JP6548641B2 - 転移性前立腺癌の治療 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年10月28日に出願された米国特許仮出願第61/896,250号および2013年12月11日に出願された同第61/914,389号の恩典およびこれらに係る優先権を主張する。これらの内容はその全体が全目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府の支援による研究および開発によってなされた発明に対する権利の記載
本発明は、米国立衛生研究所により付与された助成金番号CA140468による米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
現行の前立腺癌治療法はアンドロゲンシグナル伝達の標的化を含み、前立腺癌を有する患者への抗アンドロゲン薬およびアンドロゲンアンタゴニストの投与によるアンドロゲン除去療法も含む。これらの方法は最初のうちは有効な場合があるが、患者が去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）を発症したら効果がなくなることが多い。現在までのところCRPCは治癒不可能である。
CRPC患者およびドセタキセル治療によって健康状態が改善しない患者は、エンザルタミドおよびアビラテロンなどの薬剤によって治療されることが多い。しかしながら、前立腺癌患者ではエンザルタミドおよびアビラテロンに対する薬剤耐性が発生することが多い。
進行性前立腺癌組織、例えば、CRPC患者からの組織および進行性前立腺癌細胞株はアンドロゲン受容体（AR）スプライスバリアントがよく見られる。これらのARバリアントは、異常なスプライシング、例えば、mRNAのオルタナティブスプライシングと早すぎる翻訳終結によって生じる。切断型ARバリアントはアンドロゲン非依存的増殖を推進する。ARはまた遺伝子発現も媒介する。一部の前立腺癌細胞では、エンザルタミドおよびアビラテロンの標的であるリガンド結合ドメイン（LBD）が無いARバリアントであるAR-V7が構成的に活性化されている。AR-V7にはLBDが無いので、LBD標的治療剤、例えば、エンザルタミドおよびアビラテロンに対して耐性である。
ARバリアントはまたアンドロゲン感受性患者試料と比較してCRPC患者試料ではアップレギュレートされることも観察されている。従って、ARバリアントは前立腺癌の進行およびAR標的療法に対する耐性と関連付けられている。ある特定のARバリアントは、AREにより動かされるレポーターのリガンド非依存的活性化をアンドロゲン非存在下で誘導することが観察された。このことから、これらのバリアントは完全長ARと比較して異なる転写プログラムを有する可能性があることが分かる。完全長ARがARバリアントの活性を媒介できるように、ある特定のARバリアントは完全長ARと相互作用するかもしれない。
インターロイキン-6（IL-6）は宿主防御機構において中心的な役割を果たす多面的なサイトカインである。IL-6の生物学的活性は、IL6特異的受容体サブユニットとシグナルトランスデューサーであるgp130で構成されるIL6受容体によって媒介される。IL-6とその受容体が結合すると、JAK-STAT経路およびMAPK経路を含む、いくつかの細胞内シグナル伝達カスケードが活性化される。IL-6産生と、ある特定のヒト癌、例えば、卵巣癌および前立腺癌における腫瘍進行は相関関係にある。IL-6の血清中濃度は進行性ホルモン不応性前立腺癌をもつ多くの男性において上昇し、進行および予後不良と関係がある。IL-6はまた、アンドロゲン合成に関与する多くのステロイド産生酵素をコードする遺伝子の発現も調節する。オートクラインIL-6は前立腺癌細胞においてアンドロゲン非依存的増殖を促進する。構成的活性化型STAT3はポジティブオートクラインIL-6ループの一部であり、ヒト腫瘍におけるSTAT3活性化が、炎症細胞に隣接する腫瘍の浸潤前部において観察される。このことは、STAT3依存的腫瘍形成がIL-6によって媒介されることを意味しているのかもしれない。
いくつかの報告から、ニクロサミドは癌細胞に対して活性があるが、正常細胞の生存にはほとんど影響を及ぼさないことが示唆されている（Pan JX, et al. Chin J Cancer; 31（4）: 178-184; Lu W, et al. PLoS One; 6（12）: e29290; Park SJ, et al. BMB Rep; 44（8）: 517-522; Osada T, et al. Cancer Res; 71（12）:4172-4182. 36; Jin Y, et al. Cancer Res; 10（6）: 2516-2527; Guo Z, et al. Cancer Research 2009; 69（6）: 2305-2313（非特許文献1〜6））。他の報告から、ニクロサミドは、STAT3、核内因子-κB（NF-κB）、Wnt/β-カテニン、およびNotch経路などの複数のシグナル伝達経路を標的とすることが示唆されている（Yo YT, et al. Mol Cancer Ther; 11（8）:1703-1712（非特許文献7））。ニクロサミドはまた、インビトロおよびインビボで癌細胞の転移および遊走を阻害することも報告されている（Helfman DM. J Natl Cancer Inst; 103（13）: 991-992; Sack U, et al. J Natl Cancer Inst; 103（13）: 1018-1036（非特許文献8および9））。
現在、CRPC患者および抗アンドロゲン薬剤耐性前立腺癌患者を治療するための新たな組成物および方法が必要とされている。驚いたことに、本発明は、一つには、これらの患者を治療するための、ならびに前立腺癌細胞増殖を阻害するための新たな組成物および方法を提供する。この分野の他の問題に対する他のいくつかの解決策も本発明によって対処される。
Pan JX, et al. Chin J Cancer; 31（4）: 178-184 Lu W, et al. PLoS One; 6（12）: e29290 Park SJ, et al. BMB Rep; 44（8）: 517-522 Osada T, et al. Cancer Res; 71（12）:4172-4182. 36 Jin Y, et al. Cancer Res; 10（6）: 2516-2527 Guo Z, et al. Cancer Research 2009; 69（6）: 2305-2313 Yo YT, et al. Mol Cancer Ther; 11（8）:1703-1712 Helfman DM. J Natl Cancer Inst; 103（13）: 991-992 Sack U, et al. J Natl Cancer Inst; 103（13）: 1018-1036
一局面では、本明細書において、AR-V7阻害剤、ならびにエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む組成物が提供される。前記組成物は薬学的組成物でもよく、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含んでもよい。一部の態様において、AR-V7阻害剤の量は、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量である。一部の態様において、前記組成物はAKR1C3阻害剤をさらに含む。一部の態様において、前記組成物は、前立腺癌治療を必要とする患者への経口投与に合わせられる。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。
第2の局面において、本発明は、AKR1C3阻害剤、ならびにエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む組成物を提供する。前記組成物は薬学的組成物でもよく、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含んでもよい。一部の態様において、AKR1C3阻害剤の量は、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量である。一部の態様において、前記組成物はAR-V7阻害剤をさらに含む。一部の態様において、前記組成物は、前立腺癌治療を必要とする患者への経口投与に合わせられる。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。
第3の局面において、本明細書において、患者において前立腺癌を治療する方法が提供され、本方法は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを患者に投与する工程を含む。一部の態様において、AR-V7阻害剤の投与は経口投与を含む。
第4の局面において、本明細書において、抗アンドロゲン薬またはドセタキセルに対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する、逆転させる、または再度感受性にする方法が提供され、本方法は、前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと接触させる工程を含む。
第5の局面において、本明細書において、前立腺癌を有する患者において抗アンドロゲン薬またはドセタキセルの治療効果を向上させる方法が提供され、本方法は、抗アンドロゲン薬を必要とする患者に有効量のAR-V7阻害剤またはAKR1C3阻害剤を投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のAR-V7阻害剤および有効量のAKR1C3阻害剤を患者に同時投与する工程を含む。一部の態様において、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば、抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは、経口投与される。一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドとAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは同時に経口投与される。
一部の態様において、治療は、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるもしくは軽減する工程、および/または抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。一部の態様において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物である。一部の態様において、治療は、ドセタキセルに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるもしくは軽減する工程および/またはドセタキセルに対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。
一部の態様において、投与する工程は、AR-V7阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与する工程を含む。一部の態様において、投与する工程は、AKR1C3阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与する工程を含む。一部の態様において、投与する工程は、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤を同時投与する工程を含む。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。
第6の局面において、本明細書において、アンドロゲン受容体（AR）バリアントを阻害する方法が提供され、本方法は、ARバリアントを、ある量のARバリアント阻害剤と接触させる工程を含む。一部の態様において、ARバリアント阻害剤は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドである。ある特定の態様において、本発明は、細胞においてARバリアントを阻害する方法を提供し、本方法は、細胞を有効量のニクロサミドと接触させる工程を含む。一部の態様において、ARバリアントはAR-V7である。一部の態様において、阻害する工程は、ARバリアントトランス活性化を阻害する工程、ARバリアント発現を阻害する工程、ARバリアント誘導性細胞遊走を阻害する工程、前立腺癌細胞によるARバリアント誘導性浸潤を阻害する工程、前立腺癌細胞コロニー形成を阻害する工程、前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターへのARバリアントの動員を阻害する工程、またはそれらの組み合わせを含む。一部の態様において、前記細胞は前立腺癌細胞である。
第7の局面において、本明細書において、ARバリアント阻害剤、ならびにエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を備えるキットが提供される。一部の態様において、ARバリアント阻害剤はAR-V7阻害剤である。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。
第8の局面において、本明細書において、STAT3を阻害する方法が提供され、本方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、STAT3と接触させる工程を含む。
第9の局面において、本発明は、患者において前立腺癌を治療する方法を提供し、本方法は、有効量のAR-V7阻害剤または有効量のAKR1C3阻害剤を患者に投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のAR-V7阻害剤および有効量のAKR1C3阻害剤を患者に同時投与する工程を含む。一部の態様において、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の態様において、治療は、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるもしくは軽減する工程、および/または抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。一部の態様において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物である。一部の態様において、治療は、ドセタキセルに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるもしくは軽減する工程、および/またはドセタキセルに対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。
一部の態様において、投与する工程は、AR-V7阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与する工程を含む。一部の態様において、投与する工程は、AKR1C3阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与する工程を含む。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは経口投与される。一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは、同時に経口投与される。
第10の局面において、本発明は、前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減するまたは逆転させる方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤と接触させる工程を含む。一部の態様において、前記方法は、前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤と接触させる工程を含む。一部の態様において、前立腺癌薬剤は抗アンドロゲン薬である。一部の態様において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物である。一部の態様において、前立腺癌薬剤はドセタキセルである。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減するまたは逆転させる工程は、前立腺癌薬剤に対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。
一部の態様において、前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減するまたは逆転させる工程は、前立腺癌を有する患者において行われる。一部の態様において、AR-V7またはAKR1C3阻害剤を患者に経口投与することによって、AR-V7阻害剤またはAKR1C3阻害剤は前立腺癌細胞と接触される。一部の態様において、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤は同時に経口投与される。一部の態様において、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
第11の局面において、本発明は、前立腺癌を有する患者において前立腺癌薬剤の治療効果を向上させる方法を提供し、本方法は、前立腺癌治療を必要とする患者に有効量のAR-V7阻害剤または有効量のAKR1C3阻害剤を投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、前立腺癌治療を必要とする患者に有効量のAR-V7阻害剤および有効量のAKR1C3阻害剤を同時投与する工程を含む。一部の態様において、向上される前立腺癌薬剤は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の態様において、向上される前立腺癌薬剤は抗アンドロゲン薬である。一部の態様において、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは経口投与される。一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは、同時に経口投与される。
第12の局面において、本発明は、AR-V7阻害剤またはAKR1C3阻害剤、ならびにエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を備えるキットを提供する。一部の態様において、前記キットは、AR-V7阻害剤を投与する方法について説明しているラベルを備える。例えば、前記ラベルはAR-V7阻害剤の経口投与について説明してもよい。一部の態様において、前記キットは、AKR1C3阻害剤を投与する方法について説明しているラベルを備える。例えば、前記ラベルはAKR1C3阻害剤の経口投与について説明してもよい。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、AR-V7阻害剤またはAKR1C3阻害剤は、前立腺癌治療を必要とする患者への経口投与に合わせられる。一部の態様において、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤は両方とも、前立腺癌治療を必要とする患者への経口投与に合わせられる。
第13の局面において、本発明は、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤を含む組成物を提供する。一部の態様において、前記組成物は抗アンドロゲン薬をさらに含む。例えば、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物でもよい。一部の態様において、前記組成物は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む。一部の態様において、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤は、前述の他の化合物の1つまたは複数の治療上の利点を向上させるのに有効な量で存在する。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、前記組成物は経口投与に合わせられる。場合によっては、前記組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
第14の局面において、本発明は、AR-V7阻害剤を、前立腺癌を有する患者に投与し、連続してまたは同時に、AKR1C3阻害剤を患者に投与する工程を含む、前立腺癌を治療する方法を提供する。一部の態様において、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えばAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の態様において、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤は同じ組成物中にある。一部の態様において、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤は異なる組成物中にある。一部の態様において、前記方法は抗アンドロゲン薬を投与する工程をさらに含む。例えば、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物でもよい。一部の態様において、前記方法は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤を患者に投与する工程をさらに含む。一部の態様において、AR-V7阻害剤またはAKR1C3阻害剤は経口投与される。一部の態様において、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤は同時に経口投与される。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドである。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。
第15の局面において、本発明は、細胞を有効量のインドメタシンと接触させる工程を含む、細胞においてアルド・ケト還元酵素1C3（AKR1C3）を阻害する方法を提供する。一部の態様において、前記阻害する工程は、AKR1C3発現を阻害する工程、AKR1C3活性を阻害する工程、またはそれらの組み合わせを含む。一部の態様において、前記細胞は前立腺癌細胞である。
[本発明1001]
AR-V7阻害剤と、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物とを含む、組成物。
[本発明1002]
AR-V7阻害剤が、前記化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量で存在する、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
AKR1C3阻害剤をさらに含む、本発明1001または1002の組成物。
[本発明1004]
AKR1C3阻害剤と、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物とを含む、組成物。
[本発明1005]
AKR1C3阻害剤が、前記化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量で存在する、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
AR-V7阻害剤をさらに含む、本発明1004または1005の組成物。
[本発明1007]
AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤を含む、組成物。
[本発明1008]
エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤が、前記化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量で存在する、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
AR-V7阻害剤がニクロサミドである、本発明1001〜1003および1006〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1011]
AKR1C3阻害剤がインドメタシンである、本発明1003〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1012]
薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
それを必要とする患者において前立腺癌を治療する方法であって、有効量のAR-V7阻害剤および/または有効量のAKR1C3阻害剤を該患者に投与する工程を含む、方法。
[本発明1014]
有効量のAR-V7阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
有効量のAKR1C3阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、本発明1013の方法。
[本発明1016]
有効量のAR-V7阻害剤および有効量のAKR1C3阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
治療が、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるもしくは軽減する工程、および/または抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む、本発明1013〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
治療が、ドセタキセルに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるもしくは軽減する工程、および/またはドセタキセルに対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む、本発明1013〜1017のいずれかの方法。
[本発明1021]
投与する工程が、AR-V7阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与することを含む、本発明1013〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
投与する工程が、AKR1C3阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与することを含む、本発明1013〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
AR-V7阻害剤がニクロサミドである、本発明1013〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
AKR1C3阻害剤がインドメタシンである、本発明1013〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
有効量のAR-V7阻害剤の経口投与、および/または
有効量のAKR1C3阻害剤の経口投与
を含む、本発明1013〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記患者への前記化合物の経口投与をさらに含む、本発明1021〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤および/またはAKR1C3阻害剤と接触させる工程を含む、前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減するまたは逆転させる方法。
[本発明1028]
前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤と接触させる工程を含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前立腺癌細胞をAKR1C3阻害剤と接触させる工程を含む、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤およびAKR1C3阻害剤と接触させる工程を含む、本発明1027の方法。
[本発明1031]
前立腺癌薬剤が、抗アンドロゲン薬、ドセタキセル、またはそれらの組み合わせである、本発明1027〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
AR-V7阻害剤がニクロサミドである、本発明1027〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
AKR1C3阻害剤がインドメタシンである、本発明1027〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性の軽減または逆転が、前立腺癌を有する患者において行われる、本発明1027〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性の軽減または逆転が、前立腺癌薬剤に対して前立腺癌細胞を再度感受性にすることを含む、本発明1027〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1027〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
有効量のAR-V7阻害剤および/または有効量のAKR1C3阻害剤を、前立腺癌治療を必要とする患者に投与する工程を含む、前立腺癌を有する患者において前立腺癌薬剤の治療効果を向上させる方法。
[本発明1039]
有効量のAR-V7阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
有効量のAKR1C3阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、本発明1038の方法。
[本発明1041]
有効量のAR-V7阻害剤および有効量のAKR1C3阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、本発明1038の方法。
[本発明1042]
向上される前立腺癌薬剤が、抗アンドロゲン薬、ドセタキセル、またはそれらの組み合わせである、本発明1038〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
抗アンドロゲン薬が、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
AR-V7阻害剤がニクロサミドである、本発明1038〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
AKR1C3阻害剤がインドメタシンである、本発明1038〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前立腺癌薬剤に対して前立腺癌細胞を再度感受性にすることによって前立腺癌薬剤の治療効果を向上させる、本発明1038〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1038〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
有効量のAR-V7阻害剤の経口投与、および/または
有効量のAKR1C3阻害剤の経口投与
を含む、本発明1038〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
AR-V7阻害剤および/またはAKR1C3阻害剤が前立腺癌薬剤と同時投与される、本発明1038〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
細胞を有効量のニクロサミドと接触させる工程を含む、細胞においてアンドロゲン受容体（AR）バリアントを阻害する方法。
[本発明1051]
ARバリアントがAR-V7である、本発明1050の方法。
[本発明1052]
阻害が、ARバリアントトランス活性化を阻害すること、ARバリアント発現を阻害すること、ARバリアント誘導性細胞遊走を阻害すること、前立腺癌細胞によるARバリアント誘導性浸潤を阻害すること、前立腺癌細胞コロニー形成を阻害すること、前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターへのARバリアントの動員を阻害すること、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1050または1051の方法。
[本発明1053]
細胞を有効量のインドメタシンと接触させる工程を含む、細胞においてアルド・ケト還元酵素1C3（AKR1C3）を阻害する方法。
[本発明1054]
阻害が、AKR1C3発現を阻害すること、AKR1C3活性を阻害すること、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
細胞が前立腺癌細胞である、本発明1050〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
（a）AR-V7阻害剤および/またはAKR1C3阻害剤、ならびに
（b）エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物
を備える、キット。
[本発明1057]
AR-V7阻害剤を投与するための説明が記載されたラベルをさらに備える、本発明1056のキット。
[本発明1058]
AKR1C3阻害剤を投与するための説明が記載されたラベルをさらに備える、本発明1056または1057のキット。
[本発明1059]
AR-V7阻害剤がニクロサミドである、本発明1056〜1058のいずれかのキット。
[本発明1060]
AKR1C3阻害剤がインドメタシンである、本発明1056〜1059のいずれかのキット。
本発明の他の目的、特徴、および利点は以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかであろう。
AR-V7が前立腺癌細胞において構成的に活性化されていることを示す。図1Aは、CS-FBS条件で3日間培養したLNCaP細胞、C4-2細胞、CWR22rv1細胞、およびVCaP細胞の結果を示す。AR-V7 mRNAレベルをqRT-PCRによって分析した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図1Bは、CS-FBS条件で3日間培養したLNCaP細胞、C4-2細胞、CWR22rv1細胞、およびVCaP細胞の結果を示す。全細胞タンパク質を抽出し、示された抗体でイムノブロットした。図1Cは、CS-FBS条件で培養し、EGFP-AR-V7プラスミドで3日間一過的にトランスフェクトしたC4-2細胞の結果を示す。1個1個の細胞の蛍光強度を顕微鏡下で観察した。図1Dは、CS-FBS条件で培養し、WT-ARまたはAR-V7プラスミドで3日間、一過的にトランスフェクトした後に、10nM DHTでもう24時間処理したPC3細胞を示す。全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。図1Eは、CS-FBS条件で培養し、ベクターまたはAR-V7プラスミドで3日間、一過的にトランスフェクトした後に、10nM DHTでもう24時間処理したLNCaP細胞の結果を示す。全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。図1Fは、CS-FBS条件で培養したC4-2 neoおよびC4-2 AR-V7安定クローンの結果を示す。AR-V7 mRNAレベルをqRT-PCRによって確かめ、AR-V7発現をウエスタンブロットによって検出した（内側のパネル）。図1Gは、CS-FBS条件で3日間培養したC4-2 neoおよびC4-2 AR-V7安定クローンの結果を示す。PSA mRNAレベルをqRT-PCRによって確かめた。図1Hは、CS-FBS中で3日間培養した後にPSA ELISAによって確かめた時のPSAタンパク質レベルを示す。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 ニクロサミドが前立腺癌細胞増殖を阻害し、細胞アポトーシスを誘導したことを示す。図2A:C4-2 neo細胞、C4-2 AR-V7細胞、CWR22rv1細胞、およびPZ-HPV7細胞をFBS含有培地中で0.5μMニクロサミドで処理した。細胞数を数え、48時間後に細胞生存率を計算した。図2B:C4-2 neo細胞、C4-2 AR-V7細胞、CWR22rv1細胞、およびPZ-HPV7細胞を、FBS含有培地中で0.5μMニクロサミドで処理した。48時間後に、アポトーシスを細胞死ELISAによって検出した。図2C:CWR22rv1細胞を0μM、0.5μM、または1.0μMのニクロサミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。図2D:コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。ニクロサミドはコロニー形成を用量依存的に阻害した。＊p<0.05。 ニクロサミドがタンパク質分解を増強することによってAR-V7タンパク質発現を阻害したことを示す。図3A:CWR22rv1細胞を、10％FBS含有RPMI1640培地条件で0μM、0.5μM、または1.0μMのニクロサミドで一晩処理し、全細胞溶解産物を、示された抗体でイムノブロットした。図3B:CWR22rv1細胞を、10％FBS含有RPMI1640培地条件で1.0μMニクロサミドで処理し、異なる時点で全細胞溶解産物を抽出し、示された抗体でイムノブロットした。図3C:CWR22rv1細胞を、10％FBS含有RPMI1640培地条件で0μM、0.5μM、または1.0μMのニクロサミドで一晩処理し、全RNAを抽出し、AR mRNAレベルまたはAR-V7 mRNAレベルをqRT-PCRによって分析した。図3D:時間0で、タンパク質合成阻害剤である50μg/mLシクロヘキシミド（CHX）を、2μMニクロサミド（Nic）と共にまたは2μMニクロサミド（Nic）無しで添加した。指定された時点で、細胞を採取し、AR-V7タンパク質レベルを、AR-V7に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットによって測定した。図3Eは、ニクロサミド誘導性ARタンパク質分解に対するMG132の効果を図示する。MG132（5μM/L）を、2μMニクロサミドの存在下および非存在下でシクロヘキシミド（50μg/mL）と一緒にCWR22rv1細胞に添加した。8時間で細胞溶解産物を調製した。AR-V7タンパク質レベルを、AR-V7に特異的な抗体および対照としてチューブリンに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析によって確かめた。 ニクロサミドがAR-V7転写活性を阻害することを示す。図4A:293-AR-V7-PSAルシフェラーゼプロモーター安定クローンを10％FBS含有培地または10％CS-FBS含有培地中で1.0μMニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理し、全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。図4B:LNCaP細胞をCS-FBS条件でPSAルシフェラーゼプロモーターとAR-V7プラスミドで24時間コトランスフェクトした後に、1.0μMニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理し、全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。図4C:C4-2 AR-V7安定細胞をCS-FBS条件でPSAルシフェラーゼプロモーターで24時間トランスフェクトした後に、1nM DHTと共にまたは1nM DHT無しで、0.5μM、1.0μMのニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理し、全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。図4D:C4-2 neo細胞およびC4-2 AR-V7細胞をCS-FBS条件で3日間培養し、次いで、1.0μMニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理し、上清を収集し、PSA ELISAに供した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 エンザルタミドで長期にわたって処理したC4-2B細胞がARバリアントを発現し、ニクロサミドに対して感受性であることを示す。図5A:C4-2B親細胞を、10％FBS含有RPMI1640培地条件で20μMエンザルタミドで処理し、示された別の日に総細胞数を数えた。図5B:C4-2B MR細胞を10％FBS含有RPMI1640培地条件で20μMエンザルタミドで処理し、示された別の日に総細胞数を数えた。図5C:C4-2B親細胞およびC4-2B MR細胞を10％FBS含有RPMI1640培地中で3日間培養し、全RNAを抽出し、AR-V1、AR-V7、AR1/2/2b、AR1/2/3/2b、またはAR完全長のmRNAレベルをqRT-PCRによって分析した。図5D:C4-2B親細胞およびC4-2B MR細胞を10％FBS含有RPMI1640培地中で3日間培養し、全細胞溶解産物を、示された抗体でイムノブロットした。図5E:C4-2B親細胞およびC4-2B MR細胞を10％CS-FBS含有培地中で3日間培養し、サイトゾル画分および核画分を調製するために細胞を採取し、AR-V7、AR、ポリメラーゼII、またはチューブリンに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。ポリメラーゼIIの発現を核画分完全性のマーカーとして使用し、チューブリンの発現をサイトゾル画分完全性のマーカーとして使用した。図5F:C4-2B MR細胞を10％FBS含有培地中で培養し、示されたように異なる濃度のエンザルタミドまたはニクロサミドで処理し、48時間後に総細胞数を数えた。図5G:C4-2B MR細胞を0μM、0.5μM、または1.0μMのニクロサミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。図5H:コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。ニクロサミドはコロニー形成を用量依存的に阻害した。＊p<0.05。 ニクロサミドが前立腺癌細胞におけるエンザルタミドおよびアビラテロンの効果を向上させることを示す。図6A:CWR22rv1細胞をFBS含有培地中で20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、3日後および5日後に細胞数を数えた。図6B:CWR22rv1細胞を、FBS含有培地中で、20μMアビラテロンと共にまたは20μMアビラテロン無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、3日後および5日後に細胞数を数えた。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図6C:CWR22rv1細胞を、FBS含有培地中で、20μMエンザルタミドもしくは20μMアビラテロンと共にまたは20μMエンザルタミドも20μMアビラテロンも無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。図6D:コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。図6E:C4-2B MR細胞をFBS含有培地中で20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、3日後および5日後に細胞数を数えた。図6F:C4-2B MR細胞をFBS含有培地中で20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。図6G:コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 ニクロサミドがAR-V7阻害を介してエンザルタミドおよびアビラテロンの効果を向上させることを示す。図7A:CWR22rv1細胞をFBS含有培地中で20μMエンザルタミドもしくは20μMアビラテロンと共にまたは20μMエンザルタミドも20μMアビラテロンも無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、48時間後に全細胞溶解産物を抽出し、ウエスタンブロットに供した。図:7B C4-B MR細胞をFBS含有培地中で20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、48時間後に全細胞溶解産物を抽出し、ウエスタンブロットに供した。 AR-V7-PSAプロモータールシフェラーゼ構築物で安定にトランスフェクトされた293細胞が、Prestwick Chemical Libraryからの候補AR-V7化合物についてスクリーニングされたことを示す。図8A:CWR22rv1、293、および293 GFP AR-V7-PSAプロモータールシフェラーゼ安定クローンを10％FBS含有培地中で2日間培養した。全細胞溶解産物を調製し、示されたように抗体を用いてウエスタンブロット分析に供した。図8B:293 GFP AR-V7-PSAプロモータールシフェラーゼ安定クローンを10％FBS含有培地中で2日間培養し、1個1個の細胞の蛍光強度を顕微鏡下で観察した。矢印はAR-V7タンパク質発現の一例を示す。図8C:293 neoおよび293 GFP AR-V7-PSAプロモータールシフェラーゼ安定クローンを10％FBS含有培地中で2日間培養し、全RNAを単離し、AR完全長およびAR-V7 のmRNAレベルをqRT-PCRによって確かめた。図8D:異なる細胞数の293 neoおよび293 GFP AR-V7-PSAプロモータールシフェラーゼ安定クローンを10％FBS含有培地中で2日間培養し、全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図8Eは化合物スクリーニング手順の概略図を示す。＊p<0.05。 エンザルタミドではPSAプロモーターへのAR-V7の動員を阻止できないことを示す。図9A:LNCaP細胞を、CS-FBS条件でPSA-E/P-lucまたはAREI/II-lucとAR V7プラスミドで3日間コトランスフェクトした後に、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、10nM DHTで一晩処理し、全細胞溶解産物をルシフェラーゼアッセイに供した。図9B:C4-2 neo細胞およびC4-2 AR-V7細胞をCS-FBS条件で3日間培養した後に、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、10nM DHTで一晩処理し、全細胞溶解産物をChIPアッセイに供した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。 CWR22rv1細胞においてAR-V7は細胞増殖を媒介することを示す。図10A:CWR22rv1細胞をCS-FBS条件で対照siRNA、ARエキソン7 siRNA、またはAR V7 siRNAで一過的にトランスフェクトし、別の日に細胞数を数えた。図10B:CWR22rv1細胞を、CS-FBS条件で対照siRNA、ARエキソン7 siRNA、またはAR-V7 siRNAで3日間、一過的にトランスフェクトし、ノックダウン効果をウエスタンブロットで調べた。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 CWR22rv1細胞においてAR-V7がアビラテロン耐性を誘導したことを示す。図11A CWR22rv1細胞、C4-2B細胞、およびLNCaP細胞を10％FBS含有RPMI1640培地条件で培養し、次いで、異なる用量のアビラテロンで処理し、総細胞数を数え、48時間後に細胞生存率を計算した。図11B:CWR22rv1細胞を、FBS中で対照siRNA、ARエキソン7 siRNA、AR-V7 siRNA、またはARエキソン7 siRNA+AR-V7 siRNAで一過的にトランスフェクトし、次いで、10μMアビラテロンで処理し、総細胞数を数え、48時間後に細胞生存率を計算した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 AR-V7阻害剤としてニクロサミドを特定するのに使用した薬物スクリーニング手順の模式図を示す。 ニクロサミドがAR-V7トランス活性化を阻害することを証明するプロットを示す。 ニクロサミドがAR-V7トランス活性化を阻害するが、ビカルタミドは阻害しないことを証明するプロットを示す。 ニクロサミドがARおよびAR-V7の発現を阻害することを証明するブロットを示す。 前立腺癌細胞におけるニクロサミドによる細胞遊走の阻害および浸潤の阻害を図示する。 前立腺癌細胞におけるニクロサミドによる細胞浸潤の阻害を図示する。 前立腺癌細胞におけるニクロサミドによるコロニー形成の阻害を図示する。 ニクロサミドがC4-2B MR細胞増殖を用量依存的に阻害したことを示す。 併用処理によってPSAプロモーターへのARの動員が阻害されることを示す。 併用処理によってC4-2B細胞、C4-2B TAXR細胞、C4-2B TAXR+MR細胞、およびC4-2B AbiR細胞の増殖が阻害されたことを示す。 ニクロサミドがC4-2B MR細胞におけるエンザルタミドの効果を向上させたことを示す。 ニクロサミドがC4-2B AbiR細胞におけるアビラテロンの効果を向上させたことを示す。 LNCaP-s17細胞を、DMSO、エンザルタミド、ニクロサミド、ならびにエンザルタミドとニクロサミドの組み合わせとインキュベートした結果を示す。 LNCaP-STAT3C細胞を、DMSO、エンザルタミド、ニクロサミド、ならびにエンザルタミドとニクロサミドの組み合わせとインキュベートした結果を示す。 IL-6過剰発現によってエンザルタミドに対するLNCaP細胞の耐性が増加することを示す。図26A:IL6を安定に発現するLNCaP細胞（LNCaP-S17）および対照LNCaP細胞（LNCaP-neo）を、完全FBS含有培地に溶解した異なる用量のエンザルタミドで処理し、48時間後に細胞数を数えた。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図26B:LNCaP-neo細胞およびLNCaP-S17細胞を0μMまたは20μMのエンザルタミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。図26C:コロニーを数え、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。エンザルタミドで処理した時に、LNCaP-S17細胞はLNCaP-neo細胞と比較して多数のコロニーを形成した。図26D:LNCaP-IL6+細胞（10％FBSおよび5ng/mL IL-6を含有する培地中で連続培養）ならびに対照LNCaP細胞を、完全FBS含有培地中で0μM、10μM、または20μMのエンザルタミドで処理し、48時間後に細胞数を数えた。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 前立腺癌細胞においてオートクラインIL-6がSTAT3経路を構成的に活性化し、アンドロゲン受容体トランス活性化を増強することを示す。図27A:オートクラインIL-6をもつ前立腺癌細胞はSTAT3構成的活性化を示す。LNCaP細胞およびLNCaP-s17細胞をFBS条件で24時間培養し、溶解産物を、示された抗体でイムノブロットした。LNCaP-s17細胞は、LNCaP-neo細胞と比較して高レベルのc-Myc（図27B）、サバイビン（図27C）、IL-6 mRNA（図27D）およびタンパク質（図27E）を発現する。LNCaP-neo細胞およびLNCaP-S17細胞からの全RNAをqRT-PCRによって分析した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図27F:PSAプロモーターの中にあるAREへのARの動員をChIPアッセイによって分析した。LNCaP-S17細胞およびLNCaP-STAT3C細胞はLNCaP-neo細胞と比較してPSAプロモーターへのARの動員を増強した。 STAT3発現のダウンレギュレーションによってエンザルタミド処理に対するLNCaP-s17細胞の感受性が回復することを示す。図28A:STAT3発現のダウンレギュレーションによってエンザルタミドに対するLNCaP-S17細胞の感受性が増加した。LNCaP-s17細胞を、STAT3に特異的なsiRNAまたは対照siRNAでトランスフェクトし、0μMまたは20μMのエンザルタミドで処理した。3日後に細胞数を数えた。図28B:全細胞溶解産物を収集し、ウエスタンブロットに供した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図28C:LNCaP-neo細胞およびLNCaP-STAT3C細胞を、FBS含有培地中でDMSO、10μMまたは20μMのエンザルタミドで48時間処理し、細胞数を数えた。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図28D:PSAプロモーターの中にあるAREへのARの動員をChIPアッセイによって分析した。LNCaP-neo細胞、LNCaP-S17細胞、およびLNCaP-STAT3C細胞をFBS条件で、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、一晩培養し、1％ホルムアルデヒドで架橋し、結果として得られたDNA-タンパク質複合体をChIPアッセイに供した。＊p<0.05。 前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性を逆転させる新規のSTAT3阻害剤であるニクロサミドを示す。図29Aはニクロサミドの化学構造を図示する。図29B:ニクロサミドはLNCaP-s17細胞において構成的活性化型STAT3を用量依存的に阻害した。図29C:LNCaP-s17細胞を、FBS含有培地中で20μMエンザルタミドと組み合わせて、または20μMエンザルタミド無しで0.25μM、0.5μMのニクロサミドまたは10μM AG490で処理し、48時間後に細胞数を数えた。図29D:アポトーシスを細胞死ELISAによって分析した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図29E:LNCaP-s17細胞を、FBS含有培地中で20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、2日後、4日後、および7日後に細胞数を数えた。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。図29F:コロニー形成能力を試験管内腫瘍細胞感受性試験によって調べ、LNCaP-s17細胞を、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、同数の細胞を10cmプレートに平板培養し、3週間後にコロニーを0.5％クリスタルバイオレットで染色し、コロニー数を数えた。 CS-FBS条件で3日間培養した後に、1.0μMニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理したC4-2 neo細胞およびC4-2 AR-V7細胞を示す。全細胞溶解産物を、示された抗体でイムノブロットした。 CS-FBS条件で3日間培養した後に、0.5μM、1.0μMのニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理したC4-2 AR-V7細胞を示す。全細胞溶解産物をChIPアッセイに供した。結果は、2回繰り返して行った3回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。 未処理対照細胞と比較してニクロサミドがAR-V7タンパク質分解を増加させたことを示す。AR-V7タンパク質の相対量を半対数スケールでプロットした。AR-V7タンパク質の量を時間0で100％に基準化した。破線は50％半減期を示す。 0μM、0.5μM、および1.0μMのニクロサミドと共に培養したCWR22rv1細胞、C4-2R-V7細胞、およびC4-2 neo細胞を示す。この図では、ニクロサミドは前立腺癌細胞のクローン形成能力を用量依存的に有意に阻害することが示された。 0μM、0.5μM、および1.0μMのニクロサミドと共に培養したCWR22rv1細胞、C4-2R-V7細胞、およびC4-2 neo細胞のコロニー数対ニクロサミド濃度のプロットを示す。コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。 C4-2B MR細胞においてニクロサミドはコロニー形成を阻害し、コロニーサイズも阻害したが、エンザルタミドは阻害しなかったことを示す。C4-2B MR細胞を、DMSO、10μMまたは20μMのエンザルタミド、0.5μMまたは1.0μMのニクロサミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。 コロニー数対エンザルタミド、ニクロサミド、および対照DMSOの濃度のプロットを示す。この図から、C4-2B MR細胞においてニクロサミドはコロニー形成およびコロニーサイズを阻害したが、エンザルタミドは阻害しなかったことが分かる。コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。ニクロサミドはコロニー形成を用量依存的に阻害した。＊p<0.05。 エンザルタミドと共にまたはエンザルタミド無しで、ニクロサミドで48時間処理したCWR22rv1細胞を対象にした試験管内腫瘍細胞感受性試験の結果を示す。CWR22rv1細胞またはC4-2B MR細胞を、FBS含有培地中で、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。 DMSO、エンザルタミド、ニクロサミド、またはニクロサミドとエンザルタミドの組み合わせで処理したCWR22rv1細胞を対象にしたコロニー数のプロットである試験管内腫瘍細胞感受性試験の結果を示す。CWR22rv1およびC4-2B MRのコロニーを数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。 ビヒクル、エンザルタミド、ニクロサミド、またはそれらの組み合わせで処理したCWR22rv1細胞から作製した異種移植片を用いたインビボ研究の腫瘍量対時間（日）のプロットを示す。CWR22rv1異種移植片をもつマウスを、ビヒクル対照、エンザルタミド、ニクロサミド、またはそれらの組み合わせで3週間処置し、腫瘍量を週2回測定し、腫瘍を収集した。＊p<0.05。 CWR22Rv1異種移植片モデルの腫瘍成長に対するニクロサミド（経口投与を介したニクロサミド）の効果を示す。CWR22Rv1細胞（4百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、雄SCIDマウスの側腹部に皮下注射した。担癌マウス（腫瘍量約50〜75mm3）を、以下:対照:（H2Oに溶解した5％PGE8000 p.o 1日2回）、ニクロサミド（200mg/kg p.o 1日2回）の通り1週間あたり5日間処置した。腫瘍をカリパスを用いて週2回測定し、長さx幅2/2を用いて腫瘍量を計算した。処置して3週間後に腫瘍組織を採取した。＊p<0.05。 インビトロでのCWR22Rv1細胞におけるニクロサミドとビカルタミドの組み合わせを示す。図41A:ニクロサミドとビカルタミドの組み合わせはインビトロで腫瘍成長を用量依存的に阻害する。図41B:ニクロサミドとビカルタミドの組み合わせはインビトロで腫瘍成長を時間依存的に阻害する。＊p<0.05。 ニクロサミドとビカルタミドの組み合わせのCWR22Rv1異種移植片モデルを示す。CWR22Rv1細胞（4百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、雄SCIDマウスの側腹部に皮下注射した。担癌マウス（腫瘍量約50〜75mm3）を、以下:対照:（0.5％重量/体積（w/v）Methocel A4M p.o、ならびにPBSに溶解した5％Tween80および5％エタノール、i.p.）、ビカルタミド（25mg/kg p.o）、ニクロサミド（25mg/kg i.p.）、ならびに組み合わせ（25mg/kgビカルタミドp.o+25mg/kgニクロサミドi.p.）の通り1週間あたり5日間処置した。腫瘍をカリパスを用いて週2回、測定し、長さx幅2/2を用いて腫瘍量を計算した。処置して3週間後に腫瘍組織を採取した。＊p<0.05。 C4-2B MDVR細胞がインビトロおよびインビボでエンザルタミドに対して耐性であることを示す。図43A:C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞を異なる濃度のエンザルタミドで48時間処理し、総細胞数を数え、細胞生存率を計算した。図43B:10μMまたは20μMのエンザルタミドで処理したC4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞のクローン形成能力を分析した。エンザルタミドはC4-2B親細胞のクローン形成能力を有意に阻害した。図43C:C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞をSCIDマウスの前立腺に同所に注射し、25mg/Kgエンザルタミドまたはビヒクル対照で処置した。3週間で腫瘍を採取し、秤量した。図43D:LNCaP細胞、LN-95細胞、およびCWR22Rv1細胞を異なる濃度のエンザルタミドで2日間処理し、総細胞数を数え、細胞生存率（％）を計算した。＊p<0.05。 イントラクラインアンドロゲン合成経路がエンザルタミド耐性前立腺癌細胞において活性化されていることを示す。図44A：ステロイドホルモン生合成に関与する遺伝子をコードする転写物の発現を、遺伝子セット濃縮（gene set enrichment）によって分析した。C4-2B親細胞とC4-2B MDVR細胞との間で1.3倍に調節されていた遺伝子を濃縮し、ヒートマップをSubioプラットフォームによって作成した。 イントラクラインアンドロゲン合成経路がエンザルタミド耐性前立腺癌細胞において活性化されていることを示す。図44B：C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞を10％FBS含有RPMI1640培地中で3日間培養し、全RNAを抽出し、CYP17A1、HSD3B1、HSD3B2、HSD17B3、SRD5A1、AKR1C1/2、またはAKR1C3のmRNAレベルをqRT-PCRによって分析した。AKR1C3、HSD3B、およびCYP17A1のタンパク質レベルをウエスタンブロットで調べた（右パネル）。 AKR1C3が転移性前立腺腫瘍およびエンザルタミド耐性異種移植片において高発現であることを示す。図45A：C4-2B親細胞、C4-2B MDVR細胞、VCaP細胞、CWR22Rv1細胞、LNCaP細胞、およびLN-95細胞を採取し、全溶解産物をウェスタンブロッティングに供した。 AKR1C3が転移性前立腺腫瘍およびエンザルタミド耐性異種移植片において高発現であることを示す。図45B：C4-2B親異種移植片、C4-2B MDVR異種移植片、およびCWR22Rv1異種移植片におけるAKR1C3発現レベルをIHC染色によって分析した。 AKR1C3が転移性前立腺腫瘍およびエンザルタミド耐性異種移植片において高発現であることを示す。図45C：正常な前立腺組織と前立腺癌を比較した2つデータセットにおけるAKR1C3相対発現レベルを示した、Oncomineデータベースを用いた遺伝子発現分析。Vanaja:正常、n=8;癌、n=32。Singh:正常、n=50;癌、n=52。データは、Oncomineアウトプットに従って基準化された発現単位の平均±S.E.で示した（上）。良性、原発性、または転移性の前立腺癌を比較した2つデータセットにおけるGEOデータベースを用いたAKR1C3遺伝子発現分析。GSE27616:良性、n=4;原発性前立腺癌、n=5;および転移性前立腺癌、n=4;GSE32269:原発性前立腺癌、n=22;および転移性前立腺癌、n=29。データを抽出し、Subioプラットフォームによって分析した（下）。 AKR1C3が転移性前立腺腫瘍およびエンザルタミド耐性異種移植片において高発現であることを示す。図45D：Oncomineデータベースを用いた遺伝子発現分析から、2つの独立したデータセット（GlinskyおよびSingh前立腺）においてAKR1C3発現は前立腺癌の進行および再発と相関関係があることが分かった。 イントラクラインアンドロゲンがエンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてアップレギュレートされることを示す。図46A：C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞を、無血清かつフェノールレッドを含まないRPMI1640培地中で5日間培養し、細胞抽出物中のステロイド濃度をLC-MSによって分析した。MassLynx4.1ソフトウェアによって作成した代表的なテストステロンおよびエストラジオールクロマトグラムを示した。 イントラクラインアンドロゲンがエンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてアップレギュレートされることを示す。図46B：C4-2B親細胞のアンドロゲン代謝産物レベルとC4-2B MDVR細胞のアンドロゲン代謝産物レベルとの間の差違を分析および定量した。 イントラクラインアンドロゲンがエンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてアップレギュレートされることを示す。図46C：C4-2B親細胞とC4-2B MDVR細胞との間で、表示されたステロイド代謝産物を定量した。 イントラクラインアンドロゲンがエンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてアップレギュレートされることを示す。図46D：エンザルタミド耐性前立腺癌細胞ではアンドロゲン代謝経路がアップレギュレートされた。 前立腺癌細胞においてAKR1C3がエンザルタミドに対する耐性を付与することを示す。図47A:CWR22Rv1細胞を20μMエンザルタミドで処理した後に対照shRNAまたはAKR1C3 shRNA（#561および#694）で一過的にトランスフェクトし、3日目に細胞数を求めた。図47B:C4-2B MDVR細胞を20μMエンザルタミドで処理した後に対照shRNAまたはAKR1C3 shRNA（#561および#694）で一過的にトランスフェクトし、3日目に細胞数を求めた。図47C:CWR22Rv1またはC4-2B MDVR細胞を対照shRNAまたはAKR1C3 shRNA（#561および#694）で一過的にトランスフェクトし、3日目または5日目に細胞を収集し、全細胞溶解産物をウェスタンブロッティングに供した。図47D:LNCaP-neo細胞またはLNCaP-AKR1C3細胞を異なる濃度のエンザルタミドで2日間処理し、総細胞数を数え、細胞生存率（％）を計算した。図47E:LNCaP-neo細胞またはLNCaP-AKR1C3細胞を10μMエンザルタミドで処理し、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行い、コロニーサイズの画像を顕微鏡下で撮った。図47F:コロニーを数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した。＊p<0.05。Enza:エンザルタミド。 AKR1C3活性阻害剤であるインドメタシンがエンザルタミド耐性を克服することを示す。図48A：CWR22Rv1細胞を、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、10μMもしくは20μMのインドメタシンで2日間処理した。総細胞数を数えた（左）。試験管内腫瘍細胞感受性試験を行い、コロニーサイズの画像を顕微鏡下で撮った（中央）。コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した（右）。 AKR1C3活性阻害剤であるインドメタシンがエンザルタミド耐性を克服することを示す。図48B：C4-2B MDVR細胞を、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、10μMもしくは20μMのインドメタシンで2日間処理し、総細胞数を数え（左）、試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。コロニーサイズの画像を顕微鏡下で撮った（中央）。コロニー数を数えた。結果は、2回繰り返して行った2回の実験の平均±SDで示した（右）。 AKR1C3活性阻害剤であるインドメタシンがエンザルタミド耐性を克服することを示す。図48C：CWR22Rv1異種移植片をもつマウスを、ビヒクル対照、エンザルタミド（25mg/Kg p.o）、インドメタシン（3mg/Kg i.p）、またはそれらの組み合わせで3週間処理した。腫瘍量を週2回測定し、腫瘍を収集および秤量した。 AKR1C3活性阻害剤であるインドメタシンがエンザルタミド耐性を克服することを示す。図48D：各群においてKi67のIHC染色およびH/E染色を行い、定量した。＊p<0.05。Enza:エンザルタミド。Indocin:インドメタシン。
発明の詳細な説明
I.序論
本明細書に記載のように、本発明者らは、前立腺癌細胞の増殖、生存、またはある特定の前立腺癌薬剤に対する耐性の2つの新たな機構、ならびに前立腺癌を治療するための方法および組成物を発見した。一部の態様において、前立腺癌細胞の増殖、生存、または薬剤耐性は、アンドロゲン受容体（AR）バリアント、例えば、AR-V7の発現または活性によって媒介される。従って、本発明は、ARバリアント発現または活性の阻害剤を提供する。例えば、ニクロサミドは、前立腺癌細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する新規のARバリアント阻害剤である。ニクロサミドは、薬剤耐性前立腺癌細胞または腫瘍の増殖または生存を阻害することができる。例えば、ニクロサミドは、抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミド）耐性前立腺癌細胞または腫瘍の増殖または生存を阻害することができる。さらに、ニクロサミドは前立腺癌薬剤との相乗効果を示すことができる。例えば、ニクロサミドは、抗アンドロゲン化合物、例えば、エンザルタミドとの相乗効果を示し、前立腺癌療法、例えば抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミド）療法に対して治療抵抗性の前立腺癌細胞を、再度感受性にすることができる。従って、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、進行期前立腺癌、例えば転移性前立腺癌を治療するための単独療法として、または抗アンドロゲン療法を含む現行の前立腺癌療法と組み合わせて有効な、かつ経口により生体利用可能な薬剤である。
一部の態様において、前立腺癌細胞の増殖、生存、または薬剤耐性は酵素アルド・ケト還元酵素1C3（AKR1C3）の発現または活性によって媒介される。従って、本発明はAKR1C3発現または活性の阻害剤を提供する。例えば、インドメタシンは、前立腺癌細胞の増殖もしくは生存を阻害することができる、またはアポトーシスを誘導することができるAKR1C3阻害剤である。本明細書に記載のように、AKR1C3阻害剤は、薬剤耐性前立腺癌細胞または腫瘍の増殖または生存を阻害することができる。例えば、AKR1C3阻害剤は、抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミド）耐性前立腺癌細胞または腫瘍の増殖または生存を阻害することができる。さらに、AKR1C3阻害剤は他の前立腺癌療法との相乗効果を示すことができる。例えば、AKR1C3阻害剤は抗アンドロゲン化合物、例えば、エンザルタミドとの相乗効果を示すことができ、抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミド）療法に対する治療抵抗性前立腺癌細胞を再度感受性にすることができる。従って、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは、進行性転移性前立腺癌を治療するための単独療法として、または抗アンドロゲン療法を含む現行の前立腺癌療法と組み合わせて有効な、かつ経口により生体利用可能な薬剤である。
本発明は、前立腺癌、例えば、抗アンドロゲン薬剤耐性前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、またはそれらの組み合わせを治療するための新たな組成物および方法を提供する。これらの新たな組成物には、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドおよび/またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを含む薬学的組成物が含まれるが、これに限定されない。これらの新たな方法には、前立腺癌を有する患者を治療するために、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドおよび/またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与する方法が含まれるが、これに限定されない。本発明はまた、アンドロゲン受容体バリアント発現、例えば、AR-V7を阻害する方法およびAR-V7を発現する細胞を死滅させる方法も提供する。本発明はまた、AKR1C3発現または活性を阻害する方法およびAKR1C3を発現する細胞を死滅させる方法も提供する。本発明はまた、抗アンドロゲン前立腺癌薬剤を含む前立腺癌薬剤の効力を向上させる方法も提供する。
II．定義
本明細書で使用する以下の用語は特に定めのない限り、その用語のものとされる意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数への言及を含む点に留意する。
本明細書で使用する「有効量」という用語は、示された障害、状態、または精神状態に関して望ましい結果を生じるのに十分な投与量を含む。望ましい結果は、投与のレシピエントにおける主観的な改善点または客観的な改善点を含んでもよい。例えば、有効量のAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）またはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）は、前立腺癌、例えば、CRPCの徴候、症状、または原因を軽減するのに十分な量を含む。従って、有効量は、腫瘍成長を遅らせるか、または逆転させる量、平均生存期間を延ばす量、腫瘍の進行もしくは転移を阻害する量、または前立腺癌薬剤に対して耐性になっているか、もしくは前立腺癌薬剤に対して耐性である前立腺癌細胞を前立腺癌薬剤に対して再度感受性にする量でもよい。また、例えば、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）またはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）の有効量は、対象に投与された時に前立腺癌を有する対象において大幅な改善を引き起こすのに十分な量を含む。この量は、治療されている前立腺癌のタイプ、前立腺癌の進行のステージ、適用される組成物のタイプおよび濃度、ならびに対象に同じく投与される抗アンドロゲン薬の量によって異なる。例えば、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）またはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）の有効量は、薬剤、例えば、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミドの前立腺癌治療活性の向上において有効な量を含んでもよい。
本明細書で使用する「治療する」という用語は、レシピエントの健康状態、例えば、患者の前立腺癌の状況に有益な変化を生じさせるための方法および操作を含むが、これに限定されない。変化は主観的でもよく客観的でもよく、治療されている前立腺癌の症状または徴候などの特徴に関するものでもよい。例えば、患者が疼痛が減少したことに気付けば、疼痛の治療は成功している。例えば、腫脹の量が減少していれば、炎症治療は成功している。同様に、臨床家が客観的な変化、例えば、前立腺癌細胞数の減少、前立腺癌細胞増殖の減少、前立腺癌腫瘍サイズの縮小、または別の前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性の減少に気付けば、前立腺癌治療は同様に有益となっている。この用語には、レシピエントの状況の悪化を予防することも含まれる。本明細書で使用する治療するとは、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）またはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）を、前立腺癌を有する患者に投与することも含む。
本明細書で使用する「投与する」という用語は、ある量の本明細書に記載の化合物、例えば、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）またはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）を患者に提供することに関連する活動を含む。投与するとは、単位投与量の本明細書に示した組成物を、これを必要とする患者に提供することを含む。投与するとは、有効量の化合物、例えば、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）またはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）を、指定された期間にわたって、例えば、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、もしくは31日にわたって、あるいは指定された順序、例えば、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）もしくはAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）を投与した後に、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を投与するか、または逆もまた同様に提供することを含む。
本明細書で使用する「同時投与する」という用語は、構造が異なる2種類以上の化合物を連続投与または同時投与することを含む。例えば、構造が異なる2種類以上の薬学的に活性な化合物は、構造が異なる、活性のある2種類以上の薬学的に活性な化合物を含有する経口投与に合わせられた薬学的組成物を投与することによって、同時投与されてもよい。別の例として、構造が異なる2種類以上の化合物は、一方の化合物を投与し、次いで、他方の化合物を投与することによって同時投与されてもよい。場合によっては、同時投与される化合物は同じ経路によって投与される。他の場合では、同時投与される化合物は異なる経路を介して投与される。例えば、一方の化合物は経口投与されてもよく、他方の化合物は、例えば、静脈内注射または腹腔内注射を介して、連続投与または同時投与されてもよい。
本明細書で使用する「進行期前立腺癌」または「進行性前立腺癌」という句は、疾患の初期段階を過ぎて進行した前立腺癌のクラスを含む。典型的に、進行期前立腺癌は予後不良と関連する。進行期前立腺癌のタイプには、転移性前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば、抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌など）、ホルモン難治性前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えば、AR-V7誘導性抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、AR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌）、AKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、例えば、AKR1C3誘導性抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、AKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌）、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これに限定されない。場合によっては、進行期前立腺癌は、一般的に、以下の従来の前立腺癌療法：エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびドセタキセルの1つまたは複数による治療に応答しないか、または耐性がある。本発明の化合物、組成物、および方法は、本明細書において開示された進行期前立腺癌のタイプのいずれか1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多い）を含む前立腺癌、例えば進行期前立腺癌を治療するために提供される。
本明細書で使用する「前立腺癌の症状を寛解させる」という句は、前立腺癌を有する患者の症状または状態を緩和または改善することを含む。症状を寛解させるとは、前立腺癌に関連する疼痛または不快感を軽減することを含む。症状を寛解させるとはまた、前立腺癌のマーカーを軽減すること、例えば、前立腺癌細胞の数を少なくすること、または前立腺癌腫瘍のサイズを小さくすることも含む。
本明細書で使用する「治療効果を向上させる」という句は、本明細書において議論されるように治療されている状態の有益な応答または改善を示す多数の主観的要因または客観的要因のうちのいずれかを含む。例えば、抗アンドロゲン薬（例えば、エンザルタミド、アビラテロン、もしくはビカルタミド）またはドセタキセルの治療効果を向上させるとは、抗アンドロゲンまたはドセタキセル療法に対する抗アンドロゲン薬耐性前立腺癌またはドセタキセル耐性前立腺癌を再度感受性にすることを含む。また、例えば、抗アンドロゲン薬またはドセタキセルの治療効果を向上させるとは、抗アンドロゲン薬耐性前立腺癌細胞またはドセタキセル耐性前立腺癌細胞を、抗アンドロゲン薬またはドセタキセルに対して感受性になるように変えることを含む。また、例えば、抗アンドロゲン薬またはドセタキセルの治療効果を向上させるとは、抗アンドロゲン薬またはドセタキセルの活性を相加的または相乗的に改善するか、または高めることも含む。一部の態様において、向上は、前立腺癌を治療するのに用いられる抗アンドロゲン薬またはドセタキセルの治療活性の1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、または1000倍の増加を含む。
本明細書で使用する「前立腺癌細胞の耐性を逆転させる」という句は、抗アンドロゲン薬またはドセタキセル療法に対して耐性の前立腺癌細胞を、抗アンドロゲン薬またはドセタキセル療法に対して感受性になるように変えるか、または改変することを含む。
本明細書で使用する「前立腺癌細胞の耐性を軽減する」という句は、抗アンドロゲン薬もしくはドセタキセル療法に対して耐性であるか、または抗アンドロゲン薬もしくはドセタキセル療法に対して以前に耐性であった前立腺癌細胞に対する抗アンドロゲン薬もしくはドセタキセルの治療活性を高めることを含む。
本明細書で使用する「前立腺癌細胞の耐性を再度感受性にする」という句は、抗アンドロゲン薬またはドセタキセル療法に対して耐性の前立腺癌細胞における抗アンドロゲン薬またはドセタキセル療法に対する感受性を誘導することを含む。本明細書で使用する感受性とは、前立腺癌細胞が抗アンドロゲン薬またはドセタキセルで効果的に治療される能力を誘導することを含む。感受性はまた、抗アンドロゲン薬またはドセタキセル療法を用いて有益な効果を実現するのに必要な投与量と減らすことも含む。
本明細書で使用する「抗アンドロゲン薬」という句は、アンドロゲン受容体を遮断することによって、細胞表面にある結合部位において競合することによって、またはアンドロゲン産生に影響を及ぼすか、もしくはアンドロゲン産生を媒介することによってアンドロゲン経路を変える抗アンドロゲン化合物を含む。抗アンドロゲンは、前立腺癌を含むが、これに限定されない、いくつかの疾患を治療するのに有用である。抗アンドロゲンには、エンザルタミド、アビラテロン、およびビカルタミドが含まれるが、これに限定されない。
本明細書で使用する「アンドロゲン受容体」または「AR」という用語は、細胞質内にある男性ホルモンであるテストステロンまたはジヒドロテストステロンに結合し、核に移動する核受容体を含む。ARは、とりわけ、標的遺伝子のプロモーターにあるアンドロゲン応答エレメント（ARE）に結合することによって標的遺伝子の転写を調整する。
本明細書で使用する「ARバリアント」という用語は完全長ARのスプライスバリアントを含む。様々なARバリアントが公知である。Guo et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69（6）:2305-13を参照されたい。例示的なARバリアントには、機能的なリガンド結合ドメイン（LBD）が無いバリアントが含まれるが、これに限定されない。LBDが無いARバリアントの一例はAR-V7である。「AR-V7」は、機能的なリガンド結合ドメイン（LBD）が無い、構成的に活性化されているARバリアントであるアンドロゲン受容体スプライスバリアント7を含む。例えば、Hu et al., Cancer Research 69（1）: 16-22 （2009）を参照されたい。
「個体」、「対象」、または「患者」という用語は典型的にはヒトを含むが、他の動物、例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなども含む。
「薬学的に許容される」または「治療的に許容される」とは、活性成分の有効性または生物学的活性を妨害せず、かつ使用される量で宿主に無毒な物質を含み、宿主は、物質を投与しようとするヒトでもよく動物でもよい。
III．組成物
a．AR-V7阻害剤
本発明はAR-V7阻害剤に関する。本発明の一局面では、驚いたことに、AR-V7阻害によって、ドセタキセル、抗アンドロゲン薬（例えば、ビカルタミド、エンザルタミド、およびアルビラテロン）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される前立腺癌薬剤に対して薬剤耐性前立腺癌細胞を再度感受性にできることが発見された。本発明の別の局面では、驚いたことに、AR-V7阻害によって、ドセタキセル、抗アンドロゲン薬（例えば、ビカルタミド、エンザルタミド、およびアルビラテロン）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される前立腺癌薬剤の有効性を向上できることが発見された。本発明のさらに別の局面では、AR-V7阻害剤はAKR1C3阻害剤と組み合わせて投与することができる。
AR-V7阻害剤には、AR-V7の転写、翻訳、安定性、または活性を阻害する化合物が含まれるが、これに限定されない。AR-V7活性の阻害はアンドロゲン応答エレメント（ARE）へのAR-V7の動員の阻害を含んでもよい。一部の態様において、AR-V7活性の阻害はPSAプロモーターへのAR-V7の動員の阻害を含んでもよい。一部の態様において、AR-V7活性の阻害はPSAプロモーターのAR-V7誘導性活性化の阻害を含んでもよい。一部の態様において、AR-V7活性の阻害はAR-V7誘導性PSA産生の阻害を含んでもよい。例えば、AR-V7の阻害はDHTの非存在下でのPSA産生の阻害を含んでもよい。
本発明はまた、AR-V7阻害剤、ならびにエンザルタミド（Xtandi）、アビラテロン（Zytiga）、ドセタキセル（Taxotere）、ビカルタミド（Casodex、Cosudex、Calutide、Kalumid）、インドメタシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む組成物に関する。
例示的なAR-V7阻害剤には核酸ベースの阻害剤が含まれるが、これに限定されない。AR-V7のこのような核酸ベースの阻害剤には、AR-V7 mRNAを標的とするショートヘアピンRNA（shRNA）または低分子干渉RNA（siRNA）が含まれ得るが、これに限定されない。一部の態様において、核酸類似体を利用して、AR-V7の転写、スプライシング、または翻訳を標的化することができる。このような核酸類似体には、アンチセンスホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド、ロックド核酸、またはペプチド核酸が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、例示的なAR-V7阻害剤には、LY294002、Wortmanin、およびAKT阻害剤IIが含まれるが、これに限定されない。例えば、Mediwala et al., Prostate, 2013 Feb 15;73（3）:267-77を参照されたい。
1200を超えるFDAにより認可された低分子薬物を、ARバリアント、例えば、AR-V7に対する潜在的な阻害活性についてアッセイした。驚いたことに、ニクロサミドは、AR-V7タンパク質発現をタンパク質分解によって、およびプロテアソーム依存的経路によって用量依存的および時間依存的に有意にダウンレギュレートした。従って、AR-V7阻害剤はニクロサミドを含んでもよい。
従って、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを投与して、ARバリアント活性、例えば、AR-V7転写活性を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、PSAプロモーターへのARバリアント、例えば、AR-V7の動員を低減するための組成物および方法も提供する。本発明はまた、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを投与して、ARバリアントシグナル伝達を標的化することによって前立腺癌細胞増殖を阻害するための、または前立腺癌細胞死を誘導するための組成物および方法も提供する。
本発明はまた、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを投与して、前立腺癌細胞における薬剤耐性、例えば、エンザルタミド耐性、ビカルタミド耐性、またはアビラテロン耐性を克服することによって前立腺癌細胞増殖を阻害するための、または前立腺癌細胞死を誘導するための組成物および方法も提供する。さらに、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを単独で、または前立腺癌療法、例えば抗アンドロゲン療法、エンザルタミドベースの療法、ビカルタミドベースの療法、アビラテロンベースの療法、ドセタキセルベースの療法、インドメタシンベースの療法、もしくはそれらの組み合わせとの組み合わせで含む組成物を提供する。
本発明はまた、進行期前立腺癌、例えば、薬剤耐性前立腺癌、転移性前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、またはそれらの組み合わせを有する患者に合わせられた、このような組成物も提供する。さらに、本発明は、公知の前立腺癌治療剤、例えば、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、またはドセタキセルに対して耐性の前立腺癌を有する患者に合わせられた、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、インドメタシン、またはそれらの組み合わせと組み合わせて用いられた時に前立腺癌細胞に対して予想外の相乗効果または相加効果を提供する、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを含有する組成物を提供する。
さらに、本発明は、プロテアソーム依存的経路を介したタンパク質分解によってAR-V7タンパク質発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本明細書に示したアッセイに基づいて、ARバリアント、例えば、AR-V7は、前立腺癌細胞においてエンザルタミド耐性およびアビラテロン耐性を誘導することが観察された。さらに、本明細書に示したAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを含む組成物ならびに方法は、AR活性、例えば、AR-V7転写活性を阻害するのに適している。本明細書に示したAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを含む組成物ならびに方法は、前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターへのARバリアント、例えば、AR-V7の動員を低減するのに適している。本明細書に示した組成物および方法は、例えば、AR-V7を阻害することによって、エンザルタミド耐性前立腺癌もしくはアビラテロン耐性前立腺癌またはそれらの組み合わせを治療するのに適している。
一部の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、ならびにエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、インドメタシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む組成物を提供する。
上述の態様の一部において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドの量は、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびインドメタシンからなる群より選択される化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量である。ある特定の態様において、前記化合物はエンザルタミドである。他のある特定の態様において、前記化合物はアビラテロンである。他のある特定の態様において、前記化合物はドセタキセルである。他のある特定の態様において、前記化合物はビカルタミドである。他のある特定の態様において、前記化合物はインドメタシンである。
本明細書に記載の組成物の一部において、前記組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドとエンザルタミドの両方を含む。本明細書に記載の一部の他の組成物において、前記組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、アビラテロンを含む。本明細書に記載の一部の組成物において、前記組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、ドセタキセルを含む。本明細書に記載のさらに他の組成物において、前記組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、ビカルタミドを含む。本明細書に記載のさらに他の組成物において、前記組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンの両方を含む。
AR-V7阻害剤であるニクロサミドが本明細書において説明される。ニクロサミドは、ヒト条虫に有効な、米食品医薬品局（FDA）によって認可された薬剤である。ニクロサミドの化学構造を以下に示した。
Figure 0006548641
ニクロサミドの化学名は、（5-クロロ-N-2クロロ-4-ニトロ-フェニル）-2-ヒドロキシベンズアミドである。
本明細書で使用する「ニクロサミド」という用語は、投与された対象においてニクロサミドまたはその類似体もしくは誘導体に変換されるプロドラッグを含むニクロサミドの類似体および誘導体を含む。例えば、Ulrike Sack et al., J. Natl. Cancer Inst., Jul 6;103（13）: 1018-36 （2011）;および国際特許公開番号WO2012/143377を参照されたい。例示的なニクロサミド類似体には、Sack et al., 2011に記載の化合物50643-F/1;69360-X/1;82020-KD2;111338-C/1;164315-M/2;および306664-O/1が含まれるが、これに限定されない。「ニクロサミド」という用語はまた、ニクロサミドの塩、例えば、薬学的に許容される塩も含む。ニクロサミドの塩には、ニクロサミドエタノールアミン塩、ニクロサミドメタノール溶媒和化合物、およびニクロサミド水和物が含まれ得るが、これに限定されない。「ニクロサミド」という用語はまた、ナノ粒子に入れられたニクロサミド製剤、例えば、Ye et al., Drug Dev. Ind. Pharm., Sep 10:1-9 （2014）に記載のナノ粒子に入れられたニクロサミド製剤も含む。
b．アルド・ケト還元酵素1C3（AKR1C3）阻害剤
本発明はまた、弱いアンドロゲン前駆体である4-アンドロステン-3,17-ジオン（Δ4-AD）から強力なアンドロゲンであるテストステロンへの変換および弱いアンドロゲン前駆体である5α-アンドロスタン-3,17-ジオンから強力なアンドロゲンである5α-ジヒドロテストステロン（DHT）への変換を触媒する酵素であるアルド・ケト還元酵素1C3（AKR1C3）の阻害剤を含有する組成物に関する。本明細書に記載のように、AKR1C3活性化は、前立腺癌細胞に対して一般的に用いられる治療的処置に対する耐性を付与することができる。例えば、AKR1C3活性化はビカルタミド、エンザルタミド、またはアビラテロンに対する耐性を付与することができる。従って、AKR1C3転写、翻訳、タンパク質安定性、または酵素活性の阻害剤は前立腺癌細胞における薬剤耐性を軽減するか、逆転させるか、または無くすことができる。
例示的なAKR1C3阻害剤には核酸ベースの阻害剤が含まれるが、これに限定されない。このような核酸ベースのAKR1C3阻害剤には、AKR1C3 mRNAを標的とするショートヘアピンRNA（shRNA）または低分子干渉RNA（siRNA）が含まれるが、これに限定されない。一部の態様では、核酸類似体を利用して、AKR1C3の転写、スプライシング、または翻訳を標的化することができる。このような核酸類似体には、アンチセンスホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド、ロックド核酸、またはペプチド核酸が含まれるが、これに限定されない。
一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンである。インドメタシンは、プロスタグランジン産生を阻害することによって発熱、疼痛、凝り、および腫脹を和らげることができる、米食品医薬品局（FDA）により認可された非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）である。インドメタシンはまたアンドロゲン生合成の阻害剤でもある。一部の態様において、インドメタシンはAKR1C3を阻害する。
インドシンまたはインドメタシン（indometacin）とも知られるインドメタシン（indomethacin）の化学構造を以下に示した。
Figure 0006548641
インドメタシンの化学名は、2-{1-[（4-クロロフェニル）カルボニル]-5-メトキシ-2-メチル-1H-インドール-3-イル}酢酸である。本明細書で使用する「インドメタシン」という用語は、投与された対象においてインドメタシンまたはその類似体もしくは誘導体に変換されるプロドラッグを含むインドメタシンの類似体および誘導体を含む。一部の態様において、インドメタシン誘導体は、Liedtke et al., J Med Chem., 2013 Mar 28;56（6）:2429-46に記載の任意の誘導体を含んでもよい。
さらなる示的なAKR1C3阻害剤には、ASP9521;4-メチル（デ-ジメチルアミン）-テトラサイクリン;バチャリン（baccharin）;スタイロピン（stylopine）;フルフェナム酸;3-（（4'-（トリフルオロメチル）フェニル）アミノ）安息香酸;SN33638;N-（4-クロロベンゾイル）-メラトニン;3-（3,4-ジヒドロイソキノリン-2（1H）-イルスルホニル）安息香酸、3-（4'-（ニトロナフタレン-1-アミノ））安息香酸、およびその塩、類似体、または誘導体が含まれるが、これに限定されない。さらに、例示的なAKR1C3阻害剤には、Khanim et al., Br J Cancer. 2014 Mar 18;110（6）: 1506-16; Liedtke et al., J Med Chem. 2013 Mar 28;56（6）:2429-46; Adeniji et al., Endocr. Rev. 2012, 33, SAT-537; Adeniji et al., J Med Chem. 2012 Mar 8;55（5）:2311-23; Adeniji et al., Bioorg Med Chem Lett. 2011 Mar 1;21（5）:1464-8; Chen et al., Bioorg Med Chem Lett. 2012 May 15;22（10）:3492-7; Endo et al., J Nat Prod. 2012 Apr 27;75（4）:716-21; Jamieson et al., J Med Chem. 2012 Sep 13;55（17）:7746-58; Sinreih et al., Bioorg Med Chem Lett. 2012 Sep 15;22（18）:5948-51; Brozic et al., J Med Chem. 2012 Sep 13;55（17）:7417-24; Bauman et al., Mol Pharmacol. 2005 Jan;67（1）:60-8; Yin et al. Front Oncol （2014） 4: 159; Skarydova et al., J Steroid Biochem Mol Biol. 2014 Sep;143:250-8;および国際特許出願公開WO2013/142390に記載の任意のAKR1C3阻害剤化合物が含まれ得るが、これに限定されない。
本発明はまた、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンまたはその誘導体、ならびにエンザルタミド（Xtandi）、アビラテロン（Zytiga）、ドセタキセル（Taxotere）、ビカルタミド（Casodex、Cosudex、Calutide、Kalumid）、ニクロサミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む組成物に関する。
本発明はまた、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与して、前立腺癌細胞増殖を阻害するための、または前立腺癌細胞死を誘導するための組成物および方法も提供する。本発明はまた、インドメタシンを投与して、前立腺癌細胞におけるビカルタミド耐性、エンザルタミド耐性、もしくはアビラテロン耐性を克服するか、または軽減することによって前立腺癌細胞増殖を阻害するための組成物および方法も提供する。さらに、本発明は、インドメタシンのみの組成物、またはインドメタシンと現行の抗アンドロゲン療法を組み合わせた組成物を提供する。本発明はまた、進行期前立腺癌、例えば、薬剤耐性前立腺癌、転移性前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、またはそれらの組み合わせを有する患者に合わせられた、このような組成物も提供する。さらに、本発明は、公知の前立腺癌治療剤、例えば、エンザルタミド、アビラテロン、またはドセタキセルに対して耐性の前立腺癌を有する患者に合わせられた、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、エンザルタミド、ビカルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ニクロサミド、またはそれらの組み合わせと併用した時に、前立腺癌細胞に対して予想外の相乗効果または相加効果を提供する、AK1RC3阻害剤、例えば、インドメタシンを含有する組成物を提供する。一部の態様において、本発明は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、ならびにエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、ニクロサミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含む組成物を提供する。
上述の態様の一部において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンの量は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、ニクロサミド、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物の治療上の利点を向上させるのに有効な量である。ある特定の態様において、前記化合物はエンザルタミドである。他のある特定の態様において、前記化合物はアビラテロンである。他のある特定の態様において、前記化合物はドセタキセルである。他のある特定の態様において、前記化合物はビカルタミドである。他のある特定の態様において、前記化合物はニクロサミドである。
本明細書に記載の組成物の一部において、前記組成物は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとエンザルタミドの両方を含む。本明細書に記載の一部の他の組成物において、前記組成物は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとアビラテロンの両方を含む。本明細書に記載の一部の組成物において、前記組成物は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとドセタキセルの両方を含む。本明細書に記載のさらに他の組成物において、前記組成物は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとビカルタミドの両方を含む。本明細書に記載のさらに他の組成物において、前記組成物は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドの両方を含む。
本明細書に記載の組成物のいずれにおいても、前記組成物は薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。
IV．薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、薬学的に許容される担体および/または賦形剤もしくは希釈剤を混合することによって作られた組成物を包含する。このような組成物は動物またはヒトにおける薬学的な使用に適している。
本発明の薬学的組成物はまた、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと、薬学的に許容される担体および/または賦形剤もしくは希釈剤を混合することによって作られた組成物も包含する。このような組成物は動物またはヒトにおける薬学的な使用に適している。
本発明の薬学的組成物は薬学分野において周知の任意の方法によって調製することができる。本発明と使用するのに適した薬学的に許容される担体には、リン酸緩衝食塩水溶液、水、およびエマルジョン（例えば、油/水エマルジョンまたは水/油エマルジョン）、ならびに様々なタイプの湿潤剤および/または補助剤を含む、任意の標準的な薬学的な担体、緩衝液、および賦形剤が含まれる。適切な薬学的な担体およびその製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co., Easton, 19th ed. 1995）に記載されている。好ましい薬学的な担体は活性薬剤の意図された投与方法によって決まる。
本発明の薬学的組成物は、活性成分として薬剤、例えば、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、AKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）、もしくはAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）、またはその任意の薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体および/または賦形剤もしくは希釈剤を含んでもよい。一部の態様において、前記薬学的組成物は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを含んでもよい。薬学的組成物は任意で他の治療成分を含有してもよい。
本発明の化合物は、従来の調剤法に従って、適切な薬学的な担体および/または賦形剤とよく混合した活性成分として組み合わされてもよい。本明細書において開示された化合物と使用するために、投与に望ましい調製物の形に適した任意の担体および/または賦形剤が意図される。
前記組成物には、局部投与、非経口投与、肺投与、経鼻投与、直腸投与、または経口投与に適した組成物が含まれる。任意の特定の場合における最も適切な投与経路は一つには前立腺癌状態の内容および重篤度によって決まり、任意で、前立腺癌のステージによっても決まる。
他の好ましい組成物には、全身（経腸または非経口）投与に適した組成物が含まれる。全身投与には、経口投与、直腸投与、舌下投与、または唇下（sublabial）投与が含まれる。一部の態様において、前記組成物は注射器を介して投与されてもよく、静脈内投与されてもよい。
肺投与用の組成物には、本明細書に記載の化合物またはその塩の粉末と適切な担体および/または潤滑剤の粉末からなるドライパウダー組成物が含まれるが、これに限定されない。肺投与用の組成物は、当業者に公知の任意の適切なドライパウダー吸入器装置から吸入することができる。
全身投与用の組成物には、本明細書に示した組成物と適切な担体および/または賦形剤の粉末からなるドライパウダー組成物が含まれるが、これに限定されない。全身投与用の組成物は、錠剤、カプセル、丸剤、シロップ、溶液、および懸濁液によって表されてもよいが、これに限定されない。
一部の態様において、本発明は、薬学的界面活性剤をさらに含む組成物を提供する。他の態様において、本発明は、凍結防御物質をさらに含む組成物を提供する。一部の態様において、凍結防御物質は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、グルタミン酸ナトリウム、PVP、HPβCD、CD、グリセロール、マルトース、マンニトール、およびサッカロースからなる群より選択される。
一部の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。一部の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと、薬学的に許容される賦形剤を組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。これらの態様の一部において、薬学的に許容される賦形剤は塩または希釈剤を含む。
一部の態様において、本発明は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを含む組成物を提供する。一部の態様において、前記組成物は経口投与用または静脈内投与用に処方され、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと、水溶液および緩衝溶液からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーを含む。一部の態様において、前記組成物は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンの両方を含んでもよい。
本発明において使用するための薬学的組成物または医用薬剤は、標準的な技法によって、1種類または複数種の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて処方することができる。適切な薬学的な担体は、本明細書およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins （2005）に記載されている。
本発明の組成物の徐放非経口製剤は、移植片、油性注射剤、または粒子システムとして作ることができる。送達系の広範囲の概観については、参照により本明細書に組み入れられる、Banga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, （1995）を参照されたい。粒子システムには、マイクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が含まれる。
本発明の組成物のイオン制御放出のためにポリマーを使用することができる。制御された薬物送達において使用するための様々な分解性ポリマーマトリックスおよび非分解性ポリマーマトリックスが当技術分野において公知である（Langer R., Accounts Chem. Res., 26:537-542（1993））。例えば、低温では粘性があるが流動性があり、体温では半固体ゲルを形成する液体としてブロック共重合体ポラキサマー（polaxamer）407が存在する。これは、組換えインターロイキン2およびウレアーゼの処方および持続送達に有効なビヒクルであることが示されている（Johnston et al., Pharm. Res., 9:425-434 （1992）; およびPec et al., J. Parent. Sci. Tech., 44（2）:58 65 （1990））。代替として、タンパク質を徐放するためのマイクロキャリアとしてヒドロキシアパタイトが用いられてきた（Ijntema et al., Int. J. Pharm., 112:215-224 （1994））。さらに別の局面では、脂質に入れられた薬物を徐放ならびに薬物標的化するためにリポソームが用いられる（Betageri et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA （1993））。治療用タンパク質を制御送達するための非常に多くのさらなるシステムが公知である。例えば、米国特許第5,055,303号、同第5,188,837号、同第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、同第4,957,735号、ならびに同第5,019,369号、同第5,055,303号、同第5,514,670号、同第5,413,797号、同第5,268,164号、同第5,004,697号、同第4,902,505号、同第5,506,206号、同第5,271,961号、同第5,254,342号および同第5,534,496号を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
V.前立腺癌を治療する方法
一部の態様において、本発明は、患者において前立腺癌（例えば、進行期前立腺癌）を治療する方法を提供し、本方法は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、またはそれらの組み合わせを患者に投与する工程を含む。これらの態様の一部において、前立腺癌は、進行期前立腺癌、例えば、本明細書において開示された進行期前立腺癌のタイプのいずれか1つまたは複数である。これらの態様の一部において、前立腺癌は薬剤耐性である。これらの態様の一部において、前立腺癌は抗アンドロゲン薬剤耐性である。これらの態様の一部において、前立腺癌は転移性である。これらの態様の一部において、前立腺癌は転移性かつ薬剤耐性（例えば、抗アンドロゲン薬剤耐性）である。これらの態様の一部において、前立腺癌は去勢抵抗性である。これらの態様の一部において、前立腺癌は転移性かつ去勢抵抗性である。これらの態様の一部において、前立腺癌はエンザルタミド耐性である。これらの態様の一部において、前立腺癌はエンザルタミド耐性でありアルビラテロン耐性である。これらの態様の一部において、前立腺癌はエンザルタミド耐性、アルビラテロン耐性、およびビカルタミド耐性である。これらの態様の一部において、前立腺癌はドセタキセル耐性である。これらの態様の一部において、前立腺癌はエンザルタミド耐性、アルビラテロン耐性、ビカルタミド耐性、およびドセタキセル耐性である。
一部の態様において、治療は、前立腺癌細胞増殖を阻害する工程、前立腺癌細胞遊走を阻害する工程、前立腺癌細胞浸潤を阻害する工程、前立腺癌の症状を寛解させる工程、前立腺癌腫瘍のサイズを小さくする工程、前立腺癌腫瘍の数を少なくする工程、前立腺癌細胞の数を少なくする工程、前立腺癌細胞の壊死、ピロトーシス、オンコーシス（oncosis）、アポトーシス、オートファジー、もしくは他の細胞死を誘導する工程、またはエンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療効果を向上させる工程を含む。
本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌細胞増殖を阻害する工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌細胞遊走を阻害する工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌細胞浸潤を阻害する工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌の症状を寛解させる工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌腫瘍のサイズを小さくする工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌腫瘍の数を少なくする工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌細胞の数を少なくする工程を含む。本明細書に記載の前立腺癌を治療する一部の方法において、治療は、前立腺癌細胞の壊死、ピロトーシス、オンコーシス、アポトーシス、オートファジー、または他の細胞死を誘導する工程を含む。
本明細書に記載の前立腺癌を治療する特定の方法において、治療は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療効果を向上させる工程を含む。ある特定の態様において、治療は、エンザルタミドの治療効果を向上させる工程を含む。他のある特定の態様において、治療は、アビラテロンの治療効果を向上させる工程を含む。さらに他の態様において、治療は、ドセタキセルの治療効果を向上させる工程を含む。他の一部の態様において、治療は、ビカルタミドの治療効果を向上させる工程を含む。向上は相乗的でもよく、相加的でもよい。
本明細書に示した方法のある特定の態様において、治療は、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させる工程または抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する工程を含む。本明細書に示した方法のある特定の態様において、治療は、抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物である。ある特定の態様において、抗アンドロゲン薬はエンザルタミドである。
上述の方法のいずれにおいても、治療は、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させる工程、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する工程、またはエンザルタミドに対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含んでもよい。一部の態様において、治療は、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させる工程を含む。他の一部の態様において、治療は、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する工程を含む。本発明のさらに他の態様において、治療は、エンザルタミドに対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。
本明細書に示した一部の態様において、治療は、ドセタキセルに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させる工程を含む。他の一部の態様において、治療は、ドセタキセルに対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する工程を含む。さらに他の態様において、治療は、ドセタキセルに対して前立腺癌細胞を再度感受性にすせる工程を含む。
本明細書に示した一部の態様において、治療は、アビラテロンに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させる工程を含む。本明細書に示した他の一部の態様において、治療は、アビラテロンに対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する工程を含む。本明細書に示したさらに他の態様において、治療は、アビラテロンに対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程を含む。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性またはAKR1C3誘導性薬剤耐性前立腺癌、AR-V7誘導性またはAKR1C3誘導性抗アンドロゲン薬剤耐性前立腺癌、AR-V7誘導性またはAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本発明の一部の態様において、前立腺癌は去勢抵抗性前立腺癌である。他の態様において、前立腺癌は転移性去勢抵抗性前立腺癌である。さらに他の態様において、前立腺癌は進行期前立腺癌である。他の態様において、前立腺癌は抗アンドロゲン耐性前立腺癌である。他の一部の態様において、前立腺癌はエンザルタミド耐性前立腺癌である。さらに他の態様において、前立腺癌はアビラテロン耐性前立腺癌である。他の一部の態様において、前立腺癌はドセタキセル耐性前立腺癌である。他のある特定の態様において、前立腺癌はAR-V7誘導性またはAKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌である。一部の態様において、前立腺癌は、前述のタイプの前立腺癌の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれより多い前立腺癌の組み合わせである。
前立腺癌を治療する方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与する工程を含んでもよい。前立腺癌を治療する方法は、さらに、もしくはまたは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、ニクロサミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と同時投与する工程を含んでもよい。
本発明の一部の態様は、エンザルタミド耐性およびアビラテロン耐性の前立腺癌を治療するための方法を提供し、本方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、またはそれらの組み合わせを、エンザルタミド耐性またはアビラテロン耐性の前立腺癌を有する患者に投与する工程を含む。
VI．前立腺癌細胞を阻害する方法
一部の態様において、本発明は、細胞においてアンドロゲン受容体スプライスバリアントを阻害するための方法を提供し、本方法は、前記細胞またはアンドロゲン受容体スプライスバリアントを、ある量のARバリアント阻害剤、例えば、ニクロサミドと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記バリアントはAR-V7スプライスバリアントである。ある特定の態様において、前記量は有効量である。ある特定の態様において、前記細胞は、前立腺癌細胞、例えば、去勢抵抗性前立腺癌細胞、抗アンドロゲン耐性（例えば、エンザルタミド耐性）前立腺癌細胞、またはそれらの組み合わせである。
一部の態様において、本発明は、細胞またはSTAT3を、ある量のAR-V7阻害剤と接触させる工程を含む、細胞においてSTAT3活性化を阻害するための方法を提供する。一部の態様において、前記量は有効量である。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドまたはその類似体もしくは誘導体である。ある特定の態様において、前記細胞は、前立腺癌細胞、例えば、去勢抵抗性前立腺癌細胞、抗アンドロゲン耐性（例えば、エンザルタミド耐性）前立腺癌細胞、またはそれらの組み合わせである。
一部の態様において、本発明は、細胞またはSTAT3を、ある量のAR-V7阻害剤と接触させる工程を含む、細胞においてIL-6シグナル伝達を阻害するための方法を提供する。一部の態様において、前記量は有効量である。一部の態様において、AR-V7阻害剤はニクロサミドまたはその類似体もしくは誘導体である。ある特定の態様において、前記細胞は、前立腺癌細胞、例えば、去勢抵抗性前立腺癌細胞、抗アンドロゲン耐性（例えば、エンザルタミド耐性）前立腺癌細胞、またはそれらの組み合わせである。
一部の態様において、本発明は、細胞またはAKR1C3を、ある量のAKR1C3阻害剤と接触させる工程を含む、細胞においてAKR1C3を阻害するための方法を提供する。一部の態様において、前記量は有効量である。一部の態様において、AKR1C3阻害剤はインドメタシンまたはその類似体もしくは誘導体である。ある特定の態様において、前記細胞は、前立腺癌細胞、例えば、去勢抵抗性前立腺癌細胞、抗アンドロゲン耐性（例えば、エンザルタミド耐性）前立腺癌細胞、またはそれらの組み合わせである。
一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、ならびに任意で、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミドからなる群より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞増殖を阻害するための方法を提供する。
他の一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、ならびに任意で、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミドからなる群より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞遊走を阻害するための方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシン、ならびに任意で、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミドからなる群より選択される1種類または複数種の化合物と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞浸潤を阻害するための方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるための方法を提供する。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるための方法を提供する。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む、エンザルタミドおよびアビラテロンに対する前立腺癌細胞二重耐性を逆転させるための方法を提供する。一部の態様において、本発明は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む、エンザルタミドおよびアビラテロンに対する前立腺癌細胞二重耐性を逆転させるための方法を提供する。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、本発明は、抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、エンザルタミドに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、本発明は、エンザルタミドに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、アビラテロンに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、本発明は、アビラテロンに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするのための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、エンザルタミドおよびアビラテロンに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、本発明は、エンザルチミドおよびアビラテロンに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、ビカルタミドに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、本発明は、ビカルタミドに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、ドセタキセルに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、本発明は、ドセタキセルに対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。ある特定の態様において、前記量は有効量である。
一部の態様において、本発明は、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減するための方法、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるための方法、または抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含むる。一部の態様において、本発明は、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減するための方法、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるための方法、または抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にするための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。
上述の方法のいずれにおいても、抗アンドロゲン薬は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物でよい。
本明細書に示した一部の態様において、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を軽減する工程、抗アンドロゲン薬に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させる工程、または抗アンドロゲン薬に対して前立腺癌細胞を再度感受性にする工程は、前立腺癌を有する患者において行われる。
一部の態様において、本発明はまた、前立腺癌を有する患者において抗アンドロゲン薬の治療効果を向上させるための方法を提供し、本方法は、抗アンドロゲン薬を必要とする患者に有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与する工程を含む。一部の態様において、本発明はまた、前立腺癌を有する患者において抗アンドロゲン薬の治療効果を向上させるための方法も提供し、本方法は、抗アンドロゲン薬を必要とする患者に有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与する工程を含む。
他の一部の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者においてエンザルタミドの治療効果を向上させるための方法を提供し、本方法は、有効量のエンザルタミドをAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のエンザルタミドを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて、患者に同時投与する工程を含む。
さらに他の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者においてドセタキセルの治療効果を向上させるための方法を提供し、本方法は、有効量のドセタキセルを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のドセタキセルを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。
ある特定の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者においてアビラテロンの治療効果を向上させる方法を提供し、本方法は、有効量のアビラテロンを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のアビラテロンを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。
ある特定の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者においてビカルタミドの治療効果を向上させるための方法を提供し、本方法は、有効量のビカルタミドを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のビカルタミドを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。
ある特定の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者においてAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドの治療効果を向上させるための方法を提供し、本方法は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと組み合わせて、患者に同時投与する工程を含む。ある特定の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドの治療効果を向上させる方法を提供し、本方法は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミド、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤と組み合わせて、患者に同時投与する工程を含む。
ある特定の態様において、本発明は、前立腺癌を有する患者において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンの治療効果を向上させるための方法を提供し、本方法は、有効量のAKR1C3阻害剤を、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミド、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤と組み合わせて患者に同時投与する工程を含む。
他の態様において、本発明は、アンドロゲン受容体（AR）バリアントを阻害するための方法を提供し、本方法は、ARバリアントを、ある量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと接触させる工程を含む。これらの態様の一部において、ARバリアントはAR-V7である。
他のある特定の態様において、本発明は、ARトランス活性化を阻害するための方法、AR発現を阻害するための方法、AR細胞遊走を阻害するための方法、前立腺癌細胞におけるAR細胞浸潤を阻害するための方法、前立腺癌細胞コロニー形成を阻害するための方法、および前立腺特異的抗原（PSA）プロモーターへのARバリアントの動員を阻害するための方法を提供する。ある特定の場合では、前記阻害方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、ならびに任意で、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミドからなる群より選択される1つまたは複数の化合物と接触させる工程を含む。
本発明はまた、AR完全長およびAR-V7の発現を阻害するための方法を提供し、本方法は、ARまたは前腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと接触させる工程を含む。さらに、本発明は、AR完全長およびAR-V7の発現を阻害するための方法も提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと接触させる工程を含む。
他のある特定の態様において、本発明は、エンザルタミド/アビラテロン耐性CRPC細胞の増殖、遊走、または浸潤を阻害するための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞を、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、前記方法は、前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと接触させる工程を含む。一部の態様において、前立腺癌細胞はCRPC細胞である。
他の一部の態様において、本発明は、前立腺癌を治療するためのエンザルタミド/アビラテロンの効果を相乗的に向上させる方法を提供し、本方法は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを、前立腺癌を有する患者に投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、およびAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを、前立腺癌を有する患者に投与する工程を含む。
本発明はまた、PSAプロモーターへのARの動員を阻害するための方法も提供し、本方法は、ARを、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと接触させる工程を含む。
AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを投与するある特定の方法では、AR-V7阻害剤は単独で経口投与されるか、またはエンザルタミド、アビラテロン、AKR1C3阻害剤、もしくはそれらの組み合わせと組み合わせて経口投与される。AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与するある特定の方法では、AKR1C3阻害剤は単独で経口投与されるか、またはエンザルタミド、アビラテロン、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、もしくはそれらの組み合わせと組み合わせて経口投与される。AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与するある特定の方法では、AKR1C3阻害剤はAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと組み合わせて経口投与される。
本発明はまた、前立腺癌細胞における抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、エンザルタミド、またはアビラテロン）効果を相乗的または相加的に向上させるための方法を提供し、本方法は、前立腺癌細胞をAR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと、ならびに任意で1種類または複数種の抗アンドロゲン薬、例えばビカルタミド、エンザルタミド、またはアビラテロンとも接触させる工程を含む。これらの方法の一部において、前立腺癌細胞は、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびビカルタミドからなる群より選択される1種類または複数種の化合物に対して耐性がある。一部の態様において、前記化合物はエンザルタミドである。他の態様において、前記化合物はアビラテロンである。他の一部の態様において、前記化合物はドセタキセルである。さらに他の態様において、前記化合物はビカルタミドである。
一部の態様において、本発明はまた、STAT3を、AR-V7阻害剤（例えばニクロサミド）と接触させる工程を含む、STAT3を阻害するための方法も提供する。
ある特定の態様において、本発明はまた、STAT3をAR-V7阻害剤（例えばニクロサミド）と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞におけるSTAT3によって媒介されるエンザルタミド耐性を逆転させるための方法も提供する。
他のある特定の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）を、前立腺癌を有する患者に投与する工程を含む、STAT3を阻害するための方法を提供する。さらに他の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）を、（例えば、エンザルタミド耐性の）前立腺癌を有する患者に投与する工程を含む、STAT3を阻害するための方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）と接触させる工程を含む、STAT3を阻害するため方法を提供する。ある特定の態様において、接触させる工程は、前立腺癌細胞内で、前立腺癌細胞上で、または前立腺癌細胞の近くで行われる。一部の態様において、前記方法は、STAT3を、AR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）およびエンザルタミドと接触させる工程を含む。
他の一部の態様において、本発明は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞増殖を阻害するための方法を提供する。ある特定の態様において、接触させる工程は、前立腺癌細胞内で、前立腺癌細胞上で、または前立腺癌細胞の近くで行われる。一部の態様において、前記方法は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）およびエンザルタミドと接触させる工程を含む。
一部の態様において、本発明は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法を提供する。ある特定の態様において、接触させる工程は、前立腺癌細胞内で、前立腺癌細胞上で、または前立腺癌細胞の近くで行われる。一部の態様において、前記方法は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド） エンザルタミドと接触させる工程およびエンザルタミドを含む。
一部の態様において、本発明は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）と接触させる工程を含む、前立腺癌細胞のコロニー形成を阻害するための方法を提供する。ある特定の態様において、接触させる工程は、前立腺癌細胞内で、前立腺癌細胞上で、または前立腺癌細胞の近くで行われる。一部の態様において、前記方法は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）およびエンザルタミドと接触させる工程を含む。
一部の態様において、本発明は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）と接触させる工程を含む、STAT3発現を阻害することでエンザルタミド耐性を逆転させるための方法を提供する。ある特定の態様において、接触させる工程は、前立腺癌細胞内で、前立腺癌細胞上で、または前立腺癌細胞の近くで行われる。一部の態様において、前記方法は、STAT3をAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）およびエンザルタミドと接触させる工程を含む。
VII．投与
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、前立腺癌を有する患者に投与される。
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、エンザルタミドと組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、アビラテロンと組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、エンザルタミドおよびアビラテロンの両方と組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、ドセタキセルと組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、エンザルタミドおよびドセタキセルの両方と組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドは、アビラテロンおよびドセタキセルの両方と組み合わせて投与される。
本明細書に示した、前立腺癌を治療するある特定の方法において、前記方法は、最初に、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、前立腺癌を有する患者に投与する工程、次いで、エンザルタミドを患者に投与する工程を含む。本明細書に示した、前立腺癌を治療するある特定の方法において、前記方法は、最初に、エンザルタミドを、前立腺癌を有する患者に投与する工程、次いで、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを患者に投与する工程を含む。
本発明の一部の態様において、前記投与方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを単独で、またはエンザルタミドと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明の他の一部の態様において、前記投与方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを単独で、またはアビラテロンと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明のさらに他の態様において、前記方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを単独で、またはドセタキセルと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明のさらに他の態様において、前記方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを単独で、またはビカルタミドと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。
一部の態様において、本発明は、有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、前立腺癌を有する患者に送達する方法を提供する。
本発明のAR-V7阻害剤（例えば、ニクロサミド）製剤は薬学的組成物または医用薬剤の製造において有用である。薬学的組成物または医用薬剤は、これらを必要とする対象、例えば、前立腺癌を有する患者に投与することができる。
上述の態様のいずれかにおいても、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば、抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌など）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AR-V7誘導性抗アンドロゲン耐性前立腺癌、例えば、AR-V7誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンは前立腺癌を有する患者に投与される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはエンザルタミドと組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはアビラテロンと組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはエンザルタミドおよびアビラテロンの両方と組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはドセタキセルと組み合わせて投与される。一部の他の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはエンザルタミドおよびドセタキセルの両方と組み合わせて投与される。
本発明の一部の態様において、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンはアビラテロンおよびドセタキセルの両方と組み合わせて投与される。
本明細書に示した前立腺癌を治療するある特定の方法において、前記方法は、最初に、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを、前立腺癌を有する患者に投与する工程、次いで、エンザルタミドを患者に投与する工程を含む。本明細書に示した、前立腺癌を治療するある特定の方法において、前記方法は、最初に、エンザルタミドを、前立腺癌を有する患者に投与する工程、次いで、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを患者に投与する工程を含む。
本発明の一部の態様において、前記投与方法は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを単独で、またはエンザルタミドと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明の他の一部の態様において、前記投与方法は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを単独で、またはアビラテロンと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明のさらに他の態様において、前記方法は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを単独で、またはドセタキセルと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。本発明のさらに他の態様において、前記方法は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを単独で、またはビカルタミドと組み合わせて、これらを必要とする患者に投与する工程を含む。
一部の態様において、本発明は、有効量のAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを、前立腺癌を有する患者に送達する方法を提供する。
本発明のAKR1C3阻害剤（例えば、インドメタシン）製剤は薬学的組成物または医用薬剤の製造において有用である。薬学的組成物または医用薬剤は、これらを必要とする対象、例えば、前立腺癌を有する患者に投与することができる。
上述の態様のいずれにおいても、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、例えば、抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌など）、ドセタキセル耐性前立腺癌、AKR1C3誘導性抗アンドロゲン耐性前立腺癌、例えば、AKR1C3誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本発明において使用するための薬学的組成物または医用薬剤は、標準的な技法によって、1種類または複数種の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて処方することができる。適切な薬学的な担体は、本明細書およびE.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。本発明の化合物および薬剤ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和化合物は、吸入、局所、経鼻、経口、静脈内、非経口、または直腸を介した投与を含む任意の適切な経路による投与に合わせて処方することができる。
a．投与経路
局部投与用の代表的な製剤には、クリーム、軟膏、噴霧剤、ローション剤、およびパッチが含まれる。しかしながら、前記薬学的組成物は、任意のタイプの投与、例えば、注射器または他の装置を用いた皮内注射、真皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、鼻腔内注射、脳内注射、気管内注射、動脈内注射、腹腔内注射、膀胱内注射、胸膜内注射、冠内注射、または腫瘍内注射に合わせて処方することができる。吸入による投与のための製剤（例えば、エアロゾル）または経口投与もしくは直腸投与のための製剤も意図される。
経皮適用に適した製剤は、任意で担体と共に有効量の1種類または複数種の本明細書に記載の化合物を含む。好ましい担体には、宿主の皮膚を通り抜けるのを助けるために吸収性の薬理学的に許容される溶媒が含まれる。例えば、経皮装置は、裏打ち部材、化合物と任意で担体を含有するリザーバー、任意で、長期間にわたって、制御された、かつ予め決められた速度で化合物を宿主の皮膚に送達するための速度制御バリア、および装置を皮膚に固定するための手段を備える包帯の形をとる。マトリックス経皮製剤も用いられることがある。
経口投与の場合、薬学的組成物または医用薬剤は、例えば、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形をとってもよい。本発明は、（a）希釈剤もしくは増量剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（例えば、エチルセルロース、結晶セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレート、および/もしくはリン酸一水素カルシウム、硫酸カルシウム、（b）潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、マグネシウム塩もしくはカルシウム塩、金属ステアリン酸塩、コロイド状二酸化ケイ素、硬化植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および/もしくはポリエチレングリコール;錠剤の場合は、（c）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、デンプンのり、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、および/もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース;所望であれば（d）崩壊剤、例えば、デンプン（例えば、バレイショデンプンもしくはナトリウムデンプン）、グリコレート、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または沸騰性混合物;（e）湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびに/あるいは（f）吸収剤、着色剤、着香剤、および甘味剤と一緒に、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンおよび/またはAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを単独で、あるいは他の化合物、例えば、抗アンドロゲン薬および/もしくはドセタキセルまたはこれらの薬剤の乾燥固形粉末と組み合わせて含む、錠剤およびゼラチンカプセルを提供する。
錠剤は、当技術分野において公知の方法に従ってフィルムコーティングされてもよく、腸溶コーティングされてもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形をとってもよく、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提示されてもよい。このような液体調製物は、従来の手段によって、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂;乳化剤、例えば、レシチンまたはアラビアゴム;非水性ビヒクル、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留した（fractionated）植物油;および防腐剤、例えば、安息香酸メチルもしくはp-ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸を用いて調製することができる。調製物はまた、適宜、緩衝塩、着香剤、着色剤、および/または甘味剤も含有してもよい。所望であれば、経口投与用の調製物は、活性化合物を徐放するように適切に処方することができる。
本明細書に示した組成物および製剤は、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与に合わせて処方することができる。注射用製剤は、添加防腐剤と一緒に、単位剤形で、例えば、アンプルまたはマルチドーズ容器の中に入れられて提示されてもよい。注射用組成物は、好ましくは、等張の水溶液または水性懸濁液であり、坐剤は、好ましくは、脂肪エマルジョンまたは脂肪懸濁液から調製される。前記組成物は滅菌されてもよく、および/または補助剤、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、もしくは乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧を調節するための塩、および/または緩衝液を含有してもよい。代替として、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末の形をしてもよい。さらに、活性成分は、他の治療上価値のある物質も含有してもよい。前記組成物は、それぞれ、従来の混合方法、造粒方法、またはコーティング方法に従って調製され、約0.1〜75％、好ましくは約1〜50％の活性成分を含有する。
吸入による投与の場合、本発明の組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体を用いて、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で都合よく送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量送達するように弁を設けることによって決めることができる。化合物および適切な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有する、吸入器または注入器において使用するためのカプセルおよびカートリッジ、例えば、ゼラチンカプセルおよびゼラチンカートリッジを処方することができる。
本明細書に示した組成物はまた、直腸用組成物、例えば、坐剤または停留浣腸、例えば、従来の坐剤基剤、例えば、カカオ脂または他のグリセリドを含有する直腸用組成物の形で処方することもできる。
さらに、前記活性成分はデポー調製物として処方することができる。このような長時間作用製剤は移植によって（例えば、皮下もしくは筋肉内に）投与されてもよく、筋肉内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、本明細書に記載の化合物の1つまたは複数は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油に溶解したエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体、例えば、やや溶けにくい塩として処方することができる。
特定の態様において、本発明の薬学的組成物または医用薬剤は、（i）有効量のAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、（ii）任意で、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含んでもよい。特定の態様において、本発明の薬学的組成物または医用薬剤は、さらに、もしくはまたは、（i）有効量のAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと、（ii）任意で、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を含んでもよい。前記治療剤は、個々に、連続して、または1種類もしくは複数種の他のこのような治療剤（例えば、第1の治療剤、第2の治療剤、本発明の化合物など）と組み合わせて用いられてもよい。投与は同じ投与経路または異なる投与経路によるものでもよく、同じ薬学的製剤に一緒に入れられてもよい。
b．投与量
薬学的組成物または医用薬剤は、本明細書に記載のように前立腺癌を予防するために、前立腺癌を治療するために、前立腺癌を再度感受性にするために、または前立腺癌を管理するために治療に有効な用量で対象に投与することができる。前記薬学的組成物または医用薬剤は、対象において有効な治療応答を誘発するのに十分な量で対象に投与される。
投与されるの活性薬剤の投与量は、対象の体重、年齢、個々の状態、治療しようとする部分の表面積または容積、および投与形式によって決まる。用量のサイズはまた、特定の対象における特定の製剤の投与に伴う任意の副作用の存在、内容、および程度でも決定される。約50〜約70kgの哺乳動物への経口投与用の単位投与量は、約5〜約500mg、約25〜200mg、約100〜約1000mg、約200〜約2000mg、約500〜約5000mg、または約1000〜約2000mgの活性成分を含有してもよい。約50〜約70kgの哺乳動物への経口投与用の単位投与量は、約10mg、20mg、25mg、50mg、75mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1,000mg、1,250mg、1,500mg、2,000mg、2,500mg、3,000mg、またはこれより多い活性成分を含有してもよい。典型的に、本発明の活性化合物の投与量は、望ましい効果を実現するのに十分な投与量である。最適な投与計画は、対象の体内における活性薬剤蓄積の測定値から計算することができる。一般的に、投与量は、一日に、一週間に、または一ヶ月に一回またはそれより多く与えられてもよい。当業者は、最適な投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。
本発明の組成物の最適な投与量、毒性、および治療効力は、投与される組成物の相対効力に応じて変化することがあり、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、LD50（集団の50％が死に至る用量）およびED50（集団の50％において治療効果を示す用量）を求めることによって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、比LD50/ED50で表すことができる。治療指数が高い薬剤が好ましい。毒性副作用を示す薬剤を使用することができるが、正常細胞に対する潜在的な損傷を最小源にし、それによって副作用を低減するために、このような薬剤を患部組織部位に標的化する送達系を設計するように注意しなければならない。
最適な投与計画は、対象の体内における活性薬剤蓄積の測定値から計算することができる。一般的に、投与量は、体重1kgあたり約1ng〜約1,000mgであり、一日に、一週間に、一ヶ月に、または一年に一回またはそれより多く与えられてもよい。当業者は、最適な投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。当業者は、当技術分野において公知の確立したプロトコールおよび本明細書における開示に従って、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミド、またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンをヒトに投与するための最適な用量を決定することができるだろう。
例えば、動物試験（例えば、げっ歯類およびサル）から得られたデータを用いて、ヒトにおいて使用するための投与量範囲を示すことができる。本発明の化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたは毒性がないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変化することがある。本発明の方法において使用するための任意の組成物について、最初に細胞培養アッセイから、治療に有効な用量を見積もることができる。動物モデルにおいて、細胞培養において求められたIC50（症状の最大半量まで阻害する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲に達するように用量を処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に求めることができる。血漿中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって測定することができる。一般的に、キメラタンパク質、好ましくは、組成物の用量に相当するものは、典型的な対象の場合、約1ng/kg〜約100mg/kgである。一部の態様において、ラットにおける5mg/kgニクロサミドの単回経口用量は1.08μmol/mLの最大血漿中濃度を生じることができる。
経口投与または静脈内投与のための本発明の代表的な組成物は、患者一人あたり一日あたり約0.1〜約10mg;患者一人あたり一日あたり約1〜約100mg;患者一人あたり一日あたり約25〜約200mg;患者一人あたり一日あたり約50〜約500mg;患者一人あたり一日あたり約100〜約1000mg;または患者一人あたり一日あたり約1000〜約2000mgの活性成分でもよい。例示的な投与量には、患者一人あたり一日あたり約10mg、20mg、25mg、50mg、75mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1,000mg、1,250mg、1,500mg、2,000mg、2,500mg、3,000mg、またはそれより多い活性成分が含まれるが、これに限定されない。投与可能な組成物を調製するための方法が公知であり、当業者に明らかであり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins （2005）などの刊行物において、さらに詳細に説明される。
本明細書に記載の組成物の例示的な用量は、対象または試料の重さ1キログラムあたりの組成物の量ミリグラムまたはマイクログラム（例えば、1キログラムあたり約1マイクログラム〜1キログラムあたり約500ミリグラム、1キログラムあたり約100マイクログラム〜1キログラムあたり約5ミリグラム、または1キログラムあたり約1マイクログラム〜1キログラムあたり約50マイクログラム）を含む。さらに、組成物の適切な用量は、実現しようとする望ましい効果に関する組成物の効力によって決まることが理解される。これらの組成物の1つまたは複数が哺乳動物に投与される時、医師、獣医師、または研究者は最初に比較的少ない用量を処方し、その後に、適切な応答が得られるまで用量を増やしてもよい。さらに、任意の特定の哺乳動物対象の特定の用量レベルは、使用される特定の組成物の活性、年齢、体重、身体全体の健康、性別、および対象の食事、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬剤の組み合わせ、ならびに調整しようとする発現または活性の程度を含む様々な要因によって決まることが理解される。
一部の態様において、本発明の薬学的組成物または医用薬剤は、例えば、約1mgの化合物/対象体重kg（1mg/kg）〜約1g/kgの範囲の一日量で投与される。別の態様において、用量は約5mg/kg〜約500mg/kgの範囲の用量である。さらに別の態様において、用量は約10mg/kg〜約250mg/kgである。別の態様において、用量は約25mg/kg〜約150mg/kgである。好ましい用量は、約2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、18mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、または50mg/kgである。一日量は1日1回投与されてもよく、サブドーズ（subdose）に分割され、複数回の投与で、例えば、1日2回、1日3回、または1日4回投与されてもよい。しかしながら、当業者により理解されるように、本明細書に記載の組成物は異なる量および異なる回数で投与されてもよい。当業者はまた、疾患もしくは悪性状態の重篤度、以前の治療、身体全体の健康、および/または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これに限定されない、ある特定の要因が、対象を有効に治療するのに必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があることも理解するだろう。さらに、治療的有効量の組成物による対象の治療は、1回の治療を含んでもよく、または好ましくは一連の治療を含んでもよい。
望ましい治療効果を実現するために、本明細書に記載の化合物または薬剤は、治療に有効な一日量で何日もわたって投与されてもよい。従って、対象における前立腺癌を治療するための治療に有効な化合物投与は、3日〜2週間またはそれより長い期間にわたって続く定期的な（例えば、毎日の）投与を必要としてもよい。本明細書に示した組成物は、少なくとも3日連続して、多くの場合で少なくとも5日連続して、もっと多くの場合で少なくとも10日連続して、時として20日、30日、40日、またはそれより長く連続して投与されてもよい。連続した毎日の投与が、治療に有効な用量を実現するのに好ましい経路であるが、対象において薬剤が毎日投与されなくても、治療に有効な薬剤濃度を維持するのに十分な頻度で投与が繰り返される限り、治療に有益な効果を実現することができる。例えば、薬剤は1日おきに、2日おきに投与されてもよく、さらに多い用量範囲が用いられ、対象に許容されるのであれば、週1回で投与されてもよい。
一部の態様において、AR-V7阻害剤であるニクロサミドが経口投与される。一部の態様において、ニクロサミドは、一日あたり約100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1,000mg、1,250mg、1,500mg、1,750mg、2,000mg、2,500mg、3,000mg、3,500mg、4,000mg、4,500mg、5,000mg、またはそれより多い一日量のニクロサミドで対象（例えば、成人ヒト）に経口投与される。一部の態様において、ニクロサミドは一日あたり1,000〜2,000mgの一日量で対象（例えば、成人ヒト）に経口投与される。一部の態様において、AKR1C3阻害剤であるインドメタシンが経口投与される。一部の態様において、インドメタシンは、一日あたり約10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、またはそれより多い一日量のインドメタシンで対象（例えば、成人ヒト）に経口投与される。一部の態様において、インドメタシンは一日あたり25〜200mgの一日量で対象（例えば、成人ヒト）に経口投与される。一部の態様において、インドメタシンおよびニクロサミドは経口的に同時投与される。例えば、一日あたり25〜200mgの一日経口用量のインドメタシンと、一日あたり1000〜2000mgの一日経口用量のニクロサミドを同時投与することができる。
一部の態様において、前記方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドの後に、エンザルタミド（enzalutiade）、アビラテロン、ビカルタミド、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物を連続して投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物の後に、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを連続して投与する工程を含む。
他の態様において、前記方法は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物と組み合わせてを投与する工程を含む。これらの態様の一部において、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン（aberiterarone）、またはドセタキセルの量は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドが患者に投与されない場合に投与される、前立腺癌を有する患者に投与されるビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、またはドセタキセルの量より少ない。
一部の態様において、前記方法は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンの後に、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物を連続して投与する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物の後に、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを連続して投与する工程を含む。
他の態様において、前記方法は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、およびドセタキセルからなる群より選択される化合物と組み合わせて投与する工程を含む。これらの態様の一部において、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、またはドセタキセルの量は、AKR1C3阻害剤が患者に投与されない場合に投与される、前立腺癌を有する患者に投与されるビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、またはドセタキセルの量より少ない。
本発明の一部の態様において、薬学的組成物または医用薬剤は、前立腺癌を予防するために、前立腺癌を治療するために、または前立腺癌を管理するために治療に有効な用量で対象に投与される。前記薬学的組成物または医用薬剤は、患者において有効な治療応答または診断応答を誘発するのに十分な量で患者に投与される。有効な治療応答または診断応答は、前立腺癌の症状または合併症を、少なくとも部分的に止めるかまたは遅らせる応答である。これを実現するのに十分な量が「治療に有効な用量」と定義される。
治療が成功した後に、前立腺癌の再発を予防するために対象に維持療法を受けせることが望ましい場合がある。
有効量の決定は、特に、本明細書において提供される詳細な開示を考慮すれば、当業者の能力の十分に範囲内にある。一般的に、組成物の効果を示す量または有効な量は、最初に、低用量または少量の組成物を投与し、次いで、投与される用量または投与量を徐々に増やし、最小限の毒性副作用で、または毒性副作用なく、治療されている対象において望ましい効果が観察されるまで、必要に応じて第2の薬物療法または第3の薬物療法を加えることによって決定される。
患者に必要とされ、かつ許容される投与量および頻度に応じて、単回投与または複数回投与の組成物が投与される。いかなる事象においても、前記組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量の本発明の組成物を提供しなければならない。一般的に、用量は、容認できない毒性を患者に生じることなく疾患の症状または徴候を治療するか、または寛解させるのに十分な用量である。
VIII．キット、容器、装置、およびシステム
本発明に従って、多種多様なキット、システム、および組成物を、キットおよびシステムの意図された使用者ならびに使用者の特定のニーズに応じて調製することができる。一部の態様において、本発明は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を備えるキットを提供する。ある特定の態様において、前記キットは、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドとエンザルタミドを備える。他のある特定の態様において、前記キットは、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドとアビラテロンを備える。他の態様において、前記キットは、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、ドセタキセルを備える。他の一部の態様において、前記キットは、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、ビカルタミドを備える。他の一部の態様において、前記キットは、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドと、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを備える。
一部の態様において、本発明は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンと、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物を備えるキットを提供する。ある特定の態様において、前記キットは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとエンザルタミドを備える。他のある特定の態様において、前記キットは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとアビラテロンを備える。他の態様において、前記キットは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとドセタキセルを備える。他の一部の態様において、前記キットは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとビカルタミドを備える。他の態様において、前記キットは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンとAR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを備える。
本明細書に記載のキットの一部は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを投与する方法について説明しているラベルを備える。例えば、前記ラベルは、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドの経口投与について説明してもよい。本明細書に記載のキットの一部は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを投与する方法について説明しているラベルを備える。例えば、前記ラベルは、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンの経口投与について説明してもよい。本明細書に記載のキットの一部は、前立腺癌、例えば、去勢抵抗性前立腺癌または抗アンドロゲン耐性前立腺癌を予防する、治療する、または管理する方法について説明しているラベルを備える。
AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドを含む組成物またはAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンを含む組成物を含むが、これに限定されない本発明の組成物は、所望であれば、活性成分を含有する1つまたは複数の投与量を供給し得る、米食品医薬品局（FDA）または他の規制機関によって認可された瓶、ジャー、バイアル、アンプル、チューブ、または他の容器密閉システムの形で提示されてもよい。包装容器またはディスペンサーには、薬の製造、使用、もしくは販売を規制する政府機関により定められた形をした容器に関連する掲示、その機関による認可を示した掲示が付随してもよい。ある特定の局面において、前記キットは、本明細書において開示された製剤または組成物、製剤を含む容器密閉システムまたは製剤を含む投与単位剤形、および本明細書において開示された使用方法が記載されている掲示または説明書を備えてもよい。
一部の態様において、前記キットは、製剤（例えば、乾燥成分および液体成分）または組成物の様々な要素を保持するために区画化された容器、製剤または組成物を作るための説明書、ならびに前立腺癌、例えば、去勢抵抗性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、またはそれらの組み合わせを予防する、治療する、または管理するための説明書を備える。ある特定の態様において、前記キットは、脱水された形または乾燥した形をとる製剤と、これを再水和（または再構成）および投与するための説明書を備えてもよい。
例えば、経口投与、直腸投与、経皮投与、または注射投与（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、もしくは皮下注射の場合）における活性組成物の単位用量を備えるキットが提供される。このようなキットには、単位用量を含有する容器に加えて、前立腺癌、例えば、去勢抵抗性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、またはそれらの組み合わせの予防、治療、または管理における組成物の使用とそれに伴う利益が記載されている、情報を提供する添付文書がある。適切な活性組成物および単位用量は、本明細書において説明された活性組成物および単位用量である。
本発明の一部の態様は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドが、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と一緒に入れられた包装容器を含む。本発明の一部の態様は、AKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンが、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と一緒に入れられた包装容器を含む。本発明の一部の態様は、AR-V7阻害剤、例えばニクロサミドとAKR1C3阻害剤、例えばインドメタシンが、ビカルタミド、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と一緒に入れられた包装容器を含む。
本発明の各要素が複数の態様を含んでいると本明細書において説明されたが、特に定めのない限り、本発明のある特定の要素の態様はそれぞれ、本発明の他の要素のそれぞれの態様と共に使用することができ、このような使用はそれぞれ、本発明の別個の態様を形成することが意図されると理解しなければならない。
IX．実施例
本発明は特定の実施例によって、さらに詳細に説明される。以下の実施例は例示目的で提供され、どのようなやり方でも本発明を限定することを目的としない。当業者は、本質的に同じ結果を出すように変更または修正することができる様々な重要でないパラメータを容易に理解するだろう。
実施例1．前立腺癌細胞におけるAR-V7活性、エンザルタミド耐性、ならびに前立腺癌細胞を治療するための組成物および方法
a．序論
LBDが欠失すると前立腺癌細胞のAR構成的活性化が起こる。図1Aに示したように、様々な細胞株においてAR-V7 mRNAの発現が検出された。CWR22rv1細胞およびVCaP細胞は、LNCaP細胞およびC4-2細胞より有意に多いAR-V7を発現した。CWR22rv1細胞のAR-V7発現レベルはLNCaP細胞およびC4-2細胞の25倍であったのに対して、VCaP細胞は比較すると15倍の増加を示した。この結果は、図1Bに示したようにウエスタンブロットでも確かめられた。図1Bでは、CWR22rv1細胞およびVCaP細胞は、LNCaP細胞およびC4-2細胞より高いARバリアントタンパク質発現レベル、特にAR-V7タンパク質発現レベルを発現した。AR-V7は前立腺癌細胞において構成的に活性化されていることが示されている。これらの結果を確認するために、EGFP-AR-V7を一過的にトランスフェクトすることによってC4-2細胞に導入した。図1Cに示したように、48時間後、AR-V7はC4-2細胞の核にしか発現していなかった。このことから、古典的NLS（核位置配列（nuclear location sequence））が無いAR-V7は、現在のところ分かっていない機構によって、核に依然として移動できることが示唆される。次に、変異AR（T877A）を発現する、ARが無いPC3細胞株およびLNCaP細胞においてAR-V7転写活性が確かめられた。図1DおよびEに示したように、AR-V7はPC3細胞およびLNCaP細胞において構成的に活性化され、アンドロゲンによって妨げることができない。前立腺癌細胞におけるAR-V7機能をさらに理解するために、図1Fに示したように、AR-V7を安定にトランスフェクトすることによってC4-2細胞に導入した。C4-2 AR-V7安定クローンはC4-2 neo細胞と比較して有意に多いAR-V7 mRNAを発現した。さらに、AR-V7はC4-2細胞においてPSA mRNAおよびPSAタンパク質の発現を機能的に増加させた（図1GおよびH）。まとめると、これらのデータから、AR-V7は前立腺癌細胞において構成的に活性化されていることが確かめられた。
b．試薬および方法
i．一般的な細胞培養
細胞は全て5％二酸化炭素の加湿インキュベーターに入れて37℃で維持された。LNCaP細胞、C4-2細胞、C4-2B細胞、CWR22rv1細胞、DU145細胞、および293細胞は、10％胎仔ウシ血清（FBS）、100単位/mlペニシリン、および0.1mg/mlストレプトマイシンを加えたRPMI1640中で維持された。VCaP細胞は、10％胎仔ウシ血清（FBS）、100単位/mlペニシリン、および0.1mg/mlストレプトマイシンを加えたDMEM中で維持された。C4-2-neo細胞およびC4-2 AR-V7細胞は、pcDNA3.1またはAR-V7を含有するプラスミドで安定にトランスフェクトされ、300μg/mL G418 RPMI1640培地中で維持された。293-AR-V7-PSA-E/P-LUC細胞は、AR-V7プラスミドおよびPSA-E/P-LUCレポータープラスミドで安定にトランスフェクトされ、300μg/mL G418 RPMI1640培地中で維持された。LNCaP-neo（pcDNA3.1対照ベクターを安定に発現するLNCaP細胞）、LNCaP-S17（IL-6を安定に発現するLNCaP細胞）、およびLNCaP-STAT3C細胞（構成的活性化型STAT3を安定に発現するLNCaP細胞）は、Lou W, Ni Z, Dyer K, Tweardy DJ, Gao AC. Interleukin-6 induces prostate cancer cell growth accompanied by activation of stat3 signaling pathway. Prostate 2000;42（3）:239-242およびDeMiguel F, Lee SO, Lou W, Xiao X, Pflug BR, Nelson JB, Gao AC. STAT3 enhances the growth of LNCaP human prostate cancer cells in intact and castrated male nude mice. Prostate 2002;52（2）: 123-129に基づいて調製された。ヒト 組換え IL-6はR&D Systems （Minneapolis, MN）から入手した。
C4-2B細胞をFBS中で漸増濃度のエンザルタミド（5μM〜40μM）と12ヶ月間にわたってインキュベートし、さらなる分析のために保管した。耐性細胞を単離し、C4-2B MR（すなわち、C4-2Bエンザルタミド耐性）と呼んだ。エンザルタミド処理細胞と共に適切な対照として親C4-2B細胞を継代した。C4-2B MR細胞を、20μMエンザルタミドを含有する培地の中で維持した。ニクロサミドはSigmaから購入した。
ii．プラスミドおよび細胞トランスフェクション
低分子干渉RNA（siRNA）トランスフェクションのために、細胞を12ウェルプレートで1x105細胞/ウェルか、または6ウェルプレートで3x105細胞/ウェルの密度で播種し、リポフェクタミン-RNAiMAX（invitrogen）を用いて、ARエキソン7配列
Figure 0006548641
もしくはAR-V7配列
Figure 0006548641
を標的とするsiRNA（Dharmacon）、またはSTAT3を標的とするsiRNA（Cell signaling #6582）でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ（Luc）遺伝子を標的とする対照配列、siControl
Figure 0006548641
もリポフェクタミン-RNAiMAX（invitrogen）を用いてトランスフェクトした。細胞をAttractene（QIAGEN）を用いて、示された発現プラスミド、例えばAR-V7またはEGFP-AR-V7で、一過的にトランスフェクトした。
iii．クロマチン免疫沈降アッセイ
本明細書において述べたようにC4-2 neo細胞およびC4-2 AR-V7細胞を処理した。1％ホルムアルデヒドを添加することによって、細胞内でDNA-ARタンパク質複合体を架橋した。全細胞抽出物を超音波処理によって調製し、回転させながらAR特異的抗体（Santa Cruz Biotechnologyから入手したAR-441）と4℃で一晩インキュベートすることによって、架橋DNA-タンパク質複合体のアリコートを免疫沈降させた。回転させながらプロテインA/Gアガロースビーズと4℃で1時間インキュベートすることによって、クロマチン-抗体複合体を溶液から単離した。結合したDNA-タンパク質複合体を洗浄し、溶出緩衝液（1％SDSおよび0.1mol/L NaHCO3）を用いてビーズから溶出させ、架橋を逆転させ、DNAを抽出した。結果として生じたクロマチン調製物を、PSAプロモーターの基部エンハンサーAREまたは末端エンハンサーAREにわたるプライマーを用いてPCRによって分析した。アイソタイプが一致するIgGを対照として使用した。
iv．ウエスタンブロット分析
全細胞タンパク質抽出物をSDS-PAGEで分離し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。5％乳を含むPBS/0.1％Tween-20に入れて室温で1時間ブロッキングした後に、膜を、示された一次抗体[例えば、AR（441, sc-7305、マウスモノクローナル抗体、1:1000希釈、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）；AR-V7（AG10008、マウスモノクローナル抗体、1:1000希釈、高精度抗体）；チューブリン（T5168、モノクローナル抗α-チューブリン抗体、1:5000希釈、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）]と4℃で一晩インキュベートした。チューブリンを用いて、適用された試料の量をモニタリングした。二次抗体インキュベーション後に、免疫反応性タンパク質を、高感度化学ルミネセンス検出システム（enhanced chemiluminescence detection system）（Millipore, Billerica, MA）を用いて視覚化した。
v．ルシフェラーゼアッセイ
LNCaP細胞、C4-2細胞、または293細胞を、例えば、図に示したように、FBS条件またはCS-FBS条件で、pGL3-PSA6.0-Luc、pGL3-AREI/II-LucレポーターとAR-V7でトランスフェクトした。細胞溶解産物を、Luciferase Assay System （Promega）を用いるルシフェラーゼアッセイに供した。
vi．細胞増殖アッセイ
C4-2 neo細胞、C4-2 AR-V7細胞、CWR22rv1細胞、またはpzHPV7細胞を、1x105細胞/ウェルの密度で、10％FBS含有RPMI1640培地が入っている12ウェルプレートに播種し、0.5μMニクロサミドで48時間処理した。総細胞数を数え、細胞生存率（％）を計算した。細胞生存率（％）＝（処理群の細胞数／対照群の細胞数）ｘ100％。CWR22rv1細胞、C4-2B MR細胞、またはC4-2B AbiR細胞を、0.5x105細胞/ウェルの密度で、10％FBS含有RPMI1640培地が入っている12ウェルプレートに播種し、FBS含有培地中で0.25μMニクロサミドと20μMエンザルタミドまたは20μMアビラテロンで処理した。2日後、4日後、および7日後に総細胞数を数えた。LNCaP-neo細胞、LNCaP-S17細胞、LNCaP-IL6+細胞、またはLNCaP-STAT3C細胞を、1x105細胞/ウェルの密度で、10％FBS含有RPMI1640培地が入っている12ウェルプレートに播種した。示されたように細胞を処理し、総細胞数を数えた。
vii．試験管内腫瘍細胞感受性試験
C4-2 neo細胞、C4-2AR-V7細胞、CWR22rv1細胞、またはC4-2B MR細胞を、10％完全FBS含有培地中で、DMSO、0.5μMまたは1.0μMのニクロサミドで処理した。CWR22rv1細胞またはC4-2B MR細胞を、20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、0.25μMニクロサミドで処理した。細胞を同じ密度で100mmディッシュに14日間平板培養し、培地を7日ごとに交換した。コロニーをPBSでリンスした後に、0.5％クリスタルバイオレット/4％ホルムアルデヒドで30分間染色し、コロニー数を数えた。LNCaP-neo細胞またはLNCaP-S17安定クローン細胞を、10％完全FBS含有培地中で、DMSOまたはエンザルタミドで処理した。細胞を同じ密度（1000個の細胞/ディッシュ）で、100mmディッシュに14日間平板培養した。コロニーをPBSでリンスした後に、0.5％クリスタルバイオレット/4％ホルムアルデヒドで30分間染色し、コロニー数を数えた。
viii．細胞死ELISA
C4-2 neo細胞、C4-2 AR-V7細胞、CWR22rv1細胞、またはpzHPV7細胞を、10％FBSを含有するRPMI1640培地が入っている12ウェルプレート（1x105個の細胞/ウェル）に播種し、DMSOまたは0.5μMニクロサミドで48時間処理した。細胞質画分中のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームを、Cell Death Detection ELISAキット（Roche, カタログ番号11544675001）によって製造業者の説明書に従って測定した。浮遊している細胞および付着した細胞を収集し、400μLのインキュベーション緩衝液中でホモジナイズした。ウェルを抗ヒストン抗体でコーティングし、溶解産物、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗DNA抗体、および基質とインキュベートした。吸光度を405nmで測定した。
ix．リアルタイム定量RT-PCR
TriZOL試薬（Invitrogen）を用いて全RNAを抽出した。RNaseフリーRQ1 DNase（Promega）で消化した後にcDNAを調製した。cDNAを、Sso Fast Eva Green Supermix （Bio-Rad）を用いて製造業者の説明書に従って、またはLiu C, et al. Andrographolide targets androgen receptor pathway in castrate-resistant prostate cancer, Genes Cancer; 2: 151-9に記載のようにリアルタイム逆転写-PCR（RT-PCR）に供した。アクチンを同時増幅することによって各反応を基準化した。3つの同じ試料をBio-Rad CFX-96リアルタイムサイクラーのデフォルト設定で操作した。
x．PSAの測定
培養上清中のPSA濃度を、ELISA（United Biotech, Inc., Mountain View, CA）を用いて製造業者の説明書に従って測定した。
i．IL-6の測定
50μlの細胞培養上清を用いてIL-6分泌レベルを確かめた。LNCaP-neo細胞およびLNCaP-s17細胞によるIL-6分泌を、ELISAによって製造業者のプロトコール （eBioscience, San Diego, CA）に従って確かめた。
xi．統計解析
データを平均±平均の標準偏差（SD）で表した。統計解析をMicrosoft Excel分析ツールを用いて行った。個々の群間の差違を一元配置分散分析（ANOVA）によって分析し、その後に平均を比較するためにシェッフェ法によって分析した。p<0.05は統計的に有意であるとみなした。
c．結果
i.Prestwick Chemical LibraryにおいてAR-V7阻害剤を得るための化合物スクリーニング
Prestwick Chemical Library（登録商標）は、1200種類の低分子（FDA、EMEA、および他の機関）で構成されている。活性化合物を、高い化学的多様性および薬理学的多様性ならびにヒトにおける既知のバイオアベイラビリティおよび安全性について選択した。このアッセイによって、AR-V7活性を標的とすることができるFDAにより認可された薬剤が特定された。ライブラリーの化合物で処理した24時間後に、AR-V7活性を求めるためにルシフェラーゼ活性アッセイを用いて薬物スクリーニングを行った。完全長ARの妨害を回避するために、ARが無い293細胞株を使用した。図8および図12に示したように、293細胞をEGFP-AR-V7プラスミドおよびPSA-E/P-ルシフェラーゼレポータープラスミドで安定にトランスフェクトし、安定クローンをG418によって選択した。293 AR-V7-PSA-luc安定クローンは、293 neo細胞と比較して、多量のAR-V7タンパク質を発現した。CWR22rv1細胞を正の対照として使用した。核移行を蛍光顕微鏡下で調べた。図8Bに示したように、293 AR-V7-PSA-luc安定クローンは核内でAR-V7を高発現した。AR-V7発現はqRT-PCRでも確かめられた。この場合、293 AR-V7-PSA-luc安定クローンは、293 neo細胞と比較して、140倍のAR-V7 mRNAレベルを発現したが、両細胞とも完全長ARを発現しなかった（図8C）。293 AR-V7-PSA-luc安定クローンがPSA-luc活性も安定して発現することを確認するために、異なる細胞数の細胞をCS-FBS条件で平板培養した。2日後に、図8Dに示したようにルシフェラーゼアッセイを行った。293 AR-V7-PSA-luc細胞は構成的なPSAプロモーター活性を有することが示された。このことから、293細胞系において安定細胞が首尾良く構築されたことが示唆される。化合物スクリーニングを行うために、図8Eに示したようにスクリーニングプロトコールを行った。293 AR-V7-PSA-luc安定クローンを、ライブラリーにある各化合物で24時間にわたって処理した後に、96ウェルプレートに播種した。再度、ルシフェラーゼアッセイを行い、細胞増殖を有意に阻害した化合物を、1回目のスクリーニング時に排除した。2回目の後に、再スクリーニングするために毒性の強い化合物をさらに希釈し、この一連の基準から、関心対象の薬剤としてニクロサミドが選択された。
ii．ニクロサミドは前立腺癌細胞増殖を阻害し、細胞アポトーシスを誘導した
前立腺癌細胞に対するニクロサミドの効果を調べるために、図2Aに示したように、C4-2 neo細胞、C4-2 AR-V7細胞、CWR22rv1細胞、およびpz-HPV7細胞をDMSOまたは0.5μMニクロサミドで48時間処理した。0.5μMニクロサミドは前立腺癌細胞の細胞増殖を有意に阻害し、pz-HPV7正常前立腺上皮細胞にほとんど影響を及ぼさなかった。ニクロサミドによる抗癌効果をさらに調べるために、図2Bに示したように細胞死ELISAを行った。0.5μMニクロサミドは前立腺癌細胞の細胞アポトーシスを有意に誘導し、pz-HPV7細胞にほとんど影響を及ぼさなかった。ニクロサミドによって阻害されたクローン形成能力は、調べられた通りであり、図2CおよびDに示した。ニクロサミドは前立腺癌細胞のクローン形成能力を用量依存的に有意に阻害した。このことから、ニクロサミドには前立腺癌療法の候補になる大きな可能性があることが確かめられた。まとめると、前述の結果から、ニクロサミドは前立腺癌細胞の増殖を阻害し、細胞アポトーシスを誘導するのに対して、正常前立腺上皮細胞には最小限の影響しか誘導しなかったことが明らかになった。
図33〜34に示したように、ニクロサミドは前立腺癌細胞のクローン形成能力を用量依存的に有意に阻害した。図37および図38に示したように、ニクロサミドはC42B MR細胞のコロニー形成を有意に阻害する。さらに、ニクロサミドは、エンザルタミドによるC42B MR細胞およびCWR22rv1細胞のコロニー形成の阻害を有意に向上させる。これらの結果から、ニクロサミドは前立腺癌細胞の増殖を阻害し、細胞アポトーシスを誘導し、正常前立腺上皮細胞にほとんど影響を及ぼさなかったことが明らかになった。
前立腺癌細胞におけるAR-V7の細胞増殖機能を調べるために、CWR22rv1細胞を、CS-FBS条件で、ARエキソン7 siRNAまたはAR-V7 siRNAで、一過的にトランスフェクトした。図10に示したように、翌日、細胞数を数えた。完全長ARノックダウンには、CWR22rv1細胞に対して中程度の増殖阻害効果があったのに対して、AR-V7ノックダウンによって細胞増殖は有意に阻害された。ノックダウン効果はウエスタンブロットで確かめられた（図10）。このことから、AR-V7の機能は前立腺癌細胞増殖に重要であり、AR-V7標的化はCRPC患者を治療するための有効な戦略であることが示唆された。
iii．ニクロサミドはタンパク質分解を増強することによってAR-V7タンパク質発現を阻害した。
ニクロサミドがAR-V7発現に影響を及ぼすかどうか確かめるために、多量の内因性AR-V7を発現するCWR22rv1細胞を、異なる濃度のニクロサミドで一晩処理した。全細胞タンパク質を抽出した。図3Aに示したように、ニクロサミドは、AR-V7タンパク質を用量依存的に阻害した。0.5μMニクロサミドは、AR-V7発現を有意に阻害したが、完全長AR（AR FL）発現にほとんど影響を及ぼさなかった。このことから、ニクロサミドは切断型AR阻害に対する効果の方が大きいことが示唆された。ニクロサミドはまた、AR-V7タンパク質発現を時間依存的にも阻害した（図3B）。どのようにニクロサミドがAR-V7タンパク質発現を減少させるのかをさらに明らかにするために、AR-V7発現に対するニクロサミドの効果を転写レベルで確かめた。図3Cに示したように、ニクロサミドは、AR-V7 mRNAレベルにも完全長AR mRNAレベルにも影響を及ぼさなかった。このことから、ニクロサミドは転写レベルでAR-V7発現に影響を及ぼさなかったことが示唆される。次に、AR-V7タンパク質レベルをダウンレギュレートするための潜在的な機構であるシクロヘキシミドでタンパク質新合成をブロックした後に、AR-V7タンパク質分解に対するニクロサミドの効果を調べた。時間0で、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（50μg/mL）を、2μMニクロサミドと共にまたは2μMニクロサミド無しで、添加した。指定された時点で、細胞を採取し、AR-V7タンパク質レベルを、AR-V7に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットによって測定した。図3Dおよび32に示したように、ニクロサミド処理細胞では、AR-V7タンパク質の半減期は対照細胞の8時間から4時間未満に短くなった。同様の結果が、タンパク質安定性の維持において重要な役割を果たしているユビキチン-プロテアソーム系による系統的なタンパク質分解である。ニクロサミドがユビキチン-プロテアソーム系を介してAR-V7タンパク質分解を誘導したかどうかを調べるために、ニクロサミドで処理した細胞に26Sプロテアソーム阻害剤MG132（5μM）を添加した。MG132は、ニクロサミドによるAR-V7タンパク質レベルに対する効果を遅らせることができた（図3E）。このことから、ニクロサミドは、プロテアソーム依存的経路を介してAR-V7分解を誘導したことが示唆される。図32に示したように、ニクロサミドは未処理対照と比較してAR-V7タンパク質分解を増加させた。
iv．ニクロサミドはAR-V7転写活性を阻害し、PSAプロモーターへのAR-V7の動員を低減した
このアッセイでは、前立腺癌細胞においてエンザルタミドがAR-V7転写活性を阻害できず、PSAプロモーターへのAR-V7の動員も低減できないことが確かめられた（図9）。ニクロサミドにAR-V7転写活性に対する効果があるかどうか調べるために、図4Aに示したように、293 AR-V7-PSA-E/P-LUC細胞系を使用した。ニクロサミドはAR-V7転写活性を有意に阻害したのに対して、エンザルタミドは影響を及ぼさなかった。この効果を前立腺癌細胞系に移すことができるかどうかさらに調べるために、図4Bに示したように、DHTと共にまたはDHT無しで、ニクロサミドまたはエンザルタミドで一晩処理した後に、LNCaP細胞をAR-V7で一過的にトランスフェクトした。ニクロサミドおよびエンザルタミドは両方とも、DHT誘導性AR転写活性を劇的に阻害したが、ニクロサミドしかAR-V7転写活性を阻害しなかった。LNCaP細胞と同様に、AR-V7で安定にトランスフェクトされたC4-2細胞におけるAR-V7転写活性は、ニクロサミドによって有意に阻害されたが、エンザルタミドでは阻害されなかった（図4C）。図4Dに示したように、この結果はPSA ELISAでも確かめられた。C4-2 AR-V7細胞をCS-FBS条件で培養し、C4-2 neo細胞より高いPSA濃度を発現することが示された。ニクロサミドは、C4-2 AR-V7細胞においてPSA濃度を有意に阻害した。この現象はウエスタンブロットで確かめられた。ニクロサミドによるAR-V7阻害効果の機構をさらに精査するためにChIPアッセイを行った。C4-2 AR-V7細胞を1μMニクロサミドまたは20μMエンザルタミドで一晩処理した後に、CS-FBS条件で3日間培養した。図4Dに示したように、全細胞溶解をChIPアッセイに供した。ニクロサミドによってPSAプロモーターへのAR-V7の動員が有意に低減されたのに対して、エンザルタミドは影響を及ぼさなかった。まとめると、これらの結果から、ニクロサミドには、タンパク質レベルおよびmRNAレベルの両方で、新たなAR-V7阻害剤になる可能性があることが確かめられた。
これらの結果は、図30に示したようにウエスタンブロットでも確かめられた。ニクロサミドはPSAタンパク質発現を有意に阻害したのに対して、エンザルタミドはほとんど影響を及ぼさなかった。ChIPアッセイを行った。C4-2 AR-V7細胞を、CS-FBS条件で3日間培養した後に、ニクロサミド（0.5μMおよび1μM）または20μMエンザルタミドで一晩処理した。全細胞溶解産物をChIPアッセイに供した。図31に示したように、ニクロサミドはPSAプロモーターへのAR-V7の動員を有意に低減したのに対して、エンザルタミドは影響を及ぼさなかった。これらの結果から、ニクロサミドはAR-V7トランス活性化を阻害できたが、エンザルタミドは阻害できなかったことが証明された。図13に示したように、チャコール除去済（charcoal stripped）血清培地中でC4-2 AR-V7細胞を様々な濃度のニクロサミドと一晩インキュベートした後に、同様の結果が得られた。
LNCap-Stat3C細胞を用いて同様の結果が得られた。図20に示したように、ニクロサミドおよびエンザルタミドを用いた併用処理によってPSAプロモーターへのARの動員が阻害される。
v．長期にわたってエンザルタミドで処理されたC4-2B細胞は、ARバリアントを発現し、ニクロサミドに対して感受性を示す
ARバリアントは、エンザルタミド耐性を誘導するための可能性のある機構の1つであることが示されているが、現在まで、前立腺癌の細胞または患者において、エンザルタミドがARバリアントを誘導するという証拠はほとんどない。この問題に取り組むために、図5Aおよび5Bに示したように、C4-2B細胞をFBS条件でエンザルタミドで長期にわたって処理した。エンザルタミドを含有する培地中で培養して12ヶ月後に、C4-2B MR（C4-2Bエンザルタミド耐性）細胞はC4-2B親細胞より強い耐性を示した。次に、図5Cに示したように、本発明者らは、C4-2B親細胞およびC4-2B MR細胞におけるARバリアントレベルを調べた。C4-2B MR細胞は、AR-V1、AR-V7、AR1/2/2b、およびAR1/2/3/2bを含めて、C4-2B親細胞より多いARバリアントmRNAレベルを発現する。これらの結果は、図5Dに示したようにウエスタンブロットでも確かめられた。C4-2B MR細胞は、C4-2B親細胞と比較して核内で有意に多いAR-V7を発現した。C4-2B MR細胞では完全長ARもアップレギュレートされた。このことから、ARシグナル伝達の過剰発現は重要なエンザルタミド耐性機構であり得ることが示唆された。AR-V7ノックダウンによってC4-2B MR細胞におけるエンザルタミド耐性は有意に逆転した（図5E）。このことから、AR-V7はC4-2B MR細胞におけるエンザルタミド耐性の主な促進要因であることが示唆される。次に、図5Fに示したように、C4-2B MR細胞に対するニクロサミドの効果を調べた。C4-2B MR細胞はエンザルタミドに対して耐性であったが、ニクロサミドによって用量依存的に有意に阻害された。これらの結果は、図5Gに示したように試験管内腫瘍細胞感受性試験でも確かめられた。図5Gでは、0.5μMニクロサミドはC4-2B MR細胞のコロニー形成およびコロニーサイズを有意に阻害した。まとめると、上記のデータから、ARバリアントは重要なエンザルタミド耐性機構である可能性があり、ARシグナル伝達の標的化は、進行性前立腺癌患者を治療するための有効な戦略であることが示唆された。
図35〜図36に示したように、ニクロサミドはC4-2B MR細胞によるコロニー形成を有意に阻害したが、エンザルタミドは阻害しなかった。図35〜図36に示したように、ニクロサミドはC4-2B MR細胞のコロニーサイズを有意に阻害したが、エンザルタミドは阻害しなかった。図21に示したように、ニクロサミドとエンザルタミドの併用処理によって、C4-2B細胞、C4-2B MR細胞、CB-2B TAXR細胞、およびC4-2B TAXR-MR細胞における細胞増殖が有意に阻害される。図22に示したように、ニクロサミドは、C4-2B細胞およびC4-2B MR細胞の増殖または生存率に対するエンザルタミドの効果を向上させる。図23に示したように、ニクロサミドは、C4-2B細胞およびC4-2B AbiR細胞の増殖または生存率に対するアルビラテロンの効果を向上させる。
vi．ニクロサミドはAR-V7阻害を介してエンザルタミドおよびアビラテロンの効果を向上させる
ARバリアントはCWR22rv1細胞においてエンザルタミド耐性を誘導することが示されている。このアッセイでは、完全長ARではなくAR-V7がCWR22rv1細胞の細胞増殖を支配し、CWR22rv1細胞は、アビラテロン処理されたLNCaP細胞およびC4-2B細胞より耐性が強いことが確かめられた（図11）。AR-V7がCWR22rv1細胞においてアビラテロン耐性も誘導するかどうか確かめるために、図11Bに示したように、10μMアビラテロンで48時間処理した後に、AR-V7特異的siRNAまたはARエキソン7 siRNAを一過的にトランスフェクトすることによって、CWR22rv1細胞に導入した。AR-V7ノックダウンによって、アビラテロンに対してCWR22rv1細胞は有意に再度感受性となった。このことから、AR-V7は前立腺癌細胞においてアビラテロン耐性も誘導する可能性があることが示唆される。AR-V7阻害剤であることがスクリーニングされたニクロサミドが、前立腺癌細胞においてエンザルタミド耐性またはアビラテロン耐性を逆転できるかどうか調べるために、図6Aおよび6Bに示したように、CWR22rv1細胞を、エンザルタミドとアビラテロンの組み合わせと共にまたはエンザルタミドとアビラテロンの組み合わせ無しで、ニクロサミドで48時間処理した。単剤処理にはCWR22rv1細胞に対して中等度の効果があったのに対して、併用処理によって細胞増殖は時間依存的に有意に阻害された。図14に示したように、CWR22rv1細胞を、ビカルタミドと共にまたはビカルタミド無しで、ニクロサミドで処理した後に同様の結果が得られた。エンザルタミド耐性細胞株およびアビラテロン耐性細胞株における効果も試験した。単剤処理と比較して、ニクロサミドとエンザルタミドまたはニクロサミドとアビラテロンとの併用療法によって、C4-2B MR細胞またはC4-2B AbiR細胞の増殖は有意に阻害された（図6Cおよび図6D）。阻害効果は試験管内腫瘍細胞感受性試験でも確かめられた（図6E）。AR-V7が前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性機構およびアビラテロン耐性機構として機能するので、図7Aおよび15に示したように、ニクロサミドおよびエンザルタミドで処理したCWR22rv1細胞におけるAR-V7レベルを調べた。ニクロサミドによる単剤処理によってAR-V7発現が低減したが、エンザルタミドまたはアビラテロンと組み合わせた時に阻害効果は有意に向上した。このことから、AR-V7発現の阻害はエンザルタミド耐性またはアビラテロン耐性に対する直接的な療法戦略である可能性があることが示唆される。これらの結果はC4-2B MR細胞でも確かめられた（図7B）。要約すると、これらの結果から、新規のAR-V7阻害剤であるニクロサミドは、進行性前立腺癌患者向けの、特に、エンザルタミドまたはアビラテロンに対して耐性の進行性前立腺癌患者向けの、強力な薬剤である可能性があることが示唆された。
vii．STAT3の阻害およびエンザルタミド耐性の逆転
エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の感受性を、細胞増殖アッセイおよび試験管内腫瘍細胞感受性試験を用いて試験した。IL-6、c-Myc、サバイビン、およびARの発現レベルを検出するために、定量逆転写-PCR、ELISA、およびウェスタンブロッティングを行った。STAT3に特異的なsiRNAを用いてSTAT3発現をダウンレギュレートした。PSAプロモーターへのARの動員を調べるためにChIPアッセイを行った。
これらの結果から、オートクラインIL-6を発現する前立腺癌細胞はエンザルタミド耐性であり、オートクラインIL-6は、STAT3およびその標的遺伝子の構成的活性化につながることが証明された。STAT3のダウンレギュレーションによって、エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の感受性は増加した。前立腺癌細胞における構成的活性化型STAT3の過剰発現によってエンザルタミド処理に対する耐性が誘導された。構成的活性化型STAT3はまた、エンザルタミドによって妨害できなかったPSAプロモーターへのARの動員も増強した。STAT3阻害剤であるニクロサミドは前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性を逆転させたのに対して、エンザルタミドとニクロサミドによる併用処理は細胞増殖を有意に阻害し、細胞アポトーシスを誘導し、コロニー形成を阻害した。オートクラインIL-6経路は、STAT3の構成的活性化を介して前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性を誘導する。
前立腺癌細胞におけるオートクラインIL-6は、エンザルタミドに対する耐性を誘導することが本明細書において観察された。
viii．STAT3の阻害およびエンザルタミド耐性の逆転
示されたようにLNCaP-neo細胞、LNCaP-s17細胞、またはLNCaP-STAT3C細胞を処理した。1％ホルムアルデヒドを添加することによって、細胞内でDNA-ARタンパク質複合体を架橋した。全細胞抽出物を超音波処理によって調製し、回転させながらAR特異的抗体（AR-C19; Santa Cruz Biotechnology）と4℃で一晩インキュベートすることによって、架橋DNA-タンパク質複合体のアリコートを免疫沈降させた。回転させながらプロテインA/Gアガロースビーズと4℃で1時間インキュベートすることによって、クロマチン-抗体複合体を溶液から単離した。結合したDNA-タンパク質複合体を洗浄し、溶出緩衝液（1％SDSおよび0.1mol/L NaHCO3）を用いてビーズから溶出させ、架橋を逆転させ、DNAを抽出した。結果として生じたクロマチン調製物を、PSAプロモーターの基部エンハンサーAREまたは末端エンハンサーAREにわたるプライマーを用いてPCRによって分析した。アイソタイプが一致するIgGを対照として使用した。
IL-6の過剰発現によって、エンザルタミドに対するLNCaP細胞の耐性が増加する。LNCaP（LNCaP-s17）細胞におけるIL-6のオートクライン発現が細胞増殖を促進し、ビカルタミド処理に対する耐性を増加させることが観察された。このアッセイでは、IL-6発現がエンザルタミドに対する前立腺癌細胞の応答に影響を及ぼすかどうかを試験した。LNCaP-s17細胞を漸増用量のエンザルタミドで処理し、細胞数を数えた。図26A〜Cに示したように、LNCaP-neo細胞は、LNCaPs17細胞と比較して、エンザルタミド処理に対して高感受性であった。濃度が5μMのエンザルタミドはLNCaP-neo細胞の増殖を30％超低減したのに対して、LNCaP-s17細胞の増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。さらに高濃度のエンザルタミド（40μM）でもLNCaP-s17細胞の増殖は約30％しか低減せず、これに対して、LNCaP-neo細胞はほぼ60％低減した。
試験管内腫瘍細胞感受性試験を行った。LNCaP-neo細胞およびLNCaP-s17細胞を20μMエンザルタミドで処理し、クローン形成能力を確かめた。図26A〜Cに示したように、コロニー形成能力は、20μMエンザルタミドで処理したLNCaP-neo細胞において有意に阻害されたのに対して、LNCaP-s17細胞は増殖とコロニー形成を続けた。
エンザルタミド耐性に関与するIL-6の過剰発現が確かめられた。IL-6を含有する培地中でLNCaP細胞を長期培養することによって、IL-6を発現するLNCaP細胞であるLNCaP-IL6+細胞を、完全FBS含有培地中で、10μMおよび20μMエンザルタミドで48時間処理した。図26Dに示したように、エンザルタミドはLNCaP細胞の増殖を有意に阻害した。対照的に、エンザルタミドは、LNCaP-IL6+細胞の増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。まとめると、これらのデータから、前立腺癌細胞におけるIL-6過剰発現は、エンザルタミド耐性に関連することが分かる。
オートクラインIL-6は、STAT3経路を構成的に活性化し、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体トランス活性化を増強する。他の報告から、構成的STAT3活性化は発癌性があり、腫瘍の進行および転移に寄与することが証明されている。以前の研究から、STAT3はLNCaP-s17細胞において構成的に活性化されることが分かった。LNCaP-s17細胞がSTAT3シグナル伝達の上昇を示すかどうか試験するために、このアッセイでは、c-Myc、サバイビン、およびBcl-2を含むいくつかのSTAT3標的遺伝子の発現レベルが確かめられた。
図27Aに示したように、LNCaP-s17細胞は、構成的に活性化されているSTAT3を発現し（STAT3のTyr705がリン酸化されている）、LNCaP-neo細胞より高いレベルのAR、c-Myc、サバイビン、およびBcl-2タンパク質を発現する。タンパク質レベルと一致して、LNCaP-s17細胞はLNCaP-neo細胞より高いレベルのc-Myc mRNAおよびサバイビンmRNAを発現する（図27Bおよび図27C）。
LNCaP-s17細胞は、LNCaP-neo細胞より高いレベルのIL-6 mRNAおよびタンパク質を発現した（図27Dおよび図27E）。
このアッセイでは、構成的活性化型STAT3が、ARE部位へのARの動員を増加させるかどうかも確かめられた。LNCaP細胞、LNCaP-s17細胞、およびLNCaP-STAT3C細胞において、ChIPアッセイを行った。図27Fに示したように、LNCaP-s17細胞およびLNCaP-STAT3C細胞はいずれも、LNCaP-neo細胞と比較して、PSAプロモーターの基部結合部位（AREI/II）および末端エンハンサー結合部位（AREIII）の両方へのARの動員の増強を示した。
まとめると、これらのデータから、IL-6の過剰発現は、前立腺癌細胞におけるSTAT3シグナル伝達経路およびARシグナル伝達経路を活性化することが証明された。
STAT3発現ノックダウンによって、エンザルタミドに対するLNCaP-s17細胞の感受性が回復する。STAT3がIL-6発現前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性に関与するかどうかを確かめるために、LNCaP-neo細胞およびLNCaP-s17細胞を、STAT3特異的siRNAでトランスフェクトした。
次いで、細胞を20μMエンザルタミドでさらに3日間処理し、細胞数を求めた。図28Aに示したように、LNCaP-s17細胞におけるSTAT3発現ノックダウンによって、エンザルタミド処理に対して細胞は再度感受性になった。ノックダウン効果は、p-STAT3（Tyr705）抗体およびSTAT3抗体を用いたウェスタンブロッティングによって確かめられた（図28B）。さらに、構成的活性化型STAT3（STAT3C）を発現するLNCaP細胞は、エンザルタミドに対する耐性の増加を示した（図28C）。これらの結果から、stat3活性化は前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性に関与することが示唆される。
エンザルタミドの作用機序の1つは、標的遺伝子のプロモーター内にあるAREへのARの動員を阻害することである。STAT3を介したエンザルタミド耐性がAREへのARの動員に影響を及ぼすかどうか試験するために、ChIPアッセイを行った。図28Dに示したように、エンザルタミドは、LNCaP-neo細胞のPSAプロモーター内にあるARE（基部結合部位および末端結合部位の両方）へのARの動員を有意に阻害した。対照的に、エンザルタミドは、LNCaP-s17細胞およびLNCaP-STAT3C細胞のAREへのARの動員にほとんど影響を及ぼさなかった。これらの結果から、STAT3を介したエンザルタミド耐性は、PSAプロモーター内にあるAREへのARの動員に影響を及ぼすことに関与している可能性があることが分かる。
ix．STAT3の阻害およびエンザルタミド耐性の逆転
このアッセイでは、以前にDU145細胞におけるSTAT3発現を阻害できることが示された小さな非ペプチド薬剤であるニクロサミド（図29A）が前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性を逆転できるかどうかを試験した。
ニクロサミドは前立腺癌細胞においてSTAT3活性化を有意に阻害することが観察された（図29B）。
このアッセイでは、ニクロサミドによるSTAT3活性化の阻害によって、LNCaP-s17細胞におけるエンザルタミド耐性を逆転できるかどうかを試験した。図29Cに示したように、20μMエンザルタミド処理はLNCaP-s17細胞増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、0.25μMニクロサミドの存在下でエンザルタミドは細胞増殖を有意に阻害した（図29C）。これは、アポトーシス細胞死が誘導されたことによるものかもしれない（図29D）。公知のJak2-STAT3阻害剤であるAG490もエンザルタミド耐性を逆転させることが観察された（図29Cおよび図29D）。
これらの結果を時間依存的な実験でも確かめた。LNCaP-s17細胞を異なる時間にわたって20μMエンザルタミドおよび0.25μMニクロサミドで個々に、または組み合わせて処理した。LNCaP-s17細胞の増殖はニクロサミドの存在下でエンザルタミドによって有意に阻害されたのに対して、エンザルタミドまたはニクロサミド単独での処理は細胞増殖にほとんど影響を及ぼさなかった（図29E）。細胞増殖阻害と一致して、LNCaP-s17細胞のクローン形成能力はニクロサミドの存在下でエンザルタミドによって有意に阻害された（図29F）。まとめると、これらのデータから、ニクロサミドはSTAT3発現を阻害することでエンザルタミド耐性を克服できる、または逆転できることが証明された。
本実施例は、IL-6と持続的STAT3活性化との間にある軸が、エンザルタミド耐性に関与する重要な機構の1つになり得ることを示す。
本実施例は、LNCaP細胞におけるオートクラインIL-6によってSTAT3経路が活性化され、エンザルタミドに対する耐性が増強されるのに対して、LNCaP-s17細胞におけるSTAT3ダウンレギュレーションによってエンザルタミドに対してLNCaP-s17細胞は劇的に再度感受性になることを示す。さらに、構成的活性化型STAT3をLNCaP細胞に導入することによってエンザルタミドに対する耐性が誘導された。このことから、前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性はSTAT3活性化によって動かされている可能性があることが分かる。
本実施例は、LNCaP親細胞と比較して、構成的活性化型STAT3を発現する前立腺癌細胞株ではエンザルタミド処理によってPSAプロモーターへのARの動員がわずかにしか低減しなかったことを示す。このことから、持続的STAT3活性化が、標的遺伝子プロモーターへのARの動員のブロッキングにおけるエンザルタミド作用を打ち消している可能性があることが示唆される。
本実施例は、ニクロサミドがSTAT3活性化を阻害し、STAT3構成的活性化を示す前立腺癌細胞におけるエンザルタミド耐性を有意に逆転させたことを示す。エンザルタミドとニクロサミドの併用処理によって細胞増殖が阻害されただけでなく、コロニー形成も阻害された。
本実施例は、IL6-STAT3軸が前立腺癌におけるエンザルタミドに対する耐性の発生に関与することを示す。さらに、本実施例は、IL-6-STAT3軸の標的化がエンザルタミド耐性患者における潜在的な治療方針であり得ることを示す。
x．ニクロサミドは前立腺癌細胞における細胞増殖、遊走、浸潤、およびコロニー形成を阻害する
図16〜図19に示したように、ニクロサミドは前立腺癌細胞における細胞増殖、遊走、浸潤、およびコロニー形成を阻害する。この効果は用量依存的であるようにみえる。図24に示したように、ニクロサミドはLNCap-s17細胞における細胞遊走または浸潤を阻害する。この効果は、ニクロサミドがエンザルタミドと併用された時に向上する。図25に示したように、ニクロサミドはLNCap-Stat3C細胞における細胞遊走または浸潤を阻害する。この効果は、ニクロサミドがエンザルタミドと併用された時に向上する。
xi．インビボ腫瘍形成アッセイ
このアッセイでは、ニクロサミドがインビボで前立腺癌のエンザルタミド耐性を克服するかどうかを試験した。このアッセイでは、CWR22rv1細胞から作製した異種移植片をビヒクル、エンザルタミド、ニクロサミド、またはそれらの組み合わせで3週間処置した。
CWR22rv1細胞（3百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、6〜7週雄SCIDマウスの側腹部に皮下注射した。担癌マウス（腫瘍量約50〜100mm3）を無作為化して4つの群にし、以下:（1）ビヒクル対照（5％Tween80および5％エタノールを含むPBS、i.p.）、（2）エンザルタミド（25mg/kg、p.o.）、（3）ニクロサミド（25mg/kg、i.p.）、（4）エンザルタミド（25mg/kg、p.o.）+ニクロサミド（25mg/kg、i.p.）の通りに処置した。腫瘍をカリパスを用いて週2回測定し、長さx幅2/2を用いて腫瘍量を計算した。処置して3週間後に腫瘍組織を採取した。
図39に示したように、エンザルタミド処理に対して耐性のCWR22rv1細胞の腫瘍量はビヒクル処理対照群の腫瘍量と同等であった。ニクロサミドは単独で腫瘍量を減少させたのに対して、ニクロサミドとエンザルタミドの組み合わせはCWR22rv1腫瘍を相乗的に小さくした。このアッセイから、ニクロサミドはエンザルタミド耐性を克服し、インビボでのエンザルタミドに対するCWR22rv1異種移植片の感受性を回復できることが分かる。要約すると、これらの結果から、ニクロサミドはエンザルタミド処置を改善し、エンザルタミド耐性を克服できることが証明された。
実施例2．エンザルタミド耐性細胞に対するニクロサミドの効果
CWR22Rv1細胞（4百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、雄SCIDマウスの側腹部に皮下注射した。担癌マウス（腫瘍量約50〜75mm3）を、以下:対照:（H2Oに溶解した5％PGE8000 p.o 1日2回）、ニクロサミド（200mg/kg p.o 1日2回）の通り1週間あたり5日間処置した。腫瘍をカリパスを用いて週2回測定し、長さx幅2/2を用いて腫瘍量を計算した。処置して3週間後に腫瘍組織を採取した。結果を図40に図示した。図40A〜Cに示したように、ニクロサミドは経口投与された時にRv1異種移植片腫瘍成長を有意に阻害した。図40Dに示したように、ニクロサミドの投与は、体重の維持により示されるように、ニクロサミドが与えられなかった対照マウスと比較して忍容性が良かった。
ニクロサミドとビカルタミドの組み合わせの効果をインビトロおよびインビボで調べた。図41に示したように、ニクロサミドは、インビトロでのCWR22Rv1細胞におけるビカルタミドの効果を用量依存的（図41A）および時間依存的（図41B）に有意に向上させた。ニクロサミドはまたインビボでのマウス異種移植片モデルにおけるCWR22Rv1細胞のビカルタミド処置も向上させた。
インビボ実験のために、CWR22Rv1細胞（4百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、雄SCIDマウスの側腹部に皮下注射した。担癌マウス（腫瘍量約50〜75mm3）を、以下:対照: （0.5％重量/体積（w/v） Methocel A4M p.o、ならびにPBSに溶解した5％Tween80および5％エタノール、i.p.）、ビカルタミド（25mg/kg p.o）、ニクロサミド（25mg/kg i.p.）、ならびに組み合わせ（25mg/kgビカルタミド p.o+25mg/kgニクロサミド i.p.）の通り1週間あたり5日間処置した。腫瘍をカリパスを用いて週2回測定し、長さx幅2/2を用いて腫瘍量を計算した。処置して3週間後に腫瘍組織を採取した。結果を図42に図示した。図42A〜Cに示したように、ニクロサミドはインビボでのマウス異種移植片モデルにおいてCWR22Rv1細胞に対するビカルタミドの効果を有意に向上させた。図42Dに示したように、ニクロサミドの投与は単独でも、ビカルタミドと組み合わされても、体重の維持により示されるように、ニクロサミドが与えられなかった対照マウスと比較して忍容性が良かった。
実施例3．AKR1C3活性化およびイントラクラインアンドロゲンはエンザルタミドに対する耐性を付与する。
a．序論
アンドロゲン除去療法を介したアンドロゲンシグナル伝達の標的化は前立腺癌（PCa）における臨床介入の主力であった。初めは有効であったが男性の大半は一時的な利益しか得ず、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）を再発する。去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）は現在、治癒不可能である。患者において去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）を治療するために第2世代抗アンドロゲンであるエンザルタミドが最近、認可された。一時的な休息をもたらす、これらの進歩にもかかわらず、エンザルタミド耐性が頻繁に起こる。ARバリアント発現（Antonarakis et al., 2014; Li et al., 2013; Liu et al., 2014a）、IL6-STAT3-AR軸活性化（Liu et al., 2014b）、AR F876L変異（Joseph et al., 2013; Korpal et al., 2013）、およびグルココルチコイド受容体（GR）過剰発現（Arora et al., 2013; Isikbay et al., 2014）などの、いくつかの潜在的な耐性機構が明らかになっている。
腫瘍内アンドロゲン生合成はCRPC機構としてよく特徴付けられているが（Cai et al., 2011; Ishizaki et al., 2013; Locke et al., 2008; Mohler et al., 2011）、エンザルタミド耐性におけるその役割はまだ理解されていない。臨床報告から、エンザルタミドで治療された患者は骨髄中のテストステロンレベルが高いことが分かっている（Efstathiou et al., 2014; Efstathiou E, 2011）。腫瘍内アンドロゲン生合成には、CYP17A1、HSD3B、およびAKR1C3を含む一連の酵素が関与している。最近、CRPC患者においてHSD3B1の機能獲得変異（N367T）が特定されており、エンザルタミドに対する耐性を付与すると仮定された（Chang et al., 2014; Chang et al., 2013）。アルド・ケト還元酵素ファミリー1メンバーC3（AKR1C3）は多機能酵素であり、アンドロゲンの合成および代謝に関与する最も重要な遺伝子の1つである。AKR1C3によって、弱いアンドロゲンであるアンドロステンジオン（A'ジオン）から活性がさらに強いアンドロゲンであるテストステロン、弱いアンドロゲンである5α-アンドロスタンジオン（5α-ジオン）から活性がさらに強いアンドロゲンであるDHTへの変換が容易になる（Bauman et al., 2006; Labrie et al., 1997）。AKR1C3はステロイド変換を触媒し、ステロイド受容体のトランス活性化を調整する。AKR1C3の高発現はPCaの進行および攻撃性と結び付けられてきた（Stanbrough et al., 2006; Wako et al., 2008）。エンザルタミド耐性前立腺癌におけるAKR1C3の役割を本明細書において検討する。
本研究では、エンザルタミドに対して耐性のPCa細胞株が開発され、エンザルタミド耐性前立腺癌細胞ではイントラクラインアンドロゲン合成が活性化されることが見出された。エンザルタミドに対する耐性を付与する重要な機構として、重要なステロイド産生酵素の1つであるAKR1C3の活性化が特定された。shRNAまたはインドメタシンを用いたAKR1C3活性阻害によって、エンザルタミドに対してエンザルタミド耐性PCa細胞は、再度感受性となった。さらに、インドメタシンとエンザルタミドの組み合わせによってエンザルタミド耐性PCa異種移植片腫瘍成長は有意に阻害された。
b．結果
i．エンザルタミド耐性前立腺癌細胞におけるAKR1C3活性化の特定
以前に、エンザルタミド含有培地中でC4-2B細胞を長期培養することによって、C4-2B MDVRと名付けたエンザルタミド耐性前立腺癌細胞が作製された（Liu et al., 2014a）。図43Aおよび図43Bに示したように、エンザルタミドはC4-2B親細胞の増殖およびクローン形成能力を有意に阻害したが、C4-2B MDVR細胞にほとんど影響を及ぼさなかった。C4-2B MDVR細胞に対するエンザルタミド処置の効果をインビボでも調べた。図43Cに示したように、C4-2B MDVR異種移植片はエンザルタミドに対して耐性であった。エンザルタミドで3週間処置された後に、C4-2B異種移植片の腫瘍重量はエンザルタミドによって有意に阻害されたのに対して、処置されたC4-2B MDVR群の腫瘍重量は非処置対照群の腫瘍重量と同等であった。これらの結果から、C4-2B-MDVR細胞はインビトロおよびインビボの両方でエンザルタミドに対して耐性であることが分かる。エンザルタミド処理に対する、他のいくつかの前立腺癌細胞株の応答も調べた。図43Dに示したように、LNCaP細胞はエンザルタミド感受性であるのに対して、CWR22Rv1細胞およびLN-95細胞は、以前に発表された研究と一致して（Dehm et al.,2008; Hu et al.,2013; Nadiminty et al.,2013）、エンザルタミド処理に対して耐性である。
腫瘍内アンドロゲン生合成はCRPC機構としてよく特徴付けられているが（Cai et al.,2011; Fankhauser et al.,2014; Ishizaki et al.,2013; Locke et al.,2008; Mohler et al., 2011）、エンザルタミド耐性におけるその役割ははっきりとわかっていない。エンザルタミド耐性の基礎をなす潜在的な機構をさらに理解するために、マイクロアレイ分析をエンザルタミド耐性C4-2B-MDVR細胞およびエンザルタミド感受性C4-2B親細胞に対して行った。ステロイドホルモン生合成をコードする転写物の発現を遺伝子セット濃縮によって分析した。ホルモン生合成に関与する45の遺伝子のうち、C4-2B MDVR細胞では31の遺伝子がアップレギュレートされたのに対して、14の遺伝子がダウンレギュレートされた。図44Aに示したように、C4-2B親細胞と比較して、C4-2B MDVR細胞ではAKR1C3、AKR1C1、AKR1C2、HSD3B1、CYP17A1、およびSRD5A3の発現増加ならびにUGT2B15、UGT2B17、CYP39A1、HSD17B6、およびSRD5A1の発現減少が見出された。遺伝子発現データを検証するために、CYP17A1、HSD3B1、HSD3B2、HSD17B3、SRD5A1、AKR1C1/2、およびAKR1C3のmRNAレベルを特異的プライマーを用いてqRT-PCRによって測定した。図44B左に示したように、mRNA発現レベルはマイクロアレイデータと一致した。これらの結果は図44B右に示したようにウエスタンブロットでも確かめられた。C4-2B MDVR細胞は、C4-2B親細胞と比較して有意に高いレベルのAKR1C3、HSD3B、およびCYP17A1タンパク質を発現する。これらの結果から、エンザルタミド耐性前立腺癌細胞ではアンドロゲン合成シグナル伝達がアップレギュレートされることが分かる。
ii．AKR1C3は転移性かつ再発性の前立腺癌ならびにエンザルタミド耐性前立腺異種移植片腫瘍において高発現している
AKR1C3は、エンザルタミド耐性C4-2B MDVR細胞ではC4-2B親細胞と比較して16倍超アップレギュレートされることが見出された。AKR1C3発現を、以下の異なる前立腺癌細胞株:VCaP細胞、CWR22Rv1細胞、LNCaP細胞、LN-95細胞、C4-2B細胞、およびC4-2B-MDVR細胞において調べた。C4-2B MDVR細胞、CWR22Rv1細胞、およびLN-95細胞はエンザルタミド耐性であるのに対して、C4-2B細胞およびLNCaP細胞はエンザルタミド感受性である。図45Aに示したように、C4-2B MDVR細胞、VCaP細胞、CWR22Rv1細胞、およびLN-95細胞は全て有意に高いレベルのAKR1C3を発現する。C4-2B MDVR細胞、CWR22Rv1細胞、およびLN-95細胞は高いレベルのHSD3Bを発現する。C4-2B MDVR細胞およびLN-95細胞はまた高いレベルのCYP17A1も発現した。図45Bに示したように、腫瘍異種移植片におけるAKR1C3発現をIHCでも調べた。C4-2B MDVR腫瘍およびCWR22Rv1腫瘍はC4-2B親腫瘍と比較して高レベルのAKR1C3を発現する。正常前立腺におけるAKR1C3発現と前立腺癌におけるAKR1C3発現を比較するためにOncomineデータベースおよびGEOデータベースを用いてデータマイニングも行った。原発性前立腺癌および正常前立腺は2つの独立した前立腺データセットにおいてほぼ同じAKR1C3レベルを発現するのに対して、AKR1C3はGEOデータセットの転移性前立腺癌において有意に上昇していた（図45C）。これは以前の報告と一致している（Mitsiades et al., 2012; Montgomery et al., 2008）。AKR1C3と前立腺癌疾患進行の相関関係をさらに探索した。図45Dに示したように、AKR1C3はOncomineにある2つの独立した前立腺データセットにおいて前立腺癌患者のGleasonスコアおよび再発状況と有意な相関関係があった。まとめると、これらの結果から、AKR1C3は後期前立腺癌およびエンザルタミド耐性前立腺癌異種移植片において高発現していることが証明された。
iii．イントラクラインアンドロゲンはエンザルタミド耐性前立腺癌細胞において上昇している
AKR1C3（17βHSD5とも呼ばれる）はアンドロゲンの合成および代謝に関与する最も重要な遺伝子の1つである。AKR1C3によって、弱いアンドロゲンであるアンドロステンジオン（A'ジオン）から活性がさらに強いアンドロゲンであるテストステロン、弱いアンドロゲンである5α-アンドロスタンジオン（5α-ジオン）から活性がさらに強いアンドロゲンであるDHTへの変換が容易になる。C4-2B MDVR細胞が細胞内アンドロゲン合成を獲得したことをさらに確認するために、C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞におけるステロイド代謝を液体クロマトグラフィー-質量分析法（LC-MS）によって分析した。C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞を、無血清かつフェノールレッドを含まない培地中で5日間培養し、50x106個の細胞からステロイド代謝産物を抽出し、LC-MS分析に供した。図46A〜Cに示したように、C4-2B MDVR細胞はC4-2B親細胞と比較して極めて高いレベルのテストステロン（131.025対0.15pg/5000万個の細胞）、ジヒドロテストステロン（17.55対0pg/5000万個の細胞）、およびDHEA（72.075対0pg/5000万個の細胞）を合成する。興味深いことに、C4-2B MDVR細胞では、活性エストロゲン代謝産物であるエストラジオールが有意に低減した（82.725対207.3pg/5000万個の細胞）。このことから、C4-2B MDVR細胞ではアンドロゲン生合成が活性化されたのに対して、アンドロゲンからエストロゲンへの変換が抑制されたことが示唆される。注目すべきことに、C4-2B親細胞と比較して、C4-2B MDVR細胞ではイントラクラインアンドロゲン合成に関与する前駆体、例えば、コレステロール、DHEA、およびプロゲステロンも上昇する（図46C）。アンドロゲンの合成および代謝に関与するステロイド産生酵素を図46Dに図示した。太い矢印および太字のフォントは、C4-2B親細胞と比較してエンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてアップレギュレートされていることを示す（図46D）。まとめると、これらの結果から、エンザルタミドに対して耐性の前立腺癌細胞では、イントラクラインによって獲得されるアンドロゲン合成が上昇したことが示唆される。
iv．AKR1C3は前立腺癌細胞におけるエンザルタミドに対する耐性を付与する
エンザルタミド耐性前立腺癌細胞および後期前立腺癌患者においてAKR1C3はアップレギュレートされることが証明されたので、次に、本発明者らは、AKR1C3がエンザルタミドに対する耐性を付与できるかどうかを調べた。AKR1C3は前立腺癌細胞におけるエンザルタミドに対する耐性を付与するのに十分であることが見出された。CWR22Rv1細胞またはC4-2B MDVR細胞をエンザルタミドで3日間処理した後に、対照shRNAまたはAKR1C3 shRNAで一過的にトランスフェクトした。図47Aおよび図47Bに示したように、CWR22Rv1細胞およびC4-2B MDVR細胞はエンザルタミドに対して耐性であるのに対して、2つの独立したshRNA（#561および#694）によるAKR1C3発現のノックダウンによって、エンザルタミドに対するCWR22Rv1細胞およびC4-2B MDVR細胞の感受性は回復した。shRNAによるAKR1C3ダウンレギュレーションがウエスタンブロットで確かめられた（図47C）。AKR1C3の外因性発現がエンザルタミド耐性を誘導するかどうか試験するために、AKR1C3を安定に発現するLNCaP細胞（LNCaP-AKR1C3）も作製した。LNCaP-AKR1C3細胞およびLNCaP-neoベクター対照細胞を異なる濃度のエンザルタミドで48時間処理し、細胞数を数えた。図47Dに示したように、LNCaP-AKR1C3細胞はLNCaP-neo細胞より強いエンザルタミド耐性を示した。これらの結果はクローン形成能力アッセイでも確かめられた。LNCaP-AKR1C3細胞はエンザルタミド処理に対する応答において対照LNCaP-neo細胞より有意に高いクローン形成能力を示した（図47Eおよび図47F）。まとめると、これらの結果から、AKR1C3の過剰発現がエンザルタミドに対する耐性を付与するのに対して、AKR1C3のダウンレギュレーションがエンザルタミド処理に対してエンザルタミド耐性前立腺癌細胞を再度感受性にすることが証明された。
v．AKR1C3活性阻害剤であるインドメタシンはエンザルタミド耐性を克服する
発熱、疼痛、および炎症を軽減するために用いられる非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）であるインドメタシンはAKR1C3活性を阻害できることが示されている（Cai et al., 2011; Flanagan et al., 2012; Liedtke et al., 2013）。エンザルタミド耐性におけるAKR1C3の役割をさらに調べるために、インドメタシンを用いてAKR1C3活性化を妨害し、エンザルタミド処理に対するPCa細胞の応答に対する効果をインビトロおよびインビボで調べた。図48A左に示したように、インドメタシンは10μMではCWR22Rv1細胞増殖に影響を及ぼさなかったが、20μMでは細胞増殖をわずかに阻害した。しかしながら、インドメタシンとエンザルタミドの組み合わせはエンザルタミド耐性CWR22Rv1細胞の増殖を有意に阻害した。この結果は試験管内腫瘍細胞感受性試験でも確かめられた。図48A右に示したように、インドメタシンとエンザルタミドの組み合わせはCWR22Rv1細胞においてコロニー数を有意に阻害し、コロニーサイズを有意に小さくした。C4-2B MDVR細胞でも同様の結果が得られた（図48B）。インドメタシンによるAKR1C3阻害がインビボでのエンザルタミド処置に対する耐性を克服するかどうか試験するために、CWR22Rv1異種移植片モデルを使用した。図48Cに示したように、CWR22Rv1腫瘍はエンザルタミド処置に対して耐性であったが、インドメタシンは腫瘍成長を有意に阻害した。インドメタシンとエンザルタミドの組み合わせはCWR22Rv1異種移植片の腫瘍成長をさらに阻害した。Ki67の免疫組織化学染色によって、細胞増殖はインドメタシンによって有意に阻害され、併用処置によってさらに阻害されたことが分かった（図48D）。まとめると、これらの結果から、インドメタシンによるAKR1C3阻害によってエンザルタミド耐性腫瘍成長が低減し、エンザルタミドとインドメタシンの組み合わせによってエンザルタミド耐性前立腺癌の腫瘍成長がさらに低減したことが示唆される。これらの結果から、インドメタシンによるAKR1C3阻害によってエンザルタミドの細胞死滅効果が増強されることが分かる。
c．考察
第2世代アンドロゲンアンタゴニストであるエンザルタミドは後期転移性CRPCに対する治療選択肢における改善点である（Scher et al., 2010; Scher et al., 2012）。しかしながら、初期レスポンダー（initial responder）は必ず耐性を起こす。エンザルタミド耐性に関連する潜在的な機構が精力的な研究の中心になっている。NF-κB2/p52（Cui et al., 2014; Nadiminty et al., 2013）、AR-V7（Liu et al., 2014a; Nadiminty et al., 2013）、STAT3（Liu et al., 2014b）の活性化、およびオートファジーの誘導（Nguyen et al., 2014）を含む、エンザルタミド耐性に関与する、いくつかの新規の機構が以前に特定されている。この研究では、AKR1C3活性化およびイントラクラインアンドロゲン上昇が、エンザルタミド耐性に寄与する潜在的な機構として特定された。この研究から、エンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてAKR1C3は過剰発現していることが証明された。さらに、この研究から、AKR1C3の過剰発現がエンザルタミドに対する耐性を付与するのに対して、AKR1C3のダウンレギュレーションがエンザルタミド処理に対してPCa細胞を再度感受性にすることが分かった。さらに、臨床転移性前立腺癌においてAKR1C3の過剰発現が証明され、疾患進行と相関関係にある。エンザルタミド耐性細胞では、アンドロゲンを含むイントラクラインステロイドが上昇することも証明された。この上昇は、おそらく、AKR1C3などのステロイド産生酵素の発現が増加したことによるものである。さらに、強力なAKR1C3阻害剤であるインドメタシンを用いてエンザルタミド耐性を克服できることも証明された。エンザルタミド耐性細胞ではイントラクラインアンドロゲン合成が上昇し、AKR1C3活性化が増強すると発見されたことから、エンザルタミド耐性CRPCが発症および進行するための新規の機構が明らかになった。第2世代抗アンドロゲン治療剤を用いた男性におけるAKR1C3の同時標的化は耐性を克服し、長期間にわたる応答を実現する可能性が高い。
イントラクラインアンドロゲン生合成はCRPC機構としてよく特徴付けられている（Cai et al., 2011; Fankhauser et al., 2014; Ishizaki et al., 2013; Locke et al., 2008; Mohler et al., 2011）。CYP17A1、AKR1C3、およびHSD3Bを含む多くの酵素がアンドロゲン合成に関与する。CYP17A1は臨床治療においてアビラテロンによって阻害することができる（de Bono et al., 2011; Ryan et al., 2013）。AKR1C3はステロイド生合成に関与するステロイド産生酵素であり、アンドロステンジオンからの最後のテストステロン生合成段階を媒介する。AKR1C3はステロイド変換を触媒し、ステロイド受容体のトランス活性化を調整する。AKR1C3の高発現はPCaの進行および攻撃性と結び付けられてきた（Stanbrough et al., 2006; Wako et al., 2008）。AKR1C3はまたARコアクチベーターとしても特定されている（Yepuru et al., 2013）。この研究では、遺伝子濃縮分析を用いて、エンザルタミド耐性細胞をエンザルタミド感受性細胞と比較した。ステロイド生合成遺伝子はC4-2B MDVR細胞において高濃縮されていることが見出された。エンザルタミド耐性細胞では、アンドロゲン合成に関与するいくつかの重要な遺伝子、例えば、AKR1C3、HSD3B、およびCYP17A1がアップレギュレートされていた。別の新規エンザルタミド耐性細胞株であるCWR22Rv1では、AKR1C3はC4-2B細胞またはLNCaP細胞と比較して高発現していた。このことから、AKR1C3はエンザルタミド耐性において重要な役割を果たしていることが示唆される。C4-2B MDVR細胞によってイントラクラインアンドロゲン合成が獲得されたことをさらに確認するために、C4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞におけるステロイドレベルを液体クロマトグラフィー-質量分析法（LC-MS）によって確かめた。エンザルタミド耐性細胞ではテストステロンレベルおよびDHTレベルが高いことに加えて、C4-2B-MDVR細胞では、コレステロール、DHEA、およびプロゲステロンなどのテストステロン前駆体のレベルは全てC4-2B親細胞と比較して上昇していた。これらの結果から、エンザルタミド耐性前立腺癌細胞においてAKR1C3は有意に上昇しており、その結果として、エンザルタミド耐性細胞におけるテストステロンレベルおよびDHTレベルが高くなった可能性が高いことが証明された。
AKR1C3活性化を標的化するために、インドメタシンを含む、いくつかの阻害剤が開発されている（Flanagan et al., 2012）。インドメタシンは、発熱、疼痛、および炎症を軽減するのに用いられる非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）である。いくつかの研究から、インドメタシンには、抗癌剤に対する癌細胞の感受性、例えば、TRAIL誘導性アポトーシスに対するヒトメラノーマ細胞の感受性（Tse et al., 2013）およびシスプラチンに対する結腸癌細胞の感受性（Brunelli et al., 2012）を増加させる可能性があり得ることが明らかになった。インドメタシンには、再発したVCaP異種移植腫瘍においてPSAおよびERGタンパク質の発現を阻害する能力ならびにテストステロンレベルおよびDHTレベルを減少させる能力もある（Cai et al., 2011）。本研究では、インドメタシンによってAKR1C3酵素活性を阻害することで、インビトロおよびインビボの両方でエンザルタミド耐性前立腺癌細胞におけるエンザルタミド感受性が回復したことが示された。さらに、インドメタシンとエンザルタミドの組み合わせによってエンザルタミド耐性腫瘍成長が有意に阻害された。本明細書に記載のデータから、AKR1C3阻害によって、エンザルタミド耐性患者において抗腫瘍効果を回復できることが証明された。
まとめると、本結果から、AKR1C3活性化および結果として生じたイントラクラインアンドロゲン合成は前立腺癌細胞におけるエンザルタミドに対する耐性を付与することが分かる。shRNAまたはインドメタシンによるAKR1C3阻害によってエンザルタミドに対する耐性が克服される。さらに、インドメタシンとエンザルタミドの組み合わせによってエンザルタミド耐性腫瘍成長が有意に阻害された。従って、AKR1C3標的化はエンザルタミド耐性患者に有効な治療戦略となる。
d．実験手順
i．試薬および細胞培養
LNCaP細胞、CWR22Rv1細胞、VCaP細胞、およびHEK293T細胞は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手した。細胞株を用いた実験は全て、ATCCから受け取って6ヶ月以内に、または凍結保存後、蘇生して6ヶ月以内に行った。ATCCは、細胞株を検査および確認するために短いタンデム反復（STR）プロファイリングを用いる。C4-2B細胞は、Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CAのDr.Leland Chungの厚意により提供および確認されたものである。LN-95細胞は、University of Pittsburg, PAのDr.Joel Nelsonの厚意により提供および確認されたものである。10％胎仔ウシ血清（FBS）、100単位/mlペニシリン、および0.1mg/mlストレプトマイシンを加えたRPMI1640中で細胞を維持した。LNCaP-neo細胞およびLNCaP-AKR1C3細胞は、LNCaP細胞を空のベクターpcDNA3.1またはAKR1C3をコードするpcDNA3.1を用いて安定にトランスフェクトすることによって作製されたものであり、300μg/mL G418を含有するRPMI1640培地中で維持した。AKR1C3 shRNA（TRCN0000026561およびTRCN0000025694）はSigmaから購入した。以前（Liu et al., 2014a）に述べられたように、エンザルタミド耐性細胞をC4-2B MDVR（C4-2Bエンザルタミド耐性）と呼んだ。細胞は全て5％二酸化炭素の加湿インキュベーターに入れて37℃で維持した。
ii．試料調製およびステロイド分析
ステロイドの抽出および分析は以前に説明されている（Gaikwad, 2013）。簡単に述べると、5000万個のC4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞を、血清およびフェノールレッドを含まないRPMI1640培地中で5日間培養し、次いで、細胞を4mLの1:1水/メタノール混合物に懸濁した。懸濁液をホモジナイズし、結果として生じたホモジネートを氷上で冷却した。高速で5分間遠心分離することによって、沈殿した材料を除去し、上清を取り出し、SpeedVac（Labconco Inc.）に入れて蒸発させ、これに続いて凍結乾燥器（Labconco Inc.）に入れて蒸発させた。残渣を150μLのCH3OH/H2O（1:1）に懸濁し、0.2μm超遠心フィルター（Millipore inc.）で濾過し、UPLC/MS-MS分析に供した。UPLC-MS/MS分析中に試料を2回繰り返して流した。分析物を保存するために8℃まで冷却したAcquityサンプルマネージャに試料を入れた。試料分析前に、純粋な標準物質を用いてUPLC-MS/MS条件を最適化した。また、マトリックス効果および日々の計器のばらつきによる誤差を防ぐために、1回目の試料の前に標準混合物を流した。さらに、初回標準物質の直後に、および1回目の試料の前に、マトリックス効果による全分析物の保持時間のドリフト（drift）を較正するために2つの添加（spiked）試料を流した。標準物質および添加試料が流れた後に、インジェクタを洗浄し、キャリーオーバーの影響を取り除くために、ブランクを注入した。
iii．ステロイド代謝産物のUPLC-MS/MS分析
質量分析法実験は全てWaters Xevo-TQ三重四重極質量分析計（triple quadruple mass spectrometer）（Milford, MA, USA）において行い、MSスペクトルおよびMS/MSスペクトルを、エレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いて陽イオン（PI）および陰イオン（NI）モード、3.0kVのキャピラリー電圧、3Vのエクストレーターコーン（extractor cone）電圧、ならびに650Vの検出器電圧で記録した。コーンガス流を50L/hに設定し、脱溶媒ガス流を600L/hに維持した。供給元温度を150℃に設定し、脱溶媒温度を350℃に設定した。娘イオンを最適化するように衝突エネルギーを変えた。取得範囲は20〜500Daであった。分析用分離は、50℃および流速0.15ml/分に保ったAcquity UPLC HSS T3 1.8 μm 1X150mm分析用カラムを用いたUPLCシステムにおいて行った。勾配は100％A（H2Oに溶解した0.1％ギ酸）および0％B（CH3CNに溶解した0.1％ギ酸）から開始し、2分後に、2分間にわたって80％Aまで、次いで5分間にわたって45％Aまで、続いて2分で20％Aまで変化した。最後に、勾配を1分間にわたって元の100％Aに変え、その結果として総分離時間は15分になった。UPLCカラムからの溶出液を質量分析計に導入し、結果として得られたデータをMassLynx 4.1ソフトウェアを用いて分析および処理した。
iv．cDNAマイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析は以前に説明されている（Zhu et al., 2013）。簡単に述べると、1x105個のC4-2B親細胞およびC4-2B MDVR細胞を平板培養して24時間後に、TRIzol Reagent（Invitrogen）を用いて全RNAを単離し、Eppendorfフェーズロックゲル（phase-lock-gel）チューブを用いて精製した。RNA完全性を保証するために、全試料のRNA品質をRNA電気泳動によって試験した。試料を、Affymetrix Human Gene 1.0 STアレイを用いてGenomics Shared Resource（UC Davis Medical Center, Sacramento, CA） によって分析した。データをSubio プラットフォームおよびIngenuity Pathway Analysis （IPA）によって分析した。
v．ウエスタンブロット分析
細胞タンパク質抽出物をSDS-PAGEで分離し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。5％乳を含むPBS/0.1％Tween-20に入れて室温で1時間ブロッキングした後に、膜を、示された一次抗体[AKR1C3（A6229, Sigma）;CYP17A1（SC-66849, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）;HSD3B（SC-28206, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）;チューブリン（T5168, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）]と4℃で一晩インキュベートした。ローディング・コントロールとしてチューブリンを使用した。二次抗体インキュベーション後に、免疫反応性タンパク質を、高感度化学ルミネセンス検出システム（Millipore, Billerica, MA）を用いて視覚化した。
vi．細胞増殖アッセイ
C4-2B MDVR細胞、CWR22Rv1細胞を、0.5x105細胞/ウェルの密度で、10％FBS含有RPMI1640培地が入っている12ウェルプレートに播種し、20μMエンザルタミドで処理した後にAKR1C3 shRNAまたは対照shRNAで一過的にトランスフェクトした。3日後または5日後に総細胞数を数えた。LNCaP-neo細胞、LNCaP-AKR1C3細胞、またはLN-95細胞を異なる濃度のエンザルタミドで48時間処理した。総細胞数を数えたか、または細胞生存率（％）を計算した。細胞生存率（％）=（処理群の細胞数/対照群の細胞数）x100％。
vii．試験管内腫瘍細胞感受性試験
C4-2親細胞またはC4-2B MDVR細胞を10％FBS含有培地中でDMSO、10μMまたは20μMのエンザルタミドで処理した。CWR22Rv1細胞またはC4-2B MDVR細胞を20μMエンザルタミドと共にまたは20μMエンザルタミド無しで、10μMもしくは20μMのインドメタシンで処理し、細胞を同じ密度（1500個の細胞/ディッシュ）で100mmディッシュに14日間平板培養し、培地を3日ごとに交換した。LNCaP-neo細胞またはLNCaP-AKR1C3細胞を10％完全FBS含有培地中でDMSOまたは10μMエンザルタミドで処理し、細胞を同じ密度（10000個の細胞/ディッシュ）で100mmディッシュに28日間平板培養し、コロニーをPBSでリンスした後に、0.5％クリスタルバイオレット/4％ホルムアルデヒドで30分間染色し、コロニー数を数えた。
viii．リアルタイム定量RT-PCR
TriZOL Reagent（Invitrogen）を用いて全RNAを抽出した。RNaseフリーRQ1 DNase（Promega）で消化した後にcDNAを調製した。cDNAを、Sso Fast Eva Green Supermix（Bio-Rad）を用いて製造業者の説明書に従って、および以前に説明されたように（Liu et al., 2011）リアルタイム逆転写-PCR（RT-PCR）に供した。アクチンを同時増幅することによって各反応を基準化した。3つの同じ試料を、Bio-Rad CFX-96リアルタイムサイクラーのデフォルト設定で操作した。リアルタイムPCRに使用したプライマーは以下の通りである。
Figure 0006548641
ix．PSAの測定
PSA濃度は、PSA ELISAキット（KA0208, Abnova, Inc., Walnut, CA）を用いて製造業者の説明書に従ってC4-2B親マウスまたはC4-2B MDVR腫瘍を有するマウスからの血清中で測定した。
x．インビボ腫瘍形成アッセイ
C4-2B親細胞またはC4-2B MDVR細胞（4百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、6〜7週雄SCIDマウスの前立腺に注射した。血清中PSA濃度が5ng/mlに達した時に、マウスを2つの群（各群に4匹のマウス）に無作為化し、以下:（1）ビヒクル対照（0.5％重量/体積（w/v）Methocel A4M p.o）、（2）エンザルタミド（25mg/kg, p.o.）の通りに処置した。腫瘍をPSA濃度によってモニタリングした。処置して3週間後に全腫瘍組織を採取した。
CWR22Rv1細胞（4百万個）をマトリゲル（1:1）と混合し、6〜7週雄SCIDマウスの側腹部に皮下注射した。担癌マウス（腫瘍量約50〜100mm3）を4つの群（各群に5匹のマウス）に無作為化し、以下:（1）ビヒクル対照（5％Tween80および5％エタノールを含むPBS, i.p.）、（2）エンザルタミド（25mg/kg, p.o.）、（3）インドメタシン（3mg/kg, i.p.）、（4）エンザルタミド（25mg/kg、p.o.）+インドメタシン（3mg/kg, i.p.）の通りに処置した。腫瘍をカリパスを用いて週2回測定し、長さx幅2/2を用いて腫瘍量を計算した。処置して3週間後に腫瘍組織を採取した。
xi．免疫組織化学
腫瘍をホルマリンで固定し、パラフィン包埋組織ブロックからパラフィンを取り除き、再水和し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。抗原賦活化（antigen retrieving）をクエン酸ナトリウム緩衝液（0.01mol/L、pH6.0）中でマイクロ波オーブン内で1,000Wで3分間行い、次いで、100Wで20分間行った。非特異的抗体結合を、PBSに溶解した10％胎仔ウシ血清と室温で30分間インキュベートすることによってブロックした。次いで、スライドを抗Ki-67（1:500; NeoMarker）、抗AKR1C3（1:100; Sigma）と4℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを洗浄し、ビオチン結合二次抗体と30分間インキュベートした後に、アビジンDH-ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories）と30分間インキュベートした。切片をジアミノベンジジン基質キット（Vector Laboratories）を用いて発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。5つの異なる視野にある核染色細胞をスコア化および計数した。DP72カメラを備えたOlympus BX51顕微鏡を用いて画像を撮った。
xii．統計解析
全データを平均±平均の標準偏差（SD）で表した。統計解析をMicrosoft Excel分析ツールを用いて行った。個々の群間の差違を一元配置分散分析（ANOVA）によって分析し、その後に平均を比較するためにシェッフェ法によって分析した。p<0.05は統計的に有意であるとみなした。
e．参考文献
Figure 0006548641
Figure 0006548641
Figure 0006548641
Figure 0006548641
Figure 0006548641
Figure 0006548641
前述の発明は、明確にするために、かつ理解できるようにするために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、絶対に本発明の精神または範囲を逸脱するというわけではなく、ある特定の変化、変更、修正、および均等物の交換を加えることができることは、本発明の開示を考慮すれば当業者に容易に明らかであろう。結果として、本明細書に記載の態様は様々な修正、変更などが加えられ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ決定される。当業者は、本質的に類似した結果を出すように変更、改変、または修正することができる重要でない様々なパラメータを容易に理解するだろう。また、本明細書で使用した専門用語は特定の態様を説明する目的で用いられているのにすぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、添付の特許請求の範囲を限定することを目的としないことも理解しなければならない。さらに、本明細書において提供されるそれぞれの参考文献はその全体が、それぞれの参考文献が個々に参照により組み入れられるのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。本願と本明細書において提供される参考文献が矛盾する場合は、本願が優先されるものとする。
X．非公式の配列表
Figure 0006548641
プライマー配列
リアルタイムPCRに使用したプライマー:
Figure 0006548641
ChIPアッセイに使用したプライマーは以下の通りであった。
PSAプロモーター:
Figure 0006548641

Claims (32)

  1. ニクロサミドの有効量と、エンザルタミド、アビラテロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される前立腺癌薬剤とを含む組成物であって、ニクロサミドの有効量が、該前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分な量である、組成物。
  2. 前記前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分であるインドメタシンの有効量をさらに含む、請求項１記載の組成物。
  3. インドメタシンの有効量と、前立腺癌薬剤エンザルタミドとを含む組成物であって、インドメタシンの有効量が、該前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分な量である、組成物。
  4. 前記前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分であるニクロサミドの有効量をさらに含む、請求項３記載の組成物。
  5. 前立腺癌を有する患者においてエンザルタミド、アビラテロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するための薬学的組成物であって、該前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分なニクロサミドの有効量を含む、薬学的組成物。
  6. 前立腺癌を有する患者において前立腺癌薬剤エンザルタミドに対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するための薬学的組成物であって、該前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分なインドメタシンの有効量を含む、薬学的組成物。
  7. 前記前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分であるニクロサミドの有効量をさらに含む、請求項６記載の薬学的組成物。
  8. 前記前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分であるインドメタシンの有効量をさらに含む、請求項５記載の薬学的組成物。
  9. 前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、進行期前立腺癌、薬剤耐性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ＡＲ−Ｖ７誘導性薬剤耐性前立腺癌、ＡＫＲ１Ｃ３誘導性薬剤耐性前立腺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５〜８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  10. ニクロサミドの有効量が経口投与されるように用いられる、および／または
    インドメタシンの有効量が経口投与されるように用いられる、
    請求項５〜９のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  11. ニクロサミドおよび／またはインドメタシンが前立腺癌薬剤と同時投与されるように用いられる、請求項５〜１０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  12. ニクロサミドおよび／またはインドメタシンが前立腺癌薬剤の前および／または後に連続投与されるように用いられる、請求項５〜１０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  13. 約５００ｍｇまたはそれ以上の一日量のニクロサミドが、１日に患者に投与されるように用いられる、請求項５または７〜１２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  14. 一日量のニクロサミドが、１日１回投与されるように用いられる、請求項１３記載の薬学的組成物。
  15. 一日量のニクロサミドが、サブドーズ（subdose）に分割され、複数回投与されるように用いられる、請求項１３記載の薬学的組成物。
  16. ニクロサミドの複数回投与が、１日２回、１日３回、または１日４回の投与である、請求項１５記載の薬学的組成物。
  17. 一日量のニクロサミドが、経口投与されるように用いられる、請求項１３〜１６のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  18. 約５０００ｍｇの一日量のニクロサミドが、１日に患者に投与されるように用いられる、請求項５または７〜１２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  19. 一日量のニクロサミドが、サブドーズに分割され、１日２回、１日３回、または１日４回投与されるように用いられる、請求項１８記載の薬学的組成物。
  20. 一日量のニクロサミドが、経口投与されるように用いられる、請求項１８または１９記載の薬学的組成物。
  21. 約2,500 mgの一日量のニクロサミドが、1日に患者に投与されるように用いられる、請求項５または７〜１２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  22. 一日量のニクロサミドが、サブドーズに分割され、１日２回、１日３回、または１日４回投与されるように用いられる、請求項２１記載の薬学的組成物。
  23. 一日量のニクロサミドが、経口投与されるように用いられる、請求項２１または２２記載の薬学的組成物。
  24. 一日量のニクロサミドが、1日あたり約1,000 mgの用量のアビラテロンとともに投与されるように用いられる、請求項１３〜２３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  25. ニクロサミドが、患者に、少なくとも約5日、10日、20日、または30日にわたって投与されるように用いられる、請求項１３〜２４のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  26. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５〜２５のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  27. （ａ）ニクロサミドの有効量、ならびに
    （ｂ）エンザルタミド、アビラテロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される前立腺癌薬剤
    を備えるキットであって、ニクロサミドの有効量が、該前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分である、キット。
  28. 前記前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分であるインドメタシンの有効量をさらに備える、請求項２７記載のキット。
  29. （ａ）インドメタシンの有効量、および
    （ｂ）前立腺癌薬剤エンザルタミド
    を備えるキットであって、インドメタシンの有効量が、該前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分である、キット。
  30. 前記前立腺癌薬剤に対する前立腺癌細胞の耐性を逆転させるまたは軽減するのに十分であるニクロサミドの有効量をさらに備える、請求項２９記載のキット。
  31. ニクロサミドを投与するための説明が記載されたラベルをさらに備える、請求項２７または３０記載のキット。
  32. インドメタシンを投与するための説明が記載されたラベルをさらに備える、請求項２８または２９記載のキット。
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