JP2009544679A - 異常な細胞増殖に関連する疾患の治療におけるレチノイド及び小分子のNrf2アンタゴニストとしての使用 - Google Patents
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Abstract
Description
NAD(P)H:キノン酸化還元酵素1(NQO1)、アルド−ケト還元酵素(AKR)ミクロソームエポキシド加水分解酵素、UDP−グルクロノシル転移酵素、ならびに還元グルタチオン(GSH)と共に反応するグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、およびGSHの生合成酵素(グルタミン酸システインリガーゼ(GCL;GCLCおよびGCLMサブユニットを含む)ならびにGSHシンターゼ)などの薬物代謝酵素は、活性酸素種(ROS)だけでなく発癌性親電子性物質からも細胞を保護する(Hayes & Wolf, 1990; Nioi & Hayes, 2004)。この防御は酸化還元ストレッサーに応答してアップレギュレートでき、その結果として細胞が適応し、酸化促進物質および親電子性物質の存在への耐性の獲得を可能にする。その防御は特定の腫瘍においてもまた過剰発現される。これらの遺伝子の誘導は、主としてNrf2(McMahon et al., 2001; Lee et al., 2003)(キャップ・アンド・カラー(cap ’n’ collar)(CNC)塩基性領域ロイシンジッパー(bZIP)タンパク質のファミリーに属する転写因子)によって制御される(Hayes & McMahon, 2001; Motohashi et al., 2002; Kobayashi et al., 2005)。Nrf2は、遺伝子のプロモーター中に抗酸化応答エレメント(ARE、5’−(A/G)TGACNNNGC(A/G)−3’)を含む解毒遺伝子および抗酸化遺伝子の誘導を仲介し(Rushmore et al., 1991; Friling et al., 1992; Nguyen et al., 1994; Wasserman & Fahl, 1997; Sasaki et al.,, 2002; Mulcahy et al., 1997; Erickson et al., 2002; Ikeda et al., 2002; Kepa et al., 2003; Nioi, et al., 2003; Jowsey et al., 2003);AREは文献中で時々親電子性物質応答エレメント(EpRE)とも呼ばれている。細胞が有害な環境要因に抵抗する能力の制御におけるNrf2についての重要な役割は、Nrf2ノックアウトマウス(Itoh et al., 1997)が、高酸素誘導性肺損傷(Cho et al., 2002)たばこ煙誘導性肺気腫に感受性を示すこと、および発癌物質を含む毒性生体異物に対して罹病性が増加することを示した研究によって実証された(Aoki et al., 2001; Chan et al., 1999; Enomoto et al., 2001; Iida et al., 2004; Ramos-Gomez et al., 2001)。
a)抗酸化応答を行なうことができる細胞であり、複数の連結したARE配列の下流に位置するレポーター遺伝子を含むAREレポーター遺伝子コンストラクトを含む細胞、をインビトロで提供する工程と;
b)該細胞とスクリーニングされる被検薬剤を接触させる工程と;
c)該薬剤が、被検薬剤が加えられていない細胞に比較して、レポーター遺伝子の誘導を低下できるか、または発現を低下できるかどうかを検出する工程と、を含むスクリーニング方法が提供される。
化学物質および細胞培養
特別の指示の無い限り、化学物質はすべてシグマ・アルドリッチ(Sigma−Aldrich) 社、ドーセット、イギリスから購入した。D.L−スルフォラファンは、LKTラボラトリーズ(LKT laboratories)社(セント・ポール、ミネソタ、アメリカ)から入手した。OTO096463は、メイブリッジ・ケミカル社の化合物ライブラリーの化学的スクリーニングから同定され、ACDコードMFCD00173669下でそれらから利用可能である。HepG2(ヒト肝芽腫)、MCF7(ヒト乳癌)、Hepa1(マウス肝臓癌)およびCHO(チャイニーズハムスター卵巣癌)細胞株は、英国癌研究所(Cancer Research−UK)(ロンドン、イギリス)の細胞サービスから入手した。MCF7細胞のための増殖培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を添加したグルタマックス(glutamax)含有ダルベッコMEMであった。HepG2細胞を、10%のFBSおよび抗生物質を添加したグルタマックス含有ダルベッコMEM中で維持した。Hepa1細胞を、10%FBS、抗生物質、1%非必須アミノ酸および2.5μg/mlウシインスリンを添加したグルタマックス含有ダルベッコMEM中で維持した。CHO細胞を、10%FBS、抗生物質、1%チミジンおよび1%ヒポキサンチンを添加したグルタマックス含有ダルベッコMEM中で維持した。すべての細胞を95%空気および5%CO2中37℃で培養し、3〜4日ごとに継代した。すべての細胞培養のための培地添加物はライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)社、ペーズリー、イギリスから購入した。
ARE−ルシフェラーゼレポータープラスミドを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にSV40プロモーターを含むpGL3−プロモーターベクター(プロメガUK(Promega UK)、サザンプトン、イギリス)を使用して作製した。それらを表1中に要約する。これらのプラスミドは、プロモーター−luc+転写ユニットの上流のNhe1およびXho1の制限部位を介して頭−尾方向で挿入されたARE配列のコピー数が、異なる。ラットGSTA2およびマウスgsta1中に存在するARE(5’−GTGACAAAGCA−3’、下線部の最小の機能性配列を有する)の1、2、4、6または8個のいずれかのコピーを含む5つのプラスミドを作製し;これらはpGL−n×AREと呼ばれた。向かい合った鎖上に5’−CCC3−’および5’−GGG3−’の配列を有するリンカーを、個々のシスエレメントの間に置いた。さらに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動するラットGSTA2遺伝子プロモーターのヌクレオチド−682〜−722の41bp(5’−GAGCTTGGAAATGGCATTGCTAATGGTGACAAAGCAACTTTG−3’、最小の機能性エンハンサーは下線で示される)を表わす、pGL−GSTA2AREと命名されたプラスミドを作製した。マウスgsta1において、この配列は5’−TAGCTTGGAAATGACATTGCTAATGGTGACAAAGCAACTG−3’である(Hayes & Pulford, 1995)。オリゴヌクレオチドは、MWG−バイオテック(BIOTECH)社(エバーセルク(Eberserg)、ドイツ)によって合成された。プラスミドを作製した後、インサートのDNA配列を検査した。
デュアルルシフェラーゼのレポーターアッセイ系(プロメガ社)を一過性にトランスフェクションした細胞におけるレポーター遺伝子活性を検査するために使用した。簡潔には、細胞を24ウェルプレートにおいて2×105細胞/ウェルの密度で播種し、適切な培地中で増殖させた。一晩のインキュベーション後に、細胞に、様々なARE−ルシフェラーゼレポータープラスミドを一過性にトランスフェクションした。プラスミドpRL−TK(ウミシイタケ属ルシフェラーゼをコードする)を、トランスフェクション効率に対する対照に使用した。トランスフェクションは、製造者の使用説明書に従って、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000試薬(リファー・テクノロジーズ(Lifer Technologies)社、コベントリー、イギリス)を使用して実行した。トランスフェクションに続いて、培養液を、各実験の直前に調製された50μMのtBHQ(最終濃度0.1%v/vのジメチルスルホキシド(DMSO)を与える溶液において)を含む新しい増殖培地で24時間後に置換した。対照実験のために、媒質単独(0.1%v/v DMSO)を増殖培地へ加えた。細胞を採取前に生体異物へ応答するように24時間放置し、細胞溶解物中のホタルおよびウミシイタケ属のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬II(プロメガ社)の追加後に、照度計(ターナー・デザインズ(Turner Designs)、モデルTD−20/20、プロメガ社)を使用して測定した。反応のクエンチング後に、ストップアンドグロー(Stop & Glo)試薬(プロメガ)を加えることによってウミシイタケ属ルシフェラーゼ反応を開始した。ウミシイタケ属ルシフェラーゼ活性に対してホタルルシフェラーゼ活性を正規化することによって、相対的なルシフェラーゼ活性を計算した。
pGL−8×AREを、ネオマイシンにより選択可能なマーカーを含むpCDNA3.1プラスミドと一緒に、リン酸カルシウム法を使用して、MCF7細胞の中へ安定的にトランスフェクションした(Moffat et al., 1997)。トランスフェクションされた細胞を、3〜4週間培地中の0.8mg/mlのG418を使用して選択した。G418耐性クローンは、基底ルシフェラーゼ活性、および誘導性ルシフェラーゼ活性(50μMのtBHQによって)の測定によって分離およびスクリーニングした。上述されるように、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。陽性のクローン(それらは低いバックグラウンドおよび高い誘導性ルシフェラーゼ活性を示す)を継代し、0.8mg/mlのG418を含む増殖培地中で維持した。
BCNUおよびメルファランを1000×濃縮溶液として酸性化エタノール中に溶解した。ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサートおよびパクリタキソールを、リン酸緩衝生理食塩水中に溶解した。他の抗癌剤をDMSO中の1000×濃縮ストック溶液として調製し、使用まで−20℃で保存した。抗癌剤による処理のために、細胞を、増殖培地において1.2×104細胞/ウェルの密度で96ウェルマイクロタイタープレート中に播種した。一晩の回復後に、培養液を、対象となる抗癌剤と共に抗生物質添加済みの新しいダルベッコMEMで置換した。等容積の媒質を対照ウェルへ加えた。24時間の処理後に、上述されるように、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
トランスフェクションのために、AREc32細胞を、100μl増殖培地において1.5×104細胞/ウェルで96ウェルプレート中に播種した。一晩の回復後に、リポフェクタミン2000試薬を使用して、25〜100ng/ウェルのpHyg−EF−hNrf2ベクターまたはpEGFP−N1ベクターを、細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後の4時間の回復期間に続いて、培養液を、グルタマックスおよび10μMのtBHQ(またはDMSO単独)を含む抗生物質添加済みの新しいダルベッコMEMで置換した。等容積のDMSOを対照ウェルへ加えた。最終的に、tBHQによる24時間の処理後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
pRS hNrf2(ヒトNrf2を標的とするpSUPER RNAiベクター)を、スーパー(SUPER)RNAi(商標)ライブラリー(オランダ癌研究所(Netherlands Cancer Institute)、アムステルダム、オランダ)のグリセロールストックから回収した。この研究において使用されるpRS−hNrf2中のオリゴインサートの配列は、hNrf2 cDNAの2083〜2101(ナンバリングはATG開始コドン中のAからである)の領域に対応する、5’−GCATTGGAGTGTCAGTATG−3’であった。GFPを標的とするpSUPER RNAiベクター(pRS−GFP)も、スーパーRNAi(商標)ライブラリーから得て、陰性対照として使用した。
統計比較を対応のないスチューデントのt検定によって実行した。p<0.05の値が有意であると統計的に判断された。
機能的なARE駆動性レポータートランス遺伝子を発現する安定した細胞株の作製
この研究において、ラットGSTA2遺伝子およびマウスgsta1遺伝子のプロモーターに共通のシスエレメントの1、2、4、6または8個のいずれかのコピーを含む一連のARE−ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製した。ARE配列を表1中にリストする。これらのレポーターコンストラクトを、MCF7細胞およびHepG2細胞における一過性トランスフェクションによって検査した。図2中に示されるように、pGL3のプロモーター中のAREのコピー数を増加させることは、通常の恒常的条件下で観察されるルシフェラーゼ活性の基底レベルに対して有意な効果はなかった。しかしながら、MCF7細胞におけるpGL3プロモーターベクター中のAREコピーの数とtBHQによるルシフェラーゼ活性の誘導のレベルとの間には十分な相関性があった。これらの結果から、ラットGSTA2−AREの複数のコピーのトランスフェクションが、tBHQ処理に対するレポーター遺伝子活性(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)の感受性を増加させたことを実証したNguyen et al., 1994)の結果が確認される。
AREc32細胞におけるルシフェラーゼ活性がNrf2に対して応答したものであることを確認するために、このCNC bZIPタンパク質を、発現コンストラクトpHyg−EF−hNrf2の一過性トランスフェクションによってAREc32細胞において過剰発現させた。図3中に示されるように、10μMのtBHQを処理したときにDNAがトランスフェクションミックス中に含まれない対照細胞では、ルシフェラーゼ活性は13倍誘導された。1ウェルあたり25ngのpHyg−EF−hNrf2プラスミドDNAを使用したときには、基底ルシフェラーゼ活性も誘導性ルシフェラーゼ活性も有意に影響されなかった。しかしながら1ウェルあたり50ngのpHyg−EF−hNrf2によるトランスフェクション後には、ルシフェラーゼ活性の基底レベルは2.6倍に増加し、誘導性レベルは19倍に増加した。100ngのpHyg−EF−hNrf2によるトランスフェクション後には、レポーター遺伝子基底活性は4倍に、および誘導性レベルは25倍に増加した。異なるウェルにおいて、同量のpEGFP−N1(EGFP発現ベクター)を、陰性対照としてAREc32細胞の中へトランスフェクションした。基底のルシフェラーゼ活性も誘導性ルシフェラーゼ活性も、EGFPの過剰発現によっては有意に影響されなかった。
AREc32細胞におけるルシフェラーゼ活性は時間依存的および用量依存的様式で誘導することができ;24時間間処理後に、ルシフェラーゼ活性は1μMのtBHQによって2倍および5μMのtBHQによって5倍増加した(図4Aおよび表3を参照)。最大ルシフェラーゼ活性(約10倍の増加)は、10μMのtBHQによる処理後に観察された。tBHQによるルシフェラーゼ活性の誘導は時間依存的でもあり;それは、10μMのtBHQによる8時間の処理後に4倍増加し、同一用量のtBHQによる処理の18時間後に10倍に達した。AREc32細胞におけるルシフェラーゼ活性の誘導の同様の大きさは、10μMスルフォラファン(SUL)(NQO1およびAKR1Cの強力な酵素誘導因子)に対する24時間の暴露後に観察された(Bonnesen et al., 2001)。
癌化学療法剤がNrf2−ARE系を修飾するかどうかを知るために、多数の抗癌剤をAREc32細胞を使用してスクリーニングした。IC50の結果に基づいて(データ不掲載)、AREc32細胞を致死未満用量の複数の治療剤により24時間処理した。ルシフェラーゼ活性に対するそれらの効果に従って、これらの薬物を3つの群へと表4中で分類した:有意な効果はないもの、中等度の活性化剤、および強力な活性化剤である。したがって、ドキソルビシン、エピルビシン、パクリタキソール(タキソール)、メトトレキサートおよびチオテパの処理は、AREc32細胞におけるルシフェラーゼ活性レベルに対して効果がなかった。アルキル化剤シスプラチン、メファラン(mephalan)および酸化還元サイクル化合物エトプシドは、中等度にルシフェラーゼ活性を増加させた。アルキル化剤のクロラムブチル、ミトザントロンおよびBCNUによるAREc32細胞の処理は、2〜4倍のルシフェラーゼ活性のより強力な誘導を誘発した。
細胞のGSHレベルが、抗癌剤によるルシフェラーゼ活性の活性化能力に対する効果を有するかどうかを調べるために、我々は、化学療法剤を投与する前に、50μMのBSOでAREc32細胞を24時間前処理した。図5Aに示されるように、BSOによる前処理は、シスプラチンおよびメルファランによるルシフェラーゼ活性の誘導をそれぞれ3倍および5倍に増加させた。より顕著に、BSOは、クロラムブチルおよびBCNUによるルシフェラーゼ活性の誘導を>10倍に増加させた。そのような誘導は、約5mMのNACの追加によって完全に抑制された(図5A)。エトプシドおよびミトザントロンの処理については、BSO前処理がルシフェラーゼ活性を有意に変化させないことが明らかにされた(データ不掲載)。
ルシフェラーゼトランス遺伝子の発現を指令するために最小のエンハンサー配列のみが存在する、安定したAREレポーターヒト乳腺細胞株(MCF7細胞に由来するAREc32)を作製した。この目的のために用いられるAREは、ラットGSTA2およびマウスgsta1の両方のプロモーターで見出されるものの付近にデザインされた。gsta1の場合、その基底発現および誘導性発現はインビボのNrf2によって調節されることが示された(Chanas et al., 2002)。さらに、ヒトNQO1中のプロモーターとは異なり、GSTA2およびgsta1のプロモーターは組み込まれているAP1部位を含んでおらず、ARE内にこの部位が存在しないことがレポーター遺伝子活性の誘導の実行を促進するので、GSTA2およびgsta1のプロモーターからのAREを使用した。AREc32細胞において、ルシフェラーゼ活性の発現はNrf2によって仲介され、酸化還元状態に対して感受性のあることが示された。この細胞株は、10μMのtBHQによってレポーター活性が10倍誘導され、したがってNrf2のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための化学的ライブラリーのスクリーニングに使用できる十分なモデル系を提供する。
本研究において、ARE駆動性遺伝子発現を誘導する抗癌性アルキル化剤の能力を検討するために、AREc32細胞を使用した。シスプラチン、エトポシド(VP16)、ミトザントロン、メルファラン、クロラムブチルおよびBCNUが、ルシフェラーゼを誘導できることが明らかになった。これらの化学療法剤によるARE−ルシフェラーゼの誘導は、それがBSO前処理によって増大され、NACによって抑制される場合、酸化還元感受性であることが見出された(図5A)。興味深いことには、このことは、特定の抗癌剤による患者の準最適の治療は、Nrf2によって制御される腫瘍において、細胞保護防衛を誘導することを示唆する。更に、腫瘍における細胞の酸化還元状態は、そのような防衛を活性化するそれらの能力に影響を及ぼすだろう。
化学物質
AREc32細胞の処理において使用されるレチノイドはDMSO中に調製され、マウスに対して投与されるレチノイドはトウモロコシ油中に調製された。レチノイド溶液は小分けにして−70℃で保存し、各々を解凍した後は1回だけ使用した。レチノイドの投与に関係する実験手順は、薄明かりで実行した。
ホモ接合Nrf2 KOマウスおよびマウスの遺伝子型決定は、以前に記述した通りであった(Itoh et al., 1997)。2か月のC57BL/6 nrf2-/-およびnrf2+/+のオスマウスをこの研究で使用した。動物は餌および水を自由に摂取させて12時間の明暗サイクルで飼育した。マウスは実験期間の間毎日体重測定した。すべての動物手順は、イギリス内務省のライセンス下で、および地方倫理委員会の承認取得後に行なわれた。
上の材料および方法セクション中で記載されるようにAREc32細胞を調製し、95%空気および5%CO2において37℃で0.8mg/mlのG418を含む増殖培地(10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質添加済みのグルタマックス含有ダルベッコMEM)で維持し、3〜4日ごとに継代した。細胞培養のための培地添加物はライフ・テクノロジーズ社(ペーズリー、イギリス)から購入した。
全RNAをトリゾール(TRIzol)により単離し、製造者の使用説明書に従ってRNイージー(RNeasy)ミニキット(キアゲン(Qiagen) 社)によりさらに精製した。使用される全RNAのA260/A280比は典型的には≧1.9であった。RNAの質はアジレント(Agilent)2100バイオアナライザーを使用して評価した。以前に記述したようにRT−PCRを実行した(Wang et al., 2005)。プライマーはMWG−バイオテック社によって合成された。プローブ(5’蛍光レポーター色素(6−カルボキシフルオレセイン)および3’クエンチング色素(6−カルボキシテトラメチルローダミン)で標識された)は、キアゲン社(ドイツ)によって合成された。各アッセイは三回行った。オリゴヌクレオチドプライマーの様々なセットからのPCR増幅の特異性を、アガロースゲル電気泳動によってルーチンに調べた。結果は7700システムソフトウェアの使用によって分析した。18S rRNAのレベルを内部スタンダードとして使用した。ヒトAKR1CのmRNAへ対応するcDNAの測定のためのプライマーおよびプローブに対する配列は以前に記述されている(Devling et al., 2005)。
全細胞の抽出物は以前に記述したように培養細胞から調製した(Wang XJ 2006)。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社)を追加した0.1Mヘペス(pH 7.4)、0.5M KCl、5mM MgCl2、0.5mM EDTA、20%グリセロールを含む抽出緩衝液中で、細胞を溶解した。タンパク質サンプル(30μg)を、標準的なプロトコールを使用してSDS−PAGEゲルで分離した。以前に記述したように、AKR1Cに対して作製された抗血清を使用してイムノブロットを実行した(O'Connor et al., 1999)。以前に記述したように、小腸サイトゾルを調製した(McMahon et al., 2001)。小腸サンプルからの5μgのタンパク質をSDS−PAGEによってルーチンに分離した。NQO1およびGSTのタンパク質レベルを推定するために、ウェスタンイムモブロッティング(immumoblotting)を実行した。使用する一次抗体の供給源は以前に記述されている(Hayes et al., 2000; Kelly et al., 2000)。すべての場合において、等量のローディングを確認するために、アクチン(シグマ社)に対する抗体によるイムノブロットを実行した。
EMSAのために使用する核抽出物を別記された手順に従って調製した(Moffat et al., 1997)。[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識した二本鎖DNAプローブ(ARE、5’−GAGCTTGGAAATGGCATTGCTAATGGTGACAAAGCAACTTTG−3’[下線はコア配列])を、以前に記述したように、ゲルシフト解析のために使用した(Moffat et al., 1997)。いくつかの分析において、結合の特異性を、標識プローブを加える前に、反応混合物へ200倍モル過剰の未標識オリゴヌクレオチドを加えることによって実行される競合実験によって測定した。サンプルを4%ポリアクリルアミドゲルにおいて100Vで分離した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーを行なった。
以前に記述したように、プルダウンアッセイのために使用する核抽出物を調製した(Deng et al., 2003)。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤混合物(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)を追加した10mMヘペス(pH 8.0)、1.5 mM MgCl2、200mMショ糖、0.5%ノニデットP−40、10mM KCl、0.5mMジチオトレイトール、0.1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、1mM EGTAを含む、パック細胞2容積分の緩衝液A中で5分間4℃にてAREc32細胞を溶解した。粗製の核をミクロ遠心によって回収し、パック細胞3容積分の緩衝液B(PBS(pH.7.4)、1.0mM EDTA、1.0mMジチオトレイトールに加えて緩衝液A中のプロテアーゼ阻害剤および脱リン酸化酵素阻害剤)中に再懸濁した。次に核を4℃で超音波処理によって破壊し、続いて残屑を除去するためにミクロ遠心を行なった。核抽出物タンパク質を含む上清を回収し、−70℃で保存した。
統計比較は対応のないスチューデントのt検定によって実行した。pの値<0.05は有意であると統計的に判断された。
オールトランスレチノイン酸によって誘導可能なARE駆動性遺伝子発現のアンタゴナイズ作用
MCF7−AREレポーター細胞株は、tBHQ、アクロレイン、β−ナフトフラボン(NF)およびスルフォラファンを含む、AREを活性化することが公知である多数の化合物により処理された。期待されるように、これらすべての誘導剤はAREc32細胞におけるルシフェラーゼ活性を増加させた(図6)。しかしながら1μMのATRAの存在下でtBHQ、アクロレイン、NFおよびスルフォラファンによるAREc32細胞の処理は、誘導剤によって影響を受けるARE駆動性ルシフェラーゼ活性における増加を有意に弱めた。実際は、得られた値からDMSO対照を引いた後は、ルシフェラーゼ活性はほとんど完全になくなった。続いて行なわれる実験において(図7Aにおいて示される)、ARE駆動性応答の阻害のレチノイン酸濃度に対する依存性、およびさらに他のレチノイド誘導体がARE応答を阻害する能力を検討した。興味深いことには、すべての3つのレチノイドは、同様の用量依存的様式(IC50値はおよそ3×10-7Mである)でARE応答を阻害した。すべてのこれらの3つのレチノイド誘導体がほぼ等しい力価でレチノイン酸受容体に結合することが知られており、これが観察された応答を仲介することを示唆する。さらに、レチノイン酸によるルシフェラーゼ活性の阻害の時間依存性を測定した。図7Bにおいて示されるように、およそ3時間の遅滞期後に、tBHQ処理した細胞におけるルシフェラーゼ活性は、24時間の期間にわたりほとんど直線的に増加した。しかしながら、AREc32細胞をtBHQおよびATRAにより同時に処理したときに、遅滞期は3時間から16時間に増加し、その後ルシフェラーゼ活性は16〜24時間の間緩やかに増加したのみであった。
レチノイン酸がAREを介して調節される内在性遺伝子の発現を阻害できるかどうかを立証するために、tBHQによるAKR1C1遺伝子の誘導に対するATRAの効果を研究した(図8A)。この実験において、tBHQはほぼ15倍までAKR1C1のmRNAの発現を誘導し、この誘導はレチノイン酸との共インキュベーションによって著しく抑制された(たった3倍の誘導まで)。DMSO対照を引いた後に、阻害はおよそ85%であると推測された。次にウエスタンブロット分析によってAKR1Cタンパク質の誘導に対するATRAの効果を研究した。図8B中に図に示すように、このタンパク質のレベルもまた著しく減少した。ウエスタンブロットのスキャニングからこの減少がおよそ50%であることが示され;タックマンとイムノブロットのデータとの間のこの見かけ上の相違は、AKR1C1に対して作製された抗体がAKR1C2および恐らくAKR1C3と交差反応するので、恐らくこの抗体は特異性を欠くものであるためである。
一連の抗癌剤によりレチノイン酸がNrf2調節遺伝子の誘導を阻害できるかどうかを決定するために、さらなる実験を実行した(図10)。抗癌剤のうちで、シスプラチン、メルファランおよびクロラムブチルは、ARE駆動性遺伝子発現の弱い誘導因子であった(表4)。それに比べれば、BCNUはより強力な誘導剤であった。これらの抗癌剤の各々によるARE駆動性ルシフェラーゼ活性の誘導は、化学療法剤と共にATRAが培地中に含有されることにより阻害された(図10A)。グルタチオン除去剤L−ブチオニン−S,R−スルホキシミン(BSO)でAREc32細胞を24時間前処理することによって、これらの薬剤によるルシフェラーゼ活性の誘導を著しく促進でき、実際これらの条件下で使用される抗癌剤のすべてはAREレポーターの効率的な誘導因子であり;BCNUおよびクロラムブチルは10〜15倍の間で誘導する。これらの実験のすべてにおいて、ATRAはAREの誘導の強力な阻害剤であった。これは特に、細胞が50μMのBSOにより前処理されたときに、DMSO対照値を引いた後のARE応答がほとんどバックグラウンドレベルまで減少した実験のケースであった。これらのデータは、現在使用される抗腫瘍薬剤により誘導されたARE応答を、レチノイン酸が減ずる能力を有することを実証する。
レチノイン酸がその抑制効果を発揮するメカニズムを確立するために、Nrf2の核濃度がこの化合物の存在下で変化するかどうかを調べた。しかしながら、これはそうでないことが見出された(図11)。したがって、bZIP因子を不安定にすること、またはその核移行を阻害することのどちらによっても、ATRAが遺伝子発現のNrf2仲介性誘導をアンタゴナイズしないことが結論される。
上述されたデータは、レチノイン酸およびその各種誘導体がモデル誘導剤によるARE駆動性遺伝子発現の誘導をアンタゴナイズすることを示す。更に、ARE駆動性遺伝子発現のこのアンタゴナイズ作用は比較的低用量(すなわち10-7M)のATRAを必要とし、レチノイドはNrf2活性の強力な阻害剤であることが示唆される。抗癌剤によるARE駆動性遺伝子の誘導もまたATRAがブロックするという結果は、腫瘍が化学療法に応答して細胞保護遺伝子のスイッチを入れることを、レチノイドが阻害するということを示唆する。したがって、レチノイドは、それらが薬剤と共に共投与されるならば、抗癌剤が治療上より効果的であることを可能にする。
さらなる実験を行ない、それらの結果を図14〜25中で示す。各実験のための方法および結果を以下に記述する。
最小のエンハンサー配列の5’− A/GTGACnnnGCA/G−3’(様々なレポーターコンストラクトについてインサート内で単一または複数のコピーとして存在する)を、下線で示す。
MCF7、HepG2、CHOおよびHepa1細胞を1×105細胞/ウェルで24ウェルプレート中に播種し、pGL−GSTA2.41bp−AREコンストラクトでトランスフェクションした。プラスミドpRL−TKを各トランスフェクションにおいて内部対照として使用した。使用される細胞を50μMのtBHQで処理し、材料および方法中で詳しく述べられるように、ルシフェラーゼレポーター活性を決定した。対照実験のために、同一体積のDMSOを培地へ加えた。DMSOで処理したHepG2細胞の相対的なルシフェラーゼ活性の値を1に設定した。これは3つの独立した実験の結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも3つの重複測定がある。
細胞を増殖培地において1.2×104細胞/ウェルで96ウェルプレート中に播種した。24時間の回復後に、培養液を以下に様々な濃度のリストされた化合物を含む抗生物質添加済みの新しいDMEMで置換した。次に細胞を24時間インキュベートし、材料および方法中で詳しく述べられるようなルシフェラーゼ活性についてアッセイした。DMSO(0.1%v/v)で処理した細胞のルシフェラーゼ活性の値を1に設定した。提供された結果は3つの独立した実験からの結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも3つの重複測定がある。
材料および方法中で詳しく述べられるように、処理は24時間であった。対照細胞については、同一体積の0.1%(v/v)の媒質を培地へ加えた。抗癌剤へ暴露した培養とDMSOで処理した培養からのルシフェラーゼ活性との間の差の有意性は、対応のないスチューデントのt検定により評価した。これは3つの独立した実験の結果を表わす。(*)p<0.05。a対照値と比較した増加の平均(倍)±標準偏差として表現されたデータ。
Claims (41)
- 治療法で使用される医薬品の製造のための、Nrf2遺伝子活性をダウンレギュレートできる薬剤の使用。
- 前記薬剤が、Nrf2による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートする、請求項1に記載の薬剤の使用。
- 1つまたは複数の前記遺伝子がARE遺伝子経路に関連する遺伝子であり、その発現がNrf2によるトランス活性化の減少によってダウンレギュレートされる、請求項2に記載の使用。
- 前記医薬品が異常な細胞増殖に関連する疾患を治療するためのものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤が単独で投与されることが意図される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記医薬品が、細胞毒性剤、アルキル化剤、酸化還元サイクル剤、チオール活性化薬、GSH合成の阻害剤、またはアポトーシス誘導剤からなる群から選択される他の薬剤をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 治療される被験体が、UV電離放射線または光力学療法によって治療される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 治療される前記疾患が癌または乾癬である、請求項3〜7のいずれか一項に記載の使用。
- レチノイドがNrf2遺伝子活性をダウンレギュレートし、それによってNrf2が防御程度を高める抗増殖剤の感受性を増加させる、請求項9に記載の使用。
- 前記医薬品が、レチノイドによって感受性を高められた細胞の細胞死を誘導できるさらなる薬剤をさらに含む、請求項9または10のいずれか一項に記載の使用。
- 前記さらなる薬剤が、アルキル化剤または酸化還元サイクル剤などの化学療法剤である、請求項11に記載の使用。
- レチノイドが、Nrf2による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートする、請求項9〜12のいずれか一項に記載の使用。
- レチノイドが、オールトランスレチノイン酸、9−シスレチノイン酸、13−シスレチノイン酸、レチナールまたはレチノールである、請求項9〜13のいずれか一項に記載の使用。
- レチノイドおよび化学療法剤などのNrf2活性をダウンレギュレートできる薬剤を活性成分として含むか、またはそれらから本質的にはなる、医薬組成物。
- 前記化学療法剤がアルキル化剤または酸化還元サイクル化合物である、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記化学療法剤が、シスプラチン、メルファラン、クロラムブチル、ミトロザントロン(mitrozantrone)、BCNU、チステパ(thistepa)、ドキソルビシンまたはブレオマイシンである、請求項17に記載の医薬組成物。
- GSH産生またはチオレドキシン産生を阻害する、BSOなどの酸化還元制御剤をさらに含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞毒性またはアポトーシスに対して細胞の感受性を高めることに使用される、ARE駆動性遺伝子発現の誘導を直接的または間接的にダウンレギュレートする薬剤についてスクリーニングする方法であって、
a)抗酸化応答を行なうことができる細胞であり、下流に位置するレポーター遺伝子を含み複数の連結されたARE配列によって制御されるAREレポーター遺伝子コンストラクトを含む細胞、をインビトロで提供する工程と;
b)該細胞とスクリーニングされる被検薬剤を接触させる工程と;
c)該薬剤が、被検薬剤が加えられていない細胞に比較して、レポーター遺伝子の誘導を低下できるか、または発現を低下できるかどうかを検出する工程と、
を含むスクリーニング方法。 - 異常な細胞増殖に関連する疾患の治療で使用する薬剤の同定のための請求項20に記載の方法。
- 前記疾患が癌または乾癬である、請求項21に記載の方法。
- 前記被検薬剤がNrf2活性を阻害する能力についてもまた検査される、請求項20〜22のいずれかに記載の方法。
- 使用される前記ARE配列がラットGSTA2遺伝子および/またはマウスgstal遺伝子からである、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が抗酸化応答を行なうことができる哺乳類の細胞である、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がMCF7細胞である、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の誘導が活性化剤の追加によって促進される、請求項20〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化剤が、tBHQなどのキノン、およびスルフォラファンなどのイソチオシアメート(isothiocyamate)、マレイン酸ジエチルなどのα,β−不飽和カルボニル、またはβ−ナフトフラボンなどのフラボノイド、または1−シアノ−2,3−エピチオプロパンなどのエピチオアルカン、またはリポ酸などのジ−メルカプタンである、請求項28に記載の方法。
- Nrf2が、アンチセンスまたはRNAiの技術を使用してKeaplの発現をダウンレギュレートすることによって、または変異Keapl遺伝子を含む細胞内で、活性化される、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- Nrf2が、Bach1、Bach2、cFosおよび小Mafなどの負に作用する競合転写因子の発現をダウンレギュレートすることによって活性化される、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- レポーター遺伝子が、GFPおよび関連した蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホソファターゼ(phosophatase)または任意のアッセイ可能なホルモンもしくは酵素である、請求項20〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の産物の検出が、比色アッセイ、蛍光アッセイ、発光アッセイ、放射免疫アッセイまたは免疫学的アッセイによって実行される、請求項20〜32のいずれか一項に記載の方法。
- レポーター活性のレベルまたは程度を確認するために、被検薬剤の不在下で比較実験または対照実験が実行される、請求項20〜23のいずれかに記載の方法。
- 細胞が、ラットGSTA2および/またはマウスgstal遺伝子からのARE配列の複数の連結したコピーの下流にレポーター遺伝子を含むAREレポーターコンストラクトを含むヒト乳腺MCF7細胞である、ARE駆動性遺伝子発現に対する効果についてのスクリーニング薬剤で使用される細胞。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項20〜35のいずれか一項に記載の方法または細胞。
- 複数の連結した前記ARE配列が、レポーター遺伝子の上流に頭−尾で連続して位置する、請求項20〜36のいずれか一項に記載の方法または細胞。
- コピー数が6〜8である、請求項36に記載の方法または細胞。
- 被験体へNrf2による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートできる薬剤の有効量を投与する工程を含む、異常な細胞増殖に関連する疾患に罹患する患者を治療する方法。
- 細胞死を引き起こすかもたらすことができるさらなる薬剤を投与することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 異常な細胞増殖に関連する疾患に罹患する患者を治療する方法であって、ARE駆動性遺伝子発現を減少させることができる量のレチノイド、および異常な細胞増殖を減少させることができる量のさらなる薬剤を被験体へ投与する工程を含み、レチノイドが異常な増殖細胞のさらなる薬剤に対する感受性を増加させる役目をする方法。
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