CN102264916B - 新的癌基因nrf2 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可用作mTOR相关抗癌剂的功效预测或预后预测的指示物的标志物，及新的抗癌剂。本发明提供用于癌症药物的功效评估的方法，特别是检测NRF2异常来预测mTOR相关癌症药物的功效的方法。另外，本发明提供用于癌症的预后预测方法，特别是通过检测NRF2异常来预测癌症的预后的方法。另外，本发明提供新的靶向NRF2的抗癌剂。

Description

新的癌基因NRF2
发明领域
本发明涉及癌症药物的的功效预测、癌症的预后预测、及癌症治疗的领域。更具体的说，本发明涉及以检测NRF2异常为手段的mTOR相关癌症药物的功效预测方法；以检测NRF2异常为手段的癌症预后预测方法；及抑制NRF2基因或蛋白质的癌症治疗剂。
发明背景
已知环境因素诸如吸烟、辐射、由病毒感染引起的慢性炎症等，及暴露于有毒化学物质影响癌症的发作和发展。先前的研究揭示了由引起DNA和蛋白质异常的因素导致的氧化应激与癌症的发展有关。
活生物体具有针对此类氧化应激的生理学防御机制。一种被称作核因子erythroid 2相关因子2(NRF2)的转录因子被认为是在该生理学防御系统的分子机制中发挥作用的重要分子之一。NRF2是一种具有高转录诱导能力的DNA结合分子，其在细胞暴露于氧化应激时被激活，而且诱导多组酶表达(诸如减轻氧化应激的谷胱甘肽还原酶)来保护细胞免于由应激引起的失调。
例如，已知NRF2是将启动信号传递给抗氧化应答元件(ARE)成分的重要转录因子，ARE是控制保护细胞免于致癌物、氧化剂、和其它有毒化合物作用的基因产物转录的DNA调节元件。有人报告，一种由ARE介导的、具有抑制性活性的增强因子可提高核中的NRF2水平(参见Yuesheng et al.MolecularCancer Therapeutics，3(7)885-893，2004)。在苯并-α-吡喃的口服施用模型中，NRF2敲除小鼠中的癌症数目表现出与野生型相比增多(参见Ramos-Gomez etal.Proc.Natl Acad.Sci.USA，98，3410-3415，2001)。另外，文献提示抗癌剂奥体普拉提高NRF2表达，而且在NRF2敲除小鼠中未观察到奥体普拉的抗癌效果，如此，NRF2表达增强可导致抗癌效果。
另外，报告了在活的生物体中，NRF2的存在受Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP1)的负反馈控制，而且人们正在开发KEAP1抑制剂作为抗癌剂(参见Ewan，Drug Discovery Today，10(14)950-951，2005)。因此预期增强NRF2表达的靶向NRF2或KEAP1的药物可用作抗癌剂。
另一方面，报告了在肺癌中，观察到NRF2因KEAP1活性降低(由KEAP1基因突变引起)而持续激活，而且激活的NRF2诱导抗氧化蛋白持续表达。报告了NRF2表达升高可能是癌细胞对顺铂的抗性的原因之一(参见Ohta et al.Cancer Res.，68，1303-1309，2008和国际公开文本WO2006/128041)。还报告了使用顺铂、美法仑、苯丁酸氮芥和BCNU等烷化剂可提高受ARE调节的基因诸如NRF2的表达。有人提出受ARE调节的基因表达产物增多可能涉及癌细胞对抗癌剂的抗性。还提出能结合NRF2的所有反式视黄酸(ATRA)可能能够增强化疗药物的效果(参见国际公开文本WO2008/012534)。
如此，施用烷化抗癌剂似乎可激活NRF2，而且NRF2可能在针对烷化抗癌剂的抗性中起作用。烷化抗癌剂通过交联癌细胞中DNA的碱基来破坏增殖。施用烷化剂后NRF2激活的机制仍然有待解释。虽然根据NRF2的细胞保护作用可以推测NRF2导致针对烷化抗癌药物效果的抗性获得的一部分机制，但是总体机制尚未完全阐明。尚未报告烷化抗癌剂以外的抗癌剂与NRF2之间的关系。
如上所述，人们认为在癌细胞中观察到的NRF2激活主要是基于KEAP1基因突变而导致的KEAP1活性降低。尚不知道癌细胞中突变与NRF2激活之间的关系，及NRF2因突变而激活与癌症的恶性改变之间的关系。尤其是，人们认为NRF2在由氧化应激等引起的癌症发作中具有抗癌效果。认为NRF2相当遏制癌症的恶性改变。关于化疗剂，有人提出NRF2对施用烷化剂有响应，而且至少全反式视黄酸增强烷化剂的效果。然而，完全不清楚全反式视黄酸的效果是否基于NRF2遏制效果，而且，如果是的话，也不知道这种抑制作用背后的机制。因此，全然不知道NRF2遏制与烷化抗癌剂以外的抗癌剂之间的关系。
雷帕霉素的哺乳动物靶物(mTOR)是一种丝氨酸苏氨酸激酶，它被鉴定为大环内酯抗生素雷帕霉素的靶分子，并且充当细胞生长、细胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白质合成和转录的调节物。由于雷帕霉素诱导缺乏p53功能的癌细胞凋亡，因此认为mTOR抑制剂具有抗癌活性(参见Shile Huang etal.Molecular Cell，11，1491-1501，2003)。另外，mTOR抑制剂正在作为抗癌剂进行开发，用于例如肾癌和胰腺导管癌。
还知道mTOR是一种胰岛素受体酪氨酸激酶。一项关于高血糖患者中脑血管内皮细胞凋亡的研究的结论称，mTOR抑制剂可阻碍人脑血管内皮细胞的胰岛素诱导性NRF2介导型谷氨酸-L-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLc)的表达、氧化还原平衡、及存活(参见Okouchi，Masahiro et al.CurrentNeurovascular Research，3(4)249-261，2006)。然而，尤其是就癌症治疗领域而言，NRF2表达对mTOR抑制剂作用的影响尚未有人报告。
发明概述
本发明涉及一种通过检测NRF2基因突变来预测癌症的方法。尤其是，本发明涉及一种预测mTOR相关癌症药物的功效的方法、一种通过检测NRF2基因突变来选择有效患者的方法、或一种预测癌症预后的方法。本发明还涉及通过抑制NRF2基因或NRF2蛋白质来治疗癌症的方法，或使用NRF2基因或NRF2蛋白质抑制剂作为活性组分的癌症治疗剂。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及通过检测NRF2基因突变或蛋白来提供有关mTOR相关癌症药物的功效预测方法的信息的方法，或者通过检测NRF2基因突变或蛋白来选择有效患者的方法。另外，本发明涉及通过检测NRF2基因或蛋白突变来预测mTOR相关癌症的药物的有效性或选择有效患者的方法。具体而言，本发明涉及一种用于预测mTOR相关癌症药物在NRF2基因或蛋白具有突变时有效的方法。本发明还涉及一种能够检测NRF2中的突变，用于预测mTOR相关癌症药物的有效性的试剂盒。例如，本发明涉及包含能够结合NRF2基因的核酸或能够结合NRF2蛋白质的物质(例如抗体)的试剂盒，其中该核酸和该物质能够检测NRF2中的突变。或者，本发明涉及一种能检测NRF2因突变而发生的功能改变的试剂盒。例如，本发明还涉及一种检测KEAP1对NRF2的消化的试剂盒。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种通过检测来自癌症患者的癌组织细胞中的NRF2中的突变来提供关于癌症的恶性或关于预后质量的信息的方法。或者，本发明涉及一种诊断癌症恶性或预测癌症预后的方法，其包括检测来自癌症患者的癌组织细胞中NRF2中的突变，并将NRF2中具有突变的患者诊断为恶性，或将NRF2中具有突变的患者预测为预后不良。或者，本发明涉及一种用于诊断癌症或预测预后的试剂盒，其能够检测NRF2中的突变。例如，本发明涉及一种包含能够结合NRF2基因的核酸或能够结合NRF2蛋白质的物质(诸如抗体)的试剂盒，其中该核酸和该物质能够检测NRF2中的突变。另外，本发明涉及一种能够使用基因扩增技术(诸如PCR)检测突变的试剂盒。例外，本发明涉及一种包含入侵探针(invader probe)、等位基因探针(allele probe)、三链体特异性DNA酶、和通用荧光标记探针及淬灭探针的试剂盒，例如Invader(TM)测定试剂盒等。另外，本发明包括一种能够测量由突变引起的NRF2功能变化(metergasia)的试剂盒。例如，本发明还涉及一种能检测KEAP1对NRF2的消化的试剂盒。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗癌症的方法，其包括抑制NRF2基因或NRF2蛋白。本发明包括一种用于治疗癌症的方法，其包括遏制NRF2基因表达。另外，本发明涉及一种治疗癌症的方法，包括遏制NRF2蛋白质的表达或活性。此外，本发明涉及一种含有NRF2基因或NRF2蛋白的抑制剂的癌症药物。具体而言，本发明涉及一种用于治疗癌症的药剂，其包含NRF2的反义、dsRNA、核酶、适体，NFR结合蛋白的片段，或抗体或其片段，作为活性组分。
更具体地说，本发明涉及下述发明。(1)一种获得用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的信息的方法，该方法包括：
(a)检测源自患者的样品中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白；和
(b)将测得的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与患者的癌症对mTOR相关癌症药物的响应关联起来。
(2)一种从源自患者的肿瘤样品获得用于预测患者的癌症对mTOR相关癌症药物的响应的信息的方法，该方法包括：
(a)检测源自患者的样品中的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白；
(b)依据检测到的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平而归类为癌症响应类别之一，其中归类结果依赖于编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的表达水平；并
(c)以属于所归类的癌症响应类别之一的癌症所特有的已知性质为基础来预测患者的癌症对癌症药物的响应。
(3)依照(2)的方法，其中高水平的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白指示患者对mTOR相关癌症药物有高度响应性。
(4)一种用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的试剂盒，其包含至少一种选自(i)至(iv)的物质：
(i)结合编码NRF2的DNA或RNA而不结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的物质；
(ii)不结合NRF2基因而结合突变型NRF2基因的物质；
(iii)结合NRF2蛋白而不结合突变型NRF2蛋白的物质；和
(iv)不结合NRF2蛋白而结合突变型NRF2蛋白的物质。
(5)一种获得用于预测癌症患者的预后的信息的方法，该方法包括：
(a)检测源自患者的样品中的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白；以及
(b)将测得的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与患者的预后关联起来。
(6)依照(5)的方法，其中高水平的编码突变型NRF2的DNA或RNA或突变型NRF2蛋白的指示患者的预后不良。
(7)一种癌症药物，其含有NRF2抑制剂作为活性成分。
(8)依照权利要求(7)的癌症药物，其中所述NRF2抑制剂是反义核酸、dsRNA、核酶、适体、NRF2结合蛋白片段、或抗体或其片段。
本发明的功效预测方法能够在施用前预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应或预测mTOR相关癌症药物是否对癌症患者产生效果。因此，利用本发明能够选择预期对癌症患者有效的药物，并避免对预期不会产生有效响应的患者多余地施用癌症药物，由此使患者免遭多余的副作用的痛苦。本发明能够提供用于选择癌症药物的信息。另外，通过预测癌症患者的预后，本发明能提供有意义的信息来为癌症患者决定治疗方案策略。另外，本发明的抑制NRF2基因或NRF2蛋白质的方法或本发明包含NRF2基因或NRF2蛋白质抑制剂的治疗药物可用作新的癌症治疗方法或新的治疗药物。
附图简述
图1显示与mTOR相关的生物学途径。
图2显示食道癌临床样品和食道癌细胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)中NRF2基因中突变的位置及由此引起的氨基酸替代。
图3显示使用针对NRF2的抗体通过免疫组织化学染色检测正常食道(A和B)和食道癌(C)中NRF2表达的结果。图中箭头代表表达NRF2的细胞。图3B是图3A的一部分的放大视图。
图4显示通过NRF2基因突变筛选的食道癌病例中手术后存活时间与基因突变的有无之间的关系的统计分析(Kaplan-Meier分析)的结果。图中垂直轴代表累积存活率，水平轴代表手术后经过的天数。
图5显示对具有NRF2基因突变的食道癌细胞系(KYSE-50和KYSE-180)施用或不施用dsRNA后细胞增殖的变化。图中垂直轴是施用NRF2dsRNA的细胞数与施用对照dsRNA的细胞数的比。
图6显示对没有NRF2基因异常的食道癌细胞系(KYSE-30、KYSE-140、KYSE-170、KYSE-270)和具有NRF2基因异常的癌细胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)进行雷帕霉素处理所导致的增殖变化。图中垂直轴显示当具有0nM雷帕霉素(没有药物)的细胞数设为100％时，每种细胞系的细胞数的比。图中水平轴显示雷帕霉素的剂量。
图7显示对没有NRF2基因异常的肺癌细胞系(SQ-5、QG-56)和具有NRF2基因异常的癌细胞系(LK-2、EBC-1)进行雷帕霉素处理所导致的增殖变化。图中垂直轴显示当具有0nM雷帕霉素(没有药物)的细胞数设为100％时，每种细胞系的细胞数的比。图中水平轴显示雷帕霉素的剂量。
图8显示对没有NRF2基因异常的头颈癌细胞系(HO-1-N-1、HSC2)和具有NRF2基因异常的癌细胞系(HO-1-u-1)进行雷帕霉素处理所导致的增殖变化。图中垂直轴显示当具有0nM雷帕霉素(没有药物)的细胞数设为100％时，每种细胞系的细胞数的比。图中水平轴显示雷帕霉素的剂量。
发明详述
A.mTOR相关癌症药物的预测
在一个方面，本发明涉及用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法或试剂盒，或获得用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的信息的方法。
如本文中所使用的，“mTOR相关癌症药物”不受限制，只要是可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于癌症治疗有效的药物即可。mTOR相关癌症药物包括直接抑制mTOR的药物(mTOR抑制剂)，例如化疗药，如西罗莫司(也称作雷帕霉素)、依维莫司、temsirolimus和deferolimus；蛋白质，如抗体；肽，如抗体片段；和核酸，如适体、反义核酸(antisense)、和dsRNA。由于NRF2抑制剂可抑制mTOR途径，因此本发明的NRF2抑制剂也可以作为mTOR抑制剂包括在内。已知mTOR途径参与了多种途径，如图1所示。不过，特别优选的涉及mTOR途径且被本发明中的mTOR相关癌症药物所靶向的物质有例如I型磷酸肌醇3-激酶(下文缩写为“PI3K”)、丙酮酸脱氢酶激酶1(下文缩写为“PDK1”)、FK506结合蛋白(FKBP12)、Akt(也称作蛋白激酶B(PKB))、p70核糖体蛋白S6激酶1(下文缩写为“S6K1”)、c-Jun N端激酶(下文缩写为“JNK”)、和低氧诱导因子1α(下文缩写为“HIF1α”)。因此，PI3K抑制剂，如TG100115、TCN-P、LY294002、渥曼青霉素、BFZ235、和SF1126；PDK1抑制剂，如UCN-01、BX912、B-3012、和OSU030313；FKBP12抑制剂，如AP1903和他克莫司；Akt抑制剂，如XL418、LY294002、渥曼青霉素、TCN-P、BV-1701-1、FPA-124、KP372-1、和GSK690693；S6K1抑制剂，如XL418和H-89；JNK抑制剂，如AM111、SP600125、美国专利No.7,199,124中记载的化合物、和AS601245；及HIF1α抑制剂，如PX478和SF1126，也包括在本发明中的mTOR相关癌症药物中。
如本文中所使用的，“对mTOR相关癌症药物的响应”意指当给癌症患者施用mTOR相关癌症药物时，对至少一项代表癌症患者状况的指标的效果，其中该效果是由施用mTOR相关癌症药物引起的。所述的指标包括肿瘤尺寸的缩小、对肿瘤生长的遏制、转移、预后质量、复发(recidivation)、再发(recurrence)、等。如本文中所使用的，“对mTOR相关癌症药物的响应良好”意指接受mTOR相关癌症药物的癌症患者与不接受mTOR相关癌症药物的癌症患者相比显示癌症患者中疾病状况的至少一项指标的有效性，包括例如肿瘤尺寸的缩小、肿瘤生长的遏制、转移的遏制或没有转移、预后的改善、没有复发、或没有再发，等。
如本文中所使用的，“编码突变型NRF2基因的DNA或RNA”指在编码正常NRF2的(脱氧核糖)核苷酸或核糖核苷酸序列的任何部分中具有突变的DNA或RNA，例如在SEQ ID NO.1的部分序列中具有突变的DNA。如本文中所使用的，“突变型NRF2蛋白”指在构成正常NRF2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的一部分中具有突变的蛋白质。具体而言，编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白是这样的编码突变型NRF2的DNA或RNA或蛋白，其中NRF2蛋白的表达水平由于突变而提高。在一个更具体的方面，突变型NRF2蛋白包括如下的蛋白质，其中NRF2蛋白第24位色氨酸被半胱氨酸或赖氨酸替代、NRF2蛋白的第26位谷氨酰胺被谷氨酸替代、NRF2蛋白的第28位异亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位谷氨酰胺被组氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被缬氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位谷氨酸被赖氨酸替代、NRF2蛋白的第80位苏氨酸被赖氨酸或脯氨酸替代、和/或NRF2蛋白的第82位谷氨酸被天冬氨酸替代。突变型NRF2基因包括编码如下突变型NRF2蛋白的基因，其中NRF2蛋白的第24位色氨酸被半胱氨酸或赖氨酸替代、NRF2蛋白的第26位谷氨酰胺被谷氨酸替代、NRF2蛋白的第28位异亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位谷氨酰胺被组氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被缬氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位谷氨酸被赖氨酸替代、NRF2蛋白的第80位苏氨酸被赖氨酸或脯氨酸替代、和/或NRF2蛋白的第82位谷氨酸被天冬氨酸替代。编码突变型NRF的DNA或RNA的水平，是指通过能检测突变型基因的程序测量得出的编码突变型NRF2的DNA或RNA的水平，包括通过如Southern印迹、Northern印迹、ASO法等使用杂交的方法或者通过如PCR-SSCP、ARMS、直接凝胶测定等使用PCR的方法测量得出的水平，或者作为通过适合于每一种测量方法的软件计算得出的数值给出的水平。
如本文中所使用的，术语“将...与...关联起来”用于描述与编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的测量水平与患者对mTOR相关癌症药物的响应之间的联系，以确定患者对mTOR相关癌症药物的响应时，意思是比较受试者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的存在或水平与对mTOR相关癌症药物的响应不良的患者或已知对mTOR相关癌症药物的响应不良的患者或对mTOR相关癌症药物的响应良好的患者或预测对mTOR相关癌症药物的响应良好的患者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平。用于比较的患者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平可以例如基于本发明的公开内容，通过测量源自先前发现对mTOR相关癌症药物的响应的患者的样品中的突变型NRF2基因或突变型NRF2蛋白的水平，或者结合使用其它对mTOR相关癌症药物的响应的指标的其它评估方法进行评估来获得。通过使用编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平，可以确定患者对mTOR相关癌症药物有响应的可能性。可以利用统计分析将编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与对mTOR相关癌症药物的响应关联起来。通过比较两组或更多组，并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性(Dowdy and Wearden，Statistics for Research，John Wiely & Sons，NewYord，1983)。本发明的置信区间可以是例如90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或99.99％。另外，本发明的p值可以是例如0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0002、或0.0001。
优选的是，依据其存在或不存在，可以将编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白与患者对mTOR相关癌症药物的响应关联起来。又例如，通过与为编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白作为对mTOR相关癌症药物的响应指标而建立的阈值水平比较，可以将源自患者的样品中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与患者对mTOR相关癌症药物的响应关联起来。此类阈值水平可以例如用不小于50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％的灵敏度来确定。阈值水平可以例如用不小于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％的特异性来确定。
确定对mTOR相关癌症药物的响应，是指预测施用mTOR相关癌症药物对患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测施用对患者状况的过程或结果。确定对mTOR相关癌症药物的响应，是指确定通过施用抗癌剂是否能增加某些过程或结果的可能性，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定该过程或结果发生的可能性。即，确定对mTOR相关癌症药物的响应的结果显示，通过施用mTOR相关癌症药物，在编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平升高的患者中与不显示此类特征的患者相比更有可能观察到特定过程或结果。
如本文中所使用的，“癌症响应类别”指提供相似特性的癌症类群。更特别地，癌症响应类别是指表现相似的特定基因表达的表达样式，或表现相似的临床状况的癌症类群。属于某个癌症响应类别的成员表现相同或相似的对mTOR相关癌症药物的响应。属于某响应类别的成员的基因表达或临床状况优选不同于且可区别于不属于该响应类别的成员的基因表达或临床状况。这样的基因表达优选为突变型NRF2基因表达。癌症响应类别可以包括至少两个类别，即“对mTOR的响应高的”和“对mTOR的响应低的”。此外还可以包括很多个类别。
如本文中所使用的，“归类为癌症响应类别之一”是指依据源自患者的样品中编码突变型NRF2的DNA或RNA或(突变型)NRF2蛋白质的水平将癌症患者分类。所说的水平通常意指DNA、RNA或蛋白质的量，如表达水平，但是可以意指突变的水平(level of mutation)，如突变的数目或程度。分类可以依据绝对或相对指标来进行。例如，可以通过依据患者的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白水平将目标患者归类入具有预定水平的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的类群来进行分类。或者，在确定了包括目标患者在内的一群非特定的患者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平后，可以依据编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白相对水平的差异将这些患者归类到两个或更多个类群中。另外，可以使用与健康个体中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平相比的差异程度作为指标来进行归类。优选的是，比较后，当编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平较高时，将受试者归类到对mTOR具有较高响应的类别中。
在一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法或试剂盒可基于使用核酸分子的已知方法来实施，如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法等，可以包括在这样的方法中。使用预测试剂盒，可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
具体而言，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法可以例如用下述步骤来实施：
(a)制备源自患者的样品；
(b)使样品与至少一种核酸接触，其中该核酸选自(i)和(ii)：
(i)特异性结合编码正常NRF2的DNA或RNA而不结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸，和结合编码正常NRF2的DNA或RNA与编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸，和
(ii)不结合编码正常NRF2的DNA或RNA而特异性结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸；
(c)检测DNA或RNA对核酸的结合并测量编码突变型NRF2的DNA或RNA的水平；并
(d)根据编码突变型NRF2的DNA或RNA的水平预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应，其中编码突变型NRF2的DNA或RNA的存在或增多指示患者高度可能对mTOR相关癌症药物有响应。
本发明的用于基于使用核酸分子的已知方法来预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的试剂盒包括特异性结合特定基因(例如编码正常NRF2的DNA或RNA、编码突变型NRF2的DNA或RNA、或二者)的核酸。具体而言，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的试剂盒包含至少一种选自(i)至(iv)的物质：
(i)结合编码NRF2的DNA或RNA而不结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的物质；
(ii)不结合NRF2基因而结合突变型NRF2基因的物质；
(iii)结合NRF2蛋白而不结合突变型NRF2蛋白的物质；和
(iv)不结合NRF2蛋白而结合突变型NRF2蛋白的物质。
用于试剂盒的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
在另一个实施方案中，本发明的方法或试剂盒可以基于使用PCR的已知方法。例如，ARMS(Amplification Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法、等可以包括在此类方法中。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。试剂盒的分析可以定性地、定量地、或半定量地进行。
具体而言，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法可以例如用下述步骤来实施：
(a)制备源自患者的样品；
(b)扩增至少一种选自编码正常NRF2的DNA或RNA和编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸；
(c)检测核酸的扩增水平并测量编码突变型NRF2的DNA或RNA的水平；并
(d)根据编码突变型NRF2的DNA或RNA的水平预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应，其中编码突变型NRF2的DNA或RNA的存在或增多指示患者对mTOR相关癌症药物有高度响应。
本发明基于使用PCR的已知方法来预测癌症患者对mTOR相关癌症的响应的试剂盒包括特异性结合特定基因(例如编码正常NRF2的DNA或RNA、编码突变型NRF2的DNA或RNA、或二者)的一部分的引物。试剂盒中使用的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考本说明书的公开内容和已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在另一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法可以例如使用已知方法，如Invader(TM)法来实施(参见例如Kwiatkowski，R.W.et al.：″Clinical genetic，and pharmacogenetic applications ofthe Invader assay.″Mol.Diagn.，4：353-364，1999)。
例如，依照本说明书，用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法可以用下述步骤来实施：
(a)制备源自患者的样品；
(b)通过使样品与下面(i)和(ii)描述的核酸接触，与互补于等位基因探针(allele probe)的DNA形成三链体：
(i)等位基因特异性探针，其包含与编码正常NRF2的DNA的一部分互补的序列和与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼(flap))，和/或包含与编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列和与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)，和
(ii)入侵探针(invader probe)，其包含与编码正常NRF2的DNA和/或编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列；
(c)使对三链体特异性DNA酶与从(b)获得的核酸样品接触，从而从核酸形成的三链体释放襟翼；
(d)使释放的襟翼与包含与襟翼互补的序列的通用荧光标记探针和淬灭探针接触；
(e)通过使三链体特异性DNA酶与自(d)获得的核酸样品接触来释放荧光标记探针，进而生成荧光；并
(f)通过检测生成的荧光来测量编码突变型NRF2的DNA的水平，其中编码突变型NRF2的DNA的存在或增多指示患者高度可能对mTOR有响应。
在一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的试剂盒可以是适合于上述Invader(TM)法的试剂盒。例如，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的试剂盒可以包括下列各项：包含与编码正常NRF2的DNA的一部分互补的序列及与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)的等位基因特异性探针，和/或包含与编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列及与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)的等位基因特异性探针，包含与编码正常NRF2的DNA和/或编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列的入侵探针，三链体特异性DNA酶，和与淬灭探针一起提供的通用荧光标记探针。襟翼优选在等位基因特异性探针间是不同的。荧光标记物可以合适地选自本领域技术人员已知的荧光标记物，而且优选在通用荧光标记探针间是不同的。例如，FAM和VIC可用作荧光标记物。
上述本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的试剂盒中包括的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考本说明书的公开内容和已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。本发明的试剂盒中包括的三链体特异性DNA酶是商品化的(例如Cleavase，Third Wave Japan，inc)。
在另一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法或试剂盒可以基于使用抗体分子的已知方法。例如，可以包括ELISA(Catty，Raykundalia，1989)、放射免疫测定法(Catty，Murphy，1989)、免疫组织化学法(Heider et al.，1993)、Western印迹、等作为此类方法。
在另一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法可以包括：
(a)制备源自患者的样品；
(b)使至少一种抗体与样品接触，其中该抗体选自下面(i)和(ii)：
(i)特异性结合NRF2蛋白质而不结合突变型NRF2蛋白的抗体，和结合NRF2蛋白质和突变型NRF2蛋白的抗体，和
(ii)不结合NRF2蛋白质而特异性结合突变型NRF2蛋白的抗体；
(c)检测蛋白质对抗体的结合并测量突变型NRF2蛋白的表达水平；并
(d)根据突变型NRF2蛋白的表达水平来预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应，其中突变型NRF2蛋白的表达或升高的表达指示患者高度可能对mTOR有响应。
本发明的试剂盒包括特异性结合特定蛋白质(例如NRF2蛋白、突变型NRF2蛋白、或二者)的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的试剂盒中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。如本文中所使用的，CDR的定义见Kabat et al.，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，U.S.Department of Health and Human Services，1983，或Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196，901-917，1987。本发明的试剂盒可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的NRF2蛋白或突变型NRF2蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对NRF2蛋白或突变型NRF2蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本说明书的预测方法和预测试剂盒的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的免疫学测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。优选的是，使用组织，尤其是癌组织作为样品。对于本发明用于预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应的方法，感兴趣的癌症类型不受特别限制，而且优选是实体癌，诸如肺癌、头颈癌、食道癌、宫颈癌、胆癌、乳腺癌、和恶性黑素瘤。试剂盒的分析可以定性地、定量地、或半定量地实施。
B.癌症的预后
在另一个方面，本发明涉及用于预测癌症患者的预后的方法或试剂盒，或获得用于预测癌症患者的预后的信息的方法。在本发明中，预后预测可以是确定患者的作为癌症的结果的复发、转移或尤其是死亡的风险。
如本文中所使用的，“预后”意指癌症患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果(例如转移的有无、生命状态、等)。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即突变型NRF2蛋白或编码突变型NRF2蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。如本文中所使用的，“预后确定”和“预后评估”与“预后预测”同义使用。
如本文中所使用的，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。
如本文中所使用的，“预后不良”意指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差可以意指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。
如本文中所使用的，术语“将...与...关联起来”，用于与编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的测得的表达水平与患者的响应之间的联系以确定患者的响应时，意指将受试者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的存在或水平与响应不良的患者或已知响应不良的患者或响应良好的患者或预测响应良好的患者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平进行比较。同样，“将...与...关联起来”用于比较受试者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的存在或水平与没有发生癌症的健康受试者中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平。用于比较的患者中的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平可以例如基于本发明的公开内容，通过测量源自先前发现响应的患者的样品中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平，或者通过结合使用其它响应指标的其它评估方法进行评估来获得。编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平可用于预测患者可能的死亡、复发或转移。可以通过使用统计分析将预后因素与预后关联起来。通过比较两组或更多组，并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性(Dowdy and Wearden，Statistics for Research，John Wiely & Sons，NewYord，1983)。本发明的置信区间可以是例如90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或99.99％。另外，本发明的p值可以是例如0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0002、或0.0001。
例如，通过其存在或不存在，可以将本发明的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白与患者的响应关联起来。又例如，通过与为本发明编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白作为预后指标而建立的阈值水平比较，可以将源自患者获得样品中编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与患者的响应关联起来。这样的阈值水平可以例如用不小于50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％的灵敏度来确定。阈值水平可以例如用不小于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或98％的特异性来确定。
预后确定意指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预后确定意指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。即，预后确定结果显示，在其本发明突变型NRF2基因或突变型NRF2蛋白的水平升高或降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
在一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者的预后的方法或试剂盒可基于使用核酸分子的已知方法。例如，此类方法可以包括Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列等。试剂盒的样品可以使用例如从活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的免疫学测定即可，可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的样品。优选的是，用于试剂盒的样品是组织，尤其是癌组织。可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
本发明用于预测癌症患者的预后的方法可以例如用下述步骤来进行：
(a)制备源自患者的样品；
(b)使至少一种核酸与样品接触，其中该核酸选自(i)和(ii)：
(i)特异性结合编码正常NRF2的DNA或RNA而不结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸，和结合编码正常NRF2的DNA或RNA与编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸，和
(ii)不结合编码正常NRF2的DNA或RNA而特异性结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的核酸；
(c)检测核酸对DNA或RNA的结合并测量编码突变型NRF2的DNA或RNA的水平；并
(d)根据编码突变型NRF2的DNA或RNA的表达水平预测癌症患者的预后，其中编码突变型NRF2的DNA或RNA的表达或升高的表达指示癌症患者的预后不良。
本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒包括特异性结合特定DNA或RNA(例如编码正常NRF2的DNA或RNA、编码突变型NRF2的DNA或RNA、或二者)的核酸。具体而言，本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒包含至少一种选自(i)至(iv)的物质：
(i)结合编码NRF2的DNA或RNA而不结合编码突变型NRF2的DNA或RNA的物质；
(ii)不结合NRF2基因而结合突变型NRF2基因的物质；
(iii)结合NRF2蛋白而不结合突变型NRF2蛋白的物质；和
(iv)不结合NRF2蛋白而结合突变型NRF2蛋白的物质。
用于试剂盒的核酸可以通过化学合成来制备，或通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
在另一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者的预后的方法可以例如使用称作Invader(TM)法的方法来进行(参见例如Kwiatkowski，R.W.et al.：″Clinical genetic，and pharmacogenetic applications of the Invader assay.″Mol.Diagn.，4：353-364，1999)。
例如，用于预测癌症患者的预后的方法可以用下述步骤来进行：
(a)制备源自患者的样品；
(b)通过使样品与下面(i)和(ii)描述的核酸接触，与互补于等位基因探针的DNA形成三链体：
(i)等位基因特异性探针，其包含与编码正常NRF2的DNA的一部分互补的序列和与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)，和/或包含与编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列和与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)，和
(ii)入侵探针，其包含与编码正常NRF2的DNA和/或编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列；
(c)通过使三链体特异性DNA酶与从(b)获得的核酸样品接触，自核酸形成的三链体释放出襟翼；
(d)使释放的襟翼与包含与襟翼互补的序列的通用荧光标记探针和淬灭探针接触；
(e)通过使三链体特异性DNA酶与从(d)获得的核酸样品接触来释放荧光标记探针，进而生成荧光；并
(f)通过检测生成的荧光来测量编码突变型NRF2的DNA的水平，其中编码突变型NRF2的DNA的存在或增多指示癌症患者的预后不良。
在一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒可以是适合于上述Invader(TM)法的试剂盒。例如，本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒可以包括：包含与编码正常NRF2的DNA的一部分互补的序列和与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)的等位基因特异性探针、和/或包含与编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列和与淬灭探针的一部分互补的序列(襟翼)的等位基因特异性探针，包含与编码正常NRF2的DNA和/或编码突变型NRF2的DNA的一部分互补的序列的入侵探针，三链体特异性DNA酶，和与淬灭探针一起提供的通用荧光标记探针。襟翼优选在等位基因特异性探针之间是不同的。荧光标记物可以合适地选自本领域技术人员已知的荧光标记物，而且优选在通用荧光标记探针间是不同的。例如，FAM和VIC可用作荧光标记物。
本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒中包括的探针可以通过化学合成来制备，通过本领域技术人员知道的方法参考本说明书的公开内容和已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过自生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。本发明的试剂盒中包括的三链体特异性DNA酶是商品化的(例如Cleavase，Third Wave Japan，inc)。
在另一个实施方案中，本发明用于预测癌症患者的预后的方法或试剂盒可以基于使用抗体分子的已知方法。例如，此类方法可以包括ELISA(Catty，Raykundalia，1989)、放射免疫测定法(Catty，Murphy，1989)、免疫组织化学法(Heider et al.，1993)、Western印迹等。
本发明用于预测癌症患者的预后的方法可以例如用下述步骤来进行：
(a)制备源自患者的样品；
(b)使至少一种抗体与样品接触，其中该抗体选自(i)和(ii)：
(i)特异性结合NRF2蛋白而不结合突变型NRF2蛋白的抗体，和结合NRF2蛋白与突变型NRF2蛋白的抗体，
(ii)不结合NRF2蛋白而特异性结合突变型NRF2蛋白的抗体；
(c)检测蛋白质对抗体的结合并测量突变型NRF2蛋白的表达水平；并
(d)根据突变型NRF2蛋白的表达水平来预测癌症患者的预后，其中突变型NRF2蛋白的表达或升高的表达指示癌症患者的预后不良。
本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒包括结合特定蛋白质(例如NRF2蛋白质、突变型NRF2蛋白、或二者)的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的试剂盒中的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段是指如下所述的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽，其保留抗体对抗原的结合活性。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。如本文中所使用的，CDR的定义见Kabat et al.，″Sequences ofProteins of Immunological Interest″，U.S.Department of Health and HumanServices，1983，或Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196，901-917，1987。本发明的试剂盒可以包括编码本发明试剂盒中包括的抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
本发明用于预测癌症患者的预后的试剂盒使用的抗体可以通过上文所述方法来获得。同样，标记物与抗体或其片段的结合可以通过上文所示方法来实施。另外，商品化的标记试剂盒，诸如上文所列的，可用于标记。为了正确地标记，可以通过使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为用于预测癌症患者的预后的试剂盒的样品，可以使用例如从活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的免疫学测定即可，可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的样品。优选的是，用于试剂盒的样品是组织，尤其是癌组织。可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。在上述本发明用于预测癌症患者的预后的方法中，感兴趣的癌症类型不受特别限制，而且优选是实体癌，诸如肺癌、头颈癌、食道癌、宫颈癌、胆癌、乳腺癌、和恶性黑素瘤。
C.癌症药物的筛选
在另一个方面，本发明涉及用于筛选癌症药物的方法。由于编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白可用作癌症患者预后的指示物，因此编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白也可用于癌症药物的筛选中作为患者预后改善的指示物。例如，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对癌症模型动物施用测试药物后的某个时期测量编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平来测定癌症药物改善癌症预后的效果。更具体地说，当编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平在添加或施用测试药物后降低或观察不到时，可选择该药物作为改善癌症预后的治疗药物。
D.癌症药物
在另一个方面，本发明涉及含有NRF2抑制剂作为活性组分的癌症药物。如本文中所使用的，“″NRF2抑制剂”不受限制，只要它抑制NRF2蛋白质的功能或表达或者NRF2基因的表达即可，可包括诸如反义核酸、dsRNA、核酶、适体、NRF2结合蛋白的片段、NRF2抗体或其片段、或结合蛋白。
“反义核酸”指含有与编码NRF2的mRNA互补的序列的核酸。反义核酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与靶NRF2的mRNA 100％互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件(Sambrook etal.1989)下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核酸可以根据NRF2序列信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法(例如化学合成)来生成。
“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpin turn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA.
“核酶”指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可以包括锤头、发夹等。
“适体”指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合靶分子即可，可以由例如10至200个核苷酸、优选10至100个核苷酸、更优选15至80个核苷酸、进一步更优选15至50个核苷酸组成。适体可以使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可以采用SELEX(通过指数式富集进行的配体的系统进化)(Tuerk，C.and Gold，L.，1990，Science，249，505-510)。
“NRF2结合蛋白的片段”指结合NRF2且抑制NRF2实施原始功能的蛋白质的片段。NRF2结合蛋白可以包括例如铁蛋白、轻质多肽(FTL)、jun癌基因(JUN)、组织蛋白酶L1(CTSL1)、白介素增强子结合因子3(ILF3)、KEAP1、普列克底物蛋白(pleckstrin)同源域相互作用蛋白(PHIP)、erythroid衍生的核因子2(NFE2)、v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物G(MAFG)、和V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因家族蛋白K(MAFK)。例如，NRF2结合蛋白的片段可以通过制备此类蛋白质的部分肽并选择结合NRF2的肽来获得。此外，可以恰当修饰该肽以改进其稳定性或增强其抑制活性，而且可以在肽的一部分中引入氨基酸突变。
本发明的试剂盒或治疗药物中使用的抗NRF2抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合NRF2即可。当抗体用作治疗药物时，优选的是它可识别尽可能多的氨基酸，只要它能够抑制NRF2的功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY，优选是IgG。本申请的抗体可以包括任何抗体同种型。
如本文中所使用的，“抗体片段”指如下所述的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽，其保留抗体对抗原的活性。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(下文缩写为“scFv”)、二硫化物键合的Fv(下文缩写为“dsFv”)或其聚合物、二聚化V区(下文缩写为“双抗体”)、或含有CDR的肽。
F(ab′)2指通过用蛋白水解酶胃蛋白酶加工IgG获得的片段，它是具有抗原亲合力的分子量约100,000的抗体片段。Fab′指通过切割F(ab′)铰链区上的二硫键生成的抗体片段，分子量约50,000，具有抗原亲合力。sdFv是这样的多肽，其中一个VH和一个VL通过肽接头接合在一起，并且抗原亲合力。dsFv指如下所述的具有抗原亲合力的片段，其中VH和VL中被半胱氨酸替代的氨基酸残基经二硫键接合在一起。双抗体指二聚化的scFv片段。本发明的双抗体可以是单特异性的或双特异性的(多特异性抗体)。二聚化的scFv可以是相同的或不同的。含有CDR的肽指含有至少一个选自重链可变区CDR1、CDR2、和CDR3及轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3的CDR氨基酸序列的肽。
本发明的抗体可以通过用含有NRF2或NRF2一部分的肽免疫非人哺乳动物或鸟来生成，在必要时使用佐剂(例如矿物油或铝沉淀物和热灭活的细菌或脂多糖、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、等)。
用作免疫原的NRF2不受限制，只要它是哺乳动物NRF2即可，诸如小鼠、家兔、和人NRF2，优选是人NRF2。用于制备本发明抗体的免疫原可以通过将含有编码NRF2的cDNA的载体引入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、等并表达它来获得。当含有NRF2一部分的肽用作免疫原时，它可以通过将包含编码这样的肽的cDNA的表达载体引入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等，并表达它来制备。当使用含有NRF2一部分的肽作为免疫原时，可以使用含有NRF2一部分的肽或组合肽，其中一种或多种NRF2一部分经接头接合在一起。
含有NRF2或NRF2一部分的肽可以通过化学合成来生成，其中使用Fmoc法、Boc法、等等。例如，含有期望氨基酸序列的肽可以如下来获得，即将含有NRF2或NRF2一部分的肽的C端氨基酸固定化到聚苯乙烯树脂上，使用缩合剂诸如二异丁基碳二亚胺(DIC)使受9-芴甲氧羰基(Fmoc基团)或叔丁氧羰基(Boc基团)保护的氨基酸反应以将去保护的氨基酸连接到C端氨基酸，并重复清洗和去保护过程。
含有NRF2或NRF2一部分的肽也可以使用自动化肽合成仪来合成。此类肽合成仪可以包括例如PSSM-8(Shimazu Corporation)、433A型肽合成仪(Applied Biosystems，Inc.)、ACT 396Apex(Advanced ChemTech Inc.)、等。
待免疫的动物不受限制，只要能生成杂交瘤即可，可以使用诸如小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、鸡和鸭、等。优选的是，免疫使用小鼠或大鼠，更优选小鼠，而且最优选NRF2敲除小鼠。免疫原可以例如通过皮下注射、腹膜内注射、静脉内注射、皮内注射、肌肉内注射、或足底注射来施用，优选通过皮下注射或腹膜内注射。免疫原的量不受限制，只要它足以产生抗体即可，优选0.1至1000微克，更优选1至500微克，进一步更优选10至100微克。免疫可以实施一次或数次，间以适当的间隔。免疫优选实施2至5次，间隔时间为1至5周，更优选实施3次，间隔时间为3周。最后一次免疫后1-2周，从经过免疫的动物的眼窝或尾静脉收集血液样品，并使用其血清测量抗体效价。抗体效价的测量可以通过本领域技术人员公知的方法来实施，例如放射性同位素免疫测定(RIA)、固相酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光抗体技术、和被动血细胞凝集测定，优选通过ELISA来实施。可以通过对显示足够抗体效价的动物的血清进行纯化来获得本发明的抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过培养从按照上文所述方法免疫的动物获得的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合而得到的杂交瘤来生成。此类融合方法可以是例如Milstein等人的方法(Galfre，G.& Milstein，C.，Methods Enzymol.73：3-46，1981)。要使用的抗体生成细胞可以从经过上文所述方法免疫且在血清中显示足够抗体效价的小鼠或大鼠的下述部位收集：脾、胰、淋巴结、和外周血，优选脾。要使用的骨髓瘤细胞不受限制，只要该细胞衍生自哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔、或人，并且可以在体外增殖即可。此类细胞可以包括例如P3-X63Ag8(X63)(Nature，256，495，1975)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)(Eur.J.Immunol.，6，292，1976)、P3X63Ag8U1(P3U1)(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，81，1，1978)、P3X63Ag8.653(653)(J.Immunol.，123，1548，1979)、Sp2/0-Ag14(Sp2/O)(Nature，276，269，1978)、Sp2/O/FO-2(FO-2)(J.Immunol.Methods，35，1，1980)，优选P3U1。
将遵循上文所述方法获得的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞用培养基、PBS(磷酸盐缓冲盐水)等清洗，然后添加细胞凝集培养基诸如聚乙二醇(下文缩写为“PEG”)(Elsevier Publishing，1988)来进行融合。要融合的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞的比可以在例如2∶1至1∶2的范围内。细胞融合实施后，在培养基诸如HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)培养基中培养杂交瘤以容许选择性扩增。培养后，收集培养物上清液，并通过ELISA等来选择结合抗原蛋白但不结合非抗原蛋白的样品。通过有限稀释法将样品单细胞化，并选择稳定显示高抗体效价的细胞。
可以通过在体外培养通过上文所述方法获得的杂交瘤，然后纯化培养物来，获得单克隆抗体。或者，可以通过将杂交瘤移植给先前向腹腔内施用了角鲨烷的同基因动物或免疫缺陷动物，然后制备腹水，然后收集腹水进行纯化来获得本发明的单克隆抗体。单克隆抗体的纯化可以通过在离心分离后使用蛋白A柱、蛋白G柱等收集IgG级分来实现。当抗体类别是IgY和IgM时，纯化可以使用巯基吡啶作为配体在柱上进行。纯化可以使用NRF2固定化柱、离子交换层析、疏水相互作用层析等来进行，无论抗体是什么类别。
当抗体用作治疗药物时，优选使用人源化嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体作为抗体。人源化嵌合抗体可以如下来获得：构建DNA，其编码源自非人动物、可结合NRF2以抑制NRF2功能的单克隆抗体的VH和VL；将构建好的DNA整合到源自人的免疫球蛋白的恒定区的cDNA中，将整合好的DNA引入表达载体，再将载体引入适宜的宿主细胞以表达它(Morrison，S.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855，1984)。
人源化抗体可以如下来获得：构建编码如下所述的V区的DNA，其中，源自非人动物的编码结合NRF2以抑制NRF2功能的单克隆抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人抗体的VH和VL的FR中；将构建的DNA整合到源自免疫球蛋白的恒定区的cDNA中，将整合好的DNA引入表达载体，并将载体引入适宜的宿主细胞以表达它(参见L.Rieohmann et al.，Nature，332，323，1988；Kettleborough，C.A.et al.，Protein Eng.，4，773-783，1991；Clark M.，Immunol.Today.，21，397-402，2000)。
人抗体可以例如通过使用人抗体噬菌体文库或人抗体生成转基因小鼠来获得(Tomizuka et al.，Nature Genet.，15，146-156(1997))。人抗体噬菌体文库是指由在表面上展示人抗体Fab或scFv等所成的融合蛋白的噬菌体所构成的文库，它们是通过将来自由源于人B细胞的各种序列组成的抗体基因集合中的VH基因和VL基因引入噬菌体基因而得到的。这样的人抗体噬菌体文库可以包括：幼稚(未免疫)文库，其是通过使用RT-PCR从外周血淋巴细胞等扩增正常人中的抗体VH基因和VL基因，并生成其文库而创建的(CambridgeAntibody Technology；Medical Research Council；Dyax Corp.，etc.)；合成文库，其是通过选择人B细胞中的特定功能性抗体基因，用编码足够长度的随机化氨基酸序列的寡核苷酸替代V基因片段中抗原结合区一部分诸如CDR3区，并生成其文库而创建的(BioInvent International AB.；Crucell；and MorphoSysAG)；和免疫文库，其是从癌症、自身免疫性疾病或传染病患者或作为疫苗接种过感兴趣抗原的人的淋巴细胞创建的。
抗体片段，诸如F(ab′)2、Fab′、Fab、scFv、dsFv或其聚合物，双抗体，或含有CDR的肽，可以通过下述方式来生成。F(ab′)2片段可以通过用蛋白水解酶胃蛋白酶处理结合NRF2的本发明IgG，在重链氨基酸残基234处切割，作为分子量具有大约100,000的具有抗原亲合力的抗体片段而获得。或者，本发明的F(ab′)2片段可以通过经由硫醚键或二硫键连接Fab′(下文会描述)来获得。本发明的Fab′片段可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理通过上文所述方式获得的结合NRF2的F(ab′)2来获得。或者，本发明的Fab′片段可以如下获得：将编码结合NRF2的抗体的Fab′的DNA插入表达载体，将载体引入宿主细胞，并表达它。Fab片段可以作为具有抗原亲合力、分子量为大约50,000的抗体片段(其中重链N端大约一半的区域和轻链的整个区域经二硫键接合在一起)通过用蛋白水解酶木瓜蛋白酶处理结合NRF2的抗体，在重链氨基酸残基224处切割来获得。另外，Fab片段可以如下来获得：将编码结合NRF2的抗体的Fab的DNA插入表达载体，将载体引入宿主细胞，并表达DNA。scFv可以如下来获得：获取编码NRF2结合抗体的VH和VL的cDNA，将编码接头序列的DNA插入这些cDNA之间而构建编码scFv的DNA，将该DNA插入表达载体，将载体引入宿主细胞，并表达DNA。接头的长度不受限制，只要接头容许VH与VL之间的联合即可，优选10至20个残基，更优选15个残基。接头的序列不受限制，只要它不抑制两个结构域(即VH和VL)的多肽链的折叠即可。接头优选由甘氨酸和/或丝氨酸组成，由更优选GGGGS(G：甘氨酸，S：丝氨酸)序列或其重复序列组成。dsFv可以如下来获得：通过位点特异性突变用半胱氨酸残基替代VH和VL中的各一个氨基酸残基，并藉由半胱氨酸残基之间的二硫键连接VH和VL。要取代的氨基酸不受限制，只要基于构象该氨基酸残基不影响抗原结合。双抗体可以如下来获得：构建编码上述scFv的DNA，使得接头的氨基酸序列可以是8个残基或更少(优选5个残基)，将该DNA插入表达载体，将载体引入宿主细胞，并表达它。双特异性双抗体可以通过组合来自两种不同类型scFv的VH和VL的DNA来获得。含有CDR的肽可以如下获得：构建包含编码结合NRF2的抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的DNA的DNA，将该DNA插入表达载体，将载体引入宿主细胞，并表达它。
本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防癌症的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
本发明药物的配制剂不受限制，只要它能施用于患者即可，优选注射配制剂。本发明药物的配制剂可以包括例如液体配制剂或冷冻干燥配制剂。本发明的药物可以包括可注射形式、添加剂(例如增溶剂，诸如丙二醇和乙二胺等；缓冲剂，诸如磷酸盐；张度剂，例如氯化钠和甘油；稳定剂，诸如亚硫酸盐；防腐剂，诸如酚；及安抚剂，诸如利多卡因)(参见″Iyakuhin TenkabutsuJiten(日本药品添加剂事典)″，Yakuji Nippo limited和″Handbook ofPharmaceutical Excipients Fifth Edition″APhA Publications)。当本发明的药物作为可注射形式使用时，可以使用安瓿、管形瓶、载药注射器、笔式注射筒、静脉内袋等作为贮藏容器。
本发明药物的施用路径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，优选静脉内施用。具体而言，它可以施用到血管中，例如静脉内或冠状动脉内。本发明药物的施用方法可以包括通过注射或静脉内滴注进行的静脉内施用，和通过肌肉内注射进行的肌肉内施用。本发明的药物可以通过单次的、连续的、或间歇的给药来施用。例如，本发明的药物可以连续施用1分钟至2周。本发明的药物优选连续施用5分钟至1小时，更优选的是，将它连续施用5分钟至15分钟。
本发明药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄、等来恰当地确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对癌症的治疗效果或预防效果作为指标来确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量优选是1ng/kg至10mg/kg，更优选10ng/kg至1mg/kg，进一步优选50ng/kg至500ug/kg，进一步更优选50ng/kg至100ug/kg，进一步更优选50ng/kg至50ug/kg，最优选50ng/kg至5ug/kg。
实施例
下文描述了本发明的详细实施例。然而，本发明绝非限于实施例中描述的方面。
实施例1：食道癌中的NRF2基因突变
自食道癌的临床样品(通过手术切除的标本)和食道癌细胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)提取DNA后，通过PCR扩增NRF2基因，然后通过测序分析来测定序列。使用的引物及它们的序列显示于表1。通过PCR扩增每一个外显子后，使用相同的引物进行测序反应，并用完全自动毛细管测序仪(ABI 3130)对序列解码。PCR条件为30秒94℃，30个循环(30秒94℃，30秒55℃，和90秒72℃，和5分钟72℃。
表1
  引物   序列   序列编号
  NRF2-EX1正向引物   5’GCCGCCACCAGAGCCGCCCTGTC 3’   3
  NRF2-EX1正向引物(内部的)   5’AGCCCCAACACACGGTCCACAGCT 3’   4
  NRF2-EX1反向引物   5’GAAGCCGGTTGCGGCTGTCCCTC 3’   5
  NRF2-EX2正向引物   5’ACCATCMCAGTGGCATAATGTG 3’   6
  NRF2-EX2反向引物   5’GGCAAAGCTGGAACTCAAATCCAG 3’   7
  NRF2-EX3正向引物   5’TGAATATTTAGCTTGGCAATGTGA 3’   8
  NRF2-EX3反向引物   5’GGAGATTCATTGACGGGACTTAC 3’   9
  NRF2-EX4正向引物   5’GTTTTGTAGTGGTGCCTTAGAGC 3’   10
  NRF2-EX4反向引物   5’TAATAGCACCCTCCAATCCTTCC 3’   11
  NRF2-EX5-1正向引物   5’CTGAAGATAATGTGGGTAGGGAG 3’   12
  NRF2-EX5-1反向引物   5’TAGAAGTTCAGAGAGTGAATGGC 3’   13
  NRF2-EX5-2正向引物   5’TCTGCTTTCATAGCTGAGCCCAG 3’   14
  NRF2-EX5-2反向引物   5’CAGGCAATTCTTTCTCTGGTGTG 3’   15
  NRF2-EX5-3正向引物   5’ACCCTTGTCACCATCTCAGGGGC 3’   16
  NRF2-EX5-3反向引物   5’CATCTTCATCACGTAGCATGCTG 3’   17
  NRF2-EX5-4正向引物   5’AAATGACAAAAGCCTTCACCTAC 3’   18
  NRF2-EX5-4反向引物   5’GCATTTCACATCACAGTAGGAGC 3’   19
图2显示了在食道癌临床样品和食道癌细胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)中突变在NRF2基因中的位置及其引起的氨基酸替代。在晚期癌症中检测到一处突变(18/82，22％)，而在早期癌症中没有检测到突变(0/36)。
实施例2：正常食道上皮中和食道癌中的NRF2基因表达
使用针对NRF2的抗体通过免疫组织化学染色检测了正常食道中(A和B)和食道癌中(C)的NRF2表达。自福尔马林固定、石蜡包埋的食道癌样品制备厚度3微米的标本，并使它与多克隆抗NRF2抗体(C-20，Santa CruzBiotechnology，稀释100倍)反应。然后使用免疫组织学方法使表达可视化(染色褐色)。
结果显示于图3。在图中，箭号代表具有表达的细胞。图3B是图3A的一部分的放大视图。在正常食道上皮中观察到局限于基细胞底层的NRF2表达，而且在食道癌细胞中观察到NRF2表达的升高。
实施例3：癌症患者NRF2基因异常与生机预后之间的相关性
针对筛选NRF2基因突变的食道癌病例，以统计学分析(Kaplan-Meier分析)了手术后存活时间与基因突变的有无之间的相关性。
结果显示于图4。在它们之间有显著的相关性，统计学值为0.005。与没有NRF2基因异常的癌症患者相比，NRF2基因中具有突变的癌症患者的生存预后不良。此结果提示NRF2基因中具有异常的患者在手术后可能需要积极的治疗。
实施例4：针对NRF2的dsRNA对癌细胞的生长遏制效果
具有NRF2基因突变的食道癌细胞系(KYSE-50和KYSE-180)的NRF2基因表达受到dsRNA遏制。将食道癌细胞系以5000个细胞/孔接种入96孔板，并使用Lipofectamine(Lipofectamine RNAiMax，Invitrogen)引入对照dsRNA(ON-TARGET plus Non-targeting Pool，Dharmacon，D-001810-10)或针对NRF2的dsRNA(NRF2dsRNA，5′-UAAAGUGGCUGCUCAGAAUUU-3′(SEQ IDNO 20)和5′-pAUUCUGAGCAGCCACUUUAUU-3′(SEQ ID NO 21))。然后将它们于37℃温育72小时。然后通过针对NADH活性的MTS测定法(CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)测定存活细胞数目。
结果显示于图5。在图中，显示NRF2dsRNA的细胞计数对对照dsRNA的细胞计数的比。当具有NRF2基因突变的食道癌细胞系(KYSE-50和KYSE-180)中NRF2基因表达受到dsRNA遏制时，发现了与对照相比26％(KYSE-50)或38％(KYSE-180)的增殖遏制效果。
实施例5：通过生物统计分析对与NRF2激活有关的分子途径的鉴定
为了调查由NRF2突变所致的基因表达变化，比较了在引入有突变型NRF2基因的细胞中表达的基因与在对照细胞中表达的基因之间的表达水平，并分析了因NRF2突变而变化的一组基因。将两种不同的突变型NRF2基因(NRF2-TK和NRF2-LF)引入293细胞，并建立了持续表达突变型NRF2的克隆。从建立的细胞和对照细胞(只引入载体的细胞)提取RNA。用Cy3-CPT标记0.5mg总RNA后，使用Agilent基因表达微阵列对大约30,000种基因测量表达水平。
使用IBMT法(Sartor M.A，Tomlinson C.R.，Wesselkamper S.C.，Sivaganesan S.，Leikauf G.D.，Medvedovic.Intensity-based hierarchical Bayesmethod improves testing for differentially expressed genes in microarrayexperiments.BMC Bioinformatics.7：538-54，2006)比较了NRF2变体的两个微阵列中的基因表达和对照细胞的两个微阵列中的基因表达。通过分析，获得了指示基因间表达的显著差异的p值。使用Benjamini & Hochberg法(Benjamini，Y，and Hochberg，Y(1995).Controlling the false discovery rate：apractical and powerful approach to multiple testing.Journal of the RoyalStatistical Society Series B，57，289-300)修正了获得的p值，称其为修正后的p值。p值小于0.05的基因视为有统计学意义的基因，而且获得了2290种适宜的基因。为了检查这2290种基因是否集中在特定途径中，针对BROAD研究所(MsigDB，C2)公开的基因集数据库(Subramanian A，Tamayo P，Mootha VK，Mukherjee S，Ebert BL，Gillette MA，Paulovich A，Pomeroy SL，Golub TR，Lander ES，Mesirov JP(2005).″Gene set enrichment analysis：aknowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles″.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102(43)：15545-50)进行了基于超几何分布的统计举检验(Boyle，E.I.，Weng，S.，Gollub，J.，Jin，H.，Botstein，D.，Cherry，J.M.，Sherlock，G.(2004)GO：TermFinder-open source software for accessing GeneOntology information and finding significantly enriched Gene Ontology termsassociated with a list of genes，Bioinformatics 20，3710-3715)。然后通过上文所述Benjamini & Hochberg法修正了获得的p值。p值小于0.05的基因集视为有统计学意义的基因集。
结果，自有统计学意义的基因集发现了PENG_RAPAMYCIN_DN。PENG_RAPAMYCIN_DN的p值显示于表2。使用生物统计学技术，鉴定PENG_RAPAMYCIN_DN及其它途径为被NRF2基因活化显著激活的分子途径。PENG_RAPAMYCIN_DN是其表达在用mTOR途径抑制剂雷帕霉素处理时降低的分子途径。换言之，它是能充当mTOR途径激活的指标的途径(Penget al.，Mol.Cell Biol.2002Aug；22(15)：5575-5584)。
表2
 途径   x   n   M   N   p值   修正后的p值
 PENG_RAPAMYCIN_DN   x：48   n：1909   M：229   N：16510   2.88E-05   1.94E-03
实施例6：具有NFR2基因异常的癌细胞对mTOR抑制剂(雷帕霉素)的响应
对没有NRF2基因异常的食道癌细胞系(KYSE-30、KYSE-140、KYSE-170、KYSE-270)及对具有NRF2基因异常的细胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)检查了雷帕霉素处理对增殖的遏制。将这7种食道癌细胞系以5000个细胞/孔接种到96孔板上，并添加0、1、5、和10nM雷帕霉素。于37°温育72小时后，基于NADH活性对存活细胞计数(MTS测定法，CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)。
另外，通过与上文用于食道癌细胞系相似的方法，还检查了雷帕霉素处理对没有NRF2基因异常(SQ-5、QG-56)或具有NRF2基因异常(LK-2，EBC-1)的肺癌细胞系及对没有NRF2基因异常(HO-1-N-1、HSC2)或具有NRF2基因异常(HO-1-u-1)的头颈癌细胞系的生长遏制效果。
结果显示于图6、7和8。图显示了当0nM(不添加药物)设为100％时，每种细胞系在每种浓度的细胞计数的比的变化。如图6所示，具有NRF2基因异常的食道癌细胞系的细胞增殖受到雷帕霉素处理的显著遏制(降低至对照的约70％)。同样，如图7和8所示，具有NRF2基因异常的肺癌细胞系和头颈癌细胞系的细胞增殖分别被雷帕霉素处理显著遏制至对照的约62-70％和70％。
通过述及将2008年7月25日提交给日本专利局的日本专利申请No.2008-192876(其充当本发明优先权要求的基础)的全部内容收入本文。同样，通过述及本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献的全部内容收入本文。
工业实用性
依照本发明的功效预测方法可以作为在施用前预测癌症患者对mTOR相关癌症药物的响应或预测mTOR相关癌症药物对癌症患者是否有效的方法。另外，依照本发明的预后预测方法能够提供重要信息，用于通过预测患者的预后来为癌症患者开发治疗给药策略。另外，本发明用于抑制NRF2基因或NRF2蛋白质的方法和本发明包含NRF2基因或NRF2蛋白质抑制剂的治疗药物可用作癌症的治疗方法或治疗药物。

Claims (14)

1.检测编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的药剂在制备用于实施获得用于预测癌症患者对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应的信息的方法的试剂中的用途，该方法包括：
(a)检测源自患者的样品中的编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白；并
(b)将测得的编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与患者的癌症对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应关联起来，
其中编码突变型NRF2蛋白的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的表达水平更高指示患者对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应性更高，
其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是作为mTOR抑制剂的化疗药；
其中所述突变型NRF2蛋白是NRF2蛋白的第24位色氨酸被半胱氨酸或赖氨酸替代、NRF2蛋白的第26位谷氨酰胺被谷氨酸替代、NRF2蛋白的第28位异亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位谷氨酰胺被组氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被缬氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位谷氨酸被赖氨酸替代、NRF2蛋白的第80位苏氨酸被赖氨酸或脯氨酸替代、和/或NRF2蛋白的第82位谷氨酸被天冬氨酸替代的突变型NRF2蛋白。
2.检测编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的药剂在制备用于实施从源自患者的肿瘤样品获得用于预测患者的癌症对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应的信息的方法的试剂中的用途，该方法包括：
(a)检测源自患者的样品中的编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白；
(b)依据检测到的编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平归类到癌症响应类别之一中，其中归类结果依赖于编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的表达水平；并
(c)基于属于所归类的癌症响应类别之一的癌症所特有的已知特性来预测患者的癌症对癌症药物的响应，
其中编码突变型NRF2蛋白的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的表达水平更高指示患者对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应性更高，
其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是作为mTOR抑制剂的化疗药；
其中所述突变型NRF2蛋白是NRF2蛋白的第24位色氨酸被半胱氨酸或赖氨酸替代、NRF2蛋白的第26位谷氨酰胺被谷氨酸替代、NRF2蛋白的第28位异亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位谷氨酰胺被组氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被缬氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位谷氨酸被赖氨酸替代、NRF2蛋白的第80位苏氨酸被赖氨酸或脯氨酸替代、和/或NRF2蛋白的第82位谷氨酸被天冬氨酸替代的突变型NRF2蛋白。
3.权利要求1-2中任一项的用途，其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是mTOR的抑制剂或涉及mTOR上游或下游途径的物质的抑制剂。
4.权利要求1-2中任一项的用途，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质选自mTOR、PI3K、PDK1、FKBP12、Akt、S6K1、JNK或HIF1α。
5.权利要求1-2中任一项的用途，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质是mTOR或PI3K。
6.权利要求1-2中任一项的用途，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质是mTOR。
7.权利要求1-2中任一项的用途，其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是雷帕霉素。
8.一种用于预测癌症患者对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应的试剂盒，其包含不结合NRF2基因而结合编码编码突变型NRF2蛋白的突变型NRF2基因的DNA或RNA的物质，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质选自mTOR、PI3K、PDK1、FKBP12或Akt，其中所述突变型NRF2蛋白是NRF2蛋白的第24位色氨酸被半胱氨酸或赖氨酸替代、NRF2蛋白的第26位谷氨酰胺被谷氨酸替代、NRF2蛋白的第28位异亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位谷氨酰胺被组氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被缬氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位谷氨酸被赖氨酸替代、NRF2蛋白的第80位苏氨酸被赖氨酸或脯氨酸替代、和/或NRF2蛋白的第82位谷氨酸被天冬氨酸替代的突变型NRF2蛋白，
其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是作为mTOR抑制剂的化疗药。
9.一种用于预测癌症患者对可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂的响应的试剂盒，其包含不结合NRF2蛋白而结合突变型NRF2蛋白的物质，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质选自mTOR、PI3K、PDK1、FKBP12或Akt，其中所述突变型NRF2蛋白是NRF2蛋白的第24位色氨酸被半胱氨酸或赖氨酸替代、NRF2蛋白的第26位谷氨酰胺被谷氨酸替代、NRF2蛋白的第28位异亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位谷氨酰胺被组氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被缬氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位谷氨酸被赖氨酸替代、NRF2蛋白的第80位苏氨酸被赖氨酸或脯氨酸替代、和/或NRF2蛋白的第82位谷氨酸被天冬氨酸替代的突变型NRF2蛋白，
其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是作为mTOR抑制剂的化疗药。
10.权利要求8或9所述的试剂盒，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质是mTOR或PI3K。
11.权利要求8或9所述的试剂盒，其中mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质是mTOR。
12.权利要求8或9所述的试剂盒，其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是雷帕霉素。
13.检测编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的药剂在制备用于实施获得用于预测食道癌患者的预后的信息的方法的试剂中的用途，该方法包括：
(a)检测源自患者的样品中的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白；并
(b)将测得的编码突变型NRF2的DNA或RNA或者突变型NRF2蛋白的水平与患者的预后关联起来；
其中可抑制mTOR或涉及mTOR上游或下游途径的物质的表达或活化的药剂是作为mTOR抑制剂的化疗药。
14.依照权利要求13的用途，其中编码突变型NRF2的DNA或RNA或突变型NRF2蛋白的高表达水平指示患者的预后不良。
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