JP6250543B2 - ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質 - Google Patents

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Description

本出願は２０１１年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／５３９，７９７号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、ジ脂肪族置換脂質、それらの調製方法、および凝集低減剤としてのそれらの使用に関する。本発明はまた、ジ脂肪族置換脂質を含有する脂質粒子、および薬物送達におけるそのような脂質粒子の使用に関する。
治療用核酸として、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンチセンス、アンタゴｍｉｒ、アンチｍｉｒ、マイクロＲＮＡ模倣体、スーパーｍｉｒ、Ｕ１アダプター、およびアプタマーが挙げられる。これらの核酸は、種々の機序を介して作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称される過程を通して特定のタンパク質の細胞内レベルをダウンレギュレートすることができる。細胞の細胞質へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの導入後、これらの二本鎖ＲＮＡコンストラクトは、ＲＩＳＣと称されるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体から排除され、それによって結合したｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識し結合することができるＲＩＳＣ内の鋳型が用意される。相補的なｍＲＮＡを結合すると、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡを切断し、その切断した鎖を放出する。ＲＮＡｉは、タンパク質合成をコードする、対応するｍＲＮＡの特異的破壊を標的化することにより、特定のタンパク質のダウンレギュレーションを実現することができる。
標的タンパク質に向けられた任意のヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡコンストラクトを合成することができるので、ＲＮＡｉの治療用途は極めて幅広い。これまで、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方のモデルにおいて、標的タンパク質を特異的にダウンレギュレートする能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡコンストラクトは現在、臨床試験で評価されている。
しかしながら、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコンストラクトには現在直面する２つの問題がある、すなわち、第１に血漿中でのヌクレアーゼ消化に対してそれらが感受性であること、第２に遊離のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与された場合、ＲＩＳＣに結合することができる細胞内区画に到達できる、それらの能力が限定されていることである。これらの二本鎖コンストラクトは、化学修飾されたヌクレオチドリンカー、例えば、ホスホチオエート基を分子内に組み込むことにより安定化させることができる。しかしながら、これらの化学修飾は、ヌクレアーゼ消化に対して限定的な防御しか提供せず、コンストラクトの活性を低下させる可能性もある。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内送達は、ポリマー、カチオン性リポソームなどの担体システムの使用により、またはコンストラクトの化学修飾、例えば、コレステロール分子の共有結合により促進することができる。しかしながら、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力を増大し、かつ化学修飾の必要性を低下または排除するためには、送達システムの改善が必要とされる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムも、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することができる。アンチセンスコンストラクトの場合には、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質のｍＲＮＡに相補的な配列を有し、ワトソン‐クリック型塩基対によりｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害し、かつ／またはｍＲＮＡ転写物のＲＮアーゼＨ分解を誘発する。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、作用の特異性（すなわち、特定の疾患に関連したタンパク質のダウンレギュレーション）について多大な可能性がある。これまでに、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、およびＨＩＶのモデルを含む、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのモデルにおいて期待できることが示されている（Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）に概説されている）。アンチセンスはまた、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることにより細胞活動に影響を及ぼすことができる。いくつかのアンチセンス薬の高度なヒト臨床評価が現在進行中である。これらの薬物の標的には、ｂｃｌ２およびアポリポタンパク質Ｂの遺伝子およびｍＲＮＡ産物が含まれる。
免疫刺激性核酸には、デオキシリボ核酸およびリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合には、特定の配列またはモチーフが哺乳動物において免疫刺激を誘発することが示されている。これらの配列またはモチーフとしては、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンリッチ配列、およびパリンドローム配列が挙げられる。デオキシリボ核酸中のＣｐＧモチーフは、エンドソーム受容体であるｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）により特異的に認識され、それによって、次に自然免疫および獲得免疫の両方の刺激経路が誘発されると考えられている。ある種の免疫刺激性リボ核酸配列も報告されている。これらのＲＮＡ配列は、ｔｏｌｌ様受容体６および７（ＴＬＲ−６およびＴＬＲ−７）に結合することにより、免疫活性化を誘発すると考えられている。さらに、二本鎖ＲＮＡも、免疫刺激性があると報告されており、ＴＬＲ−３への結合を介して活性化すると考えられている。
治療用核酸の使用に関する周知の問題の１つは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の安定性およびヌクレアーゼに対するこのリンカーの感受性に関するものである。血清中のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの存在は、ホスホジエステルリンカーを有する核酸の迅速な消化をもたらし、したがって、治療用核酸の半減期は、血清の存在下または細胞内で極めて短いものになる可能性がある。（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）およびＴｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐ１４７−１６１ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ（Ｅｄｓ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ ａｎｄ Ｉｚａｎｔ，ＪＧ；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２））。これらおよび他の公知の問題のために、現在開発されている治療用核酸は、天然の核酸で見出されている基本的なホスホジエステル化学を使用していない。
この問題は、血清または細胞内の分解を低減する化学修飾により部分的に克服されている。修飾は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはホスホロアミデート結合を使用する）、ヌクレオチド塩基（例えば、５−プロピニル−ピリミジン）、または糖（例えば、２’修飾糖）で試験されている（Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ ６４−８１ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９７））。他の研究者は、２’−５’糖結合を使用して、安定性を改善することを試みている（例えば、（米国特許第５，５３２，１３０号明細書）を参照のこと）。他の変更も試みられている。しかしながら、これらの解決策の中には、完全に満足すべきものと判明したものはなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの遊離治療用核酸は、依然として限定された効力を有するに過ぎない。
さらに、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関連して上述したように、治療用核酸の細胞膜を通過する能力が限定されている問題（Ｖｌａｓｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：９５−１０８２（１９９４)）を参照のこと）、ならびに補体媒介アナフィラキシー、凝固特性の変化、および血球減少などの全身毒性に関連した問題（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４））が残っている。
効力を改善する試みでは、研究者らはまた、化学修飾されている、または化学修飾されていない治療用核酸を送達するために、脂質ベースの担体システムを使用している。Ｚｅｌｐｈａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．４１：９９−１１９（１９９６）では、著者らは、アニオン性（従来型）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポソーム、融合性リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集物の使用に言及している。Ｈｅｙｅｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１１２：２８０−２９０（２００６）では、著者らは、より安定なポリ（エチレングリコール）−脂質コンジュゲートの使用に言及している。同様に、ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソームで全身投与されており、これらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳類において標的タンパク質のダウンレギュレーションを改善することが報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４（２００６））。
この進歩にもかかわらず、全般的な治療用途に適した脂質−治療用核酸組成物の改良の必要性が依然として当技術分野には存在する。これらの組成物は、高効率に核酸を封入し、高い薬物：脂質比を有し、封入された核酸を血清における分解およびクリアランスから保護し、全身性の送達に適し、かつ封入された核酸の細胞内送達を提供することが好ましい。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、有効用量の核酸での患者の治療が、患者に顕著な毒性および／またはリスクを伴わないように、忍容性が良好でかつ十分な治療係数を提供すべきである。疾患治療用を含む、組成物、組成物の製造方法、および核酸を細胞に導入するための組成物の使用方法を提供する。
本発明は、凝集低減剤として有用なジ脂肪族置換化合物に関する。
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
の化合物またはその薬学的に許容される塩に関し、式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪族基であり、ここで、各脂肪族基は、Ｒａからそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の基によって、場合により置換されており；
Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−（Ｌ２−Ｚ２）ｃ−Ｌ３−であり；
Ｌ１は、結合、−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−、または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−；ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐ−または−（ＣＲａＲｂ）ｊ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
各Ａは独立して、−Ｌ４−、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−であり；ここで、各ｑは独立して、０、１、２、３、または４であり；各ｒは独立して、０、１、２、３、または４であり；
各Ｌ４は独立して、−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり；ここで各ｓは独立して、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ３は、−Ｈ、−Ｒｃ、または−ＯＲｃであり；
Ｒ５およびＲ５’の各存在は独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルであり；
ＲａおよびＲｂの各存在は独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｃは独立して、−Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
ｂは、１〜１，０００の整数であり；
ｃは、０または１であり；
ｉの各存在は独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり；
ｊの各存在は独立して、０、１、２、または３であり；
ｋの各存在は独立して、０、１、２、または３であり；かつ
ｐは、１〜１０である。
特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して脂肪族基；例えば、炭素および水素から主に構成され、飽和または不飽和のいずれかであるが、芳香環を含まない基である。追加の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１０〜Ｃ２０アルケニルである。例えば、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルである。さらなる例の場合には、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２−アルキル、Ｃ１３−アルキル、Ｃ１４−アルキル、Ｃ１５−アルキル、Ｃ１６−アルキル、Ｃ１７−アルキル、Ｃ１８−アルキル、Ｃ１９−アルキル、またはＣ２０−アルキルである。
一実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ個々に、Ｃ８〜Ｃ２０アルキルまたはＣ８〜Ｃ２０アルケニルである。別の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ個々に、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１０〜Ｃ２０アルケニルである。例えば、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ個々に、オクタニル、ノナニル、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、α−リノレイル、ステアリドニル、リノレイル、γ−リノレニル、アラキドニル、またはオレイルから選択することができる。
一実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ置換されていない。別の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ置換されている。一実施形態では、Ｒ１およびＲ２の一方は置換されており、Ｒ１およびＲ２の他方は置換されていない。
さらなる実施形態では、Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ３−である。別の実施形態では、Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｌ３−である。
さらに別の実施形態では、Ｌ１は、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−である。例えば、Ｌ１を、結合、−ＣＨ２−、または−ＣＨ２−ＣＨ２−とすることができる。一実施形態では、Ｌ１は結合である。別の実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−、例えば−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＲ５Ｒ５’）２、例えば−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
さらに別の実施形態では、Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−；ヘテロアリール、またはヘテロシクリルである。
例えば、特定の実施形態では、Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｏ−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−、またはヘテロアリール（トリアゾリルなど、例えば１，２，３−トリアゾリル）である。
別の実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１の左端の窒素原子は、式（Ｉ）の第三級炭素原子に結合しているか、あるいはＺ１は、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合している（またはＬ１が結合の場合は、中央の第三級炭素原子に結合している）。
さらに別の実施形態では、Ｌ２は−（ＣＲａＲｂ）ｐであり、ｃは１である。例えば、Ｌ２を、−（ＣＲａＲｂ）１（−ＣＨ２−など）または−（ＣＲａＲｂ）２（−ＣＨ２−ＣＨ２−など）とすることができる。
さらに別の実施形態では、Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはヘテロアリールであり、ｃは１である。例えば、Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、またはヘテロアリール（トリアゾリルなど、例えば１，２，３−トリアゾリル）である。
追加の実施形態では、Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり、ここで、ＲａおよびＲｂの各存在は独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルである。例えば、ＲａおよびＲｂの各存在をそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルとすることができる。別の実施形態では、ＲａおよびＲｂの各存在はそれぞれ独立して、Ｈまたはアルキルであってよく、変数ｉは２、３、４、または５である。適切なＬ３基としては、これらに限定されないが、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−が挙げられる。
一実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−である。別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。さらに別の実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。一実施形態では、Ｌ３は、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
特定の実施形態では、−（Ａ）ｂ−はポリマー基、すなわち−Ａ−の反復単位から構成される基である。一実施形態では、各Ａは独立してＬ４である。
さらなる実施形態では、各Ｌ４は独立して、−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり、ここで、各ｓは独立して、例えば、１、２、３または４である。一実施形態では、Ｌ４におけるＲａおよびＲｂの各存在は独立して、Ｈまたはアルキルである。したがって、一部の実施形態では、基−（Ａ）ｂ−は、ポリオキシアルキレン、例えばポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）である。例えば、Ｌ４を、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−とすることができる。好ましい実施形態では、各Ｌ４は−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
追加の実施形態では、各Ａ基は独立して、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−である。これらの状況では、基−（Ａ）ｂ−はポリアミドである。適切なポリアミドは、例えば米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されている。例えば、基−（Ａ）ｂ−は、構造−［ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４ＣＨ２Ｃ（Ｏ）］ｂ−を有し得る。
追加の実施形態では、基−（Ａ）ｂ−は、コポリマー、すなわち２種類以上のモノマーからなるポリマーである。コポリマーは、ランダム、ブロック、グラフト、または他のコポリマー構造であってよい。例えば、基−（Ａ）ｂ−を、例えば−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−単位と−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）−単位とのランダムコポリマーとすることができる。別の例として、基−（Ａ）ｂ−を、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−単位と−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−とのブロックコポリマーとすることができる。
特定の実施形態では、Ｒ３は、化合物がアルコキシ基、例えばメトキシ基などのＣ１〜Ｃ４アルコキシで終結するように選択される。一部の場合では、−（Ａ）ｂ−Ｒ３が、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分になるように選択される。ｂ値は、ｍＰＥＧ部分の分子量に基づいて選択することができる。例えば、分子量２，０００は、約４５のｂ値に対応する。所与の調製では、ポリマーが種々のポリマー鎖長の分布として見出され得るので、反復単位の数（例示化合物において変数ｎとして言及される）は、ｂ値の分布となり得る。
特定の実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、アルキル、またはＯＲｃである。例えば、Ｒ３を、Ｈ、メチル、または−ＯＨとすることができる。
追加の実施形態では、ｂは、約５〜約５００、約１０〜約５００、約１０〜約２５０、約２５〜約１００、約３０〜約６０、または約４０〜約５０などの約１〜約５００の範囲である。
一実施形態では、ｃは０である。別の実施形態では、ｃは１である。
一実施形態では、ｉは１、２、３、４、５、または６である。別の実施形態では、ｉは２、３、４、５、または６である。さらに別の実施形態では、ｉは２、３、４、または５である。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物の分子量は、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約５，０００ｇ／ｍｏｌである。
さらに別の実施形態では、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルであり；
Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ３−または−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｌ３−であり；
Ｌ１は、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐであり；
Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはヘテロアリールであり；
Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
各Ａは独立して、−Ｌ４−であり；
各Ｌ４は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；
Ｒ３は、−ＯＲｃであり；
ＲａおよびＲｂの各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり；かつ
Ｒｃは、Ｈまたはアルキルである。
さらに別の実施形態では、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルであり；かつ
Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１における左端の窒素原子は、Ｌ１に結合しており（またはＬ１が結合の場合は、式（Ｉ）の中央の第三級炭素原子に結合している）、あるいはＺ１は、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合している（またはＬ１が結合の場合は、式（Ｉ）の中央の第三級炭素原子に結合している）。好ましい一実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである。
さらに別の実施形態では、本発明は、式
の化合物またはその薬学的に許容される塩に関し、式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪族基（例えば、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニル）であり；
Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ３−であり；
Ｌ１は、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−であり；
Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１における左端の窒素原子は、Ｌ１に結合しており（またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合している）、あるいはＺ１は、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合しており（またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合している）；Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
各Ａは独立して、−Ｌ４−であり；
ｂは、１〜１，０００の整数であり；
各Ｌ４は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；Ｒ３は、−ＯＲｃであり；
Ｒａ、Ｒｃ、Ｒ５、およびＲ５’の各存在は独立して、Ｈまたはアルキル（例えばＣ１〜Ｃ４アルキル）であり；かつ
ｉは、２、３、４、または５である。式（ＩＩ）の化合物の好ましい一実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキル、例えばＣ１２〜Ｃ２０アルキルである。好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２は同じである。
式（ＩＩ）の化合物の一実施形態では、Ｌ１は結合である。別の実施形態では、Ｌ１は−ＣＨ２−である。
式（ＩＩ）の化合物の一実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、例えば−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−である。別の実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、例えば−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である。さらに別の実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、例えば−ＮＨＣ（Ｏ）−または−ＮＣ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）−である。
式（ＩＩ）の化合物のさらに別の実施形態では、Ｌ１は結合であり、変数ｉは２である。
さらに別の実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）
の化合物またはその薬学的に許容される塩に関し、式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルであり；
Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｌ３−であり；
Ｌ１は、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−であり；
Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１における左端の窒素原子は、Ｌ１に結合しており（またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合している）、あるいはＺ１は、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合しており（またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合している）；
Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐであり；
Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはヘテロアリールであり；
Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
各Ａは独立して、−Ｌ４−であり；
ｂは、１〜１，０００の整数であり；
各Ｌ４は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；Ｒ３は、−ＯＲｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒ５、およびＲ５’の各存在は独立して、Ｈまたはアルキル（例えばＣ１〜Ｃ４アルキル）であり；
ｉは、２、３、４、または５であり；かつ
ｐは、１〜１０である。
式（ＩＩＩ）の化合物の好ましい一実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキル、例えばＣ１２〜Ｃ２０アルキルである。好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２は同じである。
式（ＩＩＩ）の化合物の一実施形態では、Ｌ１は結合である。別の実施形態では、Ｌ１は−ＣＨ２−である。
式（ＩＩＩ）の化合物の一実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−である。別の実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、例えば−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−である。別の実施形態では、Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、例えば−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−である。
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物の他の実施形態では、変数は、式（Ｉ）に関して上記に記載されているが、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）によっても包含される定義を有する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を含む脂質粒子に関する。例えば、脂質粒子は、式（Ｉ）の化合物の約０．５〜約１５％（例えば約０．５〜約２．５％または約０．５〜約２％）のモル百分率を含有することができる。脂質粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、およびステロールの１つまたは複数をさらに含むことができる。一実施形態では、脂質粒子はカチオン性脂質を含む。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、およびステロールを含む。中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択することができる。例えば、脂質粒子は、約２０％および約６０％のモル百分率で存在するカチオン性脂質；約５％〜約２５％のモル百分率で存在する中性脂質；約２５％〜約５５％のモル百分率で存在するステロール；ならびに約０．５％〜約１５％のモル百分率で存在する式（Ｉ）の化合物を含有することができる。
別の実施形態では、脂質粒子は、活性薬剤（例えば、生理活性物質）をさらに含むことができる。別の実施形態では、活性薬剤を、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択される核酸とすることができる。
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を含む脂質粒子と（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、本発明の脂質粒子を細胞に提供することにより、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。一実施形態では、脂質粒子中の活性薬剤は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択される核酸である。
さらなる実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、ベータカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、癌抑制遺伝子、およびｐ５３癌抑制遺伝子からなる群から選択することができる。一実施形態では、標的遺伝子は、１つまたは複数の突然変異を含有することができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を被験体に提供することを含む、被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法に関する。一実施形態では、活性薬剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される核酸である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を被験体に提供することを含む、被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法に関する。一実施形態では、活性薬剤は、ポリペプチドをコードするプラスミド、またはその機能的変異体もしくは断片である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を被験体に提供することを含む、被験体に免疫応答を誘導する方法に関する。一実施形態では、活性薬剤は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。
１．１、１．４、１．７、もしくは２．０モル％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＯ、または１．１、１．４、１．７、もしくは２．０モル％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＡのいずれかを含有するｓｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の静脈内投与後の、皮下Ｈｅｐ−３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍における、ヒトベータアクチンに規準化されたルシフェラーゼの発現レベル（ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲにより測定）を示す棒グラフである。
一般に、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、脂質、より具体的には凝集低減脂質とみなされる。これらの脂質は、例えば、核酸−脂質粒子組成物に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、核酸の活性増大および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの組成物の耐容性の改善を提供し、それによって、以前に記載された脂質−核酸粒子組成物と比較して、治療係数の顕著な増大をもたらすことができる。
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の送達のための組成物を記載する。これらの組成物は、標的タンパク質のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートするのに有効である。これらの組成物の活性は、カチオン性脂質の存在および製剤中のカチオン性脂質のモル比により影響を受けることがある。
脂質粒子および組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における、結合または封入された治療剤の細胞への送達を含む、種々の目的のために使用することができる。したがって、それを必要とする被験体の疾患または障害を治療する方法は、適切な治療剤を結合した脂質粒子を被験体に接触させることを含むことができる。
本明細書に記載のように、脂質粒子は、例えばｓｉＲＮＡ分子およびプラスミドを含む核酸の送達に特に有用である。したがって、脂質粒子および組成物は、標的遺伝子発現を低下させる核酸（例えばｓｉＲＮＡ）または所望のタンパク質の発現を増大させるために使用できる核酸（例えば、所望のタンパク質をコードするプラスミド）と結合した脂質粒子を細胞に接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、標的遺伝子およびタンパク質の発現を調節するために使用することができる。
脂質、脂質粒子、およびそれらを含む組成物、ならびに治療剤を送達し、かつ遺伝子およびタンパク質発現を調節するためのそれらの使用に関する種々の代表的な実施形態について、以下にさらに詳細に説明する。
ある条件下では、脂質粒子は、電荷誘導性の凝集を起こすことがあり、この状態は望ましくない場合がある。したがって、例えば、形成の間、粒子を立体的に安定化することにより、凝集を低減できる化合物を脂質粒子中に含むことが望ましいことがある。立体的にかさ高いが電荷のない部分を有する化合物が、脂質粒子の電荷部分が他の脂質粒子に近接するのを遮蔽または防護する場合に、立体的安定化が起こり得る。そのような成分は凝集を防止するだけではない。それらは、血液循環寿命を延長し、標的組織への脂質−核酸組成物の送達を改善することもできる。
粒子に立体的安定性を付与する１つの方法は、粒子の外側に立体的にかさ高い基を有する脂質を含む脂質を含めることである。適切な立体的にかさ高い基としては、ポリ（オキシアルキレン）、例えば、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）などの親水性ポリマーが挙げられる。そのようなかさ高い基を有する脂質は、凝集低減脂質と呼ぶことができる。かさ高い基がポリ（エチレングリコール）の場合、その脂質を、ポリ（エチレングリコール）−脂質コンジュゲート、ＰＥＧ化脂質、または単にＰＥＧ脂質と呼ぶことができる。
式（Ｉ）の化合物は、１つまたは複数の不斉炭素原子を含むことができ、それによって立体異性体が生じる可能性がある。化合物は、ラセミ混合物、１つの鏡像異性体について鏡像異性過剰である混合物、および実質上立体的に純粋な異性体（例えば、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の鏡像異性過剰を有する）を含む、いくつかの異なる立体異性体のうちのいずれかをとることができる。２つ以上の不斉炭素原子が存在する場合、ジアステレオ異性体が可能であり、同様にメゾ化合物も可能である。これらのいずれも種々の純度で見出すことができる。したがって、式（Ｉ）の化合物は、異なるジアステレオマーの混合物の形態であることも、または単一ジアステレオマーの実質的に純粋な形態であることもある。シス異性体、トランス異性体、ジアステレオ異性体の混合物、ラセミ体、鏡像異性体の非ラセミ混合物、実質的に純粋な鏡像異性体、および純粋な鏡像異性体を含むこれらの化合物はすべて、本発明の範囲内である。
光学異性体は、従来の方法によるラセミ混合物の分割、例えば、光学活性な酸または塩基を使用するジアステレオ異性体塩の形成または共有結合性ジアステレオマーの形成により得ることができる。適切な酸の例には、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンジル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、および樟脳スルホン酸がある。ジアステレオ異性体の混合物は、当業者に公知の方法、例えばクロマトグラフィーまたは分別結晶により、それらの物理的および／または化学的な差に基づいて個々のジアステレオマーに分離することができる。次いで、光学活性な塩基または酸を、分離したジアステレオマー塩から遊離させる。光学異性体を分離する異なる方法には、鏡像異性体の分離を最大にするために最適として選ばれる、従来の誘導体化を伴うまたは伴わないキラルクロマトグラフィー（例えば、キラルＨＰＬＣカラム）の使用がある。適切なキラルＨＰＬＣカラムは、Ｄｉａｃｅｌにより製造されており、例えば、多くある中でもＣｈｉｒａｃｅｌ ＯＤおよびＣｈｉｒａｃｅｌ ＯＪであり、これらはすべて、ルーチン的に選択可能である。さらに、酵素的分離も、誘導体化の有無にかかわらず、有用である。式（Ｉ）の光学活性化合物は、ラセミ化を起こさない反応条件下でのキラル合成方法において、光学活性な出発物質を利用することにより同様に得ることができる。
適用可能な場合には、本発明はまた、遊離塩基形態など、式（Ｉ）の化合物の有用な形態、および調製することができる、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩に関する。薬学的に許容される塩には、塩基として作用する主化合物を、塩を形成させるために無機酸または有機酸と反応させることにより得られるものが含まれ、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、樟脳スルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、ギ酸、臭化水素酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、サリチル酸、マンデル酸、および炭酸の塩が挙げられる。薬学的に許容される塩にはまた、主化合物が酸として作用し、適切な塩基と反応して形成されるものが含まれ、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、およびコリン塩が挙げられる。当業者ならば、特許請求の範囲にある化合物の酸付加塩を、いくつかの公知の方法のいずれかを介して、適切な無機酸および有機酸と化合物の反応により調製することができることをさらに認識するであろう。あるいは、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩を、種々の公知の方法を介して、適切な塩基と本発明の化合物を反応させることにより調製することができる。
以下のものは、無機酸または有機酸との反応により得ることができる酸性塩のさらなる例である：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩、およびウンデカン酸塩。
式Ｉの代表的な化合物として以下のものが挙げられる：
（式中、
ｎは、１〜１，０００の整数であり；
ｍは、０、１、２、３、４、または６である）
およびそれらの薬学的に許容される塩。
一実施形態では、ｎは約１０〜約５００である。別の実施形態では、ｎは約３０〜約６０である。
以下に示すスキーム１〜４では、化合物ＡおよびＢの調製のための合成法について記載する。式（Ｉ）の他の化合物は、出発物質を適切に使用して、スキーム１〜４で示す方法により調製することができる。
スキームＩでは、脂肪族アルコール１のアルコール基をメトキシ基に変換して化合物２を形成させる。化合物２のメトキシ基を脱離基（例えば臭素）に変換して化合物３を形成させる。次いで、化合物３を反応させて、中心原子から延びた２つの脂肪族基および１つの水酸基を有する化合物（化合物５）を形成させる。次いで、化合物５の水酸基を、所望の官能基（すなわち、−Ｌ−（Ａ）ｂ−Ｒ３）に変換する。その後、脂肪族基を飽和してもよい（例えば、化合物７を化合物Ａに変換するために）。
スキーム２では、末端臭素を有する脂肪族化合物を反応させて、中心原子から延びた２つの脂肪族基および１つの水酸基を有する化合物（化合物５）を形成させる。次いで、化合物９の水酸基を、所望の官能基（すなわち、−Ｌ−（Ａ）ｂ−Ｒ３）に変換する。
スキーム３では、中心原子上に２つの脂肪族基および１つのアルコールを有する化合物（化合物５）のアルコール基をメトキシ基に変換する。次いで、メトキシ基をアジド（Ｎ３）（化合物１２）に変換した後、加水分解してアミノ基（化合物１３）を形成させる。次いで、アミノ基を、所望の官能基（すなわち、−Ｌ−（Ａ）ｂ−Ｒ３）に変換することができる。
スキーム４では、中心原子上に２つの脂肪族基および１つのアルコールを有する化合物（化合物９）のアルコール基をアジド基（化合物１５）に変換する。アジド基を加水分解してアミノ基（化合物１６）を形成させる。次いで、アミノ基を、所望の官能基（すなわち、−Ｌ−（Ａ）ｂ−Ｒ３）に変換することができる。
脂質粒子
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を含む脂質粒子に関する。脂質粒子は、以下により詳細に説明する１つまたは複数のカチオン性脂質を含むことができる。脂質粒子は、第２のアミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および脂質粒子の凝集を低減するために選択される脂質、すなわち凝集低減脂質、の１つまたは複数をさらに含むことができる。脂質粒子は、これに限定されないが、リポソームを含む。本明細書で使用する場合、リポソームとは、水性の内部を包む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、１つまたは複数の脂質膜を有することができる。リポソームは、単層と呼ばれる単一の層であることも、または多重層と呼ばれる複数の層であることも可能である。核酸と複合体を形成する場合には、脂質粒子は、記載されるように、ＤＮＡ層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスであってもよい。
脂質粒子はまた、コレステロールなど、１つまたは複数のさらなる脂質および／または他の成分を含むことができる。脂質酸化の防止またはリポソーム表面上へのリガンド結合のためなど種々の目的で、他の脂質をリポソーム組成物に含めることができる。両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質を含む、いくつかの脂質のうちのいずれもリポソーム中に存在させることができる。そのような脂質は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。存在し得るさらなる脂質成分の具体例を以下に記載する。
脂質粒子中に存在し得るさらなる成分として、ポリアミドオリゴマーなどの二重層安定化成分（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号明細書を参照のこと）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、例えばホスファチジルエタノールアミンに連結したＰＥＧおよびセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧなど（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照のこと）が挙げられる。
脂質粒子は、２つ以上のカチオン性脂質を含むことができる。脂質は、種々の有利となる特性に寄与するように選択することができる。例えば、アミンのｐＫａ、化学的安定性、血中半減期、組織内半減期、正味の組織内蓄積、または毒性などの特性が異なるカチオン性脂質を脂質粒子に使用することができる。具体的には、混合脂質粒子の特性が個々の脂質からなる単一脂質粒子の特性よりも望ましくなるように、カチオン性脂質を選択することができる。
カチオン性脂質
特定の実施形態では、脂質はカチオン性脂質である。本明細書で使用する場合、用語「カチオン性脂質」は、１つまたは２つの脂肪酸または脂肪族鎖と、生理的ｐＨでプロトン化してカチオン性脂質を形成し得るアミノ頭部基（アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を含む）とを有する脂質を含むことを意図する。一部の実施形態では、カチオン性脂質は「アミノ脂質」と呼ばれる。
カチオン性脂質は、頭部基、１つまたは複数の疎水性尾部、ならびに頭部基と１つまたは複数の尾部との間のリンカーを含む、設計上の特定の特徴を有することができる。頭部基はアミンを含むことができる。特定の条件下では、アミン窒素は正電荷の部位になり得る。例えば、アミンが第一級、第二級、または第三級アミンである場合、そのアミンは固有のｐＫａを有することになる；換言すれば、そのアミンは、水性媒体中で可逆的なプロトン化を受けることになる。正電荷の程度は、ｐＫａおよび水性媒体のｐＨの関数である。アミンは第四級アミンのこともあり得るが、その場合には、アミンは、純粋な形態であるか、水性媒体中にあるか、または水性媒体のｐＨにかかわらず、正電荷を有することになる。
ｐＫａは、脂質の構造、特に頭部基の性質；例えば、アニオン性官能基、水素結合供与官能基、水素結合受容基、疎水基（例えば、脂肪族基）、親水基（例えば、ヒドロキシルまたはメトキシ）、またはアリール基などの官能基の有無および位置により影響を受けることがある。頭部基のアミンはカチオン性アミン；第一級、第二級、第三級、または第四級アミンであってよく；頭部基は、１つのアミン基（モノアミン）、２つのアミン基（ジアミン）、３つのアミン基（トリアミン）、またはオリゴアミンまたはポリアミンのように多数のアミン基を含むことができる。頭部基は、アミンよりも塩基性が弱い官能基、例えばイミダゾール、ピリジン、またはグアニジウム基などを含むことができる。頭部基は両性イオンであってもよい。
１つまたは複数の疎水性尾部は２つの疎水性鎖を含むことができ、これらは同じであっても異なっていてもよい。尾部は脂肪族であってもよく；例えば、尾部は、炭素および水素から構成することができ、それらは飽和または不飽和のいずれかであってもよいが、芳香環を含まない（例えば、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキルまたはＣ１０〜Ｃ３０アルケニル）。尾部は脂肪酸尾部であってもよく；そのような基の一部としては、これらに限定されないが、オクタニル、ノナニル、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、α−リノレイル、ステアリドニル、リノレイル、γ−リノレニル、アラカドニル、オレイル等が挙げられる。
リンカーとしては、例えば、グリセリドリンカー、非環式グリセリドアナログリンカー、または環式リンカー（スピロリンカー、二環式リンカー、および多環式リンカーを含む）を挙げることができる。リンカーは、これらに限定されないが、エーテル、エステル、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロチオエート、スルホネート、ジスルフィド、アセタール、ケタール、イミン、ヒドラゾン、またはオキシムなどの官能基を含むことができる。
カチオン性脂質は、１つまたは複数の生分解性結合を含むことができる。生分解性結合は、生物学的環境内で、例えば生体内、器官内、組織内、細胞内、または細胞小器官内で、結合切断反応を受けることができる。生分解性結合を含む官能基の一部としては、例えば、エステル、ジチオール、およびオキシムが挙げられる。生分解性は、被験体に投与したときに、体内からの化合物のクリアランスに影響を及ぼす因子となり得る。生分解性は、細胞ベースのアッセイで測定することができ、このアッセイでは、カチオン性脂質を含む製剤を細胞に曝露し、種々の時点で試料を採取する。脂質分画を細胞から抽出し、ＬＣ−ＭＳにより分離および分析する。ＬＣ−ＭＳデータから、生分解速度を（例えば、ｔ１／２値として）測定することができる。
いくつかのカチオン性脂質およびそれらの製造方法は、例えば、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット、および国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット、国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット、および国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレット、ならびにそれらの中で参照される出願、例えば、２００８年１０月９日に出願された米国仮出願第６１／１０４，２１９号明細書；２００８年１１月１０日に出願された同第６１／１１３，１７９号明細書；２００９年２月２０日に出願された同第６１／１５４，３５０号明細書；２００９年４月２１日に出願された同第６１／１７１，４３９号明細書；２００９年５月５日に出願された同第６１／１７５，７７０号明細書；２００９年６月９日に出願された同第６１／１８５，４３８号明細書；２００９年７月１５日に出願された同第６１／２２５，８９８号明細書；および２００９年８月１４日に出願された同第６１／２３４，０９８号明細書に記載されている。例えば、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレットの１６〜２１頁にある表１を参照されたい。
他のカチオン性脂質としては、例えば、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ基−等）を含む、別の脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有するものが挙げられる。脂肪基が長鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアシル基である実施形態の場合には、それらは同じであっても異なっていてもよい。一般に、飽和度が低いアシル鎖を有する脂質（例えば、カチオン性脂質）は、特に、濾過滅菌を目的として複合体を約０．３ミクロン未満のサイズにする場合、より容易にサイズ調整される。Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲にある炭素鎖長の不飽和脂肪酸を含有するカチオン性脂質が典型的である。他のスキャフォールドも、カチオン性脂質のアミノ基（例えば、カチオン性脂質のアミノ基）と脂肪酸または脂肪アルキル部分を分離するために使用することができる。適切なスキャフォールドは当業者に公知である。
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、脂質が、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下で正に荷電し、第２のｐＨ、好ましくは生理的ｐＨ以上で中性になるように、少なくとも１つのプロトン化または脱プロトン化可能な基を有する。そのような脂質もカチオン性脂質と呼ばれる。ｐＨの関数としてのプロトンの付加または解離は平衡過程であること、および荷電または中性脂質への言及は主たる種の性質を指し、脂質すべてが荷電または中性形態で存在することを要求するものではないことは、当然のことながら理解されるであろう。脂質は、２つ以上のプロトン化もしくは脱プロトン化可能な基を有するものであっても、両性イオンであってもよい。
特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質（すなわち、カチオン性脂質）は、約４〜約１１の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有している。典型的には、脂質粒子に組み込まれる場合、脂質のｐＫａは、約４〜約７、例えば、約５．５〜約６．８など約５〜約７の間である。そのような脂質は、より低いｐＨの製剤段階ではカチオン性であるが、ｐＨ７．４付近の生理的ｐＨでは、粒子の表面は大部分（完全ではないが）中性になる。約４〜７の間の範囲にあるｐＫａの利点の１つは、粒子の外表面に結合した少なくとも一部の核酸が、生理的ｐＨでその静電的相互作用を喪失し、簡単な透析により除去されることであり；したがって、粒子のクリアランス感受性を大幅に低減することである。脂質粒子内の脂質のｐＫａ測定は、例えば、Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ ４０，１２７−１４４（１９８６）に記載の方法を用い、蛍光プローブの２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）を使用することにより実施することができる。
追加の実施形態では、脂質は荷電脂質である。本明細書で使用する場合、用語「荷電脂質」は、１つまたは２つの脂肪アシル鎖または脂肪アルキル鎖および第四級アミノ頭部基を有する脂質を含むことを意図する。第四級アミンは、常に正電荷を担持する。頭部基は、場合によっては、生理的ｐＨでプロトン化され得る第一級、第二級、第三級、または第四級アミンなどのイオン化可能な基を含むことができる。第四級アミンが存在すると、イオン化可能な基のｐＫａが、第四級アミンを欠く構造的に類似の化合物（例えば、第四級アミンが第三級アミンに置換されている）の中のその基のｐＫａに比較して、変化する可能性がある。一部の実施形態では、荷電脂質は「アミノ脂質」と呼ばれる。例えば、２０１０年１２月７日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５９２０６号を参照されたい。
カチオン性脂質に由来する正味の組織蓄積および長期毒性（もしあれば）は、所与の製剤において単一のカチオン性脂質を選択する代わりにカチオン性脂質の混合物を選択することにより、好ましいように調節することができる。そのような混合物はまた、より優れた薬物封入および／または薬物放出を提供することができる。カチオン性脂質の組合せはまた、製剤中の単一実体と比較すると、全身安定性に影響を及ぼすことができる。例えば、２０１０年１２月１７日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／６１０５８号を参照されたい。
例えば、脂質粒子は、例えば国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレットおよび２００８年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１０４，２１９号明細書に記載のカチオン性脂質およびそのエステルアナログの混合物を含有することができる。別の例では、脂質粒子は、国際公開第２０１０／０８８５３７号パンフレットに記載の脂質、例えばリピドＡ、および２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書に記載の脂質、例えば式Ｖまたは式ＶＩの脂質の混合物を含有することができる。
上記に具体的に記載のものに加えて、生理的ｐＨ付近で正味の正電荷を担持する他のカチオン性脂質も、脂質粒子に含めることができる。そのようなカチオン性脂質としては、これらに限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ、Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられる。さらに、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含み、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含み、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）などの、いくつかの市販のカチオン性脂質調製物を使用することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。
凝集低減脂質
形成時の粒子の凝集を低減する脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、およびポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）、例えば米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載のものなどが挙げられる。ＰＥＧ、Ｇｍ１、またはＡＴＴＡのような、製剤化の間の凝集を防止する、無電荷かつ親水性で立体障壁性の部分を有する他の化合物も脂質に結合させることができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号明細書、同第５，５３４，４９９号明細書、および同第５，８８５，６１３号明細書に記載されている。典型的には、凝集を低減するために選択される脂質成分の濃度は、約１〜約１５％（脂質のモル百分率で）である。凝集を低減し、かつ／またはＰＥＧ部分を含む他の脂質が、例えば米国特許第７，８０３，３９７号明細書および国際公開第２００９／０８２６０７号パンフレットに記載されている。
脂質小胞の表面にＰＥＧ部分を固定するために種々の「アンカリング」脂質部分を有し得るＰＥＧ修飾脂質（または、脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体例としては、これらに限定されないが、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、米国特許第５，８２０，８７３号明細書に記載されているＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールが挙げられる。
ＰＥＧまたはＡＴＴＡなどの立体的に大きな部分が脂質アンカーにコンジュゲートしている実施形態では、脂質アンカーの選択は、そのコンジュゲートが脂質粒子と有すべき結合タイプに依存する。ｍＰＥＧ（分子量：２，０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、粒子が血液循環から排除されるまで、おそらくは数日間、リポソームと結合し続けることがよく知られている。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他のコンジュゲートも同様の滞留能を有する。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に曝露されると、製剤から急速に交換排出され、いくつかのアッセイではＴ１／２は６０分未満である。
米国特許第５，８２０，８７３号明細書に説明されるように、少なくとも３つの特徴、すなわち、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障壁性頭部基のサイズが交換速度に影響を及ぼし得る。これらの特徴が適切に改変されている化合物が有用となり得る。一部の治療用途については、ＰＥＧ修飾脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸−脂質粒子から迅速に失われることが好ましい場合があり、したがって、ＰＥＧ修飾脂質は、比較的短い脂質アンカーを有することになる。他の治療用途では、核酸−脂質粒子は、より長い血漿循環寿命を示すことが好ましい場合があり、したがって、ＰＥＧ修飾脂質は、比較的長い脂質アンカーを有することになる。
凝集を防止する化合物は、適切に機能するために、必ずしも脂質コンジュゲーションを必要とするわけではないことに留意されたい。溶液中に遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡがあれば、凝集を防止するのに十分である場合もある。粒子が製剤後に安定な場合、被験体に投与する前にＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析で除去することができる。
中性脂質およびステロール
中性脂質は、脂質粒子中にある場合、生理的ｐＨで無電荷形態または中性両性イオン形態のいずれかで存在するいくつかの脂質種のいずれであってもよい。そのような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載の粒子で使用する中性脂質の選択は、一般には、例えばリポソームのサイズおよび血流におけるリポソームの安定性を考慮することにより導かれる。特定の実施形態では、中性脂質成分は２つのアシル基を有する脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。異なる鎖長および飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質は、入手可能であるか、または周知の手法により単離もしくは合成することができる。一群の実施形態では、脂質は、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の範囲の飽和脂肪酸を含有する。別の群の実施形態では、脂質は、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の範囲のモノ不飽和脂肪酸またはジ不飽和脂肪酸を含有する。さらに、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖の混合物を含む脂質を使用することができる。特定の実施形態では、使用する中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、または任意の関連するホスファチジルコリンである。中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質で構成することもできる。
脂質混合物のステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質小胞、または脂質粒子調製の分野で慣用的に使用されるステロールのいずれであってもよい。一実施形態では、ステロールはコレステロールである。
アニオン性脂質および両親媒性脂質
脂質粒子中で使用するのに適したアニオン性脂質としては、これらに限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノロアミン（Ｎ−ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に連結した他のアニオン性修飾基が挙げられる。
追加の実施形態では、両親媒性脂質が脂質粒子中に含まれている。「両親媒性脂質」とは、脂質物質の疎水性部分が疎水相の中に配向し、一方親水性部分が水相に向かって配向する、任意の適切な物質を指す。そのような化合物としては、これらに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられる。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファトジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸など、他のリン欠損化合物も使用することができる。さらに、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなどの他の脂質と容易に混合することができる。
融合促進脂質
プログラム可能な融合脂質または融合促進脂質も、脂質粒子に含めるのに適している。そのような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向をほとんど示さず、所与のシグナル事象が起こるまでそのペイロードを送達する。これにより、脂質粒子は、生体または疾患部位に注入された後、細胞との融合を開始する前に、より均一に分布することが可能になる。シグナル事象は、例えばｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化であり得る。融合促進脂質は、例えば、上記の式（Ｉ）の化合物であってもよい。一部の場合では、シグナル事象は、例えば、細胞外環境と細胞内環境との間のｐＨ差または細胞内環境とエンドソーム環境との間のｐＨ差など、ｐＨの変化であり得る。
時間がシグナル事象である場合には、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートなど、融合遅延成分または「遮蔽」成分が、時間経過と共に、脂質粒子膜から単純に交換排出され得る。脂質粒子は、体内に適切に分布するまでには、十分な遮蔽剤を失って、膜融合性になっている。他のシグナル事象については、炎症部位での上昇した温度など、疾患部位または標的細胞に関連するシグナルを選択することが望ましいことがある。
特定の実施形態では、細胞型または組織に特異的なターゲティング部分を使用して、脂質粒子を標的指向性にすることが望ましい。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、およびモノクローナル抗体などの種々のターゲティング部分を用いた脂質粒子のターゲティングを使用することができる（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号明細書および同第４，６０３，０４４号明細書を参照のこと）。ターゲティング部分は、タンパク質全体またはその断片を含むことができる。ターゲティング機序では、一般に、ターゲティング部分が標的（例えば、細胞表面受容体）との相互作用に利用可能なように、ターゲティング物質が脂質粒子の表面に配置されることが必要となる。種々の異なるターゲティング物質およびターゲティング方法が、当技術分野で公知かつ利用可能であり、例えば、Ｓａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，ＴＭ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）；およびＡｂｒａ，ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１−３，（２００２）に記載のものなどがある。
ターゲティングのために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖の表面コーティングを有する脂質粒子、すなわちリポソームの使用が提案されている（例えば、Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８（１９９５）；ＤｅＦｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１８：６１０１−６１０４（１９９６）；Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４（１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）；米国特許第５，０１３，５５６号明細書；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｃｈａｐｔｅｒ ９（Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｄｓ）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ（１９９５）を参照のこと）。１つの手法では、脂質粒子をターゲティングさせるための、抗体などのリガンドは、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に連結する。別の手法では、ターゲティングリガンドは、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位端に結合している（Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８８：１１５−１１８（１９９６））。
ターゲティング物質を結合するために標準的方法を使用することができる。例えば、ターゲティング物質の結合のために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、または脂質誘導体化ブレオマイシンなどの誘導体化親油性化合物を使用することができる。抗体標的リポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを使用して構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１（１９９０）を参照のこと）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号明細書に開示されている。ターゲティング部分の例としてまた、新生物または腫瘍に関連した抗原を含む細胞成分に特異的な他のタンパク質を挙げることができる。ターゲティング部分として使用されるタンパク質は、共有結合を介してリポソームに結合させることができる（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照のこと）。他のターゲティング方法として、ビオチン−アビジンシステムが挙げられる。
脂質粒子製剤
一部の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質と融合促進脂質の混合物を含む。脂質粒子は、中性脂質、ステロール、凝集低減脂質、またはこれらの組合せをさらに含むことができる。例えば、一実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、および中性脂質を含み得るが、ステロールも凝集低減脂質も含まない。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、および中性脂質を含み得るが、ステロールも凝集低減脂質も含まない。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、および凝集低減脂質を含み得るが、ステロールも中性脂質も含まない。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、および中性脂質を含み得るが、凝集低減脂質は含まない。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、および凝集低減脂質を含み得るが、中性脂質は含まない。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質、および凝集低減脂質を含み得るが、ステロールは含まない。別の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、中性脂質、および凝集低減脂質を含み得る。
代表的な一実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）、および凝集低減脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物、ＰＥＧ−ＤＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物を含む。特定の実施形態では、脂質混合物は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質、コレステロール、および凝集低減脂質からなるか、またはそれらから本質的になる。さらなる実施形態では、脂質粒子は、モル百分率で、約２０〜７０％のカチオン性脂質：約０．１〜５０％の融合促進脂質：約５〜４５％の中性脂質：約２０〜５５％のコレステロール：約０．５〜１５％の凝集低減脂質の上記脂質混合物を含む。一部の実施形態では、融合促進脂質は、約０．１〜５０％、約０．５〜５０％、約１〜５０％、約５％〜４５％、約１０％〜４０％、または約１５％〜３５％のモル百分率で存在することができる。一部の実施形態では、融合促進脂質は、約０．１〜５０％、約０．５〜５０％、約１〜５０％、約５％〜４５％、約１０％〜４０％、または約１５％〜３５％のモル百分率で存在することができる。一部の実施形態では、融合促進脂質は、約０．１〜５０％、約１０〜５０％、約２０〜５０％、または約３０〜５０％のモル百分率で存在することができる。一部の実施形態では、融合促進脂質は、約０．１〜５０％、約０．５〜４５％、約１〜４０％、約１％〜３５％、約１％〜３０％、または約１％〜２０％のモル百分率で存在することができる。
さらなる実施形態では、脂質粒子は、モル百分率で、約２０〜７０％のカチオン性脂質：約０．１〜５０％の融合促進脂質：約５〜４５％の中性脂質：約２０〜５５％のコレステロール：約０．５〜１５％の凝集低減脂質の上記脂質混合物からなるか、またはそれらから本質的になる。
特定の実施形態では、脂質粒子は、１つまたは複数のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質の混合物からなるか、それらから本質的になる。例えば、脂質粒子は、モル百分率で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約０．１〜５０％の融合促進脂質：約５〜２５％のＤＳＰＣ：約２５〜５５％のコレステロール：約０．５〜１５％の凝集低減脂質の混合物からなるか、それらから本質的になる。特定の実施形態では、脂質モル比（モル％のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質に関して）は、およそ、約４０／１０／４０／１０、約３５／１５／４０／１０、または約５２／１３／３０／５であり；この混合物はさらに、モル百分率で、約０．１〜５０％、約０．１〜５０％、約０．５〜５０％、約１〜５０％、約５％〜４５％、約１０％〜４０％、または約１５％〜３５％の融合促進脂質と組み合わせることができる。換言すれば、脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質の約４０／１０／４０／１０混合物を、モル百分率で約５０％の融合促進ペプチドと組み合わせると、得られる脂質粒子の全体モル比は、（モル％のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質／融合促進ペプチド）約２０／５／２０／５／５０になり得る。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質であるＤＳＰＣは、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置換される。
アポリポタンパク質
製剤は、アポリポタンパク質をさらに含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」は、当業者に公知のアポリポタンパク質およびその変異体および断片、ならびに下記に記載のアポリポタンパク質アゴニスト、そのアナログまたは断片を指す。
適切なアポリポタンパク質としては、これらに限定されないが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥ、ならびにそれらの活性多形型形態、アイソフォーム、変異体、および突然変異体と、それらの断片または短縮形態が挙げられる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、チオール含有アポリポタンパク質である。「チオール含有アポリポタンパク質」は、少なくとも１つのシステイン残基を含有するアポリポタンパク質、変異体、断片、またはアイソフォームを指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパク質は、１つのシステイン残基を含有するＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）である（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２９７：２０６−１３；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ ａｎｄ Ｏｄａ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：２０８９−９６）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２、およびＡｐｏＥ３も、チオール含有アポリポタンパク質である。単離されたＡｐｏＥならびに／またはその活性断片およびポリペプチドアナログは、その組換え産生形態を含めて、米国特許第５，６７２，６８５号明細書；同第５，５２５，４７２号明細書；同第５，４７３，０３９号明細書；同第５，１８２，３６４号明細書；同第５，１７７，１８９号明細書；同第５，１６８，０４５号明細書；および同第５，１１６，７３９号明細書に記載されている。ＡｐｏＥ３は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９８１）２５６：９０７７−９０８３；およびＲａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８２）７９：４６９６−４７００に開示されている。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ００３９６も参照されたい。
特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、その成熟形態であっても、そのプレプロアポリポタンパク質形態であっても、またはそのプロアポリポタンパク質形態であってもよい。プロおよび成熟のＡｐｏＡ−Ｉ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｋｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７９：（３）１６７９−８７；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（１４）：８６３７−４６；Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、およびＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８（１４）：８９９３−９０００）のホモダイマーおよびヘテロダイマー（実現可能の場合）も利用することができる。
特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体、またはアイソフォームであってもよい。用語「断片」は、天然のアポリポタンパク質よりも短いアミノ酸配列を有し、かつ脂質結合特性を含む、天然のアポリポタンパク質の活性を保持する任意のアポリポタンパク質を指す。「変異体」とは、脂質結合特性を含む、天然のアポリポタンパク質の活性を消失させないアポリポタンパク質のアミノ酸配列の置換または変更、例えばアミノ酸残基の付加および欠失を意味する。したがって、変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、化学的に類似のアミノ酸で保存的に置換されている、本明細書に提供する天然のアポリポタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドを含むことができる。保存的置換の例としては、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの少なくとも１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換が挙げられる。同様な例として、例えばアルギニンとリジンとの間の置換、グルタミンとアスパラギンとの間の置換、およびグリシンとセリンとの間の置換など、少なくとも１つの親水性残基の置換も、保存的置換である（米国特許第６，００４，９２５号明細書、同第６，０３７，３２３号明細書、および同第６，０４６，１６６号明細書を参照のこと）。用語「アイソフォーム」は、同じ機能、より大きな機能、または部分的な機能を有し、かつ類似の配列、同一の配列、または部分的な配列を有するタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物であってもそうでなくてもよく、通常は組織特異的であってもそうでなくてもよい。（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８；Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４０（１−３）：１８１−７；Ｗｅｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００（１−３）：４８１−９２；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３３）：２９９１９−２６；Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（２３）：１４８８８−９３、および米国特許第６，３７２，８８６号明細書を参照のこと）。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構築物の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築物は、虚血再潅流保護特性を有するアポリポタンパク質ドメインと結合した、高い脂質結合能を有するアポリポタンパク質ドメインで構成され得る。アポリポタンパク質のキメラ構築物は、アポリポタンパク質内の別々の領域を含む構築物（すなわち、同種構築物）であってもよく、またはキメラ構築物は、異なるアポリポタンパク質間の別々の領域を含む構築物（すなわち、異種構築物）であってもよい。キメラ構築物を含む組成物は、アポリポタンパク質変異体のセグメントまたは特定の性質（例えば、脂質結合性、受容体結合性、酵素特性、酵素活性化特性、抗酸化性、または酸化還元性）を有するように設計されたセグメントも含むことができる（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８；Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９（９）：２２１４−２５；Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ １９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：３２８−３８：Ｔｈｕｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０６２−７０；Ｄｙｅｒ １９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２３）：１５０００９−１５；Ｈｉｌｌ １９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３０９７９−８４を参照のこと）。
追加の実施形態では、本発明で利用されるアポリポタンパク質には、組換え、合成、半合成、または精製のアポリポタンパク質も含まれる。アポリポタンパク質またはその均等物を得るための方法は、当技術分野で周知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば密度勾配遠心分離または免疫親和性クロマトグラフィーにより血漿または天然物から分離するか、あるいは合成的に、半合成的に、または当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる（例えば、Ｍｕｌｕｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７９８（１−２）：８３−９０；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１；Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９；Ｐｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７１１：９７−１０９；米国特許第５，０５９，５２８号明細書、同第５，８３４，５９６号明細書、同第５，８７６，９６８号明細書、および同第５，７２１，１１４号明細書；ならびに国際公開第８６／０４９２０号パンフレットおよび国際公開第８７／０２０６２号パンフレットを参照のこと）。
アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するペプチドおよびペプチドアナログなどのアポリポタンパク質アゴニストをさらに含むことができる。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第６，００４，９２５号明細書、同第６，０３７，３２３号明細書、同第６，０４６，１６６号明細書、および同第５，８４０，６８８号明細書に記載のいずれのものであってもよい。
アポリポタンパク質アゴニストペプチドまたはペプチドアナログは、例えば、米国特許第６，００４，９２５号明細書、同第６，０３７，３２３号明細書、および同第６，０４６，１６６号明細書に記載の手法を含む、当技術分野で公知の任意のペプチド合成手法を使用して合成または製造することができる。例えば、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）により最初に記載された固相合成手法を使用して調製することができる。他のペプチド合成手法は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｄ Ｅｄ．，（１９７６）、および当業者に容易に入手可能な他の参考文献に見出すことができる。ポリペプチド合成手法の概要は、Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）に見出すことができる。ペプチドはまた、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｄ Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）に記載される溶液法により合成することもできる。種々のペプチド合成法で使用するのに適した保護基は、上述の文献およびＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）に記載されている。ペプチドはまた、例えばアポリポタンパク質Ａ−Ｉのより大きな部分から、化学的または酵素的切断により調製することもできる。
特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の混合物であってもよい。一実施形態では、アポリポタンパク質は、均質混合物、すなわち単一型のアポリポタンパク質であってもよい。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の不均質混合物、すなわち２種以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であってもよい。アポリポタンパク質の不均質混合物の実施形態は、例えば、動物供給源に由来するアポリポタンパク質と半合成的供給源に由来するアポリポタンパク質の混合物を含むことができる。特定の実施形態では、不均質混合物は、例えば、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏの混合物を含むことができる。特定の実施形態では、不均質混合物は、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ ＭｉｌａｎｏとＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓの混合物を含むことができる。本明細書に記載の方法および組成物で使用するのに適した混合物は、当業者には明らかである。
アポリポタンパク質は、天然の供給源から得る場合、植物または動物の供給源から得ることができる。アポリポタンパク質は、動物供給源から得る場合、いずれの種に由来してもよい。特定の実施形態では、アポリポタンパク質は動物供給源から得ることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質はヒト供給源から得ることができる。好ましい実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が投与される個体と同じ種に由来する。
治療剤−脂質粒子組成物および製剤
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載の脂質粒子と脂質粒子に結合している活性薬剤とを含む組成物に関する。特定の実施形態では、活性薬剤は治療剤である。一部の実施形態では、活性薬剤は脂質粒子の水性内部内に封入されている。他の実施形態では、活性薬剤は脂質粒子の１つまたは複数の脂質層内に存在する。他の実施形態では、活性薬剤は、脂質粒子の外部脂質表面または内部脂質表面に結合している。
本明細書で使用する場合、「完全に封入されている」とは、遊離核酸を顕著に分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに暴露された後でも、粒子中の核酸が顕著に分解されないことを示す。完全に封入された系では、例えば、遊離核酸を通常１００％分解する処理において、粒子核酸の約２５％未満、例えば、粒子核酸の約１０％未満または約５％未満しか分解されない。あるいは、完全封入化は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより決定することができる。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染色法である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）。完全封入化はまた、粒子が血清に安定であること、すなわち、粒子が、ｉｎ ｖｉｖｏ投与された際に、構成成分に急速に分解しないことを示唆する。
本明細書で使用する場合、活性薬剤には、細胞、組織、器官、または被験体に所望の効果を及ぼすことができる任意の分子または化合物が含まれる。例えば、そのような効果は生物学的、生理学的、または美容的なものであってもよい。活性薬剤は、これらに限定されないが、核酸、ペプチド、およびポリペプチドを含む、いかなるタイプの分子または化合物であってもよく、例えば、それらには、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、およびＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体などの抗体、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそれらのリガンド；ホルモン；ならびに小さな有機分子または化合物を含む小分子が挙げられる。
一実施形態では、活性薬剤は、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体治療活性があってもよく、またはさらなる修飾で活性になるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、修飾されていない薬剤と比較して、治療活性の一部または全部を保持するが、別の実施形態では、治療剤誘導体は治療活性を欠如している。
種々の実施形態では、治療剤には、例えば、抗炎症性化合物、抗うつ薬、刺激薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば抗不整脈薬、血管収縮剤、ホルモン、およびステロイドなどの治療上有効な任意の薬剤または薬物が含まれる。
特定の実施形態では、治療剤は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗悪性腫瘍薬などと呼ばれることもある腫瘍学的薬物である。使用することができる腫瘍学的薬物の例としては、これらに限定されないが、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈用ブスルファン、経口用ブスルファン、カペシタビン（ゼローダ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、サイクロスポリンＡ、シタラビン、サイトシンアラビノサイド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デキスラゾキサン、ドデタキセル（ｄｏｄｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシドホスフェート、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（ジェムザール）、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（カンプトスター（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ）、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、リュープロリド、レバミソール、リトレチノイン（ｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、メガストロール（ｍｅｇａｓｔｒｏｌ）、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキセート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロルアミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（ハイカムチン）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン（ｖｅｌｂａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられる。使用することができる腫瘍学的薬物の他の例には、エリプチシンおよびエリプチシンのアナログまたは誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、ならびにカンプトテシンがある。
核酸−脂質粒子
さらなる実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子は、核酸と結合して、核酸−脂質粒子を生じる。一部の実施形態では、核酸は、脂質粒子内に完全に封入される。本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。５０個以内のヌクレオチドを含有する断片は、一般にオリゴヌクレオチドと称され、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、１５〜５０ヌクレオチドである。
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、天然の塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」にはまた、同様に機能する非天然のモノマーまたはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーが含まれる。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの増大およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの特性のために天然の形態よりも好ましいことが多い。
脂質−核酸粒子中に存在する核酸には、公知の任意の核酸形態が含まれ得る。本明細書で使用する核酸は、一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッドとすることができる。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域および終結領域を含む遺伝子、ならびにウイルスまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、以下に記載するオリゴヌクレオチド修飾形態の１つまたは複数を含むことができる。
核酸は、一般に核酸の特定の形態に応じて、種々の長さにすることができる。例えば、一部の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子の長さは、約１，０００〜約１００，０００ヌクレオチド残基とすることができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、約１０〜約１００ヌクレオチドの範囲とすることができる。種々の実施形態では、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のオリゴヌクレオチドの長さは、約１０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、または約２０〜約３０ヌクレオチドの範囲とすることができる。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするか、またはそれに相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定かつ特異的な結合が生じるのに十分な相補性の程度を示すのに使用される用語である。特異的にハイブリダイズ可能であるために、オリゴヌクレオチドがその標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことが理解される。標的へのオリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常機能に干渉して、それに由来する効果または発現を消失させる場合で、かつ特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な相補性の程度がある場合に、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それがターゲティングするかまたは特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域に比較して、１つ、２つ、または３つの塩基置換、例えばミスマッチを含む。
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子を結合している。ＲＮＡｉ分子を使用するＲＮＡ干渉法は、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を破壊するために使用することができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、開発中の次世代標的化オリゴヌクレオチド薬として、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムに基本的に取って代わっている。
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる細胞質多タンパク質複合体と結合し得る、長さが通常１６〜３０ヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。ｓｉＲＮＡを負荷したＲＩＳＣは、相同なｍＲＮＡ転写物の分解を媒介し、したがって、ｓｉＲＮＡは、タンパク質発現を特異性高くノックダウンするように設計することができる。他のアンチセンス技術と異なり、ｓｉＲＮＡは、非コードＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するように進化した天然の機序により機能する。これが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｓｉＲＮＡの活性がアンチセンスＯＤＮまたはリボザイムのいずれよりも強力である理由と一般に考えられている。臨床に関連する標的をターゲティングするｓｉＲＮＡを含む、種々のＲＮＡｉ試薬が現在、例えばｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：４４３−４５３（２００７）に記載のように、医薬品として開発中である。
最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、現在では、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスのハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスのハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを媒介できることが実証されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．，（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１１１−１１９）。したがって、これら種々のタイプの二本鎖分子のいずれかを含むＲＮＡｉ分子の使用が企図される。さらに、ＲＮＡｉ分子は、種々の形態で使用および細胞導入することができることが理解される。したがって、本明細書で使用する場合、ＲＮＡｉ分子は、細胞でＲＮＡｉ反応を誘導することができるすべての分子を包含し、それらには、これらに限定されないが、２つの別々の鎖、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））；非ヌクレオチジルリンカーにより相互に連結される２つの別々の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド；二本鎖領域を形成する相補的配列のヘアピンループを含むオリゴヌクレオチド、例えばｓｈＲＮＡｉ分子、ならびに単独でまたは別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成できる１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターが挙げられる。
「一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、本明細書で使用する場合、単一分子から構成されるｓｉＲＮＡ化合物である。それは、鎖内対合により形成される二本鎖領域を含むことができ、例えば、ヘアピンまたはパンハンドル構造であっても、それを含んでもよい。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、標的分子に対してアンチセンスであることもある。
一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、ＲＩＳＣに入り、標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断に関与できるほど十分な長さであり得る。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の長さは、少なくとも１４ヌクレオチドであり、他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、その長さは、２００、１００、または６０ヌクレオチド未満である。
ヘアピンｓｉＲＮＡ化合物は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。二本鎖領域の長さは、２００、１００、または５０以下であり得る。特定の実施形態では、二本鎖領域の範囲の長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。ヘアピンには一本鎖オーバーハングまたは末端不対領域があってもよい。特定の実施形態では、オーバーハングの長さは２〜３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、オーバーハングは、ヘアピンのセンス側であり、一部の実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側である。
「二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、本明細書で使用する場合、鎖間ハイブリダイゼーションにより二本鎖構造の領域が形成され得る二本鎖以上、また一部の場合では二本鎖を含むｓｉＲＮＡ化合物である。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖の長さは、１４、１５、１６ １７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しいか、または少なくとも１４、１５、１６ １７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドとすることができる。その長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下とすることができる。長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドの範囲とすることができる。本明細書で使用する場合、用語「アンチセンス鎖」は、標的分子、例えば標的ＲＮＡに十分相補的なｓｉＲＮＡ化合物の鎖を意味する。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドとすることができる。その長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下とすることができる。長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドの範囲とすることができる。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の二本鎖部分の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドとすることができる。その長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下とすることができる。長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対の範囲とすることができる。
多くの実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、内因性分子、例えばダイサーにより切断されて、より小さなｓｉＲＮＡ化合物、例えばｓｉＲＮＡ剤を生成することができるほど十分大きい。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物が分子の一端または両端に一本鎖または不対領域を含むように、センス鎖およびアンチセンス鎖を選択することができる。したがって、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、オーバーハング、例えば１つもしくは２つの５’もしくは３’オーバーハング、または１〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含有するように対合した、センス鎖およびアンチセンス鎖を含有することができる。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長いことの結果である場合も、または同じ長さの２つの鎖がずれていることの結果である場合もある。一部の実施形態では、少なくとも１つの３’オーバーハングがある。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の両末端が３’オーバーハングを有する。一部の実施形態では、オーバーハングは２ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、二本鎖領域の長さは、例えば、上記で論じたｓｓｉＲＮＡ化合物の範囲では、１５〜３０ヌクレオチドの間、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチドである。ｓｓｉＲＮＡ化合物は、天然のダイサーによりプロセシングされた、長いｄｓｉＲＮＡに由来する産物に、長さおよび構造が類似することがあり得る。ｓｓｉＲＮＡ化合物の２つの鎖が連結、例えば共有結合している実施形態も含まれる。ヘアピン、または必要な二本鎖領域を提供する他の一本鎖構造、および３’オーバーハングも企図される。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物および一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を含む、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる。便宜上、そのようなｍＲＮＡは、本明細書では、サイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。そのような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内因性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡも標的になり得る。
本明細書で使用する場合、語句「ＲＮＡｉを媒介する」は、配列特異的な方法で標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論に拘束されたくはないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉの機構またはプロセス、およびガイドＲＮＡ、例えば２１〜２３ヌクレオチドのｓｓｉＲＮＡ化合物が使用されると考えられている。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」であり、そのため、ｓｉＲＮＡ化合物は標的ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡに「完全に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡ化合物をアニーリングすると、例えば完全に相補的な領域でワトソン−クリック型塩基対のみから作られるハイブリッドが形成される。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに完全に相補的な内部領域（例えば、少なくとも１０ヌクレオチド）を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、単一ヌクレオチド差を特異的に識別する。この場合、単一ヌクレオチド差がある領域（例えば、７ヌクレオチド以内）で完全な相補性が見出される場合のみ、ｓｉＲＮＡ化合物はＲＮＡｉを媒介する。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、動植物ゲノムのＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない高度に保存された小型ＲＮＡ分子のクラスである。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれるようになる、約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖ＲＮＡ分子であり、発生、細胞増殖、アポトーシス、および分化の重要な調節因子であると同定されている。それらは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の調節にある役割を果たすと考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳の阻害、転写物の切断、またはその両方によって、遺伝子発現のダウンレギュレーションを媒介する。ＲＩＳＣはまた、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は多くかつ増え続けており、その実例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に、またｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／にも見出すことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列、例えば標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なｍＲＮＡに結合することにより遺伝子発現を阻害すると考えられている。相補的なｍＲＮＡ鎖に結合してその翻訳を妨害するか、または標的ｍＲＮＡの分解を誘導するかのいずれかによって、標的ｍＲＮＡへの結合は、遺伝子発現の阻害をもたらすことができる。アンチセンスＤＮＡは、特定の相補的な（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的にするために使用することができる。結合が起こると、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは酵素ＲＮアーゼＨにより分解され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド、例えば、約１５〜約３０ヌクレオチドを含有する。この用語はまた、所望の標的遺伝子に完全には相補的でない可能性があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、非標的特異的活性がアンチセンスで見出される場合、または標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の使用にとって最も好ましい場合を企図する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効なターゲティング阻害剤であることが実証されており、そのため、標的遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は十分確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼおよびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それぞれのｍＲＮＡ配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号明細書および同第５，７５９，８２９号明細書）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、およびヒトＥＧＦで実証されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号明細書；同第５，７８９，５７３号明細書；同第５，７１８，７０９号明細書、および同第５，６１０，２８８号明細書）。さらに、種々の異常な細胞増殖、例えば癌を阻害し、治療するのに使用することができるアンチセンスコンストラクトも記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号明細書；同第５，５９１，３１７号明細書、および同第５，７８３，６８３号明細書）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法は、当技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するように容易に適合させることができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の分析、ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞において、標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低減または妨害することになるダイマー、ヘアピン、または他の二次構造を形成するそれらの能力の相対的な低さに基づいて選択することができる。ｍＲＮＡの高度に好ましい標的部位は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその近辺の領域、およびｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造分析および標的部位選択の検討は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施することができる。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、ＲＮアーゼ保護、ならびに組織および細胞取り込みの増強などの薬理学的特性のために種々の修飾を施されているＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖の完全２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格、および例えば３’−末端のコレステロール部分によって、通常のＲＮＡとは異なる。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒと内因性ｍｉＲＮＡを含む二本鎖を形成し、それによってｍｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングを妨害することにより、内因性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングするために使用することができる。アンタゴｍｉｒ媒介のｍｉＲＮＡサイレンシングの一例として、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載された、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングがある。アンタゴｍｉｒ ＲＮＡは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコールを使用して合成することができる。米国特許出願公開第２００７／０１２３４８２号明細書および同第２００７／０２１３２９２号明細書を参照されたい。
アンタゴｍｉｒは、オリゴヌクレオチド合成用のリガンドコンジュゲートしたモノマーサブユニットおよびモノマーを含むことができる。代表的なモノマーは、米国特許出願公開第２００５／０１０７３２５号明細書に記載されている。アンタゴｍｉｒは、国際公開第２００４／０８０４０６号パンフレットに記載のものなど、ＺＸＹ構造を有することができる。アンタゴｍｉｒは、両親媒性部分と複合体を形成することができる。オリゴヌクレオチド剤と共に使用する代表的な両親媒性部分は、国際公開第２００４／０８０４０６号パンフレットに記載されている。
アプタマー
アプタマーは、高親和性かつ高特異性で目的の特定分子に結合する核酸またはペプチドの分子である（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８（１９９０））。大きなタンパク質から小さな有機分子に至る多種多様な実体に結合するＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーの製造に成功している。Ｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−１６（１９９７），Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−９（１９９９）、およびＨｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０−５（２０００）を参照されたい。アプタマーは、ＲＮＡベースでもＤＮＡベースでもよく、リボスイッチを含んでもよい。リボスイッチは、小さな標的分子に直接結合することができ、その標的結合が遺伝子活性に影響を及ぼすｍＲＮＡ分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、その標的分子の有無に依存して、それ自体の活性の調節に直接関与する。一般に、アプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の反復ラウンドまたは同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）によって、例えば、小分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的、ならびに細胞、組織、および生体さえも結合するように操作される。アプタマーは、合成、組換え、および精製の方法を含む、公知の任意の方法により調製することができ、単独でまたは同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書により詳細に記載されるように、用語「アプタマー」は、所与の標的に対する２つ以上の公知のアプタマーを比較することにより得られるコンセンサス配列を含有する「二次的アプタマー」を特別に含む。
リボザイム
別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子はリボザイムと結合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ分子複合体である（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質にあるいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断する（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性の原因は、化学反応に先立って、基質が、特異的塩基対相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合しなければならないことにあると考えられている。
天然の酵素的ＲＮＡの少なくとも６つの基本的な種類が現在知られている。それぞれは、生理的条件下にて、トランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する、分子の酵素的部分に隣接して保持されている、酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。したがって、酵素的核酸は、相補的塩基対合を介して標的ＲＮＡを最初認識し、次いで結合するが、いったん正確な部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡが戦略的に切断されると、コード化タンパク質の合成に導くその能力が破壊されることになる。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合し切断した後、そのＲＮＡから放出されて別の標的を探索し、新しい標的に結合し切断することを繰り返して行うことができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、肝炎δウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と結合して）、またはニューロスポラＶＳ ＲＮＡモチーフに形成することができる。ハンマーヘッド型モチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピン型モチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０３６０２５７号明細書）、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４、および米国特許第５，６３１，３５９号明細書に記載されている。肝炎δウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載されており；ＲＮアーゼＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７に記載されており；ニューロスポラＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載されており；またグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号明細書に記載されている。使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、酵素的核酸分子が、標的遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡ領域の１つまたは複数に相補的な特異的基質結合部位を有すること、および基質結合部位の内部またはその周辺に、酵素的核酸分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイムコンストラクトを、本明細書に記述した特定のモチーフに限定する必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムを製造する方法は当技術分野で公知である。リボザイムは、国際公開第９３／２３５６９号パンフレットおよび国際公開第９４／０２５９５号パンフレットに記載のように設計および合成して、そこに記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。
リボザイム結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する修飾（例えば、国際公開第９２／０７０６５号パンフレット、国際公開第９３／１５１８７号パンフレット、国際公開第９４／１３６８８号パンフレット、および国際公開第９１／０３１６２号パンフレット；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号明細書；および米国特許第５，３３４，７１１号明細書を参照のこと；これらは、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に施すことができる種々の化学修飾を記載する）、細胞におけるそれらの効力を増強する修飾、およびＲＮＡ合成時間を短縮し、化学的要求性を低減するためのステムＩＩ塩基の除去を施したリボザイムを化学的に合成することにより、リボザイム活性を最適化することができる。
免疫刺激性オリゴヌクレオチド
脂質粒子に結合した核酸は、免疫刺激性であってもよく、それには被験体に投与されると、免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）が含まれる。被験体は、哺乳動物であっても他の患者であってもよい。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン型二次構造をもたらす特定のパリンドローム（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６を参照のこと）、またはＣｐＧモチーフ、ならびに他の公知のＩＳＳ形態（多重Ｇドメインなど、例えば国際公開第９６／１１２６６号パンフレットを参照のこと）が含まれる。
免疫応答は、自然免疫応答であっても適応免疫応答であってもよい。免疫系は、より先天性の免疫系と脊椎動物の後天性の適応免疫系とに分類され、後者はさらに、液性、細胞性の構成要素に分類される。特定の実施形態では、免疫応答は粘膜性であってもよい。
特定の実施形態では、免疫刺激性核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与される場合のみ、免疫刺激性であり、「遊離形態」で投与される場合には、免疫刺激性ではない。そのようなオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性であるとみなされる。
免疫刺激性核酸は、免疫応答を誘発するために標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、その発現を低下させることが必要とされない場合、配列非特異的であるとみなされる。したがって、特定の免疫刺激性核酸は、天然の遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含んでもよいが、それらは、依然として、配列非特異的な免疫刺激性核酸とみなされ得る。
一実施形態では、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくても、メチル化されていてもよい。別の実施形態では、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンはメチル化されている。別の実施形態では、核酸は、配列５’ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３’を含む。代替実施形態では、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つのシトシンはメチル化されている。さらなる実施形態では、配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれのシトシンは、メチル化されている。別の実施形態では、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つはメチル化シトシンを含む。
一実施形態では、核酸は、配列５’ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’を含む。別の実施形態では、
核酸配列は、配列５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’を含み、太字で示す２つのシトシンはメチル化されている。さらなる実施形態では、ＯＤＮは、以下に示すＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、ＯＤＮ＃３、ＯＤＮ＃４、ＯＤＮ＃５、ＯＤＮ＃６、ＯＤＮ＃７、ＯＤＮ＃８、およびＯＤＮ＃９からなるＯＤＮの群から選択される。
適切なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のさらなる核酸配列は、例えば、Ｒａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９８：１１８５−１１９２（２００１）に記載されている。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用するＯＤＮは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオエート（「ＰＳ」）骨格、および／またはＣｐＧモチーフ中に少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周辺にゲノムＤＮＡがない状態でも、その比較的短い結合配列を認識するので、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を有する短いオリゴヌクレオチドを、生細胞における遺伝子発現を操作するためのツールとして使用することができる。この戦略には、そのような「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内送達が含まれており、次いで、このデコイオリゴヌクレオチドは、標的因子に認識され結合される。デコイにより転写因子のＤＮＡ結合部位が占有されると、転写因子が標的遺伝子のプロモーター領域にその後結合することができなくなる。デコイは、転写因子により活性化される遺伝子の発現を阻害するために、または転写因子の結合により抑制される遺伝子をアップレギュレートするために、治療剤として使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの利用例は、例えば、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出すことができる。
スーパーｍｉｒ
スーパーｍｉｒは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその両方あるいはその修飾形態の一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを指し、そのヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、かつその標的に対してアンチセンスとなっている。この用語は、天然の核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間（骨格）共有結合から構成され、かつ同様に機能する少なくとも１つの非天然部分を含有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの望ましい特性のために天然の形態よりも好ましい。一実施形態では、スーパーｍｉｒはセンス鎖を含まず、別の実施形態では、スーパーｍｉｒはそれほど顕著に自己ハイブリダイズすることはない。スーパーｍｉｒは、二次構造を有し得るが、生理的条件下では実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーｍｉｒとは、スーパーｍｉｒの約５０％未満（例えば、約４０％未満、約３０％未満、約２０％、約１０％未満、または約５％未満）がそれ自体と二本鎖を形成する程度に一本鎖であるものである。スーパーｍｉｒは、ヘアピンセグメントを含んでもよく、例えば、好ましくは３’末端の配列が自己ハイブリダイズして、二本鎖領域、例えば、少なくとも１、２、３、または４ヌクレオチドで、かつ８、７、６、またはｎヌクレオチド未満、例えば５ヌクレオチドの二本鎖領域を形成してもよい。二本鎖領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば３、４、５、６ｄＴ、例えば修飾ｄＴによって連結することができる。別の実施形態では、スーパーｍｉｒは、例えば３’末端および５’末端の一方もしくは両方で、またはスーパーｍｉｒの一端および非末端もしくは中央で、例えば５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長のより短いオリゴと二本鎖を形成する。
ｍｉＲＮＡ模倣体
ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣するために使用することができる一群の分子を表す。したがって、用語「マイクロＲＮＡ模倣体」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる、合成の非コードＲＮＡを指す（すなわち、このｍｉＲＮＡは、内因性ｍｉＲＮＡの供給源から精製により得ることができない）。ｍｉＲＮＡ模倣体は、成熟分子（例えば、一本鎖）または模倣体前駆体（例えば、プリ−またはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、限定はされないが、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ロックされた核酸、もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、または上記の任意の組合せ（ＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッドを含む）を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸（修飾または修飾核酸）で構成することができる。さらに、ｍｉＲＮＡ模倣体は、送達、細胞内区画化、安定性、特異性、機能性、鎖使用、および／または効力に影響を及ぼすことができるコンジュゲートを含むことができる。一設計では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、二本鎖分子（例えば、約１６〜約３１ヌクレオチド長の間の二本鎖領域を有する）であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖と同一性を有する、１つまたは複数の配列を含有する。修飾は、分子の一方または両方の鎖上の２’修飾（２’−Ｏメチル修飾および２’Ｆ修飾を含む）ならびに核酸の安定性および／または特異性を増強するヌクレオチド間修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）を含むことができる。さらに、ｍｉＲＮＡ模倣体はオーバーハングを含むことができる。オーバーハングは、いずれかの鎖の３’末端または５’末端のいずれかにある１〜６ヌクレオチドからなることができ、安定性または機能性を増強するように修飾することができる。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、１６〜３１ヌクレオチドの二本鎖領域および以下の化学修飾パターンの１つまたは複数を含む：センス鎖は、ヌクレオチド１および２（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）ならびにすべてのＣおよびＵの２’−Ｏメチル修飾を含み；アンチセンス鎖修飾は、すべてのＣおよびＵの２’Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化、ならびに２ヌクレオチドの３’オーバーハングに関連した安定なヌクレオチド間結合を含むことができる。
アンチｍｉｒまたはｍｉＲＮＡ阻害剤
用語「アンチｍｉｒ」、「マイクロＲＮＡ阻害剤」、「ｍｉＲ阻害剤」または「阻害剤」は同意語で、特定のｍｉＲＮＡの能力に干渉するオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドを指す。一般に、阻害剤は、本質的には核酸または修飾核酸であり、例えば、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、または上記の任意の組合せを含むオリゴヌクレオチドである。修飾には、送達、安定性、特異性、細胞内区画化、または効力に影響を及ぼすことができる２’修飾（２’−０アルキル修飾および２’Ｆ修飾を含む）ならびにヌクレオチド間修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）が含まれる。さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、送達、細胞内区画化、安定性、および／または効力に影響を及ぼすことができるコンジュゲートを含むことができる。阻害剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖）、およびヘアピン構造を含む種々の立体配置をとることができ、一般に、マイクロＲＮＡ阻害剤は、標的とされるｍｉＲＮＡの成熟鎖（１つまたは複数の鎖）に相補的または部分的に相補的な１つまたは複数の配列または配列部分を含み、さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡの逆相補鎖である配列の５’および３’に位置する付加配列も含むことができる。この付加配列は、成熟ｍｉＲＮＡが由来するプリ−ｍｉＲＮＡ中の成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列の逆相補鎖であってもよく、この付加配列は、任意の配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵの混合物を有する）であってもよい。一部の実施形態では、１つまたは両方の付加配列は、ヘアピン型を形成できる任意の配列である。したがって、一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの逆相補鎖である配列は、５’側面および３’側面にヘアピン構造が隣接している。マイクロＲＮＡ阻害剤は、二本鎖の場合、反対鎖上のヌクレオチドとの間にミスマッチを含むことがある。さらに、マイクロＲＮＡ阻害剤は、細胞への阻害剤の取り込みを促進するために、コンジュゲート部分に連結することができる。例えば、マイクロＲＮＡ阻害剤を、細胞へのマイクロＲＮＡ阻害剤の受動取り込みを可能にするコレステリル５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３ヒドロキシペンチルカルバマートに連結することができる。マイクロＲＮＡ阻害剤は、ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害剤を含めて、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”ＲＮＡ １３：７２３−７３０（２００７）ならびに国際公開第２００７／０９５３８７号パンフレットおよび国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレットに詳細に記載されている。当業者は、所望のｍｉＲＮＡに対する配列をデータベースから選択し、本明細書に開示の方法に有用な阻害剤を設計することができる。
Ｕ１アダプター
Ｕ１アダプターは、ポリＡ部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソン内の部位に相補的な標的ドメインおよびＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１核内低分子ＲＮＡ成分に結合する「Ｕ１ドメイン」を有する二機能性オリゴヌクレオチドである（Ｇｏｒａｃｚｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２５７−２６３）。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、プレ−ｍＲＮＡのエキソン−イントロン境界への結合によって、スプライセオソーム形成の初期段階を主に導くように機能するリボ核タンパク質複合体である（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９：７７−９５）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡ塩基対の５’末端のヌクレオチド２〜１１は、プレｍＲＮＡの５’ｓｓと結合する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＵ１アダプターである。一実施形態では、Ｕ１アダプターは、少なくとも１つの他のｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与することができる。
オリゴヌクレオチド修飾
未修飾のオリゴヌクレオチドは、一部の用途では最適であるとは言い難いことがあり、例えば、未修飾のオリゴヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼによって分解を受けやすい場合がある。ヌクレアーゼは、核酸ホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドの化学修飾により、改善された特性を付与することができ、例えば、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定にすることができる。
オリゴヌクレオチドは、サブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、以下に記載の修飾の多く、例えば、塩基、糖、ホスフェート部分、またはホスフェート部分の非架橋酸素の修飾は、オリゴヌクレオチド内の反復位置で起こる。所与のオリゴヌクレオチド内のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、前述の修飾の２つ以上が、単一オリゴヌクレオチドに組み込まれてもよく、さらにはオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドに組み込まれてもよい。
一部の場合では、修飾は、オリゴヌクレオチド内の対象位置のすべてに起こることになるが、多くの場合、実際にはほとんどの場合で、そうはならない。例として、修飾が、３’または５’の末端位置でのみ起こる場合、内部領域でのみ起こる場合、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置で、またはオリゴヌクレオチドの最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ起こる場合がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で起こってもよい。修飾は、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域でのみ起こってもよく、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖領域でのみ起こってもよい。例えば、非架橋酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方の末端または両方の末端でのみ起こってもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ起ってもよく、二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端で起こってもよい。１つまたは複数の５’末端をリン酸化することができる。
本明細書に記載の修飾は、単独の修飾であっても複数のヌクレオチド上に含まれる単独型の修飾であってもよく、または修飾は、本明細書に記載の１つまたは複数の他の修飾と組み合わせてもよい。本明細書に記載の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上で組み合わせてもよく、例えば、オリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドが本明細書に記載の異なる修飾を有する。
一部の実施形態では、例えば安定性を増強するために、オーバーハングに特定の核酸塩基を含めること、あるいは一本鎖オーバーハングに、例えば５’もしくは３’のオーバーハングまたはその両方に修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド代用物を含めることが望ましい。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。一部の実施形態では、３’または５’のオーバーハングのすべてまたは一部を、例えば、本明細書に記載の修飾で修飾する。修飾としては、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基への修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりにデオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンの使用、およびリン酸基の修飾、例えばホスホチオエート修飾が挙げられる。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
さらなる代表的な修飾を以下に詳細に論じる。
リン酸基
リン酸基は負に荷電した化学種である。電荷は、２つの非架橋酸素原子上に均等に分布する。しかしながら、リン酸基は、酸素の１つを異なる置換基で置換することにより修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果として、核酸分解切断に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性を増大させることができる。したがって、理論に拘束されたくはないが、一部の実施形態では、無電荷のリンカーまたは非対称的な電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を導入することが望ましいことがある。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。特定の実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つは、以下のいずれかと置換することができる：Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（例えばアルキル基またはアリール基）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリールである）、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）。未修飾リン酸基中のリン原子はアキラルである。しかしながら、上記の原子または原子団の１つで非架橋酸素の１つを置換すると、リン原子はキラルになる；換言すれば、このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、不斉中心になる。不斉リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを保持することができる。
ホスホロジチオアートは、両方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオアート中のリン中心はアキラルであり、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成が排除される。したがって、理論に拘束されたくはないが、キラル中心を消失させる、両方の非架橋酸素に対する修飾、例えばホスホロジチオアートの形成は、ジアステレオマー混合物を生成し得ないという点で望ましい場合がある。したがって、非架橋酸素を独立して、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のいずれか１つにしてもよい。
リン酸リンカーはまた、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによっても修飾することができる。置換は、いずれかの連結酸素で起こっても、両方の連結酸素で起こってもよい。架橋酸素がヌクレオシドの３’−酸素である場合、炭素による置換が一実施形態である。架橋酸素がヌクレオシドの５’−酸素である場合、窒素による置換が一実施形態である。
リン酸基の置換
リン酸基は、リンを含有しない連結基と置換することができる。理論に拘束されたくはないが、荷電ホスホジエステル基は、核酸分解の反応中心であるので、これを中性の構造模倣体で置換すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上するはずと考えられる。再度、理論に拘束されたくはないが、一部の実施形態では、荷電リン酸基を中性部分に置換する改変を導入することが望ましいことがある。
リン酸基を置換することができる部分の例としては、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。代表的な置換としては、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が挙げられる。
リン酸に連結した酸素の少なくとも１つが置換されているか、またはリン酸基が非リン基に置換されている修飾リン酸結合は、「非ホスホジエステル骨格結合」とも呼ばれる。
リボリン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物で置換されているオリゴヌクレオチド模倣スキャフォールドを構築することもできる。理論に拘束されたくはないが、反復して電荷がある骨格が存在しないと、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が低下すると考えられる。再度、理論に拘束されたくはないが、一部の実施形態では、塩基を中性の代用骨格によって保持する改変を導入することが望ましいことがある。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられる。好ましい代用物は、ＰＮＡ代用物である。
糖修飾
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基のすべてまたは一部の修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」置換基または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。理論に拘束されるものではないが、このヒドロキシルは、もはや脱プロトン化されて２’−アルコキシドイオンを形成することができない以上、安定性の向上が観察される可能性がある。２’−アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内求核攻撃により分解を触媒することができる。再度、理論に拘束されたくはないが、一部の実施形態では、２’位でのアルコキシド形成が可能でない改変を導入することが望ましいことがある。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、−ＯＲ、ここで、Ｒは、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である（例えば、−ＯＲはアルコキシまたはアリールオキシであり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（ここで、Ｒは上記に定義されたとおりであり、ｎは１〜２０である）；「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）、ここで、２’ヒドロキシルは、例えばメチレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素に結合している；−Ｏ−アミン（ここで、アミンは、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノである）；アミノアルコキシ；−Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン（ここで、ｎは１〜２０であり、アミンは、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノである）が挙げられる。一実施形態では、この基はメトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）である。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、部分的にｄｓ ＲＮＡのオーバーハング部分に特に関連するデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（ここで、アミンは、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノであり、ｎは１〜２０である）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここで、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは例えばアミノ官能基で場合によっては置換されていてもよい）が挙げられる。特定の実施形態の他の置換基としては、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロが挙げられる。
糖基は、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学配置を有する１つまたは複数の炭素を含有することもできる。したがって、オリゴヌクレオチドは、例えば糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。モノマーは、糖の１’位にアルファ結合を有することができる（例えば、アルファヌクレオシド）。オリゴヌクレオチドは、Ｃ−１’に核酸塩基を欠く「脱塩基」糖を含むこともできる。これらの脱塩基糖は、構成糖原子の１つまたは複数にさらに修飾を含有することもできる。オリゴヌクレオチドは、Ｌ型の１つまたは複数の糖（例えば、Ｌ−ヌクレオシド）を含有することもできる。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することができる。そのような修飾は、分子の３’末端にあっても、５’末端にあっても、または両末端にあってもよい。それらには、末端リン酸全体の修飾または置換、あるいはリン酸基の原子の１つまたは複数の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、標識部分、例えばフルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）、または保護基（例えばイオウ、シリコン、ホウ素、またはエステルに基づいた）などの他の機能的分子実体にコンジュゲートすることができる。機能的分子実体をリン酸基および／またはリンカーを介して糖に結合することができる。リンカーの末端原子を、リン酸基の連結原子に、あるいは糖のＣ−３’またはＣ−５’のＯ、Ｎ、Ｓ、またはＣの基に結合またはそれらと置換することができる。あるいは、リンカーを、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に結合またはそれと置換することができる。
リンカー／リン酸−機能的分子実体−リンカー／リン酸のアレイが、ｄｓＲＮＡの２つの鎖の間に挿入される場合、このアレイは、ヘアピン型ＲＮＡ剤におけるヘアピンＲＮＡループの代わりになることができる。
本明細書の他の箇所で論じたものを含めて、いくつかの理由で、活性を調節するためまたは分解に対する耐性を調節するための末端修飾を加えることができる。活性を調節するために有用な末端調節としては、リン酸またはリン酸アナログによる５’末端の修飾が挙げられ、例えば、特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、特にアンチセンス鎖が５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリルアナログを含む。５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合するものが含まれる。適切な修飾としては、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；）５’−一ジチオリン酸（ホスホロジチオアート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／イオウ置換一リン酸、二リン酸、三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−アルファ−チオ三リン酸および５’−ガンマ−チオ三リン酸）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（例えば、Ｒ−Ｐ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−Ｒ、ここで、Ｒは、メチル、エチル、イソプロピル、またはプロピルなどのアルキル）、または（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−；ならびに５’−アルキルエーテルホスホネート（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、ここで、Ｒは、メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）またはエトキシメチルなどのアルキルエーテルである）が挙げられる。一実施形態では、一本鎖ｉＲＮＡ剤の５’末端、または二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の５’末端は、リン酸化されること、または上記に記載のものなどのホスホリルアナログを含むことが可能である。
末端修飾は、分布をモニターするためにも有用となり得るが、そのような場合、付加するのに好ましい基としては、フルオロフォア、例えば、フルオレセインまたはＡｌｅｘａ色素、例えばＡｌｅｘａ ４８８が挙げられる。末端修飾は、取り込みの増強にも有用となり得るが、このために有用な修飾としてはコレステロールが挙げられる。末端修飾は、ＲＮＡ剤を他の部分に架橋するためにも有用となり得るが、このために有用な修飾としては、マイトマイシンＣが挙げられる。
核酸塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルがＲＮＡで見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基は、特性が改善したＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドを、これらの塩基を用いて、または合成および天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、もしくはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ））ならびに上記の修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。あるいは、上記の任意の塩基の置換または修飾アナログ、例えば、本明細書に記載の「異常塩基」、「修飾塩基」、「非天然塩基」、および「汎用塩基」を使用することができる。例としては、限定はされないが、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、および２−アミノプロピルアデニンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示のもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示のもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示のものが挙げられる。
カチオン性基
オリゴヌクレオチドに対する修飾はまた、糖、塩基、および／またはリン酸または修飾リン酸骨格部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン性基の結合を含むことができる。カチオン性基は、天然、異常、または汎用の塩基上で置換可能な任意の原子に結合することができる。適切な位置は、ハイブリダイゼーションを妨害しない位置、すなわち、塩基対合に必要とされる水素結合相互作用を妨害しない位置である。カチオン性基は、糖のＣ２’位または環式もしくは非環式糖代用物の類似の位置を介して結合することができる。カチオン性基としては、例えば、プロトン化アミノ基、例えば、Ｏ−アミン（アミンは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノ）；アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン、（例えば、ｎは１〜２０であり、アミンは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノもしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、もしくはアミノ酸）；またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（ここで、アミンは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ）に由来するものを挙げることができる。
オリゴヌクレオチド内での配置
さらなる実施形態では、修飾は、特定の位置で、例えば、鎖内部の位置で、またはオリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端上でオリゴヌクレオチドに含まれていてもよい。例えば、オリゴヌクレオチド上のある特定の位置の修飾は、この薬剤に好ましい特性を付与することができる。例えば、特定の修飾の位置は、最適な遺伝子サイレンシング特性、またはエンドヌクレアーゼ活性もしくはエキソヌクレアーゼ活性に対する増大した耐性を付与することができる。
オリゴヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドに、２’−５’結合があってもよい。オリゴヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドに、反転した結合、例えば、３’−３’、５’−５’、２’−２’、または２’−３’結合があってもよい。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、末端５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである、末端５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、末端５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである、末端５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである、末端５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである、末端５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチドを含むことができる。これらの修飾を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ活性に対して特に安定化される。
リガンド
多種多様な実体を、オリゴヌクレオチドおよび脂質に結合することができる。適切な部分は、テザーを介在させて、直接的または間接的に、例えば共有結合で結合されるリガンドである。
特定の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれる分子の分布、ターゲティング、または寿命を変化させる。一部の実施形態では、リガンドは、選択された標的、例えば分子、細胞もしくは細胞型、コンパートメント、例えば細胞コンパートメントまたは器官コンパートメント、組織、器官、または体内部位に対する親和性を、例えばそのようなリガンドのない化学種に比較して増強する。選択された標的に対する親和性を増強するリガンドは、ターゲティングリガンドとも呼ばれる。脂質にコンジュゲートする代表的なリガンドは、ターゲティングリガンドである。
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、および／または組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存的な膜活性および膜融合性を示すポリアニオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。特定の実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨで、その活性コンフォメーションをとる。「活性」コンフォメーションとは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、および／または組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。代表的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられる。特定の実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化する化学基（例えば、アミノ酸）を含有することができる。エンドソーム溶解成分は、線状であっても分枝状であってもよい。ペプチドベースのエンドソーム溶解リガンドの代表的な一次配列を表３に示す。
代表的なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を改善することができ、その結果得られる天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載のモノマーおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性も改善することができる。
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子；例えば、分布をモニターするための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含むことができる。一般的な例としては、例えば、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
リガンドとしては、天然の物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換え分子であっても、合成分子であってもよく、例えば、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとして、ターゲティング基、例えば、細胞または組織のターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を挙げることもできる。ターゲティング基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グルコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであってもよい。表４に、ターゲティングリガンドおよびその関連受容体の例を一部示す。
リガンドの他の例としては、これらに限定されないが、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えば共リガンドに対する特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であってもよい。リガンドには、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。リガンドには、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーなどの非ペプチド性化学種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であってもよい。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格の破壊によって（例えば、細胞の微小管、微小線維、および／または中間径フィラメントの破壊によって）、ｉＲＮＡの細胞への取り込みを増大させ得る物質（例えば、薬物）であってもよい。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であってもよい。
リガンドは、例えば、炎症応答を活性化することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増大させることができる。そのような効果を有するであろう代表的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、インターロイキン−１ベータ、またはガンマインターフェロンが挙げられる。
一実施形態では、リガンドは脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば体内の非腎臓標的組織にコンジュゲートが分布することを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であってもよい。ＨＳＡに結合することができる他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキセン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性の増大、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜へのターゲティングもしくは輸送の増大、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調節するための使用を可能にする。
脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織への結合を調節するために、例えば制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓にターゲティングされる可能性が低く、したがって、体内から排出される可能性も低くなる。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートを腎臓にターゲティングするために使用することができる。
一実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。例えば、このリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合を解消することができないほど強くはないことが望ましい。
別の実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、またはまったく結合せず、そのためコンジュゲートは腎臓に分布することになる。腎臓細胞にターゲティングする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞に取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性型または非悪性型の、例えば癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患を治療するのに有用である。代表的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の代表的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。さらに、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）も含まれる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。特定の実施形態では、薬剤は両親媒性である。代表的な薬剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド結合または擬似ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、修飾することができる。ヘリックス型薬剤は、好ましくはアルファヘリックス型薬剤であり、これには親油性相と疎油性相とがあることが好ましい。
リガンドは、ペプチドであってもペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の明確な３次元構造にフォールディングできる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約５〜５０アミノ酸、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０アミノ酸とすることができる（例えば表５を参照のこと）。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅから主としてなる）であってもよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束性ペプチド、または架橋ペプチドであってもよい。別の代替案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。代表的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦアナログ（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）はまた、ターゲティング部分にもなり得る。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであってもよく、それによって、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を横切って運搬することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）由来の配列が、送達ペプチドとして機能可能であることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ−１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。例えば、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体として、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などの細胞ターゲティングペプチドがある。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲に及ぶことができる。ペプチド部分は、安定性を増大させる、またはコンフォメーション特性を指示するような構造修飾を有することができる。以下に記載の任意の構造修飾を利用することができる。
ＲＧＤペプチド部分は、内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む、種々の他の組織の腫瘍へのｉＲＮＡ剤のターゲティングを促進することができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓へのターゲティングを促進する。ＲＧＤペプチドは線状であっても環状であってもよく、特定の組織へのターゲティングを促進するために修飾すること、例えば、グリコシル化またはメチル化を施すことができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。
増殖細胞に濃縮されるマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、具体的には、αｖβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、そのようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。このタイプの代表的なコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば本明細書に記載の癌遺伝子を標的とするリガンドである。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−ヘリックス型線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１種または２種のアミノ酸のみを主に含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であってもよい。細胞透過性ペプチドには、核移行シグナル（ＮＬＳ）も含まれ得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの２つの部分からなる両親媒性ペプチドであってもよい（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤および／または担体オリゴマーに連結されたターゲティングペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであってもよい。代表的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、これらに限定されないが、セクロピン、リコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン、Ｓ．クラバ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、デルナセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−１、およびカエリンが挙げられる。ヘリックス安定性を完全な状態に維持するために、いくつかの因子を考慮することが好ましいであろう。例えば、ヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）を最大数利用し、ヘリックス不安的化残基（例えば、プロリンまたは環状モノマー単位）を最小数利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは代表的なＮ−キャッピング残基であり、かつ／またはＣ末端アミド化は、ヘリックスを安定化するための追加のＨ−結合を提供するために使用することができる）。ｉ±３またはｉ±４の位置離れた、反対電荷を有する残基間に塩橋が形成されると、安定化が起こり得る。例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基のグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩橋を形成することができる。
ペプチドおよびペプチド模倣体リガンドとして、天然または修飾のペプチド、例えば、ＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置換された、１つまたは複数のアミド（すなわちペプチド）結合を有するペプチド；あるいは環状ペプチドを有するものが挙げられる。
ターゲティングリガンドは、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドであってよい。例としては、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスターなどの糖クラスター、またはアプタマーがある。クラスターは、２つ以上の糖単位の組合せである。ターゲティングリガンドには、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬおよびＨＤＬリガンドも含まれる。リガンドはまた、核酸ベースであっても、例えばアプタマーであってもよい。アプタマーは、未修飾であっても、本明細書に開示の修飾の任意の組合せを有していてもよい。
エンドソーム放出剤としては、例えば、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスクされたオリゴ−またはポリ−カチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスクされたまたはマスクされていないカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスクされたまたはマスクされていないカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
ＰＫ調節物質は、薬物動態調節物質を意味する。ＰＫ調節物質としては、例えば、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク結合剤、ＰＥＧ、およびビタミンが挙げられる。代表的なＰＫ調節物質としては、これらに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、およびビオチンが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、約１０塩基、約１５塩基、または約２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）適用可能である。
さらに、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして適用可能である。
適用可能な他のリガンドは、米国特許出願第２００５／０１０７３２５号明細書、同第２００５／０１６４２３５号明細書、および同第２００８−０２５５３４５号明細書、ならびに米国特許第７，０２１，３９４号明細書および同第７，６２６，０１４号明細書に記載されている。
２つ以上のリガンドが存在する場合、それらのリガンドがすべて同じ特性を有していても、すべて異なる特性を有していてもよく、または一部のリガンドは同じ特性を有するが他のリガンドは異なる特性を有していてもよい。例えば、リガンドはターゲティング特性を有しても、エンドソーム溶解活性を有しても、またはＰＫ調節特性を有してもよい。一実施形態では、リガンドはすべて異なる特性を有する。
リガンドは、種々の場所で、例えば３’末端、５’末端、および／または内部の位置でオリゴヌクレオチドに結合させることができる。好ましい実施形態では、リガンドは、テザーを介在させてオリゴヌクレオチドに結合させる。モノマーを成長鎖に組み込む場合、リガンドまたはテザーを介在させたリガンドを、前記モノマー上に存在させることができる。一部の実施形態では、「前駆体」モノマーを成長鎖に組み込んだ後に、前記「前駆体」モノマーへの結合を介してリガンドを組み込むことができる。例として、例えば末端がアミノであるテザーを有する（すなわち、結合リガンドを有していない）モノマー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を、成長するセンス鎖またはアンチセンス鎖に組み込むことができる。次の操作で、すなわち鎖に前駆体モノマーを組み込んだ後、続けて、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの求核基とをカップリングさせることによって、前駆体モノマーに結合させることができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方の鎖または両方の鎖に結合させることができる。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートしたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートしたリガンドを含有する。
一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートさせることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションは、環内および環外の原子を含む、任意の位置で行うことができる。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２、６、７、または８位に、コンジュゲート部分を結合させる。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションも、任意の位置で行うことができる。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２、５、および６位を、コンジュゲート部分で置換することができる。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子で行うことができる。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’の炭素原子が含まれる。さらに、脱塩基残基の場合などには、１’位にコンジュゲート部分を結合させることができる。ヌクレオシド間結合に、コンジュゲート部分を保持させることもできる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオテート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、ホスホロアミデート等）の場合は、コンジュゲート部分を、直接リン原子に、またはリン原子に結合したＯ、Ｎ、もしくはＳ原子に結合させることができる。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合は、コンジュゲート部分を、アミンもしくはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合させることができる。
オリゴマー化合物のコンジュゲートを調製するための方法は数多くある。一般に、オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物上の反応性基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒド等）をコンジュゲート部分上の反応性基と接触させることによりコンジュゲート部分に結合させる。一部の実施形態では、一方の反応性基は求電子性であり、他方は求核性である。
例えば、求電子基をカルボニル含有官能基とすることができ、求核基をアミンまたはチオールとすることができる。核酸および関連オリゴマー化合物の、連結基を用いたコンジュゲーションおよび用いないコンジュゲーションのための方法は、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １７などの文献に詳細に記載されている。
核酸−脂質粒子の特徴
核酸が脂質層内部に封入されている、脂質に封入された核酸粒子を生成するための方法および組成物を提供する。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み込む、そのような核酸−脂質粒子は、（１）薬物対脂質比；（２）封入効率；および（３）粒子サイズを含む種々の生物物理学的パラメーターを使用して特徴づけられる。高い薬物対脂質比、高い封入効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに制御可能な粒子サイズ、通常２００ｎｍ未満の直径が望ましい。さらに、ヌクレアーゼ耐性を付与するための、負担を伴う核酸の修飾は、多くの場合、限定された耐性しか提供しないものの、治療コストを追加することになるので、核酸ポリマーの性質は重要である。他に記述がないかぎり、これらの基準は本明細書中で以下のように計算される。
核酸対脂質比は、規定量の調製物中の核酸量を同量中の脂質量で割ったものである。これは、モル当たりのモルに基づいても、重量当たりの重量に基づいても、モル当たりの重量に基づいてもよい。最終的な投与用製剤の場合、核酸：脂質比は、透析、クロマトグラフィー、および／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化を用いて、外部核酸を可能な限り除去した後に計算される。
封入効率は、出発混合物の薬物対脂質比を、最終的な投与可能製剤の薬物対脂質比で割ったものを指す。これは相対効率の尺度である。絶対効率の尺度の場合は、最終的に投与可能製剤になる出発混合物に添加される核酸の総量を計算することもできる。製剤工程の間に失われる脂質量を計算することもできる。効率は、製剤の損失および費用の尺度である；および
サイズは、形成される粒子のサイズ（直径）を示す。サイズ分布は、Ｎｉｃｏｍｐ Ｍｏｄｅｌ ３７０サブミクロン粒子サイズ測定器で準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して決定することができる。２００ｎｍ未満の粒子は、新生物および炎症部位などの新生血管形成のある（漏出性）組織への分布のために好ましい。
医薬組成物
脂質粒子は、特に治療剤を結合した場合、医薬組成物として製剤化することができ、医薬組成物は、投与経路および標準的薬務に従って選択される、生理食塩水またはリン酸緩衝液などの薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含む。
特定の実施形態では、脂質−核酸粒子を含む医薬組成物は、標準手法によって調製され、薬学的に許容される担体をさらに含む。通常、生理食塩水を薬学的に許容される担体として使用する。他の適切な担体としては、例えば、アルブミン、リポタンパク質、およびグロブリンなど、安定性を増強する糖タンパク質を含む、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン等が挙げられる。生理食塩水または他の塩含有担体を含む組成物では、担体は、好ましくは脂質粒子を形成した後に添加する。したがって、脂質−核酸組成物を形成した後に、生理食塩水などの薬学的に許容される担体中に組成物を希釈することができる。
得られる医薬調製物は、従来の周知の滅菌手法によって滅菌することができる。その後、水溶液は、使用のために包装するか、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌水溶液と混合する。組成物は、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤など、生理的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含有することができる。さらに、脂質懸濁液は、保存時にフリーラジカルおよび脂質過酸化による損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャー、およびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレーターが適している。
医薬製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、例えば、約０．０１重量％未満、通常は、約０．０５〜約５重量％または少なくとも約０．０５〜約５重量％から約１０〜約３０重量％までも幅広く変化させることができ、選択された特定の投与方法に応じて、主として液量、粘性により選択される。例えば、濃度を増大させて、治療に伴う液体負荷を低下させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症に付随したうっ血性心不全または重度の高血圧症に罹患した患者において、特に望ましい場合がある。あるいは、刺激性脂質で構成される複合体を低濃度に希釈して、投与部位での炎症を軽減することができる。一群の実施形態では、核酸は標識を結合しており、診断（相補的な核酸の存在を示すことによる）のために使用される。この例では、投与する複合体の量は、使用する特定の標識、疾患状態の診断、および臨床医の判断に依存することになるが、通常、体重１キログラム当たり約０．０１〜約５０ｍｇの間、例えば、体重の約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇの間となる。
脂質−治療剤組成物は、キットの形態で提供することもできる。キットは、典型的には、キットの種々の要素を収納するために区画化された容器で構成される。キットは、粒子または医薬組成物を、好ましくは脱水形態または濃縮形態で、それらの再水和または希釈および投与のための指示書と共に含有する。特定の実施形態では、粒子は活性薬剤を含むが、他の実施形態では、含まない。
製造方法
記載の方法および組成物は、特定のカチオン性脂質を活用し、その合成、調製、特性評価は、例えば、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット、国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット；ならびに国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット、ならびにそれらの中で参照される出願、例えば、２００８年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１０４，２１９号明細書；２００８年１１月１０日に出願された同第６１／１１３，１７９号明細書；２００９年２月２０日に出願された同第６１／１５４，３５０号明細書；２００９年４月２１日に出願された同第６１／１７１，４３９号明細書；２００９年５月５日に出願された同第６１／１７５，７７０号明細書；２００９年６月９日に出願された同第６１／１８５，４３８号明細書；２００９年７月１５日に出願された同第６１／２２５，８９８号明細書；および２００９年８月１４日に出願された同第６１／２３４，０９８号明細書；国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット；および国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。例えば、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレットの１６〜２１頁にある表１および米国仮特許出願第６１／２８７，９９５号明細書の２８〜５３頁および１３５〜１４１頁にある表１〜４および９を参照されたい。
さらに、治療剤、例えば核酸に結合したものを含む脂質粒子を調製する方法を説明する。本明細書に記載の方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝水溶液と混合して、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間混合物を生成する。ここで、封入された核酸は、約３重量％〜約２５重量％、例えば約５〜１５重量％の核酸／脂質比で存在する。中間混合物を場合によっては、サイズによって分別し、脂質部分が、好ましくは約３０〜約１５０ｎｍ、例えば約４０〜約９０ｎｍの直径を有する単層小胞である脂質−封入核酸粒子を得ることができる。次いで、ｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それによって、少なくとも部分的に表面が中和された脂質−封入核酸組成物を提供する。
上記に記載のように、これらのカチオン性脂質のいくつかは、アミノ基のｐＫａよりも低いｐＨで荷電し、ｐＫａよりも高いｐＨで実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、二段階プロセスを使用する製剤化で使用することができる。第１に、滴定可能なカチオン性脂質および他の小胞成分を用いて、核酸の存在下、より低いｐＨで脂質小胞を形成することができる。このようにして、小胞は核酸を封入し捕捉する。第２に、媒体のｐＨを、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａを超えるレベル、すなわち、生理的ｐＨ以上に上昇させることにより、新しく形成された小胞の表面電荷を中和することができる。このプロセスの特に有利な態様として、いかなる表面吸着核酸も容易に除去されること、および中性表面を有する核酸送達ビヒクルが結果として生ずることの両方が挙げられる。中性表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、血液循環からの迅速なクリアランスを回避し、カチオン性リポソーム調製物に付随する特定の毒性を回避すると期待される。核酸−脂質粒子の製剤化における、そのような滴定可能なカチオン性脂質の使用に関するさらなる詳細は、米国特許第６，２８７，５９１号明細書および同第６，８５８，２２５号明細書に提供されている。
さらに注目すべきは、このようにして形成された小胞が、高含量の核酸を含む、均一小胞サイズの製剤を提供することである。加えて、小胞のサイズは、約３０〜約１５０ｎｍ、例えば約３０〜約９０ｎｍの範囲である。
いかなる特定の理論にも拘束されたくはないが、核酸封入の効率が極めて高いのは、低いｐＨでの静電的相互作用の結果であると考えられている。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）では、小胞表面は荷電し、静電的相互作用によって核酸の一部と結合する。外部の酸性緩衝液をより中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）に交換すると、脂質粒子またはリポソームの表面が中和され、それによって、いかなる外部核酸も除去が可能になる。例えば、米国特許第６，２８７，５９１号明細書および同第６，８５８，２２５号明細書を参照されたい。
上記を考慮して、脂質／核酸製剤を調製する方法を説明する。本明細書に記載の方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝水溶液と混合して、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間混合物を生成する。例えば、封入された核酸は、約１０重量％〜約２０重量％の核酸／脂質比で存在する。中間混合物を場合によっては、サイズによって分別し、脂質部分が、好ましくは約３０〜約１５０ｎｍ、例えば約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層小胞である脂質−封入核酸粒子を得ることができる。次いで、ｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それによって、少なくとも部分的に表面が中和された脂質−封入核酸組成物を提供する。
特定の実施形態では、脂質の混合物は、少なくとも２つの脂質成分、すなわち、脂質がｐＫａより低いｐＨでカチオン性であり、ｐＫａより高いｐＨで中性であるようなｐＫａを有する脂質の中から選択される第１の脂質成分、および脂質−核酸粒子形成時の粒子凝集を防止する脂質の中から選択される第２の脂質成分を含む。特定の実施形態では、アミノ脂質はカチオン性脂質である。
核酸−脂質粒子を調製する際、脂質の混合物は、典型的には、有機溶媒中の脂質の溶液である。次いで、この脂質混合物を乾燥して薄い膜状にするか、凍結乾燥して粉末にした後、水性緩衝液で水和してリポソームを形成させる。あるいは、好ましい方法では、エタノールなどの水混和性アルコール中に脂質混合物を溶解することができ、このエタノール溶液は、水性緩衝液に添加されると、自発的にリポソームを形成する。ほとんどの実施形態では、アルコールは、市販の形態で使用する。例えば、エタノールは、無水アルコール（１００％）、または残部を水とする９５％エタノールとして使用することができる。米国特許第５，９７６，５６７号明細書を参照されたい。
一実施形態では、脂質混合物は、アルコール溶媒中の、カチオン性脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）、および凝集低減脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物である。他の実施形態では、脂質混合物は、エタノールなどのアルコール中で、１つまたは複数のカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、および凝集低減脂質から本質的になる。さらなる実施形態では、第１の溶液は、モル百分率で、約２０〜７０％のカチオン性脂質：約５〜４５％の中性脂質：約２０〜５５％のコレステロール：約０．５〜１５％の凝集低減脂質の上記脂質混合物からなる。さらにさらなる実施形態では、第１の溶液は、カチオン性脂質またはカチオン性脂質の混合物、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質から本質的になり、より好ましくは、モル百分率で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約５〜２５％のＤＳＰＣ：約２５〜５５％のコレステロール：約０．５〜１５％の凝集低減脂質である。さらなる実施形態では、モル脂質比は、およそ、約４０／１０／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）、約３５／１５／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）、または約５２／１３／３０／５（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置換される。
脂質混合物を、核酸を含有し得る緩衝水溶液と混合する。緩衝水溶液は、典型的には、緩衝剤が脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫａより低いｐＨをもたらす溶液である。適切な緩衝剤の例としては、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、およびＭＥＳが挙げられる。代表的な緩衝液はクエン酸緩衝液である。特定の実施形態では、緩衝液のアニオン濃度の範囲は、封入される核酸の化学的性質に応じて、１〜１，０００ｍＭになり、緩衝剤濃度の最適化は、高い負荷レベルを達成するのに重要となり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号明細書および同第６，８５８，２２５号を参照のこと。あるいは、塩化物、硫酸塩等でｐＨ５〜６に酸性化した純水が有用な場合がある。この場合、粒子を透析してエタノールを除去するか、ｐＨを上昇させるか、または生理食塩水などの薬学的に許容される担体と混合するときに、粒子膜を横切る浸透ポテンシャルを平衡に保つことになる５％グルコースまたは別の非イオン性溶質を添加することが適切なことがある。緩衝液中の核酸量は変動し得るが、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
脂質混合物および治療用核酸の緩衝水溶液を混合して、中間混合物を準備する。中間混合物は、典型的には、封入された核酸を有する脂質粒子の混合物である。加えて、中間混合物は、負に荷電した核酸と脂質粒子表面上の正に荷電した脂質とのイオン間力によって、脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に結合する一部の核酸を含有することがある（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１の脂質成分を構成する他の脂質は、脂質上のプロトン化可能な基のｐＫａよりも低いｐＨの緩衝液中で正に荷電する）。一群の好ましい実施形態では、脂質混合物は、脂質のアルコール溶液であり、それぞれの溶液の量は、混合時に得られるアルコール含有量が、約２０容積％〜約４５容積％になるように調整される。混合物を混合する方法は、種々のプロセスのいずれを含んでもよく、製造する製剤の規模に依存することが多い。例えば、全量が約１０〜２０ｍＬ以下の場合、溶液を試験管内で混合し、ボルテックスミキサーを使用して一緒に撹拌することができる。大規模なプロセスは、適切な生産規模のガラス容器中で実施することができる。
場合によっては、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝水溶液とを混合することによって生成される脂質−封入治療剤（例えば、核酸）複合体をサイズにより分別して、脂質粒子サイズの望ましいサイズ範囲および比較的狭い分布を達成することができる。好ましくは、本明細書で提供する組成物について、平均直径を約７０〜約２００ｎｍに、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍにする。リポソームを所望のサイズにするために、いくつかの手法が利用可能である。サイズを調整する方法の１つは、米国特許第４，７３７，３２３号明細書に記載されている。超音波槽または超音波プローブのいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さな単層膜小胞（ＳＵＶ）にまで漸進的にサイズが低減される。ホモジナイゼーションは、大きなリポソームをより小さなリポソームに細分化するために剪断エネルギーに頼る別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、典型的には約０．１〜約０．５ミクロンの間の選定したリポソームサイズが観察されるまで、標準エマルジョンホモジナイザーにより多重層膜小胞を再循環する。両方の方法において、粒子サイズ分布は、従来のレーザー光線粒子サイズ決定法によりモニターすることができる。本明細書における特定の方法の場合には、均一の小胞サイズを得るために押出し法を使用する。
細孔ポリカーボネート膜または非対称性セラミック膜を通してリポソーム組成物を押し出すことにより、比較的一定したサイズ分布が得られる。典型的には、リポソーム複合体の所望のサイズ分布が得られるまで、懸濁液を１回または複数回膜に通すことを繰り返す。リポソームを、連続的に細孔を小さくした膜に通して押し出し、リポソームサイズを徐々に低減することができる。一部の例では、形成した脂質−核酸組成物は、何らサイズ調整することなく使用することができる。
特定の実施形態では、方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分上の表面電荷の少なくとも一部を中和するステップをさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって、封入されていない核酸を脂質粒子表面から遊離させ、従来の手法を使用して組成物から除去することができる。好ましくは、封入されずに表面に吸着した核酸は、得られた組成物から緩衝液の交換により除去する。例えば、クエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物の形成のために使用された）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ約７．５）溶液に交換すると、リポソーム表面が中和されて表面から核酸が遊離する。次いで、遊離した核酸は、標準的な方法を使用してクロマトグラフィーにより除去し、その後、使用した脂質のｐＫａよりも高いｐＨの緩衝液に切り替えることができる。
場合によっては、脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を、水性緩衝液中での水和により形成し、核酸を添加する前に、上記の任意の方法を使用してサイズ調整することができる。上記のように、水性緩衝液はアミノ脂質のｐＫａよりも低いｐＨにすべきである。次いで、これらのサイズ調整された、予め形成させた小胞に核酸溶液を添加することができる。このような「予め形成させた」小胞への核酸の封入を可能にするために、混合物にエタノールなどのアルコールを含有させるべきである。エタノールの場合には、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在させるべきである。さらに、水性緩衝液−エタノール混合物中の予め形成させた小胞と核酸との混合物を、脂質小胞の組成および核酸の性質に応じて、約２５℃〜約５０℃の温度に加温することが必要な場合がある。当業者には、脂質小胞中に所望レベルの核酸を実現するための封入プロセスの最適化には、エタノール濃度および温度などの変数の操作が必要であることは明らかである。核酸封入に適した条件の例は、実施例で提示する。核酸を予め形成させた小胞内部にいったん封入したならば、表面電荷を少なくとも部分的に中和するために、外部ｐＨを上昇させることができる。その後、封入されずに表面に吸着した核酸は、上記のように除去することができる。
使用方法
脂質粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、治療剤を細胞に送達するために使用することができる。特定の実施形態では、治療剤は核酸であり、核酸は核酸−脂質粒子を使用して細胞に送達される。脂質粒子および関連医薬組成物を使用する種々の方法に関する以下の説明は、核酸−脂質粒子に関する説明により例示されるが、これらの方法および組成物は、そのような治療により恩恵を受ける任意の疾患または障害の治療のための任意の治療剤の送達に容易に適応させることができることがわかる。
特定の実施形態では、細胞に核酸を導入するための方法を説明する。細胞の中に導入するのに好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、およびリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達が起こるのに十分な時間、粒子または組成物を細胞と接触させることにより実施することができる。
組成物は、ほとんどすべての細胞型に吸着することができる。いったん吸着すると、核酸−脂質粒子は、細胞の一部によりエンドサイトーシスされるか、細胞膜と脂質を交換するか、細胞と融合するかのいずれかを行うことができる。複合体の核酸部分の移行または取り込みは、これらの経路のいずれか１つを介して生じ得る。限定する意図はないが、エンドシトーシスにより細胞に取り込まれた粒子の場合には、その後、粒子はエンドソーム膜と相互作用し、おそらく非二重層膜相の形成によりエンドソーム膜を不安定化し、封入された核酸の細胞質への導入をもたらすと考えられる。同様に、粒子と細胞原形質膜との直接融合の場合には、融合が起こると、リポソーム膜は、細胞膜の中に統合され、リポソームの含有物は細胞内液と合体する。細胞と脂質−核酸組成物との間の接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、生物学的に適合する培地中で行われる。組成物の濃度は、特定の用途に応じて広範に変動し得るものであるが、一般には、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌの間である。特定の実施形態では、脂質−核酸組成物による細胞の処理は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１〜２４時間、好ましくは約２〜約８時間実施される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途の場合には、核酸の送達は、植物由来であるか動物由来であるか、脊椎動物由来であるか無脊椎動物由来であるか、またいかなる組織または型由来であるかにかかわらず、培養で増殖するいかなる細胞にも実施することができる。特定の実施形態では、細胞は、動物細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。
一群の実施形態では、脂質−核酸粒子懸濁液を、約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、例えば約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する、６０〜８０％コンフルエントの播種細胞に添加する。細胞に添加する懸濁液の濃度は、約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、例えば約１μｇ／ｍＬとすることができる。
別の実施形態では、脂質粒子は、細胞または細胞株（例えば、腫瘍細胞株）に核酸を送達するために使用することができる。そのような細胞株の非限定例としては、ＨＥＬＡ（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−２）、ＫＢ（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−１７）、ＨＥＰ３Ｂ（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＢ−８０６４）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−７７）、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−２４７）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−３８）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１４３５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−１８５）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−２６）が挙げられる。
典型的な用途には、ｓｉＲＮＡを細胞内送達するための周知の手順を使用して、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングすることが含まれる。あるいは、用途には、治療上有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達が含まれる。このようにして、欠失または欠損する遺伝子産物を供給することにより、遺伝病のための治療を提供する（すなわち、デュシェーヌジストロフィーに関しては、Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４５（３）：６３０−６４３（１９８９）を参照のこと、嚢胞性線維症に関しては、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１０２−１０３（１９８９）を参照のこと）。組成物についての他の使用には、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入が含まれる（Ｂｅｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４１：１０２３−１０３３（１９９２）を参照のこと）。
あるいは、組成物は、当業者に公知の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達に関しては、Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）に、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を使用する、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達について記載されている。Ｈｙｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６（１９９３）に、リポソームを使用する、マウス肺の気道上皮および気胞への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達について記載されている。Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９）に、細胞内酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする、機能性原核生物遺伝子によるマウス肺のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションについて記載されている。したがって、組成物は、感染症の治療に使用することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与の場合、医薬組成物は、好ましくは、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射により静脈内または腹腔内に投与される。一例として、Ｓｔａｄｌｅｒらの米国特許第５，２８６，６３４号明細書を参照されたい。細胞内核酸送達も、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０１：５１２−５２７（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：２３９−２７１（１９８９）、およびＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８（１９９３）に論じられている。脂質ベースの治療剤を投与するさらに他の方法は、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号明細書；同第４，１４５，４１０号明細書；同第４，２３５，８７１号明細書；同第４，２２４，１７９号明細書；同第４，５２２，８０３号明細書；および同第４，５８８，５７８号明細書に記載されている。
他の方法では、医薬調製物は、組織に調製物を直接適用することにより標的組織に接触させることができる。この適用は、局所的な「開放」または「閉鎖」手技により行うことができる。「局所的」とは、例えば皮膚、口腔咽頭、外耳道など、環境に曝されている組織に医薬調製物を直接適用することを意味する。「開放」手技は、患者の皮膚を切開し、その下にある、医薬調製物を適用する組織を直接視覚化することを含む手技である。これは、一般には、外科的処置、例えば、肺に接近するための開胸術、腹部臓器に接近するための腹式開腹術、または標的組織への他の直接的な外科的接近手法により達成される。「閉鎖」手技は、内部標的組織を直接的に視覚化しないが、皮膚の小さな創傷を介して器具を挿入することにより接近する侵襲性手技である。例えば、針洗浄により調製物を腹膜に投与することができる。同様に、腰椎麻酔または脊髄のメトラザミド（ｍｅｔｒａｚａｍｉｄｅ）イメージングのために通常行われるように、腰椎穿刺した後、患者が適切な体位をとっている間に、点滴により髄膜または脊髄に医薬調製物を投与することができる。あるいは、内視鏡検査装置を通して調製物を投与することができる。
脂質−核酸組成物は、肺に吸入されるエアロゾルで（Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８−２８１（１９８９）参照のこと）または疾患部位への直接注射により（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４））投与することもできる。
これらの方法は、種々の宿主で実施することができる。代表的な宿主としては、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の哺乳動物種が挙げられる。
脂質−治療剤粒子の投与量は、治療剤対脂質比および患者の年齢、体重、および症状に基づいた投与医師の見解に依存することになる。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を説明する。これらの方法は、一般には、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することができる核酸を結合している脂質粒子と細胞とを接触させることを含む。本明細書で使用する場合、用語「調節する」は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させることを指す。種々の実施形態では、調節は、増大もしくは増強を意味することも、または低下もしくは低減を意味することもできる。標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定する方法は、当技術分野で公知かつ利用可能であり、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学的手法を使用する方法が挙げられる。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルは、適切な対照値と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、または５０％超増大または低下する。
例えば、ポリペプチドの発現増大を所望する場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとすることができる。他方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現低下を所望する場合は、核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、それによって標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を破壊するポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡとすることができる。あるいは、核酸は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであってもよい。
一実施形態では、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法は、１つまたは複数のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、例えば、モル百分率で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約０．１〜５０％の融合促進脂質：約５〜２５％のＤＳＰＣ：約２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％の凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、ポリペプチドの発現を調節することができる核酸を結合している脂質粒子を細胞に提供することを含む。特定の実施形態では、モル脂質比は、融合促進脂質が０．１〜５０％であり、残りの成分が、約４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０、または５２／１３／３０／５の相対的モル脂質比（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）で存在する。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置換される。
特定の実施形態では、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ここで、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合し、そのポリペプチドの発現を低下させるようなポリヌクレオチド、またはその相補体を含む。
他の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードし、ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片の発現を増大させるようなプラスミドである。
追加の実施形態では、被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法は、治療剤がｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、かつｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補体を含む医薬組成物を被験体に提供することを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、例えば、モル百分率で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約５〜２５％のＤＳＰＣ：約２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％の凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、治療用核酸を結合している脂質粒子を含む。特定の実施形態では、モル脂質比は、約４０／１０／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）、約３５／１５／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）、または約５２／１３／３０／５（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置換される。
別の関連実施形態では、被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法は、治療剤がポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである医薬組成物を被験体に提供することを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、例えば、モル百分率で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約０．１〜５０％の融合促進脂質：約５〜２５％のＤＳＰＣ：約２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％の凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、治療用核酸を結合している脂質粒子を含む。特定の実施形態では、モル脂質比は、融合促進脂質が約０．１〜５０％であり、残りの成分が、約４０／１０／４０／１０、約３５／１５／４０／１０、または約５２／１３／３０／５の相対的モル脂質比（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）で存在する。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置換される。
被験体に免疫応答を誘導する方法は、治療剤が免疫刺激性オリゴヌクレオチドである医薬組成物を被験体に提供することを含むことができる。特定の実施形態では、免疫応答は体液性または粘膜性免疫反応である。一実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、例えば、モル百分率で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約０．１〜５０％の融合促進脂質：約５〜２５％のＤＳＰＣ：約２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％の凝集低減脂質の混合物からなるかまたはそれらから本質的になる、治療用核酸を結合している脂質粒子を含む。特定の実施形態では、モル脂質比は、融合促進脂質が約０．１〜５０％であり、残りの成分が、約４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０、または５２／１３／３０／５の相対的モル脂質比（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集低減脂質）で存在する。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭに置換される。
さらなる実施形態では、医薬組成物は、ワクチンまたは抗原と組み合わせて被験体に提供する。したがって、ワクチンは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む脂質粒子を含むことができ、かつ免疫応答が所望される抗原とも結合している。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原であるか、または例えばウイルス、細菌、寄生生物などの感染体に関連している。
種々の腫瘍抗原、感染体抗原、および他の疾患に関連した抗原は、当技術分野で周知であり、これらの例は本明細書に引用した参考文献に記載されている。適切な抗原の例としては、これらに限定されないが、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原が挙げられる。抗原の具体例としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核、および風疹の抗原がある。好ましい実施形態では、抗原はＢ型肝炎の組換え抗原である。他の態様では、抗原はＡ型肝炎の組換え抗原である。別の態様では、抗原は腫瘍抗原である。そのような腫瘍関連抗原の例としては、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原、およびバーキットリンパ腫関連抗原がある。さらなる態様では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原の組換え抗原である。当業者ならば、使用に適し得るさらなる抗原を容易に認識するであろう。
使用に適した腫瘍関連抗原には、単一腫瘍型を表し得る、いくつかの腫瘍型の間で共有され得る、かつ／または正常細胞と比較して腫瘍細胞においてもっぱら発現され得るかもしくは過剰発現され得る突然変異分子および非突然変異分子の両方が含まれる。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、およびムチンの腫瘍特異的な発現パターンについても記載がある。本癌ワクチンで使用される代表的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および腫瘍細胞に特有の突然変異または再編成を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚性遺伝子産物、腫瘍胎児性抗原、組織特異的（しかし、腫瘍特異的ではない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、ならびにいくつかの他の自己タンパク質が挙げられる。
腫瘍関連抗原の代表的な実施形態としては、例えば、Ｒａｓ ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３、およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク質産物、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、およびβカテニンなどの突然変異抗原；ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、およびＫＳＡなどの過剰発現抗原、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）などの腫瘍胎児性抗原；癌胎児抗原（ＣＥＡ）などの自己抗原およびＭａｒｔ １／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、およびＴＲＰ２などのメラノサイト分化抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１、およびＰＳＭ−Ｐ２などの前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ならびにＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２、およびＳＣＰ１などの他の癌精巣抗原などの再活性化胚遺伝子産物；Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２などのムチン；ＧＭ２、ＧＤ２、およびＧＤ３などのガングリオシド、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびｇｌｏｂｏ−Ｈなどの中性糖脂質および糖タンパク質；ならびにＴｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、およびｓＴｎなどの糖タンパク質が挙げられる。全細胞溶解物および腫瘍細胞溶解物とそれらの免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用される、Ｂリンパ球のモノクローナル増殖時に発現される免疫グロブリンイディオタイプもまた、本明細書で腫瘍関連抗原として含まれる。
病原体としては、これに限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染病原体、例えばウイルスが挙げられる。感染性ウイルスの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロノウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉ ｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびに分類不能ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染性；クラス２＝非経口伝染性（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス）が挙げられる。
さらに、グラム陰性菌およびグラム陽性菌も、脊椎動物において抗原として作用する。そのようなグラム陽性菌としては、これらに限定されないが、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が挙げられる。グラム陰性細菌としては、これらに限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、これらに限定されないが、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅ ｒｏｉｄｅｓ）種、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびアクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）が挙げられる。
病原体のさらなる例としては、これらに限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染性真菌が挙げられる。感染性真菌の例としては、これらに限定されないが、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コッキディオイデス・イムミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミケス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミディア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられる。感染性寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、および三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）などのマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）が挙げられる。他の感染性生物（すなわち、原生生物）としては、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。
一実施形態では、製剤は、これらに限定されないが、以下のものを含む標的遺伝子をサイレンシングまたは調節するために使用することができる：ＦＶＩＩ、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、ベータカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、癌抑制遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子、ｐ５３ファミリーメンバーＤＮ−ｐ６３、ｐＲｂ癌抑制遺伝子、ＡＰＣ１癌抑制遺伝子、ＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子、ＰＴＥＮ癌抑制遺伝子、ｍＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子、ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子、アルファｖ−インテグリン遺伝子、Ｆｌｔ−１受容体遺伝子、チューブリン遺伝子、ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルス複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス複製に必要な遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、呼吸器合胞体ウイルス遺伝子、呼吸器合胞体ウイルス複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ＪＣウイルス遺伝子、ＪＣウイルス複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス遺伝子、西ナイルウイルス複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎複製に必要な遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス４０遺伝子、シミアンウイルス４０複製に必要な遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス複製に必要な遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、および麻疹ウイルス遺伝子、麻疹ウイルス複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム遺伝子、プラスモジウム遺伝子複製に必要な遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）複製に必要な遺伝子、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複製に必要な遺伝子、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）遺伝子、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）複製に必要な遺伝子、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）複製に必要な遺伝子、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−１遺伝子、Ｉ−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素に対する遺伝子、神経伝達物質受容体に対する遺伝子、神経伝達物質リガンドに対する遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ＬＯＨ細胞で見出される対立遺伝子、または多形遺伝子のうちの１つの対立遺伝子。
定義
複合体の投与が疾患または障害に有効な治療レジメンである被験体または患者は、好ましくはヒトであるが、臨床試験またはスクリーニング実験もしくは活性実験の文脈では、実験動物を含む、任意の動物であってもよい。したがって、当業者により容易に認識され得るように、本発明の方法、化合物、および組成物は、任意の動物、具体的には哺乳動物、例えば、これらに決して限定されないが、ヒト、ネコまたはイヌ被験体などの家庭動物、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタ被験体などの家畜、野生動物（野生または動物園にかかわらず）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、およびネコなどの研究動物、ニワトリ、シチメンチョウ、および鳴禽類などの鳥類に、すなわち、獣医学的使用のために投与するのに特に適している。
上記の一般式で列挙された化学基の多くは、特定の順序（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−）で記載される。化学基は、他に指示がない限り、提示された順序で一般式に組み込まれることが意図される。例えば、形式Ｘ−Ｙ−Ｚの一般式は、Ｙが−ＯＣ（Ｏ）−の場合、特に明記されない限り、Ｘ−ＯＣ（Ｏ）−Ｙを指す。化学基が特定の順序で記載されている場合、特に明記されない限り、逆の順序も意図されることを理解されたい。例えば、Ｙが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−と定義される一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（すなわち、Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｚ）では、Ｙが−ＮＨＣ（Ｏ）−である化合物（すなわち、Ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚ）も、特に明記されない限り、意図される。
本明細書で使用する場合、「脂肪族」基は、炭素原子が鎖に連結されている非芳香族基であり、飽和または不飽和のいずれの場合もある。
用語「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素部分を指す。一実施形態では、アルキル基は直鎖飽和炭化水素である。特に明記されない限り、「アルキル」基は１〜２４個の炭素原子を含有する。代表的な飽和直鎖アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｎ−ヘキシルが挙げられ；飽和分岐アルキル基としては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびイソペンチルが挙げられる。代表的な飽和環状アルキル基（「シクロアルキル」とも呼ばれる）としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられ；不飽和環状アルキル基としては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。
用語「アルケニル」は、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を指す。一実施形態では、アルケニル基は、１つ、２つ、または３つの二重結合を含有し、それ以外は飽和している。特に明記されない限り、「アルケニル」基は、２〜２４個の炭素原子を含有する。アルケニル基にはシス異性体とトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分枝アルケニル基としては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、および２，３−ジメチル−２−ブテニルが挙げられる。
用語「アルキニル」は、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素部分を指す。特に明記されない限り、「アルキニル」基は、２〜２４個の炭素原子を含有する。代表的な直鎖および分枝アルキニル基としては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、および３−メチル−１−ブチニルが挙げられる。
用語「アシル」は、水素、アルキル、部分的に飽和しているかまたは完全に飽和しているシクロアルキル、部分的に飽和しているかまたは完全に飽和している複素環、アリール、およびヘテロアリールで置換されたカルボニル基を指す。例えば、アシル基としては、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、およびｔ−ブチルアセチル）、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキルカルボニル（例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、およびシクロヘキシルカルボニル）、複素環式カルボニル（例えば、ピロリジニルカルボニル、ピロリド−２−オン−５−カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、テトラヒドロフラニルカルボニル）、アロイル（例えば、ベンゾイル）およびヘテロアロイル（例えば、チオフェニル−２−カルボニル、チオフェニル−３−カルボニル、フラニル−２−カルボニル、フラニル−３−カルボニル、ｌＨ−ピロイル−２−カルボニル、１Ｈ−ピロイル−３−カルボニル、およびベンゾ［ｂ］チオフェニル−２−カルボニル）が挙げられる。
用語「アリール」は、芳香族単環式、二環式、または三環式の炭化水素環構造を指す。アリール部分の例としては、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルが挙げられる。
用語「シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどの飽和環式または二環式炭化水素部分を指す。
用語「複素環」（または「ヘテロシクリル」）は、５〜８員の単環式、または７〜１２員の二環式、１１〜１４員の三環式環構造を意味し、これらは飽和または不飽和のいずれかであり、かつ単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合には１〜６個のヘテロ原子を、三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を含有し、これらのヘテロ原子は、窒素、酸素、およびイオウから独立して選択され、窒素およびイオウヘテロ原子は場合によっては酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は場合によっては四級化されていてもよい。例えば、複素環はシクロアルコキシ基であり得る。複素環は、複素環中の任意のヘテロ原子または炭素原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。複素環としては、これらに限定されないが、モルホルニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、およびテトラヒドロチオピラニルが挙げられる。
用語「へテロアリール」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員単環式、７〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環構造を指し、ここでヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１〜３、１〜６、または１〜９個のＮ，Ｏ、またはＳのヘテロ原子）。本明細書に記載のヘテロアリール基は、共通の炭素−炭素結合を共有する縮合環を含有してもよい。
用語「置換された」は、他に指示がない限り、所与の構造の１つまたは複数の水素ラジカルが、指定された置換基ラジカルで置換されたことを指し、置換基としては、これらに限定されないが、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ（ａｒａｌｋｏｘｙ）、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル（ａｒａｌｋｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環式、および脂肪族基が挙げられる。言うまでもなく、置換基はさらに置換されていてもよい。代表的な置換基としては、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、および環状アミノ化合物が挙げられる。
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
一部の実施形態では、これらの方法は、保護基の使用を必要とすることがある。保護基の方法論は当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照のこと）。手短に言えば、保護基は、官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、官能基に付加して、特定の反応中に官能基の反応性をマスクし、その後除去して、もとの官能基に戻すことができる。一部の実施形態では、「アルコール保護基」を使用する。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、当技術分野で周知の手法を使用して、付加および除去することができる。
化合物は、公知の有機合成手法により調製することができる。
全般的な参考文献
以下の参考文献は、本発明に関係し得る背景的情報を提供する。
オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成法で合成することができ、例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１（特に、Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ５，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，およびＣｈａｐｔｅｒ ７，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓを参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロック基、および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１、およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、またはそれらの中に引用されている参考文献に記載されている。国際公開第００／４４８９５号パンフレット、国際公開第０１／７５１６４号パンフレット、および国際公開第０２／４４３２１号パンフレットに記載されている修飾法も本明細書で使用することができる。
リン酸基に関する参考文献
ホスフィネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載されている。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号明細書および同第５，３６６，８７８号明細書に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載されている。ボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号明細書および同第５，１７７，１９８号明細書に記載されている。３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号明細書に記載されている。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９−２８０１に記載されている。イオウ架橋ヌクレオチドの調製は、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載されている。
糖基に関する参考文献
２’修飾に対する修飾法は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９−１３４およびその中のすべての参考文献に見出すことができる。リボースに対する具体的な修飾法は、以下の参考文献に見出すことができる：２’−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１）、２’−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０−１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１−３１０）。
リン酸基の置換に関する参考文献
本明細書ではＭＭＩ連結オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンメチルイミノ連結オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではＭＤＨ連結オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴリボヌクレオシド、および本明細書ではアミド−３連結オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンカルボニルアミノ連結オリゴリボヌクレオシド、および本明細書ではアミド−４連結オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンアミノカルボニル連結オリゴリボヌクレオシド、ならびに例えば、ＭＭＩとＰＯまたはＰＳの連結を交互に有する混合骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号明細書、同第５，３８６，０２３号明細書、同第５，４８９，６７７号明細書、ならびに国際公開第９２／２０８２２号パンフレットおよび国際公開第９２／２０８２３号パンフレットに記載されるように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号明細書および同第５，２６４，５６４号明細書に記載されるように調製することができる。エチレンオキシド連結オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書に記載されるように調製することができる。シロキサン置換は、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載されている。炭酸塩置換は、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ １９７１，１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載されている。カルバメート置換は、Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載されている。
リン酸−リボース骨格の置換に関する参考文献
シクロブチル糖代用化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号明細書に記載されるように調製することができる。ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号明細書に記載されるように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号明細書および同第５，２３５，０３３号明細書に記載されるように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３で言及された種々の手順のいずれかに従って調製することができる。それらは、米国特許第５，５３９，０８３号明細書に従って調製することもできる。
末端修飾に関する参考文献
末端修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３−１２８（２００２）およびその中に開示の参考文献に記載されている。
核酸塩基に関する参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号明細書に記載されるように調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号明細書に記載されるように調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号明細書に記載されるように調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号明細書に記載されるように調製することができる。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製
米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，１４９，７８２号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書；同第５，６７２，６６２号明細書；同第５，６８８，９４１号明細書；同第５，７１４，１６６号明細書；同第６，１５３，７３７号明細書；同第６，１７２，２０８号明細書；同第６，３００，３１９号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書；同第６，３３５，４３７号明細書；同第６，３９５，４３７号明細書；同第６，４４４，８０６号明細書；同第６，４８６，３０８号明細書；同第６，５２５，０３１号明細書；同第６，５２８，６３１号明細書；および同第６，５５９，２７９号明細書は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製について記載している。
以下の非限定的実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。これらの実施例の開示を適用する際には、本発明により包含される多くの変形物および均等物が本開示を読めば当業者には明らかになるので、実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきでないことを明確に留意すべきである。
以下の略語を本明細書では使用する：Ｐｙ（ピリジン）、Ｍｓ（メタンスルホニル）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＤＳＣ（Ｎ，Ｎ’−ジサクシニミジルカーボネート））、ＴＥＡ（トリエチルアミン）、ｍ−ＰＥＧ−アミンおよびｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２（モノメトキシポリエチレングリコール−アミン）、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化）。
実施例１：ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＯ（８）の合成
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＯ（８）は、下記の合成スキーム概要に従って調製することができる。
工程１：メタンスルホン酸オクタデカ−９，１２−ジエニルエステル（２）の合成
アルコール１（２６．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１００ｍＬ）に、トリエチルアミン（１３．１３ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を氷浴中で冷却した。この冷溶液に、塩化メシル（１２．６ｇ、１１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６０ｍＬ）を滴下して加え、添加完了後、反応混合物を室温に戻し、一晩攪拌した。反応混合物のＴＬＣにより、反応の完了が示された。反応混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、水（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＮａＳＯ４）。有機層を濃縮して粗生成物を得、それをヘキサン中の０〜１０％Ｅｔ２Ｏを使用するカラムクロマトグラフイー（シリカゲル）により精製した。純生成物分画を合わせ濃縮して、無色オイルとして純生成物（２）（３０．６ｇ、８９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ＝５．４２−５．２１（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｔ，２Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｔ，２Ｈ），２．１９−２．００（ｍ，４Ｈ），１．９０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．０６−１．１８（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１３０．７６，１３０．５４，１２８．６，１２８．４，７０．６７，３７．９，３２．０５，３０．１２，２９．８７，２９．８５，２９．６８，２９．６５，２９．５３，２７．７２，２７．７１，２６．１５，２５．９４，２３．０９，１４．６０。ＭＳ．Ｃ１９Ｈ３６Ｏ３Ｓに対して計算された分子量、計算値３４４．５３、実測値３４３．５２（Ｍ−Ｈ−）。
工程２：１８−ブロモ−オクタデカ−６，９−ジエン（３）の合成
メシレート（２）（１３．４４ｇ、３９ｍｍｏｌ）を無水エーテル（５００ｍＬ）に溶解し、それに、ＭｇＢｒ．Ｅｔ２Ｏ複合体（３０．７ｇ、１１８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加え、混合物をアルゴン下で２６時間還流した。２６時間後、ＴＬＣにより反応の完了が示された。反応混合物をエーテル（２００ｍＬ）で希釈し、この混合物に氷冷水（２００ｍＬ）を加え、層を分離した。有機層を１％水性Ｋ２ＣＯ３（１００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（無水Ｎａ２ＳＯ４）。有機層の濃縮により粗生成物を得、それをヘキサン中の０〜１％Ｅｔ２Ｏを使用するカラムクロマトグラフイー（シリカゲル）によりさらに精製して、無色オイルとして臭化物３（１２．６ｇ、９４％）を単離した。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ＝５．４１−５．２９（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｄ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０９−２．０２（ｍ，４Ｈ），１．８８−１．００（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．２７（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１３０．４１，１３０．２５，１２８．２６，１２８．１２，３４．１７，３３．０５，３１．７５，２９．８２，２９．５７，２９．５４，２９．３９，２８．９５，２８．３８，２７．４２，２７．４０，２５．８４，２２．７９，１４．２８。
工程３：ジリノレイルメタノール（５）の合成
火炎乾燥した５００ｍＬのＲＢフラスコに、新たに活性化したＭｇターニング（２．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加え、フラスコに、磁気撹拌棒、添加漏斗、および還流冷却器を装着した。このセットアップを脱気し、アルゴンでフラッシュし、注射器を介して無水エーテル１０ｍＬをフラスコに加えた。臭化物（３）（２６．５ｇ、８０．４７ｍｍｏｌ）を無水エーテル（５０ｍＬ）に溶解し、添加漏斗に加えた。このエーテル溶液約５ｍＬを激しく攪拌しながらＭｇターニングに加えた。発熱反応を認め（グリニャール試薬の形成を確実にする／加速するために、ヨウ素５ｍｇを加えると、即座に脱色が観察され、グリニャール試薬の形成が確認された）、エーテルの還流を開始した。水中でフラスコを冷却することによる温和な還流下で反応を維持しながら、臭化物溶液の残りを滴下して加えた。添加完了後、反応混合物を３５℃に１時間維持し、次いで氷浴で冷却した。ギ酸エチル（２．６８ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）を無水エーテル（４０ｍＬ）に溶解し、添加漏斗に移し、反応混合物に攪拌しながら滴下して加えた。発熱反応を観察し、反応混合物の還流を開始した。反応開始後、ホルマートのエーテル溶液の残りを、迅速に流れとして加え、反応混合物を室温でさらに１時間攪拌した。アセトン１０ｍＬを滴下して加え、その後氷冷水（６０ｍＬ）によって反応をクエンチした。溶液が均一になるまで、反応混合物をＨ２ＳＯ４水溶液（１０容積％、３００ｍＬ）で処理し、層を分離した。水相をエーテル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、有機層を減圧下で濃縮して、少量のＯ−ホルミル化生成物と要求のジリノレイルメタノールの混合物として粗生成物を得た。この粗生成物をＴＨＦ（１００ｍＬ）に再溶解し、氷冷ＮａＯＨ（１０％）水溶液で処理し、４０℃で１８時間加熱した。１８時間後、ＴＬＣ（ヘキサン中の１０％エーテル）により、要求のジリノレイルメタノールへのＯ−ホルミル化生成物の完全な変換が示された。反応混合物を冷却し、エーテル（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過した後、有機層を濃縮して粗生成物を得た。このようにして得た粗生成物を、ヘキサン中の４％エーテルを用いて、６０〜１２０メッシュシリカゲルを使用するカラムクロマトグラフイーにより精製した。純生成物分画を濃縮して、無色の液体として純生成物（１５．４ｇ、８６％）を得た。ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ５．４７−５．２４（ｍ，８Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝６．８，４．２，１Ｈ），２．８５−２．６６（ｍ，４Ｈ），２．１２−１．９１（ｍ，９Ｈ），１．５０−１．１７（ｍ，４６Ｈ），０．９８−０．７６（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １３０．４１，１３０．３７，１２８．１８，１２８．１５，７７．５４，７７．２２，７６．９１，７２．２５，３７．７３，３１．７５，２９．９４，２９．８９，２９．８３，２９．７３，２９．５８，２９．５３，２７．４６，２７．４３，２５．８９，２５．８６，２２．８０，１４．３０。
工程４：活性エステル（６）の合成
ジリノレイルメタノール（２０．６６ｇ、３９．１ｍｍｏｌ）、ＤＳＣ（１５．００ｇ、５８．６ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１６ｍＬ、１１７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中で合わせ、反応混合物を２日間加熱し、週末にわたり（３日間）室温に置いた。反応をＴＬＣによりモニターし、反応混合物をＤＣＭ／ヘキサンで希釈し、水（３００ｍＬ）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル／ヘキサン（０〜３０％）を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、無色オイルとして生成物（１５．７ｇ、６０％）を得た。この化合物を次の反応のためにそのまま使用した。
工程５：（７）の合成
ｍＰＥＧ−ＮＨ２（４．００ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）および化合物６（１．８７ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）をＤＣＭに溶解し、氷水混合物で冷却した。ピリジン（５ｍＬ）を反応混合物に加え、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣを確認し、反応混合物をＤＣＭで希釈し、水および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、揮発性物質を除去した。粗生成物を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、ＥｔＯＡｃ、次いで２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、白色固体として生成物（３．３６ｇ、６５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ５．３０（ｄｄ，Ｊ＝９．８，６．５Ｈｚ，１０Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），４．６６（ｓ，１Ｈ），３．７７（ｓ，１Ｈ），３．７０−３．３８（ｍ，３０１Ｈ），３．３６−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｓ，５Ｈ），２．００（ｓ，１０Ｈ），１．７２（ｓ，２Ｈ），１．３３（ｄ，Ｊ＝８４．４Ｈｚ，５４Ｈ），０．９５−０．７２（ｍ，６Ｈ）；ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２８００；実測値 約２８００。
工程６：ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＯ（８）の合成
化合物（７）（１．５７ｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１５０ｍｇ、１０重量％の湿潤デグサ型）を使用して、バルーン圧力下で一晩水素化した。反応をＴＬＣによりモニターし、小パッドのセライトを通して濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、白色固体として化合物（１．０８８ｇ、６９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ５．０６（ｓ，１Ｈ），４．６３（ｓ，１Ｈ），３．８１−３．０６（ｍ，３０８Ｈ），２．３０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．８２−１．５９（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｄ，Ｊ＝２８．３Ｈｚ，７Ｈ），１．１８（ｓ，７９Ｈ），０．８０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２８００；実測値 約２８００。
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＯ（８）の代替合成
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＯ（８）は、下記の合成スキーム概要に従っても調製することができる。
ジリノレイルメタノール５の合成に使用したものと同様の手順で、市販の臭化ステアリルをジステアリルメタノール２４に変換する。ジステアリルメタノール２４の活性化スクシニミジルカーボネート２５への変換は、６の合成に使用したものと同様の手順を使用して達成する。ｍＰＥＧ−アミンと共に活性化カーボネート１０を処理すると、生成物ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＯが得られる。
実施例２：ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＡ（１３）の合成
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＡ（１３）は、下記の合成スキーム概要に従って調製することができる。
工程１：（９）の合成
（５）（５０ｇ、９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（４００ｍｌ）に、ＴＥＡ（５３ｍＬ、３７８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．２ｇ、９．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で加え、室温で撹拌した。反応物を−５℃に冷却し、塩化メシル（１５ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１００ｍＬ）を、−５℃未満の温度で徐々に加え、添加後ＲＴに戻した。３０分後（ＴＬＣ）、反応物を氷冷水（２０ｍｌ）でクエンチした。有機層を分離し、１Ｎ ＨＣｌ（３０ｍｌ）、水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて、黄色の液体として純生成物（５５ｇ、９５．５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．８９（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８），１．２−１．５（ｍ，３６Ｈ），１．６７（ｍ，４Ｈ），２．０５（ｑ，８Ｈ，Ｊ１＝６．８，Ｊ２＝６．８），２．７７（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４），２．９９（ｓ，３Ｈ），４．７１（ｍ，１Ｈ），および５．３６（ｍ，８Ｈ）。
工程２：（１０）の合成
（９）（５０ｇ、８２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５００ｍＬ）に、ＮａＮ３（２７ｇ、４１０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で加え、７０℃に加熱してその温度を４時間維持した（ＴＬＣ）。混合物を水で希釈し、酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を水、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを溶出液としてヘキサン／エーテルを使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を２％エーテルヘキサンで溶出し、淡黄色の液体として（１０）（３６ｇ、８６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．９０（ｔ，８Ｈ），１．３０（ｍ，３６Ｈ），１．４９（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）２．０４（ｑ，８Ｈ，Ｊ１＝７．６，Ｊ２＝１４Ｈｚ），２．７７（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．２２（ｍ，１Ｈ），５．３４（ｍ，８Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．１，２２．５，２５．６，２６．１，２７．２，２９．２，２９．３，２９．４５，２９．６５，３１．５，３４．１，６３．１，１２７．９，および１３０．１。ＩＲ（ＫＢｒ）：２０９８。
工程３：（１１）の合成
乾燥ＴＨＦ中の水酸化アルミニウムの懸濁液に、アルゴン雰囲気下で、ＴＨＦ中の（１０）を０℃で滴下して加えた。次いで、室温に戻して、ＲＴで２０時間攪拌した（ＴＬＣ）。０℃に冷却して、硫酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチした。クエンチした反応物を、セライト層を通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それをヘキサン中の１０％酢酸エチルを使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、薄茶色の液体として純生成物１１（３．７ｇ、収率：７１％）を得た。ＨＰＬＣ：９３．８％。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．８７（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２７（ｍ，４８Ｈ），２．０３（ｑ，８Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），２．７６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．３１（ｍ，８Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．１，２２．６，２５．６，２６．８，２７．１，２７．２，２９．３，２９．５，２９．６，３０．１，３１．５，４０．９，４５．２，１２８．０，１３０．１。
工程４：（１２）の合成
化合物（１１）（１．００ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）およびｍＰＥＧ−活性エステル（３．００ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、氷水浴で冷却した。ピリジン（５ｍＬ）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣを確認し、反応混合物をＤＣＭで希釈し、水および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、ＥｔＯＡｃ、次いで２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製し、白色固体として生成物（２．５０ｇ、７１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ５．４４−５．２１（ｍ，９Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２６−４．１１（ｍ，３Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝８．７，３．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７４−３．４１（ｍ，２２９Ｈ），３．３５（ｓ，４Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５Ｈ），２．１０−１．８８（ｍ，１０Ｈ），１．５０−１．１１（ｍ，５１Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）、およびＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２５５０；実測値 約２５５０。
工程５：ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＡ（１３）の合成
化合物（１２）（１．５０ｇ、０．６００ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１５０ｍｇ、１０重量％の湿潤デグサ型）を使用して、バルーン圧力下で一晩水素化した。反応をＴＬＣによりモニターし、小パッドのセライトを通して濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、白色固体として生成物（１３）（１．２８７ｇ、８５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ４．４８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２６−４．０２（ｍ，３Ｈ），３．８５−３．６９（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．３５（ｍ，２３９Ｈ），３．３０（ｓ，４Ｈ），２．３０（ｓ，１Ｈ），１．５４−０．９５（ｍ，８８Ｈ），０．８０（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）。およびＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２５５０；実測値 約２５５０。
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＡ（１３）の代替合成
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＳＡ（１３）は、下記の合成スキーム概要に従って調製することもできる。
１３の合成に使用したものと同様の手順において、ＤＭＦ中のアジ化ナトリウムで対応するメシレートを処理することにより、ジステアリルアルコール２４を対応するアジド２６に変換する。このようにして得られたアジドを、還流ＴＨＦ中にてＬＡＨで処理してアミン２７を得た。ピリジンの存在下、市販ＰＥＧ−ＤＳＣでジステアリルメチルアミン２７を処理して、結合した生成物ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＡ（１３）を得た。
実施例３：ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＳＯ（１６）の合成
化合物１５の合成
ＰＥＧ−ＣＯＯＨ １４（５．００ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＤｉＬｉｎ−ＯＨ ５をＤＣＭ中にとり、ＥＤＣ（０．７１８ｇ、１．５等量）、ＤＭＡＰ（１００ｍｇ、０．８１９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．８６９ｍＬ、２等量）で処理した。得られた混合物を室温で一晩攪拌し、ＤＣＭで希釈した。有機層を水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製した。最初に、１０％ＥｔＯＡＣ／ＤＣＭ、次いで１００％ＥｔＯＡｃで溶出して未反応の脂質を除去した。その後、２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出して、白色固体として生成物（３．３６ｇ、５３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．２７（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４３−５．１９（ｍ，９Ｈ），４．８３（ｐ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８５−３．７２（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．４８（ｍ，２５５Ｈ），３．４６−３．３９（ｍ，４Ｈ），３．３６（ｄ，Ｊ＝０．７Ｈｚ，４Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１０Ｈ），１．４５（ｔ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，５Ｈ），１．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝２３．６，１４．９，１０．１Ｈｚ，４６Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２５７０；実測値 約２５７０。
ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＳＯ（１６）の合成
化合物１５（１．００ｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ、１０重量％の湿潤デグサ型）を使用して、バルーン圧力下で一晩水素化した。次いで、反応混合物を、小パッドのセライトを通して濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、白色固体として化合物（０．９５０、９４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ６．３８（ｓ，１Ｈ），４．９１−４．７７（ｍ，１Ｈ），３．８６−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．７４−３．３９（ｍ，１８７Ｈ），３．３９−３．３４（ｍ，３Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９６（ｓ，６Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２７（ｓ，２Ｈ），１．３６−１．０６（ｍ，５６Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２６００；実測値 約２６０５。
実施例４：ＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＭＡ（１８）の合成
化合物１７の合成
ＰＥＧ−ＣＯＯＨ １４（３．００ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤｉＬｉｎ−ＮＨ２ １１（０．９４９ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ中にとり、ＨＢＴＵ（１．１３７ｇ、２等量）およびＤＩＥＡ（０．７８０ｍＬ、３等量）で処理した。混合物を室温で一晩攪拌し、次いでＤＣＭで希釈した。有機層を水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製した。最初に、１０％ＥｔＯＡＣ／ＤＣＭ、次いで１００％ＥｔＯＡｃで溶出して未反応の脂質を除去した。その後、２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出して、白色固体として生成物（１．２２７ｇ、３８％）および混合物２．００ｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ６．４１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４６−５．２１（ｍ，７Ｈ），３．８０（ｄｄ，Ｊ＝９．９，５．２Ｈｚ，３Ｈ），３．７３−３．５０（ｍ，１７５Ｈ），３．４９−３．４０（ｍ，３Ｈ），３．３８（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，３Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），２．５６−２．４１（ｍ，４Ｈ），２．０１（ｄｄ，Ｊ＝１８．５，１２．１Ｈｚ，９Ｈ），１．４９−１．１２（ｍ，３６Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ）。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２５９８；実測値 約２５９８。
ＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＭＡ（１８）の合成
化合物１７（１．００ｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ、１０重量％の湿潤デグサ型）を使用して、バルーン圧力下で一晩水素化した。次いで、反応混合物を、小パッドのセライトを通して濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、白色固体として化合物（０．８５０、８４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ６．３９（ｄｄ，Ｊ＝１３．５，８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．７６（ｄｄ，Ｊ＝３７．７，９．９Ｈｚ，１Ｈ），３．６１（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２２１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），２．５４−２．４１（ｍ，４Ｈ），２．３８−２．３２（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｓ，７５Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，５Ｈ）。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２６５０；実測値 約２６５０。
実施例５：化合物２２の合成
（２１）の合成
ＤｉＬｉｎ−ＯＨ ５（５ｍｍｏｌ ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）をトルエン（１００ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（０．４００ｇ、鉱油中の６０重量％）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで、ＰＥＧ−メシレート２０（５．００ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（５０ｍＬ）を加え、混合物を１０分間撹拌した。次いで、混合物を７０℃で５日間加熱した。次いで、冷水でクエンチした。溶媒を除去し、残査をＤＣＭに溶解し、水および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、未反応のＰＥＧ前駆体を一部含有する白色固体として生成物（１．２７ｇ）を得た。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２４５５；実測値 約２４５５。
（２２）の合成
化合物２１（１．２０ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１２０ｍｇ、１０重量％の湿潤デグサ型）を使用して、バルーン圧力下で一晩水素化した。次いで、反応混合物を小パッドのセライトを通して濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を除去し、粗生成物のシリカゲルクロマトグラフィー（２〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）による精製を複数回行った後、白色固体として２２（０．６００ｇ、５１％）を得た。ＭＡＬＤＩ分子量 計算値 約２４５０；実測値 約２４５０。
実施例６：ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＥＡ（３０）の合成
２８の合成
ＴＥＡ（５３ｍＬ、３７８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．２ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で、２４（５０ｇ、９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（４００ｍｌ）に加え、得られた混合物をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。反応物を−５℃に冷却し、塩化メシル（１５ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍｌ）溶液を、−５℃未満の温度で徐々に加えた。添加完了後、混合物をＲＴに戻した。３０分後、反応物を氷冷水（２０ｍｌ）でクエンチした。有機層を分離し、１Ｎ ＨＣｌ（３０ｍｌ）、水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて、黄色の液体として純生成物メシレート（５５ｇ、９５．５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．８９（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８），１．２−１．５（ｍ，３６Ｈ），１．６７（ｍ，４Ｈ），２．０５（ｑ，８Ｈ，Ｊ１＝６．８，Ｊ２＝６．８），２．７７（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４），２．９９（ｓ，３Ｈ），４．７１（ｍ，１Ｈ），および５．３６（ｍ，８Ｈ）。
攪拌したシアン化ナトリウム（１．７０ｇ、０．０３３０ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、メシレート（１０ｇ、０．０１６５ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１００ｍＬ）を加え、混合物を２４時間の間、５５℃に徐々に加熱した。次いで、室温に冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを１％エーテル／ヘキサンを使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色の液体として生成物（５．８０ｇ、６２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．８７（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２５（ｍ，３８Ｈ），１．５２（ｍ，４Ｈ），２．０３（ｑ，８Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．３２（ｍ，８Ｈ）。
（２９）の合成
ＴＨＦ中の化合物２８（５．２ｇ、０．００９７ｍｏｌ）を冷却したＬＡＨ（１．５０ｇ、０．０３８７ｍｏｌ）のＴＨＦ（５２ｍｌ）に、アルゴン雰囲気下、０℃で滴下して加えた。添加後、混合物をＲＴに戻し、２０時間攪拌した。次いで、混合物を０℃に冷却し、硫酸ナトリウムの飽和溶液（１０ｍｌ）、次いで酢酸エチルでクエンチした。次いで、セライト層を通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。合わせた有機濾液を、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それをヘキサン中の１０％酢酸エチルを使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、薄茶色の液体として２９（３．７０ｇ、７１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．８７（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．２７（ｍ，４８Ｈ），２．０３（ｑ，８Ｈ，６．８Ｈｚ，６．８Ｈｚ），２．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），２．７６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．３１（ｍ，８Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １４．１，２２．６，２５．６，２６．８，２７．１，２７．２，２９．３，２９．５，２９．６，３０．１，３１．５，４０．９，４５．２，１２８．０，１３０．１。質量５４３（Ｍ＋）。
３０（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＥＡ）の合成
アミン２９を、上記に記載のものと同様な方法で、ＰＥＧ−ＤＳＣで処理し、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＥＡ（３０）を得た。
実施例７：カチオン性脂質由来リポソームを使用する、ＦＶＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、尾静脈注射により、生理食塩水または所望の製剤のｓｉＲＮＡのいずれかを０．０１ｍＬ／ｇ容量で投与する。投与後の種々の時点で、動物をイソフルオラン吸入により麻酔し、後眼窩出血により血液を血清分離器チューブに採取する。試料における第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、製造業者のプロトコールに従い、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ，ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ，ＯＨまたはＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を使用して測定した。生理食塩水で処置した動物から採取した血清を使用して標準曲線を作成する。肝臓ｍＲＮＡを評価する実験では、投与後の種々の時点で、動物を屠殺して肝臓を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結する。凍結した肝臓組織を粉砕して粉末にする。組織溶解物を調製し、第ＶＩＩ因子およびａｐｏＢの肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を使用して測定する。
実施例８：ｉｎ ｖｉｖｏげっ歯類第ＶＩＩ因子サイレンシングモデルを使用する、種々のカチオン性脂質を含有する脂質粒子製剤の効力の測定
凝固カスケードの主要なタンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓（肝細胞）で合成され、血漿中に分泌される。血漿中のＦＶＩＩレベルは、簡単な、プレートベースの比色アッセイにより測定することができる。そのため、ＦＶＩＩは、肝細胞由来タンパク質のｓｉＲＮＡ媒介ダウンレギュレーションの測定ならびに核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡの血漿濃度および組織分布のモニタリングを行うための好都合なモデルになる。
上記に示したカチオン性脂質を、例えば米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号明細書に記載されるように、インライン混合法を使用して、ＡＤ−１６６１二本鎖を含有するリポソームを製剤化するために使用する。脂質粒子は、以下のモル百分率を使用して製剤化する：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％凝集低減脂質。
インライン混合のための全般的プロトコール
それぞれ別々の原液を調製する−一方は脂質を含有し、他方はｓｉＲＮＡを含有する。所望の脂質または脂質混合物、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質を含有する脂質原液を、９０％エタノール中に溶解することにより調製する。残りの１０％は低ｐＨのクエン酸緩衝液である。脂質原液の濃度を４ｍｇ／ｍＬとする。このクエン酸緩衝液のｐＨは、使用する脂質のタイプに応じて、ｐＨ３〜ｐＨ５の間の範囲にすることができる。ｓｉＲＮＡも、４ｍｇ／ｍＬの濃度でクエン酸緩衝液に溶解する。各原液５ｍＬを調製した。
原液は完全に透明であり、脂質が確実に完全溶解したことを確認した後、ｓｉＲＮＡと混合する。脂質を完全に溶解させるために原液を加熱してもよい。このプロセスで使用するｓｉＲＮＡは、未修飾のオリゴヌクレオチドであっても修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよく、コレステロールなどの親油性部分とコンジュゲートされていてもよい。
各溶液をＴ字管にポンプで送り込むことにより、個々の原液を混合する。２重ヘッドのＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプを使用して、２つの流れの開始および停止を同時に制御する。線流速を増大させるために、１．６ｍｍのポリプロピレンチューブをさらにサイズを小さくして０．８ｍｍのチューブにする。ポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）は、Ｔ字管の両側に接続されている。ポリプロピレンＴは、４．１ｍｍ３の容積を得るために１．６ｍｍの線端部を有する。ポリプロピレンラインの大端部（１．６ｍｍ）のそれぞれを、溶解した脂質原液または溶解したｓｉＲＮＡのいずれかを含有する試験管に入れる。Ｔ字管の後に、単一チューブを配置し、そこに混合した流れを排出する。次いで、チューブを延長して、２倍容積のＰＢＳを含有する容器に入れ、迅速に攪拌する。ポンプの流速を、３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分の設定にする。エタノールを除去して、透析によりＰＢＳに交換する。次いで、脂質製剤を、遠心分離またはダイアフィルトレーションを使用して、適切な作業濃度に濃縮する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、生理食塩水または製剤化したｓｉＲＮＡのいずれかを尾静脈注射により投与する。投与後の種々の時点で、後眼窩出血により血清試料を採取する。試料における第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を使用して測定する。第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを測定するために、動物を屠殺して肝臓を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結する。組織溶解物を凍結した組織から調製し、第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を使用して定量する。
ＦＶＩＩ活性は、ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ処置動物において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの静脈内（ボーラス）注射の４８時間後に評価する。ＦＶＩＩは、血清または組織中のタンパク質レベルを測定するための市販キットを使用して、製造業者の説明書に従い、マイクロプレート規模で測定する。ＦＶＩＩの減少を無処置対照群マウスと比較して決定し、その結果を％残留ＦＶＩＩとして示す。各新規リポソーム組成物のスクリーニングにおいて、２用量レベル（０．０５および０．００５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を使用する。
実施例９：予め形成させた小胞を使用する、ｓｉＲＮＡの製剤化
カチオン性脂質含有粒子を、予備形成小胞法を使用して作製する。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集低減脂質を、それぞれ４０／１０／４０／１０のモル百分率でエタノールに溶解した。最終エタノールおよび脂質濃度をそれぞれ３０％（容量／容量）および６．１ｍｇ／ｍＬにするように、脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に混合しながら加え、室温で２分間平衡化した後、押し出す。Ｎｉｃｏｍｐ分析により測定したときに、７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまで、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用し、２２℃で、２つの積層型８０ｎｍ孔径フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通して水和した脂質を押し出す。これには通常１〜３回の通過が必要となる。小胞を形成しなかった一部のカチオン性脂質混合物については、より低いｐＨ緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３）で脂質混合物を水和させて、ＤＳＰＣ頭部のリン酸基をプロトン化することが、安定な７０〜９０ｎｍ小胞の形成を助ける。
ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ（３０％エタノール含有５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液に溶解）を、３５℃に予め平衡化した小胞に、約５ｍＬ／分の速度で混合しながら加える。最終的な標的ｓｉＲＮＡ／脂質比を０．０６（重量／重量）にした後、小胞の再構築およびＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡの封入が可能になるように、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートする。次いで、エタノールを除去し、透析または接線流動ダイアフィルトレーションのいずれかによって、外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）に交換する。最終的な封入ｓｉＲＮＡ対脂質比は、サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを使用して未封入ｓｉＲＮＡを除去した後に測定する。
実施例１０：脂質製剤の効力のｉｎ ｖｉｖｏ測定
試験製剤について、１処置群当たり３匹のマウスを用い、０．１、０．３、１．０および５．０ｍｇ／ｋｇで、雌性７〜９週齢、１５〜２５ｇの雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＦＶＩＩノックダウンを最初に評価する。すべての試験には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、対照群）またはベンチマーク製剤のいずれかを投与された動物が含まれた。製剤は、試験直前にＰＢＳ中で適切な濃度に希釈する。マウスの体重を測定し、適切な投与容量を計算する（１０μＬ／ｇ体重）。試験製剤およびベンチマーク製剤ならびにＰＢＳ（対照動物用）を、側尾静脈を介して静脈内投与する。２４時間後にケタミン／キシラジンの腹腔内注射で動物を麻酔し、５００〜７００μＬの血液を心穿刺により、血清分離器チューブ（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）の中に採取する。血液を１５℃で１０分間、２，０００×ｇで遠心分離し、血清を回収して分析まで−７０℃に保存する。血清試料を３７℃で３０分間解凍し、ＰＢＳ中に希釈し、９６ウェルアッセイプレートに等分する。第ＶＩＩ因子レベルを、製造業者の説明書に従って発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ ｋｉｔ，Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ）を使用し、４０５ｎｍの波長フィルターを装着したマイクロプレートリーダーで吸光度を測定して評価する。血漿ＦＶＩＩレベルを定量し、ＥＤ５０値（対照動物に比較して血漿ＦＶＩＩレベルを５０％低下させる用量）を、対照動物由来のプールした血清試料から作成した標準曲線を使用して計算する。高レベルのＦＶＩＩノックダウン（ＥＤ５０＜＜０．１ｍｇ／ｋｇ）を示した目的の製剤は、効力を確認にしかつＥＤ５０を確立するためにより低い用量範囲にて、独立した試験で再試験する。
実施例１１：マウスの皮下Ｈｅｐ３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍におけるｓｉＲＮＡサイレンシング
ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＯまたはＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＡのいずれかを含有するｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子中に製剤化したｓｉＲＮＡの静脈内投与後に、ルシフェラーゼのサイレンシングを皮下Ｈｅｐ３Ｂ−ｌｕｃ腫瘍で実施した。
６週齢の雌性Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ Ｊｃｌマウスの右側腹部に３×１０６のＨｅｐ３Ｂ−ｌｕｃ細胞を移植することにより腫瘍を定着させた。細胞はホタルルシフェラーゼが安定に発現するように操作した。腫瘍移植後１９日目に、担癌マウスのコホートに、試験物質の静脈（尾静脈）内注射を以下のように行った。
Ｌ１５２、Ｌ１５３、Ｌ１５４、およびＬ１５５は、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＯ（１．１モル％、１．４モル％、１．７モル％、および２．０モル％）、ＭＣ３（５７．１モル％）、ＤＰＰＣ（７．１モル％）、および補償コレステロール（３３．８モル％〜３４．７モル％）を３．２のＮ：Ｐ比で含む脂質ナノ粒子中にインライン混合法により製剤化したルシフェラーゼｓｉＲＮＡである。
Ｌ１５６、Ｌ１５７、Ｌ１５８、およびＬ１５９は、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＳＭＡ（１．１モル％、１．４モル％、１．７モル％、および２．０モル％）、ＭＣ３（５７．１モル％）、ＤＰＰＣ（７．１モル％）、および補償コレステロール（３３．８モル％〜３４．７モル％）を３．２のＮ：Ｐ比で含む脂質ナノ粒子中にインライン混合法により製剤化したルシフェラーゼｓｉＲＮＡである。
ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの配列を下記の表に示す。
処置の４８時間後に、マウスを安楽死させ、腫瘍を分析のために摘出した。全ＲＮＡを抽出した後、ランダムプライミング法によるｃＤＮＡ合成を行った。ヒトベータアクチンに対して規準化したルシフェラーゼの発現レベルをＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果を図１に示す。
各遺伝子に対するＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーの配列を下記の表に示す。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の変更形態が、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
種々の特許、特許出願、刊行物、製品説明、およびプロトコールは、本出願の全体にわたって引用され、それらのそれぞれの開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (63)

  1. 式（Ｉ）：
    の化合物またはその薬学的に許容される塩からなる核酸送達剤（式中、
    Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪族基であり、ここで、各脂肪族基は、Ｒａからそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の基によって、場合により置換されており；
    Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−（Ｌ２−Ｚ２）ｃ−Ｌ３−であり；
    Ｌ１は、結合、−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−、または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
    Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−；ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐ−または−（ＣＲａＲｂ）ｊ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
    Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
    Ａは、−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり、ここで、各ｓは独立して、０、１、２、３、または４であり；
    Ｒ３は、−ＯＲｃであり；
    Ｒ５およびＲ５’の各存在は独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルであり；
    ＲａおよびＲｂの各存在は独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    各Ｒｃは独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    ｂは、１〜１，０００の整数であり；
    ｃは、０または１であり；
    各ｉは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり；
    ｊおよびｋの各存在は独立して、０、１、２、または３であり；かつ
    ｐは、１〜１０の整数である）。
  2. Ｒ１およびＲ２が独立して、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１０〜Ｃ２０アルケニルである、請求項１に記載の送達剤。
  3. Ｌが−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ３−である、請求項１または２に記載の送達剤。
  4. Ｌが−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｌ３−である、請求項１または２に記載の送達剤。
  5. Ｌ１が結合である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の送達剤。
  6. Ｌ１が−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の送達剤。
  7. Ｚ１が、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の送達剤。
  8. Ｚ１が、−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｏ−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−、またはヘテロアリールである、請求項７に記載の送達剤。
  9. Ｚ１が、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、Ｚ１における左端の窒素原子が、式（Ｉ）の第三級炭素原子に結合しているか、あるいはＺ１が、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子が、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、中央の第三級炭素原子に結合している、請求項１に記載の送達剤。
  10. ｃが１であり、Ｌ２が−（ＣＲａＲｂ）ｐである、請求項１、２、および４〜９のいずれか一項に記載の送達剤。
  11. ｃが１であり、Ｚ２が−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはヘテロアリールである、請求項１、２、および４〜１０のいずれか一項に記載の送達剤。
  12. Ｚ２が、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−、またはヘテロアリールである、請求項１１に記載の送達剤。
  13. Ｌ３が−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり、Ｒａの各存在およびＲｂの各存在が独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の送達剤。
  14. ＲａおよびＲｂの各存在が独立して、Ｈまたはアルキルであり、ｉが２、３、４、または５である、請求項１１に記載の送達剤。
  15. Ｒａの各存在およびＲｂの各存在が独立して、Ｈまたはアルキルである、請求項１に記載の送達剤。
  16. Ａが独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−である、請求項１５に記載の送達剤。
  17. Ａが−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１５に記載の送達剤。
  18. Ｒ３がアルコキシである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の送達剤。
  19. Ｒ３がメトキシである、請求項１８に記載の送達剤。
  20. ｂが１０〜５００である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の送達剤。
  21. ｂが３０〜６０である、請求項２０に記載の送達剤。
  22. ｃが０である、請求項１〜３、５〜９、および１３〜２１のいずれか一項に記載の送達剤。
  23. ｃが１である、請求項１、２、４、９および１５〜１７のいずれか一項に記載の送達剤。
  24. 前記化合物の分子量が、５００ｇ／ｍｏｌ〜５，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の送達剤。
  25. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルであり；
    Ｌが、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ３−または−Ｌ１−Ｚ１−（Ｌ２−Ｚ２）−Ｌ３−であり；
    Ｌ１が、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−であり；
    Ｚ１が、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    Ｌ２が、−（ＣＲａＲｂ）ｐであり；
    Ｚ２が、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはヘテロアリールであり；
    Ｌ３が、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
    Ａが、−ＯＣＨ２ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；
    Ｒ３が、−ＯＲｃであり；
    Ｒａの各存在が独立して、Ｈまたはアルキルであり；
    Ｒｂの各存在が独立して、Ｈまたはアルキルであり；かつ
    Ｒｃが、Ｈまたはアルキルである、請求項１に記載の送達剤。
  26. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルであり；かつ
    Ｚ１が、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１における左端の窒素原子は、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、式（Ｉ）の中央の第三級炭素原子に結合しており、あるいは、
    Ｚ１が、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、式（Ｉ）の中央の第三級炭素原子に結合している、請求項１に記載の送達剤。
  27. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである、請求項２６に記載の送達剤。
  28. 式（ＩＩ）：
    の化合物またはその薬学的に許容される塩からなる核酸送達剤（式中、
    Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪族基であり、
    Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ３−であり；
    Ｌ１は、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−であり；
    Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１における左端の窒素原子は、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合しており、あるいは、
    Ｚ１は、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合しており；Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
    Ａは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；
    ｂは、１〜１，０００の整数であり；
    Ｒ３は、−ＯＲｃであり；
    Ｒａ、Ｒｃ、Ｒ５、およびＲ５’の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり；かつ
    ｉは、２、３、４、または５である）。
  29. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキルである、請求項２８に記載の送達剤。
  30. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである、請求項２９に記載の送達剤。
  31. Ｌ１が結合である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の送達剤。
  32. Ｌ１が−ＣＨ２−である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の送達剤。
  33. Ｚ１が−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の送達剤。
  34. Ｚ１が−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の送達剤。
  35. Ｚ１が−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の送達剤。
  36. Ｌ１が結合であり、変数ｉが２である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の送達剤。
  37. Ｒ１とＲ２が同じである、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の送達剤。
  38. 式（ＩＩＩ）
    の化合物またはその薬学的に許容される塩からなる核酸送達剤（式中、
    Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニルであり；
    Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｌ３−であり；
    Ｌ１は、結合または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−であり；
    Ｚ１は、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、または−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−であり、ここで、Ｚ１における左端の窒素原子は、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合しており、あるいは、
    Ｚ１は、窒素含有ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、ここで、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルの窒素原子は、Ｌ１に結合しているか、またはＬ１が結合の場合は、式（ＩＩＩ）の中央の第三級炭素原子に結合しており；
    Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐであり；
    Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはヘテロアリールであり；
    Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
    Ａは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；
    ｂは、１〜１，０００の整数であり；
    Ｒ３は、−ＯＲｃであり；
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒ５、およびＲ５’の各存在は独立して、Ｈまたはアルキルであり；
    ｉは、２、３、４、または５であり；かつ
    ｐは、１〜１０である）。
  39. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキルである、請求項３８に記載の送達剤。
  40. Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである、請求項３８に記載の送達剤。
  41. Ｌ１が結合である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の送達剤。
  42. Ｌ１が−ＣＨ２−である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の送達剤。
  43. Ｚ１が−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の送達剤。
  44. Ｚ１が−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の送達剤。
  45. Ｚ１が−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の送達剤。
  46. Ｒ１とＲ２が同じである、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の送達剤。
  47. 式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩が、
    から選択される、請求項１に記載の送達剤（式中、
    ｎは、１〜１，０００の整数であり；かつ
    ｍは、０、１、２、３、４、５、または６である）。
  48. ｎが１０〜５００である、請求項４７に記載の送達剤。
  49. ｎが３０〜６０である、請求項４８に記載の送達剤。
  50. 請求項１〜４９のいずれか一項に記載の送達剤および核酸を含む脂質粒子。
  51. カチオン性脂質をさらに含む、請求項５０に記載の脂質粒子。
  52. 中性脂質およびステロールをさらに含む、請求項５０または５１に記載の脂質粒子。
  53. 前記中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される、請求項５２に記載の脂質粒子。
  54. 前記カチオン性脂質が、２０％および６０％のモル百分率で存在し；前記中性脂質が、５％〜２５％のモル百分率で存在し；前記ステロールが、２５％〜５５％のモル百分率で存在し；かつ請求項１〜２７のいずれか一項に記載の送達剤が、０．５％〜１５％のモル百分率で存在する、請求項５１または５２に記載の脂質粒子。
  55. 前記核酸が活性薬剤である、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の脂質粒子。
  56. 前記活性薬剤が、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択される、請求項５５に記載の脂質粒子。
  57. 請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  58. 請求項５５または５６に記載の脂質粒子を含む、細胞における標的遺伝子の発現を調節するための組成物。
  59. 前記活性薬剤が、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、およびリボザイムから選択される、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記標的遺伝子が１つまたは複数の突然変異を含有する、請求項５８に記載の組成物。
  61. 請求項５５または５６に記載の脂質粒子を含む、被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療するための組成物であって、前記活性薬剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択され、かつ前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補体を含む、組成物。
  62. 請求項５５または５６に記載の脂質粒子を含む、被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療するための組成物であって、前記活性薬剤が前記ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、組成物。
  63. 請求項５５または５６に記載の脂質粒子を含む、被験体に免疫応答を誘導するための組成物であって、前記活性薬剤が免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、組成物。
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