에 대해서도 인지, 학습 및 기억력 증진에 도움을 줄 수 있다는 것을 제시한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 HDL-ApoM-S1P(스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HDL-ApoM-S1P의 퇴행성 뇌질환(특히, 알츠하이머병), 인지장애, 학습장애 및 기억력 장애의 예방, 개선 또는 치료용도와 HDL-ApoM-S1P의 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진 용도에 관한 것이다.
본 발명의 HDL-ApoM-S1P는 퇴행성 뇌질환(특히, 알츠하이머병) 개체에 대하여 신경염증의 완화뿐만 아니라 현저한 인지장애, 학습 장애 및 기억장애의 개선효과를 나타내며, 아밀로이드 베타 및 타우(tau) 침착이 상당히 감소되는 효과를 나타낸다. 또한 체내 HDL-ApoM-S1P의 증가는 정상개체에 대해서도 우수한 인지, 학습 및 기억능력 증진 효능을 나타내므로, 치료제제 관련 산업 등에 있어서 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating of neurodegenerative diseases comprising HDL-ApoM-S1P as an active agent <130> NP17-0048 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoM <400> 1 Met Phe His Gln Ile Trp Ala Ala Leu Leu Tyr Phe Tyr Gly Ile Ile 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ile Tyr Gln Cys Pro Glu His Ser Gln Leu Thr Thr Leu 20 25 30 Gly Val Asp Gly Lys Glu Phe Pro Glu Val His Leu Gly Gln Trp Tyr 35 40 45 Phe Ile Ala Gly Ala Ala Pro Thr Lys Glu Glu Leu Ala Thr Phe Asp 50 55 60 Pro Val Asp Asn Ile Val Phe Asn Met Ala Ala Gly Ser Ala Pro Met 65 70 75 80 Gln Leu His Leu Arg Ala Thr Ile Arg Met Lys Asp Gly Leu Cys Val 85 90 95 Pro Arg Lys Trp Ile Tyr His Leu Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Arg 100 105 110 Thr Glu Gly Arg Pro Asp Met Lys Thr Glu Leu Phe Ser Ser Ser Cys 115 120 125 Pro Gly Gly Ile Met Leu Asn Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Gln Arg Phe 130 135 140 Leu Leu Tyr Asn Arg Ser Pro His Pro Pro Glu Lys Cys Val Glu Glu 145 150 155 160 Phe Lys Ser Leu Thr Ser Cys Leu Asp Ser Lys Ala Phe Leu Leu Thr 165 170 175 Pro Arg Asn Gln Glu Ala Cys Glu Leu Ser Asn Asn 180 185

Claims (10)

  1. 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HDL-ApoM-S1P은
    (a) 개체로부터 채취된 혈액을 혈장 및 혈구 분획으로 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 혈구 분획에 스핑고신(Sphingosin)을 처리하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 혈구 분획과 상기 (a) 단계의 혈장 분획을 혼합하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 혼합물 중 혈장 분획을 분리하는 단계
    를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은
    (e) 상기 (d) 단계의 혈장 분획으로부터 HDL-ApoM-S1P을 정제하는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 스핑고신-1-인산이 아포지단백질 M에 담지된 고밀도지단백질(HDL-ApoM-S1P)을 유효성분으로 포함하는 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진용 약학적 조성물.
  7. 제1항의 조성물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 제제.
  8. 삭제
  9. 제5항의 조성물을 포함하는 인지장애, 학습장애 또는 기억력 장애의 예방 또는 치료용 약학적 제제.
  10. 제6항의 조성물을 포함하는 인지능력, 학습능력 또는 기억력 증진용 약학적 제제.
KR1020170096223A 2017-07-28 2017-07-28 HDL-ApoM-S1P를 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR102039661B1 (ko)

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