CN111617232B

CN111617232B - 一类ApoE受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用

Info

Publication number: CN111617232B
Application number: CN202010500250.7A
Authority: CN
Inventors: 谭骏; 李崧; 范安然; 陈江; 訾聃; 谢非非
Original assignee: Anyu Biotechnology Hangzhou Co ltd
Current assignee: Anyu Biotechnology Hangzhou Co ltd
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111617232A

Abstract

一类ApoE受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，涉及合成蛋白肽药物领域，本发明公开了一类抑制ApoE受体的合成短肽为ApoEp的氨基酸顺序及其赖氨基酸修饰为6KApoEp和C‑16脂肪酸为含一个双键的棕榈酸修饰为C6KApoEp后的改造肽在预防和治疗阿尔茨海默病的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽特异性靶向阻断外源性和内源性ApoE与淀粉样前体蛋白（APP）N‑末端相互作用，最终，以鼻腔内给药方式给予C6KApoEp系列短肽预防和治疗阿尔茨海默病，我们科研组在长达20多年专注研究AD发病机制及治疗的基础上，首次提出了可阻断ApoE介导APP过度内吞及其β‑裂解和Aβ产生过程，从而在AD病理生理的多个环节进行治疗的新假说。

Description

一类ApoE受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用

技术领域

本发明涉及合成蛋白肽药物领域，尤其是涉及一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用。

背景技术

公知的，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种起病隐匿、进行性发展的神经退行性疾病，该病严重损害患者的认知功能，造成生活自理能力障碍和精神行为异常，也是全世界老年人最常见的痴呆类型和导致死亡的重要原因之一，目前，我国 AD 患者约有875万，所导致的社会经济负担接近2000亿美元；预计到2030年我国AD患者的总数将超过2000万，AD早期诊断困难，尚无特效预防和治疗药物，已给家庭和社会造成了沉重负担和巨大的经济压力。

AD分为家族性（Familial Alzheimer's disease，FAD）和散发性（SporadicAlzheimer's disease， SAD）两种，其中绝大部分是SAD,AD 的具体病因尚不清楚，较为公认的为 AD 患者大脑神经细胞外β淀粉样蛋白 (β-amyloid, Aβ) 大量沉积形成老年斑和细胞内 tau 蛋白过度磷酸化, 进而形成神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFT），这些主要的病理改变目前仍然是 AD 神经病理学诊断的标准,但相关的发病机制依然不清楚，针对AD尚无有效的防治手段,除了上述主要的 AD 病理改变外，也有研究表明，Aβ是细胞膜上I型跨膜淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein, APP）β裂解产生的蛋白质短肽（包括 Aβs 和 β-CTF），这些蛋白质短肽过度产生后可聚集形成 AD 患者大脑内的老年斑并产生毒性作用，造成神经元细胞凋亡、神经炎症及氧化应激反应，这些由于过度APP-β裂解引起的病理改变同样也促进 AD 的发生发展, 一直以来，AD 的治疗只针对中晚期，但只能缓解症状，不能终止疾病进展，更无法治愈,近年来，随着针对 tau 蛋白聚集抑制剂与靶向Aβ的药物 Verubecestat 治疗 AD 的两项 Ⅲ 期临床试验的宣告失败，进一步深入探索 APP 经β-分泌酶的代谢过程及Aβ产生在AD发生、发展中的具体作用，继续寻找能够抑制 Aβ沉积形成老年斑、tau蛋白过度磷酸化形成 NFT 以及大脑血供不足和神经细胞突触毒性的关键病理作用的靶点显得尤为重要。

随着对 AD 深入了解，家族性或遗传性 AD仅占所有病例的 5 %左右，而95 %的患者来自散发性疾病,研究发现，SAD与年龄因素、脂代谢功能异常、心血管疾病和脑损伤增加过量的Aβ生成密切相关。

已有研究表明，载脂蛋白E（Aolipoprotein E, ApoE）是引起SAD的最有显著意义的风险因素,在脂蛋白受体介导的胆固醇代谢中发挥重要作用，ApoE 可分为 ApoE2、ApoE3和 ApoE4 三种异构体,在蛋白序列方面，ApoE2 的 112 及 158 位均为半胱氨酸；ApoE3的 112 位为半胱氨酸， 158 位为精氨酸；而 ApoE4 的 112 及 158 位均为精氨酸,就人类中该异构体出现频率而言，ApoE2 为 5-10％，ApoE3 为 65-70％；ApoE4 为 15-20％,在配体-受体结合能力方面，ApoE3 和 ApoE4 对脂蛋白受体的亲和力比 ApoE2 高约 50 倍。此外，ApoE 在 AD 中扮演关键角色，有报道指出 ApoE4 的存在将显著增加 SAD 的发生率，一个等位基因（E4/3 或 E4/2）将提高 AD 风险近3倍，而两个等位基因（E4/4）将提高AD 风险近 12 倍,目前人们认为，ApoE 主要通过介导脂质转运调控其平衡，在 AD 的病理机制中，其可通过作用于Aβ沉积形成老年斑和减少 Aβ 清除的过程影响疾病的发生和进展，亦可使 tau 蛋白过度磷酸化进而形成 NFT，加速 AD 疾病的进程。

无论在国内还是国外，寻找治疗AD的新靶点仍然是目前研究的最新热点,既往研究多半集中在以下两个方向：①APPβ-裂解和 Aβ过度产生后聚集形成老年斑，造成的神经元细胞凋亡、神经炎症及氧化应激反应在AD病理生理机制中的研究;② 探讨 ApoE 在增加Aβ的形成和减少 Aβ清除促进AD疾病进程中的作用,尽管，最近的一些重要发现凸显了其它关键细胞和分子过程的重要病理作用，但是，随着研发AD治疗的项目相继失败，至今尚无改善疾病的有效治疗方法，而且许多III期临床试验尚未能证明其益处，因此，紧紧围绕 AD病理生理改变，多角度的去探索新的关键细胞和分子过程，不失为预防和治疗 AD 的新策略。

已有研究表明，ApoE氨基末端区域（1-191）可与 APP 的 N 端区域（1-207）直接结合，且不同亚型的 ApoE 与 APP 结合能力有明显差别，此外，最近的研究也表明，ApoE 与脂蛋白受体结合后，将通过激活胞内 MAPK 信号通路，最终增加 APP β-裂解及其裂解产物(Aβ) 的产生，因此，研发一种蛋白短肽竞争性抑制 ApoE 与 APP 的结合，有望通过调节APP 内吞β-裂解代谢过程，抑制Aβ的产生、tau病理磷酸化以及神经炎症反应，从而从多个环节阻断 AD 病理的发生和发展。

发明内容

为了克服背景技术中的不足，本发明公开了一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，本发明通过从分子、细胞及动物水平检测了融合的短肽特异性靶向阻断外源性和内源性 ApoE 蛋白与淀粉样前体蛋白（APP）N-末端相互作用，最终，以鼻腔内给药方式给予 C6KApoEp 系列短肽阻断内源性 ApoE 蛋白与淀粉样前体蛋白（APP）N-末端结合以达到减少 APP 内吞、缓解阿尔茨海默病（AD）病理变化和改善认知功能障碍的目的。

一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，包括一类抑制 ApoE 受体的合成短肽即ApoEp的氨基酸顺序及其赖氨基酸修饰即6KApoEp和 C-16 脂肪酸含一个双键的棕榈酸修饰即C6KApoEp后的改造肽在预防和治疗阿尔茨海默病的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽特异性靶向阻断外源性和内源性 ApoE 与淀粉样前体蛋白（APP）N-末端相互作用，最终，以鼻腔内给药方式给予 C6KApoEp 系列短肽预防和治疗阿尔茨海默病

一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，C6KApoEp 系列短肽如下：

6KApoEp：KKKKKKLRVRLASHLRKLRKRLLRDA

C6KApoEp：KKKKKKLKVRLASHLRK[Glu][C-16]LRKRLLRDA

C6KApoEp-1：KKKKKKLKVRLASHLRKLRK[Glu][C-16]RLLRDA

C6KApoEp-2：KKKKKKLRK[Glu][C-16]LRKRLLR

C6KApoEp-3：KKKKKKLKKLRK[Glu][C-16]RLLR。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明一类抑制 ApoE 受体的合成短肽（ApoEp）的氨基酸顺序及其赖氨基酸修饰（6KApoEp）和 C-16 脂肪酸（含一个双键的棕榈酸）修饰（C6KApoEp）后的改造肽在预防和治疗阿尔茨海默病的应用，同时，从分子、细胞及动物水平检测了这些融合的短肽特异性靶向阻断外源性和内源性 ApoE 与淀粉样前体蛋白（APP）N-末端相互作用，最终，以鼻腔内给药方式给予 C6KApoEp 系列短肽预防和治疗阿尔茨海默病，我们科研组在长达 20 多年专注研究 AD 发病机制及治疗的基础上，首次提出了可阻断 ApoE 介导 APP 过度内吞及其 β-裂解和 Aβ 产生过程，从而在 AD病理生理的多个环节进行治疗的新假说。

附图说明

图1为本发明的外周血给药后C6KApoEp 穿过血脑屏障示意图；

图2为本发明的修饰的 6KApoEp示意图；

图3为本发明的C6ApoEp与N末端APP紧密结合示意图；

图4为本发明的C6KApoEp 显著地抑制了 ApoE 诱导的 Aβ产生示意图1；

图5为本发明的C6KApoEp 显著地抑制了 ApoE 诱导的 Aβ产生示意图2；

图6为本发明的C6KApoEp 明显降低 tau 摄取示意图；

图7为本发明的MTT 比色分析实验示意图。

具体实施方式

通过下面的实施例子可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。

实施例1，结合附图1所述的一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，外周血给药后，C6KApoEp 穿过血脑屏障（BBB）

C-16 脂肪酸修饰后的 6KApoEp（C6KApoEp）以 250 µg/kg i.p.即腹腔给药处理雄性 C57BL6 小鼠，然后在治疗后 0-120 分钟通过 WB 分析（6H3B5）测定脑匀浆中的C6KApoEp， N ＝ 2 只小鼠/时间点，WB 分析显示，治疗后 30-120 分钟，小鼠脑组织中出现 2-3 kDa 左右的条带，表明存在 C6KApoEp 短肽。

实施例2，结合附图2所述的一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，用 C-16 脂肪酸棕榈酸酯深度修饰 6KApoEp 可增强其 N 端 APP 拮抗作用

第一步，修饰的 6KApoEp即C6KApoEp，MW 3146.22，通过在位置 8 的 Arg（R）处代替 Lys（K）修饰 6KApoEp，并将 C-16 脂肪酸（棕榈酸）与谷氨酸间隔基连接在其余部分上Lys 残基在位置 17（A），将10μM 的 6KApoEp 或 C6KApoEp 与 CHO 细胞的条件培养基孵育 0-210 分钟，然后使用抗 ApoE LDLR 结合域抗体（6H3B5，B）通过 WB 分析 6KApoEp 和C6KApoEp，与 6KApoEp 相比，C6KApoEp 显示更加稳定对内源性蛋白酶的消化，并且具有非常强的抵抗力；

进一步，结合附图3，C6ApoEp 与 N 末端APP紧密结合将 CHO/APPwt 细胞以 5 µM的浓度分别用 6K，6KApoEp 或 C6KApoEp 处理1-4小时，然后用 6E10 抗体免疫沉淀细胞裂解物，并对 6KApoEp，C6KApoEp 进行 WB 分析:分别使用 6H3B5 和小鼠抗 N 末端 APP抗体22C11在总细胞裂解液输入和免疫沉淀中的总 APP即t-APP如附图3中A所示，还将CHO/APPwt 细胞以 5x106/孔在 8个孔腔中铺板并且培养 15-24小时，以 5 µM 的 6K，6KApoEp 或 C6KApoEp 处理0.5-2小时，固定在 4％多聚甲醛溶液中，并用 6H3B5 和兔抗N末端 APP即pN-APP抗体如附图3中B所示进行荧光染色，Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG 用于检测 6KApoEp 和 C6KApoEp即绿色所示，而 Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG 用于检测 N 末端 APP即红色所示，黄色表示 C6KApoEp 或 6KApoEp 与 N-末端 APP 共定位

；

进一步，结合附图4和5，在无血清培养基中，在 6KApoEp 或 C6KApoEp 在 0 至 5µM 存在下，以 10 µg/mL 的 ApoE4 处理 CHO/APPwt 细胞 2 小时，然后通过AβELISA分析条件培养基中的Aβ水平，这些结果代表两个独立实验的 ELISA 结果，每个条件重复两次，并以 Aβ的平均值（±s.d.）表示（pg/mg 细胞内总蛋白），t 检验进行统计分析，结果表明存在 C6KApoEp 的情况下与 6KApoEp 相比，ApoE 介导的 Aβ产生发生明显变化，P<0.05；

进一步，结合附图6，SH-SY5Y 细胞用 0 至 5μM C6KApoEp 或 6KApoEp 处理 12-22 小时，然后在条件培养基中测定分泌的 tau（s-tau）和分泌的 APPα（sAPPα），以及分别使用 6E10， tau12 和β-actin 抗体通过 WB 分析裂解细胞裂解物中的细胞内 tau（c-tau）和β-actin，值得注意的是：与 6KApoEp 相比，在 SH-SY5Y 细胞中分泌的 tau（s-tau）增加和细胞内裂解 tau（c-tau）积累减少，表明 C6KApoEp 大大降低了 tau 摄取。

实施例3，结合附图7所述的一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用，SH-SY5Y 细胞用 0（Ctrl）、5μM 和 10 μM C6KApoEp（m6K）或 6K 处理 1 h、2 h、4 h、6h、8 h、和24 h，然后按照 MTT 实验使用说明完成 MTT 比色分析，MTT 实验结果显示为相对于对照的生存率P > 0.05。

本发明未详述部分为现有技术，尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，具体实现该技术方案方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 安域生物科技（杭州）有限公司

<120> 一类 ApoE 受体蛋白短肽阻断剂在阿尔茨海默病的应用

<130> XYY202211050

<140> 202010500250.7

<141> 2020-06-04

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide

<400> 1

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg

1 5 10 15

Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala

20 25

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223> Modified with a C-16 fatty acid via a glutamic acid

<400> 2

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg

1 5 10 15

Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala

20 25

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Modified with a C-16 fatty acid via a glutamic acid

<400> 3

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg

1 5 10 15

Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala

20 25

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Modified with a C-16 fatty acid via a glutamic acid

<400> 4

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg

1 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Modified with a C-16 fatty acid via a glutamic acid

<400> 5

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Lys Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg

1 5 10 15

Claims

1.一类ApoE受体蛋白短肽阻断剂在制备以鼻腔内给药方式预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，所述ApoE受体蛋白短肽阻断剂包括C6KApoEp，所述C6KApoEp为6KApoEp经含一个双键的棕榈酸修饰而得，氨基酸序列如下：

C6KApoEp：KKKKKKLKVRLASHLRK[Glu][C-16]LRKRLLRDA，

所述ApoE受体蛋白短肽阻断剂中所述C6KApoEp的浓度为5μM。