CN101948805A - 筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法。该双信号转基因细胞传感器带有抗氧化反应元件ARE、TK启动子、增强绿色荧光蛋白EGFP以及红色荧光蛋白DsRed。EGFP的表达受ARE的调控。其构建方法是：先构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE重复序列调控的真核报告载体；再将DsRed及其启动子片段插入该载体构建双信号报告载体；然后将报告载体转染HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。本发明以EGFP为报告基因，以DsRed为内参照所构建的双信号转基因细胞传感器，不需要添加任何底物和辅助试剂，安全，对环境无污染，且操作方便、时间短，费用低。

Description

筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法

技术领域

本发明属于肿瘤预防领域，具体涉及一种快速筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法。

背景技术

化学预防剂是指可对癌症进行预防、延缓以及逆转其发生发展过程的一类天然或人工合成的化合物。专用于化学预防剂体外检测的方法较少，已有的方法是将抗氧化反应元件（ARE）、TK启动子及绿色荧光蛋白（GFP）基因（报告基因）重组于HepG2细胞，使GFP的表达量在ARE的调控之下。用溴乙啶（EB）染色校正细胞数对检测结果的影响，直接检测GFP和EB荧光强度，通过相对荧光强度甄别或检测化学预防剂。这种方法避免了用酶做报告基因时测酶活性需要破坏细胞壁，不同的破壁方法对实验结果影响较大，酶活性受时间、温度、pH、菌液浓度的影响较大，耗时长等缺点，但该方法单个ARE调控无法凸显化学预防剂的作用效果，且EB具有致癌性，危害人体健康，污染环境。

发明内容

为了解决现有筛选方法耗时长，不敏感，有污染的不足，本发明提供了一种快速筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，用于肿瘤预防药物筛选，有效地解决了问题。

本发明采用的技术方案是：

一种筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，其特征在于是一种转基因细胞，该转基因细胞带有ARE（抗氧化反应元件）、TK启动子、EGFP（增强绿色荧光蛋白）以及DsRed（红色荧光蛋白），EGFP的表达受ARE的调控。

作为本发明的一个具体的技术方案，所说的转基因细胞是HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed，即在HepG2细胞中重组整合有ARE、TK、EGFP和DsRed，且EGFP的表达受ARE的调控。结构特征如图1所示，传感器中主要由2种荧光蛋白构成：（1）EGFP（增强绿色荧光蛋白）表达由TK启动子驱动，且在ARE（抗氧化反应元件）的调控之下；（2）DsRed（红色荧光蛋白）表达由CMV启动子驱动。

上述所说的筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器的构建方法是：

1）利用基因工程技术构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE重复序列调控的EGFP报告载体；

2）将红色荧光蛋白DsRed及其启动子片段插入步骤1）的报告载体，构建双信号报告载体；

3）将步骤2）的报告载体转染HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。

绿色荧光蛋白（GFP）是来自水母的一种天然荧光蛋白，红色荧光蛋白（DsRed）是从珊瑚虫中分离出的绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白，它们在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能发出荧光，因此，具有活体、原位、实时表达的特点。这样可将ARE与GFP相串联，使GFP的表达处于ARE的调控之下，再插入红色荧光（DsRed）蛋白及其启动子片段，构建成一种双信号转基因细胞传感器，其GFP的发光程度与化学预防剂的作用程度具有量效关系。当化学预防剂作用于双信号转基因细胞时，EGFP基因的表达量与化学预防剂的作用强度具有一定的剂量效应关系，通过测定EGFP和DsRed发光强度获得的相对发光强度可以反映化学预防剂的作用强度或快速筛选某些化学预防剂。该方法用4个ARE重复序列调控，可敏感显示化学预防剂的作用效果；用GFP为报告基因，可克服用酶作为报告基因不经济、可比性差等缺点，也省却了对细胞进行破壁等繁琐步骤；以DsRed为内参照来校正细胞数、细胞状态对结果的影响，可克服EB污染环境和危害人体健康等缺点。直接检测红绿荧光强度，能方便、快速、定性、定量地评价化学预防剂的诱导效果。

附图说明

图1 本发明双信号转基因细胞传感器示意图。

图2 本发明双信号转基因细胞传感器工作原理图。

图3 是p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo在HepG2细胞中的瞬时表达。

图4 是HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed细胞的表达。

图5 是质粒p4ARE-TK-GFP/neo结构示意图。

图6 是阳性受试物PDTC和tBHQ剂量效应关系。

具体实施方式

文中所用到的质粒或细胞：

HepG2：购自中科院上海细胞研究所。

p4ARE-TK-GFP/neo：本室构建保存；结构如图5。(徐海荣，卜平，李湘鸣.真核表达载体p4ARE-TK-GFP/neo的构建及其表达.      细胞与分子免疫学杂志,2009,25(11):1008-1012.)申请人承诺向公众提供20年。

p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo：本室构建保存。承诺向公众提供20年。用PCR方法从质粒pDsRed2-N1（Clontech公司）扩增红色荧光蛋白及其启动子序列，上游引物为5’-CGCCCTTAAGTAGTTATTAATAGTAATCAATT -3’（SEQ ID NO：1），下游引物为5’-GAGCACGTAGTGCTACAGGAACAGGTGGTGGCGG -3’ （SEQ ID NO：2）。在引物的5’端分别设计BspT I和Ade I两酶切位点（黑体字所示），并增加3~4个保护碱基。PCR产物经常规纯化回收后与pMD18-T载体（TaKaRa公司）相连，构建的载体命名为pMD-DsRed。 

用Ade I和BspT I酶分别对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/neo进行双酶切，产物经常规切胶回收后用T4连接酶连接，构建的载体命名为p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo(如图1) 。

实施例1：本发明双信号转基因细胞传感器的构建

（1）红、绿双色荧光蛋白报告载体的构建

1） pMD-DsRed载体的构建：

用PCR方法从质粒pDsRed2-N1（Clontech公司）扩增红色荧光蛋白及其启动子序列，上游引物为5’-CGCCCTTAAGTAGTTATTAATAGTAATCAATT -3’（SEQ ID NO：1），下游引物为5’-GAGCACGTAGTGCTACAGGAACAGGTGGTGGCGG -3’（SEQ ID NO：2）。在引物的5’端分别设计BspT I和Ade I两酶切位点（黑体字所示），并增加3~4个保护碱基。PCR扩增产物经纯化试剂盒纯化回收后与pMD18-T载体（TaKaRa公司）相连，阳性克隆载体经常规酶切鉴定、测序，命名为pMD-DsRed；

2）p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo报告载体的构建：用Ade I和BspT I酶分别对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/neo进行双酶切，产物经常规切胶回收后用T4连接酶连接，阳性克隆载体经常规酶切鉴定、测序，命名为p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo。

（2）双信号转基因细胞传感器的建立

将p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo大量制备纯化后，用脂质体转染试剂盒将载体转染于HepG2细胞，转染24~48 h后，于倒置荧光显微镜下观察细胞荧光，可见细胞发出明显的红色绿色荧光（图3），细胞用G418进行筛选，挑取阳性克隆进行扩大培养，将该双信号转基因细胞命名为HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed。（图4）

其工作原理如图2所示，当化学预防剂作用于双信号转基因细胞时，EGFP基因的表达量与化学预防剂的作用强度具有一定的剂量效应关系，通过测定EGFP和DsRed发光强度获得的相对发光强度可以反映化学预防剂的作用强度或快速筛选某些化学预防剂。

实施例2：

HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed接种入黑色96孔培养板，每孔细胞数为5×10⁴个，培养24 h后加入用二甲基亚砜（DMSO）配制的不同浓度的受试物吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）和叔丁基对苯二酚（tBHQ），受试物终浓度设计为：0(对照)、12.5、25、50、100和200 μM，每一浓度组有3个重复，37℃，5% CO₂培养箱中作用24~48 h，用PBS洗涤后每孔再加入200 ??L PBS，用多功能荧光酶标仪检测细胞的GFP和DsRed荧光强度，其激发波长/发射波长分别为485 nm/530 nm(GFP)和558 nm/ 583 nm(DsRed)，求其相对发光度。                                                

结果如表1，图6。  

Claims (3)

1.一种筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，其特征在于，是一种转基因细胞，该转基因细胞带有抗氧化反应元件ARE、TK启动子、增强绿色荧光蛋白EGFP以及红色荧光蛋白DsRed，EGFP的表达受ARE的调控。

2.如权利要求1所说的筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，其特征在于，所说的转基因细胞是HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed，即在HepG2细胞中重组整合有ARE、TK、EGFP和DsRed，且EGFP的表达受ARE的调控。

3.权利要求1所说的筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器的构建方法，是：

1）利用基因工程技术构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE重复序列调控的EGFP报告载体；

2）将红色荧光蛋白DsRed及其启动子片段插入步骤1）的报告载体，构建双信号报告载体；

3）将步骤2）的报告载体转染HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。

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