MX2010011587A - Terapia antiviral. - Google Patents

Abstract

La solicitud se refiere a tratamientos para mejorar las terapias antivirales, y a un método para determinar si las terapias antivirales serán efectivas o no. En particular, la presente solicitud proporciona un método para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga una infección viral del hígado, responderá a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Inteferón (IFN), y kits para llevar a cabo esta determinación.

Description

TERAPIA ANTIVI RAL La presente invención se refiere a tratamientos para mejorar las terapias antivirales y a un método para determinar si las terapias antivirales serán o no efectivas.

Las infecciones virales representan una seria amenaza para la salud y se sabe que son una importante causa de patolog ía para los animales y para el hombre, por ejemplo, la infección por el virus de hepatitis C (HCV) es una importante causa de enfermedad hepática crónica en todo el mundo. U na característica importante y sorprendente de la hepatitis C es su tendencia a la cronicidad . En más del 70 por ciento de los individuos infectados, el virus de hepatitis C (HCV) establece una infección persistente durante décadas que puede cond ucir a cirrosis y carcinoma hepatocelular.

U na hipótesis interesante en la biología del virus de hepatitis C (HCV) propone q ue la proteasa de NS3-4A viral no solamente procesa las proteínas virales, sino que también disocia e inactiva los componentes de las sendas sensoriales intracelulares que detectan la infección viral e inducen la activación de transcripción de los interferones tipo I (I FN), uno de los objetivos de NS3-4A es TRI F (I FN B ind uctor del adaptador que contiene el dominio TIR) , un vínculo esencial entre la detección del dsADN en los endosomas mediante el TLR3 (receptor tipo-toll 3), y la inducción del I FNB. Más recientemente, se identificaron el gen inducible por ácido retinoico-l (RIG-I) y el M DA5 (helicard) como sensores intracelulares del dsARN. Ambos sensores señalizan a través de Cardif (también conocida como IPS-1, AVS, VISA) con el objeto de inducir la producción del IFNS, el Cardif se puede disociar e inactivar mediante NS3-4A del virus de hepatitis C (HCV). Dos helicasas de ARN, RIG-I y MDA5, identificadas como sensores intracelulares del dsARN actúan a través de Cardif con el objeto de inducir la producción del IFNfi.

Los IFNs Tipo I no son solamente componentes cruciales del sistema inmunitario innato, sino que también son los componentes más importantes de las terapias actuales contra CHC. La terapia estándar actual consiste en el IFNa pegilado (PegIFNa) inyectado cada semana subcutáneamente, y la ingestión diaria del agente antiviral oral ribavirina. Este régimen logra una respuesta virologica sostenida (SVR) global en aproximadamente el 55 por ciento de los pacientes, con diferencias significativas entre los genotipos. Una respuesta virologica sostenida (SVR) se define como la pérdida del ARN del virus de hepatitis C (HCV) detectable durante el tratamiento y su ausencia continua durante cuando menos 6 meses después de interrumpir la terapia. Varios estudios de seguimiento a largo plazo en los pacientes que alcanzan una respuesta virológica sostenida (SVR) demuestran que esta respuesta es durable en más del 95 por ciento de los pacientes. La probabilidad de una respuesta virológica sostenida (SVR) depende mucho de la respuesta oportuna al tratamiento. Los pacientes que no muestran una respuesta virológica oportuna (EVR), definida como una declinación de la carga viral por cuando menos 2 log 10 después de 1 2 semanas de terapia , tienen muy pocas probabilidades de desarrollar una respuesta virológica sostenida (SVR), y el tratamiento se puede interrumpir en estos pacientes. Por otra parte, los pacientes con una respuesta virológica oportuna (EVR) tienen una buena oportunidad de curarse, alcanzando el 65 por ciento de ellos una respuesta virológica sostenida (SVR). El pronóstico es todavía mejor para los pacientes que tengan una respuesta virológica rápida (RVR), definida como un ARN del virus de hepatitis C (HCV) en suero indetectable después de 4 semanas de tratamiento. Más del 85 por ciento de ellos alcanzarán una respuesta virológica sostenida (SVR) . Desafortunadamente, menos del 20 por ciento de los pacientes con el genotipo 1 , y aproximadamente el 60 por ciento de los pacientes con los genotipos 2 6 3, muestran una respuesta virológica rápida (RVR) . Actualmente no se conocen los factores del huésped que son importantes para una respuesta oportuna a la terapia .

Los I FNs Tipo I logran sus potentes efectos antivirales a través de la reg ulación de cientos de genes (ISG, genes estimulados por los interferones) . La activación de transcripción de los genes estimulados por los interferones (I SGs) induce proteínas que normalmente no son sintetizadas en las células en reposo, y q ue establecen un estado antiviral no específico del virus dentro de la célula. Los interferones inducen su síntesis mediante la activación de la senda de Jak-STAT, un paradigma de la señalización celular utilizado por muchas citoquinas y factores de crecimiento. Todos los IFNs Tipo I se enlazan al mismo receptor de superficie celular (IFNAR) y activan a los miembros de la familia de cinasa Janus asociados con el receptor Jak1 y Tyk2. Luego las cinasas fosforilan y activan el transductor de señales y el activador de transcripción 1 (STAT1) y el STAT2. Los STATs se translocalizan en el núcleo, en donde se enlazan a elementos de ADN específicos de los promotores de los genes estimulados por los interferones (ISGs). Muchos de los genes estimulados por los interferones (ISGs) tienen actividad antiviral, pero otros están involucrados en el metabolismo de lípidos, apoptosis, degradación de proteína, y en las respuestas celulares inflamatorias. Como es el caso con muchos virus, el virus de hepatitis C (HCV) interfiere con el sistema del IFN, probablemente en múltiples niveles. La señalización de Jak-STAT inducida por el IFN es inhibida en las células y en los ratones transgénicos que expresan las proteínas del virus de hepatitis C (HCV), y en las biopsias de hígado de los pacientes con CHC. In vitro, las proteínas NS5A y E2 del virus de hepatitis C (HCV) enlazan e inactivan la cinasa R de proteína (PKR), una proteína antiviral no específica importante. Sin embargo, actualmente se desconocen los mecanismos moleculares que son importantes para la respuesta al IFN terapéuticamente aplicado en los pacientes con CHC.

La capacidad del virus de hepatitis C (HCV) para interferir con la senda del IFN en muchos niveles diferentes es probablemente un mecanismo subyacente al éxito del virus de hepatitis C (HCV) para establecer una infección crónica (2). Sin embargo, muy paradójicamente, en los chimpancés agudamente o crónicamente infectados con el virus de hepatitis C (HCV), se inducen cientos de genes estimulados por los interferones (ISGs) en el hígado (16, 17). No obstante, a pesar de la activación del sistema de IFN endógeno, el virus no se elimina de los animales crónicamente infectados (18). Los resultados obtenidos con chimpancés son difíciles de extrapolar a los seres humanos, debido a que existen algunas diferencias importantes en la patobiología de la infección por el virus de hepatitis C (HCV) entre estas especies. Aunque la mayoría de los chimpancés agudamente infectados con el virus de hepatitis C (HCV) eliminan el virus de una manera espontánea, las infecciones en los hombres en su mayoría llegan a ser crónicas. Por otra parte, los chimpancés crónicamente infectados raramente se pueden curar con el IFN, mientras que más de la mitad de los pacientes con CHC son tratados con éxito (19).

También se encontró la inducción de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las biopsias de hígado antes del tratamiento de muchos pacientes con CHC, demostrando nuevamente que la infección por el virus de hepatitis C (HCV) puede conducir a la activación del sistema de IFN endógeno (20). Notoriamente, los pacientes con una expresión previamente elevada de genes estimulados por los interferones (ISGs) tendieron a responder pobremente a la terapia al compararse con los pacientes que tenían una expresión inicial baja (20). No se entiende la causa de esta respuesta diferencial a la terapia.

La presente invención se basa en estudios en los que los inventores investigaron la señalización inducida por IFN y la inducción del gen estimulado por los interferones (ISG) en muestras emparejadas de biopsias de hígado y de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de los pacientes con hepatitis crónica antes y durante la terapia con pegIFNa. Además, correlacionaron los datos bioquímicos y moleculares con la respuesta al tratamiento. Su trabajo se estipula con mayor detalle en el Ejemplo acompañante.

Los inventores establecieron que algunos sujetos con una infección viral del hígado están en un estado de "pre-activación", de tal manera que la senda de señalización del IFN está en un estado de estimulación con los genes estimulados por los interferones (ISGs) activados. Los inventores han encontrado que estos individuos, cuando se trataron subsiguientemente con IFN y un agente antiviral, tuvieron una respuesta pobre o ninguna respuesta al tratamiento antiviral. En contraste, se presentó otro grupo de sujetos infectados que no tuvieron ninguna estimulación previa de los receptores de IFN (y estimulación de los genes estimulados por los interferones (ISGs)), y este grupo respondió bien a la terapia antiviral (es decir, tuvieron una rápida respuesta virológica (RVR)). Más aún, es posible determinar si un sujeto tendría una respuesta pobre al tratamiento o tendría una respuesta virológica rápida (RVR) de acuerdo con el nivel de expresión de un número de genes específicos, algunos de los cuales son genes estimulados por los interferones (ISGs). En otras palabras, los inventores identificaron un conjunto de genes que son marcadores genéticos de pronóstico, cuyos niveles de expresión predicen si un sujeto responderá al tratamiento antiviral.

Esto condujo a los inventores a darse cuenta de que se podría desarrollar un método para ayudar a un médico a decidir sobre un régimen de tratamiento para los sujetos que sufran de una infección viral del hígado. La expresión genética de un individuo infectado se puede comparar con la expresión genética de un control (es decir, un sujeto sin infección viral).

Los sujetos infectados con una expresión genética alterada (comparándose con el control) tendrían pocas probabilidades de beneficiarse con el uso del IFN en un régimen de tratamiento (es decir, no se esperaría que estos individuos tengan una respuesta virológica rápida (RVR)), mientras que los sujetos infectados en quienes no estuviera alterada en su mayor parte la expresión genética, comparándose con la expresión de control, tienen probabilidades de beneficiarse con la terapia de IFN y de tener una respuesta virológica rápida (RVR). Los inventores se sorprendieron al hacer estas correlaciones, debido a que una persona experta esperaría que la activación de los genes estimulados por los interferones (ISGs) estaría asociada con una mejor eliminación viral y no con un subconjunto de sujetos que respondieran pobremente al tratamiento.

Aunque ha habido estudios previos de los niveles de expresión genética en los sujetos que responden ("respondentes") y que no responden ("no respondentes") con una infección viral del hígado, por ejemplo, Chen y colaboradores (2005) Gastroenterology 128, 1437-1444, la investigación conducida como parte de la presente invención estudió un conjunto de genes mucho más amplio con el objeto de determinar cuáles actuarían como marcadores de pronóstico. Más aún, los inventores también analizaron los niveles de expresión genética en muestras tomadas antes y después del tratamiento antiviral, y utilizaron esta información para identificar los marcadores genéticos de pronóstico, mientras que los estudios anteriores solamente trataron de correlacionar el resultado del tratamiento con los niveles de expresión genética presentes en las muestras tomadas antes del tratamiento. Por consiguiente, el conjunto de datos que conduce a la identificación de los marcadores genéticos de pronóstico estipulados más adelante, se considera mucho más completo y robusto que aquél de los estudios anteriores.

De conformidad con lo anterior, en el primer aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga una infección viral del hígado responda a la terapia antiviral que incluye la estimulación de la actividad del Interferón (IFN), comprendiendo el método: (a) analizar una muestra del sujeto para la expresión de cuando menos un gen a partir de cada uno de los siguientes grupos de genes: (i) KYNU, PAH, LOC129607, DDC, FOLH1, YBX1, BCHE, ACADL, ACSM3, NARF, SLPI, RPS5, RPL3, RPLPO, TRIM5 y HERC5, (¡i) HTATIP2, CDK4, IFI44L, y KLHDC3, (iii) C7. IF, IFI27, IFIT1, 0AS2, G1P2, 0AS1, IRF7, RSAD2, IFI44, 0AS3, SIGIRR, e IFIT2, (iv) RAB4A, PPP1R1A, PPM1E, ENPP2, CAP2, ADCY1, CABYR, EVI1, PTGFRN, TRIM55, e IL28RA, (v) MME, KCNN2, SLC16A10, AM0TL1, SPP2, LRCH4, HIST1H2BG, TSPYL5, HIST1H2AC, HIST1H2BD, PHTF1, ZNF684, GSTM5, FLJ20035, FIS, PARP12, C14orf21, PNPT1, FLJ39051, GALNTL1, OSBPL1A, LGALS3BP TXNRD2, LOC201725.TOMM7, SRPX2, DCN, PSMAL, MICAL-L2, FLJ30046, SAMD9, ANKRD35, LOC284013, LOC402560, y LOC147646, y (b) comparar la expresión de los genes en la muestra con la expresión de los mismos genes en una muestra de control.

Una modalidad de la invención es en donde la expresión alterada de los genes en la muestra, comparándose con la expresión de los mismos genes en la muestra de control, indica que el sujeto no tiene probabilidades de responder a esa terapia antiviral.

Una modalidad alternativa de la invención es en donde la expresión no alterada de los genes en la muestra, comparándose con la expresión de los mismos genes en la muestra de control, indica que el sujeto tiene probabilidades de responder a esa terapia antiviral.

En la Tabla 2 del Ejemplo acompañante se proporciona mayor información con respecto a cada uno de los genes evaluados en el primer aspecto de la invención. En particular, proporcionamos el número de identificación de Affimetrix para cada uno de los genes, permitiendo, por consiguiente, que cada gen sea específicamente identificado. Se apreciará que el método del primer aspecto de la invención será de gran beneficio para los médicos. IFN es un factor de crecimiento de proteína, y las preparaciones farmacéuticas que contienen IFN son costosas de elaborar. Por consiguiente, es muy importante que un médico tenga confianza en que el IFN se esté usando de una manera apropiada y efectiva por el costo. Adicionalmente, independientemente del costo, con frecuencia es deseable eliminar una infección viral del hígado tan rápidamente como sea posible. Por consiguiente, es un tiempo desperdiciado (el cual se podría pasar empleando terapias alternativas) si un médico administra el IFN, y subsiguientemente descubre que no tiene efectos benéficos. Por consiguiente, el método del primer aspecto de la invención es de gran asistencia para un médico, debido a que puede identificar dos poblaciones de sujetos. Una población mostrará la expresión alterada de los genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2 y, por consiguiente, no se beneficiará con el tratamiento con IFN. La otra población, con la expresión de los genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2, que no difieran de una manera significativa de las muestras de control, se beneficiará con la terapia con IFN En una modalidad alternativa, se considera que la expresión de los genes de la Tabla 3 (diferencialmente expresados 4 horas después del tratamiento) se puede utilizar de una manera similar "Terapia antiviral" significa cualquier régimen de tratamiento para reducir la infección viral que involucra la estimulación de la actividad del IFN. Este régimen puede involucrar el uso de los compuestos que estimulan la actividad del IFN Tipo I y/o que inducen los genes estimulados por el IFN (ISGs). La terapia puede involucrar el tratamiento con IFN por sí mismo, o con otros agonistas de los receptores de IFN, por ejemplo la terapia puede utilizar el IFNa pegilado (pegIFNa) La terapia puede involucrar la estimulación de la actividad del IFN solo. Sin embargo, los inventores han encontrado que el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención es en particular útil para predecir la efectividad de una terapia antiviral que comprenda el uso de una terapia de combinación que comprenda un estimulante de la actividad del IFN en conjunto con un agente antiviral conocido. Muchos agentes antivirales son conocidos en la técnica, y el método de la invención se puede utilizar para evaluar la efectividad de un número de diferentes terapias de combinación. Sin embargo, los inventores han encontrado que el método del primer aspecto de la invención tiene un valor particular para predecir la efectividad de la terapia con un estimulante de la actividad del IFN utilizado en conjunto con el agente antiviral ribavirina.

Se prefiere más que el método del primer aspecto de la invención se utilice para predecir la utilidad del pegIFNa y ribavirina como una terapia antiviral.

El método del primer aspecto de la invención se puede emplear para evaluar la efectividad de los tratamientos para un número de diferentes infecciones virales del hígado, incluyendo las infecciones por el virus de hepatitis B y por el virus de hepatitis C. Se prefiere más que el método sea empleado para evaluar la efectividad de las terapias para la infección por el virus de hepatitis C (HCV). Los inventores han encontrado que el método de la invención es en particular útil para distinguir entre los sujetos que se esperaría que tendrán una respuesta virológica rápida (RVR) y aquéllos que no la tendrán (sin RVR).

Las muestras representativas de la expresión genética en un sujeto que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención abarcan cualquier muestra que pueda proporcionar información con respecto a los genes que sean expresados por el sujeto.

Los ejemplos de las muestras adecuadas incluyen biopsias, muestras escindidas durante procedimientos quirúrgicos, muestras de sangre, muestras de orina, muestras de esputo, muestras de fluido cerebroespinal, y muestras tomadas con hisopo (tales como muestras de hisopo de saliva). Se apreciará que la fuente de la muestra dependerá de que tipo de infección viral pueda tener el sujeto.

Se prefiere más que las muestras sean a partir de tejido del hígado. Se ha encontrado que las muestras de hígado son particularmente instructivas cuando se aplica el método para evaluar a los sujetos con infección por el virus de hepatitis C (HCV). Los inventores se sorprendieron de encontrar que la respuesta virológica rápida (RVR) se podría distinguir de los sujetos sin respuesta virológica rápida (sin RVR) mediante el análisis de la expresión genética a partir de muestras de hígado, mientras que los leucocitos de sangre periférica no exhibieron cambios significativos en la expresión genética antes o después de la exposición al IFN.

Las muestras adecuadas pueden incluir secciones de tejido, tales como secciones histológicas o congeladas. Los métodos mediante los cuales se pueden preparar estas secciones de tal manera que puedan proporcionar información representativa de la expresión genética en el sujeto a partir del cual se derive la sección, serán conocidos por los expertos en este campo, y se deben seleccionar con referencia a la técnica que se pretenda emplear cuando se investigue la expresión genética.

Aunque se contempla el uso de muestras que comprenden una porción de tejido a partir del sujeto, en términos generales se puede preferir que la muestra representativa de la expresión genética comprenda un extracto adecuado tomado a partir de este tejido, pudiéndose el extracto investigarse para proporcionar información con respecto a la expresión genética en el sujeto Los protocolos adecuados que se pueden utilizar para la producción de extractos de tejido capaces de proporcionar información con respecto a la expresión genética en un sujeto, serán bien conocidos por los expertos en este campo. Los protocolos preferidos se pueden seleccionar con referencia a la manera en que se vaya a investigar la expresión genética.

En el caso de las muestras derivadas a partir de hígado, los pasos de preparación adecuados se dan a conocer en 1.1.1 y 1.1.3 del Ejemplo.

"Muestra de control" significa una muestra, equivalente a aquélla a partir del sujeto, que se ha derivado a partir de un individuo que no está sufriendo de una infección viral del hígado. Aunque se pueden utilizar muestras equivalentes de tejidos u órganos, que constituyan muestras de control, o extractos a partir de estas muestras, directamente como la fuente de información con respecto a la expresión genética en la muestra de control, se apreciará, y en términos generales se preferirá, que la información con respecto a la expresión del gen seleccionado (o genes seleccionados) en una muestra de control "ideal" sea proporcionada en la forma de datos de referencia. Estos datos de referencia se pueden proporcionar en la forma de tablas que indiquen la expresión genética en el tejido de control seleccionado. De una manera alternativa, los datos de referencia se pueden suministrar en la forma de software de computación que contenga información recuperable que indique la expresión genética en el tejido de control seleccionado. Los datos de referencia, por ejemplo, se pueden proporcionar en la forma de un algoritmo que haga posible la comparación de la expresión de cuando menos un gen seleccionado a partir de cada grupo de genes en el sujeto, con la expresión de los mismos genes en la muestra de tejido de control.

En el caso de que la expresión de los genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2 en una muestra de control, se vaya a investigar por medio del procesamiento de una muestra de tejido u órgano que constituya la muestra de control, se prefiere que este procesamiento se conduzca empleando los mismos métodos empleados para procesar la muestra del sujeto. Este procesamiento paralelo de las muestras del sujeto y de las muestras de control permite tener un mayor grado de confianza de que las comparaciones de la expresión genética en estos tejidos se normalizará unas con respecto a otras (debido a que se aplicarán los artefactos asociados con el método seleccionado mediante el cual se procese el tejido y se investigue la expresión genética tanto a las muestras del sujeto como a las muestras de control).

El método de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede involucrar el análisis de la expresión genética de cuando menos un gen, seleccionado a partir de cada uno de los grupos de genes. El hallazgo de que se puede utilizar la expresión alterada de los genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2 ó 3 en la determinación de la efectividad de una terapia antiviral es sorprendente, debido a que, aunque la expresión de ciertos genes (tales como aquéllos que codifican STAT1) se ha vinculado con la infección por el virus de hepatitis C (HCV), la mayoría de los genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2 nunca se habían identificado anteriormente como asociados con la expresión genética regulada por el IFN o con la probabilidad de que una terapia sea efectiva par el tratamiento de infecciones virales. Adicionalmente, sin importar la asociación de estos genes con la actividad del IFN, fue totalmente inesperado que el aumento de expresión de los genes estimulados por el IFN (ISGs) estuviera asociada con una mala respuesta al tratamiento subsiguiente con el IFN.

Los inventores han identificado un total de 83 genes diferentes cuyos niveles de expresión pueden ser marcadores de pronóstico para el resultado de la terapia antiviral Estos genes se han distribuido en cinco grupos diferentes de acuerdo con su función: grupo (i) se considera que están involucrados en el metabolismo celular, grupo (ii) se considera que están involucrados en el ciclo celular, grupo (iii) se considera que están involucrados en la respuesta inmunitaria, grupo (iv) se considera que están involucrados en la transducción de señales, grupo (v) no están asignados cada uno a cualquier grupo particular estipulado anteriormente. Esta distribución se muestra en el método de la invención, en donde se evalúa el nivel de expresión de cuando menos un gen a partir de cada uno de los grupos de genes, con el objeto de determinar la probabilidad de que el sujeto responderá a la terapia antiviral. Los inventores han encontrado además que estos subconjuntos de genes tienen un valor particular, y pueden ser efectivos para ese propósito, cuando se analice el nivel de expresión de cuando menos un miembro de cada uno de estos grupos. Se prefiere que el método se base en el análisis de cuando menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 ó 78 genes enlistados anteriormente La expresión de los genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2 ó 3 se puede investigar mediante el análisis de las moléculas objetivo representativas de la expresión genética en la muestra. La presencia o ausencia de las moléculas objetivo en una muestra se detectará en términos generales utilizando moléculas de sonda adecuadas. Esta detección proporcionará información con respecto a la expresión genética, y de esta manera, permitirá hacer la comparación entre la expresión genética que se presente en el sujeto y la expresión que se presente en la muestra de control. Las sondas serán generalmente capaces de enlazarse específicamente a las moléculas objetivo directa o indirectamente representativas de la expresión genética. El enlace de estas sondas se puede entonces evaluar y correlacionar con la expresión genética con el fin de permitir que se tenga una comparación de pronóstico efectiva entre la expresión genética en el sujeto y en el control.

"Expresión alterada" incluye cuando la expresión genética está tanto elevada como reducida en la muestra cuando se compara con el control, como se discute anteriormente.

Inversamente "expresión no alterada" incluye cuando la expresión genética no está elevada o reducida en la muestra cuando se compara con el control, como se discute anteriormente.

Se puede hacer una evaluación de si una expresión genética está alterada o no alterada empleando los métodos de análisis estadístico de rutina.

La molécula objetivo puede ser un péptido o polipéptido. La cantidad de péptido o polipéptido se puede determinar utilizando una molécula de enlace específico, por ejemplo un anticuerpo. En una instancia preferida, la cantidad de ciertas proteínas objetivo presentes en una muestra se puede evaluar con referencia a la actividad biológica de la proteína objetivo en la muestra. La evaluación y comparación de la expresión de esta manera es en particular adecuada en el caso de los objetivos de proteína que tengan una actividad enzimática. Las técnicas adecuadas para la medición de la cantidad de un objetivo de proteína presente en una muestra incluyen, pero no se limitan a, técnicas basadas en aptámeros y anticuerpos, tales como radio-inmunoensayos (RIAs), inmunoensayos enlazados a enzimas (ELISAs), y Western blot.

Los ácidos nucleicos representan las moléculas objetivo preferidas para ensayar la expresión genética de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.

Se entenderá que "ácidos nucleicos" o "moléculas de ácidos nucleicos", para los propósitos de la presente invención, se refieren a polímeros de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en una forma ya sea de una sola cadena o bien de doble cadena. Adicionalmente, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, estos términos se deben tomar para abarcar los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los nucleótidos que se presentan naturalmente.

Adicionalmente, se entenderá que los ácidos nucleicos objetivo adecuados para utilizarse de acuerdo con la invención no necesitan comprender ácidos nucleicos "de longitud completa" (por ejemplo, transcripciones genéticas de longitud completa), sino que meramente necesitan comprender una longitud suficiente para permitir el enlace especifico de las moléculas de sonda.

Se prefiere que la molécula objetivo de ácido nucleico sea una transcripción genética de ARNm y los productos artificiales de estas transcripciones. Los ejemplos preferidos de las moléculas objetivo artificiales generadas a partir de las transcripciones genéticas incluyen ADNc y ARNc, cualquiera de las cuales se pueden generar empleando los protocolos bien conocidos o los kits o reactivos comercialmente disponibles.

En una modalidad preferida del método del primer aspecto de la invención, las muestras se pueden tratar para aislar las moléculas de ARN objetivo mediante un proceso de Usar las células tomadas a partir de una muestra adecuada (lo cual se puede lograr utilizando un regulador de tisis comercialmente disponible, tal como aquél producido por Qiagen Ltd.), seguido por la centrifugación del Usado utilizando una columna de separación de ácidos nucleicos comercialmente disponible (tal como la columna Midi Spin RNeasy producida por Qiagen Ltd.). Otros métodos para la extracción del ARN incluyen variaciones del método de isotiocianato de fenol y guanidina de Chomczynski, P. y Sacchi, N. (1987) Analytical Biochemistry 162, 156. "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction". El ARN obtenido de esta manera puede constituir una molécula objetivo adecuada misma, o puede servir como una plantilla para la producción de moléculas objetivo representativas de la expresión genética.

Se puede preferir que el ARN derivado a partir de un sujeto o de una muestra de control se puede utilizar como sustrato para la síntesis del ADNc, por ejemplo, utilizando el Sistema Superscript (Invitrogen Corp.). El ADNc resultante se puede convertir entonces hasta ARNc biotinilado utilizando el Kit de Marcado de Transcripción de ARN BioArray (Enzo Life Sciences Inc.), y este ARNc se purifica a partir de la mezcla de reacción utilizando un Mini-Kit RNeasy (Qiagen Ltd.).

El ARNm, representativo de la expresión genética, se puede medir directamente en un tejido derivado a partir de un sujeto o de una muestra de control, sin la necesidad de extracción o purificación del ARNm. Por ejemplo, el ARNm presente en, y representativo de la expresión genética en, un sujeto o muestra de control de interés, se puede investigar utilizando secciones apropiadamente fijadas o biopsias de este tejido. El uso de muestras de esta clase puede proporcionar beneficios en términos de la rapidez con la que se pueden hacer las comparaciones de la expresión, así como el procesamiento del tejido relativamente económico y simple que se puede emplear para producir la muestra. Las técnicas de hibridación in situ representan los métodos preferidos mediante los cuales se puede investigar y comparar la expresión genética en muestras de tejido de esta clase. Las técnicas para el procesamiento de los tejidos de interés que mantienen la disponibilidad del ARN representativo de la expresión genética en la muestra del sujeto o de control, son conocidas por los expertos en este campo.

Sin embargo, las técnicas mediante las cuales se pueden extraer y recolectar los ARNms representativos de la expresión genética en un sujeto o en una muestra de control también son bien conocidas por los expertos en la materia, y los inventores han encontrado que estas técnicas pueden emplearse convenientemente de acuerdo con la presente invención. Se pueden preferir las muestras que comprendan ARNm extraído a partir de un sujeto o de una muestra de control para utilizarse en el método del tercer aspecto de la invención, debido a que estos extractos tienden a investigarse más fácilmente de lo que es el caso para las muestras que comprenden los tejidos originales. Por ejemplo, las moléculas objetivo adecuadas que permitan hacer la comparación de la expresión genética pueden comprender el ARN total aislado a partir de una muestra de tejido a partir del sujeto, o a partir de una muestra del tejido de control.

Adicionalmente, el ARN extraído se puede amplificar fácilmente para producir una muestra de ARNm amplificada capaz de proporcionar mayor información sobre la expresión genética en la muestra del sujeto o de control. Los ejemplos adecuados de las técnicas para la extracción y amplificación de las poblaciones de ARNm son bien conocidos, y se consideran con mayor detalle más adelante.

A manera de ejemplo, los métodos para el aislamiento y la purificación de los ácidos nucleicos para producir objetivos de ácido nucleico adecuados para utilizarse de acuerdo con la invención, se describen con detalle en el Capítulo 3 de Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, Editor Elsevier, N.Y. (1993).

En un método preferido, el ácido nucleico total se puede aislar a partir de una muestra dada empleando las técnicas descritas en el Ejemplo.

En el caso de que se desee amplificar los objetivos de ácido nucleico antes de la investigación y comparación de la expresión genética, se puede preferir emplear un método que mantenga o controle las frecuencias relativas de los ácidos nucleicos amplificados en el sujeto o en el tejido de control a partir del cual se derive la muestra.

Los métodos adecuados de amplificación "cuantitativa" son bien conocidos por los expertos en este campo. Un ejemplo bien conocido, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, involucra la co-amplificación simultánea de una secuencia de control cuyas cantidades se sepa que no tienen cambios entre las muestras de control y del sujeto. Esto proporciona un estándar interno que se puede utilizar para calibrar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En adición a los métodos ilustrados anteriormente, la persona experta apreciará que cualquier tecnología que acople la amplificación del producto específico de la transcripción genética con la generación de una señal, también puede ser adecuada para la cuantificación. Un ejemplo preferido emplea mejoras convenientes a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 4683195 y 4683202) que la han hecho adecuada para la cuantificación exacta de las transcripciones de ARNm específicas, mediante la incorporación de una transcripción inversa inicial del ARNm al ADNc. Otras mejoras clave hacen posible la medición de los productos acumulados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real a medida que progresa la reacción.

En muchos casos, se puede preferir evaluar el grado de expresión genética en las muestras del sujeto o de control, utilizando moléculas de sonda capaces de indicar la presencia de las moléculas objetivo (representativas de uno o más de los genes enlistados anteriormente en la Tabla 2) en la muestra relevante.

Las sondas para utilizarse en el método de la invención se pueden seleccionar con referencia al producto (directo o indirecto) de la expresión genética se vaya a investigar. Los ejemplos de las sondas adecuadas incluyen sondas de oligonucleótidos, anticuerpos, aptámeros, y proteínas de enlace o moléculas pequeñas que tengan una especificidad adecuada.

Las sondas de oligonucleótidos constituyen las sondas preferidas adecuadas para utilizarse de acuerdo con el método de la invención. La generación de sondas de oligonucleótidos adecuadas es bien conocida por los expertos en este campo (Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Piet Herdewijn (ed) Humana Press (2004)). Los oligonucleótidos y los oligonucleótidos modificados están comercialmente disponibles en numerosas compañías.

Para los propósitos de la presente invención, una sonda de oligonucleótido se puede tomar para comprender un oligonucleótido capaz de hibridarse específicamente a una molécula objetivo de ácido nucleico de la secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlace químico. Este enlace usualmente puede presentarse a través de un emparejamiento de bases complementario, y normalmente a través de la formación de enlace de hidrógeno. Las sondas de oligonucleótidos adecuadas pueden incluir bases naturales (es decir, A, G, C, o T) o bases modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). En adición, se puede utilizar un enlace diferente de un enlace de fosfodiéster para unir las bases en la sonda de oligonucleótido, siempre que esta variación no interfiera con la hibridación de la sonda de oligonucleótido a su objetivo. Por consiguiente, las sondas de oligonucleótidos adecuadas para utilizarse en los métodos de la invención pueden ser ácidos nucleicos peptídicos en donde las bases constituyentes se unan mediante enlaces peptídicos en lugar de hacerlo mediante enlaces de fosfodiéster.

La frase "se híbrida específicamente a", como se utiliza en la presente, se refiere al enlace, duplexión, o hibridación de una sonda de oligonucleótido preferencialmente a una secuencia de nucleótidos objetivo particular bajo condiciones restringentes cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (tal como ADN o ARN celular total). En una modalidad, una sonda puede enlazarse, duplexarse, o hibridarse solamente a la molécula objetivo particular.

El término "condiciones restringentes" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará a su sub-secuencia objetivo, pero mínimamente a otras secuencias. En algunas modalidades, una sonda se puede hibridar a ninguna otra secuencia diferente de su objetivo bajo condiciones restringentes. Las condiciones restringentes dependen de la secuencia, y serán diferentes en distintas circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas.

En general, las condiciones restringentes se pueden seleccionar en aproximadamente 5°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo la concentración iónica, el pH, y la concentración de ácido nucleico definidos) a la cual el 50 por ciento de las sondas de oligonucleótidos complementarias para un ácido nucleico objetivo se hibridan al ácido nucleico objetivo en equilibrio. Debido a que los ácidos nucleicos objetivo generalmente estarán presentes en exceso, a la Tm, el 50 por ciento de las sondas se ocupan en equilibrio. A manera de ejem plo, las condiciones restringentes serán aquéllas en las cuales la concentración de sal sea u na concentración del ion de Na+ (o de otras sales) de cuando menos aproximadamente 0.01 a 1 .0 M , a un pH de 7.0 a 8.3. y la temperatura es de cuando menos aproximadamente 30°C para las sondas cortas (por ejemplo , de 10 a 50 n ucleótidos) . Las condiciones restringentes también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida.

Las sondas de oligonucleótidos se pueden utilizar para detectar las secuencias de ácidos nucleicos complementarias (es decir, los objetivos de ácidos nucleicos) en una muestra representativa adecuada . Este enlace complementario forma la base de la mayoría de las técnicas en donde se pueden utilizar los oligonucleótidos para detectar, y de esta manera permitir la comparación de, la expresión de genes particulares. Las tecnolog ías preferidas permiten hacer la cuantificación paralela de la expresión de múltiples genes, e incluyen las tecnolog ías en donde la amplificación y cuantificación de las especies se acoplan en tiempo real , tales como las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de transcripción inversa cuantitativa , y las tecnologías en donde la cuantificación de las especies cuantificadas se presenta subsiguientemente a la amplificación , tales como las tecnologías de arreglos.

Las tecnologías de arreglos involucran la hibridación de las muestras representativas de la expresión genética dentro de la m uestra del sujeto o de control, con una pluralidad de sondas de oligon ucleótidos , en donde cada sond a se híbrida preferencialme nte a u n gen o genes dados a conocer. Las tecnolog ías de arreglos proporcion an la identificación ú n ica de las secuencias de oligonucleótidos específicas , por ejemplo , por su posición física (por ejem plo, u na rejilla en un arreglo bidim ensional, como es proporcionada comercialmente por Affymetrix I nc. ) , o por su asociación con otra característica (por ejem plo, perlas marcadas como son comercialmente proporcionadas por lllum ina I nc. o Lu m inex I nc. ) . Los arreglos de oligon ucleótidos se pueden sintetizar in situ (por ejemplo, mediante la síntesis dirigida por luz, como es comercialmente proporcionada por Affymetrix Inc.), o se pueden pre-formar o manchar mediante la tecnolog ía de contacto o de inyección de tinta (como es proporcionada comercialmente por Agilent o Applied Biosystems). Será evidente para los expertos en la materia que las secuencias de ADN totales o parciales también pueden servir como sondas para la tecnolog ía de arreglos (como es comercialmente proporcionada por Clontech).

Las sondas de oligonucleótidos se pueden utilizar en las técnicas de manchado, tales como Southern blot o Northern blot, para detectar y comparar la expresión genética (por ejemplo, por medio de las moléculas objetivo de ADNc o ARNm representativas de la expresión genética) . Las técnicas y los reactivos adecuados para utilizarse en las técnicas de Southern o Northern blot serán bien conocidas por los expertos en este campo. Dicho de u na manera breve, las muestras que comprenden ADN (en el caso del Southern blot) o ARN (en el caso del Northern blot), las moléculas objetivo se separan de acuerdo con su capacidad para penetrar en un gel de un material tal como acrilamida o agarosa. La penetración del gel se puede impulsar mediante la acción capilar o mediante la actividad de un campo eléctrico. Una vez que se ha logrado la separación de las moléculas objetivo, estas moléculas se transfieren a una membrana delgada (típicamente nylon o nitrocelulosa) antes de inmovilizarse sobre la membrana (por ejemplo, mediante horneo o mediante radiación ultravioleta). Entonces se puede detectar y comparar la expresión genética mediante la hibridación de las sondas de oligonucleótidos a las moléculas objetivo enlazadas a la membrana.

En ciertas circunstancias, el empleo de protocolos de hibridación tradicionales para comparar la expresión genética puede ser problemático. Por ejemplo, las técnicas de manchado pueden tener dificultades para distinguir entre dos o más productos genéticos de aproximadamente el mismo peso molecular, debido a que estos productos de tamaños similares son difíciles de separar utilizando geles. De conformidad con lo anterior, en tales circunstancias, se puede preferir la comparación de la expresión genética empleando técnicas alternativas, tales como aquéllas descritas más adelante.

Se puede evaluar la expresión genética en una muestra que represente la expresión genética en un sujeto con referencia a los niveles de transcripción globales dentro de muestras de ácidos nucleicos adecuadas por medio de la tecnología de arreglos de oligonucleótidos de alta densidad. Estas tecnologías hacen uso de los arreglos en donde se atan las sondas de oligonucleótidos, por ejemplo, mediante unión covalente, a un soporte sólido. Estos arreglos de sondas de oligonucleótidos inmovilizadas sobre soportes sólidos representan los componentes preferidos para utilizarse en los métodos y kits de la invención para la comparación de la expresión genética. Se pueden unir grandes números de estas sondas de esta manera para proporcionar arreglos adecuados para la comparación de la expresión de grandes números de genes seleccionados a partir de aquéllos enlistados anteriormente y en la Tabla 2. De conformidad con lo anterior, se reconocerá que estos arreglos de oligonucleótidos pueden ser particularmente preferidos en las modalidades de los métodos de la invención en las que se desee comparar la expresión de más de un gen seleccionado a partir de cada uno de los grupos de genes enlistados anteriormente y en la Tabla 2.

Otras metodologías adecuadas que se pueden emplear en la comparación de los objetivos de ácidos nucleicos representativos de la expresión genética incluyen, pero no se limitan a, la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA); o la amplificación del ADN de círculo rodante (RCA) Normalmente es deseable marcar las sondas con el objeto de que se puedan detectar fácilmente. Los ejemplos de las fracciones detectables que se pueden utilizar en el marcado de sondas u objetivos adecuados para utilizarse de acuerdo con la invención incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, o químicos. Las fracciones detectables adecuadas incluyen diferentes enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, y materiales colorimétricos. Estas fracciones detectables son adecuadas para incorporarse en todos los tipos de sondas u objetivos que se puedan utilizar en los métodos de la invención, a menos que se indique lo contrario.

Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de radícula roja, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetil-colinesterasa; los ejemplos de los complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de dicloro-triazinil-amina, cloruro de dansilo, ficoeritrina, rojo de Texas, proteína fluorescente verde de rodamina, y similares; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de los materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; los ejemplos de los materiales radioactivos adecuados incluyen 125l, 131l, 35S, 3H, 1 C, ó 32P; los ejemplos de los materiales colorimétricos adecuados incluyen perlas de oro coloidal o vidrio coloreado o plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Los medios para detectar estas marcas son bien conocidos por la persona experta. Por ejemplo, se pueden detectar radiomarcas utilizando película fotográfica o contadores de centelleo; los marcadores fluorescentes se pueden detectar utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Las marcas enzimáticas típicamente se detectan proporcionando a la enzima un sustrato, y detectando el producto de reacción producido mediante la acción de la enzima sobre el sustrato, y las marcas colorimétricas se detectan simplemente visualizando la marca coloreada.

En una modalidad preferida de la invención, se pueden escanear las sondas fluorescentemente marcadas o los objetivos, y se puede detectar la fluorescencia utilizando un escáner confocal de láser.

En el caso del las sondas de ácidos nucleicos u objetivos marcados, el marcado adecuado puede tener lugar antes, durante, o después de la hibridación. En una modalidad preferida, las sondas de ácidos nucleicos o los objetivos para utilizarse en los métodos de la invención se marcan antes de la hibridación. Se prefieren particularmente las marcas de fluorescencia y, cuando se utilizan, la cuantificación de la hibridación de las sondas de ácidos nucleicos a sus objetivos de ácidos nucleicos se hace mediante la cuantificación de la fluorescencia a partir del ácido nucleico fluorescentemente marcado hibridado. La cuantificación puede hacerse a partir de un reactivo fluorescentemente marcado que se enlace a un hapteno incorporado en el ácido nucleico.

En una modalidad preferida de la invención, el análisis de la hibridación se puede lograr utilizando un software de análisis adecuado, tal como la icroarray Analysis Suite (Affymetrix, Inc.).

La cuantificación efectiva se puede lograr utilizando un microscopio de fluorescencia, el cual se puede equipar con una plataforma automatizada para permitir el escaneo automático del arreglo, y el cual se puede equipar con un sistema de adquisición de datos para la medición automatizada, el registro, y el subsiguiente procesamiento de la información de la intensidad de fluorescencia. Las configuraciones adecuadas para esta automatización son convencionales y bien conocidas por los expertos en este campo.

En una modalidad preferida, los ácidos nucleicos hibridados se detectan mediante la detección de una o más fracciones detectables unidas a los ácidos nucleicos. Las fracciones detectables se pueden incorporar mediante cualquiera de un número de medios bien conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, en una modalidad preferida, estas fracciones se incorporan simultáneamente durante un paso de amplificación en la preparación de los ácidos nucleicos de muestra (sondas u objetivos). Por consiguiente, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores o nuleótidos marcados con una fracción detectable, proporcionará un producto de la amplificación marcado con dicha fracción. En una modalidad preferida, la amplificación de transcripción utilizando un nucleótido fluorescentemente marcado (por ejemplo, UTP y/o CTP marcado con fluoresceína) incorpora la marca en los ácidos nucleicos transcritos.

De una manera alternativa, se puede agregar una fracción detectable adecuada directamente a la muestra de ácido nucleico original (por ejemplo, ARNm, ARNm de poli-A, ADNc, etc. a partir del tejido de interés), o a un producto de la amplificación después de llevarse a cabo la amplificación del ácido nucleico original. Los medios para unir las marcas, tales como las marcas fluorescentes, a los ácidos nucleicos, son bien conocidos por los expertos en este campo, e incluyen, por ejemplo, traducción de apriete o marcado de extremo (por ejemplo, con un ARN marcado), poniendo cinasa en el ácido nucleico, y con la unión (ligamiento) subsiguiente de un enlazador de ácido nucleico que una el ácido nucleico de muestra a una marca (tal como un fluoróforo adecuado).

Aunque el método del primer aspecto de la invención es más adecuado para utilizarse en asociación con sujetos humanos, se apreciará que también puede ser útil en la determinación de un curso de tratamiento de la infección viral en animales no humanos (por ejemplo, caballos, perros, reses).

Un método alternativo de la invención comprende un método para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga una infección viral del hígado responda a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN), comprendiendo el método: (a) Analizar una muestra del sujeto para la expresión de cuando menos un gen seleccionado a partir de los genes enlistados en la Tabla 3 más adelante. (b) Comparar la expresión de los genes en la muestra con la expresión de los mismos genes en una muestra de control.

Una modalidad del método es en donde la expresión alterada de los genes en la muestra, comparándose con la expresión de los mismos genes en la muestra de control, indica que el sujeto no tiene probabilidades de responder a esa terapia antiviral.

Una modalidad alternativa del método es en donde la expresión no alterada de los genes en la muestra, comparándose con la expresión de los mismos genes en la muestra de control, indica que el sujeto tiene probabilidades de responder a esa terapia antiviral.

Las técnicas empleadas para llevar a cabo este aspecto de la invención se proporcionan anteriormente en relación con el primer aspecto de la invención. Aunque los genes específicos son diferentes, la persona experta apreciará y podrá identificar las moléculas objetivo que se vayan a evaluar de acuerdo con este método, así como podrá identificar los agentes de enlace específico que se puedan utilizar.

Los inventores extendieron su trabajo en la investigación de las diferencias entre los sujetos infectados que responden bien al tratamiento con IFN, con aquéllos que no responden, para examinar la señalización de Jak-STAT inducida por el IFN.

El IFN se enlaza a los receptores de interferón, y activa la senda de Jak-STAT. Un evento central en esta activación es la fosforilación de STAT1. Los inventores encontraron que la fosforilación de STAT1 fue inducida en la mayoría de los sujetos cuando se trataron con peglFNa2b Sin embargo, no pareció haber correlación alguna entre la fosforilación de STAT1 y la capacidad de respuesta de un sujeto al tratamiento con IFN en una terapia antiviral. Sin embargo, los inventores se sorprendieron al encontrar que había diferencias en los respondentes y los no respondentes con respecto a la localización del STAT1 cuando se examinó en las muestras. Se sabe que STAT1 se translocaliza en el núcleo y se enlaza como un dímero a los elementos de respuesta específica en los promotores de los genes estimulados por los interferones (ISGs). Todos los sujetos que respondieron rápido tuvieron un cambio inducido por el IFN en la localización del STAT1 en seguida del tratamiento con peglFNa2b. En contraste, los sujetos que no respondieron (es decir, aquéllos con la señalización del IFN previamente activada) no tuvieron cambios de STAT1 detectables; en lugar de eso, una gran proporción de hepatocitos ya tenían un teñido nuclear apreciable.

Por consiguiente, de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga una infección viral del hígado, responderá a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN), comprendiendo el método examinar una muestra a partir del sujeto para identificar la localización subcelular del STAT1.

Como se estipula en los ejemplos acompañantes, los inventores han determinado que la localización del STAT1 en las células hepáticas es un marcador de pronóstico para la posibilidad de respuesta de un sujeto a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN). En esos datos, se muestra que una gran proporción de hepatocitos en las muestras de hígado tomadas a partir de los sujetos sin respuesta virológica rápida (sin RVR) (es decir, los que no responden a la terapia antiviral) ya tenían un teñido nuclear apreciable para STAT1 antes de la terapia antiviral, mientras que los hepatocitos en las muestras de hígado a partir de los sujetos con respuesta virológica rápida (RVR) solamente tienen un teñido nuclear mínimo. Este hallazgo totalmente inesperado no se da a conocer ni se sugiere en la técnica.

Por consiguiente, si una mayoría de hepatocitos en las muestras de hígado tienen teñido nuclear para STAT1, entonces ese sujeto tiene probabilidades de no responder a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN). Inversamente, si un número mínimo de los hepatocitos en las muestras de hígado tienen teñido nuclear para STAT1, tienen probabilidades de responder a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN) En algunas modalidades, la muestra es una muestra de hígado. También en algunas modalidades, el método examina la localización subcelular de STAT1 en las células de hepatocitos.

Los métodos para determinar la localización de la proteína de STAT1 en muestras de hígado son rutinarios en la materia. Un ejemplo de este método es la inmunohistoquímica convencional utilizando anticuerpos anti-STAT comercialmente disponibles u otras entidades de enlace específico. El Ejemplo acompañante proporciona un método detallado para determinar la localización de la proteína de STAT1 en una muestra de hígado. En algunas modalidades, la proteína de STAT1 examinada en el método de la invención es fosfo-STAT1.

En "sujeto" incluimos a los sujetos definidos anteriormente en relación con el primer aspecto de la invención. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano.

Como se estipula anteriormente, la presente invención se basa en los estudios en donde los inventores investigaron la señalización inducida por el IFN y la inducción de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en muestras emparejadas de biopsias de hígado y de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de los pacientes con hepatitis crónica antes y durante la terapia con pegIFNa; esto se describe con mayor detalle en el Ejemplo acompañante.

Los inventores establecieron que el sistema de IFN endógeno se activa constantemente en muchos pacientes infectados. Más aún, los inventores se sorprendieron al correlacionar los pacientes con un sistema de IFN previamente activado con una mala respuesta a la terapia con IFN. Este hallazgo es contra-intuitivo, debido a que se esperaría que un sistema inmunitario innato activo ayudaría a eliminar el virus durante la terapia con el IFNa.

Los inventores analizaron la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en biopsias de hígado, y además concluyeron que hay pacientes en los que el virus de hepatitis C (HCV) de una manera sorprendente induce (no bloquea) el sistema de IFN endógeno, y hay pacientes en los que el virus de hepatitis C (HCV) no induce (puede ser mediante la disociación de TRIF y/o Cardif) el sistema de IFN endógeno, pero que esta diferencia no tiene impacto alguno sobre la capacidad del virus de hepatitis C (HCV) para mantener una infección crónica.

En los pacientes con una activación previa del sistema de IFN, los inventores encontraron que el peglFNa2b inducía, dentro de 4 hors, una sobre-regulación (sub-) máxima robusta de muchos genes estimulados por los interferones (ISGs) en el hígado. De una manera sorprendente, estos altos niveles de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) ya estaban presentes en las biopsias de tratamiento previo de los pacientes que posteriormente no mostraron una respuesta virológica rápida en la semana 4.

También se encontró que la activación previa del sistema de IFN endógeno se hallaba con más frecuencia en las biopsias de hígado de los pacientes infectados con el genotipo 1 (y 4) del virus de hepatitis C (HCV), que con el genotipo 2 ó 3. Esto es intrigante debido a que es bien sabido que las infecciones por los genotipos 2 y 3 se pueden curar en más del 80 por ciento de los pacientes, comparándose con menos del 50 por ciento de los pacientes con el genotipo 1. Los inventores encontraron que la frecuencia y el grado de activación previa del sistema de IFN endógeno depende del genotipo del virus de hepatitis C (HCV) proporcionan una explicación para la diferente susceptibilidad al tratamiento de los genotipos del virus de hepatitis C (HCV).

Los inventores se dieron cuenta de que estos datos establecen que el virus de hepatitis C (HCV) interfiere con la señalización del IFN, y de esta manera, perjudica la respuesta a la terapia. Más aún, una inhibición de la señalización del IFNa mediante el virus de hepatitis C (HCV) explica la razón por la cual una fuerte activación previa del sistema de IFN endógeno no conduce a una eliminación espontánea del virus de hepatitis C (HCV). Los inventores no desean obligarse por ninguna hipótesis, sino que creen que esto significa que el IFNa no induciría un estado antiviral en los hepatocitos que estén infectados con el virus de hepatitis C (HCV). La sobre-regulación de los genes estimulados por los interferones (ISGs) observada en el hígado de muchos pacientes se presentaría entonces solamente en los hepatocitos no infectados. La fuerte inducción de los genes estimulados por los interferones (ISGs) encontrada en las biopsias de hígado es compatible con este modelo, debido a que hay más hepatocitos no infectados que infectados. Se presentaría la producción de IFNU en los hepatocitos infectados con un virus que no tenga éxito para disociar Cardif y/o TRIF. Debido a la inhibición inducida por el virus de hepatitis C (HCV) de la senda de Jak-STAT, el IFNB secretado no induciría un estado antiviral en estos hepatocitos infectados, sino solamente en las células vecinas no infectadas.

El inventor se dio cuenta de que su nuevo entendimiento de la interacción entre el virus de hepatitis C (HCV) y el sistema inmunitario era altamente relevante para el diseño y la selección de los regímenes de tratamiento para las infecciones virales, tales como la infección por el virus de hepatitis C (HCV). Por consiguiente, un objetivo de ciertas modalidades de la invención es proporcionar medios novedosos para el tratamiento de las infecciones virales.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un agente que reduce la activación del sistema de IFN para la prevención o el tratamiento de una infección viral del hígado.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un agente que reduce la activación del sistema de IFN en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección viral del hígado.

Los inventores, como se explica anteriormente y en el Ejemplo, se han dado cuenta de que algunos sujetos con una infección viral tienen activación del sistema de IFN (y una sobre-regulación asociada de los genes estimulados por los interferones (ISGs)), y esto está asociado con una mala respuesta a la subsiguiente terapia antiviral con IFN. Esto los condujo a darse cuenta de que los agentes de acuerdo con el tercero o el cuarto aspecto de la invención, los cuales prevendrán esa activación previa, son útiles para reducir la actividad de la senda de IFN, y efectivamente "inocularán" a un sujeto, de tal manera que responderá mejor a las siguientes terapias antivirales que utilicen el IFN. Los inventores se sorprendieron al hacer estas correlaciones, debido a que una persona experta esperaría que un aumento en la actividad del IFN en un sujeto estaría asociada con una mejor eliminación viral y no con un subconjunto de sujetos que respondan pobremente al tratamiento.

Por consiguiente, se prefiere que los agentes se utilicen de acuerdo con el tercero o el cuarto aspectos de la invención para tratar a los sujetos con infecciones virales que también tengan un aumento en la activación del sistema de IFN (en relación con los sujetos de control no infectados).

"Reduce" significa que el agente es efectivo para reducir la estimulación de los genes estimulados por los interferones (ISGs), de tal manera que los niveles de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) no sean significativamente diferentes de los niveles de expresión en los tejidos de control.

Los agentes se pueden utilizar en el tratamiento de un número de diferentes infecciones virales del hígado, incluyendo las infecciones por el virus de hepatitis B (HBV) y por el virus de hepatitis C (HCV). Se prefiere más que los agentes se utilicen para prevenir o reducir la infección por el virus de hepatitis C (HCV).

Los ejemplos de los agentes que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen en donde el agente pueda enlazarse al polipéptido del IFNa y prevenga la actividad funcional del IFN, por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos y derivados de los mismos (por ejemplo, los anticuerpos de dominio o Fabs). De una manera alternativa, el agente puede actuar como un inhibidor competitivo con el sistema de IFN mediante su acción como un antagonista en los receptores del IFNa (por ejemplo, IFNAR1, IFNAR2a, b, ó c). De una manera alternativa, el agente puede inhibir las enzimas u otras moléculas en la senda del IFN. Alternativamente, el agente puede enlazarse al ARNm que codifica el polipéptido de IFNa. De una forma alternativa, el agente puede enlazarse a una secuencia de ácido nucleico que codifique el IFNa, de tal manera que conduzca a una reducción en la cantidad del ARNm transcrito que codifique el polipéptido de IFNa. Por ejemplo, el agente puede enlazarse a las regiones codificantes o no codificantes del gen IFNa o al ADN 5' ó 3' del IFN, y de esta manera se reduce la expresión de la proteína.

Se prefiere que el agente del tercero o cuarto aspecto de la invención se enlace al polipéptido de IFNa, a un receptor del IFNa, o a un ácido nucleico que codifique el polipéptido de IFNa.

Hay un número de diferentes secuencias de polipéptido del lnterferón-a. En la Figura 8 se muestra una alineación de estas secuencias. A partir de esta alineación, se ha determinado la siguiente secuencia en consenso. Esta información puede ser utilizada por la persona experta para desarrollar un agente de enlace para el polipéptido del IFNa.

Cuando el agente se enlaza al polipéptido de IFNa, se prefiere que el agente se enlace a un epítopo definido por la proteína que se haya plegado correctamente en su forma nativa. Se apreciará que puede haber alguna variabilidad de secuencia entre las especies, y también entre los genotipos. De conformidad con lo anterior, otros epítopos preferidos comprenderán las regiones equivalentes a partir de las variantes del gen. Las regiones equivalentes a partir de los polipéptidos de IFN adicionales se pueden identificar utilizando las herramientas de similitud e identidad de secuencias, y los métodos de búsqueda de bases de datos, ilustrados anteriormente en el primer aspecto de la invención.

Se prefiere más que el agente se enlace a una región conservada del polipéptido del IFNa o de un fragmento del mismo. Como se puede ver a partir de la alineación de las secuencias del polipéptido de IFNa de la Figura 8, hay un número de regiones de la secuencia de aminoácidos que están conservadas entre los diferentes polipéptidos. Un ejemplo de esta región conservada seria la de las posiciones 161 a 174 de la secuencia en "consenso" mostrada en esa figura.

Los agentes que se enlazan a esta región tienen un efecto particularmente dramático sobre la actividad del IFNa y, por consiguiente, son particularmente efectivos para prevenir la activación previa del sistema del IFN, y por lo mismo, para mejorar la eliminación del virus de hepatitis C (HCV) de los sujetos que reciban la terapia antiviral.

Cuando el agente se enlaza a un receptor de IFN, se prefiere que el agente se enlace a, e inhiba el enlace de, el IFNa con el receptor de IFN.

Hay un número de diferentes receptores de Interferón. Las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en la Figura 9. Esta información puede ser utilizada por la persona experta con el fin de desarrollar un agente de enlace con el polipéptido del receptor del IFN.

Se prefiere que el agente se enlace a un epítopo sobre el receptor definido por la proteina del receptor de IFN que se haya plegado correctamente en su forma nativa. Se apreciará que puede haber alguna variabilidad de secuencia entre las especies y también entre los genotipos. De conformidad con lo anterior, otros epítopos preferidos comprenderán regiones equivalentes a partir de las variantes del gen del receptor. Las regiones equivalentes a partir de polipéptidos de IFN adicionales se pueden identificar utilizando las herramientas de similitud e identidad de secuencias, y los métodos de búsqueda de bases de datos, ilustrados anteriormente en el primer aspecto de la invención.

Una modalidad del tercero o cuarto aspectos de la invención es en donde el agente es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

El uso de anticuerpos como agentes para modular la actividad de los polipéptidos es bien conocido. En realidad, los agentes terapéuticos basados en anticuerpos se están utilizando cada vez más en medicina. Como se estipula en lo anterior, los inventores se dieron cuenta de que se puede utilizar un anticuerpo para neutralizar el sistema de IFN mediante su enlace al mismo, o que puede actuar como un inhibidor de un receptor de IFN. Por consiguiente, es evidente que estos agentes tienen una gran utilidad como medicamentos para la mejora en el tratamiento de las infecciones por el virus de hepatitis C (HCV). Más aún, estos anticuerpos se pueden utilizar en los métodos de pronóstico estipulados anteriormente en los aspectos adicionales de la invención.

Se pueden reproducir anticuerpos para utilizarse en el tratamiento de sujetos humanos contra: (a) el polipéptido de IFNa por sí mismo, o un número de péptidos derivados a partir del polipéptido de IFNa, o de péptidos que comprendan secuencias de aminoácidos correspondientes a las que se encuentran en el polipéptido de IFNa; o (b) el receptor de IFN, o un número de péptidos derivados a partir del receptor de IFN, o de péptidos que comprendan secuencias de aminoácidos correspondientes a las que se encuentran en el receptor de IFN.

Se prefiere que los anticuerpos se reproduzcan contra las estructuras antigénicas a partir del polipéptido de IFNa humano, el receptor de IFN humano, y los derivados peptídicos y fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos se pueden producir como sueros policlonales mediante la inyección del antígeno en animales. Los anticuerpos policlonales preferidos se pueden reproducir mediante la inoculación de un animal (por ejemplo, un conejo) con el antígeno (por ejemplo, todo o un fragmento del polipéptido de IFNa), empleando las técnicas conocidas en este campo.

De una manera alternativa, el anticuerpo puede ser monoclonal. Se pueden emplear las técnicas de hibridoma convencionales para reproducir estos anticuerpos. El antígeno utilizado para generar anticuerpos monoclonales para utilizarse en la presente invención puede ser igual al que se utilizaría para generar los sueros policlonales.

En su forma más simple, los anticuerpos o las proteínas de inmunoglobulina son moléculas en forma de Y usualmente ejemplificadas por la clase de anticuerpos de v-inmunoglobulina (IgG). La molécula consiste en cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) idénticas, y dos cadenas ligeras (L) idénticas de aproximadamente 50 kD y 25 kD, respectivamente. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada (H-L) mediante enlaces de disulfuro y no covalentes. Dos combinaciones idénticas de cadena H-L se enlazan una a la otra mediante enlaces no covalentes y de disulfuro similares entre las dos cadenas H para formar la estructura básica de inmunoglobulina de cuatro cadenas (H-L)2.

Las inmunoglobulinas de cadena ligera están formadas de un dominio-V (VL) y un dominio constante (CL), mientras que las cadenas pesadas consisten en un dominio-V y, dependiendo del isotipo de la cadena H, tres o cuatro dominios-C (CH1, CH2, CH3, y CH4).

En la región N-terminal de cada cadena ligera o pesada está un dominio variable (V) que varía mucho en la secuencia, y es responsable del enlace específico con el antígeno . La especificidad del anticuerpo por el antígeno realmente es determ inada po r las secuencias de ami noácidos dentro de las regiones-V conocidas como ciclos hipervariables o regiones determ inantes de com plem entariedad (C D Rs). Cada u na de las regiones-V de la cadena H y L posee 3 de estas regiones determ i nantes de com plementariedad (CDRs), y es la combinación de las 6 lo q ue forma el sitio de en lace de antígeno del anticuerpo . Los am inoácidos restantes de la región-V que exhiben menos variación y que soportan a los ciclos hipervariables se denom inan com o regiones de estructu ra (FRs).

Las reg iones más allá de los dominios variables (dom in ios-C ) son relativamente constantes en la secuencia . Se apreciará que el rasgo característico de los anticuerpos de acuerdo con la invención es el de los dom inios VH y VL. Se apreciará además que la naturaleza precisa , como un todo, de los dominios CH y CL, no es crítica para la invención . De hecho, los anticuerpos preferidos para utilizarse en la invención pueden tener dominios CH y CL muy diferentes. Adicionalmente, como se discute más completamente más adelante, los derivados funcionales de anticuerpos preferidos pueden comprender los dominios variables sin un dominio-C (por ejemplo, los anticuerpos scFV) .

Los anticuerpos preferidos que se consideran como agentes de acuerdo con el tercero o cuarto aspecto de la invención , pueden tener los dominios VL (primer dominio) y VH (segundo dominio). Un derivado de los mismos puede tener el 75 por ciento de identidad de secuencia, por ejemplo, el 90 por ciento de identidad de secuencia, o cuando menos el 95 por ciento de identidad de secuencia. Se apreciará que la mayor parte de variación de la secuencia se puede presentar en las regiones de estructura (FRs), mientras que la secuencia de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de los anticuerpos, y de los derivados funcionales de los mismos, debe estar más conservada.

Un número de modalidades preferidas del agente del tercero o cuarto aspectos de la invención se refieren a moléculas con dominios tanto Variables como Constantes. Sin embargo, se apreciará que los fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos scFV o los FAbs) también están abarcados por la invención, los cuales comprenden esencialmente la región variable de un anticuerpo sin región Constante alguna.

Un fragmento de anticuerpo scFV considerado como un agente del tercero o cuarto aspecto de la invención puede comprender el total de los dominios VH y VL de un anticuerpo reproducido contra el polipéptido de IFN. Los dominios VH y VL pueden estar separados por un péptido enlazador adecuado.

Se sabe que los anticuerpos, y en particular los anticuerpos monoclonales (mAbs), generados en una especie, tienen varios inconvenientes serios cuando se utilizan para tratar una especie diferente. Por ejemplo, cuando se utilizan anticuerpos de murino en seres humanos, tienden a tener una corta vida media circulante en suero, y pueden ser reconocidos como proteínas extrañas por el sistema inmunitario de un paciente que se esté tratando. Esto puede conducir al desarrollo de una respuesta de anticuerpo humano antiratón (HAMA) indeseada. Esto es particularmente problemático cuando se requiere una administración frecuente de un anticuerpo, debido a que puede mejorar su eliminación, bloquear su efecto terapéutico, e inducir las reacciones de hipersensibilidad. Estos factores limitan el uso de los anticuerpos monoclonales de ratón en la terapia de seres humanos, y han provocado el desarrollo de una tecnología de diseño de anticuerpos para generar anticuerpos humanizados.

Por consiguiente, cuando se va a utilizar el anticuerpo capaz de reducir la actividad del IFN como un agente terapéutico para el tratamiento de las infecciones por el virus de hepatitis C (HCV) en un sujeto humano, entonces se prefiere que los anticuerpos y los fragmentos de los mismos de la fuente no humana, sean humanizados.

La humanización se puede lograr mediante el empalme de las secuencias de la región-V (por ejemplo, a partir de un anticuerpo monoclonal generado en un hibridoma no humano) con las secuencias de la región-C (e idealmente las regiones de estructura (FRs) a partir de la región-V) a partir de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos diseñados resultantes son menos inmunogénicos en los seres humanos que los anticuerpos no humanos a partir de los cuales se derivaron, y por consiguiente, son más adecuados para el uso clínico.

Los anticuerpos humanizados pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, en donde, utilizando la tecnología de ADN recombinante, las regiones constantes de inmunoglobulina de roedor son reemplazadas por las regiones constantes de los anticuerpos humanos. Los genes quiméricos de la cadena H y de la cadena L se pueden entonces clonar en vectores de expresión que contengan elementos reguladores adecuados, y se pueden inducir en las células de mamífero con el objeto de producir anticuerpos completamente glicosilados. Mediante la selección de un gen humano de región-C y de cadena-H apropiado para este proceso, se puede pre-determinar la actividad biológica del anticuerpo. Estas moléculas quiméricas se pueden utilizar para tratar o prevenir el cáncer de acuerdo con la presente invención.

La humanización adicional de los anticuerpos puede involucrar el injerto de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o la reconfiguración de los anticuerpos. Estos anticuerpos se producen mediante el trasplante de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo no humano (las cuales forman el sitio de enlace de antígeno del anticuerpo) en las regiones de estructura correspondientes de un anticuerpo humano.

Los fragmentos de anticuerpos humanizados representan los agentes preferidos para utilizarse de conformidad con la invención. Los Fabs humanos que reconocen un epítopo sobre el polipéptido del IFNa o un receptor de IFN, se pueden identificar a través del rastreo de una biblioteca de fagos de anticuerpos humanos de cadena variable. Se pueden emplear las técnicas conocidas en este campo (por ejemplo, las desarrolladas por Morphosys o Cambridge Antibody Technology) para generar los Fabs que se pueden utilizar como agentes de acuerdo con la invención. De una manera breve, se puede generar una biblioteca de anticuerpos Fab de combinación humanos mediante la transferencia de las regiones variables de cadena pesada y ligera a partir de una biblioteca de Fv de una sola cadena en un vector de exhibición de Fab. Esta biblioteca puede proporcionar 2.1 x 1010 fragmentos de anticuerpos diferentes. Entonces se puede utilizar el péptido como "cebo" para identificar los fragmentos de anticuerpos a partir de la biblioteca, que tengan las propiedades de enlace deseadas.

Los anticuerpos de dominio (dAbs) representan otro agente preferido que se puede utilizar de acuerdo con esta modalidad de la invención. Los dAbs son la unidad de enlace funcional más pequeña de los anticuerpos, y corresponden a las regiones variables de las cadenas ya sea pesadas o ligeras de los anticuerpos humanos. Estos dAbs pueden tener un peso molecular de alrededor de 13 kDa (correspondiente a aproximadamente 1/10 (o menos) del tamaño de un anticuerpo completo).

De acuerdo con otra modalidad del tercero y cuarto aspectos de la invención, se pueden utilizar péptidos para reducir la actividad del polipéptido de IFNa. Estos péptidos representan otros agentes preferidos para utilizarse de acuerdo con la invención. Estos péptidos se pueden aislar, por ejemplo, a partir de las bibliotecas de péptidos, mediante la identificación de cuáles miembros de la biblioteca son capaces de reducir la actividad o la expresión del polipéptido de IFNa. Se pueden generar bibliotecas adecuadas empleando las técnicas de exhibición de fagos.

Los aptámeros representan otro agente preferido del tercero o cuarto aspecto de la invención. Los aptámeros son moléculas de ácidos nucleicos que asumen una forma específica dependiente de la secuencia, y que se enlazan a ligandos objetivo específicos, basándose en un ajuste de cerradura y llave entre el aptámero y el ligando. Típicamente, los aptámeros pueden comprender moléculas de ADN ya sea de una sola cadena o de doble cadena (ssADN o dsADN), o moléculas de ARN de una sola cadena (ssARN). Los aptámeros se pueden utilizar para enlazarse con los objetivos tanto de ácidos nucleicos como no de ácidos nucleicos. De conformidad con lo anterior, se pueden generar aptámeros que reconozcan, y por lo mismo reduzcan, la actividad o la expresión del IFNa. Los aptámeros adecuados se pueden seleccionar a partir de reservas de secuencias aleatorias, a partir de las cuales se pueden identificar los aptámeros específicos que se enlacen con las moléculas objetivo seleccionadas con una alta afinidad.

Los métodos para la producción y selección de los aptámeros que tengan la especificidad deseada son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen el proceso SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial).

Dicho de una manera breve, se producen grandes bibliotecas de oligonucleótidos, permitiendo el aislamiento de grandes cantidades de ácidos nucleicos funcionales mediante un proceso iterativo de selección in vitro y la amplificación subsiguiente a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las moléculas anti-sentido representan otro agente preferido para utilizarse de acuerdo con el tercero o cuarto aspectos de la invención. Las moléculas anti-sentido son típicamente ácidos nucleicos de una sola cadena, los cuales pueden enlazarse específicamente a una secuencia de ácido nucleico complementaria producida por un gen, y lo inactivan, desactivando ("off") efectivamente ese gen. La molécula se denomina "anti-sentido" debido a que es complementaria para el ARNm del gen, que se denomina como la secuencia "en sentido", como será apreciado por la persona experta. Las moléculas anti-sentido son típicamente de 15 a 35 bases de longitud de ADN, ARN, o de un análogo químico. Los ácidos nucleicos anti-sentido se han utilizado experimentalmente para enlazarse al ARNm, y previenen la expresión de genes específicos. Esto ha conducido al desarrollo de las "terapias anti-sentido" como fármacos para el tratamiento de cáncer, diabetes, y enfermedades inflamatorias. Los fármacos anti-sentido han sido aprobados recientemente por la FDA de los Estados Unidos para uso terapéutico humano. De conformidad con lo anterior, mediante el diseño de una molécula anti-sentido para la secuencia de polinucleótido que codifique el polipéptido de IFN, sería posible reducir la expresión del polipéptido del IFNa en una célula, y reducir de esta manera la actividad del IFNa, y reducir la activación previa que se ve en la infección por el virus de hepatitis C (HCV). En la Figura 8 se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido de IFNa.

El ARN de interferencia pequeño (siARN), algunas veces conocido como ARN de interferencia corto o como ARN silenciante, representa un agente preferido adicional para utilizarse de acuerdo con el tercero o cuarto aspectos de la invención. Como se estipula anteriormente, los inventores se dieron cuenta de que la activación previa del sistema de IFN está asociada con una resistencia a la terapia antiviral. Por consiguiente, es evidente que las moléculas de siARN que pueden reducir la expresión del IFNa, tienen gran utilidad en la preparación de medicamentos para el tratamiento de la infección por el virus de hepatitis C (HCV). Los siARNs son una clase de moléculas de ARN de 20 a 25 nucleótidos de largo que están involucradas en la senda de interferencia del ARN (ARNi), mediante lo cual, el siARN puede conducir a una reducción en la expresión de un gen específico, o puede interferir específicamente con la traducción de este ARNm, inhibiendo de esta manera la expresión de la proteína codificada por el ARNm. Los siARNs tienen una estructura bien definida: una doble cadena corta (usualmente de 21 nucleótidos) de ARN (dsARN) con colgaduras en 3' de 2 nucleótidos sobre cualquier extremo. Cada cadena tiene un grupo fosfato 5' y un grupo hidroxilo (-OH) 3'. In vivo, esta estructura es el resultado del procesamiento por Dicer, una enzima que convierte ya sea los dsARNs largos o los ARNs de horquilla en siARNs. Los siARNs también se pueden introducir exógenamente (artificialmente) en las células mediante diferentes métodos de transfección para provocar la eliminación genética específica de un gen de interés. De esta manera, se puede dirigir esencialmente a cualquier gen del que se conozca la secuencia, basándose en la complementariedad de secuencias, con un siARN apropiadamente hecho a la medida. Dada la capacidad para eliminar genéticamente esencialmente cualquier gen de interés, la ARNi por medio de los siARNs ha generado un gran interés en la biología tanto básica como aplicada. Existe un número creciente de rastreos de ARNi a gran escala que están diseñados para identificar los genes importantes en diferentes sendas biológicas. Debido a que los procesos de enfermedad también dependen de la actividad de múltiples genes, se espera que, en algunas situaciones, la desactivación de la actividad de un gen con un siARN pueda producir un beneficio terapéutico. Por consiguiente, su descubrimiento ha conducido a una oleada de interés para utilizar el ARNi para la investigación biomédica y el desarrollo de fármacos. Los resultados de la reciente fase I de los estudios terapéuticos de la ARNi demuestran que los siARNs son bien tolerados y tienen propiedades farmacocinéticas adecuadas. Los siARNs y los métodos de inducción de ARNi relacionados, por consiguiente, esperan llegar a ser una importante nueva clase de fármacos en el futuro previsible. Las moléculas de siARN diseñadas para el ácido nucleico que codifica el polipéptido del IFNa se pueden utilizar para reducir la expresión del IFNa, y por consiguiente, para dar como resultado una reducción en la activación previa del sistema de IFN. Por consiguiente, una modalidad de este aspecto de la invención es en donde el agente es una molécula de siARN que tiene una secuencia complementaria para el polinucleótido del IFNa.

En la Figura 8 se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido del IFNa.

El uso de esta información es directo y está bien dentro de la capacidad de la persona experta para diseñar moléculas de siARN que tengan una secuencia complementaria para el polinucleótido del IFNa. Por ejemplo, una búsqueda simple en internet proporciona muchos sitios web que se pueden utilizar para diseñar moléculas de siARN.

En "molécula de siARN" incluimos una molécula de ARN de doble cadena de 20 a 25 nucleótidos de largo, así como cada una de las dos cadenas individuales del ARN que forman una molécula de siARN.

Se prefiere más que el siARN se utilice en la forma de ARN de horquilla (shARN). Este shARN puede comprender dos moléculas complementarias de siARN que se enlacen mediante una secuencia espadadora (por ejemplo, de aproximadamente 9 nucleótidos). Las moléculas de siARN complementarias pueden plegarse de tal manera que se enlacen entre sí.

Una ribozima capaz de disociar el ARN o el ADN que codifica el polipéptido de IFNa representa otro agente preferido del tercero o cuarto aspecto de la invención.

Se prefiere que el agente del tercero o cuarto aspecto de la invención sea capaz de reducir la activación del sistema de IFN en un sujeto que se vaya a tratar, pero que no reduzca la actividad de la siguiente terapia antiviral suministrada al sujeto.

Por ejemplo, cuando el agente del tercero o cuarto aspecto de la invención es un anticuerpo o fragmento del mismo, entonces se prefiere que el agente pueda enlazarse a, y reducir, la actividad del polipéptido de IFNa endógeno, pero no del polipéptido de IFNa exógenamente suministrado. Es posible derivar estos anticuerpos empleando los métodos de rutina en la técnica y la información proporcionada previamente en este aspecto de la invención.

Se apreciará que la cantidad de un agente necesaria de acuerdo con la invención es determinada por la actividad biológica y la biodisponibilidad, la cual a su vez depende del modo de administración y de las propiedades físico-químicas del agente. La frecuencia de administración también será influenciada por los factores anteriormente mencionados, y en particular por la vida media del agente dentro del tejido objetivo o del sujeto que se esté tratando.

Se pueden emplear los procedimientos conocidos, tales como aquéllos convencionalmente empleados por la industria farmacéutica (por ejemplo, experimentación in vivo, estudios clínicos, etc.), para establecer las formulaciones específicas de los agentes y los regímenes terapéuticos precisos (tales como las dosis diarias y la frecuencia de administración).

En términos generales, se puede utilizar una dosis diaria de entre 0.01 microgramos/kilogramo de peso corporal y 0.1 gramos/ kilogramo de peso corporal de un agente en un régimen de tratamiento para tratar la infección por el virus de hepatitis C (HCV); por ejemplo, la dosis diaria es de entre 001 miligramos/kilogramo de peso corporal y 100 miligramos/kilogramo de peso corporal.

A manera de ejemplo, una dosis adecuada de un anticuerpo de acuerdo con la invención es de 10 microgramos/kilogramo de peso corporal a 100 miligramos/kilogramo de peso corporal, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 miligramos/kilogramo de peso corporal a 10 miligramos/kilogramo de peso corporal, y en algunas modalidades, de aproximadamente 6 miligramos/kilogramo de peso corporal.

Las dosis diarias se pueden dar como una sola administración (por ejemplo, una sola inyección diaria o una sola dosis a partir de un inhalador). De una manera alternativa el agente (por ejemplo, un anticuerpo o aptámero) puede requerir de la administración dos veces o más veces durante un día.

Los medicamentos de acuerdo con la invención deben comprender una cantidad terapéuticamente efectiva del agente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es cualquier cantidad de un agente de acuerdo con la invención que, cuando se administra a un sujeto, inhibe o previene el crecimiento de cáncer o la metástasis.

Un "sujeto" puede ser un vertebrado, mamífero, animal doméstico, o un ser humano. Se prefiere que el sujeto que se vaya a tratar sea un ser humano. Cuando éste es el caso, los agentes se pueden diseñar de tal manera que sean más adecuados para la terapia humana (por ejemplo, humanización de anticuerpos, como se discute anteriormente). Sin embargo, también se apreciará que los agentes también se pueden utilizar para tratar a otros animales de interés veterinario (por ejemplo, caballos, perros o gatos).

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", como es referido en la presente, es cualquier vehículo fisiológico conocido por los expertos en este campo como útil en la formulación de las composiciones farmacéuticas.

En una modalidad, el medicamento puede comprender de aproximadamente 0.01 microgramos a 0.5 gramos del agente La cantidad del agente en la composición puede ser de entre 0 0.1 miligramos y 200 miligramos, por ejemplo, de entre aproximadamente 0.1 miligramos y 100 miligramos, o de entre aproximadamente 1 miligramo y 10 miligramos. Por consiguiente, la composición puede comprender entre aproximadamente 2 miligramos y 5 miligramos del agente.

En algunas modalidades, el medicamento comprende de aproximadamente el 0.1 por ciento (peso/peso) al 90 por ciento (peso/peso) del agente, y en algunas modalidades, del 1 por ciento (peso/peso) al 10 por ciento (peso/peso). El resto de la composición puede comprender al vehículo.

Los agentes de ácidos nucleicos se pueden suministrar a un sujeto mediante su incorporación dentro de liposomas. De una manera alternativa, las moléculas de ADN "desnudas" se pueden insertar en las células de un sujeto mediante un medio adecuado, por ejemplo, mediante absorción endocitótica directa. Las moléculas de ácidos nucleicos se pueden transferir a las células de un sujeto que se vaya a tratar, mediante transfección, infección, microinyección, fusión celular, fusión del protoplasto, o bombardeo balístico. Por ejemplo, la transferencia puede hacerse mediante transfección balística con partículas de oro recubiertas, conteniendo los liposomas las moléculas de ADN, vectores virales (por ejemplo, adenovirus), y elementos para proporcionar la absorción directa del ADN (por ejemplo, endocitosis), mediante la aplicación de las moléculas de ADN directamente al tejido objetivo tópicamente o mediante inyección.

Los anticuerpos, o los derivados funcionales de los mismos, se pueden utilizar en un número de formas. Por ejemplo, se puede requerir la administración sistémica, en cuyo caso, los anticuerpos o los derivados de los mismos pueden estar contenidos dentro de una composición, la cual, por ejemplo, se puede ingerir oralmente en la forma de una tableta, cápsula, o líquido. Se prefiere que los anticuerpos o los derivados de los mismos se administren mediante inyección en la corriente sanguínea. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) ó subcutáneas (bolo o infusión). De una manera alternativa, los anticuerpos se pueden inyectar directamente al hígado.

Las entidades terapéuticas de ácidos nucleicos o de polipéptidos se pueden combinar en composiciones farmacéuticas que tengan un número de formas diferentes, dependiendo en particular de la manera en la cual se vaya a utilizar la composición. Por consiguiente, por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un polvo, tableta, cápsula, líquido, ungüento, crema, gel, hidrogel, aerosol, aspersión, micelios, parche transdérmico, liposoma, o cualquier otra forma estable que se pueda administrar a una persona o a un animal. Se apreciará que el vehículo de la composición de la invención debe ser uno que sea bien tolerado por el sujeto al que se dé, y que pueda hacer posible el suministro del agente terapéutico a la célula, tejido, u órgano objetivo.

En una modalidad preferida, el vehículo farmacéutico es un líquido y la composición farmacéutica está en la forma de una solución. En otra modalidad, el vehículo farmacéutico es un gel y la composición está en la forma de una crema o similar.

Las composiciones que comprenden estas entidades terapéuticas se pueden utilizar en un número de formas, por ejemplo, se puede requerir la administración sistémica, en cuyo caso, las entidades pueden estar contenidas dentro de una composición que, por ejemplo, pueda ser ingerida oralmente en la forma de a tableta, cápsula o líquido. De una manera alternativa, la composición se puede administrar mediante inyección hacia la corriente sanguínea.

Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión). Las entidades se pueden administrar mediante inhalación (por ejemplo, intranasalmente).

Las entidades terapéuticas también se pueden incorporar dentro de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Estos dispositivos, por ejemplo, se pueden insertar sobre o debajo de la piel, y el compuesto se puede liberar durante semanas o incluso durante meses. Estos dispositivos pueden ser particularmente convenientes cuando se requiere el tratamiento a largo plazo con una entidad, y el cual normalmente requeriría de una administración frecuente (por ejemplo, cuando menos una inyección diaria).

Los agentes del primer aspecto de la invención son particularmente útiles para tratar previamente a los pacientes a punto de someterse al tratamiento con la terapia antiviral con IFN (por ejemplo, pegIFN) y con un agente antiviral, tal como ribavirina. Por consiguiente, se prefiere que el agente se administre a un individuo viralmente infectado antes de iniciar la terapia con IFN y ribavirina.

La duración de tiempo entre el tratamiento previo con los agentes definidos en relación con el tercero y cuarto aspecto de la invención, y la terapia antiviral, puede depender de los agentes utilizados. Por ejemplo, cuando el agente es capaz de reducir la activación del sistema de IFN en un sujeto que se vaya a tratar, pero no de reducir la actividad de la siguiente terapia antiviral suministrada al sujeto, entonces la duración de tiempo puede ser muy corta. Por ejemplo, el sujeto se podría tratar de una manera concurrente, o inclusive con un régimen de tratamiento combinado.

Si el agente no se está distinguiendo, entonces la duración de tiempo puede depender de la naturaleza del agente. Por ejemplo, se sabe que el anticuerpo exógenamente suministrado toma alrededor de 4 a 6 semanas para eliminarse del cuerpo humano. Por consiguiente, cuando el agente es un anticuerpo para el polipéptido o receptor de IFNa, u otro miembro del sistema de IFN, entonces la siguiente terapia antiviral se puede suministrar al paciente de 4 a 6 semanas después, por ejemplo, cuando menos 6 semanas.

Los diferentes elementos requeridos para que un técnico lleve a cabo el método del primer aspecto de la invención se pueden incorporar en un kit.

Por lo tanto, de acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona un kit para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga una infección viral del hígado responda a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN), el cual comprende: (i) elementos para analizar en una muestra a partir de un sujeto, la expresión de cuando menos un gen a partir de cada uno de los grupos de genes enlistados anteriormente y mostrados en la Tabla 2, y, opcionalmente, (ii) elementos para comparar la expresión de los genes en la muestra con la expresión de los mismos genes en una muestra de control.

En "elementos para analizar en una muestra a partir de un sujeto, la expresión de cuando menos un gen a partir de cada uno de los grupos de genes enlistados anteriormente y mostrados en la Tabla 2" incluimos las moléculas de enlace especifico dadas en el primer aspecto de la invención, que pueden dirigirse a las moléculas representativas de la expresión genética en la muestra. En algunas modalidades, la molécula de enlace específico es una sonda de oligonucleótido, anticuerpo, aptámeros, o proteínas de enlace o moléculas pequeñas mencionadas anteriormente.

En "elementos para comparar la expresión de los genes en la muestra con la expresión de los mismos genes en una muestra de control" incluimos las muestras de control mencionadas anteriormente en el primer aspecto de la invención, También incluimos los datos de referencia de control mencionados en la presente.

El kit del quinto aspecto de la invención también puede comprender: (iii) los reguladores y reactivos relevantes para analizar la expresión de estos genes.

Los reguladores y reactivos proporcionados con el kit pueden estar en una forma líquida, y en algunas modalidades, se pueden proporcionar como alícuotas previamente medidas. De una manera alternativa, los reguladores y reactivos pueden estar en una forma concentrada (o inclusive en una forma de polvo) para su dilución.

Los diferentes elementos requeridos para que un técnico lleve a cabo el método del segundo aspecto de la invención se pueden incorporar en un kit.

Por consiguiente, de acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona un kit para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga infección viral del hígado responda a la terapia antiviral que incluya la estimulación de la actividad del Interferón (IFN), el cual comprende elementos para examinar una muestra del sujeto con el fin de identificar la localización subcelular del STAT1.

En "elementos para examinar una muestra del sujeto con el fin de identificar la localización subcelular del STAT1" incluimos las moléculas de enlace específico dadas en el segundo aspecto de la invención, que pueden identificar la localización subcelular del STAT1. En algunas modalidades, esta molécula de enlace específico es un anticuerpo anti-STAT; en algunas modalidades, es un anticuerpo anti-fosfo-STAT1.

El kit del sexto aspecto de la invención también puede comprender: (iii) los reguladores y reactivos relevantes para identificar la localización subcelular del STAT1. Los reguladores y reactivos proporcionados con el kit pueden estar en una forma líquida, y en algunas modalidades, se pueden proporcionar como alícuotas previamente medidas. De una manera alternativa, los reguladores y reactivos pueden estar en una forma concentrada (o inclusive en forma de polvo) para su dilución.

Todas las ca racterísticas descritas en la presente (incluyendo cualesq u iera reivindicaciones , resu men , y dibujos acom pañantes) , y/o todos los pasos de cualquier método o proceso dado a conocer de esta m anera , se pueden com binar con cualquiera de los aspectos anteriores en cualq uier com binación , excepto las com binaciones en donde cuando menos algunas de estas características y/o pasos sean m utuamente exclusivos.

Ahora se describirá ad icionalmente la invención con referencia al siguiente Ejem plo y a las Figuras, en las cuales: Figura 1 . Regulación de la expresión genética inducida por el PeglFN-a2b en el hígado y en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

(A) Los respondentes rápidos sobre- o sub-regulan significativamente más genes en el h ígado en respuesta al peglFN-a2b que los pacientes sin respuesta rápida (sin RR). Se muestra el número promedio (+SEM) de genes cambiados más de 2 veces en los niveles de significado p < 0.01 (pistas 1 , 2 , 5, y 6), y p < 0.05 (pistas 3, 4, 7, y 8) en >75 por ciento de los pacientes, en las biopsias de h ígado y en las células monon ucleares de sangre periférica (PBMCs) . Las diferencias entre los grupos de pacientes con respuesta rápida (RR) y sin respuesta rápida (sin RR) son significativas en las biopsias de h ígado, pero no en las células mononucleares de sang re periférica (PBMCs) (en la figu ra se muestran los valores p de las pruebas de Mann Whitney).

(B) En el diag rama de Venn los genes sig nificativamente (p < 0.05) se sobre- o sub-regularon >2 veces en respuesta al pegIF N-a en > 50 por ciento de las 6 m uestras de biopsia sin respuesta rápida (sin RR) y en las 6 m uestras de biopsia con respuesta rápida (RR) aleatoriamente seleccionadas.

(C) En el diagrama de Ven n los genes sig nificativamente (p < 0.05) se sobre- o sub-reg u la ron >2 veces en respuesta al pegIF N-a en las muestras de biopsia y de células mononuclea res de sangre periférica (PBM Cs) de > 50 por ciento de los 6 pacientes con respuesta rápida (R R) aleatoriamente seleccionados.

Figura 2. La regulación genética inducida por el PeglFN-a2b en los pacientes infectados por el virus de hepatitis C (HCV) m uestra importantes diferencias entre los hígados de los pacientes con respuesta virológica rápida (RVR) y si n respuesta virológica rápida (sin RVR), y entre el hígado y las cél ulas mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

(A) Se seleccionaron cinco genes estimulados por los interferones (ISGs) ((Mx1 , viperina, Mda5/helicard , OAS 1 , USP 1 8) a partir de la lista de los genes significativamente (p < 0.05) regulados >2 veces entre B-1 y B-2 en los pacientes con respuesta rápida (RR) . En el h ígado de los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) , la expresión de estos genes ya es alta antes del tratamiento (pistas 25 a 30) , y no aumenta adicionalmente después del pegIFNa (pistas 31 a 36) . En los pacientes con respuesta rápida (RR), la expresión antes del tratamiento (pistas 5 a 14) es similar a la de los controles (pistas 1 a 4), y el pegIFNa induce una fuerte sobre-regulación (pistas 15 a 24). No se encuentra ninguna activación previa en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (pistas 37 a 46 y 57 a 62), y el pegIFNa induce fuertemente estos genes, tanto en los pacientes con respuesta rápida (RR) como en los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) (pistas 47 a 56 y 63 a 68). Los ejes-y exhiben valores de expresión absolutos.

(B) Un ejemplo de un gen (CCL8) sobre-regulado en el hígado en respuesta al peglFN-a2b, tanto en los pacientes con respuesta rápida (RR) como en los pacientes sin respuesta rápida (sin RR). Los valores de expresión en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se muestran en las pistas 37 a 68).

Figura 3. Análisis de RT-qPCR de los genes estimulados por los interferones (ISGs) seleccionados y de la subunidad catalítica de PP2A.

(A) El análisis de RT-qPCR del ARNm de USP18 corrobora los datos del arreglo. Se ilustra la inducción de pliegue del ARNm de USP18 entre B-1 y B-2 en los pacientes individuales.

(B) El nivel de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) seleccionados en las biopsias antes del tratamiento es más bajo en los pacientes con respuesta virológica oportuna (EVR = caída de más de 2 log de la carga viral en la semana 12) que en los pacientes sin respuesta primaria (PNR = caída de menos de 2 log de la carga viral en la semana 12) (C) Tanto dentro del grupo de los pacientes con los genotipos 1 y 4 ("difíciles" de tratar), como dentro del grupo con los genotipos 2 y 3 ("fáciles" de tratar), los pacientes sin respuesta primaria (PNR) tienen niveles de expresión más altos de USP18 e IFI27 antes del tratamiento.

En los paneles B y C, el eje y muestra la expresión en relación con aquélla de GAPDH. El significado estadístico se probó con la prueba de Mann-Whitney. N - número de pacientes en cada grupo.

(D) Los pacientes con una respuesta virológica sostenida (SVR = ARN del virus de hepatitis C (HCV) indetectable 6 meses después del final del tratamiento) o con respuesta al final del tratamiento (EoTR), muestran una expresión significativamente más baja de USP18 e IFI27 que los pacientes sin respuesta primaria (PNR) o sin respuesta al final del tratamiento (EoTR).

Figura 4. Análisis de la señalización de Jak-STAT en las biopsias de hígado.

(A) La fosforilación de STAT1 en los extractos de biopsias de hígado recolectadas antes (B-1) y después (B-2) de la inyección de peglFN-a2b. Los extractos se analizaron mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos para PY(701)-STAT1. Las señales se cuantificaron utilizando el Software Odyssey Imaging para calcular la intensidad integrada (kilo cuentas x mm2). Los valores representan las veces de aumento de fosforilación en las muestras B-2. Los números de pacientes con respuesta rápida (RR) se muestran en claro, los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) en oscuro. Los manchados se desprendieron y se volvieron a sondear para el STAT1 total utilizado como un control de carga para cada par de m uestras.

(B) Los ejem plos representativos de B-1 y B-2 de los pacientes con respuesta rápida (RR) y de los pacientes sin respuesta rápida (sin RR). No es evidente ningún teñido nuclea r en las biopsias antes del tratam iento de los pacientes con respuesta rápida (R R) (Paciente 4). El color azul claro de los núcleos se origina a pa rti r del contra-teñido con hematoxilina . 4 horas después del pegIF Na , la m ayoría de los hepatocitos m uestran un fuerte teñido nuclear. En los pacientes sin respuesta rá pida (sin R R) (Paciente 1 2) , ya está presente u n teñido nuclear débil en las biopsias antes del tratam iento, y el pegIF Na induce pequeños cam bios en los hepatocitos . E l au mento visible del teñido nuclear está confinado a las células de Kupffer.

Figura 5. El patrón de expresión genética predominante en las muestras de biopsia de todos los pacientes se muestra como un mapa de calor.

El mapa se generó utilizando una lista de 252 genes que se alteran > 2 veces en > 50 por ciento de todos los respondentes rápidos (RRs) con un valor p de <0.05. La codificación de color de los valores de expresión brutos se muestra a la izquierda. Muchos genes tienen un bajo nivel de expresión en los pacientes de control y en las biopsias previas al tratamiento de los pacientes con respuesta rápida (RR) (B-1 ). En los pacientes con respuesta rápida (RR) , el pegIFNa induce u na sobre-regulación (B-2) . En los pacientes sin respuesta rápida (sin RR), muchos de los genes ya son fuertemente inducidos en las muestras de biopsia previas al tratamiento (B-1), y entonces no se encuentra inducción adicional después del pegIFNa (B-2).

Figura 6. Predicción supervisada del clasificador en las muestras de biopsia de hígado y en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) con respuesta al tratamiento en la semana 4 como criterio de agrupación.

(A) La predicción supervisada del clasificador utilizando las biopsias B-1 de los dos grupos de respuesta dio como resultado una lista de 29 genes (33 transcripciones) como los mejores predictores del resultado del tratamiento con un índice de mala clasificación del 4.3 por ciento.

(B) La predicción supervisada del clasificador utilizando las biopsias B-2 de los dos grupos de respuesta reveló una lista de 16 genes (16 transcripciones) como los mejores predictores del resultado del tratamiento con un índice de mala clasificación del 19.5 por ciento.

(C y D) La predicción supervisada del clasificador de las muestras de PBMC-1 y PBMC-2 no generó una lista útil de genes predictivos con cualquiera de las 4 pruebas estadísticas utilizadas (Support Vector Machine, Sparse Linear Discriminant Analysis, Fisher Linear Discriminant Analysis, K Nearest Neighbors). Los índices de mala clasificación fueron del 38.5 por ciento para PBMC-1 y del 42.6 por ciento para PBMC-2.

Figura 7 (A) Evaluación semi-cuantitativa del teñido inm uno-histoquímico de fosfo-STATI en las biopsias de hígado. El teñido nuclear de los hepatocitos se cuantificó mediante conteo repetido (5 veces) en 200 hepatocitos en las muestras B-1 y B-2 de los pacientes indicados (los números de los pacientes corresponden a los números en la Tabla 1 ). En cinco de seis pacientes sin respuesta rápida (sin RR) , una proporción considerable de los hepatocitos tuvieron un teñido nuclear débil pero claro ya en las biopsias antes del tratamiento. Ninguno de los pacientes con respuesta rápida (RR) tuvo señales de fosfo-STATI en los núcleos antes del tratamiento, pero mostraron una fuerte inducción después del pegIFNa.

(B) La inducción del enlace de STAT-ADN en respuesta al pegl FNa2b se deteriora en la mayoría de los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) . Los extractos nucleares a partir de las muestras B-1 y B-2 se analizaron con EMSAs utilizando la sonda de oligonucleótido SI E-m67 radiomarcada. El asterisco (*) ilustra la señal de los d ímeros STAT1 activados que tienen enlazada la secuencia del oligonucleótido. Los números arriba de los paneles de cambio de gel representan los números de los pacientes como ya se utilizan en la Tabla 1 . El panel superior muestra los 10 pacientes con una respuesta rápida en la semana 4 (números 1 a 1 0) . El panel inferior muestra los 6 pacientes sin respuesta rápida (sin RR) (números 1 1 a 1 6).

Figura 8: Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos del Interferón a humano.

Figura 9 : Secuencia de aminoácidos y de nucleótidos del Receptor de I nterferón humano 1 .

Figura 10: Secuencia de aminoácidos y de nucleótidos del Receptor de Interferón humano 2.

Figura 1 1 : Secuencia de aminoácidos y de nucleótidos del Receptor de I nterferón humano 2b.

Figura 1 2: Secuencia de aminoácidos y de nucleótidos del Receptor de I nterferón humano 2c.

Ejem plo 1 1 .1 Métodos 1 .1.1 M uestras de los sujetos y tratam iento Desde Enero de 2006 hasta Abril de 2007, a los pacientes con C HC referidos a la clínica del h ígado de pacientes externos del U niversity Hospital de Basilea , se les pidió permiso de usar parte de su biopsia de hígado de diagnóstico (B-1 ) para propósitos de investigación. A los pacientes que entonces se trataron con el I FNa2b pegilado (Peglntron) y ribavirina (Rebetol, ambos de Essex Chemie AG, Suiza) se les pidió participar en este estudio. 16 pacientes estuvieron de acuerdo en someterse a una segunda biopsia de h ígado (B-2) 4 horas después de la primera inyección de 1 .5 microgramos/kilogramo de peso corporal de peglFNa2b (Peglntron) . Todos ellos eran caucásicos. La primera dosis de ribavirina se dio después de esta segunda biopsia para evitar factores confusos adicionales . El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del University Hospital de Basilea. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. La sangre para el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se recolectó antes del tratamiento, y 4 horas después de la primera inyección del peglFNa2b. Los pacientes se trataron con peglFNa2b (1.5 microgramos/kilogramo de peso corporal), y ribavirina (dosificación basada en el peso: <65 kilogramos: 800 miligramos/día, de 65 a 85 kilogramos: 1 gramo/dia, >85 kilogramos: 1.2 gramo/día). El ARN del virus de hepatitis C (HCV) se cuantificó antes del inicio del tratamiento y en las semanas 4 y 12 del tratamiento. La duración del tratamiento fue de 24 semanas para los pacientes con los genotipos 2/3, y de 48 semanas para el genotipo 1. Como los controles sin CHC, 4 pacientes que se sometieron a biopsias guiadas por ultrasonido de las lesiones focales, dieron su consentimiento informado para una biopsia a partir del tejido de hígado normal fuera de la lesión focal. Las biopsias de hígado previas al tratamiento a partir de 96 pacientes adicionales (todos salvo uno de ellos eran caucásicos) con CHC, se utilizaron para la RT-qPCR para los genes estimulados por los interferones (ISGs) seleccionados.

Se obtuvieron muestras de biopsia de hígado humanas emparejadas a partir de los 16 sujetos crónicamente infectados con el virus de hepatitis C (HCV). Desde Enero de 2006 hasta Abril de 2007, a todos los sujetos con hepatitis C crónica referidos a la clínica del hígado de pacientes externos del University Hospital de Basilea, se les pidió su permiso para usar parte de su biopsia de hígado de diagnóstico para propósitos de investigación. Las biopsias de hígado se obtuvieron mediante la técnica guiada por ultrasonido utilizando una aguja coaxial.

Después de remover dos muestras de biopsia de 20 a 25 milímetros de largo para el procesamiento histopatológico de rutina para calificar y clasificar la enfermedad hepática de acuerdo con el sistema de calificación de Metavir, los cilindros restantes de biopsia de 5 a 20 milímetros de largo se marcaron como B1 (para la biopsia 1), y se almacenaron como muestras previas al tratamiento de los futuros participantes en el estudio. Se prescribió el IFNa2b pegilado (Essex Chemie AG, Suiza) a todos los sujetos que participaron en este estudio. Se llevó a cabo una segunda biopsia (B2) 4 horas después de la primera inyección del peglFNa2b. La primera dosis de ribavirina se dio después de esta segunda biopsia para evitar factores confusos adicionales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del University Hospital en Basilea. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos.

En adición, se recolectó la sangre para el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes del tratamiento y 4 horas después de la primera inyección del peglFNa2b.

Los sujetos con el virus de hepatitis C (HCV) se sometieron a un tratamiento de combinación convencional con peglFNa2b (1.5 microgramos/kilogramo de peso corporal), y ribavirina (dosificación basada en el peso: <65 kilogramos: 800 miligramos/día, de 65 a 85 kilogramos: 1 gramo/día, <85 kilogramos: 1,2 gramo/día). El ARN de HCV se cuantificó antes del inicio del tratamiento, en la semana 4, y en la semana 12 del tratamiento (Tabla 1). La duración del tratamiento es de 24 semanas para los sujetos con los genotipos 2/3, y de 48 semanas para el genotipo 1. De los 16 sujetos incluidos en el estudio, 2 sujetos (Números 10 y 16) no tuvieron una respuesta primaria y se interrumpió el tratamiento en la semana 12. De los 9 sujetos restantes, 2 (Números 1 y 2) llevaron a cabo la terapia con una respuesta al final de tratamiento.

Como los controles sin virus de hepatitis C (HCV), dos sujetos que se sometieron a las biopsias de hígado guiadas por ultrasonido de las lesiones focales (metástasis de carcinomas) dieron su consentimiento informado para una biopsia a partir del tejido de hígado normal fuera de la lesión focal. Nuevamente, una parte de la biopsia se utilizó para el diagnóstico histopatológico de rutina, y el tejido restante para la extracción del ARN, como se describe posteriormente. Ambas muestras de control mostraron una ausencia confirmada de enfermedad hepática en el procesamiento histo-patológico de rutina. 1.1.2 Medición de las concentraciones en suero de IFN-alfa Se midieron los niveles en suero de hlFNa antes del tratamiento, y la concentración en suero del peglFNa2b, 4 horas después de la primera inyección, utilizando el kit ELISA de interferón-alfa humano de PBL Biomedical Laboratories de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Anteriormente se ha dem ostrado que este kit ELISA reconoce el I FNa humano tanto no pegilado como pegilado34. 1 .1.3 Preparación de extractos a partir de biopsias de hígado humanas Se utilizaron muestras de biopsia de hígado para la preparación de extractos de células enteras, citoplásmicos y nucleares. Para los extractos de células enteras, las muestras se homogeneizaron en 1 00 microlitros de regulador de lisis que conten ía 1 00 milimoles/litro de NaCI , 50 milimoles/litro de Tris, pH de 7 5, 1 milimol/litro de EDTA, Tritón X-100 al 0.1 por ciento, 10 milimoles/litro de NaF, 1 milimol/litro de fluoruro de fenil-metil-sulfonilo, y 1 milimol/litro de vanadato. Los lisados se centrifugaron a 14,000 revoluciones por min uto a 4°C durante 5 minutos. La concentración de proteína fue determinada por Lowry (Ensayo de Proteína BioRad) .

Para los extractos nucleares y citoplásmicos, los hígados se lisaron en un regulador bajo en sal que conten ía 200 milimoles/litro de Hepes, pH de 7 6, 1 0 milimoles/litro de KC I , 1 milimol/litro de EDTA, 1 milimol/litro de EGTA, NP-40 al 0.2 por ciento, glicerol al 10 por ciento, y 0.1 milimol/litro de vanadato. Después de la centrifugación a 15,000 revoluciones por minuto durante 5 minutos , el aglomerado se volvió a suspender en regulador alto en sal (regulador bajo en sal complementado con 420 milimoles/litro de NaC I) . Después de la centrifugación , se extrajeron alícuotas de los extractos nucleares para los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSAs). 1.1.4 Western blots y Ensayos de Cambio de Movilidad Electroforética 10 microgramos de proteína total a partir de los Usados de hígado humano, se cargaron para la electroforesis en gel de poliacrilamida/dodecil-sulfato de sodio, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Bottmingen, Suiza). Las membranas se bloquearon en albúmina de suero bovino al 3 por ciento / leche (1:1) - Tritón X-100 al 0.1 por ciento durante 1 hora, se lavaron con suero regulado por Tris/Tween-20 (TBST), y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4°C.

Las proteínas se detectaron con los anticuerpos primarios específicos para el STAT1 fosforilado (PY(701 )-STAT1 , Señalización Cell Signaling, Bioconcept, Allschwil, Suiza), y para el STAT1 (término carboxilo; Transduction Laboratories, BD Biosciences, Pharmingen). Después de 3 lavados con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos de cabra anti-ratón (ERDye 680) o anticonejo (IRDye 800) secundarios fluorescentes infrarrojos (ambos de LI-COR Biosciences) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los manchados se analizaron mediante el Sistema de Toma de Imágenes Infrarrojas Odyssey de LI-COR. La imagen infrarroja se obtuvo en un solo escaneo, y la señal se cuantificó utilizando la intensidad integrada.

Para los controles de carga, las membranas se desprendieron y se incubaron con el anticuerpo anti-B-Actina (Sigma) .

Los EM SAs se llevaron a cabo utilizando 2 m icrogra mos de los extractos n ucleares y el elemento (S I E)-m67 inducible por suero con oligonucleótido-ADN radiom arcado con 32P correspondiente a las secuencias de los elementos de respuesta de STAT25. 1 .1.5 Inm unohistoqu ímica Se emplearon los procedimientos de inmunoperoxidasa indirecta convencionales para la inmunohistoqu ímica (ABC-Elite, Vectra Laboratories). Se cortaron secciones de 4 milímetros de espesor a partir de bloques de parafina , se rehid rataron , se trataron previamente (20 minutos en solución de ER2) , se incubaron con un anticuerpo monoclonal de conejo contra fosfo-STAT1 (dilución a 1 :200, #91 67 Cell Signaling) , y se contra-tiñeron con hematoxilina . Todo el procedimiento de teñido (deshidratación , tratamiento previo, incubación , contra-teñido, y montaje) se llevó a cabo con un teñidor automatizado (Bond®, Vision BioSystems Europe, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido). Para la cuantificación del teñido nuclear con fosfo-STAT1 , se contaron 200 hepatocitos 5 veces para cada muestra B-1 y B-2 de cada paciente. En la Figura 3 complementaria , se muestran los valores promedio con las desviaciones estándar. 1 .1 .6 Aislam iento del ARN y Análisis de Microarreglos.

Se extrajo el ARN total a partir de las muestras de h ígado y de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , utilizando el Mini-Kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se puso en alícuotas y se almacenó a -80°C. Se evaluó la expresión genética en el hígado y en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante análisis de microarreglos utilizando los arreglos del Genoma Humano Affymetrix U133 Plus 2.0, que representan más de 56,000 transcripciones y variantes con 11 pares de sonda de acoplamiento perfecto/mal acoplamiento por transcripción. Las hibridaciones de microarreglos se llevaron a cabo en la instalación genómica funcional del Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research en Basilea. El ARN total (de 1 a 2 microgramos) de cada muestra se transcribió inversamente y se biotiniló utilizando el kit de amplificación de 1 ciclo Affymetrix de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARNc biotinilado (20 microgramos) se fragmentó mediante calentamiento con magnesio (de acuerdo con las instrucciones de Affymetrix), y se hibridaron 15 microgramos del ADNc fragmentado a los GeneChips U133 Plus 2.0 Humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El control de calidad y la normalización del fondo se llevaron a cabo utilizando el Refiner 4.1 de Genedata AG (Basilea, Suiza). Las estimaciones del valor de expresión se obtuvieron utilizando la implementación de GC-RMA del Refiner 4.1. La normalización de LOWESS y la escala media de los genes pedidos presentes (detección: valor P < 0.04) en un valor de 500, se llevaron a cabo en el paquete Analyst 4.1 de Genedata. Los datos normalizados LOWESS son referidos como valores de expresión "brutos" en este documento. También llevamos a cabo una división por puntos sobre los genes dividiendo cada gen entre su media, con el objeto de centrar su nivel de expresión en 1.0. Estos datos escalados muestran solamente la magnitud y la dirección del cambio, pero no el nivel de expresión absoluto. Los datos escalados se utilizaron para los análisis de racimos. A menos que se observe de otra manera, todos los demás análisis se llevaron acabo utilizando los datos brutos.

El análisis de datos se llevó a cabo utilizando el Expresionist® Analyst 4.1 de Genedata AG. Se requería que los genes pasaran una prueba-t con un P < 0.05 y que tuvieran un cambio de pliegue medio de 1.3, 1.5, 2, y 5, o mayor entre las muestras emparejadas de los pacientes en cuando menos el 60 por ciento de los pacientes dentro de cada grupo. Para la predicción supervisada del clasificador de las muestras de biopsia de hígado y en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando la respuesta en la semana 4 como un criterio de agrupación, se utilizaron 4 pruebas estadísticas (Support Vector Machine, Sparse Linear Discriminant Analysis, Fisher Linear Discriminant Analysis, K Nearest Neighbors). Se pudieron determinar los índices de mala clasificación para cada prueba utilizada, y se seleccionó aquélla con el índice más bajo. 1.1.7 Aislamiento del ARN, Transcripción Inversa, y SYBR- PCR.

Los datos del arreglo se validaron mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT- PCR) cuantitativa en tiempo real de varios genes regulados por IFN, incluyendo STAT1, IP10, USP18, IFI27, SOCS1 y SOCS3.

El ARN total se extrajo a partir de hígado utilizando el Mini-Kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió inversamente mediante la transcriptasa inversa del virus de leucemia de murino de Moloney (Promega Biosciences, Inc., Wallisellen, Suiza) en la presencia de hexámeros aleatorios (Promega), y trifosfato de desoxinucleósido. La mezcla de reacción se incubó durante 5 minutos a 70°C, y entonces durante 1 hora a 37°C. La reacción se interrumpió mediante calentamiento a 95°C durante 5 minutos. La SYBR-PCR se llevó a cabo basándose en la fluorescencia verde SYBR (mezcla maestra de PCR verde de SYBR; Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores para GAPDH (deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato), STAT1, proteína inducible 10 (IP10), SOCS1, SOCS3, USP18, IFI27, y PP2Ac se diseñaron a través de las uniones de exón-intrón. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 4. La diferencia en el valor del umbral del ciclo (ACT) se derivó sustrayendo el valor CT para GAPDH, que sirvió como un control interno, a partir del valor CT para STAT1 u otras transcripciones de interés. Todas las reacciones se ejecutaron por duplicado utilizando un sistema de detección de secuencias ABI 7000 (Applied Biosystems). Se calcularon los niveles de expresión de ARNm de las transcripciones en relación con GAPDH a partir de los valores ACT utilizando la fórmula: 2-ACT. El cambio de la expresión en las muestras de biopsia de hígado emparejadas se calculó como las veces de cambio de acuerdo con la fórmula: 2A(ACT B-1 - ACT B-2).

Se llevaron a cago diag ram as de gráficas de recuadros , pruebas-t no em parejadas, y pruebas de M ann-Whitney utilizando G raphPad Prism versión 4.00 pa ra Macintosh , Graph Pad Softwa re , San Diego , Californ ia , EUA, www graph pad com . 1 .2 Resultados Pacientes v Respuesta al Tratamiento 16 pacientes incluidos en este estudio, 6 mujeres y 10 hombres, se trataron con una combinación ajustada al peso de peglFNa2b inyectado subcutáneamente una vez por semana , y ribavirina oral dos veces al día . Todos ellos tuvieron dos biopsias de hígado, la biopsia previa al tratamiento (B-1 ) y la segunda biopsia (B-2) obtenida 4 horas después de la primera inyección del peglFNa2b. Hemos elegido analizar la expresión genética 4 horas después de la inyección del peglFNa2b debido a que la cinética de la inducción de los genes estimulados por los interferones (I SGs) mediante el pegIFNa en el h ígado de los chimpancés fue la máxima en este tiempo, y fue seguida por una rápida sub-regulación de muchos genes (22) . Nos damos cuenta de que probablemente perdimos la sobre-regulación de algunos genes estimulados por los interferones (ISGs) tard íamente inducidos, pero, debido a la rápida sub-regulación , hemos perdido más genes estimulados por los interferones (I SGs) cuando utilizamos puntos del tiempo posteriores.

Siete de los pacientes se infectaron con el genotipo (GT) 1 del virus de hepatitis C (HCV), dos con el GT 4, cuatro con el GT 3, y tres con el GT 2. Ocho pacientes que tenían ARN del virus de hepatitis C (HCV) en suero negativo después de 4 semanas de tratamiento, y 2 pacientes con una caída >3 log de la titulación viral dentro de las primeras 4 semanas, se clasificaron como respondentes rápidos (RRs), mientras que 6 pacientes mostraron una reducción de la carga viral de menos de 1.5 log y se clasificaron como no respondentes rápidos (no RRs) (Tabla 1).

Las concentraciones del IFNa en suero estuvieron debajo del límite de detección en todos los pacientes antes del tratamiento y, de acuerdo con los datos farmacocinéticos previamente publicados (24), entre 34 y 360 picogramos/mililitro en las muestras obtenidas a las 4 horas después de la inyección del peglFNa2b (no se muestran los datos). No hubo una correlación significativa entre la respuesta virológica en la semana 4 y la concentración del IFNa en suero a las 4 horas después de la inyección. Adicionalmente, a pesar de las diferencias en los niveles de IFNa en suero, todos los pacientes mostraron una inducción de genes estimulados por los interferones (ISGs) en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (véase más adelante).

Regulación inducida por IFN de los genes objetivo La expresión genética se analizó con los arreglos Affymetrix U133plus2.0 en las muestras B-1 y B-2, y también en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas a partir de la sangre obtenida antes (PBMC-1), y 4 horas después de la primera inyección del peglFNa2b (PBMC-2). Para cada paciente, se identificaron los genes que se sobre- o sub-regularon >2 veces en las muestras posteriores al tratamiento (comparándose con aquéllas antes del tratamiento), y se guardaron en las listas de genes. Entonces generamos 7 y 3 grupos de 4 pacientes aleatoriamente seleccionados a partir de los 10 pacientes con respuesta rápida (RR) y los 6 pacientes sin respuesta rápida (sin RR), respectivamente. En cada grupo, se identificaron y se contaron los genes que cambiaron significativamente (p < 0.05 ó p < 0.01) en cuando menos 3 de 4 pacientes. En las biopsias de hígado de los 7 grupos de respuesta rápida (RR), el número promedio (± SEM) de los genes regulados fue de 76.71 (± 17.46) y de 196.7 (± 31.55) en los niveles de significado p < 0.01 y p < 0.05, respectivamente. En los 3 grupos sin respuesta rápida (RR), estos números fueron de 11.67 (± 3.76) y 28.33 (± 6.12) para p < 0.01 y p < 0.05, respectivamente. La diferencia entre los grupos con respuesta rápida (RR) y los grupos sin respuesta rápida (sin RR) fue estadísticamente significativa (Figura 1A). Hubo un traslape en los gentes significativamente regulados encontrados en las muestras con respuesta rápida (RR) y en las muestras sin respuesta rápida (sin RR). Por ejemplo, 30 de los 36 genes que cambiaron >2 veces entre B1 y B2 en más del 50 por ciento de las muestras de biopsia sin respuesta rápida (sin RR) también estuvieron presentes entre los 177 genes que cambiaron en más del 50 por ciento de los 6 pacientes con respuesta rápida (RR) aleatoriamente seleccionados (Figura 1B).

No es sorprendente que muchos de los genes regulados representan genes estimulados por los interferones (ISGs) conocidos. Sin embargo, contrariamente a nuestras expectativas, los niveles de expresión de estos genes estimulados por los interferones (ISGs) no fueron más altos en las biopsias posteriores al tratamiento con el peglFNa2b a partir de los pacientes con respuesta rápida (RR)> comparándose con aquéllos sin respuesta rápida (sin RR). En su lugar, las muestras de los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) tuvieron un nivel más alto de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) ya en B-1, y por consiguiente, las veces de cambio en las muestras B-2 fueron solamente menores. Esto se ilustra en la Figura 2A, en el ejemplo de los cinco genes estimulados por los interferones (ISGs). Los genes muestran una expresión muy baja en las biopsias a partir de los individuos sin hepatitis C y en las B-1s de los pacientes con respuesta rápida (RR). Los 6 pacientes sin respuesta rápida (sin RR) tuvieron una alta expresión de estos genes antes del tratamiento, y la administración del peglFNa2a no aumentó, o sólo aumentó mínimamente su expresión. Hubo muy pocas excepciones a esta regla (se muestra un ejemplo en la Figura 2B). Estos genes tuvieron una baja expresión en las biopsias previas al tratamiento, y el peglFNa2b los indujo en todos los pacientes. No obstante, el patrón predominante de expresión genética se pareció al mostrado en la Figura 2A. Se muestra una lista y un mapa de calor de la expresión de 252 genes que cambiaron significativamente (p < 0.05) >2 veces entre B-1 y B-2 en el grupo con respuesta rápida (RR) para todas las muestras de biopsia, en la información complementaria (SI9 de la Tabla 2 y en la información complementaria (SI) de la Figura 6.

Hubo un traslape considerable de los genes regulados por el peglFNa2b en el hígado y en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (Figura 1C). Es interesante que, en todos los pacientes, el peglFNa2b reguló más genes en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) que en el hígado. Sin embargo, la diferencia en la sobre-regulación de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) entre los respondentes rápidos (RRs) y los no respondentes (no RRs) no fue significativa (Figura 1A). No se encontró activación previa de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), y el tratamiento con el peglFNa2b tuvo el mismo efecto sobre la regulación de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en los pacientes con respuesta rápida (RR) y sin respuesta rápida (sin RR) (SI, Figura 5). Esto indica que la infección crónica por el virus de hepatitis C tiene fuertes efectos locales sobre el sistema de IFN en el hígado, pero poco efecto sobre las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

Un subconiunto de genes que predice la respuesta al tratamiento El análisis supervisado del clasificador de datos de arreglos permite hacer la identificación de un subconjunto de genes que predice menor el resultado, en nuestro caso, la respuesta rápida contra ninguna respuesta, en la semana 4. Todos los conjuntos de datos de biopsia de hígado y de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se sometieron a la predicción supervisada del clasificador utilizando la respuesta a las 4 semanas de tratamiento como el criterio de agrupación. Para las muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), el análisis no identificó un subconjunto de genes que pudiera predecir el resultado del tratamiento. En contraste, se identificó un subconjunto de 16 genes en las muestras de hígado B-2 que predijo la respuesta al tratamiento con un índice de error del 19.5 por ciento. Fue posible una predicción todavía mejor con un subconjunto de 29 genes en las biopsias previas al tratamiento B-1, en donde el Índice de error fue del 4.3 por ciento. En este conjunto, hubo 22 genes sobre-regulados por el peglFNa2b (Tabla 2). Por consiguiente, el 76 por ciento de los mejores genes predictores representan los genes estimulados por los interferones (ISGs).

Contrariamente a la predominación de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en el mejor conjunto predictor a partir de las biopsias previas al tratamiento, solamente 3 (19 por ciento) de los 16 mejores genes predictores derivados a partir de un análisis de las biopsias B-2 fueron genes estimulados por los interferones (ISGs) (Tabla 3). Estos resultados apoyan los hallazgos mostrados en la Figura 2, de que los niveles de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en B-2 no difieren entre las muestras con respuesta rápida (RR) y sin respuesta rápida (sin RR), y por consiguiente, no son adecuados para la discriminación de los respondentes a partir de los no respondentes. Entre los que no son genes estimulados por los interferones (ISGs) presentes en las listas de biopsias de hígado B-1 y B-2 discutidas anteriormente, están los genes que tienen funciones en la transducción de señales, en la regulación del ciclo celular, en la apoptosis, y en el metabolismo de los aminoácidos.

Análisis de RT-aPCR de la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en biopsias de hígado El análisis de arreglos de las biopsias de hígado emparejadas enfatizó la importancia de la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las biopsias B-1 para el resultado de la terapia. Para confirmar estos datos, medimos, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) seleccionados (USP18, Statl, IP10, IFI27) en 16 pacientes con biopsias B1 y B2, y en las biopsias previas al tratamiento de 96 pacientes adicionales con CHC. En los 16 pacientes con las biopsias emparejadas, los valores de RT-qPCR concordaron bien con la expresión del arreglo, validando la calidad de los datos del arreglo (Figura 3A, y no se muestran los datos). La expresión de los cuatro genes estimulados por los interferones (ISGs) en las biopsias previas a la terapia, fue significativamente diferente entre los grupos de respuesta virológica oportuna (EVR) y sin respuesta primaria (PNR) (Figura 3C), apoyando adicionalmente la conclusión de que hay una correlación inversa entre la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) antes del tratamiento en el hígado, y la respuesta a la tera pia con el IFNa . U na sobre-reg u lación significativa de los genes estim ulados por los interferones (ISGs) se correlacionó tam bién con la falta de respuesta en la semana 12 y con el resultado final del tratamiento .

Los niveles de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) antes del tratamiento se correlacionan con el genotipo del virus de hepatitis C (HCV) También analizamos la expresión de los genes estimulados por los interferones (I SGs) con respecto al genotipo (GT) del virus de hepatitis C (HCV). Es interesante que los genes estimulados por los interferones (ISGs) investigados mostraron una expresión significativamente más alta en los pacientes infectados con los genotipos (GTs) "difíciles de tratar" 1 y 4 que con los genotipos (GTs) 2 y 3, los cuales se pueden tratar con éxito en más del 80 por ciento de los pacientes. Es importante que los niveles de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) fueron más altos en los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) que en los pacientes con respuesta rápida (RR), independientemente del genotipo del virus de hepatitis C (HCV GT). Por consiguiente, el aumento en el nivel de expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en los pacientes sin respuesta rápida (sin RR) no se puede explicar simplemente por el hecho de que el GT 1 esté sobre-representado en el grupo sin respuesta rápida (sin RR) . En su lugar, el hecho de que los pacientes con los genotipos (GT) 1 y 4 del virus de hepatitis C (HCV) tengan más frecuentemente un aumento en la expresión de los genes estim ulados por los interferones (I SGs) en su h ígado, proporciona una explicación plausible para la mala respuesta de estos pacientes a la terapia con I FN .

Los no respondentes tienen una expresión más alta de PP2Ac Previamente hemos mostrado que la subunidad catal ítica de PP2A (PP2Ac) se sobre-expresa en el h ígado de los pacientes con CHC comparándose con los controles, y que la sobre-expresión de PP2Ac inhibe la señalización del I FNa (14, 25) . Por consiguiente, analizamos los niveles de ARNm de PP2Ac en un grupo de pacientes con respuestas al tratamiento conocidas en la semana 12. Los pacientes del grupo de respuesta virológica oportuna (EVR) expresaron significativamente menos ARNm de PP2Ac que los pacientes sin respuesta primaria (PN R) (Figura 3B).

Señalización de Ja -STA T inducida por IFN El STAT1 fosforilado se translocaliza en el núcleo y se enlaza como un d ímero a los elementos de respuesta específica de los promotores de los genes estimulados por los interferones (ISGs) (26). La evaluación de la translocalización nuclear mediante inmunohistoqu ímica , utilizando anticuerpos anti-fosfo-STAT , debe permitir potencialmente discriminar entre la activación de STAT1 en los hepatocitos y otras células presentes en el material de la biopsia. El análisis de las biopsias emparejadas de los pacientes con respuesta virológica rápida (RVR), reveló un teñido nuclear m ínimo en las muestras B-1 , y un fuerte teñido en la mayoría de los núcleos de los hepatocitos en las muestras B-2, en seguida de la inyección del pegIFNa (Figura 4B). En contraste, todos salvo uno (número 11) de los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR) mostraron un patrón de teñido notoriamente diferente. En las biopsias previas al tratamiento, una gran proporción de los hepatocitos ya tenían un apreciable teñido nuclear, el cual no aumentó en las muestras B-2. El aumento visible en el teñido nuclear en las muestras B-2 de los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR) se originó a partir de la translocalización nuclear del STAT1 en las células de Kupffer (macrófagos hepáticos), y en los que no son hepatocitos (Figura 4B). La activación de STAT 1 en las células de Kupffer, y posiblemente en las células sanguíneas contaminantes, puede haber contribuido al aumento en la fosforilación de STAT1 que se observa en el Western blot (Figura 4A).

El siguiente paso en la senda de señalización es el enlace del fosfo-STAT1 nuclear a los elementos promotores de los genes estimulados por los interferones (ISGs). Por consiguiente, evaluamos el enlace del ADN de STAT1 en los extractos de las biopsias B-1 y B-2 llevando a cabo ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSAs). Todos los respondentes rápidos mostraron un notorio aumento en el enlace del ADN de STAT1 en las muestras B-2. En contraste, la mayoría de los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR) mostraron un aumento mínimo o ningún aumento de la señal de cambio de gel después de la aplicación del pegIFNa.

Estos datos indican que los resultados de los ensayos de inmunohistoquímica y de los ensayos de cambio de movilidad electroforética (E M SAs), se correlacionan mejor con el resu ltado de la terapia q ue los resultados del análisis Western para fosfo-STAT1 . Tom ados juntos, los datos dem uestran diferencias sustanciales en la señalización de Jak-STAT inducida por I FN entre los pacientes con respuesta virológica rápida (RVR) y los pacientes sin respuesta virológ ica rápida (sin RVR). 1 .3. Discusión Para aprender más acerca de los posibles mecanismos subyacentes a la respuesta diferencial de los pacientes infectados por el virus de hepatitis C (HCV) a la terapia de I FN , investigamos la señalización inducida por I FN y la inducción de los genes estimulados por los interferones (I SGs) en biopsias de hígado emparejadas a partir de los pacientes con CHC antes y durante la terapia con el pegI FNa. La comparación de la señalización del I FN en dos muestras de hígado obtenidas a partir del mismo paciente, y la comparación con la inducción de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las muestras acopladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) originadas a partir del mismo paciente, nos permitieron obtener una evidencia inequ ívoca de que los pacientes que responden pobremente a la terapia muestran una activación previa de su sistema de I FN , y que la activación previa está confinada al hígado y no es evidente en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Es importante que, en los pacientes con una baja expresión inicial de los genes estimulados por los interferones (ISGs) , que representan los respondentes futuros a la terapia, la activación del sistema de IFN en respuesta al pegIFNa no excedió a aquélla que se ve en los no respodentes, ya sea antes o después de la terapia. Esto podría sugerir que los pacientes con la activación previa inicial del sistema de IFN, los futuros no respondentes, tienen algunos defectos en los pasos corriente debajo de la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs), haciéndolos refractarios tanto al IFN endógeno como a la terapia de IFN.

El tratamiento con el IFNa indujo la fosforilación de STAT1 en todos salvo un paciente. Hubo una tendencia a una activación más fuerte de STAT1 en las muestras con respuesta virológica rápida (RVR), comparándose con las muestras sin respuesta virológica rápida (sin RVR). Sin embargo, el análisis inmunohistoquímico reveló una diferencia más pronunciada. En las muestras sin respuesta virológica rápida (sin RVR), el pegIFNa indujo fuertemente la translocalización nuclear del STAT1 en las células de Kupffer, contrariamente a las muestras con respuesta virológica rápida (RVR), en donde la acumulación nuclear del STAT1 se indujo predominantemente en los hepatocitos. Es interesante que los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR) (con una excepción) tenían el fosfo-STAT1 nuclear ya presente en las biopsias previas al tratamiento. Esto es consistente con la observación de que las transcripciones de los genes estimulados por los interferones (ISGs) se sobre-regulan en las biopsias previas al tratamiento de los no respondentes posteriores. La manera en que esta activación previa de la senda de Jak-STAT está relacionada con lo refractario del sistema de IFN en los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR), requiere de investigaciones adicionales.

Durante los últimos años, se han obtenido perspectivas importantes de la interferencia del virus de hepatitis C (HCV) con el sistema inmunitario innato. Más aún, una serie de elegantes documentos demostró la capacidad del virus de hepatitis C (HCV) para inhibir las sendas de señalización tanto de TLR3-TRIF-IRF3 como de RIG-I/MDA5-Cardif de la inducción del IFNIi (27-33). Esta capacidad del virus de hepatitis C (HCV) podría ayudar a explicar la razón por la cual el virus con frecuencia establece una infección crónica. Sin embargo, nuestros datos y los resultados previamente publicados (20) demuestran que el sistema de IFN endógeno parece responder pobremente a la terapia con IFN. Este hallazgo es contra-intuitivo (se esperaría que un sistema inmunitario innato activo ayudaría a eliminar el virus durante la terapia con el IFNa), pero es en gran parte apoyado por otros datos publicados de chimpancés y de pacientes humanos (16, 17, 20). A partir de los análisis de la expresión de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las biopsias de hígado, es evidente que, en algunos pacientes, el virus de hepatitis C (HCV) induce (o cuando menos no bloquea) al sistema de IFN endógeno, mientras que en otros, lo reprime con éxito, posiblemente mediante la disociación de TRIF y/o Cardif. Paradójicamente, esta diferencia no tiene un impacto aparente sobre la capacidad del virus de hepatitis C (HCV) para mantener una infección crónica.

En los pacientes sin el sistema de IFN previamente activado, el peglFNa2b indujo una robusta sobre-regulación de muchos genes estimulados por los interferones (ISGs) en el hígado dentro de 4 horas. Y estaba presente una alta expresión similar de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en las biopsias previas al tratamiento de los pacientes que posteriormente no mostraron una respuesta virológica rápida (RVR) en la semana 4. Es un poco complicada la razón por la cual los últimos pacientes no resuelven la infección crónica por el virus de hepatitis C (HCV) espontáneamente a pesar de la fuerte activación del sistema de IFN. Una posibilidad es que las proteínas de los genes estimulados por los interferones (ISGs) que son sobre-reguladas en ambos casos, poseen diferentes modificaciones posteriores a la transcripción. En un escenario alternativo, la falta de respuesta al IFNa tanto endógeno como exógeno puede ser causada por la falta de inducción de unos cuantos genes estimulados por los interferones (ISGs) críticos que son específicamente requeridos para la eliminación del virus de hepatitis C (HCV). No podemos excluir esta posibilidad, pero un análisis de arreglos llevado a cabo sobre muestras de hígado emparejadas no reveló genes estimulados por los interferones (ISGs) que fueran específicamente sobre-regulados en los respondentes rápidos. Adicionalmente, este modelo no puede explicar la razón por la cual la activación previa del sistema de IFN endógeno está tan estrechamente vinculado a la falta de respuesta posterior al tratamiento.

De una manera alternativa, la cinética de la inducción de la respuesta del interferón podría ser decisiva. En los pacientes sin un sistema de IFN previamente activado, la inyección del IFNa exógeno durante el tratamiento debería inducir un estado antiviral muy rápidamente en la mayoría de las células hepáticas, y el virus de hepatitis C (HCV) no tendría "suficiente" tiempo para escapar de la defensa inducida por el IFN. Por otra parte, la acumulación del estado antiviral podría ser lenta en el otro grupo de pacientes, lo cual daría al virus de hepatitis C (HCV) suficiente tiempo para adaptarse y evadir al sistema de defensa antiviral intracelular, haciéndolo también resistente a la subsiguiente terapia con IFN.

¿Cómo podría la inducción del sistema de IFN endógeno comprometer el éxito de la terapia con el IFNa? Claramente, la activación de los ciclos de retroalimentación negativo que inhiben la señalización del IFN podría tener una función. Los candidatos prominentes entre los reguladores negativos son: los supresores de la señalización de citoquina 1 (SOCS1) y SOCS3 (34), dos proteínas inducidas por el IFN que se enlazan al receptor de IFN e inhiben la actividad de Jak1 y Tyk2; y el regulador más recientemente descrito, Ubp43, una proteína estimulada por el IFN que se enlaza al receptor 2 del IFNa (IFNAR2), y que bloquea el acceso de Jak1 a ella (35). Sin embargo, no pudimos encontrar una diferencia significativa en los niveles de expresión de estos reguladores negativos en las biopsias de hígado estimuladas por el peglFNa2b de los pacientes con respuesta virológica rápida (RVR) comparados con los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR) (no se muestran los datos). Más aún, una sobre-regulación general de los reguladores negativos, tales como SOCSs y Ubp43, no es compatible con la fuerte expresión constitutiva observada de un gran número de genes estimulados por los interferones (ISGs) en el subconjunto de pacientes que responden pobremente a la terapia de IFN. Si realmente la señalización del IFNa fuera inhibida por la inducción de SOCSs y Ubp43 en la mayoría de las células hepáticas, entonces no se debería observar una activación previa tan pronunciada de los genes estimulados por los interferones (ISGs) en los hígados antes del tratamiento.

Notoriamente, la activación previa de los genes estimulados por los interferones (ISGs) probados ocurrió más frecuentemente en las biopsias de hígado de los pacientes infectados con los genotipos 1 y 4 del virus de hepatitis C (HCV) que con los genotipos 2 ó 3. Es bien sabido que las infecciones por los genotipos 2 y 3 se pueden curar en más del 80 por ciento de los pacientes, comparándose con menos del 50 por ciento de las infecciones con el genotipo 1 (4). Nuestro descubrimiento de que la frecuencia y el grado de activación previa del sistema de IFN endógeno depende del genotipo del virus de hepatitis C (HCV) podría proporcionar una explicación para esta susceptibilidad diferencial.

Tal vez los genotipos 2 y 3 del virus de hepatitis C (HCV) tienen más éxito para prevenir la activación de la inmunidad innata en el hígado mediante una disociación más efectiva de Cardif y/o TRIF. Sin embargo, el éxito del virus para prevenir la inducción del sistema de IFN endógeno llegaría a costa de ser más susceptible a las terapias con el IFNa. Se debe observar que se ha demostrado que un solo chimpancé infectado con el genotipo 3 del virus de hepatitis C (HCV) tiene niveles de expresión más bajos de los genes estimulados por los interferones (ISGs) que los animales infectados con el genotipo 1 (17).

Anteriormente hemos demostrado que el virus de hepatitis C (HCV) inhibe la señalización inducida por el IFNa por medio de la senda de Jak-STAT mediante la sobre-regulación de una fosfatasa de proteína PP2A (12, 14, 25, 36). PP2A es un complejo heterotrimérico de las subunidades de andamiaje A, reguladora B, y catalítica C. La expresión de la subunidad PP2Ac es significativamente más alta en los hígados de los pacientes infectados con el genotipo 1 que con el genotipo 3 (25). Como se muestra en este trabajo, la expresión del ARNm de PP2Ac es más alta en las biopsias de los no respondentes que de los respondentes. Estos datos apoyan un modelo en donde la interferencia del virus de hepatitis C (HCV) con la señalización del IFN perjudica la respuesta a la terapia. Más aún, la inhibición de la señalización del IFNa por parte del virus de hepatitis C (HCV) también podría explicar la razón por la cual la fuerte activación previa del sistema de IFN endógeno no conduce a una eliminación espontánea del virus de hepatitis C (HCV). Si se asume que no todos los hepatocitos son infectados por el virus de hepatitis C (HCV), sino más bien una minoría, entonces la inducción de los genes estimulados por los interferones (ISGs) observada en las biopsias antes del tratamiento de los pacientes sin respuesta virológica rápida (sin RVR) podría ocurrir predominantemente en los hepatocitos no infectados. En las células infectadas, el IFN sería inefectivo, debido a la inhibición de la senda de señalización de Jak-STAT. El IFN responsable de la activación previa del sistema sería secretado por los hepatocitos que estén infectados con un virus que no tenga éxito para disociar Cardif y/o TRIF. Debido a la inhibición de la senda de Jak-STAT inducida por el virus de hepatitis C (HCV), el ÍFNB secretado no induciría un estado antiviral en los hepatocitos infectados, sino más bien en las células vecinas no infectadas. Para obtener perspectivas adicionales sobre la patobiología del CHC, los estudios futuros deben enfocarse en el análisis al nivel de una sola célula. Desafortunadamente, la detección de los hepatocitos infectados por el virus de hepatitis C (HCV) en las biopsias de hígado todavía es insatisfactoria, haciendo difíciles estos estudios.

Aunque todavía se tiene que elucidar el mecanismo preciso del escape del virus de hepatitis C (HCV) a partir del sistema de defensa inmunitario, ahora está bien establecido el deterioro de la terapia de hepatitis C mediante la activación previa del sistema de IFN endógeno. Sería interesante investigar si esta activación previa es un proceso reversible. La inyección de los anticuerpos neutralizantes anti-IFNa/ß u otros factores que bloquean la respuesta del IFN antes del tratamiento, podría devolver al sistema de IFN endógeno hasta un estado "puro", y podría mejorar potencialmente la respuesta a las terapias basadas en el IFNa.

Tabla 1 Carg; i Viral, log lU/mL No. de Respuesta Respuesta HCV Línea 4 12 SeguiPeso Paen 4 Sexo Edad en 12 etavir GT Base semanas semanas miento (kg) ciente semanas semanas 1 RVR m 52 3a 7.14 neg. neg. EVR SVR A2/F2 75 2 RVR m 37 3a 4.90 neg. neg. EVR EoTR A1/F2 73 3 RVR m 38 1a 6.91 neg. neg. EVR EoTR A2/F1 85 4 RVR m 33 2b 6.27 neg. neg. EVR EoTR A1/F2 57 5 RVR m 48 2b 6.67 neg. neg. EVR EoTR A3/F4 110 6 RVR f 53 2a/c 4.95 neg. neg. EVR EoTR A3/F3 74 7 RVR m 56 3 5.25 neg. continuo continuo continuo A3/F4 61 8 RVR m 38 4 4.08 neg. continuo continuo continuo A2/F2 69 9 RR f 50 1b 7.22 3.52 continuo continuo continuo A1/F2 47 10 RR f 48 1 6.49 3.31 continuo continuo continuo A3/F4 60 11 Sin RVR f 54 3a 4.52 4.08 1.3 EVR Sin A3/F4 69 Carg< i Viral, log lU/mL No. de Respuesta Respuesta HCV Línea 4 12 SeguiPeso Paen 4 Sexo Edad en 12 Metavir GT Base semanas semanas miento (kg) ciente semanas semanas EoTR Sin 12 Sin RVR m 64 1b 6.24 4.83 3.46 EVR A3/F4 74 EoTR 13 Sin RVR m 49 4 6.91 5.87 5.22 PNR - A3/F4 102 14 Sin RVR m 56 1b 6.89 6.76 6.01 PNR - A2/F3 60 15 Sin RVR f 50 1a 7.11 6.58 6.35 PNR - A1/F2 77 16 Sin RVR f 47 1a 6.16 5.99 5.52 PNR - A2/F2 81 Tabla 2 Análisis de la expresión genética en las biopsias previas al tratamiento (B-1 ) . La lista de 29 genes predicen mejor el resultado del tratamiento en la semana 4 (los genes estimulados por I FN están sombreados en gris; los genes que difieren entre respuesta rápida (RR) y sin respuesta rápida (sin RR) pero que no son regulados por I FN no están sombreados).

Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 I RR 10 RRs sin RRs Tipo proteína 44 3392 Ciclo IFI44L 204439_at 306 (50) 11.10 inducida por (903) celular Interferón Radical 2 que contiene Resp. el dominio 2405 RSAD2 242625_at 272 (41) 8.83 Inm. de S- (425) Innata adenosil- metionina Interferón, proteína Resp. 2238 17375 G1 P2 inducida por 205483_s_a_t 7.76 Inm. (397) (2762) alfa (clon Innata IFI-15K) Interferón, Resp. Proteína 27 3320 24927 IFI27 201411_at 7.51 Inm. inducida por (714) (2441) Innata alfa Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 I RR 10 RRs sin RRs Proteína de membrana 3 Prolife¬ 665 LAMP3 asociada 205569_at 96 (22) 6.97 ración (108) con celular lisosoma Sintetasa 3 de 2'-5 - Resp. 1842 OAS3 oligo- 218400_at 319 (46) 5.77 Inm. (296) adenilato, Innata 100kDa Dominio Resp.

HERC6 2 9352_at 144 (32) 795 (93) 5.53 hect y RLD 6 Inm.

Empa¬ Histona 1 , HIST1 H2BD 235456_at 40 (4) 202 (33) 5.02 que de H2bd ADN Proteína Resp. inducida por 2209 9995 IFIT1 203153_at 4.53 Inm.

Interferón (165) (1706) Innata con Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en SEM) en 6 / RR 10 RRs sin RRs repeticiones de tetratrico- péptido 1 Metabo¬ Proteína 970 4135 lismo de OC 129607 hipotética 226702_at 4.26 (143) (520) aminoLOC 29607 ácidos Proteína 44 Resp. 1101 4183 IFI44 inducida por 214453_s_a_t 3.80 Inm. (153) (405) Interferón Innata Ubiquiti- Dominio 3144 nación HERC5 219863_at 693 (93) 3.26 hect y RLD 5 (552) de proteína Lectina, enlace de 1537 4960 Resp. a LGALS3BP galactosida, 200923_at 3.23 (238) (475) estrés soluble, proteína de Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 I RR 10 RRs sin RRs enlace 3 9 que contiene el 997 Desco¬ SAMD9 dominio del 228531_at 323 (32) 3.08 (166) nocida motivo alfa estéril Proteína inducida por Interferón Resp. 2744 IFIT2 con 226757_at 951 (63) 2.89 Inm. (510) repeticiones Innata de tetratrico- péptido 2 Proteína LOC286208 hipotética 1560089_at 39 (3) 1 10 (18) 2.86 LOC286208 Factor Resp. 679 IRF7 regulador de 208436_s_a_t 240 (16) 2.82 Inm. (107) Interferón 7 Innata Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 I RR 10 RRs sin RRs Proteína 1191 3341 FLJ20035 hipotética 218986_s_a_t 2.80 Helicasa (84) (378) FLJ20035 Proteína inducida por Interferón Resp. 2760 7703 IFIT3 con 229450_at 2.79 Inm. (213) (1327) repeticiones Innata de tetratrico- péptido 3 Ral GEF con dominio PH Trans- RALGPS1 y motivo 1 204199_at 22 (2) 61 (8) 2.70 ducción de enlace de de señal SH3 Familia de Familia polimerasa 1158 de poli¬ PARP12 218543_s_a_t 437 (36) 2.65 de poli- (60) merasa (ADP- de poli- Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 / RR 10 RRs sin RRs ribosa), (ADP- miembro 12 ribosa) Empa¬ Historia 1 , HIST1H2BG 2 0387_at 13 (1) 29 (3) 2.13 que de H2bg ADN Familia de Familia polimerasa de polide poli- 1386 2868 merasa PARP9 223220_s_a_t 2.07 (ADP- (111) (263) de poli- ribosa), (ADP- miembro 9 ribosa) nucleotidil- Catabotransferasa 971 PNPT1 225291_at 518 (23) 1.88 lismo de de poli-ribo- (105) ARN nucleótido 1 75 que contiene el 1382 CCDC75 213294_at 776 (40) 1.78 - dominio de (105) bobina Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 / RR 10 RRs sin RRs enrollada 3'-fosfodi- Metaboesterasa de 1954 lismo de CNP 2',3'- 208912_s_a_t 682 (24) 1.55 (70) núcleo- nucleótido tidos cíclico Proteína 2 de interac¬ 3317 4451 Apopto- HTATIP2 ción con Tat 209448_at 1.34 (130) (74) sis de VIH-1 , 30kDa Proteína ribosomal, Biosínte- grande, P0, 16980 13294 RPLPO 211720_x_a_t 0.78 sis de proteína (404) (439) proteína ribosomal, grande, P0 Hipotética LOC402560 227554_at 562 (95) 90 (20) 0.16 - LOC401384 Tabla 3 Análisis de la expresión genética en biopsias obtenidas 4 horas después del peg I FNa (B-2) . Lista de 16 genes que predicen mejor el resultado del tratamiento en la semana 4 (los genes estimulados por I FN están sombreados en g ris; los genes que difieren entre respuesta rápida (RR) y sin respuesta rápida (sin RR) pero que no regulados por I FN no están sombreados).

Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 /RR 10 RRs sin RRs Interferón, Resp. proteína 27 4540 25501 IFI27 202411_at 5.62 Inm. inducible por (735) (2372) Innata alfa Lectina, enlace de galactosida, 1728 5223 Resp. a LGALS3BP 200923_at 3.02 soluble, (282) (386) estrés proteína de enlace 3 Homólogo de Enlace ZFP3 proteína 3 de 235728_at 33 (4) 75 (7) 2.28 iónico dedo de zinc Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en SEM) en 6 IRR 10 RRs sin RRs (ratón) Miosina, Morfogé¬ MYH1 polipéptido 234290_x_at 33 (2) 64 (5) 1.98 nesis pesado 14 celular Familia Familia de de polipolimerasa de merasa PARP6 poli-(ADP- 219639_x_at 149 (8) 285 (23) 1.92 de poli- ribosa), (ADP- miembro 6 ribosa) Receptor 143 Trans¬ GPR143 emparejado a 206696_at 18 (1) 28 (2) 1.54 ductor de proteína G señales 5 tipo Bruno, proteína de Enlace BRUNOL5 enlace de 232416_at 13 (0.3) 19 (1) 1.43 de ARN ARN (Drosofila) Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en [SEM) en 6 IRR 10 RRs sin RRs Sintasa de ATP, transporte de H+, complejo F1 Metabo¬ 14472 17712 ATP5A1 mitocondrial, 213738_s_at 1.22 lismo (290) (487) subunidad celular alfa, isoforma 1 , músculo cardíaco Proteína 4A Localiza¬ CHMP4A modificadora 228764_s_at 348 (11) 234 (6) 0.67 ción de de cromatina proteína 2-sulfatasa de Metaboiduronato lismo de IDS 206342_x_at 185 (7) 122 (5) 0.66 (síndrome de carbohiHunter) dratos Proteína gb:AI341383/ 227092_at 475 (24) 254 (17) 0.54 DB_XREF=gi: Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 /RR 10 RRs sin RRs 4078310/ DB_XREF= qx91a06.x1/ CLONE=IMA GE: 2009842 /FEA=EST /CNT=52 /TID=Hs. 112751.2 mER=Stack /STK=42 /UG=Hs, 12751 /LL=23383 /UG_GENE= KIAA 0892 /UG_TITLE= KIAA 0892 Adaptador de Resp.

VISA 229741 _at 167(7) 77 (4) 0.46 señalización Inm.

Expresión Expresión Símbolo promedio promedio Sin RR Descripción ID-Affy Función del gen (SEM) en (SEM) en 6 /RR 10 RRs sin RRs inducida por Innata • virus Mejorador de C-endopep- 1297 Desa¬ PCOLCE 202465_at 539 (56) 0.42 tidasa de pro(135) rrollo colágeno Factor 1 Resp. 1106 IRF1 regulador de 238725_at 449 (30) 0.41 Inm. (109) Interferón Innata Tipo antígeno de membrana Desco¬ PSMAL 211303_x_at 793 (76) 278 (68) 0.35 específico de nocida próstata Hipotético LOC402560 227554_at 578 (85) 83 (17) 0.14 - LOC401384 (c) 1.4 Referencias 1. Li, K. y colaboradores, Immune evasión by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. Proc Nati Acad Sci EUA 102, 2992-2997 (2005). 2. Yoneyama, . y colaboradores, The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat Immunol 5, 730-737 (2004). 3. Kang, D. 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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la probabilidad de que un sujeto que tenga una infección viral del hígado responda a la terapia antiviral, el cual incluye la estimulación de la actividad del Interferón (IFN), comprendiendo el método: (a) analizar una muestra del sujeto para la expresión de cuando menos un gen a partir de cada uno de los siguientes grupos de genes: (i) LOC129607, RPLPO, y HERC5, (ii) HTATIP2, e IFI44L, (iii) IFI27, IFIT1, G1P2, IRF7, RSAD2, IFI44, OAS3, e IFIT2, (iv) LAMP3, HERC6, LOC286208, IFIT3, RALGPS1, PARP9, CCDC75, y CNP, (v) HIST1H2BG, HIST1H2BD, FLJ20035, PARP12, ???? , LGALS3BP, SAMD9, y LOC402560, y (b) comparar la expresión de los genes en la muestra con la expresión de los mismos genes en una muestra de control.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la expresión alterada de los genes en la muestra, comparándose con la expresión de los mismos genes en la muestra de control, indica que el sujeto no tiene probabilidades de responder a esa terapia antiviral.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la expresión no alterada de los genes en la muestra, comparándose con la expresión de los mismos genes en la muestra de control, indica que el sujeto tiene probabilidades de responder a esa terapia antiviral.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la terapia antiviral incluye el IFNa pegilado.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la terapia antiviral incluye pegIFNa y ribavirina.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la infección viral es una infección por el virus de hepatitis B o por el virus de hepatitis C.

7. El método de la reivindicación 4, en donde el virus es el virus de hepatitis C.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra comprende tejido hepático.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se analiza la expresión de cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 26, 27, 28 ó 29 genes de la reivindicación 1.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la expresión genética se determina mediante la medición de la cantidad de transcripción genética del ARNm en la muestra, o de la cantidad de ADNc derivado a partir de dicho ARNm.

11. El método de cualquiera de reivindicaciones 1 a 9, en donde expresión genética se determina mediante la medición de la cantidad de péptido o polipéptido codificada por el gen en la muestra.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la cantidad de péptido o polipéptido se determina utilizando una molécula de enlace específico.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto es un ser humano.

14. Un kit para llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el cual comprende: (i) elementos para analizar en una muestra a partir de un sujeto, la expresión de cuando menos un gen a partir de cada uno de los grupos de genes enlistados en la reivindicación 1, y, opcionalmente, (ii) elementos para comparar la expresión de los genes en la muestra con la expresión de los mismos genes en una muestra de control.

15. El kit de la reivindicación 14, el cual comprende una o más moléculas de enlace específico que pueden dirigirse a las moléculas representativas de la expresión genética en la muestra, en donde esta molécula de enlace específico es una sonda de oligonucleótido, un anticuerpo, o un aptámero.