CN106148531A - 下咽癌生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CGB3作为下咽癌的诊治标志物的用途。据此可将CGB3用于开发诊断下咽癌的产品、开发治疗下咽癌的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为下咽癌药物的开发提供新的药物靶点。

Description

下咽癌生物标志物
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测CGB3异常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法；及抑制CGB3基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
背景技术
下咽癌是原发于下咽黏膜上皮的恶性肿瘤,好发于50～60岁男性，约占头颈部恶性肿瘤的1.4～5.0％，占全身恶性肿瘤的0.5％。下咽癌中95％以上为鳞状细胞癌，其中56％～71％的肿瘤细胞分化较差，易于黏膜下广泛扩散。下咽癌好发部位依次为：梨状窝区(70～80％)，下咽后壁区(5～22％)，环后区(3～12％)。由于下咽癌具有以下特性：位置隐蔽，早期多无特异性症状，各种临床症状出现相对较晚；局部呈侵袭性生长并沿黏膜下浸润；易发生颈部淋巴结转移和远处转移(就诊时50％-60％有颈淋巴结转移)，为临床诊疗带来一定难度，故预后较差。因此，通过较为准确、简便的方法检测相关指标，正确评估该恶性肿瘤生物学行为，有助于及时、合理采取综合治疗措施，有利于提高患者生存率。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测CGB3基因或蛋白表达差异来诊断下咽癌的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过检测CGB3基因或蛋白表达差异来预测下咽癌预后的方法。
本发明的目的之三在于提供一种通过抑制CGB3基因或CGB3蛋白来治疗下咽癌的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗下咽癌的药物的方法。
本发明的目的之五在于提供一种用于治疗下咽癌的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测CGB3基因或CGB3蛋白的产品在制备下咽癌诊断工具中的用途。
本发明还提供了检测CGB3基因或CGB3蛋白的产品在制备预测下咽癌预后工具中的用途。
进一步，所述检测CGB3基因或CGB3蛋白的产品包括检测CGB3基因或CGB3蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合CGB3基因的核酸或者能够结合CGB3蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CGB3基因的表达水平；所述物质能够检测CGB3蛋白的表达水平。
本发明的检测CGB3基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增CGB3基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测CGB3蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测CGB3蛋白的产品包括特异性结合CGB3蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测CGB3蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的CGB3蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对CGB3蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
在本发明中，“预后”是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即CGB3蛋白或编码CGB3蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中CGB3基因或CGB3蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
进一步，所述检测CGB3基因或CGB3蛋白的产品可以是检测CGB3基因或CGB3蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断下咽癌的工具，所述工具能够检测CGB3基因或CGB3蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合CGB3基因的核酸或者能够结合CGB3蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CGB3基因的表达水平；所述物质能够检测CGB3蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断下咽癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断下咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CGB3基因的异常与下咽癌相关也属于CGB3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种预测下咽癌预后的工具，所述预测下咽癌预后工具包括能够结合CGB3基因的核酸或者能够结合CGB3蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CGB3基因的mRNA水平；所述物质能够检测CGB3蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述预测下咽癌预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断下咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CGB3基因的异常与下咽癌相关也属于CGB3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗CGB3抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合CGB3即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制CGB3功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。
本发明还提供了一种诊断下咽癌或预测下咽癌预后的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中CGB3基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的CGB3基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，CGB3基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为下咽癌，或该受试者被确定为预后不良。
本发明还提供了一种下咽癌的治疗方法，所述方法包括抑制CGB3基因或CGB3蛋白。
进一步，所述方法包括抑制CGB3基因的表达，或抑制CGB3蛋白的表达或抑制CGB3蛋白的活性。
本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对肿瘤细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量CGB3基因或者CGB3蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当CGB3基因或者CGB3蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
本发明还提供了一种含有CGB3基因或CGB3蛋白的抑制剂的药物。
本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗下咽癌的药物中的应用。
本发明的CGB3基因或CGB3蛋白的抑制剂不受限制，只要是可以抑制CGB3或涉及CGB3上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。
进一步，所述抑制剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、CGB3结合蛋白片段、或抗体或其片段。
“反义核酸”指含有与编码CGB3的mRNA互补的序列的核酸。反义核酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与靶CGB3的mRNA 100％互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核酸可以根据CGB3序列信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。
“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpinturn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。
“核酶”指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可以包括锤头、发夹等。
“适体”指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合靶分子即可，可以由例如10至200个核苷酸、优选10至100个核苷酸、更优选15至80个核苷酸、进一步更优选15至50个核苷酸组成。适体可以使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可以采用SELEX(通过指数式富集进行的配体的系统进化)。
“CGB3结合蛋白的片段”指结合CGB3且抑制CGB3实施原始功能的蛋白质的片段。
本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
在本发明的上下文中，“诊断下咽癌”既包括判断受试者是否已经患有下咽癌、也包括判断受试者是否存在患有下咽癌的风险。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断下咽癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在下咽癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。
本发明的包括CGB3基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的下咽癌的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR检测CGB3基因在mRNA水平上的差异表达；
图2显示利用免疫印迹检测CGB3基因在蛋白水平上的差异表达；
图3显示利用QPCR检测siRNA对CGB3基因表达的干扰效率；
图4显示利用免疫印迹检测siRNA对CGB3基因表达的干扰效率；
图5显示利用MTT检测抑制CGB3基因表达对下咽癌细胞增殖的影响；
图6显示抑制CGB3蛋白功能对下咽癌细胞增殖的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因芯片筛选差异表达基因
1、取材：
8例行同期颈部淋巴结清扫的原发下咽癌患者手术切除癌组织，另取9例非下咽癌疾病患者的下咽正常粘膜组织作为对照。所有癌组织均术后病理证实为下咽癌。全部原发下咽癌患者术前均未行放、化疗，全部病例临床资料完整。
2、组织RNA的获取
使用Trizol一步法提取组织总RNA。
3、RNA纯度及浓度的测定
取RNA溶液1μl，仪器测定OD260、OD280，RNA浓度为OD260值×稀释倍数×40/1000，计算OD260/OD280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液纯度高，含蛋白质等杂质少，-20℃保存。
4、RNA完整性检测
(1)取2μl RNA样品行1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)；
(2)分出区带后，genefinder染色，蓝光下观察电泳区带；
(3)当28s/18s约2:1时，说明RNA稳定无降解。
5、高通量转录组测序
5.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用的TopHat方法的系统默认参数。
5.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
5.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
6、结果
RNA-Sep结果显示，下咽癌组织与正常对照组织之间共筛选出211个差异表达基因，其中表达水平上调的基因54个，表达水平下调的基因157个。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小，我们选择CGB3基因进行验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法收集下咽癌组织45例，正常对照组织50例。
2、在mRNA水平上进行验证
2.1提取组织RNA
步骤同实施例1。
2.2逆转录
反转录使用Primescript 1st strand cDNA synthesis kit试剂盒，操作步骤如下进行：
(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表1所示：
表1反应液体
试剂 剂量
RNA 2.0μg
dNTP 1.0μl
Oligo(dT) 2.0μl
Rnase free dH2O 加至10.0μl
(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；
在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系：
试剂 剂量
5x1st Strand Synthesis Buffer 4.0μl
PrimeScript RTase 1.0μl
RNase Inhibitor 1.0μl
Rnase free dH2O 4.0μl
轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。
采用SYBP Premix Ex TapTM II试剂盒，在Eppendorf Real-time PCR分析仪进行，具体操作如下：
(1)在冰上配制以下PCR反应液：
试剂 剂量
SYBR 10.0μl
正向引物 1.0μl
反向引物 1.0μl
cDNA 2.0μl
ddH2O 6.0μl
总量 20.0μl
引物序列设计如下：
CGB3基因：
5’-CCTTCCTACACCCTACTC-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-AAGTGACCTCAGAGACTC-3’(SEQ ID NO.2)
β-actin：
5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)
(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。
结果釆用相对定量法，运用公式2-△Δct计算。实验重复3次。
△ct＝ct(A)-ct(β-actin)
△Δct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)
结果如图1显示，与正常对照组织相比，下咽癌组织中CGB3基因的mRNA水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、在蛋白水平上进行验证
按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中蛋白浓度。以常规Western-blot方法检测CGB3蛋白变化，各组实验均重复3次，以β-actin为内参，做CGB3蛋白条带吸光度定量分析，表达量以CGB3蛋白/β-actin吸光度的比值代表。
结果如图2显示，与正常对照组织相比，下咽癌组织中CGB3蛋白水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3抑制CGB3基因表达
1、siRNA设计合成
针对CGB3的siRNA序列：
siRNA-CGB3：
正义链为5’-UUUUUUGCGGAUUGAGAAGCC-3’(SEQ ID NO.5)
反义链为5’-CUUCUCAAUCCGCAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.6)；
以上siRNA序列与阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公司提供。
2、下咽癌细胞的培养与转染
2.1细胞培养
下咽癌FADU细胞采用含有 10％胎牛血清(FBS)、青霉素 100U/ml、链霉素 100μg/ml的RPMI 1640培养基置于 37℃，5％CO2，饱和湿度环境下培养。
2.2细胞转染
(1)转染前24小时，在500μl无抗培养基中接种0.5-2*105个细胞，转染时细胞融合度为30-50％。铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。
(2)用50μl Opti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM，轻轻吹吸3-5次混匀。
(3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl Opti-MEM稀释1μl Lipofectamine2000轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。
(4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。
(5)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
(6)细胞板置于37℃，5％CO2培养箱中培养18-48小时。转染4-6小时后可换鲜培养基。
3、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率
3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
3.2逆转录
步骤同实施例2。
3.3QPCR
步骤同实施例2。
3.4结果
结果如图3所示，与siRNA-NC组相比，siRNA-CGB3能够有效的抑制CGB3基因mRNA的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
4、利用Western blot实验检测siRNA的干扰效率
步骤同实施例2。
结果如图4所示，与siRNA-NC组相比，siRNA-CGB3能够有效的抑制CGB3蛋白的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4CGB3基因的表达对下咽癌细胞增殖能力的测定
1、步骤
按照实施例2的步骤进行细胞转染，将转染48小时的细胞消化，接种于96孔培养板中，每孔5000个细胞，每孔200μL细胞悬液，分别培养24h、48、72后，以不加细胞者为空白对照组，每孔加入20μL MTT(0.5mg/mL)，培养箱内孵育4h后小心吸去孔内液体，每孔加入100μL DMSO，振荡10～20min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪测定各孔OD570值，以时间和吸光度值分别为横纵坐标，绘制细胞生长曲线。每孔细胞设置3个复孔。本实验重复3次。
2、结果
结果如图5所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-CGB3组细胞增殖缓慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，CGB3基因表达促进了下咽癌细胞的增殖。
实施例5下咽癌细胞抗体中和实验
1、步骤：
将下咽癌细胞FADU接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/孔/200μl，细胞贴壁后进行如下处理：
实验组1(对照组)：下咽癌细胞中加入无关单抗(1:50)；
实验组2：下咽癌细胞中加入抗人CGB3单抗(1:50)。
将细胞在37℃、5％CO2培养箱孵育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如图6所示，相比于对照组，加入抗人CGB3单抗的组细胞增殖减缓。上述实验结果表明，抑制CGB3蛋白的功能可以抑制下咽癌细胞增殖。
实施例6检测CGB3基因表达对细胞迁移影响
1、迁移实验步骤
(1)将转染24h后的细胞消化，调整细胞密度为105/ml；
(2)24孔细胞培养板每孔加入600μL进口胎牛血清(FBS)，将Transwell小室置入24孔细胞培养板小孔，Transwell小室内加入各100μL RPMI 1640培养基细胞悬液；
(3)24孔细胞培养板孵育24h，将Transwell小室从24孔细胞培养板取出，弃掉培养基，PBS冲洗Transwell小室膜部附着细胞；
(4)取新24孔细胞培养板，小孔内加入甲醇/PBS混合液((1:1)600μL，将Transwell小室放入小孔，使甲醇/PBS混合液从下室(24孔细胞培养板小孔)浸入上室，室温静置15min；
(5)弃掉Transwell小室上室及24孔细胞培养板小孔内甲醇/PBS混合液，下室加入600μL甲醇，将Transwell小室置入小孔，使甲醇从下室(24孔细胞培养板小孔)浸入上室，室温静置15min；
(6)弃掉甲醇，室温下干燥15-30min；
(7)取0.1％结晶紫染液600μL滴入24孔细胞培养板小孔，将Transwell小室置入小孔染色15min；
(8)弃掉0.1％结晶紫染液，蒸馏水冲洗Transwell小室15min，晾干，显微镜下观察，取不同视野拍照计数，实验重复3次。
2、结果
转染siRNA-NC组和转染siRNA-CGB3组每个视野下平均迁移细胞数目分别为(168.23±14.47)个和(77.14土8.21)个，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，CGB3基因表达促进了下咽癌细胞的迁移。
实施例7检测CGB3基因表达对细胞侵袭的影响
1、侵袭实验步骤
实验前从-20℃冰箱取出MatrigelTM基质胶，冰盒上融化，取MatrigelTM基质胶与RPMI 1640培养基按1:6比例混合，制成混合液加入Transwell小室上室，每孔45μL，将Transwell小室置入24孔细胞培养板，转移至37℃5％CO2培养箱孵育30min，后续细胞接种及培养操作同上述细胞迁移实验。培养24h后，弃掉培基，用棉签轻轻拭去Transwell小室上室内MatrigelTM基质胶，勿损伤小室底膜，余操作同细胞转移实验。本实验重复3次。
2、结果
转染siRNA-NC组和转染siRNA-CGB3组每个视野下平均侵袭细胞数目分别为(54.85±6.21)个和(24.94土3.43)个，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，CGB3基因表达促进了下咽癌细胞的侵袭。
实施例8体外克隆形成能力的检测
1、步骤
(1)将转染24h后的细胞消化后制成细胞悬液，细胞计数板计数；
(2)六孔细胞培养板每孔加入2ml 10％FBS-RPMI 1640培养基，按500个/孔细胞密度接种细胞悬液，轻轻混匀；
(3)六孔细胞培养板移至37℃5％CO2培养箱孵育10天，每3天更换培养基1次，每次2ml/孔；
(4)培养结束后，弃掉培养基，PBS缓冲液小心清洗3次，每次5min，室温干燥，甲醇固定15min，弃掉甲醇，室温空气干燥20min；
(5)取0.1％结晶紫染液加入细胞培养板，每孔加入1ml，染色15min；
(6)回收0.1％结晶紫染液，细胞培养板蒸馏水清洗15min；
(7)拍照观察计数，重复试验3次。
2、结果
转染siRNA-NC组平均集落形成数目分别为(175.12±16.30)个，转染siRNA-CGB3组细胞平均集落形成数目为(76.53土4.91)个。上述实验结果表明，CGB3基因表达促进了下咽癌细胞的成瘤能力。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测CGB3基因或CGB3蛋白的产品在制备诊断下咽癌或预测下咽癌预后的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CGB3基因或CGB3蛋白的产品包括检测CGB3基因或CGB3蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合CGB3基因的核酸或者能够结合CGB3蛋白的物质；所述核酸能够检测CGB3基因的表达水平；所述物质能够检测CGB3蛋白的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增CGB3基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.一种诊断下咽癌或预测下咽癌预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测CGB3基因或CGB3蛋白的表达水平的工具。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合CGB3基因的核酸或者能够结合CGB3蛋白的物质；所述核酸能够检测CGB3基因的表达水平；所述物质能够检测CGB3蛋白的表达水平。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增CGB3基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
8.一种治疗下咽癌的药物，其特征在于，所述药物包含CGB3基因或CGB3蛋白的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述抑制剂能够抑制CGB3或涉及CGB3上游或下游途径的物质的表达或活性。
10.权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗下咽癌的药物中的应用。
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