CN102099478A - 有效表达核转基因的生产菌株的产生 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在产生适合转基因在其中表达的真核细胞的方法，其包括(a)将编码响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到细胞核中，其中所述选择标记的表达水平与对所述选择试剂的表型响应水平成正比；(b)在步骤(a)得到的细胞中选择所述选择标记的表达可检测的细胞；(c)任选地繁殖步骤(b)所选择的细胞；(d)诱变步骤(b)所选择的细胞或步骤(c)繁殖的细胞、或允许步骤(b)所选择的细胞或步骤(c)繁殖的细胞中出现自发突变；和(e)选择相比于步骤(b)得到的细胞的表达，显示出所述选择标记表达增加的细胞。本发明还涉及由本发明的方法产生的真核细胞、在由本发明方法产生的细胞中生成目标化合物的方法，其包括(a)将编码(i)目标化合物，其是蛋白质或RNA；或(ii)合成所述目标化合物的必要蛋白质；并且任选地响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到所述细胞中；(b)在细胞中表达所述蛋白质；和(c)分离产生的目标化合物；以及试剂盒，其包括(a)可由本发明的方法得到的细胞，以及任选地在所述细胞中蛋白质表达优化的载体；或(b)本发明的细胞。

Description

有效表达核转基因的生产菌株的产生

本发明涉及产生适于转基因在其中表达的真核细胞的方法，其包括(a)将编码响应于选择试剂(selecting agent)的选择标记的核酸导入到细胞核中，其中所述选择标记的表达水平与对所述选择试剂的表型响应(phenotypic responsiveness)水平成正比；(b)在步骤(a)得到的细胞中选择所述选择标记的表达可检测的细胞；(c)任选地繁殖步骤(b)所选择的细胞；(d)诱变步骤(b)所选择的细胞或步骤(c)繁殖的细胞、或允许步骤(b)所选择的细胞或步骤(c)繁殖的细胞中出现自发突变；和(e)选择相比起步骤(b)得到的细胞的表达，显示出所述选择标记表达增加的细胞。本发明还涉及由本发明的方法产生的真核细胞，在用本发明方法产生的细胞中生成目标化合物的方法，其包括(a)将编码(i)目标化合物，其是蛋白质或RNA；或(ii)合成所述目标化合物的必要蛋白质；并且任选地响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到所述细胞中；(b)在细胞中表达所述蛋白质；和(c)分离产生的目标化合物；以及试剂盒，其包括(a)可由本发明的方法得到的细胞，以及任选地在所述细胞中蛋白质表达优化的载体；或(b)本发明的细胞。

在本说明书中引用了许多文件，包括专利申请和制造商手册(manufacturer’s manual)。这些文件的公开内容被认为与本发明的专利性无关，通过引用其全部内容将其并入本文。更具体而言，所有引用的文件以引用的方式被并入本文，该引用的程度如同每个单独的文件被特定地和单独地指明通过引用并入本文。

重组蛋白质或核酸在并非自然含有所述蛋白质和核酸的细胞中的表达在研究中以及大规模生产各种化合物，如药物或酶中已经成为一种有价值的工具。原核生物中的重组表达如今已被优化，并且，如果产生的化合物在转录和/或翻译后并不自然地经受化学改性，该重组表达是有用的。在原核生物中表达、并没有以那种方式被改性的化合物往往不发挥其生物活性。

另一方面，真核细胞中的重组表达有重大缺陷，即表达量通常低，或者甚至根本就不表达。这是由于这些细胞使用的一些机制以抑制基因表达，如基因沉默。考虑到具有所有修饰以实现表达产物的真核细胞的潜在应用，它们已经成为生产“绿色化学制品”、生物燃料和重组蛋白，如生物药物(疫苗、抗体)的目标。这适于有前景的真核有机体，如各种植物，例如，藻类或植物细胞培养、真菌或哺乳动物细胞。

作为含有单个大叶绿体的单细胞藻类，衣藻属(Chlamydomonas)的藻类代表最简单的光合真核生物(photosynthetic eukaryote)之一。它们可以有性繁殖或无性繁殖，并且可以光合自养、异养或混合营养生长。在衣藻物种中，绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)已经成为广泛的生物学问题，包括：例如，鞭毛功能、光生物学和光合作用研究的极好的模式生物(Hippler et al.，1998；Harris，2001；Pedersen et al.，2006；Schmidt et al.，2006)。此外，莱茵衣藻将强大的遗传学和和独特的遗传和基因组资源的可用性结合起来：所有三个基因组都被完全测序(核、质体和线粒体基因组；Merchant et al.，2007)，大的突变体库已经被建立，并且三个基因组都可接受通过转化进行的基因操作(Hippler et al.，1998；Remacle et al.，2006)。

最近，莱茵衣藻基因组测序工程的完成(Merchant et al.，2007)已经为光合真核生物的进化提供了新的视野，并为探索藻类作为植物后基因组学研究中的模式系统铺平了道路。系统功能基因组学需要的大部分工具都能在莱茵衣藻中得到，包括高频率转化方案(Kindle，1990)、化学诱变和插入诱变的有效方法(Dent et al.，2005)以及RNA干扰可使用的方案(RNAi；Rohr et al.，2004)。然而，如在许多其它真核细胞中观察到的，莱茵衣藻研究的主要障碍是由令人失望的来自藻类核基因组转基因的弱表达造成的。

鉴于上述原因，存在对具有增加的转基因表达的真核细胞或真核有机体株系的需要。

因此，本发明涉及产生真核细胞的方法，所述细胞适于转基因在其中表达、优选为增加的表达，所述方法包括(a)将编码响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到细胞核中，其中所述选择标记的表达水平与对所述选择试剂的表型响应水平成正比；(b)在步骤(a)得到的细胞中选择所述选择标记的表达可检测的细胞；(c)任选地繁殖步骤(b)所选择的细胞；(d)诱变步骤(b)所选择的细胞或步骤(c)繁殖的细胞、或允许步骤(b)所选择的细胞或步骤(c)繁殖的细胞中出现自发突变；和(e)选择相对于步骤(b)得到的表达，显示出所述选择标记表达增加的细胞。

包含在细胞核中基因的表达分两步发生：转录在细胞核中进行并产生mRNA产物，mRNA产物被输出到细胞溶质中，其在细胞溶质中被翻译成形成肽或蛋白质的氨基酸序列且可能在翻译后被修饰。在本发明的上下文中，术语“表达”指产生表达产物的过程，表达产物可以是蛋白质或肽，也称为“(多)肽”，表达产物或者可以是不被翻译成(多)肽的核酸，诸如某些RNA种类，例如，rRNA、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、核开关或反义RNA。“转基因的表达”是导入到细胞中的外源基因在所述细胞中表达产物的生成。本发明上下文中所使用的术语“增加的表达”指步骤(d)中真核细胞中产生的转基因的较高表达产物量，其是相对于经过步骤(b)以后在所述细胞中可以观察到的所述转基因的产物水平。例如，如果在步骤(b)后在细胞中可检测到特殊转基因的低表达，“增加的表达”优选地表示获得的表达产物量增加至少10％，优选为至少25％，更优选为至少50％，甚至更优选为至少100％，如至少200％、至少300％、至少400％，而且最优选为至少500％。如果转基因对细胞是异源的基因，即来自不同的株系或种，增加通常意为改进的表达，超过用现有技术方法，即，没有使用本发明方法的细胞或有机体获得的表达量。或者，增加是用常规检测手段可检测的超出背景水平的表达产物量。优选地，增加量为各个细胞中表达的总蛋白的至少0.0001％，如至少0.001％或至少0.01％，更优选为至少0.05％，甚至更优选为至少0.1％，如至少0.2％。增加的量可以通过将用现有方法获得的产量与用本发明方法获得的产量比较来测量。该测量可以通过使用本领域已知的方法和/或本说明书中描述的方法来实现。增加的百分数通常与以上提到的数值相对应。

通常，编码将被表达的蛋白质或核酸的基因以表达载体的形式被导入到细胞中。在不同的有机体或不同物种的细胞中表达蛋白质的条件在本领域是周知的，而且取决于所要表达的蛋白质以及使用的细胞。

典型的真核表达载体含有启动子元件，其调节mRNA的初始转录、蛋白质编码序列以及转录终止需要的信号和转录本的聚腺苷酸化。另外的元件可能包括：增强子、Kozak序列和两侧具有RNA剪接供体位点和受体位点的间插序列。高效率的转录可以用来自SV40的早期启动子和晚期启动子、来自反转录病毒的长末端重复序列(LTRs)，例如，RSV、HTLVI、HIVI、和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子来完成。然而，细胞元件也可以被使用(例如，人类肌动蛋白启动子)。保证转录起始的调控元件可能的例子包括：巨细胞病毒(CMV)启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、lacZ(β-半乳糖苷酶基因)启动子、gal10启动子、人类延伸因子1a启动子、CMV增强子、钙调蛋白激酶(CaM-kinase)启动子、苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)多角体启动子或者SV40增强子。植物启动子的例子是组成型启动子，如无花果瘤花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子、CaMV35S启动子或MAS启动子，或者组织特异启动子，如康乃馨花瓣GST1启动子或拟南芥(Arabidopsis)SAG12启动子(参考，例如，J.C.Palaqui etal.，Plant Physiol.，112：1447-1456(1996)；Morton et al.，Molecular Breeding 1：123-132(1995)；Fobert et al.，Plant Journal，6：567-577(1994)；和Ganetal，Plant Physiol.，113：313(1997))。酵母启动子是，例如，Gal10启动子或者TPI丙糖磷酸异构酶启动子。转录终止信号的例子是CaMV35S或Nos终止子、SV40聚腺苷酸(poly-A)位点或tk聚腺苷酸位点或SV40、lacZ和AcMNPV多角体多腺苷酸化信号、多核苷酸下游。此外，也可以包括这样的元件，如复制起点、耐药基因、调节子(作为诱导型启动子的一部分)或者内部核糖体进入位点(IRES)。

本文使用的术语“(多)肽”描述了一组分子，其包括由多达30个氨基酸组成的一组肽，以及由大于30个氨基酸组成的一组多肽，多肽也称为蛋白质。(多)肽还可以形成二聚体、三聚体和更高的低聚体，即，由一个以上(多)肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的(多)肽分子可以是相同的或不同的。因此，相应的更高级的结构称为同源二聚体或异源二聚体、同源三聚体或异源三聚体等。术语“(多)肽”和“蛋白质”也指自然修饰的(多)肽/蛋白质，其中这种修饰是通过例如，糖基化、乙酰化作用、磷酸化作用以及类似作用实现的。这样的修饰在本领域是众所周知的。

根据本发明的“核酸”包括DNA，如cDNA或基因组DNA以及RNA，正义链和反义链，以及常规修饰的或衍生的核酸分子。就这点而言，作为表达产物的核酸优选为RNA，然而，即将被导入到细胞中的核酸优选为DNA。

“转基因”是被从一个生物体转移到另一个生物体的核酸分子。术语“转基因”优选地描述已经从一个生物体中分离出来的DNA片段，或者根据所述生物体中发现的核酸序列半合成产生的或合成产生的DNA片段，并且其被导入到不同的生物体中。这种非固有的DNA片段，即在新的宿主生物体中的“转基因”可以在转基因生物中保留被表达成RNA或肽或蛋白质的能力。根据上述定义的“转基因”可以是cDNA或自然存在于基因组DNA中的基因，包括非编码区，如内含子。或者，转基因可以是编码RNA物质的DNA序列。在这种情况下，转基因的最小长度至少为25个核苷酸、优选为至少40个核苷酸、更优选为至少60个核苷酸。如本领域已知的，如果转基因产生了siRNA、shRNA或miRNA，转录产物的长度范围优选为17到27、更优选为19到21个核苷酸，形成双链并任选地含有一个或两个突出端。在本发明的上下文中，转基因可以是来源于与转基因生物所属物种不同的物种中的基因，但也可以是从一个物种的一个个体(细胞)中分离并被导入到同一物种的不同个体(细胞)中的基因。后者包括，例如，在一个物种的某些个体中发现的一个基因的突变等位基因。换言之，被导入到根据本发明的细胞中的转基因可以是同源的或异源的核酸序列。

术语“导入核酸”指将核酸应用到细胞中、及其随后的吸收以及整合到所述细胞，尤其是核的遗传信息中。根据细胞的种类，即，与什么类型的真核细胞有关，即，其属于哪类生物体(植物、真菌、动物，例如，脊椎动物，或者更具体而言哺乳动物)，不同的术语被用来表示这种过程(process)。一般而言，由外源遗传物质的导入/吸收和表达导致的细胞的遗传学改变被称为“转化”，但是该术语也仅用于描述非动物真核细胞，如真菌、藻类和植物中非病毒DNA的转移。术语“转导”被用于由病毒导入的DNA导致的遗传学改变。动物细胞，尤其是哺乳动物细胞的“转化”通常被称为“转染”。酵母和真菌可以用众所周知的方法，如乙酸理/单链载体DNA/聚乙二醇方法转化(Gietz and Woods，2002)。酵母转化的另外一个选择是冷冻酵母转化方案(Frozen Yeast Protocol)，其结果产生解冻后仍能转化的冷冻酵母细胞(Schiestl et al.，1993)。基因枪转化是用包被有DNA的金或钨纳米颗粒实现的，包被有DNA的金或钨纳米颗粒被射入到例如，真菌细胞、植物细胞或植物胚胎中，因而将它们转化。用这种方法的转化效率在植物中比细菌介导的转化效率低，但大部分植物可以用这种方法转化。通过原生质体转化，真菌孢子或植物细胞通过除去细胞壁能被转变成原生质体，然后被浸入到含有DNA的溶液中被被转化。没有细胞壁的植物细胞的转化也可以用玻璃珠法实现(Kindle et al，1990)。

农杆菌(Agrobacterium)介导的转化是最容易和最简单的植物转化(An，1987)。例如植物组织(通常是叶)被切成小片，例如，10×10mm(毫米)，并在含有悬浮农杆菌的流体中浸泡10分钟。沿着切口的一些细胞会被细菌转化，细菌将其DNA插入到细胞中。当被放到生根和发芽选择培养基上后，植物会再生长。一些植物物种可以仅仅通过将花浸渍到农杆菌的悬浮液中，然后将种子种在选择性培养基上而被转化。农杆菌也可以通过使用电穿孔而被转化(Weigel and Glazebrook，2006)。

在植物细胞病毒转导中，预期的遗传物质被包装到合适的植物病毒中，然后所得的病毒可以感染植物。如果遗传物质是DNA，它可以与染色体重组产生转化细胞。

动物细胞转染通常包括开启细胞质膜上的瞬时孔隙或“洞”以吸收物质。除了电穿孔，转染可以通过各种将外源DNA导入到细胞中的方法来实现。

一种方法是通过磷酸钙转染(见，例如，Nature Methods 2，319-320)。含有磷酸盐离子的HEPES缓冲盐溶液(HeBS)与含有将被转染的DNA的氯化钙溶液结合。当两种溶液被结合时，将会形成带正电荷的钙和带负电荷的磷酸盐的细小沉淀物，将待被转染的DNA结合其表面上。然后，沉淀物的悬浮液被加入到即将被转染的细胞(通常是以单细胞层生长的细胞培养物)。许多物质已经被用作转染的载体，其中(阳离子)聚合物、脂质体和纳米颗粒(见例如，美国专利5948878，Felgner等，1987；Martien et al.，2008)。这样的方法使用例如，高支化有机化合物，即所谓的树状大分子来结合DNA。非常有效的方法是将待被转染的DNA包含到脂质体中，该脂质体能够与细胞膜融合，将DNA释放到细胞中。对于真核细胞，基于脂质-阳离子的转染更经常被使用，因为细胞更敏感。另一种方法是使用阳离子聚合物，如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺。带负电荷的DNA结合到聚阳离子上，并且络合物通过胞吞作用被细胞吸收。如上所述，转染也可以通过基因枪实现。

转染的其它方法包括核转染、热击、磁转染，和转染试剂，如Lipofectamine^TM、Dojindo HilyMax、Fugene、jetPEI^TM、Effectene或DreamFect^TM。

优选地是核酸的导入是稳定的，即，它稳定地驻留于细胞核中。如果导入的核酸本身并不编码选择标记——该选择标记使细胞具有选择优势，如对某种除草剂、毒素或抗生素的抵抗力，以及如果导入的核酸没有稳定地整合到细胞核中，则可以通过与另一种编码这样的选择标记的核酸的共转化促进整合。

导入到细胞核中的核酸如果编码蛋白质，其通常在细胞溶质细胞溶质中被翻译(胞质表达)。本方法旨在增加胞质表达，然而，表达也发生在细胞器中，如线粒体或叶绿体，它们自己具有编码细胞器特异基因的基因组。然而，本发明优选地不考虑后面的表达类型。

结合本发明所使用的“选择标记”表示遗传信息，其使细胞与不含所述选择标记的其它细胞相比具有选择优势。选择标记的例子包括：毒素、除草剂或抗生素抗性基因的表达产物，或者编码恢复细胞对特殊有机化合物原养型的蛋白质的基因表达产物，或者编码使在不利条件下能够生长的蛋白质的基因表达产物。

在本方法的背景下，使用对选择试剂做出响应的选择标记，并且其中所述选择标记的表达水平与对选择试剂的表型响应水平成正比。选择试剂使不含有编码响应于所述选择试剂的选择标记的基因的细胞具有劣势，选择标记能抵消所述选择试剂的作用。“表型响应”表示表达选择标记的细胞对选择试剂的可检测反应的程度。换言之，所述选择标记在细胞中的表达越高，在选择试剂存在的情况下所述选择标记的表达越清楚地可检测。

在优选实施方式中，对选择试剂的响应是对选择试剂的抗性。在该实施方式中，选择标记赋予抗性。所述抗性优选为可以通过在所述选择试剂存在的情况下细胞的存活或生长检测。这尤其适用于当选择试剂是抗生素、毒素或除草剂的情况，即，当选择标记赋予对所述抗生素、毒素或除草剂的抗性时。因此，赋予抗性的所述选择标记在细胞中的表达越高，可应用到所述细胞而不抑制其生长或将其杀死的选择试剂，如抗生素、毒素或除草剂的剂量就越高。

通常在哺乳动物中导入并表达的赋予抗性的选择标记是，例如，赋予对环氯胍抗性的二氢叶酸还原酶(dhfr)、赋予对霉酚酸抗性的次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(gpt)、赋予对新霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II或赋予对潮霉素B抗性的潮霉素活性钝化激酶。真菌细胞的选典型择标记基因包括：例如，贝那诺霉素抗性(benA)基因、卡那霉素抗性基因、G418抗性基因和博莱霉素抗性基因。植物细胞选择标记基因是那些表达寡霉素抗性ATP合成酶(oliC)、潮霉素B抗性、卡那霉素抗性、G418(遗传霉素)抗性、腐草霉素/博来霉素抗性、依米丁抗性、巴龙霉素抗性或赋予对除草剂BASTA抗性的BAR的基因。

如上所述，选择标记可以是编码恢复对有机化合物原养型的蛋白质的基因，也称为原养型恢复基因的表达产物。在这种情况下，导入的选择标记使细胞本身能够合成所述化合物，以使其不再依赖于或更少依赖于通过培养基外源供应的所述化合物。因此，如本发明所使用的原养型恢复基因是编码表达产物的基因，即选择标记，通过促进其在细胞内合成而降低或优选为消除宿主细胞对外源供应有机化合物的依赖。对表达所述原养型恢复基因的细胞的选择是通过在不含所述化合物的培养基上/中培养所述细胞来实现的。只有表达所述原养型恢复基因的细胞会生长。所述基因的表达产物可以是合成途径的组分，并且所述组分产生的产物可能必须被进一步加工以获得有机化合物，否则就要外源供给有机化合物。通常应用到植物或真菌细胞的原养型恢复基因是，例如，那些表达能赋予精氨酸原养型、色氨酸原养型、尿苷原养型的蛋白质的基因，或者是能够利用硝酸盐或硫酸盐的基因。如果选择标记是原养型恢复基因的表达产物，选择试剂是这样的培养基，细胞在其中培养而且其并不含有各自的有机化合物。在那种情况下响应被表达，例如，细胞的生长率。因此，选择标记的表达越高，在不存在各自有机化合物的情况下，细胞的生长率越高。

对于一些原养型恢复基因，足以产生原养型的表达产物的量很低。因此，区分以低水平表达所述原养型恢复选择标记的细胞与以高水平表达所述原养型恢复选择标记的那些细胞更加费力。为了促进所述区分，这样的原养型恢复基因可以与编码报告基因的核酸一起被共同导入，所述报告基因的可检测性与其表达水平成正比。因此，在该实施方式中，根据本发明的选择标记由辅源营养基因和报告基因构成。

“报告基因”是其表达产物超过背景水平可测量、并通过常用和直接的方法可检测的基因。所述表达产物也称为“报道分子”。报告基因一般可以用于获取有关细胞表达行为(expression behaviour)的信息、在与报告基因融合情况下的有关其它基因表达和定位信息、或者有关控制报告基因的启动子的活性的信息。某些表达的报道分子可以从视觉上检测，如荧光蛋白或磷光蛋白。其它的，如荧光素酶将底物转换成从视觉上可检测的产物，其，例如，发出生物荧光。以上报道分子在细胞中可检测。另外的报道分子是那些存在特异结合分子，如抗体的报道分子。这些可以由本领域已知的方法应用这样的结合分子，如免疫沉淀反应或蛋白质印迹法来检测。核酸形式的报道分子或报告基因可以通过DNA印记法或RNA印记法来检测。然而，这些报道分子的检测并不能在细胞内发生，而是它们必需被从细胞中释放出来。本发明该实施方式中合适的报告基因的例子是以下进一步详细描述的荧光蛋白或磷光蛋白，或者是那些调节生物荧光的报告基因。达到上述必要条件的用于生物体衣藻的选择标记和报告基因的示例性组合由Arg基因和GFP或YFP组成。

术语“荧光蛋白”或“荧光(多)肽”指以一定的波长激发后发出荧光的(多)肽或蛋白质。各种荧光蛋白可以用于本发明中。一组这样的荧光蛋白包括：从水母(Aequorea Victoria)中分离的绿色荧光蛋白(GFP)，以及许多GFP变异体，如青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等(Zhang et al.，2002；Zimmer，2002)。颜色转移GFP突变子具有蓝色到黄绿色的发光颜色、增加的亮度以及光稳定性(Tsien，1998)。一种被称为增强型黄色荧光蛋白的这种GFP突变子显示出529nm(纳米)的最大发射波长。另外的具有改进型激发和发射光谱(美国专利申请200201231)、增强的荧光强度和热耐受性(美国专利申请20020107362A1；美国专利申请20020177189A1)、以及在降低的氧水平下形成生色团(美国专利第6,414,119号)的基于GFP的变异体已经被描述。

磷光是与荧光有关的特殊类型的光致发光。与荧光不同，磷光物质并不立即重新发射其吸收的辐射。重新发射的较慢时标(time scale)与量子力学中“禁阻”能态跃迁有关。因为这些跃迁在某些物质中较少发生，吸收的辐射可以以较低的强度被重新发射达几个小时。磷光蛋白的例子是磷光金属卟啉。

生物发光是由于化学反应由活生物体产生和发出光，在该化学反应期间，化学能被转换成光能。生物发光可以由较大生物体中携带的共生生物自然产生。三磷腺苷(ATP)包含于大部分例子中。化学反应可以或者发生在细胞内，或者发生在细胞外。引起生物荧光的示例性蛋白质是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和长腹水蚤荧光素酶。

对表达选择标记细胞的选择条件依赖于所使用的选择标记的特性。如果抗生素抗性被导入到细胞中，其将会在含有各自抗生素的培养基中/上被培养，各自抗生素的浓度足够保证转化细胞的选择。

如上所述，如果原养型恢复基因单独被导入、或与报告基因结合被导入，该细胞将会在不含所述原养型恢复基因的基因产物合成的有机化合物的培养基上被培养。

在本方法中，利用所述选择标记的可检测表达实现对细胞的选择。根据选择标记，可检测性表示为细胞的存活和/或生长，或者足够量的待检测选择标记的表达——例如通过细胞改变的表型。关于抗生素抗性的例子，可检测表达意为导入选择标记后获得的不同克隆每一个均受不同浓度的各自抗生素的影响。以在高浓度所述抗生素下生长和/或存活表现出抗性的克隆在步骤(b)、并随后在步骤(d)中被选择。在原养型恢复基因的情况中，在不含各自有机化合物而含有报告基因的培养基上生长的克隆在步骤(b)、并随后在步骤(d)中被选择。

“繁殖”表示通过在含有选择试剂的适当的培养基中/上培养，从一个或更多个细胞，在该实例中是那些从步骤(b)中获得的细胞开始增加细胞数目。一般而言，在步骤(b)后得到的克隆在所述克隆繁殖后变得可检测/可见和/或可区分，例如以菌落的形式。因此，繁殖步骤是选择步骤(b)的固有部分。然而，在某些情况下，例如，如果需要或要求高数量的细胞，可以进行另外的繁殖步骤。

“诱变细胞”表示随机改变细胞中含有的遗传信息的过程。根据使用的方法，诱变产生更小程度上或更大程度上改变的细胞。在本发明的上下文中，诱变以细胞核中含有的遗传信息为目标，因为被认是造成细胞中转基因弱表达的过程，例如，基因沉默机制，被假定位于细胞核内而不是细胞器中。诱变可以例如，通过化学诱变剂、通过辐射或通过遗传学方法实现。

化学诱变剂被定义为增加一些突变类型频率的化合物。它们的潜能、它们与DNA的反应能力、它们的一般毒性、以及它们引入到DNA中的化学改变类型会被修复系统修正的可能性会变化。

描述了几种化学诱变剂的种类：碱基类似物诱变剂是模拟正常碱基并被DNA复制系统使用的化学物。它们的基本性质是它们用两个不同的碱基进行碱基配对，由于它们缺乏碱基配对一致性而引起突变。一个例子是5-溴脱氧尿苷(5BU)，其可以以两种互变异构体形式存在：通常，它以与A配对的酮式(T模拟型)存在，但它也可以以与G配对的烯醇式(C模拟型)存在。因为其不断错配的可能性，每个碱基类似物诱变剂会继续随着时间推移诱变。因为这在复制过程中要求“错配”，因此，接下来的几轮复制是任何即将产生的突变所必需的。此外，在突变被稳定以前即，在DNA的两个链都含有突变信息之前，需要另一轮复制。这被称为“突变固定”。错配修复系统依然可以识别并清除错误的碱基直到突变固定发生。

烷化剂直接与某些碱基反应，因而为了发挥作用并不需要活性DNA合成，但为了产生“固定的突变”仍需要DNA合成。它们是很常用的，因为它们几乎在每个生物系统中都是强大的诱变剂。烷化剂的例子包括：甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG、NG、MNNG)。这些诱变剂倾向于优选富含G的区域，发生作用以形成各种修饰的G残基，结果经常是脱嘌呤。这些修饰的G残基中的一些具有诱导错误倾向修复的特性，尽管改变的碱基的错配也有可能发生。尽管碱基替换到目前为止是最频繁的，由于这些诱变剂，这种错误倾向修复的刺激使各种突变类型得以发生。而且，烷基化的碱基看起来可以在复制过程中错配。

另外的化学诱变剂是引起特殊碱基氧化脱氨基作用的亚硝酸。它将腺嘌呤转变成次黄嘌呤(其现在与C配对)，胞嘧啶转变成尿嘧啶(其现在与A配对)，并且最后将鸟嘌呤转变成黄嘌呤(其仍然继续与C配对)。与以上诱变剂不同，亚硝酸将碱基直接改变成“密码错编”形式，并因为其效应而不需要随后的DNA合成。

还有另外一种类型的化学诱变剂，即所谓的“ICR”化合物(杂环氮芥)，包括移码突变，其需要DNA合成以产生突变。它们显然通过邻近碱基之间的“插入”来诱变，可能使合成/修复系统认为那个位置上有另外的碱基。

由辐射引起的诱变优选为由紫外线进行诱变，所述紫外线在邻近的嘧啶碱基处主要产生环丁烷二聚体和焦(6-4)脓菌素光产物。其它基于辐射的诱变技术使用，例如，X光或快速中子轰击。

遗传诱变技术包括，例如，随机插入诱变(例如，用质粒或农杆菌T-DNA构建物)和转座子诱变，例如，Azpiroz-Leehan(1997)、Bouchez(1998)、Zhang(2003)、Ostergaard(2004)、Alonso(2006)。

除了积极诱变细胞以外的另外一种诱变也可以通过允许细胞内自发突变的出现而实现。由于细胞内存在各种DNA修复系统，细胞中的突变速率通常很低。然而，某些环境条件适于提高自发突变的速率。这样的条件是，例如，培养过程中温度的提高或者暴露于某细胞或组织培养基(一种现象，也称为“体细胞克隆变异”)。

诱变之后，对与步骤(b)获得的细胞相比，表现出选择标记表达增加的细胞进行选择。在抗生素抗性作为选择标记的情况下，这意味着更高剂量的选择试剂可以被应用到诱变后得到的克隆中，与应用到步骤(b)中得到的克隆一样，而不会抑制其生长或将其杀死。表达增加优选地表示与步骤(b)中获得的细胞相比，表达的基因产物增加至少10％、优选为至少25％、更优选为至少50％、甚至更优选为至少100％，如至少200％、至少300％或至少400％，并且最优选为至少500％。对于原养型恢复基因，克隆在培养基上生长，培养基不含各自有机化合物并与其它克隆相比，显示出更高的报告基因可检测表达，其中表达比步骤(b)中检测的表达更高，其在步骤(d)中被选择。

本发明第一次公开了产生具有增加的转基因表达的真核细的有效方法。具有相同目的的方法已经在文献中被多次建议过，然而，但是并没有产生可比性的结果。本方法是基于转化到目标细胞中选择标记的相互作用和随后的诱变细胞步骤。基于对抑制细胞中转基因表达的过程的钝化，只有这些步骤的组合才能够选择与自然发生的细胞相比所述选择标记表达更高的细胞。用本方法获得的细胞提供了有价值的研究手段。此外，它们可以作为一些蛋白质或核酸，如生物制药或生物燃料组分的有效表达宿主，这些蛋白质或核酸的重组表达目前还不可能，因为某些生物活性化合物不能获得，例如，由于缺乏赋予所述活性必需的翻译后修饰。

与原核生物相反，翻译后修饰是在真核细胞的细胞溶质中完成的。因此，转基因的有效表达与对表达产物实现必要修饰以赋予它们生物活性的可能性的组合，使某些蛋白质或核酸的重组表达得到相当大的提高。本发明的方法尤其适用于这样的细胞，其易于培养和繁殖，如植物细胞或工业使用的酵母。然而，由于表达增加，该方法甚至对生长更缓慢的细胞，如哺乳动物细胞也有价值。

最后，本文开发的分离表现转基因高表达能力细胞的策略不仅适用于外源蛋白质在其中的积累水平很低的细胞，通常也适用于不存在转基因表达问题、但期望表达能力进一步提高的细胞。该策略的适用性也不依赖于转录与转录后转基因弱表达原因——唯一的区别是，筛选会产生不同的突变体。

在优选实施方式中，细胞是植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。适合于本发明的植物细胞是，例如，紫花苜蓿、埃塞俄比亚芥、马铃薯、烟草、拟南芥属(Arabidopsis)、浮萍属(Lemna)、水稻、香蕉、玉米、大豆、花椰菜、苔藓、如小立宛藓属(Physcomitrella)、番茄、谷物、含油种子、小麦或藻类，如真核红藻类和绿藻类，例如，衣藻属(Chlamydomonas)、眼虫属(Euglena)和小球藻属(Chlorella)。合适的真菌细胞选自，例如属于曲霉科(Aspergillus)，如黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)或镰孢霉(Fusarium venenatum)，或者酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)或巴斯得毕赤酵母(Pichia pastoris)或其它工业使用的酵母物种的菌株。经常使用的哺乳动物表达宿主包括但不限于：人类Hela(海拉细胞)、HEK293(胚胎肾细胞)、H9(T淋巴细胞)、SH-EP1和Jurkat细胞，鼠NIH3T3和C2C12细胞，Cos1、Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，鼠L细胞，幼年叙利亚金黄地鼠肾(BHK)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

细胞可以是单细胞生物或者来自多细胞生物。在后者的情况下，例如，组织或组织外植体的细胞可以被取出并培养。此外，如果合适的细胞，如非人类胚胎干细胞被选为原始材料，用本发明的方法得到的细胞可以形成/发育成多细胞转基因生物，例如，转基因植物、真菌或非人类转基因动物。

在另一个优选实施方式中，细胞是衣藻细胞。

尽管转基因克隆可以依靠转化衣藻细胞很容易地以高频率获得，但众所周知很难识别将目标外源基因表达到相当高水平的克隆(Fuhrmann et al.，1999；Schroda et al.，2000)。衣藻中转基因表达效率很低的分子水平的原因还未被了解。可能的机制包括异端外遗传基因沉默活性的存在和/或例外地压缩染色质结构，其一般不允许转基因的活性转录。

特化启动子的使用(Schroda et al.，2000；Fischer and Rochaix，2001)和再合成转基因编码区以调节其对衣藻高度富含GC的核基因组的密码子使用(Fuhrmann et al.，1999；Fuhrmann et al.，2004；Shao and Bock，2008)，这些在一定程度上减轻了一些情况中的问题，但还没有发现通用的解决方案。

为了试图克服在以模式生物莱茵衣藻为例的几种真核生物中观察到的转基因表达的局限，研发了一种遗传筛选程序，其目的是使得能够选择在细胞溶质中高水平表达导入的转基因的衣藻突变体。从所附的实施例中可以明显看出，藻类表达菌株可以被分离，其积累从核转基因表达的荧光蛋白，多达可溶性蛋白总量的0.2％。菌株具有解决衣藻中严重的转基因表达问题并大大拓展衣藻细胞和分子生物学研究工具箱的潜力。

在本发明中，开发了模式藻类莱茵衣藻的专用菌株，其高水平表达导入的外源基因，即，转基因(trangene)。这些菌株将会帮助克服用衣藻进行基础研究和应用研究中的可以说最严重的限制。根据菌株高水平表达天然的衣藻基因、RPS14基因(CRY1-1)的抗生素抗性等位基因的能力来选择菌株。然而，不同的选择标记也同样适于用本方法。

重要的是，菌株也非常高水平地表达导入的异源转基因，如实施例中所示的荧光报告蛋白(fluorescent reporter protein)GFP和YFP的基因。此外，表达被证明是不依赖于启动子的，因为当在PsaD和RBCS2启动子控制下表达GFP时并不能观察到实质的差别。这现在使得将以前不能用的整套技术应用到衣藻中成为可能，包括使用FRET、BiFC以及相似的方法进行亚细胞定位分析和体内蛋白质-蛋白质相互作用研究。与最近完成的衣藻的基因组序列一起，这些技术的可利用性预期会大大加快绿藻的后基因组学研究。此外，内源基因的过表达现在应该变得没那么麻烦，内源基因的过表达通常会提供关于基因功能的有价值的信息。

为了生物技术的目的开发衣藻的兴趣也在强烈增长，例如，作为生物燃料的生产系统(Happe et al.，2002；Kruse et al.，2005)以及为了生物药物受控制的和有效的表达，通常称为分子耕作的领域(Franklin and Mayfield，2004；Walker et al.，2005)。因为目前为止，由于衣藻中获得的非常低的转基因水平，严重阻碍了所有这些应用，本文所描述的菌株也会有助于克服藻类生物技术中最严重的瓶颈之一。

以前利用衣藻作为表达宿主的企图基于导入到衣藻密码子使用的转基因密码子的适应。有趣的是，本发明获得的菌株中转基因表达的效率不再依赖于密码子使用。密码子优化的GFP和非密码子优化的YFP基因可以被相对高水平地表达。

如本发明所实现的蛋白质的胞质表达与在细胞器中的表达相比特别有利，因为翻译后修饰完全是在胞质溶质中完成的，翻译后修饰往往是表达的蛋白具有生物活性的先决条件。相反，最有可能从细菌发展而来的细胞器并不具有许多这样的机制。因此，即使现有技术中可以在细胞器，如衣藻的叶绿体中实现一些蛋白质的高表达，但较大部分的有用蛋白质将不会以生物活性形式被表达。

此外，本发明中产生的所有独立发生的转基因克隆表现出相对高的外源蛋白积累水平(图2B)。这表明，与野生型菌株相比，表达水平不大依赖于在基因组中的插入位点。

除了外源基因的弱表达之外，在衣藻中也已经频繁地观察到转基因表达的不稳定性(Fuhrmann et al.，1999)。最初表现出一些转基因表达的克隆后来又不明原因地失去表达。至少对于目前用实验方法检测的三个转基因(CRY1-1、GFP和YFP)，没有发现在本发明产生的菌株中转基因表达不稳定性的证据。

现有技术不能量化衣藻细胞细胞溶质中表达的转基因的表达量，因为表达量通常太低而不能被量化。因此，用本发明的方法，通过提供发挥增强的表达能力的菌株，使用衣藻作为表达宿主的主要缺点可以被克服。根据表达的转基因，表达量可以高于或低于细胞可溶性蛋白总量的0.2％。

通过本领域众所周知的常规杂交方法，也有可能将通过使用本发明的方法获得的衣藻菌株，如莱茵衣藻(Chlamydomonas rheinhardtii)菌株的有利特性转移到其它的衣藻菌株中。典型的菌株包括莱茵衣藻的细胞壁缺乏菌株和含细胞壁菌株和可互交的衣藻物种，如Chlamydomonas smithii。该技术可以被延伸到其它真核细胞中。

因此，在进一步的优选实施方式中，本发明的方法还包括将步骤(e)中选择的细胞与可互交的真核细胞进行杂交的步骤，并选择表现出如步骤(e)中观察到的所述选择标记的所述表达增加的非母细胞。

在另一个优选的实施方式中，响应是抗性，并且选择标记赋予抗性。

在更优选的实施方式中，步骤(b)和(d)中是选择对最高浓度的所述抗生素表现出抗性的细胞。

由于所用抗生素的不同作用机制以及根据所使用的细胞，抗生素的“更高浓度”或“最高浓度”可以不同。使用的具体抗生素和具体细胞的实际“更高浓度”或“最高浓度”可以由技术人员已知的常规方法确定。例如，可以用应用到培养基的广泛范围的浓度粗筛显示，其中最高耐受所述浓度范围会被发现。围绕确定的初始浓度的更具体的筛选将会产生精确的“更高或最高浓度”。对于本发明方法的这一方面，诱变前和诱变后适用于细胞的抗生素浓度之间的差异被确定。通常获得的抗生素的最高适用浓度可以以几个数量级变化。对于卡那霉素，例如，观察到的浓度通常在10到1000mg/l(毫克/升)的范围内。

在一个更优选的实施方式中，抗性基因是CRY1-1基因。

如上所述，所述CRY1-1基因是RPS14基因(CRY1-1)的等位基因，RPS14基因(CRY1-1)的表达赋予抗依米丁性。

在另一个优选的实施方式中，本发明的方法还包括(a)’在步骤(b)之前将编码响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到细胞中，所述核酸与步骤(a)中应用的不同，和(b)’用所述选择试剂选择对所述选择标记的响应，优选为在步骤(a)之后和在步骤(b)之前。

该实施方式考虑到在步骤(b)中仅用以上定义的选择标记进行选择可能会更费力，因为观察到的表达水平或表达差异非常低。例如对于衣藻，如果用具体的抗生素，如吐根碱进行选择，正是如此，因为各自选择标记，即CRY1-1基因的表达有时难以观察。因此，为促进适当的选择或为增强步骤(b)中选择的细胞的产量，编码另外选择标记的核酸可以被导入到细胞中，并且进行另外的选择步骤以选择响应于所述选择标记的细胞。

在一个更优选的实施方式中，细胞对化合物是营养缺陷型的，其中，选择标记编码恢复所述化合物原养型的蛋白质的辅源营养基因，并且，其中，步骤(b)’包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前选择所述化合物原养型的恢复。

在甚至更优选的实施方式中，细胞是衣藻细胞，其对于Arg7基因是营养缺陷型的。

辅源营养型与上述原养型相对，并且表示有机体没有能力合成自身生长所需的特殊化合物(如IUPAC所定义的)。在遗传学方法的背景下，如果一个细胞携带有突变，该突变使其不能合成必需化合物，则该细胞就被认为是营养缺陷型的。例如，酵母突变体中尿嘧啶合成途径中的基因失活，酵母突变体就是尿嘧啶营养缺陷型。这样的菌株不能合成尿嘧啶，并且，如果可以从环境中吸收尿嘧啶，其才能生长。另一个实例是衣藻突变体，其中，编码用于精氨酸合成的酶的基因失活。因此，必需从细胞的外界环境，例如，培养基中吸收精氨酸。

在另外的优选实施方式中，转基因是在PsaD或RBCS2启动子的控制之下。

在另一个优选的实施方式中，诱变是通过辐射，优选为紫外线辐射、化学诱变或基因诱变实现的，所有这些手段以上均已讨论过。

在另一个优选的实施方式中，方法还包括在步骤重(e)之后重复步骤(d)和(e)。该实施方式旨在获得与仅一次经历步骤(d)和(e)的细胞相比选择标记的表达进一步增加的细胞。步骤(d)和(e)被重复至少一次，其导致根据该优选实施方式的步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(d)、(e)、…的示例性顺序。步骤(d)和(e)可以一直被重复，直到与前轮步骤(d)和(e)相比观察不到表达进一步增加为止。

在另一个优选的实施方式中，方法还包括钝化或清除在步骤(a)中，并任选为在步骤(e)之后的步骤(a)’中导入的选择标记。

钝化选择标记旨在恢复细胞对选择试剂的原始响应。这可以通过去掉原先导入的编码选择标记的基因来完成，即，将其清除，或者通过完全或部分除去所述基因以便其不产生功能表达产物来完成。这些方法是技术人员所熟知的，而且包括，例如，通过位点特异性重组进行的标记删除(Ebinuma et al.，2001)。

该实施方式旨在恢复细胞对选择试剂的原始灵敏性以使有可能重新利用所述选择标记导入目标转基因，如果必要或需要话。

在另一个优选的实施方式中，方法还包括(f)将编码目标转基因，并且任选地响应于选择试剂的选择标记的核酸分子导入到步骤(e)获得的细胞中；和(g)在所述选择试剂存在的情况下，在所述细胞中分析所述转基因的表达或由所述转基因的表达产物调节的化合物。

优选为在步骤(e)之后执行步骤(f)。

术语“由所述转基因的表达产物调节的化合物”指细胞内的任意化合物，其存在或数量受所述表达产物影响。或者，该术语包括这样的实施方式，其中，通过所述表达产物的活性或存在，化合物从性质上发生改变。该化合物可以，例如，是离析物或生成物。在数量和存在上的改变包括这样的实施方式，其中，转基因表达产物是siRNA、shRNA或miRNA，以及其中表达产物是反义构建物等。产物性质改变的例子包括那些其中所述表达产物是酶和化合物是酶的底物(或者是酶活性的代谢产物，如果化合物是产物)的变化。

在包含导入核酸分子的本发明的该实施方式以及其它实施方式中，在合适的情况下，转基因和选择标记可以被包含在一个或多个核酸中。如果这种导入，例如，以转化的形式，通过使用一个核酸进行，通常采用的形式是同时携带即将被导入的转基因和选择标记基因的质粒。否则，可能要使用一个以上质粒，其各携带一个基因。同样，也可以使用各携带一个或多个基因的质粒混合物。

导入的一个或多个基因可以是报告基因，以下将进一步描述报告基因的一般应用。如果导入的转基因是报告基因，该具体的实施方式旨在确认步骤(d)获得的细胞除了表达步骤(a)中导入的选择标记以外，还能够高量表达转基因。尤其适于该目的的报道分子是荧光蛋白或磷光蛋白或调节生物荧光的蛋白。

如果不能获得单独导入的转基因的表达，选择标记被共同导入。在这种情况下，选择标记优选地不同于步骤(a)中导入的选择标记以增加获得表达转基因的细胞的机会。然而，择标记也可以与步骤(a)中导入的选择标一样，如果后者在所用的细胞中已经被钝化，这是优选的情况。

如上已经简单介绍的，本发明的方法不仅能使导入到细胞中的具体选择标记的表达增加，更重要地，一般还能使转基因表达。这样的转基因包括那些产生工业上重要的蛋白质(如酶)，例如，用于生产生物燃料、生物药物等的转基因。换言之，本发明的该实施方式提供了用于制备各种各样的表达产物的生产植物。如果转基因的表达产物本身就是目标产物，那么期望更高数值的这种表达产物，优选为至少(可溶性)蛋白总量的0.001％。如果由所述转基因的表达产物调节的化合物被分析，那么转基因的表达产物量可能会非常低。例如，就siRNA分子来说，为了获得减少的或消除的目标基因的表达，很少的分子本身可能就足够了。同样地，如果转基因表达产物是酶，为了获得由即将被分析的化合物的底物产生的期望产物(如果化合物是产物)，更少数量的分子可能就足够了。如果期望化合物是生物药物，这更是如此。同样地，本方法导致引起真核细胞转基因表达消弱的一般机制的钝化，而不只是导致导入的选择标记的选择性表达。

在甚至更优选的实施方式中，方法还包括在导入所述转基因后，分析步骤(f)中所得细胞的细胞核中编码所述转基因的核酸分子的完整转录单位的存在。

完整的转录单位包括转基因的编码序列以及存在于最初导入到细胞中的核酸中的任选的调控元件，如启动子。如果选择标记在同一转录盒中被共转化，所述标记的编码区以及所述标记的上述调控元件也必需存在。

该实施方式旨在证明可检测的转基因表达的缺失是由没有或没有完全被整合到细胞核中的转基因引起的。评估在细胞核中编码转基因的核酸存在的方法为技术人员所熟知，而且包括PCR、RT-PCR、RNA印记法或DNA印记法。

任选地，为了比较目的，编码转基因的所述核酸和任选地选择标记，也可以被导入到步骤(b)所得的细胞中。在这种情况下，分析编码所述转基因的核酸分子的完整转录单位的存在，以及任选地，如果从步骤(b)所得细胞中期望的转基因表达不能被观察到，选择标记可以作为核酸被整合的阳性对照。

确定核酸存在的技术包括、但不限于PCR及其各种修饰，如qRT-PCR(也称为实时RT-PCR)。PCR在本领域是众所周知的，并且被用来大量复制目标序列。这是在自动循环设备上完成的，其可以在非常短的时间内加热和冷却装有反应混合物的容器。PCR通常由一个循环的多次重复组成，循环包括(a)变性步骤，其将DNA分子的两条链解开，并终止所有先前的酶反应；(b)退火步骤，其目的在于使引物特异地与解开的DNA分子链复性；和(c)延伸步骤，其通过使用模板链提供的信息延长退火的引物。通常，PCR可以，例如在50μl(微升)的反应混合物中进行，50μl反应混合物含有：5μl 10×PCR缓冲液，其中有1.5mM(毫摩尔)MgCl₂；每种脱氧核苷三磷酸各200μM(微摩尔)；每种引物各0.5μl(10μM)；约10到100ng(纳克)模板DNA；和1到2.5个单位Taq DNA聚合酶。用于扩增的引物可以被标记或不标记。DNA扩增可以，例如，通过型号2400热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)来进行：94℃，2分钟；接下来是30到40个循环，由退火(例如50℃，30秒)、延伸(例如72℃，1分钟，取决于DNA模板的长度和所用的酶)、变性(例如94℃，10秒)和最后的在55℃退火1分钟的步骤组成；以及最后的在72℃延伸5分钟的步骤。适合与DNA模板使用的聚合酶包括：例如，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I或其克列诺夫片段(Klenow fragment)、T4 DNA聚合酶、Tth聚合酶、Taq聚合酶、从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离出来的热稳定DNA聚合酶Vent、Amplitaq、Pfu和KOD，它们当中的一些可以表现出校正功能和/或不同的最佳温度。然而，本领域的技术人员知道怎样优化用不同长度和/或组成的引物扩增具体核酸分子的PCR条件或按比例缩小或增加反应混合物的体积。当即将被扩增的核酸由RNA组成时，应用“逆转录聚合酶链反应”(RT-PCR)。术语“逆转录酶”指催化脱氧核苷三磷酸聚合以形成与核糖核酸模板互补的引物延伸产物的酶。

酶在引物的3′端开始合成，然后向模板的5′端前进，直到合成结束。将RNA目标序列转换成互补的复制DNA(cDNA)序列的合适的聚合剂的例子是：禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶，嗜热栖热菌DNA聚合酶是具有逆转录酶活性的耐热DNA聚合酶，其在市场上被Perkin Elmer所销售。通常，基因组RNA/cDNA双链体模板在初始反转录步骤后的第一次变性步骤中被热变性，使DNA链可以作为扩增的模板。高温RT使引物特异性更高并提高效率。1991年8月15日提交的美国专利申请序列号07/746,121介绍了“同源RT-PCR”，其中相同的引物和聚合酶满足反转录和PCR扩增步骤，以及反应条件被优化以便两个反应均能发生而不用更换试剂。嗜热栖热菌DNA聚合酶是具有逆转录酶作用的耐热DNA聚合酶，其可以被用于所有的引物延伸步骤，无论模板怎样。两个过程都能被完成而不需要打开试管以更换或添加试剂；只有温度分布被调节在第一循环(RNA模板)与剩下的扩增循环(DNA模板)之间。RT反应可以，例如，在20μl的反应混合物中完成，其含有：4μl 5×AMV-RT缓冲液、2μl寡脱氧胸苷酸(Oligo dT)(100μg/ml(微克/毫升))、2μl 10mM dNTPs、1μl总RNA、10单位AMV逆转录酶，加水至终体积20μl。反应可以，例如，通过使用以下条件进行，这些条件是：反应在70℃持续15分钟以允许逆转录。然后，反应温度被提高到95℃持续1分钟以将RNA-cDNA双链体变性。接下来，反应温度经历两个循环：95℃，15秒和60℃，20秒，其后是38个循环：90℃，15秒和60℃，20秒。最后，反应温度在60℃持续4分钟作为最后的延伸步骤，冷却到15℃，并持续该温度直到进一步处理扩增样品。任何上述反应条件可以根据具体情况的需要被按比例增加。

DNA印记被用于检测DNA样品中DNA序列的存在。RNA印记法将按大小分离DNA的琼脂糖凝胶电泳与将按大小分离的DNA转移到滤膜上用于探针杂交的方法结合起来(Southern，1975)。

RNA印记法是用于研究基因表达的技术。它由于其程序与用于研究DNA的DNA印记程序相似而得名，两者的关键区别在于，在RNA印记中，RNA而非DNA是被电泳和用杂交探针检测分析的物质(Alwine et al.，1977)。

如何进行两种印记技术的方案是技术人员熟知的。

在不同的方面，本发明涉及在由本发明方法产生的细胞中生成目标化合物的方法，其包括(a)将编码(i)目标化合物——其是蛋白质或RNA——；或(ii)合成所述目标化合物的必要蛋白质；以及任选地响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到所述细胞中；(b)在细胞中表达所述蛋白质；喝(c)分离产生的目标化合物。

当目标化合物是蛋白质或RNA时，所述蛋白质或RNA增加的表达已经产生了目标产物。表达一被完成，蛋白质或RNA就可以被从细胞中分离。在这种情况下——即目标化合物不是蛋白质或RNA而是可以由一种或多种蛋白质或RNA合成的物质，所述一种或多种蛋白质或RNA的表达导致它们的积累，并相应地导致目标化合物的合成。

目标化合物可以是，例如，药物，包括疫苗、毒素、抗生素、抗体或治疗酶；生物燃料组分；诊断化合物或化学品，如聚合物或代谢物。

如果不能获得单独导入的转基因的表达，选择标记被共同导入。在这种情况下，选择标记优选不同于用于产生真核细胞的本发明方法的步骤(a)中导入的选择标记，以增加获得表达转基因的细胞的机会。然而，选择标记也可以与所述方法的步骤(a)中导入的选择标记相同，如果后者标记在所使用的细胞中已经被钝化，这是优选的情况。该方法适用于可以用本发明的方法获得的细胞，其还未被转基因转化，例如，根据步骤(f)。

本领域存在大量的在合适的宿主中产生多肽(或融合蛋白)的合适方法。如果宿主是单细胞有机体，如单细胞植物有机体或来自多细胞有机体，如哺乳动物或昆虫、植物或真菌中的细胞，本领域的技术人员可以恢复到各种培养条件。方便的是，通过建立的技术产生的蛋白质从培养基、培养的有机体的裂解产物或从分离的(生物)膜收获。在多细胞有机体的情况下，宿主可以是作为有机体的一部分的细胞或来自有机体的一部分的细胞，例如，所述宿主细胞可以是植物可收获的部分。优选的方法包括上述宿主中蛋白质的重组产生。例如，包括目标转基的核酸序列因可以由PCR合成，并被插入到表达载体。随后，用本发明的方法产生的细胞可以用表达载体被转化。其后，该细胞被培养以产生/表达期望的蛋白质，其被分离和纯化。

培养用于表达目的的衣藻的常用方法在所付实施例中描述，而且还可以进一步地被技术人员，例如，从Harris(1989)或Franklin and Mayfield(2004)中检索到。类似地，培养用于表达目的的其它有机体或细胞的方法也是众所周知的，例如，对于高等植物(Potrykus I，199；McElroy and Brettell，1994；Hansen and Wright，1999；Bilang et al，1999；Ma et al.，2003)。

“分离化合物”指在导入的核酸表达期间或表达后产生的化合物的分离。分裂细胞后，各种分离方法是本领域已知的。在表达产物是蛋白质或肽的情况下，所述蛋白质或肽，除了包括使蛋白质有功能的必要的和足够的序列之外，还可以包括另外的N或C端氨基酸序列。这样的蛋白质有时也指融合蛋白。另外的氨基酸序列可以是促进所述蛋白纯化的标签。示例性的标签是6×组氨酸标签或GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签。Tap标签使得能够以多步骤纯化与它们的相互作用伴侣络合中的蛋白质。

术语“融合蛋白”通常指由来自至少两个不同蛋白质或(多)肽的序列组成的嵌合蛋白。只要能导致编码本文所述的融合蛋白组分的核酸分子框架融合，可以通过技术人员所知的任何技术进行融合。组分的融合可以以任意顺序完成。通常，由两个或更多个单独的(多)肽或结构域产生的融合蛋白是基于(Horton et al.，1989)所介绍的“重叠延伸双侧剪接法”。编码单一(多)肽的片段在两个单独的初次PCR反应中产生。初次PCR反应的内部引物含有显著的、大约20bp(碱基对)的互补区域，其允许再次PCR中的两个结构域片段的融合。或者，编码区域可以通过使用限制性位点而被融合，限制性位点或者可以是自然发生的或者可以由重组DNA技术导入。

本发明贯穿使用的融合蛋白组分可以由连接体(linker)分开。连接体可以是肽键或包含至少一个氨基酸残基的一段氨基酸，其可以以任意顺序在融合蛋白组分之间排列。这样的连接体在一些情况下可能是有用的，例如，用于提高单个结构域的单独折叠或调节融合蛋白的稳定性。此外，这样的连接体残基可以含有转运的信号、蛋白酶识别位点，或者二级修饰的信号。形成连接体的氨基酸残基可以是结构化的或非结构化的。优选地，连接体可以是短如一个氨基酸残基，或达2、3、4、5、10、20或50个残基。在特殊情况下，连接体甚至可以包含多达100或150个残基。

蛋白质分离和纯化可以通过几种已知的技术中的任意一种来完成；例如，并且没有限制地，离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法和亲和色谱法，高压液相色谱法(HPLC)、反相HPLC以及制备式盘状凝胶电泳。蛋白质分离/纯化技术可能需要用常规方法修饰本发明的蛋白质。例如，组氨酸标签可以加入到蛋白质中以允许在镍柱上纯化。其它的修饰可以引起更高或更低的活性，使蛋白质产生的水平能够更高，或者使蛋白质的纯化简单化。

在本发明方法中一个优选实施方式中，导入的核酸已经适应了所述细胞的密码子使用。

氨基酸在核酸水平上由称为密码子的核苷酸三联体指定。由于存在有4个核苷酸，因此有64个可能的三联体，它们识别20种氨基酸和翻译终止信号。因为这种冗余，除了两个氨基酸以外的所有氨基酸均由一个以上三联体编码。不同生物体对编码相同特定氨基酸的几种密码子中的一种时常表现出特殊的偏爱，这在本发明中被称为“密码子使用”。普遍公认的是，密码子偏爱反映了翻译优化(translational optimization)的突变偏好和自然选择之间的平衡。在快速生长的微生物，如大肠杆菌或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的最佳密码子反映了它们各自基因组tRNA库的组成(composition)。最佳密码子被认为有助于达到更快的翻译速率和高精确性。由于这些因素，预期翻译选择在高表达基因中更强，在上述有机体中确实如此。在其它并不表现出高生长速率或存在小基因组的有机体中，通常不存在密码子使用优化，密码子偏爱由在那个特殊基因组中观察到的特征突变偏好决定。其例子是人(Homo sapiens)和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)。表现出中间水平的密码子使用优化的有机体包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

目前尚不清楚是否是密码子使用驱使了tRNA进化，还是tRNA驱使了密码子使用的进化。至少已经发展出了一种数学模型，其中密码子使用和tRNA表达均以反馈的方式(即，已经以高频率存在的密码子使它们相应的tRNA的表达提高，而以高水平正常表达的tRNA又使它们相应的密码子的频率提高！)共同进化，然而，这种模型似乎还没有试验确认。已经提出了与密码子使用偏性有关的不同的因素，包括基因表达水平(反映tRNA丰度对优化翻译过程的选择)、％G+C含量(反映水平基因转移或突变偏性)、GC偏斜(反映特异链突变偏性)、氨基酸保守性、蛋白质亲水性、转录选择、RNA稳定性、最佳生长温度和高盐适应性(Ermolaeva，2001；Lynn et al.，2002)。

在生物信息学和计算生物学领域，许多统计方法已经被提议并被用于分析密码子使用偏性(Comeron and Aguade，1998)。方法，如‘最优密码子使用频率’(Fop)和‘密码子适应指数’(CAI)被用于预测基因表达水平，而方法，如‘有效密码子数’(Nc)和来自信息理论的香农熵被用于测量密码子使用平直度(http://codonw.sourceforge.net/Indices.html；Suzuki et al.，2004)。多元统计方法，如相关性分析和主成分分析被广泛地用于分析基因之间的密码子使用变化(Perriere and Thiolouse，2002)。有许多计算机程序执行以上列举的统计分析，包括CodonW(http://codonw.sourceforge.net/)和G-language GAE(http://www.g-language.org/wiki/)。

Mayfield et al.(2003)和Franklin et al.(2002)公开了使用密码子适应的核酸用于在衣藻中表达的示例性实用方法。

在不同的方面，本发明涉及由本发明的方法产生的真核细胞。

还有一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括(a)可由本发明的方法得到的细胞，以及任选地在所述细胞中蛋白质表达优化的载体；或(b)本发明的细胞。

试剂盒的各种组分可以被包装在一个或更多个容器中，如一个或更多个小瓶中。除了组分以外，小瓶还可以包含用于储存的防腐剂或缓冲液。

如果可通过本发明的方法获得的细胞还没有用转基因转化，为了蛋白质在所述细胞中表达而优化的所述载体优选地被包含于本发明的试剂盒中。

在另外一方面，本发明涉及检测蛋白质在由本发明方法产生的细胞中的表达和/或定位的方法，包括(a)在所述细胞中表达编码与报道分子融合的所述蛋白的核酸或(a)’在所述细胞中表达编码作为报道分子的所述蛋白质的核酸；和(b)在所述细胞中检测所述报道分子的表达和/或定位。

如果由本发明方法产生的细胞还没有用转基因转化，则该方法适用。

在本申请的别的地方已经定义了“报告基因”。某些基因被选为报道分子，因为它们赋予表达它们的有机体的特征易于识别和测量，或者因为它们是选择标记。报告基因可以用于确定目标基因是否已经被吸收或在细胞中或有机体群(population)中表达。使用在研究的细胞或有机体中不自然表达的报告基因很重要，因为报道分子的表达正被用作成功吸收目标基因的标记。通常使用的诱导视觉上可识别特征的报告基因在上面已经被介绍过，而它们一般包括荧光蛋白或磷光蛋白或催化产物易于识别的反应的酶(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶)。

报告基因通常用于转化，如转染分析。以这种方式使用的报告基因通常在自己的启动子下表达，该启动子独立于导入的目标基因的启动子；在外部干涉下，如导入转换表达的试剂(agent switching on expression)，报告基因可以组成型表达或诱导型表达。结果，报告基因的表达不依赖于目标基因的表达，当目标基因仅在某些特殊条件下表达或者在难以进入的组织中表达时，这是一个优势。在例如赋予对抗生素的抗性或原养型恢复基因的选择标记报道分子的情况下，转染的细胞可以在含有各自抗生素或不含营养缺陷型物质的底物上生长。

报告基因的另一个应用是在目标基因表达的基因表达分析中，目标基因表达可以产生蛋白质，所述蛋白质对细胞培养物或有机体几乎没有明显的或直接的作用。在这种情况下，报道分子直接被连接到目标基因上以产生基因融合。两个基因受控于相同的启动子，并没被转录成单个信使RNA分子。然后，mRNA被翻译成蛋白质。在这种情况下，尽管被融合，然而，两个蛋白质均能够正确地折叠成它们的活性构象并与底物相互作用很重要。在构建DNA构建物期间，通常包括编码柔性肽连接体区域的DNA片段，以便报道分子和目标基因产物仅最低程度地彼此干扰。

报告基因还可以被用于分析细胞或有机体中特殊启动子的活性。在这种情况下，没有单独的“目标基因”；报告基因在目标启动子的控制下被简单地放置，并且报告基因产物的活性被定量测量。该结果通常相对于在已知诱导基因强表达的“共有序列”启动子下的活性而报道。

在本发明的上下文中，编码目标蛋白质的基因可以被融合到报告基因中。融合蛋白已经在上面进一步介绍过了。

可以在不同水平实现表达的检测。在转录水平上，由基因表达的mRNAs可以通过以下方法检测，如上述PCR、RT-PCR或RNA印记法。在翻译水平，蛋白质表达产物可以在体外使用例如，蛋白质印迹法或免疫沉淀来检测，这些方法都为技术人员所熟知。如果报告基因具有能实现非入侵检测的特性，可以确立在(活)细胞中检测。示例性的特性是荧光、磷光或生物荧光，其可以通过合适的显微镜或光度计检测。

检测位置指检测导入到细胞中的基因的表达产物的定位。如果目标基因融合到报告基因上，可以通过检测报告基因表达产物的定位来确定目标基因的定位。其定位也可以在体内检测的合适的报告基因是本申请其它地方所介绍的荧光、磷光或生物荧光蛋白。以上示例性报道分子的检测可以通过试验者或通过技术人员已知的专业软件(例如，ImageJ co-localization plug-ins，http://rsb.info.nih.gov/ij/)来完成。

在不同的方面，本发明涉及用于检测由本发明方法产生的细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用的体外方法，其包括(a)在所述细胞中表达(i)编码包含融合到检测标记的目标(多)肽的融合蛋白的第一核酸，(ii)编码融合蛋白的第二核酸，该融合蛋白包含被疑为与所述第一(多)肽相互作用的、融合到不同检测标记的(多)肽；和(b)检测两个检测标记的定位；其中，细胞中两个检测标记的共定位表明有相互作用。

如果由本方法可得的细胞还没有用转基因转化，该方法优选适用。

术语“蛋白质-蛋白质相互作用”指两个或更多个蛋白质化合物，即多(肽)或蛋白质的特殊相互作用。特殊相互作用由最小结合强度(binding strength)或结合亲和力(binding affinity)表征。特殊相互作用的结合亲和力通常达到pM到mM的范围，并且也主要依赖于化学环境，例如，pH值、离子强度、辅因子的存在等。在本发明的上下文中，该术语尤其指在生理条件下，即在细胞中发生的蛋白质-蛋白质相互作用。

术语“检测标记”指融合的蛋白质可视的特性，而不干扰该标记在其中表达的活细胞。检测标记组因而组成报道分子的亚组。示例性检测标记发出辐射，如荧光(例如，GFP及其颜色变异体)、磷光或生物荧光(例如，荧光素酶)。

“细胞中两个检测标记的共定位”表示在细胞相同位置的两个不同发射的定位。一旦两个蛋白质发生相互作用，就能检测到共定位。共定位，例如，作为细胞中两个不同可检测(多)肽的发射的部分或完全空间重叠而被检测。检测可以通过实验者或通过技术人员已知的专业软件(例如，ImageJ co-localization plug-ins，http://rsb.info.nih.gov/ij/)来完成。检测标记优选为荧光蛋白或磷光蛋白。

在该实施方式以及其它实施方式中——其中荧光被测定，优选地通过使用荧光显微镜来完成检测。

荧光显微镜是用于研究有机或无机物质性质的光学显微镜，其是通过使用荧光和磷光现象替代反射和吸收现象、或者通过除了反射和吸收现象之外使用荧光和磷光现象。样品用特定波长(或多个波长)的光——其被荧光团吸收——照射，使它们发射更长波长的光(与吸收的光的颜色不同)。通过使用发射滤器，照明光被从弱得多的发射的荧光中分离出来。荧光显微镜的典型组成是光源(氙或汞弧形放电灯)、激发滤器、二向色镜(dichroic mirror)(或二色分光镜(dichromatic beamsplitter))和发射滤器。滤器和二向色镜被选择以与用于标记样品的荧光团的光谱激发和发射特征相匹配。大部分使用中的荧光显微镜是落射荧光显微镜(即：荧光的激发和观察是从样品的上方(落射(epi))进行的)。这些显微镜已经成为生物学领域的重要部分，其为更先进的显微镜设计，如共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和全内角反射荧光显微镜(TIRF)开启了大门。这些技术是技术人员所熟知的。

本发明还设想在由本发明方法产生的细胞中用普通应用的技术，如FRET、BiFC或FRAP检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。

共振能量转移(FRET，如果使用的两个分子都是荧光的，也称为荧光共振能量转移)描述了在两个生色团之间的能量转移机制。处于激发状态的供体生色团能够通过非辐射的、远程偶极-偶极偶合机制(long-range dipole-dipole coupling mechanism)将能量转移到非常接近的受体生色团(通常＜10nm)，这被称为“

共振能量转移”(FRET)(

1949)。

在荧光显微术、荧光共聚焦激光扫描显微术以及分子生物学中，FRET是量化生物物理学和生物化学中分子动力学，如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质构象变化的有用工具(Lakowicz，1999)。为了监控两个分子之间的复合物形成，其中一个用供体标记，另外一个用受体标记，并且将这些荧光团标记的分子混合。当它们被解离时，供体发射在供体激发后立即被检测到。另一方面，当由于两个分子的相互作用供体和受体接近时(1-10nm)，主要观察到受体发射，这是因为从供体到受体的分子间FRET。为了监控蛋白质构象变化，目标蛋白质在两个位点用供体和受体标记。当蛋白质的扭曲或弯曲带来供体和受体距离或相对方位的变化时，就能观察到FRET变化。如果分子间相互作用或蛋白质构象变化依赖于配体结合，这种FRET技术适用于进行配体检测的荧光指示剂。

FRET研究是可测量的：从基于试管的实验的毫升尺度到基于显微术的实验的飞升尺度，能量转移的程度经常被量化。这种量化可以直接基于(激活发射方法)在两个不同的激发条件(原初供体和原初受体)下检测两个发射通道。然而，为了可靠性(robustness)理由，FRET量化最常基于在改变实验条件(例如，供体发射的显微图像被存在的受体接收。然后受体被漂白，以便其不能够接收能量转移，并且获得另外的供体发射)时测量荧光强度或荧光寿命中的变化。临时钝化受体的另一种方法基于其荧光饱和度。采用光的偏振特性，也可能仅用单次照射曝光进行FRET量化。

生物学应用的最普遍的FRET对是青色荧光蛋白(CFP)-黄色荧光蛋白(YFP)对。两者均是绿色荧光蛋白(GFP)的颜色变异体。虽然用有机荧光燃料标记需要经过纯化、化学改性和细胞内注射宿主蛋白的繁琐过程，但通过基因工程，GFP变异体可以容易地附着到宿主蛋白上。

FRET的一个限制是要求外部照明以起始荧光转移，这会导致直接激发受体结果中的背景噪音或导致光褪色。为了避免该缺点，发展了生物发光共振能量转移(或BRET)。该技术使用生物发光的荧光素酶(通常是来自海肾(Renilla reniformis)的荧光素酶)而不是CFP来产生与YFP相容的初始光子发射。

双分子荧光互补(BiFC)是一种在活细胞内观察蛋白质结合的方法(Hu et al.，2002)。该方法基于一些蛋白质，如GFP及其变异体的荧光特性。当荧光蛋白被分裂成N端和C端两半时，该分子不产生荧光。两个非荧光片段的每一个均融合到两个假定的相互作用伙伴上，通过重新建立分裂的荧光团，导致细胞中荧光的恢复。该荧光通过荧光显微镜方法被检测，其可以被安装的摄像机记录。BiFC方法超过其它可视化蛋白质-蛋白质互作方法的优势在于其给予相互作用的指示以及复合物的细胞定位。BiFC可以用作FRET的替代，或者通过其与其它技术组合可能筛选蛋白质-蛋白质互作及其调节子，它可以补充FRET。

FRAP(荧光在光褪色之后恢复)方法表示一种能够定量荧光标记探针的扩散和迁移率的光学技术。该技术为蛋白质结合的生物学研究提供了很大的用途，并且被普遍与荧光蛋白联合使用，其中研究的蛋白质被融合到荧光蛋白上。当经特定的波长的光(通常用激光束)激发时，蛋白质会发荧光。当正被研究的蛋白质是与荧光蛋白融合产生的时，那么荧光可以被追踪。在光裂解荧光蛋白(通常用强烈的/激烈的激光脉冲)后，褪色区域的荧光恢复动力学提供了有关蛋白质互作强度、细胞器连续性和蛋白质运输的信息，其防止或延缓褪色和未褪色荧光蛋白的交换。这种观察资料最近已经被用来研究蛋白质结合。

附图显示：

图1.遗传筛查以选择高水平表达核转基因的衣藻菌株。(A)设计以产生衣藻表达菌株的实验策略的概述(B)从诱变实验中鉴定出对核糖体抑制药物吐根碱表现出高水平抗性的候选菌株。对吐根碱表现出最高耐性的5株菌株(UVM4、UVM9、UVM11、UVM12和UVM13)被选择以进一步分析。

图2.鉴定高水平表达转基因的衣藻菌株。(A)在该研究中构建的转基因表达载体。载体pJR38含有合成的GFP基因，其被密码子优化以用于莱茵衣藻(CrGFP；10)，并由PsaD启动子驱动(PPsaD；Fischer and Rochaix，2001)。质粒也含有APHVIII基因作为选择标记，其赋予对巴龙霉素的抗性(Sizova et al.，2001)，并由杂合启动子驱动，杂合启动子由HSP70A基因(PHSP70)和RbcS2基因(PRBCS2)的融合表达元件组成。载体pJR39含有‘天然的’YFP基因，其密码子使用没有被优化。在载体pJR40中，合成的GFP基因受控于RbcS2启动子。TPsaD：PsaD基因的终止子(Fischer and Rochaix，2001)。(B)通过蛋白质印迹法使用抗GFP抗体分析GFP表达。5μg(微克)用载体pJR38转化的藻类菌株的可溶性总蛋白(TSP)被加样到每个泳道中。为了定量GFP表达，包含了纯化的GFP蛋白的一系列稀释物。菌株UVM4和UVM11中的所有GFP转化体将报告基因表达到类似高的水平(TSP的约0.2％)。(C)通过RNA印记法分析GFP mRNA累积。3μg总RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳被分离，转印并杂交到GFP特异探针上(上图)。作为加样对照，也显示了溴化乙锭染色胶(下图)。注意，GFP mRNA累积水平在所有转化的UVM4和UVM11levels克隆中几乎是一致的。对照：未转化的UVM11菌株。

图3.通过共聚焦激光扫描显微术分析荧光报告蛋白GFP和YFP的积累。显示了用pJR38(GFP基因)或pJR39(YFP基因)转化的UVM4、UVM11和Elow47细胞的荧光。为了比较和亚细胞定位，还显示了明视场图像、叶绿素荧光和报告蛋白荧光和叶绿素荧光的重叠。(A)可视化GFP在细胞溶质中的表达。(B)可视化YFP表达。比例尺：10μm。

图4.衣藻表达菌株UVM4和UVM11与未诱变菌株Elow47相比的生长分析。(A)在光能混合营养型条件下记录的生长曲线。细胞以16小时光照/8小时黑暗的循环在TAP培养基上生长。(B)于光能自养条件下在连续光照下生长于HSM培养基上。细胞数目用细胞计数器在所示时间点确定。所有数据代表三个生物学重复的平均数。标准误差由误差条表示。

实施例说明了本发明。

实施例1：材料和方法

藻类菌株和培养条件。莱茵衣藻细胞壁缺乏、精氨酸原养型菌株(cw15arg-由M.Schroda，University Freiburg，Germany友情提供)被用于转化，并或者在液体TAP培养基中或者在固体TAP培养基上被光能混合营养地培养(Harris，1989)，其是于22℃培养16小时：8小时白天/夜晚的循环(光照强度50μE m-2s-1)，除非另作说明。如果需要，精氨酸可以被加入到培养基中(100μg ml-1)。菌株Elow47在用pCRY1-1(Nelson et al.，1994)和pCB412(由C.F.Beck，University Freiburg，Germany提供)——其各自带有吐根碱抗性基因和ARG7基因——共转化cw15 arg-后获得。所有UVM菌株均在紫外线诱导诱变菌株Elow47后获得。为了分析光能自养生长，在HSM液体培养基中(Harris，1989)培养衣藻细胞。

转化载体的构建。CrGFP序列(Fuhrmann et al.，1999)用引物PCrGFPfw(5’-GCCAAGGGCGAGG-3’)和PCrGFPrev(5’-

TTACTTGTACAGCTCGTCC-3’)扩增，其在5’和3’末端各引入NdeI和EcoRI位点(斜体显示的为限制位点)。GFP编码区随后作为NdeI/EcoRI片段被插入到相似切割的载体pGenD-PsaF(Fischer and Rochaix，2001)中，产生质粒pJR37。然后，来自pJR37GFP的DNA序列组件(盒，cassette)作为XhoI/XbaI片段被插入到质粒pSI103相似消化的衍生物中，质粒pSI103含有APHVIII选择标记基因(Sizova et al.，2001；由Rachel Dent，UC Berkeley，USA友情提供)，产生转化载体pJR38(图2A)。含有YFP作为报告基因的载体pJR39通过使用PCR  引物PPsaD-YFPfw(5’-G

TAGGACCCCACTGCTACTCACAACAAGC

TGAGCAAGGGCGAGGAGC-3)和PPsaD-YFPrev(5’-

TTACTTGATCAGCTCGTCCATGC-3’扩增来自质粒克隆(由Dr.Marc Lohse，MPI-MP友情提供)的Venus YFP变异体(Shyu et al.，2006)被构建，所述引物分别引入了5’BsmI位点(和含有翻译起始密码子的NcoI位点)和3’EcoRI位点(斜体显示的为限制位点)。通过用BsmI和EcoRI消化pJR38，并将GFP序列替换为含YFP的BsmI/EcoRI片段获得pJR39(图2A)。为了产生质粒pJR40(图2A)，用引物P5’RBCS2-BamHI(5’-AA

CCGGGCGCGCCAGAAGG-3’)和P3’RBCS2-NdeI(5’-GGCGGC

AAGATGTTGAGTG-3’)从质粒pBC1(在APHVIII基因上游含有HSP70A-RBCS2杂合启动子)中扩增RBCS2启动子片段，所述引物导入了5’BamHI位点和3’NdeI位点(斜体显示的序列)。然后，RBCS2 PCR片段用BamHI和NdeI消化，并被连接到用相同酶切割的pJR37上，因此将GFP上游的PsaD启动子序列替换为RBCS2启动子。最后，RBCS2启动子作为XbaI/NdeI片段被切离并被克隆到相似消化的载体pJR38上，产生了转化载体pJR40(图2A)。根据生产商指示，于16℃过夜的条件下，DNA片段用T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Frankfurt a.M.，Germany)连接到线性化质粒中。

莱茵衣藻的转化。采用玻璃珠法(Kindle，1990)进行莱茵衣藻的核转化。用pCB412(2.4μg/转化，用EcoRI成线性)和pCRY1-1(1μg/转化，用EcoRI成线性)的cw15 arg-的共转化体在不含精氨酸的培养基上进行选择。紫外线诱变Elow47后得到的UVM菌株用载体pJR38(1μg用KpnI成线性的质粒DNA)、pJR39(1μg用KpnI成线性的质粒DNA)或pJR40(0.8μg用KpnI成线性的质粒DNA)转化。转化体的选择在含5-10μg ml-1巴龙霉素的TAP培养基上进行。

吐根碱敏感性测试。为了分离适合诱变和筛选的菌株，用不断增加浓度的吐根碱(0、5、25、80μg ml^-1吐根碱)测试CRY1-1/ARG7共转化体在TAP琼脂平板上的生长。生长于5μg ml^-1吐根碱上、但对25μg ml^-1吐根碱(并因而仅表现非常低的CRY1-1表达)敏感的菌株Elow47被选择用于随后的诱变实验(图1A)。也在紫外线诱变后进行了吐根碱敏感性测试以分析在提高的吐根碱浓度(达120μg ml^-1；图1)下突变体的生长。

紫外线诱变。Elow47细胞在200ml TAP培养基中生长到对数中期(细胞密度：3.7×10⁶ml^-1)，并经离心法收集(1700×g(克)，5分钟)。将藻粒重新悬浮于2.5ml新鲜的TAP培养基中，并且将8个样品——每个250μl(相当于7.4×10⁷个细胞)被涂到含有60μg ml^-1吐根碱的TAP琼脂平板上，以直接选择表现出CRY1-1转基因表达增强的突变体。于无菌条件下，培养皿在离紫外灯(ETX-20，254nm，100W，50/60Hz，LFT Labortechnik，Wasserburg，Germany)13厘米的距离处暴露于紫外线1分钟，并被直接转移到黑暗中以使光诱导的细胞修复机制最小化。在黑暗中过夜温育之后，培养物在低光照(5μE m-2 s-1)下被温育两周。最后，通过进行吐根碱敏感性下降测试，分析UVM(紫外线诱变)菌株。在提高的吐根碱浓度(100-120μg ml^-1；图1)中表现生长的菌株通过用不同的启动子-报告基因构建物转化被进一步检测(图2A)。

DNA提取、纯化和PCR。根据公布的方法(Schroda et al.，2001)提取莱茵衣藻的基因组DNA。为了DNA片段的连接和杂交探针的分离，通过在琼脂糖凝胶电泳之后用GFXTM PCR(DNA and Gel Band Purification(DNA和胶带纯化))试剂盒(GE Healthcare，Freiburg，Germany)提取切离的凝胶切片来纯化DNA。PCR根据标准程序(于95℃ 1分钟，于58℃-66℃ 90秒，于72℃ 90秒，32个循环)进行。通过PCR检测用载体pJR38得到的转化体是否存在完整的GFP DNA序列盒。引物对APHVIIIrev(5’-CCTCAGAAGAACTCGTCCAACAGCC-3’)和APHVIIIfw(5’-GGAGGATCTGGACGAGGAGCGGAAG-3’)被用于扩增APHVIII基因的3’端(360bp产物)，而引物PPsaDrev(5’-CGAGCCCTTCGAACAGCCAGGCCG-3’)和M13fw(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)被用于扩增GFP前面的PsaD启动子的5’(380bp)端。两个引物组合均能产生PCR产物的克隆被评价为全长GFPDNA序列组件阳性。

RNA提取和RNA印记分析。使用SV RNA总提取试剂盒(SV RNA Total Isolation kit)(Promega，Mannheim，Germany)，根据生产商指示，从用pJR38转化的Elow47和UVM菌株中提取总细胞RNA。RNA样品在含1％甲醛的琼脂糖凝胶上进行分离，并被转印到Hybond尼龙膜(GE Healthcare，Freiburg，Germany)上。根据生产商的方案，于65℃，在Rapid-Hyb缓冲液(GE Healthcare)中进行杂交。用引物PCrGFPfw(5’-CATATGGCCAAGGGCGAGG-3’)和PCrGFPrev(5’-GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’)经PCR扩增用于产生GFP特异探针的DNA模板。用[α-32P]dCTP(GE Healthcare)通过随机引发对探针进行放射性标记。

蛋白质分离和蛋白质印记分析。通过将粒状衣藻细胞重新悬浮于200μl裂解缓冲液(50mM HEPES/KOH pH 7.5、10mM KAc、5mM MgAc、1mM EDTA、1mM DTT和1×蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Complete)；Roche，Mannheim，Germany)中，然后通过声波作用(Sonifier

，W-250D，G.Heinemann Ultraschall-und Labortechnik，

 Gmünd，Germany；振幅10％，15秒)分裂细胞，以制备可溶性蛋白总提取物。根据Bradford方法(Roti

-Quant，Roth，Karlsruhe，Germany)量化蛋白质量。代表5μg可溶性总蛋白的样品于95℃被变性3分钟，通过变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过使用Trans-Blot

电泳转移细胞(Biorad，München，Germany)和标准转移缓冲液(25mM Tris/HCl、192mM甘氨酸，pH 8.3)被转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Hybond P，GE Healthcare，Freiburg，Germany)上。使用ECL检测系统(GE Healthcare，Freiburg，Germany)和抗鼠二抗(Sigma-Aldrich，Munich，Germany)用单克隆抗GFP一抗(Clontech，Saint-Germain-en-Laye，France)检测免疫生物化物蛋白质。

显微镜方法。报告蛋白质荧光通过共聚焦激光扫描显微术(TCS SP2；Leica，Wetzlar，Germany)使用氩激光器激发(对于GFP在488nm纳米处，而对于YFP在514nm处)来测定，490-510nm的滤器用于检测GFP荧光，510-535nm的滤器用于检测YFP荧光，以及630-720nm的滤器用于检测叶绿素荧光。

实施例2：衣藻表达菌株的遗传筛选。

我们假定衣藻中的转基因表达问题有遗传基础，如，染色质结构异常紧或者有效沉默引入序列的外遗传过程(epigenetic process)。我们进一步推理认为，如果是这样的情况，应该有可能分离出这样的突变体，即，在其中这种转基因失活机制是有缺陷的。我们因此设计了遗传筛选，旨在选择这样的突变体。筛选下面的实验策略概述于图1A中。为了能够直接选择有效的转基因表达，我们选择了选择标记基因，其表达水平与对选择试剂的表型抗性水平成正比。CRY1-1基因满足这样的标准。它代表了胞质核糖体蛋白S14的突变等位基因，胞质核糖体蛋白S14处于对翻译抑制剂吐根碱敏感的状态下(Nelson et al.，1994)。生产于细胞中的CRY1-1蛋白(＝突变体S14蛋白)越多，吐根碱敏感野生型S14蛋白被从胞质核糖体中替代的效率就越高，并且细胞可以耐受的吐根碱的浓度就越高。通过用ARG7选择标记基因共同转化，我们将CRY1-1基因导入到精氨酸营养缺陷型衣藻菌株的核基因组中，并选择精氨酸原养型的恢复(图1A)。然后，精氨酸原养型菌株被检测与CRY1-1基因的共转化。当在不同吐根碱浓度的培养基上检测时，共转化菌株仅对吐根碱表现出低水平的抗性(通常在5和25μg/ml之间变化)，这与衣藻核基因组中的转基因弱表达一致。一株这样的共转化菌株Elow47(在低浓度抗吐根碱，菌株号47)被选择并经受紫外线诱导的诱变(图1A)。该策略背后的基本原理是遗传失活衣藻(Chlaymdomonas)中运行的转基因沉默机制会释放疑为对CRY1-1基因的转录抑制作用，因此促进在高得多的吐根碱浓度上生长。就抗60μg/ml吐根碱抗性对诱变细胞群(6×10⁸诱变细胞)的选择确实产生了在高抗生素浓度存在的情况下生长的克隆。为了在单个克隆中确定吐根碱抗性水平并鉴定那些表现出最强抗性的克隆，使用在60μg/ml吐根碱存在的情况下于初始选择平板上显示清楚生长的22个克隆在含不同浓度吐根碱的培养基上进行点滴测试(drop tes)(图1A、B，数据未显示)。这些实验揭示了菌株之间的抗生素抗性水平的实质差异，表明不同菌株可能携带导致提高的吐根碱抗性的不同突变。

实施例3：鉴定有效表达转基因的菌株。

除了敲除疑似转基因沉默机制之外，几种可选择的突变类型也可能是造成耐受高浓度吐根碱的藻类克隆出现的原因。这些突变类型包括获得内源RPS14基因中赋予吐根碱抗性的点突变或允许更高表达的CRY1-1 DNA序列组件中的突变(例如，增强启动子强度、mRNA稳定性或翻译效率的突变)。然而，这些非期望的突变体类型可以容易地与需要的类型区别，因为它们不会处于无关转基因高表达的状态。因此，我们检测5个表现最高水平吐根碱抗性的选择菌株(随后称为UVM4、UVM9、UVM11、UVM12和UVM13；图1B)的高水平表达其它转基因的潜能。为此，我们构建了含有最普通荧光报告基因GFP的转化载体。为了排除UVM菌株转基因表达能力受驱动CRY1-1基因的启动子的限制的可能性，GFP编码区被放置于表达信号的控制之下，该表达信号与在Elow47中驱动CRY1-1选择标记基因的表达信号不同(参见材料和方法；图2A)。因为外源基因在衣藻中的表达被认为依赖于密码子使用，我们使用了合成的GFP基因，其序列被调整以适合藻类核基因组中的密码子使用(Fuhrmann et al.，1999)。

我们构建了GFP表达载体(pJR38；图2A)，其含有巴龙霉素抗性基因APHVIII(Sizova et al.，2001)。所有5个候选菌株(UVM4、UVM9、UVM11、UVM12和UVM13)均用pJR38转化，并且，每个构建物随机挑选17到20个抗巴龙霉素克隆并用单克隆抗GFP抗体通过蛋白质印迹法分析GFP表达(图2B；表1)。对于三个检测的菌株UVM9、UVM12和UVM13，没有单个GFP积累克隆被鉴定(图2B；表1)，这与揭示外源基因在衣藻中表达有很大难度的大量早期工作相一致(例如，Fuhrmann et al.，1999；Schroda et al.，2000)。然而，两个菌株UVM4和UVM11产生了以高频率表达GFP的转化体。17个分析的抗巴龙霉素UVM4克隆中的9个和18个抗抗生素UVM11克隆中的9个高水平表达GFP(图2B；表1)。这试验性表明菌株UVM4和UVM11可以代表这样的突变体，即，在其中外遗传转基因失活机制已经被敲除。然而，如果确实是这种情况，应该可以预期100％的成功转化的克隆表达GFP。我们因此对确定为什么接近一半的UVM4和UVM11转化体并没有表现出可检测的GFP表达感兴趣(表1)。两种可选的假设可以潜在地解释这个发现：(i)不同的外遗传效应，如位置效应、在这些克隆中被阻止的转基因表达；或(ii)这些克隆在它们的核基因组中并不含有完整的GFP DNA序列组件。因为成功转化的克隆仅通过它们对巴龙霉素的抗性(由APHVIII基因赋予；图2A)被选择，不能保证GFP DNA序列组件被共同整合到所有抗抗生素克隆中。为了测试完整GFP DNA序列组件的整合，使用对驱动GFP DNA序列组件的启动子的5’端特异的引物组合以及扩增APHVIII基因3’端(其直接位于GFP下游；图2A)的第二引物组合进行PCR试验。如果两个引物组合均产生了PCR产物，我们就假定完整的GFPDNA序列组件被整合到基因组中了。有趣地是，所有那些并不显示可检测的GFP表达的UVM4和UVM11转化体在这些PCR试验中为阴性，因为它们缺乏完整的GFPDNA序列组件。因此，所有含有转基因转化体也高水平表达该转基因，这表明菌株UVM4和UVM11含有已经将外遗传转基因失活机制消除的突变。有趣地是，所有18个含有GFP转基因的UVM4和UVM11克隆中的表达水平均相当高，表明也没有显著的位置效应在这些菌株中起作用。针对纯化的GFP的一系列稀释物的外源蛋白积累的定量比(图2B)揭示转化体中GFP蛋白积累到可溶性总蛋白的至少0.2％。据我们所知，这是通过衣藻中核转化获得的迄今为止最高的转基因表达水平。

表1.在用GFP基因DNA序列组件转化的藻类菌株中的GFP表达能力。₍₁₎在检测全长GFP DNA序列组件整合到基因组之前的抗巴龙霉素克隆。₍₂₎用蛋白质印迹法和荧光显微镜方法分析GFP表达。₍₃₎PCR检测全长GFP DNA序列组件在基因组中的存在。

我们接下来想确定UVM4和UVM11转化体中的外源蛋白积累是否与GFP mRNA积累相关。RNA印记实验揭示确实是这种情况。表现GFP蛋白高积累的所有克隆同样也表现相当高的GFP mRNA积累(图2C)，表明两个菌株转基因表达能力的转录性质。

实施例4：开发新的衣藻荧光报道分子。

当证明了GFP蛋白积累到高水平之后，我们对通过荧光显微镜方法检测蛋白质的检测能力感兴趣。到目前为止，GFP荧光只有与高度局部化的融合蛋白一起时才能在衣藻中被看到(例如，在鞭毛或眼点；Fuhrmann et al.，1999；Huang et al.，2007)。相反，由载体pJR38中的DNA序列组件产生的GFP蛋白是游离的、未融合的蛋白，其应该存在于细胞溶质中。与蛋白质印迹法(图2B)测量的高GFP积累水平相一致，GFP荧光在UVM4和UVM11菌株的细胞溶质中易于检测(图3A)。相反，含有pJR38构建物的Elow47转化体并没有表现出超出背景的荧光，再一次证实类野生型的衣藻菌株并不将GFP表达到可用光显微镜方法检测的水平(图3A)。

受到在我们的UVM4和UVM11菌株中成功表达GFP的激励，我们着手于开发衣藻的第二个荧光报告基因。我们选择了YFP，因为这是第二个最频繁用于基因表达的体内报道分子，除此之外，它也用于各种其它细胞生物学应用，如，通过双分子荧光互补(BiFC)或荧光共振能量转移(FRET)进行蛋白质-蛋白质互作分析。我们也用该第二个报道分子来检测密码子使用适应性在我们的表达菌株UVM4和UVM11中是否已经变得不重要了。为此，我们将非密码子优化的YFP基因形式插入到我们的转化载体(图2A中的pJR39)中，并将构建物转化到UVM4、UVM11中，以及Elow47中以作为对照。用荧光显微镜方法分析转化的藻类克隆，表明携带完整YFP DNA序列组件的所有UVM4和UVM11转化体在细胞溶质显示出明亮的黄色荧光，然而，没有Elow47转化体显示任何可检测的超出背景的荧光(图3B，数据没有显示)。

最后，我们想确认，我们的表达菌株不仅能从强PsaD启动子表达转基因(Fischer and Rochaix，2001)，而且通常也能允许以不依赖于启动子的方式的有效转基因表达。因此，我们构建了另外一个载体，其中GFP基因由来自RBCS2基因(pJR40；图2C)的启动子驱动，并将该组件转化入UVM4和UVM11菌株中。通过荧光显微镜方法，GFP积累在所有含有完整GFP DNA序列组件(没有显示)的转基因克隆中都易于检测，并且，荧光的亮度与PsaD启动子构建物的相似，表明这两个菌株可以代表从衣藻核基因组中实现高水平转基因表达的普遍适用的工具。

实施例5：衣藻表达菌株的类野生型生长。

可以想象，我们显然已经在菌株UVM4和UVM11中敲除的外遗传转基因失活机制具有某些生物学功能。该功能可以或者存在于衣藻中基因表达的内源调节，或者存在于一些抵御侵入核酸序列，如病毒或细胞内细菌性病原体的抵御机制中。为了测试在标准条件下该外遗传机制是否具有重要的功能，我们进行了生长试验，其中我们将两个菌株与非诱变菌株Elow47作比较。我们或者在连续光照中或者在16小时：8小时的光照/黑暗循环中于混合营养条件(在TAP培养基中；图4A)和光能自养条件(在HSM培养基中；图4B)下均测量了生长速率。在所有条件下，两个突变体菌株与非诱变对照菌株生长的一样快，表明敲除失活转基因的外遗传机制的并不赋予显著的选择优势。

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Claims (18)

1.产生适合转基因在其中表达的真核细胞的方法，包括：

(a)将编码响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到细胞核中，其中所述选择标记的表达水平与对所述选择试剂的表型响应水平成正比；

(b)在步骤(a)得到的所述细胞中选择所述选择标记的表达可检测的细胞；

(c)任选地繁殖步骤(b)选择的所述细胞；

(d)诱变步骤(b)选择的所述细胞或步骤(c)繁殖的所述细胞、或允许步骤(b)选择的所述细胞或步骤(c)繁殖的细所述胞中出现自发突变；

(e)选择与步骤(b)得到的所述表达相比，显示出所述选择标记表达增加的细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是植物细胞，优选为真核的藻类细胞、真菌细胞，优选为酵母细胞或哺乳动物细胞。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是衣藻(Chlamydomonas)细胞。

4.权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中，所述响应是抗性，并且其中所述选择标记赋予抗性。

5.权利要求4所述的方法，其中所述抗性基因是CRY1-1基因。

6.权利要求1至5中任意一项所述的方法，还包括：

(a)’在步骤(b)之前，将编码响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到所述细胞中，所述核酸与步骤(a)中使用的核酸不同；和

(b)’用所述选择试剂选择对所述选择标记的响应，优选为在步骤(a)之后和在步骤(b)之前。

7.权利要求6所述的方法，其中所述细胞对化合物是营养缺陷的，其中所述选择标记是编码恢复对所述化合物原养型的蛋白的营养缺陷型基因，并且，其中步骤(b)’包含在步骤(a)之后和步骤(b)之前选择对所述化合物原养型的所述恢复。

8.权利要求7所述的方法，其中所述细胞是衣藻细胞，其是对Arg7基因营养缺陷的。

9.权利要求1至8中任意一项所述的方法，其中诱变通过辐射、化学诱变或基因诱变实施。

10.权利要求1至9中任意一项所述的方法，还包括在步骤(e)之后钝化在步骤(a)中导入的所述选择标记以及任选地在步骤(a)’中导入的所述选择标记。

11.权利要求1至10中任意一项所述的方法，还包括：

(f)将编码目标转基因，并且任选地响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到步骤(e)获得的所述细胞中；和

(g)在所述细胞中，任选地在所述选择试剂存在的情况下，分析所述转基因的表达或者由所述转基因的所述表达产物调节的化合物。

12.权利要求11所述的方法，还包括在导入所述转基因之后分析在步骤(f)获得的所述细胞的核中编码所述转基因的所述核酸分子的完整转录单位的存在。

13.在由权利要求1至10中任意一项所述的方法产生的细胞中生成目标化合物的方法，包括：

(a)将编码

(i)所述目标化合物，其是蛋白质或RNA；或者

(ii)合成所述目标化合物必需的蛋白质

和任选地响应于选择试剂的选择标记的核酸导入到所述细胞中；

(b)在所述细胞中表达所述蛋白质；和

(c)分离产生的所述目标化合物。

14.权利要求13所述的方法，其中所述目标化合物是药物、生物燃料组分、诊断化合物或化学药品。

15.真核细胞，其由权利要求1至12中任意一项所述的方法产生。

16.试剂盒，包括：

(a)由权利要求1至12中任意一项所述的方法可获得的细胞，以及任选地在所述细胞中蛋白质表达优化的载体；或者

(b)权利要求15所述的细胞。

17.在由权利要求1至12中任意一项所述的方法产生的所述细胞中检测蛋白质表达和/或定位的方法，包括

(a)在所述细胞中表达编码融合到报道分子上的所述蛋白质的核酸；或

(a)’在所述细胞中表达编码所述蛋白质的核酸，所述蛋白质是报道分子；和

(b)在所述细胞中检测所述报道分子的表达和/或定位。

18.体外检测在由权利要求1至12中任意一项所述的方法产生的所述细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括

(a)在所述细胞中表达

i.编码含有融合到检测标记上的目标(多)肽的融合蛋白的第一核酸；和

ii.编码含有融合到不同检测标记上的疑为与所述第一(多)肽相互作用的(多)肽的融合蛋白的核酸；和

(b)检测两个检测标记的定位；

其中，所述细胞中两个检测标记的共定位表明相互作用。

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