CN105555967A - Cgb2和cgb1基因；癌症的诊断、监测和治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及筛选人组织或流体样品中以癌症(如膀胱癌)中较差预后为特征的基因(尤其是CGB2和CGB1)的表达变化的方法。这些方法应用于筛选、诊断或监测其他常见上皮癌，包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌(包括小细胞肺癌-SCLC)、鼻/咽癌、口/脸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、阴道癌和阴户癌。还公开了通过降低CGB2和CGB1或其产物的表达水平来治疗癌症的方法。

Description

CGB2和CGB1基因；癌症的诊断、监测和治疗
发明领域
本发明涉及筛选人组织或流体样品中以癌症(如膀胱癌)中较差预后为特征的基因的表达变化的方法。这些方法应用于筛选、诊断或监测其他常见上皮癌，包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌(包括小细胞肺癌-SCLC)、鼻/咽癌、口/脸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、阴道癌和阴户癌。
背景技术
对于癌症存在非常少的确定性测试且通常仅使用细胞学确认诊断。细胞的取样仅在显示症状以后且此时通常癌症在治疗功效点以外发展。此时，癌症通常是致命的。目前的癌症诊断方法包括行为、遗传学、生物化学、化学和组织学标志物且通常对特定类型或亚类的癌症是高度特异的。之前已表明人绒膜促性腺激素(hCG)的特定基因及其亚基在具有其基因时是癌症的标志物(JMBidart专利US6,194,154)。
hCG的检测最常用于检测和监测卵巢和睾丸的妊娠滋养细胞疾病和生殖细胞肿瘤。虽然存在相关应用，但很少使用hCG的β亚基(hCGβ)。hCG是一种糖肽激素，其由胎儿胎盘的合胞滋养层产生，并且分子量为约36千道尔顿。其可通过在受精后数天内基于母体血清和尿液中的免疫测定来检测。完整的hCG分子是异质二聚体，其包含特定的β亚基，该亚基非共价结合至α亚基，这对于其它糖蛋白是常见的。hCGβ异位表达于所有上皮癌症的约32％中且与较差预后、快速转移和早期死亡相关。
因为hCG通常仅发现于妊娠中，任何可检测水平的hCGβ都可指示癌症；但升高程度可以是高度可变的且可在癌症患者的血清和尿液以及癌组织本身中检测。hCG和hCGβ都降解为泌尿产物，称作人绒膜促性腺激素β核心片段(hCGβcf)。
hCGβ通过6个hCGβ基因直向同源物的基因簇表达于19q13.32处的染色体19上区域，这6个基因直向同源物最初命名为CGB1、CGB2、CGB3、CGB5、CGB7和CGB8，其靠近编码hLHβ亚基的CGB4基因。后续的测序研究显示，基因CGB7和CGB3还具有等位基因变体，分别是CGB6和CGB9。CGB3现在简称为CGB且可能是LHβ基因(CGB4)附近产生的基因簇中第一个真CGB基因。参见图1。
在妊娠和癌症中，mRNA分析已显示所有CG基因都是有活性的但程度显著不同。自1982年首次描述以来CGB1和CGB2被认为是假基因，因为其似乎无法生成成熟的hCGβ蛋白。由于可变剪接，注意到基因CGB1或CGB2产生的信使比其他基因产生的短并且转录产生三个剪接变体，其中仅一个剪接变体代表可翻译成功能性hCGβ蛋白的产物且这被认为不可能发生。最近，研究表明CGB1剪接变体在妊娠前三个月内受到某种程度的上调。
最初完成LH-CGβ/基因簇的完整克隆后，其他研究表明存在两类生成hCGβ的基因，称作类型I和II。类型I指似乎导致合成117位处具有丙氨酸残基的hCGβ蛋白的CGB7的基因产物且类型II指CGB、CGB5和CGB8的基因产物(其在117位处均编码天冬氨酸残基)。这些研究形成了JMBidart美国专利号6,194,154的基础。最近，其他关于乳腺癌、肺癌和肾癌的研究都显示CGB7以相对低水平表达，这与这些最初所声称的不一致。
在人基因组内整合CGB1和CGB2被认为基于以下结果在基因簇中进化：取代启动子近端处的52bp序列和祖传hCGβ亚基编码基因片段的整个5’-UTR的DNA片段(对于CGB1而言是736bp且对于CGB2而言是724bp)插入，其仍存在于CGB、CGB5、CGB7和CGB8中。基因CGB1和CGB2的外显子2和3的ORF中一个碱基对的移码已被提出导致转录本中任选较早的终止密码子和较短的外显子3。因此，不同于各自生成单个mRNA转录本的CGB、CGB5、CGB7和CGB8，CGB1和CGB2潜在具有多个剪接变体，其与成熟的hCGβ具有很少或不具有类似性。这些变体包括主要的230bp转录本，其编码CGB1和/或CGB2基因的一种理论氨基酸蛋白质(迄今为止未被分离或表征)和三种其他的剪接变体：+47、+166、+176bp(图1)，其含有内含子1内提取的额外的47、166和176bpDNA序列。+47bp变体的替代性理论形式将来自ORF再偏移至经典hCGβ编码转录本且可因此从内含子1的中部生成额外的短转录本(基本是另一个外显子，称作外显子1b)。替代性mRNA+166bp和+176bp可理论上编码长度为约60个氨基酸的较短多肽。
CGB1和/或CGB2(主要是CGB2)的表达与癌症转移相关hCGβ蛋白(CMAhCGβ)的分泌特异性相关；而CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8mRNA)的检测不相关。因此，CGB1和/或CGB2mRNA检测是转移性和侵略性癌症表型的诊断。
CGB7的表达水平似乎总是低于基因CGB1和CGB2(其总被忽略)。CGB1和CGB2在癌症中的表达程度高于CGB、CGB5和CGB8且形成本发明的基础，因为其负责与转移性癌症相关的hCGβ蛋白的表达和分泌。
发明内容
根据本发明，提供了一种检查癌性病症的方法，该方法包括显示CGB1和/或CGB2基因/假基因或至少一种这些基因/假基因的产物的表达。具体而言，该方法检测和/或测量CGB1和/或CGB2的230bp剪接变体或至少一种这些基因的产物的表达。优选地，该产物是蛋白质CMAhCGβ。
在本发明的另一个方面中，提供了一种试剂盒，用于检测CGB1和/或CGB2基因/假基因或至少一种这些基因/假基因的产物的表达。
本发明还提供了CGB2或CGB1的表达产物，优选230bp剪接变体。该表达产物优选是核酸序列、蛋白质或肽。优选地，该产物是蛋白质CMAhCGβ。
CGB1和/或CGB2的表达产物可用于本发明的方法中。因此，在本发明的另一个方面中，提供了用于检查癌性病症(优选上皮癌)的CGB1和/或CGB2的表达产物。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗癌性病症(优选上皮癌)的组合物，其包含能够降低分泌性hCGβ的水平的试剂。该上皮癌优选已被发现分泌hCGβ。该组合物可包含阻止hCGβ表达的试剂，例如siRNA分子。或者，该组合物可包含结合分泌的hCGβ的试剂(如抗体)。
本发明还涉及一种治疗癌性病症(优选上皮癌)的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予有效量的能够降低分泌的hCGβ的水平的试剂。
本发明还提供了一种组合物，其包含能够降低分泌的hCGβ的水平的试剂。
发明详述
CGB1和CGB2在本发明中称作基因而非假基因，原因在于，虽然迄今为止它们被认为是假基因，但已在本申请中显示这些基因是表达的。
根据本发明，提供了一种检查癌性病症的方法，该方法包括显示CGB2和/或CGB1基因/假基因或至少一种这些基因/假基因的产物的表达。具体而言，该方法检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的230bp剪接变体的表达。优选地，通过测定是否存在表达产物和/或表达产物的量来检测和/或测量表达，所述表达产物是例如mRNA、cDNA、肽或蛋白质。获自对象的样品中存在CGB2和/或CGB1的表达产物指示存在CMAhCGβ分泌性癌性病症。具体而言，发现CGB2和/或CGB1的表达产物的水平超过其他CG基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的表达产物的水平(具体而言超过2倍或更多)，且这指示CMAhCGβ分泌性癌性病症。
本文中，“检查”包括一种或多种检测、监测、筛选、诊断和预测癌性病症的方法。存在CGB1和/或CGB2基因的表达产物指示分泌hCGβ的癌症。这些癌症是侵略性癌症形式，即转移性或侵染性，且通常具有较差的存活预后。因此，检测CGB1和/或CGB2基因的表达产物可诊断是否存在癌性病症，并可用于筛选对象以鉴定具有癌性病症的那些对象的方法。此外，其还指示预后。此外，本发明的方法可用于监测癌性病症的进展。例如，这些方法可用于鉴定某一治疗方案是否有效，表达产物水平的降低可显示存在的癌性细胞数目的减少。
可通过检测CGB2和/或CGB1基因的表达产物来显示CGB2和/或CGB1基因的表达。“表达产物”可以是核酸分子(如mRNA)或翻译自核酸序列的氨基酸序列(如肽、前蛋白或蛋白质)。
发明人已发现，CGB2和/或CGB1的230bp剪接变体(本发明中也称作CGβ2θ)是表达的。在该剪接变体中，除去了整个内含子1的序列，如图1所示。因此，生成的230bp转录本缺少内含子1，且外显子1邻接外显子2。这不同于其他理论剪接变体，其中外显子1和2之间存在一些内含子1(参见图1)。这些差异可用于检测是否存在该230bp转录本。230bpmRNA(CGβ2θ)的序列显示于SEQ.IDNO:1。如果翻译在第二个共有ATG处起始，则该230bp转录本编码氨基酸序列(SEQ.IDNO:2)。生成的前蛋白含有不同于其他CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的表达所生成的前蛋白的序列，如表2所示。前蛋白序列中的差异可用于检测230bp转录本的表达。该前蛋白经加工以生成成熟的蛋白质CMAhCGβ，如表2所示。
本发明中，表达和表达产物应理解为指天然mRNA转录产物及其衍生的cDNA，以及天然翻译产物(如前蛋白和蛋白质)。
在优选的实施方式中，检测的表达产物是核酸，优选mRNA。可使用基于230bp转录本和CGB1和/或CGB2基因的其他理论转录本和来自其他CGB基因(即CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的转录本之间的大小和/或序列差异的方法来检测是否存在核酸。此类方法是本领域已知的。这些方法包括逆转录酶PCR(RTPCR)、定量PCR(QPCR)、杂交技术(如凝胶电泳或毛细管电泳后的印迹)和任何核酸测序方法。
在优选的实施方式中，该方法利用与mRNA转录产物杂交的引物，并可使用诸如PCR的技术(包括逆转录酶PCR(rtPCR)和定量PCR(qPCR))扩增序列。正向引物优选杂交外显子1中的序列。该正向引物优选是5’-CGTCCAACACCCCTCACTCC-3’(SEQIDNo:4)。或者，该正向引物与外显子1/外显子2边界处的序列杂交，这将特异性检测230bp转录本。外显子1/外显子2边界存在于SEQ.IDNO:1的碱基110-115之间的区域。反向引物可杂交外显子2中起始位点之后的任何序列。该反向引物优选是5’-5GGCAGCCCTCCTTCTCCAC-3’(SEQIDNo:5)。选择合适的引物序列的方法是本领域技术人员已知的。在本发明的一个优选方法中，使用以下两种引物之一或全部两种：正向5’-CGTCCAACACCCCTCACTCC-3’(SEQIDNo:4)和反向5’-5GGCAGCCCTCCTTCTCCAC-3’(SEQID.NO:5)或其变体。变体包括具有适当功能的类似引物，例如具有单碱基对取代或缺失或可导致230bp转录本或其部分扩增的引物。
任选地，扩增后，可通过根据大小分离扩增产物(例如通过使用凝胶电泳)来测定是否存在230bp转录本。或者，可使用与230bp转录本杂交的探针来测定是否存在扩增的产物。该探针优选选择性杂交230bp转录本，即其不杂交CGB2和/或CGB1基因或其他CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的其他剪接变体转录本。
或者，可使用与230bp剪接变体转录本杂交的探针来检测是否存在230bpmRNA转录产物。该探针优选选择性杂交230bp剪接变体转录本，即其不杂交CGB2和/或CGB1基因或其他CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的其他剪接变体转录本。例如，该探针可与外显子1/外显子2边界处的序列杂交，这将特异性检测230bp转录本。外显子1/外显子2边界存在于SEQ.IDNO:1的碱基110-115之间的区域。可使用本领域已知的方法检测CGB2和/或CGB1基因产物的杂交。例如，通过标记探针或使用探针以起始测序反应。标记的核苷酸可用于显示已生成的序列，且因此已发生杂交。
该探针可形成阵列的一部分。本发明中，术语“阵列”指表面上一定模式的一种或多种核苷酸的空间上限定的排列。该阵列可由表面上至少96、384、536、10000、48000或192000、786000、6000万个离散位置处存在的单个核苷酸组成。该阵列优选形成于芯片上。该阵列可存在于微流体管道中。这些阵列还可位于微量滴定板的底部上或平底微量离心管上。这些优选具有由高光学质量材料组成的底部。
该阵列可以是随机阵列，其中核苷酸随机接合表面。或者，这些阵列可空间寻址。这些核苷酸可以网格图案排列，各核苷酸之间存在规则间隔。这些核苷酸可位于“点”中，连同多种相同序列的其他核苷酸。或者，这些阵列可包含DNA集落。
这些阵列还可由单个聚合物内相同序列的串联拷贝组成，如可通过滚环扩增(RCA)生成的那样(Smirnov等)。
这些多核苷酸可直接或间接接合表面。例如，该过程中使用的酶(如连接酶或聚合酶)可接合固体表面。该酶随后结合靶多核苷酸，因此将其固定于固体表面。
或者，可通过与表面接合的寡核苷酸捕获多核苷酸。该捕获可以通过单链寡核苷酸与单链靶标或双链靶标的单链区域的杂交来完成。或者，多核苷酸或表面固定的捕获探针可包含粘性末端或两者都可具有粘性末端。模板和合成的链可通过连接反应永久性连接至表面。或者，可通过包括针对胸腺嘧啶残基的补骨脂素部分和使用UV光交联来介导永久固定。
可通过本领域技术人员熟知的多种方法使分子接合至固体表面(例如参见Fodor等(1991)、Hegner等(1993)，或Finzi和Gelles(1995))。使用核苷酸以形成阵列并接合核苷酸与阵列的合适方法参见WO02/061126和WO01/57248。
阵列合成或制备生成阵列的寡核苷酸期间，UniCap亚磷酰胺(格兰研究公司(GlenResearch))可用于在寡核苷酸合成中进行有效的加帽。这将通过合成反应阻止不需要的n-1聚体(截短的寡聚物)参与后续测序。
该表面优选是玻璃、二氧化硅或聚合物(如PMDS或含氟聚合物)。基材优选是载玻片、盖玻片、硅晶片、微制造的芯片或多孔板(如平底光学级96孔板)。这些多核苷酸可接合包被表面的材料。例如，可以使用康宁公司(CorningInc)(美国)或埃斯皮生物技术公司(AsperBiotech)(爱沙尼亚)供应的氨基硅烷包被的表面。该表面可使用凝胶材料包被，包括琼脂糖、聚丙烯酰胺或溶胶凝胶。这些多核苷酸可接合至珠、颗粒或结构(如纳米棒或纳米杆)，其可参与生成或调控FRET信号。可使用例如银或金颗粒金属化表面以增强荧光或拉曼信号(Malicka2003；Kneipp1999)。
此外，表面或其上的颗粒可携带电荷或是电偏好的或可经加热以控制测序过程(Hamad-Schifferli,2002)。带电表面特别适用于避免表面上核苷酸的非特异性相互作用。适当的表面包衣包括聚乙胺(参见Braslavsky,2003)和可获自VBC基因组公司(VBCGenomics)(奥地利)的DNA结合载玻片。表面处生成的电场是一种控制表面处核苷酸的吸引和排斥的有用方法(Asanov1998；Sosnowski1997)。
与目前可获得的平行程度相比(现有技术DNA测序仪上单个毛细管内的96桑格测序反应)，整个晶片高密度寡核苷酸阵列可具有分析6000万个反应的容量(例如参见www.perlegen.com网站)。
直至最近，制备单个照相平版掩模的高成本表明制备高密度寡核苷酸阵列的方法仅可用于阵列的大规模生成而不可用于单个阵列的个体设计。然而，德州仪器公司(TexasInstruments)的数字化微镜装置(DMD)在阵列合成中的应用使具体化个体阵列更直接和廉价地。DMD是一种芯片，其包含786000个微机械铝镜的阵列，各镜是单独可寻址的。使用这些小型铝镜以特定方式照射并与光沉积化学联用，可生成寡核苷酸探针的阵列。若干公司和实验室已实施该技术，特别是优创公司(Xeotron)和尼布乐经公司(Nimblegen)。用于制备、杂交和分析高密度阵列的完全一体的台式装置可将整个微阵列实验流水线化为一天内完成(例如Geniomone；Baum等)。Geniomone使用DMD通过表面上生长的DNA链上光不稳定保护基团的空间选择性去保护来建立阵列。各新的阵列设计可简单和迅速地由软件具体化且无需使用照相平版掩模。可制备阵列，从而使用针对基因组中特定区域的寡核苷酸的阵列或用在杂交起源的任何位置处起始过程的n聚体阵列(Gunderson等1998)来起始测序。目前，Geniomone配置为合成48000个寡核苷酸。然而，其可以在一次合成轮次中在一块芯片上合成至少192000条序列。所有合成、杂交和清洗步骤都可在生产商提供的芯片的微流体通道内进行。该系统的益处在于其可基于获得的信息快速迭代阵列合成。
引物和/或探针必须与CGB2和/或CGB1基因转录产物(如230bp转录产物)具有足够水平的相同性，使得其可在合适条件下与转录产物杂交。一条单链核酸被认为与另一条杂交的条件是其之间形成双链体。这发生在一条核酸含有与另一条反向或互补的序列时(相同的排列形成基因组中DNA的正义和反义链的天然相互作用并成为双螺旋构象的基础)。为形成双链体，杂交区域之间无需完全互补；仅需要配对碱基的数目足以在使用的杂交条件下维持双链体。合适的杂交条件是本领域技术人员熟知的。例如，42℃下0.2×SSC/0.1％SDS(中等严谨性的条件)；和68℃下0.1×SSC(高严谨性的条件)。可仅使用一种给定的条件进行清洗，或使用各条件(例如以上文所列顺序每次清洗10-15分钟)。可重复任意或所有清洗。最佳条件将变化并可由本领域技术人员凭经验确定。
或者，本发明的方法中检测的表达产物是蛋白质或前蛋白。前蛋白是230bp转录本的翻译后生成的氨基酸序列。前蛋白经加工和切割以形成分泌的成熟hCGβ。前蛋白含有不存在于成熟蛋白质中的序列。该序列不同于其他CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)生成的和CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本理论上生成的前蛋白中发现的序列，如表2所示。
检测前蛋白的方法可基于230bp转录本生成的前蛋白与其他CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)生成的和CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本理论上生成的那些前蛋白之间大小和/或序列差异。这类方法是本领域技术人员已知的且包括利用特异性结合翻译自CG基因的前蛋白或蛋白质的抗体或凝集素的方法。这些抗体或凝集素优选特异性结合前蛋白中存在但成熟的蛋白质中不存在的氨基酸序列。这些抗体或凝集素优选特异性针对翻译自230bp剪接变体转录本的前蛋白，例如SEQIDNo.2和/或SEQIdNo.16的蛋白质或CMAhCGβ。
术语“抗体”在本文中指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合翻译自CG基因的前蛋白或蛋白质的结合位点的分子，其可以是天然的或部分或完全合成的。该术语还涵盖任何具有特定结合结构域的多肽或蛋白质，所述结合结构域是(或者同源于)抗体结合结构域。这些抗体可来自天然来源，或其可以是部分或完全通过合成生成的。抗体的示例是免疫球蛋白同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同型亚类；包含抗原结合区域的片段(如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd)；和双抗体。抗体可以是多克隆的或单克隆的。
可能利用单克隆抗体或其它抗体并采用重组DNA技术等技术来产生保留原始抗体的特异性的其它抗体或嵌合型分子。这些技术可包括将编码某抗体的免疫球蛋白可变区，或互补决定区(CDR)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400。
由于可以多种方式制备或修饰抗体，术语抗体应理解成涵盖具有所需特异性的结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段、衍生物、抗体的功能性等同物和同源物、人源化抗体，包括含有免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，而无论其是天然或完全或部分合成的。因此包含与另一多肽融合的包含免疫球蛋白结合结构域的嵌合分子或等同物。嵌合抗体的克隆和表达参见EP-A-0120694和EP-A-0125023。人源化抗体可以是具有非人(如鼠)抗体的可变区和人抗体的恒定区的修饰的抗体。制备人源化抗体的方法描述于例如美国专利号5225539。
现已证明完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward,E.S.等，Nature341:544-546(1989))；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab')2片段，其是包含两个连接的Fab片段的一种二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头相连，从而能连接两个结构域以形成抗原结合位点(Bird等，Science242:423-426(1988)；Huston等，PNASUSA85:5879-5883(1988))；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)通过基因融合构建的“双抗体”，多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))。
双抗体是多肽的多聚体，各多肽包含含有免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和含有免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，这两个结构域相连(例如通过肽接头)但无法彼此相关联以形成抗原结合位点：抗原结合位点通过关联多聚体内一个多肽的第一结构域与多聚体内另一多肽的第二结构域来形成(WO94/13804)。
“抗原结合结构域”是抗体的一部分，其包含特异性结合翻译自CG基因产物的前蛋白或蛋白质的一部分或全部的区域。抗体可仅结合翻译自CG基因产物的前蛋白或蛋白质的特定部分，该部分称作表位。可以由一个或多个抗体可变结构域提供抗原结合结构域。抗原结合结构域可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
“特异性”通常用于指以下情况，其中结合部分将不对除其靶标以外的其他分子显示任何显著的结合，且例如与任何其他分子具有小于约30％(优选20％、10％、1％、0.5％、0.3％、0.2％或0.1％)的交叉反应性。
该癌性病症优选是上皮癌。本发明中使用的“上皮癌”包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌(包括小细胞肺癌-SCLC)、鼻/咽癌、口/脸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、阴道癌和阴户癌。本发明的方法特别适用于与侵略性形式的癌性病症联用。本发明中，“侵略性”癌性病症是转移性和/或侵染性的病症。
本发明的方法可在获自对象的样品上进行。该样品可以是血液、尿液、脑脊液、痰液、支气管灌洗液和唾液或组织样品。组织样品包括活检材料、脱落细胞、循环的肿瘤细胞、刷取活检样品和通过拭子获得的细胞(例如鸡上皮细胞)和刷取活检样品(如宫颈刮片样品)。活检材料包括通过任何活检技术获得的细胞，包括刷取活检、切除活检、切开活检、针吸或核心活检。该样品还可包含循环的肿瘤细胞和/或干细胞，其分离自对象的血液。本发明的方法可用于测定血液中发现的循环的肿瘤细胞和循环的干细胞的转移潜力。
可在检测和/或测量CGB2和/或CGB1表达产物(如230bp剪接变体转录本的产物)前从样品中分离或富集细胞。例如，流体样品可经离心以获得细胞沉淀物；循环的肿瘤细胞可分离自血液样品。随后可对细胞进行裂解以检测CGB2和/或CGB1表达产物(如230bp剪接变体转录本的产物)。
本发明的方法还可包括检测和/或测量基因CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8中任意一种或多种的表达。优选检测和/或测量基因CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8中所有基因的表达。优选地，当230bp剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平时，指示存在hCGβ分泌性癌性病症，如CMAhCGβ分泌性癌性病症。优选地，230bp剪接变体的表达水平剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平的倍数为2、3、5、10或更高。最优选地，当230bp剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平的倍数为2时，指示存在hCGβ分泌性癌性病症，如CMAhCGβ分泌性癌性病症。
因此，本发明的方法还可包括使用以下方法，所述方法包括核酸杂交以检测CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物。
在优选的实施方式中，该方法利用与mRNA转录产物杂交的引物，并可使用诸如PCR的技术(包括逆转录酶PCR(rtPCR)和定量PCR(qPCR))扩增序列。正向引物优选杂交跨外显子1至外显子2边界的序列。该正向引物优选是5’-CAGCACCTTTCTCGGGTCAC-3’(SEQIDNo:6)。反向引物可杂交外显子2中起始位点之后的任何序列。该反向引物优选是5’-CAGGGAGTAGGGTGTAGGAAGG-3’(SEQIDNo:7)。或者，限定230bp剪接变体序列5’–CGTCCAACACCCCTCACTCCCTGTCTCACTCCCCCACGGAGACTCAATTTACTTTCCATGTCCACATCCCCAGTGCTTGCGGAAGATATCCCGCTAAGAGAGAGACATGTCAAAGGGGCTGCTGCTGTTGCTGCTGCTGAGCATGGGCGGGACATGGGCATCCAAGGAGCCGCTTCGGCCACGGTGCCGCCCCATCAATGCCACCCTGGCTGTGGAGAAGGAGGGCTGCC–3’(SEQIDNO:1)的任何引物。选择合适的引物序列的方法是本领域技术人员已知的。在本发明的一个优选方法中，使用以下两种引物之一或全部两种：正向5’-CAGCACCTTTCTCGGGTCAC-3’(SEQIDNo:6)和反向5’-CAGGGAGTAGGGTGTAGGAAGG-3’(SEQID.NO:7)或其变体以区分CGB基因表达。同样，变化包括具有适当功能的类似引物，例如具有单碱基对取代或缺失的引物。
任选地，扩增后，可通过根据大小分离扩增产物(例如通过使用凝胶电泳)来测定是否存在CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的产物。
或者，可使用与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物杂交的探针来测定是否存在CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的扩增的转录产物。优选地，该探针选择性杂交CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物，即其不杂交230bp转录本或CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本。
或者，可使用与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物杂交的探针来检测是否存在CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的mRNA转录产物。优选地，该探针选择性杂交CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物，即其不杂交230bp转录本或CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本。
引物和/或探针必须与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物具有足够水平的相同性，使得其可在合适条件下与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物杂交。一条单链核酸被认为与另一条杂交的条件是其之间形成双链体。这发生在一条核酸含有与另一条反向或互补的序列时(相同的排列形成基因组中DNA的正义和反义链的天然相互作用并成为双螺旋构象的基础)。为形成双链体，杂交区域之间无需完全互补；仅需要配对碱基的数目足以在使用的杂交条件下维持双链体。合适的杂交条件是本领域技术人员熟知的。例如，42℃下0.2×SSC/0.1％SDS(中等严谨性的条件)；和68℃下0.1×SSC(高严谨性的条件)。可仅使用一种给定的条件进行清洗，或可使用各条件(例如以上文所列顺序每次清洗10-15分钟)。可重复任意或所有清洗。最佳条件将变化并可由本领域技术人员凭经验确定。
或者，本发明的方法还可包括通过检测和/或测量肽、蛋白质或前蛋白来检测和/或测量CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达。前蛋白是mRNA翻译时生成的氨基酸序列。前蛋白经加工和切割以形成分泌的成熟hCGβ。前蛋白含有不存在于成熟蛋白质中的序列，如表2所示。前蛋白包含SEQIDNO:2或SEQIDNo.15。该序列不同于230bp转录本生成的和CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本理论上生成的前蛋白中发现的序列，如表2所示。
检测前蛋白的方法可基于与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)生成的前蛋白与230bp转录本生成的那些前蛋白以及CGB2和/或CGB1基因生成的其他剪接变体转录本理论上生成的那些前蛋白之间大小和/或序列差异。这类方法是本领域技术人员已知的且包括利用特异性结合翻译自CG基因的前蛋白或蛋白质的抗体(例如通过western印迹)。这些抗体优选特异性结合前蛋白中存在但成熟的蛋白质中不存在的氨基酸序列。这些抗体优选特异性针对翻译自CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)转录本的前蛋白。
本发明还提供了CGB1或CGB2的表达产物。该表达产物优选是230bp剪接变体转录本。该表达产物优选是mRNA转录本。230bpmRNA(CGβ2θ)的序列显示于SEQ.IDNO:1。在一个优选的实施方式中，该表达产物是核酸，其包括
SEQ.IDNO:1的核酸；
编码SEQ.IDNo:2或SEQIDNO:15的多肽序列的核酸序列；
与(a)或(b)的序列基本相同的序列；或其同源物或变体；
与(a)至(c)中任一项的序列互补或杂交的序列。
该表达产物优选是氨基酸序列。该230bp转录本编码氨基酸序列，如SEQ.IDNO:2所示。在一个优选的实施方式中，该表达产物是多肽，其包括SEQ.IDNO:2或SEQIDNO:15或其基本相同的序列，或其同源物或衍生物。该表达产物优选是具有SEQIDNo.2的N端序列的氨基酸。该氨基酸优选包含或由SEQIDNo:15的序列组成。
本领域技术人员应理解，本发明的蛋白质或多肽的同源物或衍生物也可于本发明，即用作抗原性/免疫原性材料。因此，例如，本发明包括包含一个或多个插入、缺失、取代等的蛋白质或多肽。此外，还可使用另一种类似的“类型”取代一个氨基酸。例如，使用另一种疏水性氨基酸取代一种疏水性氨基酸。
可以使用诸如CLUSTALTM的程序比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列并通过在各序列适当位置插入空格来实现最优比对。可以计算最优比对的氨基酸相同性或相似性(相同性加氨基酸类型的保守性)。诸如BLASTx的程序将比较类似序列的最长延伸体(stretch)并为该匹配赋值。因此可以获得其中发现若干类似区域的比较，其各自具有不同的评分。本发明包括全部两种相同性分析类型。
对于同源物和衍生物的情况，与本文所述蛋白质或多肽的相同性程度的重要性程度弱于同源物或衍生物应保留原始蛋白质或多肽的抗原性和/或免疫原性。然而，合适地，提供了与本发明所述蛋白质或多肽至少60％类似(如上文所述)的同源物或衍生物。优选地，提供至少70％类似，更优选地至少80％类似同源物或衍生物。最优选地，提供了至少90％或甚至95％类似的同源物或衍生物。
在一个替代性方法中，该同源物或衍生物可以是融合蛋白，其整合了使纯化更容易的部分，例如通过有效地标记所需蛋白或多肽。可能需要除去该“标签”或者情况可能是融合蛋白本身保留了有用的足够的抗原性。
“基本相同”在本发明中指至少60％相同的核酸或氨基酸序列。本发明的序列可至少60％、70％、80％、90％、95％、97.5％或99％相同。
可通过出于最佳比较目的对齐序列(例如可在第一序列中导入缺口以进行序列的最佳比对)并比较相应位置处的氨基酸残基或核苷酸来测定两条核酸序列或两条氨基酸序列的相同性百分比。“最佳比对”是导致最高百分比相同性的两条序列的比对。通过比较的序列中相同氨基酸残基或核苷酸的数目来测定相同性百分比(即相同性百分比＝相同的位置数目/位置总数x100)。
可使用本领域技术人员已知的数学算法来实现两条序列之间相同性百分比的测定。用于比较两条序列的数学算法的一个示例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264*2268的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873*5877进行了改良。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序也纳入了这种算法。可利用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对(出于比较目的)，可如Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.，25:33893402所述利用缺口BLAST。或者，可使用PSI-BLAST进行迭代搜索，其用来检测分子之间的远近关系(Id.)。利用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一个示例是Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法。作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)已纳入这种算法。本领域已知其它序列分析算法，包括如Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.,10:3-5所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.SciUSA,85:2444-8所述的FASTA。在FASTA内，ktup是设置搜索灵敏度和速度的控制选项。
此外，本发明提供了用于检查癌性病症的CGB2或CGB1的表达产物。
本发明提供了用于检测和/或测量CGB2或CGB1的表达产物(优选230bp剪接变体)的部件的试剂盒，包含用于检测和/或测量230bp剪接变体的表达的试剂。用于检测和/或测量230bp剪接变体的表达的试剂可包括任意以下一种或多种：能够与230bp剪接变体转录本杂交的一组引物、能够与230bp剪接变体转录本杂交的探针，以及能够特异性结合翻译自230bp剪接变体转录本的前蛋白或蛋白质的抗体。例如，该试剂盒可包含与CGB2或CGB1的外显子1内或外显子1/外显子2边界处的序列杂交的正向引物。该正向引物优选是5’-CGTCCAACACCCCTCACTCC-3’(SEQIDNo:4)。该试剂盒还可包含反向引物，该反向引物可杂交外显子2中起始位点之后的任何序列。该反向引物优选是5’-5GGCAGCCCTCCTTCTCCAC-3’(SEQIDNo:5)。该试剂盒还可包含能够与用作对照的管家基因杂交的引物或杂交探针。合适的管家基因是本领域技术人员已知的且包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
该试剂盒优选还包含用于检测和/或测量其他CG基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的表达的试剂。因此，该试剂盒还可包含能够与CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8生成的mRNA杂交的引物或杂交探针。这些引物优选是正向(5’-CAGCACCTTTCTCGGGTCAC-3’)(SEQIDNo:6)和反向5’-CAGGGAGTAGGGTGTAGGAAGG-3’)(SEQIDNo:7)。用于检测和/或测量其他CG基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的表达的试剂还可以是能够特异性结合其他CG基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)所生成的前蛋白或蛋白质的抗体。
本发明的试剂盒还可包含一种或多种赋形剂和/或试剂，以及用于进行本发明方法的材料。这类赋形剂包括缓冲剂、反应溶液、标记物、裂解试剂等。
该试剂盒还可包括用于使用该试剂盒的一组说明。
认为hCGβ的分泌可参与癌性病症的转移，并因此降低分泌性hCGβ的水平可阻止或抑制转移。因此，在本发明的其他方面中，提供了一种治疗hCGβ分泌性癌性病症的方法，包括向有此需要的患者给予药学上可接受量的能够降低分泌性hCGβ水平的试剂。
在另一个方面中，本发明提供了用于医疗(具体而言用于治疗hCGβ分泌性癌性病症)的能够降低分泌性hCGβ水平的试剂。在相关的方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含能够降低分泌性hCGβ水平的试剂和药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。
能够降低分泌性hCGβ水平的试剂可以是降低一种或多种CG基因(具体是CG2和/或CG1)的表达的试剂。合适的试剂包括siRNA分子，其特异性结合CG基因(具体是CG2和/或CG1基因)的序列。该siRNA优选与230bp剪接变体转录本基本互补，或能够与其杂交。这些siRNA分子可包括表3或4所列序列中的任意一种或多种(SEQIDNo16-31)。siRNA(也称作小干扰RNA或沉默RNA)是可用于干扰特定基因表达的一类双链RNA分子。siRNA分子存在于自然中，但也可在实验上用于抑制体外或体内的基因表达。这可通过靶向mRNA以降解、阻止mRNA翻译或通过建立沉默的染色质区域来实现。siRNA分子通常较短，平均长度为20-25个残基。siRNA分子本身的长度可以是15-30个核苷酸，任选长度为15-25个核苷酸，例如长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸，通常19-29个核苷酸。靶核苷酸和/或siRNA的核苷酸通常是连续的，但siRNA分子也可在递送前经历加工或化学修饰以提高其稳定性和/或效力。也可使用双链DNA分子，其之后在体内被加工为较小的siRNA分子，例如通过酶Dicer的作用。
“基本互补”指同与靶核苷酸(或其区段)互补的序列具有至少50％同源性，例如至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％同源性。例如，靶向CGB2和/或CGB1基因产物的siRNA(如230bp剪接变体转录本)可与同CGB2和/或CGB1基因产物(如230bp剪接变体mRNA)的区段互补的19-29残基核苷酸序列至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％同源。因此，核酸形式的CGB2和/或CGB1基因产物抑制剂(如230bp剪接变体抑制剂)可具有与靶核酸或其区段反向互补(反义)的序列。
根据本领域技术人员已知的多种算法，siRNA可简单地设计为靶向特定DNA(或mRNA)序列。这类方法描述于例如Walton等，FEBS,2010,277(23):4806-13和Pei等，NatMethods,2006,3(9)670-6。这些siRNA分子可以经化学修饰以例如提高效率、半衰期或稳定性(例如通过任选地向siRNA双链体的末端添加一个或多个胸腺嘧啶残基)。这类化学修饰描述于例如Bramsen和Kjems,MethodsMolBiol,2011,721:77-103。
为提高siRNA的稳定性，其可经化学修饰。例如，其可通过任何其他包封技术整合至载体、脂质体、囊泡、珠(例如树脂或琼脂糖珠)或微粒以辅助其递送。将药学活性物质整合至微粒描述于WO2006/97725。载体、脂质体、囊泡、珠或微粒可通过本领域技术人员已知的方法靶向适当组织。
其他的递送方法对于本领域技术人员而言显而易见。例如，针对阿尔茨海默病的慢病毒表达的siRNA载体描述于Peng和Masliah,MethodsinMolecularBiology,2010,614:215-224。作为阿尔茨海默病治疗工具的RNA干扰描述于Orlacchio等，Mini-ReviewsinMedicinalChemistry,2007,7(11):1166-76。基于RNAi的代谢病治疗策略描述于Czech等，NatureReviewsEndocrinology,2011,7:473-484。对眼的siRNA局部给药描述于Reich等，MolecularVision,2003,9:210-216。通过系统性给予修饰的siRNA治疗性沉默内源性基因描述于Soutschek等，Nature,2004,432:173-178。用于治疗肌营养不良的siRNA递送描述于Hagstrom等，MolecularTherapy,2004,10:386-398。
如Dykxhoorn等，GeneTherapy,2006,13:541-552所述，对于将siRNA分子递送给患者，存在两种通用方法：使用双链siRNA分子递送或使用基因治疗递送以从病毒载体中表达前体RNA。因此，本发明的实施方式包括这类策略，例如用于本发明的方法和组合物的靶向双链230bp剪接变体mRNA的siRNA分子。关于siRNA分子的制剂和递送的进一步讨论可参见例如Burnett等，BiotechnolJ.,2011,6(9):1130-46，Peer等，GeneTher.,2011,18(2):1127-33，Manjunath和Dykxhoorn,Discov.Med.,2010,9(48):418-30以及Zheng等，ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(30)11975-80。
一旦递送，siRNA分子可靶向mRNA(如编码230bp剪接变体mRNA的mRNA)以进行降解或阻止其翻译，从而沉默基因表达。前体RNA可由酶Dicer的作用加工，其将长双链RNA(dsRNA)分子切割成适用于siRNA和miRNA的短双链片段。因此，进行本发明时，本领域技术人员可使用合适的前体，其通过酶Dicer的作用被原位(体内)加工为合适和有效的siRNA分子。在一些实施方式中，siRNA可靶向基因组DNA并阻止或干扰基因转录。
可通过例如将siRNA纳入颗粒(以避免肾过滤)和通过化学修饰糖主链来延长siRNA分子的半衰期。例如，siRNA可以是2′-O-甲基或2′-氟取代的，或其可在2′位处修饰为2′脱氧核糖。siRNA分子可与脂质(如胆固醇)偶联以提高其半衰期，或其可纳入微粒或脂质体中，且其他技术将是本领域技术人员显而易见的。
本发明的siRNA可通过合适转染试剂的单独、同时或依次递送来给予患者，例如在局部递送至组织(如肺、阴道、皮下肿瘤、肌肉、眼或神经组织)期间。可通过例如快速高压静脉注射(“水力疗法”)或受体介导的系统性递送来实现系统性递送。深度综述提供于Dykxhoorn等。
或者，能够降低分泌的hCGβ水平的试剂可以是能够特异性结合分泌的hCGβ的化合物。该试剂优选是能够结合分泌的hCGβ(如CMAhCGβ)的抗体或凝集素。合适的抗体包括本发明所述的那些。
本发明的组合物可以是单位剂型形式，其每剂量含有预定量的各活性成分。这类单位可用于提供5-100mg/天的化合物，优选5-15mg/天、10-30mg/天、25-50mg/天、40-80mg/天或60-100mg/天。对于式I的化合物，提供的剂量范围是100-1000mg/天，优选100-400mg/天、300-600mg/天或500-1000mg/天。这类剂量可以单次剂量或多次离散剂量提供。最终剂量当然将取决于治疗的病症、给药途径和患者的年龄、体重和状态且将基于医生的判断。
本发明的组合物可以采用任何合适的给药途径，例如通过口服(包括经颊或舌下)、直肠、鼻、局部(包括经颊、舌下或透皮)、阴道或胃肠道外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。这类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与运载体或赋形剂联系。
适用于口服给药的药物制剂的形式可以是离散单元如胶囊剂或片剂；粉末剂或颗粒剂；水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫剂或发泡剂；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。
适用于透皮给药的药物制剂的形式可以是离散贴片，其旨在与接受者的表皮保留延长时间的紧密接触。例如，可通过离子电渗从贴片中递送活性成分，参见PharmaceuticalResearch,3(6),318(1986)。
适用于局部给药的药物制剂可配制为油膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗液、粉末剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶剂或油剂。
对于眼或其他外部组织(如嘴和皮肤)的应用，这些制剂优选以局部油膏剂或乳膏剂的形式施用。当配制为油膏剂时，活性成分可与石蜡或水混溶性油膏基质联用。或者，活性成分可用水包油乳膏基质或油包水基质配制为乳膏剂。
适用于对眼局部给药的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适运载体(尤其是水性溶剂)中。
适用于嘴中局部给药的药物制剂包括锭剂、软锭剂和漱口水。
适用于直肠给药的药物制剂的形式可以是栓剂或灌肠剂。
适用于经鼻给药的药物制剂(其中运载体是固体)包括粒度范围为20-500微米的粗粉末，其以摄取鼻烟的方式给予，即从保持在靠近鼻部的处的粉末容器中通过鼻部通道迅速吸入。对于以鼻喷雾或鼻液滴形式的给药，其中运载体是液体的合适制剂包括活性成分的水性或油性溶液。
适用于通过吸入给药的药物制剂包括可通过各种类型的计量加压气溶胶、喷雾器或吸入器的方式产生的细颗粒粉剂或喷雾剂。
适合阴道给药的制剂可制成阴道栓剂、棉塞剂，乳膏剂、凝胶剂、贴剂、泡沫剂或喷雾剂。
适用于胃肠外给药的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得制剂与指定接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包含助悬剂和增稠剂。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和药瓶，也可通过冻干条件保存这些制剂，临用前只需要加入无菌液体运载体(如注射用水)即可使用。可由无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备临时注射溶液剂和混悬剂。
优选的单位剂量制剂是包含每日剂量或子剂量(如上文所述)或者其合适部分的活性成分的制剂。
应理解，除上述特别提到的成分，这些制剂还可以包括与所检查制剂类型有关领域的其他常规药剂，例如，适宜于口服给药的制剂可以包括调味剂。
现在在参考以下附图的以下实施例中描述本发明的实施方式：
图1提供了hCGβ基因簇的图示和不同hCGβ基因的比较。
A.hCGβ-LHβ基因簇，显示CGB基因、LHB和SNAR的相对位置。直箭头显示转录方向，且空心箭头代表SNAR-G基因。起始密码子–ATG1和ATG2对应于替代性开放阅读框。
B：与CGB、CGB5、CGB7、CGB8基因结构相比基因CGB1和-2的示意图显示CGB基因的外显子和内含子区域且显示阅读通过至内含子1的潜在三个主要剪接变体(+47bp、+166bp、+167bp)。翻译的区域描述为黑色盒；开放阅读框显示为空心盒。SNAR-G位于基因CGB1和-2的外显子1的上游区域且显示为沿基因线较小黑色盒。
图2显示微芯片电泳系统MultiNA上qPCR产物的电泳和电泳图。通过电泳系统MultiNA进行的实时PCR产物分离和分析。A：通过定量PCR对经典CGB基因进行扩增。在适当泳道中观察到所需产物：胎盘、SCaBER、RT112、T24、C2235和C2238。B：基因CGB1和-2的扩增期间获得的PCR产物。产物231bp对应于CGB1和-2的经计算的特定产物，而引物是25bp以下的条带。此外，扩增+166bp剪接变体(通过MultiNa软件计算为396bp)。显示MultiNA分离中上部(UM)和下部(LM)标记物染料的位置，以及碱基对参比质量标记物的位置。梯标(英杰公司(Invitrogen))显示25bp至450bp之间的条带。产物大小中的任何轻微差异都是由不同微芯片上分离中的差异导致的。没有显示模板对照(NTC)和阴性对照(Negctrl)。使用(A)CGB、CGB5、-7和-8引物扩增的大小为81bp和使用(B)CGB1和-2特异性引物扩增的主要产物大小为231bp(计算为229bp)且少量产物大小为396bp的单独的PCR产物的来自MultiNA电芯片系统的代表性电泳图。根据生产商使用LM和UM进行校正。该图的轴显示迁移指数(x)和荧光强度(y)。电泳图中的各峰代表根据分子量迁移的引物或PCR产物的DNA片段。迁移指数与DNA片段长度呈反比且通过软件使用以计算确切大小。
图3显示CGB1和-2qPCR产物的测序分析。CGB1和-2PCR产物(231bp和396bp)的特定测序的各部分经测序显示CGB1和CGB2mRNA之间的单标记物核苷酸差异(分别在核苷酸185和223处–登录号NM_033377.1和NM_033378.1)。这表明，CGB2mRNA的表达是使用CGB1/2特异性引物进行的qPCR中检测的CGB1/2RT-PCR产物的主要来源。
图4显示实时PCR扩增曲线以建立交点值(Cp)。与使用靶向CGB基因的shRNA稳定转染的SCaBER克隆相比，使用非靶shRNA对照载体转染后扩增对照克隆SCaBER(CGB)基因表达。对照克隆对应于Cp为16.44，CGB靶向的克隆的最低Cp(23.95)对应于SCaBER克隆1且最高Cp(27.71)对应于SCaBER克隆2。
图5显示通过基因特异性短发夹RNA(shRNA)慢病毒颗粒敲减人绒膜促性腺激素(CGB)的影响。使用(shRNA)靶构建体沉默后通过实时PCR(qPCR)测量(CGB)mRNA的相对水平，通过ELISA估计培养基中hCGβ的量并通过MTS测量活细胞数目。数据标准化至非靶shRNA转导的细胞所测得的水平(设为100％)。通过实时PCR检测到，克隆1中(CGB)转录本的mRNA水平下降至38％且克隆2中下降至21％。对于克隆1和克隆2，hCGβ的水平下降(分别为下降至对照的20.45％和对照的9.09％)。癌细胞数目在克隆1中减少了55％且在克隆2中减少了40％。
图6显示CGB1和CGB2和经典CGB基因的沉默对于膀胱癌细胞系SCaBER的影响。
6A：hCGβ分泌至使用递增浓度的siRNA(靶向CGB1和CGB2，或CGB、CGB5、-7和-8)处理的SCaBER癌细胞的培养基。数值表达为未处理的对照的百分比且各点是一式两份进行的试验的六次重复的平均值；误差线显示平均值的标准偏差。EGFP沉默代表导入非功能性siRNA的非特异性作用。
6B：RNA沉默对于SCaBER细胞活力的影响–显示递增浓度的siRNA(nmol/l)和活细胞的相对水平。MTS试验值表示为未处理对照的百分比。结果是来自试验的六个重复的平均值。误差线代表平均值的标准差。EGFP沉默代表导入非功能性siRNA的非特异性作用。
应理解，下文和/或附图中显示的多种特征是优选的而非必需的。所述和/或所示特征的组合不认为是仅有的可能的组合。除非另有说明，实际应用时，可忽略、改变或以不同组合合并单个特征。
实施例1：CGB2和CGB1基因表达
使用人膀胱癌细胞系RT112、SCaBER和T24；乳腺癌细胞系C2235和C2238；前列腺癌LN-CAP和PC-3。使用妊娠末三个月胎盘作为阳性对照。
这些细胞系获自美国典型培养物保藏中心(美国玛纳萨斯)和欧洲动物细胞培养物保藏中心(英国多塞特郡波顿镇)。细胞在37℃和5％CO2下培养于附加有10％胎牛血清(FBS)(英杰公司)和5％抗生素的RPMI-1640介质(英杰公司)中。
使用SV总RNA分离系统(普洛麦格公司(Promega)，英国)从所有细胞系以及正常足月胎盘组织(妊娠第38周时阴道递送后获得的胎盘–阳性对照)和新鲜水虾(阴性对照)中分离总RNA。通过以1:3比率使用寡聚dT引物和随机六聚体的VersocDNA试剂盒(赛默科技公司(ThermoScientific)，英国)使用1μg总mRNA作为第一链合成cDNA。
在Quantica热循环仪(Techne，巴洛沃德科学公司(BarloworldScientificLtd))中进行所选乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌细胞系和胎盘组织的CGB基因表达的相对定量，其中使用带生产商推荐的ROX被动参比染料的ABsoluteTMBlueQPCRGreenMix试剂盒(赛默科技公司)。以25μl的总体积进行PCR扩增，其含有Green混合物(3mMMgCl2、100nmROX、0.2mMdNTP、1UTaqDNA聚合酶)、70nM的特定正向和反向引物(表1)和2μl的cDNA样品。扩增程序由以下组成：1次循环的95℃持续10分钟，随后是40次循环的95℃持续10秒，退火60℃持续5秒，并72℃持续9秒。45次循环结束后，进行解离曲线分析以确认预期产物的解链温度。所有引物都设计于NCBI/Primer3–BLAST工具且购自西格玛公司(SigmaLifeScience)。一组引物特异性针对CGB1/2：正向引物(5’-CGTCCAACACCCCTCACTCC-3’)(SEQ.IDNO:4)设计为与人绒膜促性腺激素β多肽1(CGB1)的mRNA和人绒膜促性腺激素β多肽2(CGB2)的mRNA(GeneBank登录号分别为NM_033377和NM_033378)的核苷酸118-137退火，且反向引物(5’-GGCAGCCCTCCTTCTCCAC-3’)(SEQ.IDNO:5)与mRNA的核苷酸329-347退火。该组引物跨内含子1且应检测所有主要剪接变体(其已在前面的胎盘中描述)。
第二组引物(F5’-CAGCACCTTTCTCGGGTCAC-3’(SEQ.IDNO:6)和R5’-CAGGGAGTAGGGTGTAGGAAGG-3’(SEQ.IDNO:7))特异性针对CGB、CGB5、CGB7和CGB8mRNA，其设计为与mRNA(GeneBank登录号NM_033183)的核苷酸10-30和核苷酸73-95退火。
为检查逆转录酶反应的完整性，使用特定的引物组(F5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAG-3’(SEQ.IDNO:8)和R5’-GTGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’(SEQ.IDNO:9))扩增的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的管家基因的表达被用作内源性对照(GeneBank登录号NM_002046)。NTC(无模板对照)含有完整的qPCR主混合物但不含cDNA。作为阴性对照，我们使用来自虾的非人cDNA。所有实验都重复三次并计算平均20个交叉点(Cp)值。
根据针对DNA-500试剂盒(岛津公司(Shimadzu))的生产商说明书通过微芯片电泳系统MCE202MultiNA(岛津公司)来检测实时PCR产物。基于25bpDNA梯标(英杰公司)的分离来估计DNA产物的长度。应用MultiNA电芯片系统可通过MultiNAViewer软件非常精确地估计qPCR产物的大小。此外，为完全鉴定qPCR产物，将其在1％琼脂糖凝胶上分离，切割并用PureLinkTM快速凝胶提取试剂盒(英杰公司)纯化，随后通过GATC生物科技公司(GATCBiotech)(英国伦敦)进行测序(正向和反向)。对生成的序列进行Blast序列分析以鉴定其与NCBI基因数据库中保存的那些序列的同源性。
为计算CGB基因的相对量，我们应用Livak和Schmittgen所述的ΔΔCp方法。检查的癌细胞系中CGB1/2和CGB、CGB5、CGB7、CGB8的转录水平在其管家基因GAPDH含量的基础上标准化并相对于胎盘组织中的基因表达(校正物)进行计算。在计算中使用平均交点值。最终结果表示为相对于校正物基因表达水平(等于1.0)的CGB表达中的N倍差异。
收集来自75cm2烧瓶上生长的融合细胞培养物的介质并通过游离hCGβ试验测试以估计分泌的蛋白质的量。从烧瓶中在胰蛋白酶-EDTA释放后使用血球计数器估计细胞数目。
使用用于高特异性检测hCG的游离β亚基的前文所述双位点FBT-11免疫酶度量试验(immunoenzymometricassay)。该系统利用一种独特的小鼠单克隆抗hCGβ抗体FBT11(其针对hCGβ的表位β6/7)作为捕获抗体和与辣根过氧化物酶偶联的兔抗hCGβ(4001-POD)，其是识别β1表位的核心抗体，以用于检测。使用去离子水中稀释(1:1)的TMB试剂(西格玛公司)的溶液来定量过氧化物酶并生成蓝色产物。通过添加2NHCl终止反应并在FLUOstarOPTIMA(BMG实验室技术公司(BMGLabtech))上在450nm处通过分光光度计测量吸光度。每次在50ng/ml至0.5ng/ml的连续稀释浓度范围下针对重组hCGβ(西格玛公司)的标准曲线校正反应，其已针对hCGβ的国际参比制备物(NIBSC公司，英国波特斯巴)校正。使用USAhCG参比服务“内部”完整hCGELISA定量完整hCG浓度，其中利用McAb2119和4001-POD的抗体组合。
结果
hCGβ基因簇被分为两类基因：CGB、CGB5、7、8和CGB1/2，通过使用序列特异性引物我们单独地扩增基因以定量表达水平。似乎没有产物来源于基因组DNA，引物没有扩增到分别对应于481或约629bp的预测产物(含有整个内含子序列)。
在测试的所有膀胱癌(SCaBER、T24、RT112)、乳腺癌(C2235、C2238)和前列腺癌(LN-CAP、PC-3)细胞系中，都检测到CGB、CGB5、7和8的转录本(图2-A)。胎盘对照组织也显示存在CGB、CGB5、7、8转录本。标准化的平均交点(Cp)值在癌细胞之间存在差异且显示CGB基因在所选癌细胞系中的不同表达水平。MultiNA系统上qPCR产物的分离确认存在具有经计算大小的预测的PCR产物(图2-B)。CGB1、2基因的转录本仅发现于膀胱癌细胞系SCaBER和RT112和乳腺癌细胞系C2235中(图2-A)。所有qPCR产物都通过MultiNA电泳分离，其中检测到231bp产物(预测是229bp产物)。此外，在这些细胞系中，对于CGB1/2qPCR检测到396bp的较低丰度高分子量产物(图2-B)。这些产物(81bp、229bp、396bp)经测序并与已知的CGBGenBank序列数据库比对。
CGB(3)、5、7、8qPCR中生成的81bp产物与已知mRNA和这些CGB基因的预测序列比对。对于CGB1/2的229bp和396bpqPCR产物，扩增序列分析鉴定到该产物由CGB2的表达生成(参见图3)，因为其在185和223处相差两个核苷酸(对于基因1和2，登录号分别为NM_033377.1和NM_033378.1)。这些序列位置处检测的主要核苷酸是的CGB2(GeneBank登录号NM_033378.1)C和G。
较低丰度高分子量qPCR产物(396bp–图2-B)对应于睾丸和胎盘中前述基因CGB1/2的剪接变体之一。存在该剪接变体包括来自内含子1的额外166个碱基对(由MultiNA分离系统测得为165)。该较大片段显示对应于CGB基因的内含子1核苷酸序列的预测纳入区域的碱基对。
定量CGB基因的水平并将其与足月胎盘中CGB基因的表达水平相比较。在我们的测试样品中，CGB、CGB5、7、8基因在胎盘组织中最高。癌细胞系中CGB、CGB5、7、8mRNA的表达发生变化但在大多数情况中小于胎盘中观察到的表达水平的1％。膀胱癌细胞系T24中的表达是1.6％，SCaBER是3.1％，其两种乳腺癌细胞系表现是6％(C2335)和25％(C2238)，这些百分比都基于胎盘对照组织中观察到的表达水平(参见表格)。
来自基因CGB1/2的mRNA在三种膀胱癌细胞系的两种中检测到；SCaBER和RT112显示与足月胎盘相比显著较高的转录本水平，两者都高128倍。与胎盘对照样品相比，乳腺癌细胞系C2335显示高32倍的CGB1/2mRNA表达(参见表1)。
通过特异性hCGβELISA测量是否存在分泌至培养基的游离hCGβ蛋白及其量。介质中最高水平的hCGβ蛋白发现于膀胱癌细胞系SCaBER(4.4ng/106个细胞/24h)、乳腺癌细胞系C2235(2.3ng/106个细胞/24h)和膀胱癌细胞系RT112(0.78ng/106个细胞/24h)。在剩余的癌细胞系(T24、PC-3、LN-CAP、C2238)中，没有可用该方法在介质中检测到的hCGβ(小于0.5ng/106个细胞/24h)。在任何培养基中都没有检测到完整的hCG(参见表1)。
实施例2–siRNA介导的hCGβ表达沉默
方法1–所有hCGβ方法，稳定的蛋白质敲减
使用生成小干扰RNA(siRNA)的基于慢病毒的shRNA来转导hCGβ分泌性癌细胞。在这些检查中使用靶向CGB基因的不同外显子区域的两种不同的shRNA基因特异性构建体。通过嘌呤霉素耐性克隆选择建立稳定的基因沉默。通过实时聚合酶链式反应(PCR)测量CGBmRNA水平的下降并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测蛋白质。随后通过MTS(四氮唑盐还原)试验估计对于细胞群体生长的影响。
shRNA慢病毒转导。使用shRNA慢病毒转导颗粒(西格玛奥德里奇公司，英国普尔)敲减表达hCGβ的膀胱癌细胞系SCaBER中的CGB，其衍生自先前已研究的人膀胱的鳞状细胞癌(ATCC，美国马里兰州罗克维尔)。除海美溴铵(hexadimethrinebromide)(8μg/ml)外，还根据生产商的方案使用含有基因特异性序列的发夹插入的TRC1-pLKO.1-puro进行癌细胞转导以增强转导效率。靶向CGB基因(外显子2或3)的shRNA构建体中插入物的序列(登录号NM033043)示于表3。通过对嘌呤霉素(500ng/ml)的细胞耐受性建立稳定的基因敲减。分离克隆并建立若干亚克隆细胞系。含有不靶向任何人序列但可激活RNA诱导的沉默复合物(RISC)和RNAi通路的插入物序列的非靶shRNA对照载体(西格玛奥德里奇公司，英国普尔)用作阴性对照。此外，使用对照载体pLKO.1-puro(无shRNA插入)(西格玛奥德里奇公司，英国普尔)以及未处理的野生型细胞。
RNA提取和cDNA合成。定量实时PCR使用SV总RNA分离系统从所选的细胞克隆中提取总RNA(普洛麦格公司(Promega)，英国南安普顿)。使用1微克总mRNA通过VersocDNA试剂盒(塞默科技公司(ThermoScientific)，英国莱切斯特)进行cDNA的第一链合成。通过实时PCR测定CGB转录本量(夸迪卡公司(Quantica)，英国斯通泰克尼)；使用设计为扩增编码hCGβ蛋白(NM_033043)的任何CGB基因的特异性引物：正向引物5’-TCACCGTCAACACCACCATCT-3’SEQ.IDNO:32和反向引物5’-ATGGAGTCGAAGCGCACATC-3’SEQ.IDNO:33并且管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；NM_002046)的水平使用以下引物测量：正向引物5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAG-3’(SEQ.IDNO:8)和反向引物5’-GTGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’(SEQ.IDNO:9)。根据ABsoluteTMBlueQPCRGreenMix试剂盒(塞默科学公司)的方案进行实时PCR。NTC(无模板对照)含有完整的qPCR主混合物但不含cDNA模板。作为阴性对照，我们使用来自虾的非人cDNA。所有实验都重复三次并计算平均交叉点(Cp)值。
CGBmRNA转录本水平的相对定量。使用Livak和Schmittgen所述的ΔΔCp方法对CGB基因表达进行相对定量。针对管家基因GAPDH的水平标准化CGB基因的转录水平并使用平均交点值相对于使用非靶shRNA对照载体(校正物)转导的细胞中的基因表达水平计算。最终结果表达为相对于校正物基因表达(设为100％)的CGB表达中的差异百分比。
hCGβ特异性ELISA。通过特异性游离hCGβELISA测定hCGβ的合成和释放至培养基，其中使用针对hCGβ的表位β6/7的单克隆抗体FBT11和捕获抗体–与辣根过氧化物酶偶联的兔抗hCGβ(4001-POD)，其是识别β1表位的核心抗体。该试验先前已验证和描述。这里使用的标准品是重组hCGβ(西格玛公司)，其针对于hCGβ的第一国际参比制备物(IRP)(NIBSC公司，英国波特斯巴)进行校正(浓度范围为0.5ng/ml至50ng/ml)。收集来自75cm2烧瓶上生长的融合细胞培养物的介质并测试以估计标准化至1x106个细胞的分泌的蛋白质的量。
细胞增殖(MTS)试验对于活力试验，使用20μl的CellTiterAOneSolution细胞增殖试验试剂(普洛麦格公司)替换细胞培养孔中100μl的完全生长介质。将板在37℃下在具有95％空气、5％CO2的潮湿的气氛中孵育1-4小时直至显色并随后在FluostarOPTIMA(BMG实验室科技公司(BMGLabtech)，英国爱斯勃雷)上在490nm处测量吸光度。针对对照达到的光学密度(设为100％)标准化数据并表达为细胞数目变化百分比。
结果
稳定的CGB基因沉默对于蛋白质表达和细胞生长的影响。克隆的实时PCR分析显示，与使用非靶shRNA对照载体转导的SCaBER细胞相比，hCGβmRNA转录本水平下降约60％-80％(分别为克隆1和克隆2)(图4)。类似地，克隆1和克隆2的培养基中的hCGβ蛋白浓度分别下降至20％和9％。在相同的时间和相同的条件下，与来自野生型SCaBER细胞的培养基中的4.4ng/ml相比，耗尽的培养基中的hCGβ浓度下降至0.4和0.9ng/ml。培养72小时后，通过MTS试验测得，与野生型细胞SCaBER相比，具有稳定敲减的SGB表达的亚克隆细胞群体减少(图5)。对照(非感染细胞)与接触对照载体非靶shRNA的细胞之间在hCGβ转录本水平、蛋白质分泌和细胞生长方面存在小于5％的差异(参见图5)。
方法2–特异性CGB1/2方法，瞬时蛋白质敲减
siRNA双链体(西格玛-奥德里奇公司，英国多塞特郡)设计为主要靶向CGB2(GenBank登录号NM_033378)和CGB8(GenBank登录号NM_033183)的公开的序列生成的mRNA。这些双链体组在靶标上不同但CGB2siRNA双链体与CGB1显著地交叉杂交(100％)，且CGB8siRNA双链体与所有经典CGB基因都显著地交叉杂交(大于95％)(表5)。根据生产商的方案使用CodeBreakerTMsiRNA转染试剂(英国普洛麦格公司)用siRNA双链体转染膀胱癌细胞系SCaBER细胞。将总共5×103个细胞/孔置于96孔板中的100μl完全生长培养基中(BD公司(BDFalcon)，英国牛津郡牛津)并允许生长24小时(直至其50％融合)。随后在6个重复的组中使用终浓度为15nM、20nM和25nM的siRNA转染细胞。在37℃和5％CO2下将板再孵育72小时。包括非特异性siRNA靶向的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为转染应答对照。阴性对照是使用转染试剂(CodeBreakerTMsiRNA；普洛麦格公司)但不使用任何siRNA处理的细胞。
特异性CGB基因沉默之前和之后的75cm2烧瓶中生长融合细胞培养物的介质经收获以用于hCGβ蛋白定量。使用前文所述双位点FBT-11hCGβ酶免疫试验估计hCGβ浓度。使用血球计数器估计培养后细胞数目并将其用于标准化蛋白质浓度(1×106个细胞)。针对重组hCGβ(西格玛公司)(范围为50pg/l至0.5pg/l)的标准曲线校正试验，其已针对hCGβ的第一国际参比制备物(批次75/551；NIBSC公司，英国波特斯巴)校正。使用USAhCG参比服务内部完整hCGELISA定量完整hCG浓度，其中利用McAb2119和4001-POD的抗体组合。针对hCG的第三国际标准制备物(批次75/589；NIBSC)进行校正。完整hCG试验的检测限值(最低标准)是0.75pg/l。
对于活力试验，如上文所述将细胞接种于完全生长培养基中。使用20μl的CellTiterAOneSolution细胞增殖试验试剂(普洛麦格公司)替换生长培养基并将细胞在37℃下在具有95％空气、5％CO2的潮湿的气氛中孵育1-4小时直至显色。3-[4,5,二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧甲氧基-苯基]-2-[4-磺苯基]-2H-四氮唑盐(MTS)是已知四氮唑盐还原型试验方法-在FluostarOPTIMA(BMG实验室科技公司，英国爱斯勃雷)上在490nm处测量吸光度并测量光密度并表示为相对于96孔板中对照培养物的百分比变化。针对未处理的对照达到的光学密度标准化数据并表达为细胞数目变化百分比。随后收集板之间的数据并表示为来自五次实验的标准化的细胞群体中的平均值和标准差变化。在ANOVA或Friedman双向分析中使用StatsDirectTM(埃尔垂卡姆公司(Altrincham)，英国柴郡)软件分析统计学显著性(数据未正常分配)。
结果–实施例2方法2
siRNA对照转染后，膀胱癌细胞的分泌的hCGβ蛋白水平范围是3-4.6pg/l。siRNACGB2寡聚双链体(25nM)使分泌下降对照的96％而CGB8寡聚双链体使分泌下降对照的42％。在所有浓度下，我们都观察到siRNA双链体有效地抑制CGB表达(图6A)。我们还检查了培养物中的细胞活力是否能在沉默后改变以确定hCGβ分泌对于存活率的影响。在所有siRNA浓度下，CGB2寡聚双链体都显著减少细胞数目：25nM减少对照的44％(p<0.0001)，20nM减少对照的24％(p＝0.0011)，且15nM减少对照的19％(p＝0.02)(图6B)。相反地，针对不相关蛋白质(EGFP)的序列的对照siRNA无法在相对细胞数目方面产生任何显著的减少，仅下降13％(p＝0.22)。通过siRNA寡聚双链体靶向CGB8基因时，仅最高浓度(25nM)导致细胞生长显著降低对照的23％(p＝0.0004)(图6B)。对照EGFP序列的非特异性沉默对细胞数目没有影响(1.01％,p＝0.42)。
表4提供了用于沉默CGB基因的siRNA序列的细节。siRNA序列用于沉默CGB2(和1)和CGB8(和CGB、CGB5、-7和-8)；其映射至外显子1上碱基对的mRNA上位置(分别根据GenBank登录号NM_033378(CGB2)和NM_033183(CGB8))和siRNA双链体与不同的CGB基因序列之间的同源化程度。
该说明书中，词语“优选的”(或其任何衍生形式)指示一个或多个特征是优选但非必需的。
本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任方法或工艺的所有步骤可以任何方式组合，除了其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合。
除非另有说明，该说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的各特征可由具有相同、等同或类似目的替代性特征替换。因此，除非另有说明，所公开的各特征仅仅是一系列等同或相似特征的一个示例。
本发明不限于任何上述实施方式的细节。本发明延伸至本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)所公开特征的任一新型种类或任何新型组合，或者延伸至如此公开的任何方法或工艺步骤的任一新型种类或任何新型组合。
表1
表4

Claims (34)

1.一种检查上皮癌的方法，所述方法包括检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的表达产物。
2.如权利要求1所述的方法，所述CGB2和/或CGB1基因的表达产物是CGB2和/或CGB1基因的230bp剪接变体。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括检测和/或测量基因CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8中任意一种或多种的表达。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的表达产物包括检测mRNA、cDNA、肽或蛋白质的水平。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的表达产物包括检测mRNA或cDNA的水平。
6.如权利要求5所述的方法，所述方法使用与所述CGB2和/或CGB1基因的外显子1内序列杂交的引物和/或与所述CGB2和/或CGB1基因中外显子2内起始位点之后序列杂交的反向引物。
7.如权利要求6所述的方法，其中，正向引物与所述CGB2和/或CGB1基因的外显子1/外显子2边界处的序列杂交。
8.如权利要求6所述的方法，其中，正向引物是5’-CGTCCAACACCCCTCACTCC-3’(SEQIDNo:4)和/或所述反向引物是5’-5GGCAGCCCTCCTTCTCCAC-3’(SEQID.NO:5)。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，所述方法还包括使用所述正向引物5’-CAGCACCTTTCTCGGGTCAC-3’(SEQIDNo:6)和/或所述反向引物5’-CAGGGAGTAGGGTGTAGGAAGG-3’(SEQID.NO:7)。
10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，所述方法使用核酸杂交来扩增CGB基因。
11.如权利要求5-9中任一项所述的方法，所述方法使用能够与所述CGB2和/或CGB1基因的核酸表达产物杂交的核酸探针。
12.如权利要求11所述的方法，所述核酸探针形成阵列的组成部分。
13.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的表达产物包括检测肽、蛋白质或前蛋白的水平。
14.如权利要求11所述的方法，所述肽、蛋白质或前蛋白包含SEQIDNo.2。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法在获自对象的样品上进行。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述样品选自血液、尿液、脑脊液、痰液、支气管灌洗液和唾液或组织样品。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述样品包含分离自对象血液的循环的肿瘤细胞和/或干细胞。
18.一种用于检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的表达的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测和/或测量所述CGB2和/或CGB1基因的表达产物的试剂。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中，用于检测和/或测量所述CGB2和/或CGB1基因的表达的试剂选自以下任意一种或多种：
(a)能够与230bp剪接变体转录本杂交的一组引物；
(b)能够与230bp剪接变体转录本杂交的探针；以及
(c)能够特异性结合翻译自230bp剪接变体转录本的前蛋白或蛋白质的抗体。
20.如权利要求12或13所述的试剂盒，所述试剂盒还包含能够与用作对照的管家基因杂交的引物或杂交探针。
21.一种治疗hCGβ分泌性癌性病症的方法，所述方法包括向有此需要的患者给予药学上可接受量的能够降低分泌的hCGβ水平的试剂。
22.如权利要求15所述的方法，所述能够降低分泌的hCGβ水平的试剂是降低一种或多种CGB基因表达的试剂。
23.如权利要求15或16所述的方法，所述试剂是特异性结合CGB基因的序列的siRNA分子。
24.一种用于医疗的能够降低分泌的hCGβ水平的试剂。
25.如权利要求24所述的试剂，所述能够降低分泌的hCGβ水平的试剂是降低一种或多种CGB基因表达的试剂。
26.如权利要求24或25所述的试剂，所述试剂是特异性结合CGB基因的序列的siRNA分子。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含能够降低分泌的hCGβ水平的试剂和药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。
28.如权利要求27所述的药物组合物，所述能够降低分泌的hCGβ水平的试剂是降低一种或多种CGB基因表达的试剂。
29.如权利要求27或28所述的药物组合物，所述试剂是特异性结合CGB基因的序列的siRNA分子。
30.一种CGB1或CGB2的表达产物。
31.如权利要求30所述的表达产物，所述表达产物是230bp剪接变体转录本。
32.如权利要求31或32所述的表达产物，所述表达产物包含选自下组的核酸
(a)SEQ.IDNO:1的核酸；
(b)编码SEQ.IDNo:2或SEQIDNo:15的多肽序列的核酸序列；
(c)与(a)或(b)的序列基本相同的序列；或其同源物或变体；
(d)与(a)至(c)中任一项的序列互补或能够与其杂交的序列。
33.如权利要求30所述的表达产物，所述表达产物是氨基酸序列。
34.如权利要求30所述的表达产物，所述表达产物是SEQ.IDNO:2或SEQIDNO:15的多肽或基本相同的多肽，或其同源物或衍生物。
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