CN106222259B - 一种诊治多发性骨髓瘤的分子标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CCDC72基因可以作为多发性骨髓瘤诊断的分子标志物，本发明的实验证明：与正常骨髓组织相比，CCDC72基因在多发性骨髓瘤组织中表达量高。本发明还公开了CCDC72基因可以用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。本发明的研究成果提供了一种新的多发性骨髓瘤临床诊断方法，同时提供了一种治疗多发性骨髓瘤的药物新靶标。

Description

一种诊治多发性骨髓瘤的分子标志物

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测CCDC72异常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法；及抑制CCDC72基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple Myeloma，MM)是发生在B细胞分化终末阶段浆细胞异常增生的恶性肿瘤，浆细胞分化异常，导致骨质受损并引起代谢及免疫功能变异。随着我国人口的老龄化，MM的发病率呈上升趋势。在我国，MM的年发病率为1/10万，西方工业化国家的年发病率为4/10万。在美国，MM的年发病人数为14000人。尽管人们对于MM恶性增生的的认识己有150年的历史，但到目前为止MM仍然是一种不能治愈的肿瘤，平均生存期3年，占造血系统肿瘤死亡率的20％。目前，多发性骨髓瘤(MM)的主要治疗方法仍为联合化疗和自体造血干细胞移植，由于MM的平均发病年龄较高，且50％～70％伴有肾损害，因此多数病人没有造血干细胞移植的机会，只能接受联合化疗。己有研究表明，骨髓微环境中基质细胞不仅对MM细胞具粘附能力，而且还产生许多细胞因子及各种细胞生长因子受体，与MM细胞的生长、迁移和耐药的产生密切相关。寻求针对骨髓微环境中的MM细胞生长及生存机制的靶向治疗一直是人们研究的焦点；鉴于此，深入研究MM细胞生长、生存及归巢机制以及一些促进MM细胞生长、生存及迁移的因素，具有重要的理论和潜在运用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测CCDC72基因或蛋白表达差异来诊断多发性骨髓瘤的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过检测CCDC72基因或蛋白表达差异来预测多发性骨髓瘤预后的方法。

本发明的目的之三在于提供一种通过抑制CCDC72基因或CCDC72蛋白来治疗多发性骨髓瘤的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗多发性骨髓瘤的药物的方法。

本发明的目的之五在于提供一种用于治疗多发性骨髓瘤的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的产品在制备多发性骨髓瘤诊断工具中的用途。

本发明还提供了检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的产品在制备预测多发性骨髓瘤预后工具中的用途。

进一步，所述检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的产品包括检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合CCDC72基因的核酸或者能够结合CCDC72蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CCDC72基因的表达水平；所述物质能够检测CCDC72蛋白的表达水平。

本发明的检测CCDC72基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增CCDC72基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测CCDC72蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的检测CCDC72蛋白的产品包括特异性结合CCDC72蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测CCDC72蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的CCDC72蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对CCDC72蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。

在本发明中，“预后”是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即CCDC72蛋白或编码CCDC72蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。

在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。

在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。

预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中CCDC72基因或CCDC72蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。

进一步，所述检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的产品可以是检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤的工具，所述工具能够检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合CCDC72基因的核酸或者能够结合CCDC72蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CCDC72基因的表达水平；所述物质能够检测CCDC72蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述诊断多发性骨髓瘤的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CCDC72基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于CCDC72基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种预测多发性骨髓瘤预后的工具，所述预测多发性骨髓瘤预后工具包括能够结合CCDC72基因的核酸或者能够结合CCDC72蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CCDC72基因的mRNA水平；所述物质能够检测CCDC72蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述预测多发性骨髓瘤预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CCDC72基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于CCDC72基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗CCDC72抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合CCDC72即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制CCDC72功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。

本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中CCDC72基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的CCDC72基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，CCDC72基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为多发性骨髓瘤，或该受试者被确定为预后不良。

本发明还提供了一种多发性骨髓瘤的治疗方法，所述方法包括抑制CCDC72基因或CCDC72蛋白。

进一步，所述方法包括抑制CCDC72基因的表达，或抑制CCDC72蛋白的表达或抑制CCDC72蛋白的活性。

本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对肿瘤细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量CCDC72基因或者CCDC72蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当CCDC72基因或者CCDC72蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

本发明还提供了一种含有CCDC72基因或CCDC72蛋白的抑制剂的药物。

本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

本发明的CCDC72基因或CCDC72蛋白的抑制剂不受限制，只要是可以抑制CCDC72或涉及CCDC72上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。

进一步，所述抑制剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、CCDC72结合蛋白片段、或抗体或其片段。

“反义核酸”指含有与编码CCDC72的mRNA互补的序列的核酸。反义核酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与靶CCDC72的mRNA100％互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核酸可以根据CCDC72序列信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。

“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpinturn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。

“核酶”指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可以包括锤头、发夹等。

“适体”指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合靶分子即可，可以由例如10至200个核苷酸、优选10至100个核苷酸、更优选15至80个核苷酸、进一步更优选15至50个核苷酸组成。适体可以使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可以采用SELEX(通过指数式富集进行的配体的系统进化)。

“CCDC72结合蛋白的片段”指结合CCDC72且抑制CCDC72实施原始功能的蛋白质的片段。

本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

在本发明的上下文中，“诊断多发性骨髓瘤”既包括判断受试者是否已经患有多发性骨髓瘤、也包括判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断多发性骨髓瘤的分子标志物，使用该分子标志物可以在多发性骨髓瘤发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。

本发明的包括CCDC72基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的多发性骨髓瘤的治疗药物。

附图说明

图1显示抑制CCDC72基因表达对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响；

图2显示抑制CCDC72蛋白功能对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响；

图3显示抑制CCDC72基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响；

图4显示抑制CCDC72基因表达对多发性骨髓瘤细胞侵袭的影响；

图5显示抑制CCDC72基因表达对多发性骨髓瘤细胞迁移的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1基因芯片筛选差异表达基因

1、取材：

多发性骨髓瘤组织：收集确诊的MM患者骨髓活检标本共10例，MM诊断标准参阅《中国多发性骨髓瘤诊治指南2011修订版》。患者中男5例，女5例，中位年龄59岁。

正常骨髓组织：收集同时期营养不良性贫血患者骨髓活检组织标本10例作为对照组，其中男5例，女5例，中位年龄53岁。

2、组织RNA的获取

使用Trizol一步法提取组织总RNA。

3、RNA纯度及浓度的测定

取RNA溶液1μl，仪器测定OD260、OD280，RNA浓度为OD260值×稀释倍数×40/1000，计算OD260/OD280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液纯度高，含蛋白质等杂质少，-20℃保存。

4、RNA完整性检测

(1)取2μl RNA样品行1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)；

(2)分出区带后，genefinder染色，蓝光下观察电泳区带；

(3)当28s/18s约2:1时，说明RNA稳定无降解。

5、基因芯片杂交及扫描

总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。

6、芯片数据处理与分析

杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。

7、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。

8、结果

芯片结果显示，多发性骨髓瘤组织与正常骨髓组织之间共筛选出489个差异表达基因，其中表达水平上调的基因215个，表达水平下调的基因274个。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因

考虑现有技术中还未见关于该基因与多发性骨髓瘤相关性进行研究的基因作为候选基因，同时考虑基因测序的结果，选择CCDC72基因(其表达在多发性骨髓瘤组织中上调)进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集多发性骨髓瘤组织50例，正常骨髓组织60例。

2、在mRNA水平上进行验证

2.1提取组织RNA

步骤同实施例1。

2.2逆转录

逆转录体系共20μL，包括细胞总RNA 2μg/2μL，50U/μL Rnasin 1μL，5×逆转录反应缓冲液4μL，10m M d NTP 2μl，50μg/mL随机引物2μL(promega)，200U/μLM-MLV逆转录酶1μL，DEPC 8μL。

37℃反应60分钟，95℃5分钟终止反应。cDNA在-80℃保存或进行PCR扩增。

2.3PCR

反应体系按照Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)配置，SYBR反应体系共25μL，2.5×Real Master Mix 10μL，20×SYBR solution1.25μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，去离子水10.75μL，cDNA 2μL。反应条件为94℃5min，94℃45s，60℃1min，30个循环，设空白对照。

PCR反应前10个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为Ct值。根据ΔC(t)＝C(t)_目的基因-C(t)_β-actin，ΔΔC(t)＝2^-ΔC(t)，计算目的基因与β-actin相对表达量。

PCR引物序列如下：

CCDC72基因引物序列如下所示：

上游引物：5’-ATGGACGAGGAAGATAAG-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-TTTGCCAGATTTCTTAATTC-3’(SEQ ID NO.2)。

β-actin基因引物序列如下所示：

上游引物：5’-CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5’-AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’(SEQ ID NO.4)

2.4结果

结果显示，与正常骨髓组织相比，多发性骨髓瘤组织中CCDC72基因的mRNA水平明显上调，相对表达量为6.18±0.97，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、在蛋白水平上进行验证

3.1提取组织总蛋白

按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

3.2Western blot检测

将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。

3.3统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将CCDC72蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3.4结果

结果显示，与正常骨髓组织相比，多发性骨髓瘤组织中CCDC72蛋白水平显著增加，相对表达量为3.42±0.75，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3抑制CCDC72基因表达

1、siRNA设计合成

针对CCDC72的siRNA序列：

siRNA-CCDC72：

正义链为5’-UUUGUUUCUGCUUGAAAGCCU-3’(SEQ ID NO.5)

反义链为5’-GCUUUCAAGCAGAAACAAAAA-3’(SEQ ID NO.6)；

以上siRNA序列与阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公司提供。

2、多发性骨髓瘤细胞的培养与转染

2.1细胞培养

RPMI8226细胞采用含有15％胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的RPMI 1640培养基置于37℃，5％CO₂，饱和湿度环境下培养。

2.2细胞转染

(1)转染前24小时，在500μl无抗培养基中接种0.5-2*10⁵个细胞，转染时细胞融合度为30-50％。铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。

(2)用50μl Opti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM，轻轻吹吸3-5次混匀。

(3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl Opti-MEM稀释1μl Lipofectamine2000轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。

(4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。

(5)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

(6)细胞板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养18-48小时。转染4-6小时后可换鲜培养基。

3、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率

3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

3.2逆转录

步骤同实施例2。

3.3QPCR

步骤同实施例2。

3.4结果

结果显示，与siRNA-NC组相比，siRNA-CCDC72能够有效的抑制CCDC72基因的表达，相对表达量为0.42±0.11，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4CCDC72基因的表达对多发性骨髓瘤细胞增殖能力的测定

1、步骤：

将转染48h的RPMI8226细胞按照2*10³细胞/孔接种于96孔板，

根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。

2、结果

结果如图1所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-CCDC72组细胞增殖缓慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，CCDC72基因表达促进了多发性骨髓瘤细胞的增殖。

实施例5多发性骨髓瘤细胞抗体中和实验

1、步骤：

将多发性骨髓瘤细胞RPMI8226接种于96孔细胞培养板中，每孔2*10³个细胞/孔/200μl，细胞贴壁后进行如下处理：

实验组1(对照组)：多发性骨髓瘤细胞中加入无关单抗(1:50)；

实验组2：多发性骨髓瘤细胞中加入抗人CCDC72单抗(1:50)。

将细胞在37℃、5％CO₂培养箱孵育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

结果如图2所示，相比于对照组，加入抗人CCDC72单抗的组细胞增殖减缓。上述实验结果表明，抑制CCDC72蛋白的功能可以抑制多发性骨髓瘤细胞增殖。

实施例6测定CCDC72基因表达对细胞凋亡的影响

1、TUNEL法检测细胞凋亡

(1)根据实施例3的步骤进行细胞转染；

(2)根据原位细胞凋亡检测试剂盒(Chemicon International)说明书，利用共聚焦显微镜定量凋亡细胞；

(3)对TUNEL阳性细胞计数。

2、统计学方法：

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果：

结果如图3所示，相比siRNA-NC细胞组，转染siRNA-CCDC72组细胞凋亡明显加剧，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明CCDC72基因表达抑制了细胞凋亡。

实施例7检测CCDC72基因表达对细胞迁移、侵袭的影响

1、侵袭实验

1.1实验步骤：

(1)上室用Matrigel(人工基底膜)预涂；

(2)在上室中种入转染后的细胞，接种浓度为5*10⁴/100μl细胞，在无血清培养基中培养18h；

(3)将细胞加入到0.1％的FBS的RPMI-1640培养基中培养18h；

(4)在冰上吸取50μl Matrigel；

(5)加入预冷的150μl无血清RPMI-1640培养基中充分混匀；

(6)分别取(5)中混合的Matrigel 50μl，加入到transwell上室，覆盖整个膜；

(7)37℃至过夜，使Matrigel聚合成胶；

(8)细胞用无血清RPMI-1640培养基洗2遍，再加入无血清的RPMI-1640培养基中，至总体积100μl；

(9)将(8)均匀加入Transwell上室中，下层培养液和小室间，避免气泡；

(10)向下室加入500-600μl含5％FBS的RPMI-1640培养，37℃，5％CO₂；

(11)48h后吸尽液体，擦去未穿透的细胞，迁移到膜的下表面的细胞用100％甲醇固定30min，PBS洗2遍；

(12)0.2％结晶紫染色上室30min，PBS洗去多余结晶紫；

(13)倒置显微镜下计数。

1.2结果：

实验结果如图4显示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-CCDC72组细胞侵袭数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2、迁移实验

2.1实验步骤

(1)上室中不需要预涂Matrigel人工基底膜。在上室中种入转染后的细胞，接种浓度为(1*10⁵)/100μl个细胞，在无血清培养基中培养18h；

(2)将细胞加入到0.1％的FBS的无血清RPMI-1640培养基中培养18h；

(3)在冰上用预冷的枪头吸取50μl Matrigel；

(4)加入预冷的150μl无血清RPMI-1640培养基中充分混匀；

(5)分别取(4)中混合的Matrigel 50μl加入到Transwell上室，覆盖整个膜；

(6)37℃至过夜，使Matrigel聚合成胶；

(7)细胞用无血清RPMI-1640培养基洗2次，再加入无血清的RPMI-1640培养基中，至总体积100μl；

(8)将(7)均匀加入Transwell上室中，下层培养液和小室间，避免气泡，向下室加入500-600μl含10％FBS的RPMI-1640培养，37℃，5％CO₂；

(9)48h后吸尽液体，擦去未穿透的细胞，迁移到膜的下表面的细胞用100％甲醇固定30min，PBS洗2遍；

(10)0.2％结晶紫染色上室30min，PBS洗去多余结晶紫；

(11)倒置显微镜下计数。

2.2结果

实验结果如图5显示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-CCDC72细胞组细胞迁移数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述结果表明，CCDC72基因表达有利于骨髓瘤细胞的迁移和侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的产品在制备诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的产品包括检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的表达水平的产品。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合CCDC72基因的核酸或者能够结合CCDC72蛋白的物质；所述核酸能够检测CCDC72基因的表达水平；所述物质能够检测CCDC72蛋白的表达水平。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增CCDC72基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括能够检测CCDC72基因或CCDC72蛋白的表达水平的工具。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述工具包括能够结合CCDC72基因的核酸或者能够结合CCDC72蛋白的物质；所述核酸能够检测CCDC72基因的表达水平；所述物质能够检测CCDC72蛋白的表达水平。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增CCDC72基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

8.CCDC72基因或CCDC72蛋白的抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂能够抑制CCDC72或涉及CCDC72上游或下游途径的物质的表达或活性。