JP2009521234A - 補体系を制御する組成および方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 本明細書に提供される開示では、１若しくはそれ以上の補体経路タンパク質の発現または産生を抑制することで、前記ヒトの補体経路を調節する方法および組成、および眼疾患および黄斑変性関連疾患を含む疾患を治療するためのかかる方法の利用について提供する。本発明には、ＲＮＡｉを介して補体経路タンパク質を分解するように設計されたｓｉＲＮＡを含む、前記補体経路の調節を媒介する活性因子も含む。
【選択図】 図４

Description

本出願は、２００５年１２月２２日に出願された米国仮出願第６０／７５３，０４１号の優先権を主張するものであり、この参照によりその全開示が本願明細書に組み込まれるものである。

補体系は、およそ３０種類のタンパク質を含むものであり、細胞外液を循環し、侵入してきた細菌およびウイルス病原体に対して非抗原特異的免疫応答を開始することができる。補体系タンパク質は、不活性型として循環し、侵入してきた微生物表面の分子パターンが前記系の初期成分によって認識されると活性化する。前記補体系の活性化した初期成分は、侵入病原体表面に他の補体タンパク質を補充し、活性化複合体を形成し、これはタンパク分解により他の前記補体系成分を切断し、活性化するプロテイナーゼとして作用する。次に、前記補体系成分のタンパク質分解的活性化、補充、共結合カスケードが起こり、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が形成し、これは細胞溶解を引き起こす前記侵入病原体細胞壁の孔となる。

前記補体系は、古典経路、第２経路、レクチン経路の３種類の経路により活性化される。各経路では結果的に前記ＭＡＣが形成されるが、異なる刺激によって開始される。

前記古典経路は、抗体（複数のＩｇＧ分子または単一のＩｇＭ分子）が前記病原体表面に結合したときに開始される。結合により、前記抗体のＦｃ成分がＣ１因子のＣ１ｑサブユニットと相互作用し、Ｃ１ｒサブユニットが活性化する。Ｃ１ｒはタンパク質分解酵素であり、Ｃ１ｓサブユニットを切断し、そのプロテアーゼ機能を活性化する。Ｃ１ｓはＣ４因子を切断し、Ｃ４ａおよびＣ４ｂを生成する。Ｃ４ａは当該反応部位で生物的に活性なままであり、炎症を調節する。Ｃ４ｂは不活性な副生成物となるか、ＩｇＧ分子と共有結合するか、抗体結合微生物の細胞表面に共有結合することができる。Ｍｇ^＋２存在下では、細胞表面に結合したＣ４ｂがＣ２を前記細胞表面に補充し、ここでＣ２はＣ１ｓによって切断され、Ｃ２ｂおよびＣ２ａが生成する。Ｃ２ｂは前記細胞表面から拡散する。Ｃ２ａはＣ４ｂと複合体を形成し、Ｃ３特異的プロテアーゼであるＣ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ）を形成する。

Ｃ３転換酵素はＣ３を切断し、Ｃ３ａおよびＣ３ｂフラグメントを生成する。Ｃ３ａは強力なアナフィラトキシンであり、前記細胞表面から拡散し、白血球の化学誘引物質として作用する。Ｃ４ｂ同様、Ｃ３ｂは不活性な副生成物となる可能性があるが、代わりに、Ｃ３ｂの１０％以下は前記病原体の原形質膜に共有結合したままとなることもできる。前記原形質膜に結合している間、Ｃ３ｂはオプソニンとして作用するか、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ）と結合し、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ３ｂ）を形成することができる。Ｃ５転換酵素はＣ５に結合、これを切断し、Ｃ５ａおよびＣ５ｂを生成する。Ｃ５ａは前記細胞表面から拡散し、強力なアナフィラトキシンおよび化学誘引物質として作用し、炎症を調節する。Ｃ５ｂは前記病原体の細胞壁に結合したままで、前記ＭＡＣの会合を開始する。

前記ＭＡＣは、前記補体系の後期成分から形成される。前記病原体細胞壁に結合したＣ５ｂはＣ６を補充し、Ｃ５ｂＣ６複合体を形成し、これが次にＣ７を補充してＣ５ｂ６７複合体を形成し、Ｃ５ｂ６７複合体は前記病原体細胞膜に挿入される。次にＣ８がＣ５ｂ６７に結合してＣ５ｂ６７８複合体を形成し、この複合体はＣ９の重合を開始し、Ｃ９が前記病原体の脂質二重層に挿入され、ＭＡＣが形成する。前記ＭＡＣは前記病原体細胞膜に孔を作り、細胞に小分子、イオン、および水を流入させ、最終的に浸透圧で細胞溶解を引き起こす。

前記レクチン経路の活性化は、炭水化物の認識に基づいている。構造がＣ１ｑに似たマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンは、前記病原体細胞表面の特異的炭水化物に結合し、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓに似たＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰｓ）と結合する。Ｃ１ｓ様のＭＡＳＰ−２は、Ｃ３転換酵素の形成を開始する補体成分Ｃ４およびＣ２を切断する。ＭＡＳＰ−１は、直接Ｃ３を切断することで、前記第２経路を刺激する。Ｃ３が切断されると、Ｃ５転換酵素が形成し、最終的に上述の通り、ＭＡＣが形成する。

血漿中のＣ３切断が少ないために抗体結合がない場合は、前記第２経路が活性化される。血漿中で産生されるＣ３ｂは、細胞表面の炭水化物およびタンパク質の水酸基と共有結合する。前記病原体の細胞表面に結合したＣ３ｂは、前記細胞表面にファクターＢを補充する。主に脂肪細胞が産生するファクターＤは、結合したファクターＢを切断し、ＢａおよびＢｂを生成する。Ｂａは血液循環中に放出される。ＢｂはＣ３ｂに結合し、第２経路のＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂを形成する。プロペルジンはＣ３転換酵素を安定化し、前記複合体はＣ３を切断することができる。生成された一部のＣ３ｂはＣ３ｂＢｂに結合し、第２経路のＣ５転換酵素Ｃ３ｂＢｂ３ｂを形成する。他のＣ５転換酵素と同様、第２経路のＣ５転換酵素はＣ５を切断し、ＭＡＣの会合を開始する。

受容体の結合はいくつかの補体系成分の活性化を調節する。ファクターＩを介したＣ３ｂの切断により生成するフラグメントｉＣ３ｂ、およびＣ４ｂは、高い親和性で１型補体受容体（ＣＲ１、ＣＤ３５）と結合する。ＣＲ１は赤血球、マクロファージ、単球、多形核白血球、Ｂ細胞、および濾胞性樹状細胞にみられる内在性膜タンパク質であり、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂでコーティングされた粒子の貪食を促し、血液循環中からの免疫複合体のクリアランスを調節する。２型補体受容体（ＣＲ２、Ｃ３ｄ受容体、ＣＤ２１）はＢリンパ球、濾胞性樹状細胞、および上皮細胞にみられる膜糖タンパク質であり、ファクターＩによるＣ３ｂ切断の切断生成物と特異的に結合する。３型補体受容体（ＣＲ３、Ｍａｃ１、ＣＤ１１ｂＣＤ１８）はマクロファージ、単球、多形核白血球、樹状細胞に認められ、ｉＣ３ｂが結合することで、ｉＣ３ｂでコーティングされた微生物および粒子の貪食を刺激すると考えられている。４型補体受容体（ＣＲ４、ｐ１５０、９５、ＣＤ１１ｃＣＤ１８）はｉＣ３ｂとＣ３ｄｇ（Ｃ３ｂのもう一つの切断生成物）に結合し、貪食を促す。その細胞分布はＣＲ３と同等である。最後に、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）および前記Ｃ３ａ／４ａ受容体は内皮細胞、肥満細胞、食細胞に認められ、それぞれＣ５ａおよびＣ３ａまたはＣ４ａに結合し、これらのタンパク質フラグメントのアナフィラトキシン活性および遊走能を高める。

前記補体系は、誤った活性化または宿主細胞への免疫攻撃を回避するため、厳重に制御されている。前記古典経路は少なくとも６種類のタンパク質で制御されている。Ｃ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１ ＩＮＨ）はＣ１ｒおよびＣ１ｓ、また前記レクチン経路のＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２プロテアーゼと結合してこれらを不活性化し、Ｃ２およびＣ４の切断とＣ３転換酵素の形成を阻害する。血中に認められるＣ１のほとんどはＣ１ ＩＮＨと結合し、自然に活性化しないようになっているが、Ｃ１は前記古典経路を活性化する抗原抗体複合体に結合すると、Ｃ１ ＩＮＨから放出される。別の制御因子である前記古典経路のファクターＩは、タンパク質分解によりＣ４ｂおよびＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂＢＰ）を切断し、これが補助因子としてＣＲ１または膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）を用いて、ファクターＩを活性化する。ファクターＩの補助因子として作用することに加え、Ｃ４ｂＢＰおよびＣＲ１はＣ４ｂに結合し、解離を促すことで古典経路のＣ３転換酵素の産生を阻害するＣ２ａの結合を競合的に阻害する。末梢血液細胞、内皮細胞、一部の粘膜上皮細胞にみられる膜貫通糖タンパク質の分解促進因子（ＤＡＦ）は、古典経路のＣ３転換酵素の解離を促し、Ｃ４ｂと結合することで、Ｃ２と結合しないようになっている。

前記第２経路も厳重に制御されている。ファクターＨは、第２経路のＣ３転換酵素の産生を阻害するＣ３ｂの結合において、ファクターＢおよびＢｂと競合する。ファクターＢはシアル酸含有量が高い表面に多く結合し、ほとんどの細菌細胞は哺乳類細胞よりも表面のシアル酸量が少ないため、ファクターＢは細菌細胞と結合しやすく、前記補体系を活性化する。対照的に、ファクターＨは哺乳類細胞表面にあるヘパリンなど、グリコサミノグリカンまたは硫酸化多糖類などのポリアニオン系分子と結合する。従って、ファクターＨは哺乳類細胞と結合し、前記補体系から保護する。さらに、ＭＣＰおよびＣＲ１はファクターＨの表面結合型Ｃ３ｂの親和性を高め、Ｂｂの解離を促すことで第２経路のＣ３転換酵素を不活性化する。ファクターＩはファクターＨ、ＣＲ１、およびＭＣＰを補助因子として用い、第２経路のＣ３転換酵素に対して同様の作用を持つ。

補体の制御はＭＡＣでも行われる。Ｃ５ｂ６７複合体の脂質膜への挿入は血清中のビトロネクチン（Ｓタンパク質）結合により阻害され、ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｙｓｉｓ（ＣＤ ５９、ＭＲＬ）およびｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＨＲＦ）は赤血球、リンパ球、単球、好中球、および血小板に認められる膜結合型タンパク質であり、それぞれ、Ｃ７およびＣ８のＣ５ｂ６への結合を阻害し、Ｃ９のＣ８との結合に干渉する。最後に、別の血清タンパク質であるクラスタリン（ＳＰ−４０／４０）は、Ｃ５ｂ−８およびＣ５ｂ−９でのＣ９の会合を阻害し、結合したＣ５ｂ６７が前記膜に結合しないようにすることで、ＭＡＣの形成を調節する。

補体欠損症も細菌および酵母に感染しやすくなるため、疾患を進行させる。抗体産生または食細胞機能に異常がある、または古典経路の補体タンパク質に欠陥がある患者は、インフルエンザ菌および肺炎連鎖球菌感染を発症するリスクが高くなる。同様に、ＭＡＣの成分が遺伝的に欠損している患者はナイセリア感染症、特に髄膜炎菌に罹患しやすく、ＭＢＬ値の低下は再発性化膿性（膿形成）感染および若年小児の発育不全と関連していた。興味深いことに、同様のオプソニン欠損症がみられる成人は健常であり、受動的に獲得した母親の抗体がなくなり、成熟した免疫系が発達している期間は、前記ＭＢＬの経路が重要な役割を果たしていることを示唆している。

多くの微生物は前記補体系を利用し、宿主による免疫反応を避け、病原性を高めている。いくつかの病原体がＣ４ｂＢＰおよび／またはファクターＨに結合する。エプスタインバーウイルスのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３５０／２２０はＣＲ２に結合し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および病原性マイコバクテリアはＣ３ｂに結合し、Ｃ３受容体を利用して細胞に入る。補体活性化を阻害するタンパク質を発現している細菌もあり、ＭＡＣ形成に対して物理的な障壁となる厚い膜を発達させた細菌もある。

ウイルスは、補体制御タンパク質をそのエンベロープ（つまり、ＨＩＶ）に組み込み、構造的に補体制御タンパク質を模倣したタンパク質を産生し、または補体認識タンパク質との構造的相同性を有していないが、同様の機能性を有するタンパク質を産生することで補体を回避する。ワクシニアウイルスは、アミノ酸配列が宿主のＣ４ｂＢＰ（３８％）、ＭＣＰ（３５％）、およびＤＡＦ（３１％）に類似した補体阻害因子であるワクシニア補体制御タンパク質（ＶＣＰ）を分泌するため、特に興味深い。ＶＣＰの構造はＣ４ｂＢＰと最も類似しているが、その機能プロフィールはＣＲ１に最も似ている。ＶＣＰは、Ｃ４ｂまたはＣ３ｂに結合することで、前記経路の数段階で補体の活性化を遮断する。ＶＣＰはヘパリンに結合することもできるが、ヘパリンはＶＣＰに上皮細胞結合能力および小分子の化学走化性サイトカイン結合阻害能力を与えることができ、化学走化性サイトカインは白血球の組織への局在化と遊走を制御する。これらの性質に基づき、ＶＣＰは異常補体活性化が関与する疾患の治療薬として高い可能性を有する。ＶＣＰはβ−アミロイドタンパク質により補体の活性化を遮断することから、アルツハイマー病の治療に有用と考えられ、異種移植後の超急性拒絶に有望な治療法である。研究では、ＶＣＰが補体活性化を遮断することで、ｉｎ ｖｉｖｏでの異種移植臓器の生存を長期化する可能性があることが示された。ＶＣＰは多臓器機能不全と、脳および脊髄損傷の治療にも有用であると考えられる。

あらゆる単一タンパク質成分の欠損により補体活性化が異常となり、ＭＡＣ形成が制限され、補体を介した反応がなくなる可能性がある。さらに、異常活性化はヒトの疾患につながる可能性があり、補体カスケードの成分は例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、敗血症、免疫複合体病、炎症、肺および肝線維症、喘息、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、およびアルツハイマー病などの多様な疾患群の発症に関与していた。持続的な微生物または自己抗原に対する自己免疫性体液性反応があるなどの異常刺激は、異常な補体系活性化を誘発する可能性がある。従って、研究の主な目標は、一定の補体成分を標的とし、その経路を不活性化する効果的な薬物、および補体が関与する疾患の新規治療法のデザインを特定することであった。

Ｃ５の酵素的切断はＭＡＣの会合を開始する。小分子Ｃ５ａＲアンタゴニスト（ＡｃＦ−ＯＰｄＣｈａＷＲ）は、複数のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、齧歯類敗血症モデルでの重大な抗炎症活性、および進行性腎機能障害の予防、およびマウスループス腎炎モデルでの好中球およびマクロファージが伴う炎症の抑制を含む、好ましい作用を生じた。さらに、ＡｃＦ−ＯＰｄＣｈａＷＲは外傷性脳損傷モデルの好中球の血管外遊出を有意に抑制し、小分子Ｃ５ａＲ阻害薬の静脈内投与はマウス肝線維形成モデルの肝コラーゲン値と線維症を有意に抑制した。

別のＣ５阻害薬であるＫ−７６モノカルボン酸ナトリウム塩（Ｋ−７６ＣＯＯＮａ）は、Ｃ５ｂの生成を阻害し、その分解を促進する。この化合物を糖尿病ラットに経口投与すると、タンパク尿と糸球体のメサンギウム増殖が抑制された。

Ｃ５も抗体により標的とされた。モノクローナル抗体のペキセリズマブ（ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）は、主要な経皮的冠動脈介入と併用する補助療法として投与した場合、急性心筋梗塞（ＭＩ）後の死亡率を有意に低下させ、弁手術の有無によらず、冠動脈バイパス移植術後の患者の死亡率またはＭＩを減少させた。ペキセリズマブは第ＩＩＩ相臨床試験（ＰＲＩＭＯ−ＣＡＢＧ）を終了している。前期試験の主要エンドポイントには達しなかったが、術後の患者死亡率および罹患率は全体的に低下した。別のモノクローナル抗体のエクリズマブは、関節リウマチ、特発性膜性腎症、ＳＬＥ、皮膚筋炎および発作性夜間血色素尿症患者で検討され、これらの症状が臨床的に改善するエビデンスが観察された。

Ｃ３の阻害も研究の焦点となっていた。Ｃ３ａＲの低分子量非ペプチドアンタゴニストであるＮ２−［２，２−ジフェニルエトキシ）アセチル］−Ｌ−アルギニン（ＳＢ ２９０１５７）は、齧歯類関節炎モデルの足浮腫を軽減し、モルモット気道好中球増加症モデルの好中球補充を阻害した。サイクリック１３残基ペプチドのｃｏｍｐｓｔａｔｉｎは霊長類のＣ３に種特異的であり、血清でＣ３に結合し、補体の活性化を阻害する。さらに前記ペプチドは、ヒト血液で灌流したブタからヒトへの異種移植片の寿命を延長することが示された。

モノクローナル抗体を用い、ファクターＢおよびＤを標的とし、前記第２経路を特異的に阻害する可能性を調査した。ｍＡｂ１３７９はマウスファクターＢのエピトープを標的とし、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、およびウマの血清で前記第２経路を阻害する。マウス抗リン脂質症候群モデルでは、抗リン脂質抗体存在下での自己免疫疾患は再発性胎仔消失、血管内血栓、および血小板減少症で特徴付けられ、前記抗体の腹腔内投与により補体活性化および胎仔消失が予防されたため、ファクターＢ阻害を治療に利用できる可能性が示唆された。１６６−３２はヒトファクターＤを標的とするモノクローナル抗体であり、心肺バイパスモデルの補体、白血球、および血小板の活性化阻害に成功した。ファクターＤを標的とした別の抗体も、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで効果があった。

考えられる治療法として、天然型および修飾補体制御タンパク質の利用も検討されている。Ｃ１ ＩＮＨは、遺伝性血管浮腫、Ｃ１ ＩＮＨ欠損による常染色体優性疾患の治療に対して２５年以上臨床的に使用され、敗血症、脳および心筋虚血−再潅流障害、超急性移植片拒絶反応、外傷性ショック、および熱傷、ＩＬ−２治療、心肺バイパスに伴う血管漏出症候群を含む多数の他の疾患モデルでも有望な結果が示された。Ｃ１ ＩＮＨの心臓保護作用が心筋虚血−再潅流障害を対象としたヒト臨床試験で証明されたが、この作用は用量依存的であり、過剰なＣ１ ＩＮＨは心肺バイパス中の新生児に致命的となることが証明された。

ＴＰ１０は可溶型ＣＲ１（ｓＣＲ１）であり、心肺バイパスに関する臨床試験で検討されてきた。初期の結果ではＴＰ１０は忍容性に優れ、有益であることが示されたが、第ＩＩ相試験では主要エンドポイントを満たすことができなかった。それにもかかわらず、心臓切開手術を受けたハイリスク群の男性患者に関するデータのさらなるサブグループ分析では、梗塞サイズおよび死亡率が有意に減少することが明らかとなったため、追加試験が計画されている。別のＴＰ１０グリコシル化体であるＴＰ２０も、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで評価された。

ＡＰＴ０７０（Ｍｉｒｏｃｏｃｅｐｔ）は、ＣＲ１の細菌で発現される領域と膜標的ペプチドを組み合わせたものに由来する薬物であり、血管ショック、関節リウマチ、腎移植、およびギラン・バレー症候群の動物モデルで有効であった。ＡＰＴ０７０は健常患者の全身に、および関節リウマチ患者および腎移植を受けた患者には局所的に投与された。また、ＡＰＴ０７０と類似の膜を標的とする戦略がＣＤ５９およびＤＡＦに応用された。

障害部位の補体阻害因子を標的にできる点は、有効性を高め、補体の全身的な抑制を回避するため、特に魅力的である。阻害因子を標的にするため考えられる戦略の１つは、一本鎖抗体フラグメントを用い、ピューロマイシン誘導ネフローゼのラットモデルで事実上証明された。ラット糸球体および近位尿細管上皮細胞に特異的な抗体フラグメントは、齧歯類に認められるＣ３転換酵素制御因子のＣｒｒｙ、およびＣＤ５９と結合した。改良された阻害薬の腹腔内注入では、尿細管間質障害および腎機能障害が保護された。

研究では、黄斑ドルーゼがあることが萎縮性および新生血管ＡＭＤの両方が発症する強いリスクファクターであることが証明された。ドルーゼはＲＰＥ単分子層の外側を引き伸ばし、直近の血管供給を行う脈絡毛細管枝からＲＰＥを物理的に移動する。この移動により、脈絡毛細管枝と網膜の間の正常な代謝物および排泄物の拡散を妨げる物理的障壁が作られる。排泄物は前記ＲＰＥ付近で濃縮され、網膜およびＲＰＥの健康状態維持に必要な酸素、グルコース、およびその他の栄養または血清関連制御分子の拡散が阻害される可能性がある。ドルーゼは、桿体および錐体に圧力をかけ、および／または光受容体の細胞配列をゆがめることで、光受容体の細胞機能を混乱させることが示唆された。

最近の研究では、補体タンパク質を眼のドルーゼに関連付けた。ドルーゼに補体因子があれば、補体がＡＭＤに関与している証拠となる。従って、補体活性を制御できれば、ＡＭＤの治療に有益と考えられる。

本明細書に提示される本発明の実施形態は、補体経路タンパク質ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡと実質的に同一のセンスＲＮＡ鎖を有する、単離低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。一部の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡに、補体経路タンパク質ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖を含むことができ、前記センスＲＮＡ鎖および前記アンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成する。様々な実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヒト古典経路、第２経路、およびレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、またはビトロネクチン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができる。好適な実施形態では、前記ｓｉＲＮＡは、ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができる。

一部の実施形態では、前記センスＲＮＡ鎖が一ＲＮＡ分子であり、前記アンチセンスＲＮＡ鎖が一ＲＮＡ分子であり、他の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖が共有結合することができる。一定の実施形態では、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がヌクレアーゼ分解に対して安定であり、前記ｓｉＲＮＡがさらに非ヌクレオチドの構成要素を含むことができる。

一部の実施形態では、前記センスＲＮＡ鎖が第一の３'オーバーハングを含み、および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖が第二の３'オーバーハングを含むことができ、一定の実施形態では、前記第一および／または第二の３'オーバーハングが１〜約６ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、前記第一および／または第二の３'オーバーハングを約２ヌクレオチドとすることができ、好適な実施形態では、前記第一および／または第二の３'オーバーハングをジチミジン（ＴＴ）またはジウリジン（ｕｕ）のジヌクレオチドとすることができる。

一定の実施形態のｓｉＲＮＡは、配列ＩＤ番号：４３、配列ＩＤ番号：４５、配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番号：４９、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５３、および配列ＩＤ番号：５６から選択される配列に対応する配列を有する、センスＲＮＡ鎖を有することができる。

本発明の他の実施形態では、補体経路タンパク質ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する有効量の単離ｓｉＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成する単離ｓｉＲＮＡ、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。様々な実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヒト古典経路、第２経路、およびレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、またはビトロネクチン、ヘパリン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖、および薬学的に許容される担体を含むことができる。好適な実施形態では、前記ｓｉＲＮＡは、ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖、および薬学的に許容される担体を含むことができる。

一部の実施形態では、前記薬学的組成物が導入試薬を含むことができ、前記導入試薬はリポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、またはリポソーム、およびその組み合わせとすることができる。特定の実施形態では、前記導入試薬をリポソームとすることができる。一部の実施形態のリポソームは、さらに、前記リポソームにドルーゼ部位またはその近傍を標的とさせるターゲティングリガンドを含むことができ、一定の実施形態では、前記リガンドを抗体とすることができる。他の実施形態のリポソームは、オプソニン化阻害部分で修飾することができ、特定の実施形態では、前記オプソニン化阻害部分にＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体を含むことができる。

様々な実施形態において、前記センスＲＮＡ鎖は、配列ＩＤ番号：４３、配列ＩＤ番号：４５、配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番号：４９、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５３、および配列ＩＤ番号：５６から選択される配列に対応する配列を有することができ、実施形態によっては、前記センスＲＮＡ鎖が第一の３'オーバーハングを有し、および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖が第二の３'オーバーハングを有することができる。一部の実施形態では、前記第一および／または前記第二の３'オーバーハングが１〜約６ヌクレオチドを含むことができ、他の実施形態では、前記第一および／または前記第二の３'オーバーハングが約２ヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、前記第一および／または前記第二の３'オーバーハングをジチミジン（ＴＴ）またはジウリジン（ｕｕ）のジヌクレオチドとすることができる。

本発明のさらに他の実施形態には、ヒト補体系または補体系制御ｍＲＮＡの発現を阻害する方法を含み、前記方法には、それを必要とする被験者に、補体経路タンパク質ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する、有効量の単離ｓｉＲＮＡを投与し、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成する工程と、前記ヒト補体系または補体系調節ｍＲＮＡを分解し、分解により前記ヒト補体系または補体系調節ｍＲＮＡの発現が阻害される工程を含む。様々な実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヒト古典経路、第２経路、およびレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、またはビトロネクチン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができる。好適な実施形態では、前記ｓｉＲＮＡが、ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができ、ヒトＣ３タンパク質ＲＮＡは分解され、前記ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの分解によりヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの発現が阻害され、補体系反応の開始および／または急増が阻害される。

実施形態によっては、それを必要とする前記被験者がヒトであり、一定の実施形態では、前記有効量のｓｉＲＮＡを約１ｎＭ〜約１００ｎＭとすることができる。

一部の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡが組み換えプラスミドから発現され、他の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターとすることができる、組み換えウイルスから発現される。特定の実施形態では、前記組み換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターを有する。さらに他の実施形態では、前記組み換えウイルスが、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、またはモコラウイルスなど、他のウイルスの表面タンパク質を発現することができる。

実施形態により、前記単離ｓｉＲＮＡは、経口、直腸、および鼻腔内投与を含む方法により、経腸的に投与することができる。他の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡは、血管内投与、組織周囲および組織内注射、皮下注射または沈着、または皮下注入投与、およびドルーゼ形成部位またはその近傍への直接投与を含む方法により、非経口投与することができる。特定の実施形態では、血管内投与に静脈内ボーラス、静脈内注射、動脈内ボーラス、動脈内注射、および血管系へのカテーテル点滴注入を含むことができ、他の実施形態では、組織周囲および組織内注射に網膜内注入、網膜下注入、および硝子体内を含むことができる。一定の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡをカテーテル、網膜ペレット剤、坐薬、多孔質物質を有するインプラント、非多孔質物質を有するインプラント、またはゼラチン様物質を有するインプラントによる投与を含む方法により、ドルーゼ形成部位またはその近傍に投与することができ、特定の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡを点眼または眼窩内注射により投与することができる。

本発明のさらなる実施形態には被験者の疾患を治療する方法を含み、前記被験者に補体経路タンパク質ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的な配列とを有するアンチセンスＲＮＡ鎖を有する、有効量の単離ｓｉＲＮＡを投与し、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成する工程と、前記ヒト補体系または補体系制御ｍＲＮＡを分解し、分解により前記ヒト補体系または補体系制御ｍＲＮＡの発現が阻害される工程を含む。様々な実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヒト古典経路、第２経路、およびレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、またはビトロネクチン、ヘパリン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができる。好適な実施形態では、前記ｓｉＲＮＡが、ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができ、ヒトＣ３タンパク質ＲＮＡは分解され、前記ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの分解によりヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの発現が阻害され、補体系反応の開始および／または急増が阻害される。

様々な実施形態において、前記疾患は黄斑変性症関連疾患、加齢黄斑疾患、ノースカロライナ型黄斑変性症、Ｓｏｒｓｂｙ'ｓ ｆｕｎｄｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、スタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ、糖尿病性網膜症、およびｍａｌａｔｔｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅから選択することができ、黄斑変性症関連疾患は網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体の変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、および錐体変性を含むことができる。特定の実施形態では、前記疾患を加齢黄斑変性症、または糖尿病性網膜症とすることができる。

一定の実施形態では、前記疾患を治療する方法が、さらに、ヒト補体系ｍＲＮＡまたは補体系制御ｍＲＮＡの発現レベルを、前記被験者の尿、血漿、血清、全血、または涙を用いて検出する方法を含むことができる。

本発明のさらなる実施形態には、被験者の少なくとも片方の眼に、補体経路タンパク質ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する、有効量の単離ｓｉＲＮＡを投与し、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成する工程と、前記ヒト補体系または補体系制御ｍＲＮＡを分解し、分解により前記ヒト補体系または補体系調節ｍＲＮＡの発現が阻害される工程を含む、ドルーゼ関連眼疾患を治療する方法を含む。様々な実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヒト古典経路、第２経路、およびレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、またはビトロネクチン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができる。好適な実施形態では、前記ｓｉＲＮＡが、ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖を含むことができ、ヒトＣ３タンパク質ＲＮＡは分解され、前記ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの分解によりヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの発現が阻害され、補体系反応の開始および／または急増が阻害される。

様々な実施形態において、前記眼疾患は黄斑変性症関連疾患、加齢黄斑疾患、ノースカロライナ型黄斑変性症、Ｓｏｒｓｂｙ'ｓ ｆｕｎｄｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、スタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ、糖尿病性網膜症、およびｍａｌａｔｔｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅの可能性があり、特定の実施形態では、前記疾患は加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症の可能性がある。

実施形態により、前記眼への投与は、局所、網膜内注入、網膜下注入、硝子体内注入、および眼窩内注入とすることができ、一部の実施形態では、前記眼への投与が点眼または眼窩内注入から選択される。

一定の実施形態では、前記センスＲＮＡ鎖は、配列ＩＤ番号：４３、配列ＩＤ番号：４５、配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番号：４９、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５３、および配列ＩＤ番号：５６から選択される配列に対応する配列を有することができ、特定の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡが、ジチミジン（ＴＴ）またはジウリジン（ｕｕ）から選択される第一の３'オーバーハングおよび／または第二の３'オーバーハングを有することができる。

本組成および方法について説明する前に、記載された特定の工程、組成、または方法論は変化する可能性があるため、本発明はこれらに限定されるものではないことは理解されるものとする。説明に使用される用語は特定の説明または実施形態のみを説明する目的で使用されており、添付の請求項によってのみ限定される、本発明の範囲を制限する意図はないことも理解されるものとする。他に定義のない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、当業者の１人に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明されたものと同一または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実施形態の実施または検証に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料が今回説明される。本明細書に記載されたすべての出版物は、参照によって完全に組み込まれる。本明細書中に、本発明が先願発明に基づき、そのような開示に先行する権利はないことの承認として解釈される事項はない。

本明細書および添付の請求項に用いる通り、内容ではっきりそうでないことを示していない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の言及も含むことにも注意する必要がある。従って、例えば、ａｎ「ｅｙｅ（眼）」の言及は、1若しくはそれ以上の眼および当業者に周知のその同等物などの言及である。

本明細書に用いる通り、「約」という用語は、使用される数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。従って、約５０％は４５〜５５％の範囲を意味する。

本明細書に使用する通り、「被験者」にはヒトまたはヒト以外の動物または哺乳類を含むことができる。好ましくは、前記被験者はヒトである。

治療と併せて使用される「投与する」は、標的組織に直接治療を施すこと、または患者に治療を施し、それによって前記治療が標的となる組織に肯定的な影響を及ぼすことを意味する。従って、本明細書に用いる通り、補体制御因子と併せて使用される場合の「投与する」という用語は、（これに限定されるものではないが）前記標的組織内またはその表面に補体制御因子を提供すること；例えば、静脈内注射により患者の全身に補体制御因子を提供することで、前記治療薬を前記標的組織に到達させること；そのコード化配列の形態で、前記標的組織に補体制御因子を提供すること（例えば、いわゆる遺伝子治療法）を含むことができる。組成を「投与すること」は、注射、局所投与、または他の既知の技術と併用する方法により達成することができる。

「改善する」という用語は、本発明により、本発明が提供、適用、または投与される組織の性状、形態、特徴、および／または物理的特性が変化することを伝えるために用いられる。形態の変化は、ドルーゼサイズの減少；視覚改善；ＲＰＥ血管新生の低下；惨出型（ｗｅｔ）および／または非惨出型（ｄｒｙ）ＡＭＤ関連症状の改善；ドルーゼ形成の遅延；および惨出型および／または非惨出型ＡＭＤの発症遅延の単独または組み合わせのいずれかにより証明することができる。

本明細書に用いる通り、「治療薬」という用語は、患者の望まない状態または疾患を治療、闘病、回復、予防、または改善させるために利用される薬物を意味する。一部、本発明の実施形態は前記眼の機能性改善に関する。これはドルーゼ形成およびＡＭＤによる障害に適用される。

組成の「治療有効量」または「有効量」は、望みの効果を達成するため、つまり、ドルーゼ形成を効果的に阻害、予防、または低下させ、惨出型および／または非惨出型ＡＭＤまたはその症状を治療するために計算された所定量である。本発明の補体制御因子の治療有効量は、典型的には、生理的に耐容性のある賦形剤組成と合わせて投与された場合、前記組織で効果的な局所濃度を達成する上で十分な量である。本発明の化合物の有効量は、視力改善、ドルーゼのサイズおよび数の低下、またはドルーゼ形成の遅延およびＡＭＤまたはＡＭＤ症状発症の遅延により測定することができる。

概して、「組織」という用語は、特定機能の遂行において一体となる、同様の特殊化した細胞の集合を指す。本明細書に用いる通り、他に指示がない限り、「組織」は（これに限定されるものではないが）前記眼の黄斑を含む組織を指す。例えば、前記黄斑は脈絡膜組織、ブルッフ膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、光受容細胞（桿体および錐体細胞）を有する。

本明細書に用いる通り、「アゴニスト」という用語は、遺伝子産物の産生または活性を向上またはアップレギュレート（例えば、増強または補充）させる物質である。アゴニストは、遺伝子産物、分子、または細胞と別の遺伝子産物、分子、または細胞との相互作用を高める化合物である可能性もあり、例えば、前記物質が遺伝子産物を別の相同的または非相同的遺伝子産物と置換するか、前記物質がその受容体に結合した遺伝子産物を置換することができる。一定の実施形態では、アゴニストは、遺伝子の上流領域への転写因子の結合または活性化を亢進または増強することで、前記遺伝子を活性化する化合物の場合もある。例えば、ＲＮＡまたはタンパク質合成を亢進するか、ＲＮＡまたはタンパク質の代謝回転を抑制する、または遺伝子産物の活性を活性化することで、遺伝子発現を活性化する物質は、前記遺伝子制御経路の上流に作用することで、前記物質が前記遺伝子または遺伝子産物に直接作用しようと、間接的に作用しようと、アゴニストの可能性がある。実施形態により、アゴニストの例はＲＮＡｓ、ペプチド、抗体、および小分子、またはその組み合わせが考えられる。

本明細書に用いる通り、「アンタゴニスト」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の産生または活性をダウンレギュレート、抑制、または阻害する物質である。例えば、アンタゴニストは遺伝子産物、分子、または細胞と別の遺伝子産物、分子、または細胞との相互作用を阻害または低下させる物質である可能性がある。一定の実施形態では、アゴニストは、遺伝子の上流領域への転写因子の結合または活性化を阻害または低下させることで、前記遺伝子の活性化を遮断する化合物の場合もある。遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を阻害する物質は、前記物質が例えば、前記遺伝子制御経路の上流に作用することで、前記遺伝子または遺伝子産物に直接作用しようと、間接的に作用しようと、アンタゴニストの可能性がある。アンタゴニストは、遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、例えばＲＮＡまたはタンパク質合成を抑制するか、ＲＮＡまたはタンパク質の代謝回転を亢進することで、存在する遺伝子産物の量を減少させる化合物である可能性もある。様々な実施形態において、アゴニストはＲＮＡｓ、ペプチド、抗体、および小分子、またはその組み合わせが考えられる。

「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、全型抗体およびその結合フラグメントを含むために使用される。典型的には、フラグメントが全型抗体と競合し、別の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む抗原フラグメントに対する特定の結合は、全型抗体に派生する。抗体フラグメントは、例えば、組み換えＤＮＡ技術、または全型免疫グロブリンの酵素的または化学的分離により、当該分野で既知の方法により作成することができる。「抗体」という用語は、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に結合するか、他のタンパク質との融合タンパク質として発現された１若しくはそれ以上の免疫グロブリン鎖も含む。「抗体」という用語は、特異性または二重特異性抗体を含み、特異性または二官能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖ペアと２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂフラグメントの結合を含む（これに限定されるものではないが）様々な方法により作成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ & Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照。

「アンチセンス分子」という用語には、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含み、特定タンパク質（例えば、補体経路分子）のｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列を標的として結合することができる、一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を有する。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得ることができるかについては、例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｌｍｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）に報告されている。

本明細書に用いる通り、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に「実質的に同一の」核酸配列は、前記標的配列と同一の核酸配列であるか、前記標的配列とは１若しくはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列である。標的配列と実質的に同一の核酸配列を有する本発明のセンス鎖は、そのようなセンス鎖を有するｓｉＲＮＡが、前記標的配列を含むｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解を誘導することで特徴付けられる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解が前記ｓｉＲＮＡで誘導される限り、標的配列とは１、２、または３若しくはそれ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列を有するセンス鎖を有することができる。

前記補体系は、正常な眼において常に低レベルで活性であり、眼内補体制御タンパク質で綿密に制御されている。正常なヒト眼の硝子体および房水は、ＭＣＰ、ＤＡＦ、およびＣＤ５９の可溶型を含む。ＭＣＰはβ１インテグリンと相互作用すると考えられ、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の基底膜およびブルッフ膜への接着に関与すると考えられている。ビトロネクチンは光受容体で産生され、網膜のＲＮＡは平均すると、肝臓で測定された値の約５０％である。Ｃ３およびＣ５のメッセージはＲＰＥで同定され、Ｃ３、Ｃ５、およびＣ９転写産物は神経網膜および／または脈絡膜で検出された。培養されたＲＰＥ細胞のＣ５ ｍＲＮＡ値は肝臓由来の細胞で認められた値とほぼ同等であり、ヒト肝臓Ｃ５ ｍＲＮＡの約６０％であることから、おそらく前記ＲＰＥがＣ５の主な供給源であることを示唆している。

補体成分および制御因子も、ドルーゼに限局していた。ドルーゼは、前記ＲＰＥの基底膜とブルッフ膜の内部コラーゲン層との間にある、細胞外物質の限局的沈着である。これが眼にあるということは、惨出型および非惨出型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の重要なリスクファクターおよび指標である。ドルーゼは、脂質、炭水化物、タンパク質、および細胞成分から成り、ＲＰＥ由来である可能性が最も高い。ドルーゼの免疫組織化学分析では、ビトロネクチン、クラスタリン、ＩｇＧ、ＭＡＣ、Ｃ５、ＭＣＰ、およびＣＲ１の存在が明らかとなった。さらに、Ｃ３／Ｃ３ｄおよび前記Ｃ３活性化フラグメント（Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ）に対して産生された抗体により、強固な標識化が観察された。

同様に、ドルーゼ周囲の組織も補体因子に対する免疫反応性を示した。Ｃ５、ＩｇＧ、ビトロネクチン、クラスタリン、ＭＡＣの成分、およびＭＣＰは、ドルーゼに近接するＲＰＥ細胞に限局していた。さらに、抗Ｃ３抗体により、強い脈絡膜の免疫染色が観察されたが、残りの脈絡膜では標識化はほとんど認められなかった。さらに、補体活性化部位に沈着することが多い未知の構造も、Ｃ３のタンパク質分解フラグメントに強い免疫反応性を示した。これらの構造は、細胞溶解を受けたＲＰＥ細胞が変性したことによる残留片であることが示唆された。

この仮説は、さらに動物研究で支持されている。マウスの単球走化性タンパク質（Ｃｃｌ−２、ＭＣＰ−１）またはその同種Ｃ−Ｃケモカイン受容体−２（Ｃｃｒ−２）が欠乏すると、ＲＰＥにリポフスチンが生成され、ＲＰＥ下のドルーゼ、光受容体退化、および脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が発生する。さらに、ＲＰＥおよび脈絡膜に補体およびＩｇＧの沈着が認められ、免疫成分が前記ＡＭＤの表現型に関与していることが示唆される。

レーザーにより誘導したＣＮＶのマウスモデルにおいて、補体の役割が検討された。Ｃ５７ＢＬマウスのレーザー光凝固により、ドルーゼ形成部位にＣ３およびＭＡＣが沈着した。対照的に、レーザー光凝固はＣ３欠乏マウスのＣＮＶを誘導するか、ＭＡＣを沈着させることはなかった。抗Ｃ６ポリクローナル抗体の全身投与は、レーザースポット部位のＣＮＶ発生およびＭＡＣ沈着を有意に抑制した。さらに、Ｃ５７ＢＬマウスでコブラ毒因子（ＣＶＦ）により全身的に補体を枯渇させ、レーザーで治療した場合、前記レーザースポットにＣ３またはＭＡＣの免疫反応性は観察されず、ＣＮＶの発生は有意に減少した。ＣＶＦは、Ｃ３ｂと機能的に似ており、ファクターＢと結合してＣ３およびＣ５転換酵素のＣＶＦＢｂを形成する、Ｃ３の構造類似体である。ＣＶＦはファクターＨおよびＩによる不活性化に耐性を示す。結果として、Ｃ３およびＣ５は、前記補体系が完全になくなるまで、持続的に加水分解される。これらの所見は、マウスのレーザーで誘導されたＣＮＶの発生には補体の活性化が必要であり、ＡＭＤにおけるＣＮＶの発生にも必要と考えられることを示唆している。

実際、ファクターＨの変異（Ｙ４０２Ｈ）はＡＭＤの発症と有意に関連していることが確認された。この変異はヘパリンとファクターＨのＣ反応性タンパク質結合部位に位置し、早期ＡＭＤおよびＣＮＶいずれの場合も関連性は顕著である。この変異は前記タンパク質の挙動を変化させ、タンパク質はもはや前記補体経路を制御できなくなる。例えば、結合能力が変化すると、微生物または補体フラグメントＣ３ｂと適切に相互作用することができなくなり、この機能障害は最終的に局所の組織損傷につながることがある。Ｙ４０２Ｈ変異に加え、他に少なくとも７種類のファクターＨ変異体がＡＭＤに関連していた。

ＡＭＤ患者の組織を染色することで、ドルーゼ内、ＲＰＥ下腔、および脈絡膜毛細血管周辺でファクターＨの強く、特異的な免疫反応性が明らかとなり、前記黄斑で最も顕著であった。黄斑でのファクターＨの分布はＭＡＣの分布と関連していた。ある場合は、前記ドルーゼ内の部分構造要素も抗Ｃ３フラグメント抗体と反応した。ファクターＨおよびＣ５ｂ−９の免疫反応性が前記黄斑外にあることは少なく、５０歳未満でＡＭＤのない患者のＲＰＥまたは脈絡膜では、Ｃ５ｂ−９免疫反応性は非常に少ないか、全くなかった。ＡＭＤの有無に関わらず、ドナーの眼に由来する単離されたばかりのＲＰＥおよびＲＰＥ／脈絡膜複合体のｍＲＮＡを分析すると、ファクターＨおよびその短縮されたイソ型が肝臓に近いレベルでＲＰＥに豊富に発現されていることが明らかとなったが、神経網膜ではそのような事実は明らかとならなかった。

最近のファクターＨに関する所見は、ＡＭＤについていくつか確立されたリスクファクターの役割に対する見識を与えている。例えば、肺炎クラミジア感染とＡＭＤとの間には強い関連性があることが報告されている。この病原体はＡＭＤのため外科的に眼から切除された新生血管組織で同定され、感染が確立した血管組織に高い親和性を有する。補体を制御できないシナリオでは、そのような病原体が慢性炎症を刺激し、最終的に組織を損傷させる。

もう一つのＡＭＤリスクは喫煙である。喫煙は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣ３を修飾し、前記第２経路を活性化させる可能性がある。そのため、機能的ファクターＨがあると、喫煙により補体の活性化が制御されなくなる可能性がある。興味深いことに、ＡＭＤ様の表現型でファクターＨの欠乏により生じる別の疾患もある。ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮＩＩ）もファクターＨの点突然変異により引き起こされる可能性があり、重度糸球体腎炎および早発型ドルーゼ形成が生じる。前記ドルーゼは、ＡＭＤで認められるドルーゼと構造的および組成的に区別することができない。

本発明の観点には、前記補体経路の活性化を制御することにより、疾患を治療または予防する組成および方法を含む。一部の実施形態では、前記疾患が眼疾患であり、特定の実施形態では、前記疾患が例えば、加齢黄斑疾患（ＡＭＤ）、ノースカロライナ型黄斑変性症、Ｓｏｒｓｂｙ'ｓ ｆｕｎｄｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、スタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ、糖尿病性網膜症、およびｍａｌａｔｔｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅを含む黄斑変性関連疾患である。他の疾患または病状には、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体の変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、および錐体変性を含む。

本発明の１つの実施形態では、黄斑変性関連疾患に罹患したか、発症するリスクのある被験者において、黄斑変性を治療、またはその発症を予防する方法を提供する。そのような方法には、少なくとも１種類の補体経路関連分子の活性、または前記補体経路を介した細胞活動を調節する、有効量の治療薬を前記被験者に投与する工程を含むことができる。前記方法に関する実施形態では、前記被験者が黄斑変性関連疾患を有し、または前記被験者が黄斑変性関連疾患を発症するリスクがある。一部の実施形態では、前記被験者に黄斑変性関連疾患以外の補体関連疾患がない。

前記方法に関する実施形態では、前記治療薬が、補体経路関連分子または前記補体経路関連分子の上流制御因子の濃度を調節することで、前記補体経路関連分子の活性を調節することができ、一定の実施形態では、前記治療薬が前記補体経路関連分子のタンパク質濃度を調節することができる。実施形態の方法を利用して調節可能な補体経路関連分子の限定されない例には、アナフィラトキシンＣ３ａ、アナフィラトキシンＣ５ａ、Ｃ６、クラスタリン、ハプトグロブリン、Ｉｇκ鎖、Ｉｇλ鎖、またはＩｇγ鎖を含む。他の実施形態では、前記治療薬が補体タンパク質または補体経路関連分子の酵素活性を調節することができる。例えば、前記治療薬は、Ｃ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの触媒作用または変換、Ｃ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの変換、またはファクターＢのＢａおよびＢｂへの切断を調節することができる。

一部の実施形態では、前記方法がさらに、前記治療薬により調節された補体経路関連分子の濃度を検出する工程を含み、補体経路関連分子の濃度は前記治療薬の投与前、投与中、または投与後に決定することができる。補体経路関連分子の濃度は当該分野で既知のいかなる方法によっても検出することができ、例えば、前記濃度は前記被験者の尿、血漿、血清、全血、または涙などの体液から決定することができる。

様々な実施形態の治療薬には、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、およびｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチドを含む（これに限定されるものではないが）すべての物質、分子、成分、化合物、実在物、またはその組み合わせを含むことができる。前記物質は、天然物、合成化合物、または化学化合物、または２若しくはそれ以上の物質の組み合わせとすることもできる。

好適な実施形態では、古典経路、第２経路、またはレクチン経路の補体タンパク質ｍＲＮＡを標的とする単離ｓｉＲＮＡを治療薬とし、それを必要とする患者に提供することができる。例えば、実施形態によっては、ｓｉＲＮＡを不適切な補体活性化が関与する疾患の症状を示す患者に投与することができ、補体活性化を阻害するために使用することもできる。特に、標的とすることができる補体タンパク質は、（これに限定されるものではないが）例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、およびビトロネクチン、ヘパリン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦが標的とされるような、細胞表面のＭＡＣ形成を調節するタンパク質など、古典経路、第２経路、またはレクチン補体経路タンパク質を含む。好適な実施形態では、Ｃ３、Ｃ５、およびビトロネクチンが標的とされ、好ましくはＣ３である。

従って、本発明の実施形態は、ヒト補体系ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡと実質的に同一の配列と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むセンスＲＮＡ鎖を有する単離ｓｉＲＮＡに関する。好適な実施形態では、前記センスＲＮＡ鎖が実質的にＣ３ ｍＲＮＡと同一と考えられる。

理論に固執することは望まないが、本発明のｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡｓのＲＮＡｉを介した分解を引き起こし、それによって当該標的補体タンパク質の産生を抑制または停止させる。例えば、Ｃ３はＣ３Ｃ５転換酵素の形成およびその後のＣ５活性化に必要であり、Ｃ５活性化はＭＡＣ形成を開始するために必要であるため、Ｃ３またはＣ５ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡを介した分解はＭＡＣ形成および補体系活性を阻害する可能性がある。同様に、ビトロネクチンの不活性化は、ドルーゼ形成を予防または改善するＲＰＥの表面で、ＭＡＣ形成を阻害する可能性がある。

本明細書に用いる通り、「標的ｍＲＮＡ」は、特異的ｓｉＲＮＡ分子を排除するようにデザインされたメッセンジャーＲＮＡを意味する。本発明の実施形態の例として、前記標的ｍＲＮＡは例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、およびビトロネクチン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦなどの細胞表面のＭＡＣ形成を調節するタンパク質など、古典経路、第２経路、またはレクチン補体経路タンパク質などのヒトタンパク質とすることができ、古典経路、第２経路、またはレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、およびビトロネクチン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦなどの細胞表面でＭＡＣ形成を調節するタンパク質を含む（これに限定されるものではないが）遺伝子の変異型または代わりのスプライス型とすることができる。

本明細書に用いる通り、ヒト遺伝子の「同種」遺伝子またはｍＲＮＡは、前記ヒト遺伝子と相同的な別の哺乳類種の遺伝子またはｍＲＮＡとする。例えば、前記同種Ｃ５ヒトｍＲＮＡはマウスのＣ５ｍＲＮＡとすることができる。

本明細書に用いる通り、「単離」はヒトの介入により天然の状態から変化または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に存在するｓｉＲＮＡは「単離」されていないが、合成ｓｉＲＮＡまたは天然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離されたｓｉＲＮＡは「単離」されている。単離ｓｉＲＮＡは実質的に純粋な形態で存在することができ、または例えば前記ｓｉＲＮＡが送達された細胞など、非天然の環境で存在することができる。

実施形態により、本発明は約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド長、一部の実施形態では、約１９〜約２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを有し、特定のｍＲＮＡを標的とする単離ｓｉＲＮＡを提供する。一般にｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン・クリックの塩基対相互作用（以下「塩基対」）によりアニーリングするセンスＲＮＡ鎖と、実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むことができる。以下にさらに詳細を説明する通り、前記センス鎖には前記標的ｍＲＮＡ内に含まれる配列と同一またはほぼ同一の核酸配列を含むことができる。

従って、本発明の実施形態は、ヒト補体系ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの１９〜２５隣接ヌクレオチドと実質的に同一の配列と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むセンスＲＮＡ鎖を有する単離ｓｉＲＮＡに関する。好適な実施形態では、前記センスＲＮＡ鎖がヒトＣ３ ｍＲＮＡの１９〜２５隣接ヌクレオチドと実質的に同一と考えられる。

本ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は２つの別の相補的一本鎖ＲＮＡ分子から成り、または２種類の相補的部分が塩基対となり、一本鎖「ヘアピン」部分で共有結合している単一の分子を含むことができる。いかなる理論に固執することも望まないが、後者のｓｉＲＮＡのヘアピンは「ダイサー」タンパク質（またはそれに相当する分子）により細胞内で切断され、２つの個別の塩基対ＲＮＡ分子によりｓｉＲＮＡを形成することができる。

本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組み換え技術によって作られたＲＮＡ、および１若しくはそれ以上のヌクレオチドを付加、欠失、置換、および／または改変させることで天然型ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを有することができる。そのような改変には、非ヌクレオチド物質を、前記ｓｉＲＮＡの１若しくはそれ以上の末端、または前記ｓｉＲＮＡの１若しくはそれ以上の内部ヌクレオチドなどに付加する工程を含むことができる。そのような改変には、（これに限定されるものではないが）前記ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾を含むことができる。

本発明の前記ｓｉＲＮＡの一本鎖または二本鎖とも３'オーバーハングとすることもできる。本明細書に用いる通り、「３'オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸長するリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはその組み合わせを含む、対になっていない少なくとも１つのヌクレオチドを指す。例えば、１実施形態では、補体ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡに、１〜約６ヌクレオチドまたは１〜約５ヌクレオチド長の少なくとも１つの３'オーバーハングを含むことができる。一部の実施形態では、前記オーバーハングを１〜約４ヌクレオチド長とし、少なくとも１つの実施形態では、前記オーバーハングを約２〜約４ヌクレオチド長とすることができる。さらに他の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡ分子の両鎖が３'オーバーハングを有する。その長さは、各鎖同一のこともあれば、異なることもある。さらに他の実施形態では、前記３'オーバーハングが前記ｓｉＲＮＡの両鎖にあり、２ヌクレオチド長とすることができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各鎖はジチミジン（「ＴＴ」）またはジウリジン（「ｕｕ」）の３'オーバーハングを有することができる。

従って、本発明の実施形態は、ヒト補体系ｍＲＮＡまたは補体系制御タンパク質ｍＲＮＡの１９〜２５隣接ヌクレオチドと実質的に同一の配列と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを含むセンスＲＮＡ鎖を有する単離ｓｉＲＮＡに関し、前記センスＲＮＡ鎖および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖は３'オーバーハングを有する。好適な実施形態では、前記センスＲＮＡ鎖が、ヒトＣ３ ｍＲＮＡの１９〜２５隣接ヌクレオチドおよび３'オーバーハングを有する前記センスＲＮＡ鎖および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖と実質的に同一である。特に好適な実施形態では、前記ｓｉＲＮＡがヒトＣ３ ｍＲＮＡと実質的に同一のセンスＲＮＡ鎖を有し、前記センスＲＮＡ鎖および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖が２ヌクレオチドの３'オーバーハングを有し、前記ヌクレオチドがそれぞれデオキシチミジンまたはデオキシウリジンである。

本ｓｉＲＮＡの安定性を向上させるため、前記３'オーバーハングを分解に対して安定化させることができる。１実施形態では、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことで、前記オーバーハングが安定化されている。代わりに、例えば、前記３'オーバーハングのウリジンヌクレオチドと２'−デオキシチミジンとの置換など、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換は耐容性を示し、ＲＮＡｉの分解効率に影響しなかった。特に、２'−デオキシチミジンの２'ヒドロキシルがないと、組織培地中で前記３'オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が有意に高まる。

一定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡに配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮＡ（Ｎ２１）を含み、Ｎはヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは約３０〜７０％のＧ／Ｃを含み、好ましくは約５０％のＧ／Ｃを有する。前記センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、それぞれ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１（つまり、３〜２３の位置）に対応する。後者の場合、前記センスｓｉＲＮＡの３'末端はＴＴに変換される。この配列変換の理論的根拠は、前記センスおよびアンチセンス鎖の３'オーバーハングの配列組成について、対称的な二本鎖を形成することである。次に、前記アンチセンスＲＮＡ鎖が、前記センス鎖の１〜２１位を補完するものとして合成される。

これらの実施形態の２３ｎｔセンス鎖の１位はそのアンチセンス鎖により配列特異的に認識されない可能性があるため、前記アンチセンス鎖の３'末端のヌクレオチド残基は意図的に選択することができる。しかし、（いずれかの実施形態で２３ｎｔセンス鎖の２位に相補的な）前記センス鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、標的配列に相補的と考えられる。

別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡが配列ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮを含み、Ｒはプリン（例えば、ＡまたはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えば、ＣまたはＵ／Ｔ）である。従って、本実施形態のそれぞれの２１ｎｔセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖は、プリンヌクレオチドで始まることが多い。そのようなｓｉＲＮＡは、標的部位を変えずにｐｏｌ ＩＩＩ発現ベクターから発現させることはできず、これは、最初に転写されたヌクレオチドがプリンの場合、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡｓの発現が効率的としか考えられないためである。

本発明のｓｉＲＮＡは、前記標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のいずれかの約１９〜２５隣接ヌクレオチドをすべて標的とすることができる。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技術は、例えば、２００４年５月６日に改訂されたＴｕｓｃｈｌ Ｔらの「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」に示されており、その全開示が本明細書に参照として組み込まれている。「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ １０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙのＤｒ． Ｔｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌが管理するウェブサイトにて、ワールドワイドウェブで閲覧可能であり、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトにアクセスするか、「ｓｉＲＮＡ」をキーワードとして検索することで見つけることができる。従って、本ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、前記標的ｍＲＮＡの約１９〜２５ヌクレオチドの隣接ストレッチと同一のヌクレオチド配列を有する。

前記標的ｍＲＮＡの標的配列は、前記標的ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡ配列から選択することができ、好ましくは開始コドンの下流（つまり、３'方向の）５０〜１００ｎｔに始まる。ただし、前記標的配列は、５'または３'の非翻訳領域、または前記開始コドン付近の領域に位置する可能性がある。例えば、表１の標的配列の配列ＩＤ番号：１〜２６および５７は、ヒトＣ３ ｃＤＮＡの配列ＩＤ番号：４の５'末端１００ｎｔ以内にあり、標的配列の配列ＩＤ番号：２７〜４１および対応するｓｉＲＮＡ配列の配列ＩＤ番号：４２〜５６に対応する。

ヒト補体系タンパク質のスプライス変異はファクターＣ２およびＭＡＣについて同定されており、エキソンのスプライシングエンハンサーが同定された。まだ同定されていない補体系タンパク質のスプライス変異体として、これらを標的とするｓｉＲＮＡは、本発明に含まれる。

代わりに、ヒト補体系タンパク質のスプライス変異は、例えば「ＲＮＡ分解酵素保護」と呼ばれる技術により、当該分野で既知の通り、同定することができる。ＲＮＡ分解酵素保護には遺伝子配列の合成ＲＮＡへの転写が関与し、合成ＲＮＡは他の細胞、例えば補体活性化部位またはその近傍の組織細胞由来のＲＮＡにハイブリダイズされる。次に、ハイブリダイズしたＲＮＡはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのミスマッチを認識する酵素とインキュベートする。予想フラグメントより小さい場合は、代わりにスプライスされたｍＲＮＡｓがあることを示す。実施形態により、代わりにスプライスされたと推定されるｍＲＮＡｓを当業者に周知でｓｉＲＮＡの作成に使用できる方法によりクローニングし、配列を決定する。

代わりにスプライスされた補体経路タンパク質をＲＴ−ＰＣＲにより同定することができる。ＲＴ−ＰＣＲでは、罹患組織のｍＲＮＡは、例えば酵素である逆転写酵素を用いる当業者に周知の方法により、ｃＤＮＡに変換される。前記ｃＤＮＡの全コード化配列は、３'非翻訳領域に位置するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよび３'非翻訳領域に位置するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを用い、ＰＣＲにより増幅することができる。増幅生成物は、例えば前記増幅生成物のサイズを正常なスプライスされたｍＲＮＡの予想生成物のサイズと、例えばアガロースゲル電気泳動により比較することで、別のスプライス型を分析することができる。前記増幅生成物のサイズに変化があれば、別のスプライシングを示している可能性がある。代わりにスプライスされた変異体の配列を決定し、ｓｉＲＮＡの作成に使用することができる。

突然変異遺伝子から生成したｍＲＮＡも、別のスプライス型を同定する前述の技術により同定することができる。本明細書に用いる通り、「突然変異」補体経路タンパク質は、例えば配列ＩＤ番号１〜２６および５７で１若しくはそれ以上の塩基対が本明細書に説明される補体経路タンパク質の配列と異なる配列を有する遺伝子から作成される。従って、これらの遺伝子の対立遺伝子型、およびそこから作成されたｍＲＮＡは、本明細書の目的で「変異体」と考えられる。

所定の疾患の遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含むデータベースを用い、別のスプライス型または変異型ｍＲＮＡｓを同定することができる。例えば、有用なデータベースにはＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｍｂａｓｅ、およびＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースを含む。前記ＣＧＡＰデータベースには例えば、様々なタイプのヒト癌の発現配列タグ（ＥＳＴｓ）を含む。古典経路、第２経路、およびレクチン補体経路タンパク質のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ファクターＢ、ファクターＤ、ファクターＨ、ファクターＩ、およびビトロネクチン、クラスタリン、Ｃ４ｂＢＰ、ＭＣＰ、およびＤＡＦ遺伝子などの細胞表面でＭＡＣ形成を調節するタンパク質を含む（これに限定されるものではないが）ｍＲＮＡまたは遺伝子配列を用い、上記データベースに問い合わせ、代わりにスプライスされたｍＲＮＡｓを示すＥＳＴｓにこれらの遺伝子が認められるか否かを決定することができる。

本発明のｓｉＲＮＡは、化学合成または組み換え技術を用いる方法を含む（これに限定されるものではないが）当業者に既知の多数の技術により得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、その全開示が本明細書に参考として組み込まれている、Ｔｕｓｃｈｌらの米国で公開された出願第２００２／００８６３５６号に説明されるショウジョウバエのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を用いて作成することができ、または、ｓｉＲＮＡを適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用い、化学的に合成することができる。実施形態により、ｓｉＲＮＡは合成後に合わせる２つの別の相補的ＲＮＡ分子として合成することができ、またはそれ自体に結合し「ヘアピン」構造を形成することができる、２つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子を合成することもできる。合成ＲＮＡ分子または市販の合成試薬も、本発明の実施形態に含まれる。

代わりに、適切なプロモーターを用い、組み換え環状または直鎖ＤＮＡプラスミドからｓｉＲＮＡを発現させることができる。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現させるため適したプロモーターは当該分野で周知であり、例えばＵ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含むことができる。他の適したプロモーターを選択することも、当該分野の技術の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現させる誘導または制御可能なプロモーターを含むことができる。

組み換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的な技術により培養細胞発現系から単離するか、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて眼またはその近傍、眼腔またはその近傍、またはドルーゼ形成部位またはその近傍などの罹患組織で細胞内に発現させることができる。本発明のｓｉＲＮＡを送達する組み換えプラスミドをｉｎ ｖｉｖｏで細胞に使用する方法は、以下にさらに詳細に考察されている。様々な実施形態において、単一のｓｉＲＮＡは、２つの別の相補的ＲＮＡ分子または２つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子として組み換えプラスミドから発現させることができる。

本発明のｓｉＲＮＡ発現に適したプラスミドの選択、前記プラスミドに前記ｓｉＲＮＡを発現させる核酸配列を挿入する方法、および組み換えプラスミドを対象細胞に送達する方法は実施形態により異なり、当該分野で既知であるか、後に開発されたあらゆるプラスミドから選択可能である。例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれているＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ Ｔ Ｒ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｌｅｅ Ｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５；およびＰａｕｌ Ｃ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８を参照。

本明細書に用いる通り、「ｐｏｌｙＴ終止配列に実現可能な関連がある」は、前記センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が５'方向のｐｏｌｙＴ終止シグナルと直接隣接していることを意味する。前記プラスミドのセンスまたはアンチセンス配列の転写中、前記ｐｏｌｙＴ終止シグナルは転写を中止させるように作用する。

本明細書に使用する通り、プロモーターの「コントロールされている」は、前記センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列は前記プロモーターの３'に位置し、前記プロモーターが前記センスまたはアンチセンスコード配列の転写を開始できるようになっていることを意味する。

実施形態によっては、組み換えウイルスベクターが本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列、前記ｓｉＲＮＡ配列を発現させる上で適切なプロモーター、例えばｐｏｌｙＴ終止シグナルなどの当該分野で既知の終止シグナルを含むことがある。他の適切なプロモーターの選択は当該分野の技術の範囲内であり、適切なプロモーターには例えば、前記Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列または前記サイトメガロウイルスプロモーターを含むことができる。一部の実施形態では、組み換えウイルスベクターに、特定の組織に、特定の細胞内環境で、または特定の細胞内または細胞外シグナルに反応して前記ｓｉＲＮＡを発現させる誘導または制御可能なプロモーターを含むことができる。本発明のｓｉＲＮＡは、２つの別の相補的ＲＮＡ分子または２つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子として、組み換えウイルスベクターから発現させることができる。

本発明での使用に適した組み換えウイルスベクターの選択、前記ベクターに前記ｓｉＲＮＡを発現させる核酸配列を挿入する方法、および前記ウイルスベクターを対象細胞に送達させる方法は当該分野の技術の範囲内である。例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれているＤｏｍｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０を参照。

前記ｓｉＲＮＡ分子で発現されるコード配列を受け入れることのできるすべてのウイルスベクターを使用することができ、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクターが使用できる。前記ウイルスベクターの向性は、他のウイルスのエンベロープタンパク質または他の表面抗原により前記ベクターの偽型を作成することで修正することもできる。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどの表面タンパク質により偽型を作成することができる。様々な実施形態において、ウイルスベクターはＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。特定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡが、例えば前記Ｕ６またはＨＩ ＲＮＡプロモーター、または前記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組み換えＡＡＶベクターの別の相補的単鎖ＲＮＡ分子２本として発現される。

ｓｉＲＮＡを発現させ、組み換えウイルスベクターを構築し、ウイルスベクターを標的細胞に送達させる方法は当該分野で既知である。例えば、前記ｓｉＲＮＡを発現させる適切なＡＶベクター、前記組み換えＡＶベクターを構築する方法、および前記ベクターを標的細胞に送達させる方法は、全開示が参照により本明細書に組み込まれているＸｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に報告されており、本発明のｓｉＲＮＡを発現させるために適したＡＡＶベクター、前記組み換えＡＶベクターを構築する方法、および前記ベクターを標的細胞に送達させるために適したＡＡＶベクターは、全開示が参照により本明細書に組み込まれているＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許出願第５，２５２，４７９号明細書；米国特許出願第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願第ＷＯ ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ ９３／２４６４１号に報告されている。

一部の実施形態では、所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡが前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解を生じる能力は、細胞内のＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する標準的な方法により評価することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、培養細胞に送達させることができ、標的ｍＲＮＡ値はノーザンブロットまたはドットブロット法、または定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定することができる。代わりに、補体経路タンパク質または前記培養細胞で調節したタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにより測定することができる。

他の実施形態では、所定の標的配列を含むｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解を動物モデルで評価することもできる。例えば、ＡＭＤを治療する特異的ｓｉＲＮＡの効果をＣＮＶマウスモデルにより評価し、ｓｉＲＮＡの投与前後でＣＮＶマウスの黄斑損傷部位を測定することができる。前記ｓｉＲＮＡ投与時にこれらのモデルの補体活性化が抑制されたことは、前記標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションまたは前記黄斑損傷が改善されたことを示している。

前述の通り、本発明のｓｉＲＮＡは、補体経路ｍＲＮＡまたは補体系活性化ｍＲＮＡのモジュレーター、または別のスプライス型、変異体、またはその同種体のＲＮＡｉを介した分解を標的とし、引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる前記標的ｍＲＮＡの分解は、補体経路タンパク質、または前記細胞表面の補体系活性化を調節するタンパク質からの機能的遺伝子産物の産生を抑制することがある。従って、本発明は、被験者において補体経路タンパク質、または前記細胞表面の補体系活性化を調節するタンパク質の発現を阻害する方法を提供し、前記本発明のｓｉＲＮＡは前記標的ｍＲＮＡが分解されるような有効量で被験者に投与される。前記補体経路の生成物、または前記補体系遺伝子のモジュレーターは補体系活性化の開始に必要なため、本発明では、本発明のｓｉＲＮＡを用い、前記標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解により、被験者の補体系活性化を阻害方法も提供する。

補体系活性化の阻害は、例えば、被験者のＡＭＤ関連ドルーゼ形成の進行を直接測定することで評価することができ、例えば、ドルーゼは、本発明のｓｉＲＮＡの投与前後に検眼鏡検査を行うか、または前記ドルーゼ中の多数の補体タンパク質を観察することで観察することができる。前記ドルーゼ中の補体タンパク質数が同じままであるか、減少するか、遅れた場合、ドルーゼ形成の阻害が示される。被験者の組織サンプル中の補体タンパク質数を観察および測定する方法は、上述の通り当該分野の範囲内であり、例えば、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解は、上述のｍＲＮＡまたはタンパク質を単離および定量化する標準的な方法により、被験者の細胞中の標的ｍＲＮＡまたはタンパク質値を測定することにより、検出することができる。補体系活性化の阻害も、補体系活性化が制御されていないことに伴う病状の変化または回復を観察することで推察することができる。例えば、ＡＭＤでは、失明の鈍化、停止、または回復は、脈絡膜中のドルーゼ形成が阻害されたことを示している。

前記ｓｉＲＮＡは亜化学量論的量（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｍｏｕｎｔ）で前記標的ｍＲＮＡを分解することができる（またそのため、補体系活性化を阻害することができる）ことは理解される。理論に固執することは望まないが、本発明のｓｉＲＮＡは触媒的に前記標的ｍＲＮＡを分解すると考えられている。従って、標準的な抗補体系療法と比べ、治療効果を得るために補体系活性化が制御されていない部位またはその近傍に送達させる必要のあるｓｉＲＮＡは有意に少ない。

実施形態によっては、単離ｓｉＲＮＡが有効量で被験者に投与される。当業者は、所定の被験者に投与すべき本発明のｓｉＲＮＡの有効量を、前記被験者のサイズおよび体重；補体系活性化または疾患浸透の程度；前記被験者の年齢、健康状態、および性別；投与経路；および前記投与が局所的か全身的かなどの要因を考慮することで容易に決定することができる。一般に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、補体系活性化が制御されていない部位またはその近傍の細胞間濃度として約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、または約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇが有効量の場合もある。ただし、一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの量が前後して投与されることもある。

一部の実施形態において、本発明の方法を利用し、前記被験者における正常なプロセスによる補体系の活性化など、非病原性の補体系活性化の構築を阻害することができる。非病原性の補体系活性化の例には、細菌およびウイルスに対する非抗原特異的免疫反応を含む。従って、本発明は、臓器移植、異種移植、およびＭＩに関連する免疫反応を調節するため、非病原性の補体系活性化を阻害する方法を提供する。他の実施形態では、本発明の方法を利用し、例えば、自己免疫疾患に関連した制御されていない補体系活性化など、補体系活性化が不適切であるか、制御されていないことにより病原性が伴う疾患において、補体活性化を阻害することができる。他の補体系が制御されていない疾患には、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、敗血症、免疫複合体病、炎症、肺および肝線維症、喘息、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、アルツハイマー病を含む。これらの疾患は、補体活性化が制御されていないことによる正常組織の破壊によって特徴付けられる。例えば、ＡＭＤでは、脈絡膜がＲＰＥのドルーゼによって侵入および破壊されることで患者の視力が阻害され、ＡＭＤの脈絡膜がドルーゼにより破壊されると、最終的には部分的または完全に失明する。従って、一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡを利用し、ＡＭＤのドルーゼ形成を阻害することができる。

補体系関連疾患を治療するため、本発明のｓｉＲＮＡは本ｓｉＲＮＡとは異なる医薬品と併用し、被験者に投与することができる。代わりに、本発明のｓｉＲＮＡは、前記補体系関連疾患を治療するために設計された別の治療法と併用し、被験者に投与することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、自己免疫疾患を治療するために現在採用されている治療法と併用して投与することができる（例えば、Ｃ１ ＩＮＨ）。

実施形態によっては、本発明のｓｉＲＮＡを裸のｓｉＲＮＡとして、導入試薬と併用し、または前記ｓｉＲＮＡを発現した組み換えプラスミドまたはウイルスベクターとして、被験者に投与することができる。本ｓｉＲＮＡとの併用投与に適した導入試薬には、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；またはポリカチオン（例えば、ポリリシン）、またはリポソームを含む。特定の実施形態では、前記導入試薬はリポソームである。

リポソームは、網膜または罹患した組織などの特定組織への前記ｓｉＲＮＡの送達を助けることができ、前記ｓｉＲＮＡの血中半減期を増加させることができる。本発明での使用に適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質を用いて形成することができ、これには中性または負に帯電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含むことができる。脂質の選択は、血流中での望みのリポソームサイズおよび前記リポソームの半減期などの因子を考慮することで誘導することができる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；および米国特許第４，２３５，８７１号明細書、第４，５０１，７２８号明細書、第４，８３７，０２８号明細書、および第５，０１９，３６９号明細書に報告されている通り、リポソームの調整については様々な方法が既知であり、その全開示は参照として本明細書に組み込まれている。

一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームはさらに、前記リポソームの標的を補体系活性化部位またはその近傍の特定細胞または組織にすることができるリガンド分子を含む。リガンドには、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原に結合する抗体など、腫瘍または血管内皮細胞に多くみられる受容体に結合するタンパク質を含むこともある。

他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームを修飾し、単核マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避することができる。例えば、実施形態によっては、前記リポソームが前記リポソーム表面に結合するオプソニン化阻害部分を含むことができる。前記リポソームの調整に用いるオプソニン化阻害部分は、典型的には、前記リポソームの膜に結合する大きな親水性ポリマーである。本明細書に用いる通り、オプソニン化阻害部分は、例えば前記膜自体に脂溶性のアンカーがインターカレーションすることで、または膜脂質の活性基に直接結合することで、前記膜に化学的または物理的に結合した場合、リポソーム膜に「結合」している。その全開示が参照として本明細書に組み込まれている米国特許第４，９２０，０１６号明細書に報告されている通り、これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に減少させる保護表層を形成する。リポソームの修飾に適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖、分岐鎖、または樹状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合した、ポリビニルアルコールおよびポリキシリトールなどのポリアルコール、およびガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドを含む。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧ、またはその誘導体も適している。さらに、前記オプソニン化阻害ポリマーはＰＥＧのブロックコポリマーとするか、ポリアミノ酸、ポリサッカライド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドとすることができる。前記オプソニン化阻害ポリマーは、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナンなどのアミノ酸またはカルボン酸を含む天然ポリサッカライド；積層ポリサッカライドまたはオリゴサッカライド（直鎖または分岐鎖）；または例えば、炭酸誘導体と反応し、カルボン酸基の結合が生じるカルボキシル化ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドとすることもできる。特定の実施形態では、前記オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾したリポソームは、「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。

前記オプソニン化阻害部分は、多数の周知の方法のいずれか１つにより、前記リポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させてから、膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用い、６０℃において、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ_３、および３０：１２の比でテトラヒドロフランと水などの溶媒混合物を用いる還元的アミノ化により、誘導体化することができる。

オプソニン化阻害部分で修飾したリポソームは、修飾されていないリポソームよりもはるかに長く血液循環中に残る。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることがある。ステルスリポソームは、多孔質または「漏出性」の微小血管系から栄養を受けた組織に蓄積することが知られている。従って、例えば固形腫瘍など、そのような微小血管系に欠陥があることで特徴付けられる標的組織は、これらのリポソームを効率的に蓄積する；Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９−５３を参照。さらに、前記ＲＥＳによる取り込みが減少すると、肝臓および脾臓への重大な蓄積を予防することで、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本ｓｉＲＮＡを腫瘍細胞に送達させることができる。

一の実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を有することができる。

さらに他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡを、前記ｓｉＲＮＡを補体系活性化が制御されていない部分またはその近傍の組織の細胞に機械的に送達させる上で適した方法により、前記被験者に投与することができる。例えば、前記ｓｉＲＮＡを遺伝子銃、または電気穿孔法により投与することができる。

本発明のｓｉＲＮＡおよび薬学的組成物は、当該分野で既知のいかなる経路によっても送達することができる。例えば、適切な経腸投与経路には、点眼、経口、直腸、または鼻腔内投与を含むことができる。適切な非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注射、動脈内ボーラス注射、動脈内注射、および血管系へのカテーテルの点滴注入）；組織内および周囲注射（例えば、網膜内注射、網膜下または硝子体内注射）；（浸透圧ポンプなどによる）皮下注射を含む皮下注射または沈着；例えば、カテーテルまたは他の留置装置（例えば、網膜ペレット剤または坐薬または多孔質、非多孔質、またはゼラチン様物質を有するインプラント）による補体系活性化が制御されていない部位またはその周辺への直接沈着；および吸入を含むことができる。一定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡの注射または注入を、補体系活性化部位またはその近傍に行うことができる。

様々な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは単回投与または複数回投与で投与することができる。当業者は、所定の被験者に本発明のｓｉＲＮＡを投与する適切な投与方法を容易に決定することもできる。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、例えば、補体系活性化が制御されていない部位またはその近傍に単回注射または沈着として、前記被験者に１回投与することができる。代わりに、前記ｓｉＲＮＡを約３〜約２８日間、または約７〜約１０日間の期間、被験者に１日１回または２回投与することができる。例えば、一部の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡを７日間１日１回、補体系活性化が制御されていない部位またはその近傍に注射することができる。投与方法が複数回投与を含む場合、前記被験者に投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、全投与方法で投与されたｓｉＲＮＡの総量を含むことができることは理解されるものとする。

本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、当該分野で既知の技術に従い、被験者に投与する前に薬学的組成物として製剤化される。本発明の薬学的組成物は、少なくとも滅菌済みで発熱物質を含まないことで特徴付けられる。本明細書に用いる通り、「薬学的製剤」にはヒトおよび家畜に使用する製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調整する方法は当該分野の技術の範囲内であり、例えば、その全開示が本明細書に参照として組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に報告されている。

本薬学的製剤は、例えば、水、緩衝用水、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などの生理学的に許容される担体と混合した、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、重量で０．１〜９０％）、または生理学的に許容されるその塩を有する。

本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤および／または添加物を含むこともできる。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、酸化防止剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、およびｐＨ調節剤を含む。適切な添加物には、生理学的に生体適合性の緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、（例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアマイドなどの）キレートまたは（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアマイドなどの）カルシウムキレート複合体の添加、または任意選択で（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウムなどの）カルシウムまたはナトリウム塩の添加を含む。本発明の薬学的組成物は、液体の形態で使用するために包装することができ、または凍結乾燥することができる。

固体組成では、従来の非毒性固体担体を使用することができ、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用できる。例えば、経口投与用の固体薬学的組成物は、例えば、本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡの約１０〜９５％、さらなる例では２５％〜７５％で上述の担体および賦形剤のいずれかを有することができる。エアロゾル（吸入）投与用の薬学的組成物は、上述のリポソームおよび噴霧剤に封入した本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡを重量で０．０１〜２０％、さらなる例では重量で１％〜１０％有することができる。例えば、鼻腔内投与用のレシチンなど、望み通りに担体を含めることもできる。

次に、以下の限定されない実施例により、本発明について図示する。

実施例
材料および方法
細胞培養
２９３細胞（ヒト胚腎臓細胞）、ＡＲＰＥ１９細胞（ヒト網膜上皮細胞）、およびＡ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）はＡＴＣＣ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手し、それぞれダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）、またはＦ１２−Ｋ培地（ＡＴＣＣ）にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カンサス州Ｌｅｎｅｘａ）および抗生物質−抗真菌剤試薬（Ｇｉｂｃｏ）を用い培養した。

ｓｉＲＮＡｓ
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）により、ヒト補体Ｃ３を標的とする１５種類のｓｉＲＮＡｓを合成した。前記ｓｉＲＮＡの標的配列を表２に記載した。

強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を標的とする追加ｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとした（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）。前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列は５'−ＧＧＣ ＵＡＣ ＧＵＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡｄＴｄＴ ３'であり、アンチセンス鎖の配列は５'−Ｕ ＧＣＧ ＣＵＣ ＣＵＧ ＧＡＣ ＧＵＡ ＧＣＣｄＴｄＴ−３'であった。

サイトカイン処理およびウエスタンブロット分析
２９３細胞、ＡＲＰＥ１９細胞、およびＡ５４９細胞を５％ ＣＯ２を用い、一晩３７℃にて２４ウェルのプレートで培養した。翌日、細胞を以下のサイトカイン（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、つまりインターロイキン１β（ＩＬ−１β；１００ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン６（ＩＬ−６；２５０ｎｇ／ｍＬ）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ；５００ｎｇ／ｍＬ）で処理した。

処理２日後、各ウェルから細胞上清を回収し、ヒト補体Ｃ３のウエスタンブロットを行った。簡単に言えば、上清（２５μＬｓ）をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）で電気泳動した。前記タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ニワトリ抗ヒト補体Ｃ３一次抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａ）、アルカリホスファターゼ複合ウサギ抗ニワトリＩｇＹ二次抗体（１：１０，０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、およびアルカリホスファターゼ検出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いてＣ３を検出した。

ヒト補体ｓｉＲＮＡスクリーニングおよび用量反応アッセイ
ＡＲＰＥ１９細胞を５％ ＣＯ２を用い、一晩３７℃にて２４ウェルのプレートで培養した。翌日、細胞が約７０％コンフルエントになった時点で形質移入を行った。リン酸カルシウム（ＣａＰｉ）試薬に混合した５ｎＭ、２５ｎＭ、１２５ｎＭ、または６２５ｎＭ ｓｉＲＮＡを用い、細胞を形質移入した。対照には、ｓｉＲＮＡおよび非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ１ ｓｉＲＮＡ）を含まない形質移入試薬を含めた。簡単に言えば、２０μＬの２５０ｍＭ ＣａＣｌ_２溶液にｓｉＲＮＡを添加した。ボルテックスで混合しながら、前記ｓｉＲＮＡ／ＣａＣｌ_２混合液を２０μＬの２Ｘハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ）に一滴ずつ添加した。前記ｓｉＲＮＡ／ＣａＣｌ_２／ＨＢＳ複合体を直接前記培地（３００μＬ／ウェル）に添加した。３７℃で４時間インキュベーション後、前記培地を取り除き、さらに室温で１〜２分、１０％ ＤＭＳＯ含有無血清培地（３００μＬ／ウェル）を用い、前記細胞をインキュベートした。次にこの培地を取り除き、前記細胞に再度２００μＬ／ウェルの増殖培地を与えた。

最終濃度１００ｎｇ／ｍＬでＩＬ−１βによる形質移入を行った４時間後に、補体Ｃ３刺激を行った。形質移入４８時間後、前記上清を各ウェルから回収し、サンプルをウエスタンブロット法にて分析した。

細胞毒性アッセイ
細胞から上清を取り除いた後、細胞毒性アッセイを行った。１０％ ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）を含む完全増殖培地を各ウェルに添加し、前記細胞を５％ ＣＯ２を用い、３時間３７℃でインキュベートした。細胞毒性はＡＤ３４０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用い、５７０ｎｍで分光光度的に決定した。前記ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）アッセイは、細胞増殖による増殖培地の化学的還元に反応する、酸化還元（ＲＥＤＯＸ）指示薬を組み入れている。増殖している細胞があると、指示薬は酸化型（蛍光なし、青色）から還元型（蛍光あり、赤色）に変化する。

実施例１
サイトカインが細胞中のＣ３発現をアップレギュレートする
サイトカイン処理２日後に細胞中のヒト補体Ｃ３の発現を検証した（例１の図１を参照）。使用したサイトカインは、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β（２）、２５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（３）、または５００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（４）を含む。前記サイトカインを処理した細胞が産生したＣ３の濃度を、非処理細胞（１）のＣ３濃度と比較した。すべてのサイトカインで処理した２９３およびＡ５４９細胞または５００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（４）で処理したＡＲＰＥ１９細胞には、補体Ｃ３の発現に明らかな変化はなかった。しかし、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β（２）または２５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６（３）で処理したＡＲＰＥ１９細胞では、Ｃ３発現が有意にアップレギュレートした。

実施例２
ヒト補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓは、ＡＲＰＥ１９細胞において、補体Ｃ３タンパク質のＩＬ−１βで誘導されるアップレギュレーションを抑制する
補体Ｃ３タンパク質の発現は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β処理によりＡＲＰＥ１９細胞を処理することでアップレギュレートされた。そのように処理された細胞は、２５ｎＭの補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓまたはネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（ＮＣ）により形質移入し、Ｃ３タンパク質レベルをウエスタンブロット分析により評価した。図２に示す通り、サイトカインで誘導された補体Ｃ３タンパク質レベルの上昇は、ヒト補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓ配列ＩＤ番号４３、４５、４８、４９、５１、５３、および５６を形質移入した細胞で有意に抑制された。前記ネガティブコントロールｓｉＲＮＡによる形質移入またはｓｉＲＮＡを用いない偽形質移入は、補体Ｃ３レベルに影響を示さなかった。

補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓにおいて用量反応研究を実施した（図３）。１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１βを処理したＡＲＰＥ１９細胞に５ｎＭ、２５ｎＭ、１２５ｎＭ、または６２５ｎＭ補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓ配列ＩＤ番号４３、４５、４８、および５１またはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＮＣ）を形質移入した。次に、ウエスタンブロット分析によりＣ３タンパク質を検出した。補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓ配列ＩＤ番号４５および５１は最も有意な用量反応を示した。

実施例３
細胞毒性アッセイ
ｓｉＲＮＡｓの細胞毒性を検証した（図４）。１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βを処理したＡＲＰＥ１９細胞に５ｎＭ、２５ｎＭ、１２５ｎＭ、または６２５ｎＭの補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡｓまたはネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ（ＮＣ）を形質移入した。形質移入およびａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）を用いたＩＬ−１β処理後４８時間で細胞毒性アッセイを行った。前記ｓｉＲＮＡｓ（５ｎＭ−６２５ｎＭ）は、前記ＡＲＰＥ１９細胞に対する細胞毒性がなかった。

本発明は、一定の好ましい実施形態に関してかなり詳細に説明したが、他の見解も可能である。従って、添付の請求項の精神と範囲は、本明細書に含まれる記載および好ましい見解に限定されるものではない。

本発明の性質および利点をより完全に理解するため、添付の図に関連して、以下の詳細な説明を参照する必要がある：
図１は、サイトカインを投与したヒト細胞におけるヒト補体Ｃ３の発現を図示している。 図２は、ＡＲＰＥ１９細胞における補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡのスクリーニングを図示している。 図３は、ＡＲＰＥ１９細胞における補体Ｃ３ ｓｉＲＮＡの用量反応を図示している。 図４は、ＡＲＰＥ１９細胞におけるＣ３ ｓｉＲＮＡの細胞毒性を図示している。

Claims (53)

1. ヒトＣ３タンパク質ｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、
   前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖と
   を有し、
   前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖とがＲＮＡ二本鎖を形成するものである、単離されたｓｉＲＮＡ。
2. 請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡ鎖は１つのＲＮＡ分子を有するものであり、前記アンチセンスＲＮＡ鎖は１つのＲＮＡ分子を有するものである。
3. 請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖は、共有結合するものである。
4. 請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、このｓｉＲＮＡは、さらに、
   ヌクレオチド以外の物質を有するものである。
5. 請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖は、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されるものである。
6. 請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡ鎖は第一の３'オーバーハングを有するものであり、および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖は第二の３'オーバーハングを有するものである。
7. 請求項６記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記第一および／または第二の３'オーバーハングは、１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
8. 請求項６記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記第一および／または第二の３'オーバーハングは、約２ヌクレオチドを有するものである。
9. 請求項６記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記第一および／または第二の３'オーバーハングを有するジヌクレオチドは、ジチミジン（ＴＴ）またはジウリジン（ｕｕ）である。
10. 請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡ鎖は、配列ＩＤ番号：４３、配列ＩＤ番号：４５、配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番号：４９、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５３、および配列ＩＤ番号：５６から選択される配列に対応する配列を有するものである。
11. ヒトＣ３タンパク質のｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センス鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する有効量の単離されたｓｉＲＮＡであって、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成するものである、当該単離されたｓｉＲＮＡと、
    薬学的に許容可能な担体と
    を有する薬学的組成物。
12. 請求項１１記載の薬学的組成物において、この薬学的組成物は、さらに、
    導入試薬を有するものである。
13. 請求項１１記載の薬学的組成物において、前記導入試薬は、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン、リポソーム、およびその組み合わせから選択されるものである。
14. 請求項１３記載の薬学的組成物において、前記導入試薬は、リポソームである。
15. 請求項１３記載の薬学的組成物において、前記リポソームは、さらに、当該リポソームにドルーゼ部位またはその近傍の細胞を標的とさせるターゲティングリガンドを有するものである。
16. 請求項１５記載の薬学的組成物において、前記リガンドは、抗体を有するものである。
17. 請求項１３記載の薬学的組成物において、前記リポソームは、オプソニン化阻害部分で修飾されるものである。
18. 請求項１７記載の薬学的組成物において、前記オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体を有するものである。
19. 請求項１１記載の薬学的組成物において、前記センスＲＮＡ鎖は、配列ＩＤ番号：４３、配列ＩＤ番号：４５、配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番号：４９、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５３、および配列ＩＤ番号：５６から選択される配列に対応する配列を有するものである。
20. 請求項１１記載の薬学的組成物において、前記センスＲＮＡ鎖は第一の３'オーバーハングを有するものであり、および／または前記アンチセンスＲＮＡ鎖は第二の３'オーバーハングを有するものである。
21. 請求項２０記載の薬学的組成物において、前記第一および／または前記第二の３'オーバーハングは、１〜約６ヌクレオチドを有するものである。
22. 請求項２０記載の薬学的組成物において、前記第一および／または前記第二の３'オーバーハングは、約２ヌクレオチドを有するものである。
23. 請求項２０記載の薬学的組成物において、前記第一および／または前記第二の３'オーバーハングは、ジチミジン（ＴＴ）またはジウリジン（ｕｕ）を有するジヌクレオチドである。
24. ヒト補体系または補体系制御ｍＲＮＡの発現を阻害する方法であって、
    ヒトＣ３タンパク質のｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する有効量の単離されたｓｉＲＮＡであって、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成するものである、当該単離されたｓｉＲＮＡを、それを必要とする被験対象に投与する工程と、
    前記ヒトＣ３制御ｍＲＮＡを分解する工程であって、前記ヒトＣ３制御ｍＲＮＡの分解は前記ヒトＣ３制御ｍＲＮＡの発現を阻害し、補体系反応の開始および／または急増を抑制するものである、前記分解する工程と
    を有する方法。
25. 請求項２４記載の方法において、前記それを必要とする被験対象はヒトである。
26. 請求項２４記載の方法において、前記有効量のｓｉＲＮＡは約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
27. 請求項２４記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡは組換えプラスミドから発現されるものである。
28. 請求項２４記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡは組換えウイルスから発現されるものである。
29. 請求項２８記載の方法において、前記組換えウイルスは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを有するものである。
30. 請求項２８記載の方法において、前記組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターを有するものである。
31. 請求項２８記載の方法において、前記組換えウイルスは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、またはモコラウイルスから選択されるウイルスの表面タンパク質を発現するものである。
32. 請求項２４記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡは経腸的に投与されるものである。
33. 請求項３２記載の方法において、経腸的投与は、経口、直腸、および鼻腔内投与から選択されるものである。
34. 請求項２４記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡは非経口投与されるものである。
35. 請求項３４記載の方法において、前記非経口投与は、血管内投与、組織周囲および組織内注射、皮下注射または沈着、または皮下注入投与、並びにドルーゼ形成部位またはその近傍への直接投与から選択されるものである。
36. 請求項３５記載の方法において、血管内投与は、静脈内ボーラス、静脈内注射、動脈内ボーラス、動脈内注射、および血管系へのカテーテル点滴注入から選択されるものである。
37. 請求項３５記載の方法において、組織周囲および組織内注射は、網膜内注射、網膜下注射、および硝子体内から選択されるものである。
38. 請求項３５記載の方法において、ドルーゼ形成部位またはその近傍への直接投与は、カテーテル、網膜ペレット剤、坐薬、多孔質物質を有するインプラント、非多孔質物質を有するインプラント、またはゼラチン様物質を有するインプラントによる投与を有するものである。
39. 請求項２４記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡは、点眼または眼窩内注射により投与されるものである。
40. 被験対象の疾患を治療する方法であって、
    ヒトＣ３タンパク質のｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する有効量の単離されたｓｉＲＮＡであって、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成するものである、当該単離されたｓｉＲＮＡを、前記被験対象に投与する工程と、
    前記被験対象のＣ３ ｍＲＮＡを分解する工程と
    を有する方法。
41. 請求項４０記載の方法において、前記疾患は、黄斑変性関連疾患、加齢黄斑疾患、ノースカロライナ型黄斑変性症、Ｓｏｒｓｂｙ'ｓ ｆｕｎｄｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、スタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ、糖尿病性網膜症、およびｍａｌａｔｔｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅから選択されるものである。
42. 請求項４１記載の方法において、黄斑変性関連疾患は、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体の変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、および錐体変性から選択されるものである。
43. 請求項４０記載の方法において、前記疾患は、加齢黄斑変性症である。
44. 請求項４０記載の方法において、前記疾患は、糖尿病性網膜症である。
45. 請求項４０記載の方法において、この方法は、さらに、
    前記被験対象の尿、血漿、血清、全血、または涙を用いて、前記ヒト補体系または補体系制御ｍＲＮＡの前記発現レベルを検出する工程を有するものである。
46. ドルーゼ関連性眼疾患を治療する方法であって、
    ヒトＣ３タンパク質のｍＲＮＡの約１９〜約２５隣接ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、前記センスＲＮＡ鎖と実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖とを有する有効量の単離されたｓｉＲＮＡであって、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成するものである、当該単離されたｓｉＲＮＡを、被験対象の少なくとも片方の眼に投与する工程と、
    前記被験対象の少なくとも片方の眼においてＣ３ ｍＲＮＡを分解する工程と
    を有する方法。
47. 請求項４６記載の方法において、
    前記眼疾患は、黄斑変性関連疾患、加齢黄斑疾患、ノースカロライナ型黄斑変性症、Ｓｏｒｓｂｙ'ｓ ｆｕｎｄｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、スタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ、糖尿病性網膜症、およびｍａｌａｔｔｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅから選択されるものである。
48. 請求項４６記載の方法において、前記疾患は、加齢黄斑変性症である。
49. 請求項４６記載の方法において、前記疾患は、糖尿病性網膜症である。
50. 請求項４６記載の方法において、前記眼への投与は、局所、網膜内注射、網膜下注射、硝子体内注射、および眼窩内注射から選択されるものである。
51. 請求項４６記載の方法において、前記眼への投与は、点眼または眼窩内注射から選択されるものである。
52. 請求項４６記載の方法において、前記センスＲＮＡ鎖は、配列ＩＤ番号：４３、配列ＩＤ番号：４５、配列ＩＤ番号：４８、配列ＩＤ番号：４９、配列ＩＤ番号：５１、配列ＩＤ番号：５３、および配列ＩＤ番号：５６から選択される配列に対応する配列を有するものである。
53. 請求項４６記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡは、ジチミジン（ＴＴ）またはジウリジン（ｕｕ）から選択される第一の３'オーバーハングおよび／または第二の３'オーバーハングを有するものである。

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