KR20210060642A - 성장 관련 질환 및/또는 그것의 임상적 상태를 억제 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

성장 관련 질환 및/또는 그것의 임상적 상태를 억제 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210060642A
KR20210060642A KR1020217014561A KR20217014561A KR20210060642A KR 20210060642 A KR20210060642 A KR 20210060642A KR 1020217014561 A KR1020217014561 A KR 1020217014561A KR 20217014561 A KR20217014561 A KR 20217014561A KR 20210060642 A KR20210060642 A KR 20210060642A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
alkoxy
halogen
hydrogen
haloalkyl
hydroxy
Prior art date
Application number
KR1020217014561A
Other languages
English (en)
Inventor
최강열
최세희
서설화
김은환
Original Assignee
주식회사 씨케이바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 씨케이바이오텍 filed Critical 주식회사 씨케이바이오텍
Publication of KR20210060642A publication Critical patent/KR20210060642A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/34—Oxygen atoms in position 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/40—Cyclodextrins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/48—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring being part of a condensed ring system of the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/40—Nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical, e.g. isatin semicarbazone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/18—Ring systems of four or more rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D513/14—Ortho-condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/328—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having effect on glycaemic control and diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/332—Promoters of weight control and weight loss
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/40—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing four condensed rings
    • C07C2603/42—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing four condensed rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/44—Naphthacenes; Hydrogenated naphthacenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7014—(Neo)vascularisation - Angiogenesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

CXXC5-DVL 계면을 저해하는 하나 이상의 제제를 포함하는 치료적 조성물, 및 성장 또는 이와 관련된 임상적 상태와 연관된 상태/질환의 모델링, 치료, 치료 내성 감소, 예방, 및 진단을 위해 이들 치료적 조성물을 투여하는 방법이 개시된다.

Description

성장 관련 질환 및/또는 그것의 임상적 상태를 억제 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 15일자 출원된 한국 출원 No. KR 10-2018-0122511, 2019년 2월 1일자 출원된 미국 임시 출원 No. 62/799,921, 2019년 2월 1일자 출원된 미국 임시 출원 No. 62/799,912, 2019년 3월 28일자 출원된 미국 임시 출원 No. 62/825,363, 및 2019년 9월 20일자 출원된 미국 임시 출원 No. 62/903,068에 대한우선권 주장 출원으로서, 해당 출원서의 내용은 인용에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술분야
본원에 개시된 다양한 양태 및 구체예들은 성장 또는 이와 관련된 임상적 상태와 연관된 상태/질환의 모델링, 치료, 치료 내성 감소, 예방, 및 진단에 관한 것이다. 구체예들은 상태/질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함하며, 이 방법은 본원에 개시된 화합물 및/또는 조성물의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 제공하는 단계를 포함한다. 다른 구체예들은 대상에서 CXXC5-DVL 계면의 활성을 변경 및/또는 억제하는 방법을 포함한다.
길이방향 뼈 성장은 연골 조직의 얇은 층으로 이루어진 성장판에서 일어난다. 이 연골층에서 연골세포가 증식하고 비대성 분화를 겪은 후 아포토시스가 일어나며, 이어서 뼈 조직으로 리모델링됨으로써 뼈가 신장된다. 길이방향 뼈 성장은 태아 발육기 및 유아기 동안 빠르게 일어난다. 성장판 노화로 인해 뼈 성장은 점차 느려지고 사춘기 끝 무렵에는 결국 중지된다. 현재 많은 어린이들이 이른 시기에 사춘기를 겪고 있으며, 이것은 더 이른 성장판 노화를 초래한다. 성조숙증이라고 알려진 이러한 현상은 길이방향 뼈 성장의 조기 종료를 야기하고, 결국 단신인 성인이 된다. 성장판 노화의 조절을 수반하는 정확한 메커니즘은 아직도 명확하게 밝혀진 바가 없다.
일부 연구는 성장판 성숙에 있어서 Wnt/β-카테닌 신호화의 연관성을 보고했다. CXXC 핑거 단백질 5(CXXC5)는 Wnt/β-카테닌 신호화의 음성 조절제로서, 세포질에서의 디셔벌드(dishevelled, DVL)의 PDZ 도메인과의 상호작용을 통해 기능한다. CXXC5-DVL 상호작용의 저해는 Wnt/β-카테닌의 활성화로 인한 골다공증, 피부 상처, 및 탈모를 포함하는 Wnt/β-카테닌 신호화를 수반하는 몇몇 병태생리적 표현형을 개선했다. 성장판 노화 및/또는 이와 관련된 상태의 조절을 수반하는 과정의 복잡성으로 인해, 대상에서 길이방향 뼈 성장을 증진시킬 수 있는 새로운 치료적 섭생의 개발이 많이 요구된다.
Wnt/β-카테닌 신호화의 음성 조절제로서의 CXXC5의 역할이 밝혀진바, 그것의 활성을 방해할 수 있는 화합물의 개발은 중요하게 되었다. 본 발명의 일부 양태는 CXXC5-DVL 계면을 방해하는 화합물 및 그것을 사용하여 대상의 성장에 영향을 미치는 방법을 포함한다.
본 출원의 일부 구체예는 대상에서 성장 또는 이와 관련된 임상적 상태와 연관된 상태 및/또는 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 치료적 섭생의 하나 이상의 부작용의 억제를 수반한다. 다른 구체예는 조기 성장판 노화에 의해 야기된, 이른 사춘기 도래 관련 질환으로 진단되거나 또는 이러한 상태를 가진 대상을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
제1 양태에서, 본원에 개시된 조성물은 대상에서 CXXC5-DVL 계면 - CXXC 핑거 단백질 5(CXXC5)와 디셔벌드(DVL) 사이의 계면 - 을 저해하는 적어도 하나의 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, CXXC5-DVL 계면을 저해하는 적어도 하나의 제제는 디셔벌드(DVL)의 PDZ 도메인 및/또는 DVL 결합 모티프에 결합하는 적어도 하나의 제제 및/또는 적어도 하나의 GSK3β 저해제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
제1 구체예는 식 I의 화합물을 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서, X는 선택적으로 R1으로 치환된 O 또는 N이고;
R1은 선택적으로 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 수소, 하이드록시, 알킬, 알케닐, 또는 알콕시이거나; 또는 R1은 부틸, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 수소, 알킬, 알케닐, 또는 알콕시이고;
R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 니트로, 할로겐, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시, 할로알콕시, 또는 카복시이다.
제2 구체예는 제1 구체예에 있어서, X가 O인 화합물을 포함한다.
제3 구체예는 제1 구체예에 있어서, X가 N이고 R1이 선택적으로 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 하이드록시 또는 알콕시인 화합물을 포함한다.
제4 구체예는 제1 내지 제3 구체예 중 어느 하나에 있어서, R1이 선택적으로 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 알콕시인 화합물을 포함한다.
제5 구체예는 제1 내지 제4 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 도 14, 도 15, 도 16, 표 6, 표 7, 및/또는 표 8에 개시된 화합물 중 어느 하나인 화합물을 포함한다.
제6 구체예는 제1 내지 제5 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00002
을 포함하는 적어도 하나의 화합물인 화합물을 포함한다.
제7 구체예는 식 II의 화합물을 포함한다:
Figure pct00003
상기 식에서, R6, R7, R8, R9, 및 R10은 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 할로알킬, 알콕시, 또는
Figure pct00004
이고;
R11은 각각 R12로 치환된, C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, N, 디이미드,
Figure pct00005
이거나; 또는
R11은
Figure pct00006
이고;
R12는
Figure pct00007
이고;
R13은 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 수소 또는 알킬이고;
각각의 R14, R15, 및 R16은 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이고;
X1, X2 및 X3은 독립적으로 탄소, 질소, 산소, 또는 황이다.
제8 구체예는 제7 구체예에 있어서, R11이, 각각 R12로 치환된 N 또는 디이미드인 화합물을 포함한다.
제9 구체예는 제7 내지 제8 구체예 중 어느 하나에 있어서, R11이
Figure pct00008
인 화합물을 포함한다.
제10 구체예는 제7 내지 제 9 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00009
인 화합물을 포함한다.
제11 구체예는 식 III의 화합물을 포함한다:
Figure pct00010
상기 식에서, 각각의 R17은 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이고;
X4 및 X5는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황이다.
제12 구체예는 제11 구체예에 있어서, 각각의 R17이 독립적으로 할로겐 또는 하이드록시인 화합물을 포함한다.
제13 구체예는 제11 내지 제 12 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00011
인 화합물을 포함한다.
제14 구체예는 식 IV의 화합물을 포함한다:
Figure pct00012
상기 식에서, 각각의 R18 및 R19는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이다.
제15 구체예는 제14 구체예에 있어서, R19가 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬인 화합물을 포함한다.
제16 구체예는 제14 내지 제 15 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물에 있어서, 각 R18가 독립적으로 수소, 하이드록시, 할로겐, 알콕시, 알킬, 알케닐, 또는 할로알킬인 것을 포함한다.
제17 구체예는 제14 내지 제16 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00013
인 화합물을 포함한다.
제18 구체예는 식 V의 화합물을 포함한다:
Figure pct00014
상기 식에서, 각각의 R' 및 각 R''는 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이다.
제19 구체예는 제18 구체예에 있어서, 각각의 R' 및 각 R''가 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알케닐, 알콕시, 또는 할로알킬인 화합물을 포함한다.
제20 구체예는 제18 내지 제 19 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00015
인 화합물을 포함한다.
제21 구체예는 식 VI의 화합물을 포함한다:
Figure pct00016
상기 식에서, 각각의 R20 및 각 R21은 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 또는 카보닐로 치환된 알킬, 여기서 카보닐은 선택적으로 수소, 할로겐, 알킬, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환됨; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이다.
제22 구체예는 제21 구체예에 있어서, 각각의 R20 및 각 R21이 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알케닐, 알콕시, 카보닐, 카복실, 또는 할로알킬인 화합물을 포함한다.
제23 구체예는 제21 내지 제 22 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00017
인 화합물을 포함한다.
제24 구체예는 제1 내지 제 23 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 CXXC5-DVL 계면, CXXC5와 DVL 사이의 상호작용, 및/또는 CXXC5 또는 CXXC5-DVL 계면의 활성을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 화합물을 포함한다.
제25 구체예는 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 DVL의 결합 자리에 대해 CXXC5와 직접 경쟁함으로써, DVL에 직접 결합함으로써, 및/또는 DVL의 PZD 도메인에 직접 결합함으로써 CXXC5와 DVL 사이의 상호작용을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 화합물을 포함한다.
제26 구체예는 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및 그것의 약학적으로 허용되는 수화물, 염, 대사물질, 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
제2 양태에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 임상적 상태를 치료하는 방법을 포함하며, 이 방법은 본원에 개시된 조성물 중 어느 것의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상은 성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태로부터 선택된 및/또는 이들을 포함하는 임상적 상태로 진단될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 조성물 중 어느 것의 복수의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
제27 구체예는 성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태를 치료하는 방법을 포함하며, 이 방법은 CXXC5-DVL 계면, CXXC5와 DVL 사이의 상호작용, 및/또는 CXXC5 및/또는 CXXC5-DVL 계면의 활성을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계; 및/또는 제1 내지 제 25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물을 포함하는 적어도 하나의 제제의 적어도 치료적 유효 용량을 투여하는 단계를 포함한다.
제28 구체예는 제27 구체예에 있어서, 대상에서 CXXC5의 상향조절된 발현을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법을 포함한다.
제29 구체예는 제27 내지 제 28 구체예 중 어느 하나에 있어서, 성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태에 대해 위험에 처한 대상을 확인하는 단계를 더 포함하는 방법을 포함한다.
제30 구체예는 제27 내지 제 29 구체예 중 어느 하나에 있어서, 성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태가 성장 장애, 사람 성장 호르몬 결핍, 쿠싱 증후군, 갑상선기능저하증, 영양성 저신장, 자궁내 성장지연, 러셀-실버 증후군, 불균형 저신장, 연골무형성증, 성장 관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증으로부터 선택된, 또는 이들을 포함하는 적어도 하나의 상태를 포함하는 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제31 구체예는 제27 내지 제30 구체예 중 어느 하나에 있어서, 대상이 비정상적 성장판 노화를 나타내는 적어도 하나의 방법을 포함한다. 이들 구체예와 관련하여, 비정상적 성장판 노화는 대상에서의 정상적인 성장판 노화보다 이른 노화 및/또는 대상에서의 치료-유도 성장판 노화를 포함한다.
제32 구체예는 제27 내지 제31 구체예 중 어느 하나에 있어서, 대상이 성장 장애 및/또는 성조숙증으로 진단된 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제33 구체예는 제27 내지 제32 구체예 중 어느 하나에 있어서, CXXC5-DVL 계면을 저해하고, CXXC5와 DVL 사이의 상호작용을 저해하고, 및/또는 CXXC5 및/또는 CXXC5-DVL의 활성을 저해하는 적어도 하나의 제제는 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물을 포함하는 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제34 구체예는 제33 구체예에 있어서, 상기 방법이 GSK3β 저해제 및/또는 Wnt/β-카테닌 경로 저해제를 포함하는 적어도 하나의 추가의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 투여하는 단계를 더 포함하는 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제35 구체예는 제27 내지 제34 구체예 중 어느 하나에 있어서, 대상이 사람 성인, 사람 아동, 및/또는 동물인 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제36 구체예는 제27 내지 제35 구체예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제제 및/또는 적어도 하나의 추가의 제제가 경구 또는 정맥내 투여되는 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제37 구체예는 제27 내지 제36 구체예 중 어느 하나에 있어서, 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물의 치료적 유효 용량이 약 5mg 내지 2000mg이고, 이 화합물 용량이 적어도 하루 1회 대상에게 투여되는 적어도 하나의 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물의 치료적 유효 용량은, 제한은 아니지만, 약 10mg 내지 1900mg; 약 15mg 내지 1800mg; 약 15mg 내지 1700mg; 약 20mg 내지 1600mg; 약 25mg 내지 1500mg; 약 30mg 내지 1000mg; 약 50mg 내지 1000mg; 약 50mg 내지 800mg; 약 100mg 내지 800mg; 약 300mg 내지 800mg; 약 500mg 내지 800mg; 약 5mg 내지 50mg; 약 1000mg 내지 1700mg; 약 1200mg 내지 1700mg; 약 1500mg 내지 1700mg; 약 10mg 내지 1000mg; 약 10mg 내지 30mg; 약 1500mg 내지 2000mg; 약 100mg 내지 200mg; 약 100mg 내지 150mg; 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 이들 구체예와 관련하여, 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물의 치료적 유효 용량은, 제한은 아니지만, 약 1mg/m2 내지 1500 mg/m2; 약 10 mg/m2 내지 1000 mg/m2; 약 20 mg/m2 내지 800 mg/m2; 약 10 mg/m2 내지 50 mg/m2; 약 800 mg/m2 내지 1200 mg/m2; 약 50 mg/m2 내지 500 mg/m2; 약 500 mg/m2 내지 1000 mg/m2; 약 80 mg/m2 내지 150 mg/m2; 약 80 mg/m2 내지 120 mg/m2; 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
제38 구체예는 제27 내지 제36 구체예 중 어느 하나에 있어서, 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물의 치료적 유효 용량이 약 0.01 mg 내지 200mg이고, 이 화합물 용량이 적어도 하루 1회 대상에게 투여되는 적어도 하나의 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물의 치료적 유효 용량은, 제한은 아니지만, 약 0.01mg 내지 150mg; 약 0.01mg 내지 100mg; 약 0.01mg 내지 80mg; 약 0.01mg 내지 60mg; 약 0.05mg 내지 100mg; 약 0.05mg 내지 80mg; 약 0.05mg 내지 50mg; 약 0.1mg 내지 100mg; 약 0.1mg 내지 50mg; 약 0.2mg 내지 100mg; 약 0.2mg 내지 50mg; 약 0.5mg 내지 100mg; 약 0.5mg 내지 50mg; 약 100mg 내지 200mg; 약 100mg 내지 150mg; 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 이들 구체예 중 일부에서, 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물의 치료적 유효 용량은, 제한은 아니지만, 약 0.01 mg/m2 내지 100 mg/m2; 약 0.01 mg/m2 내지 80 mg/m2; 약 0.01 mg/m2 내지 50 mg/m2; 약 0.01 mg/m2 내지 25 mg/m2; 약 0.05 mg/m2 내지 100 mg/m2; 약 0.05 mg/m2 내지 80 mg/m2; 약 0.05 mg/m2 내지 50 mg/m2; 약 80 mg/m2 내지 150 mg/m2; 약 80 mg/m2 내지 120 mg/m2; 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
제3 양태에서, 본 출원에 의해 제공된 방법은 치료적 섭생의 부작용을 감소 및/또는 억제하며, 이 방법은 대상에서 CXXC5-DVL 계면을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계; 및/또는 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물을 포함하는 적어도 하나의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고; 상기 대상은 성장호르몬 및/또는 성호르몬 요법, 수술적 치료, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 한 번의 치료적 섭생을 받았던 적이 있고, 치료적 섭생의 결과로서 적어도 한 차례의 부작용을 경험한 대상이다. 이들 구체예와 관련하여, 부작용은, 제한은 아니지만, 약물 내성, 재발, 염증, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
제39 구체예는 하나 이상의 성장-관련 질환 마커를 검출하는 방법을 포함하며, 이 방법은 성장-관련 질환 또는 상태를 가진다고 의심되는 대상으로부터 나온 혈액, 세포, 또는 조직의 샘플을 제공하는 단계; 및 샘플에서 하나 이상의 마커의 상향조절을 검출하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 마커는 에스트로겐 및/또는 CXXC5를 포함한다.
제40 구체예는 제39 구체예에 있어서, 성장-관련 질환이 성장 장애, 사람 성장 호르몬 결핍, 쿠싱 증후군, 갑상선기능저하증, 영양성 저신장, 자궁내 성장지연, 러셀-실버 증후군, 불균형 저신장, 연골무형성증, 성장 관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증으로부터 선택된, 또는 이들을 포함하는 적어도 하나의 상태를 포함하는 방법을 포함한다. 이들 구체예와 관련하여, CXXC5는 성장 관련 질환을 갖지 않는다고 알려진 정상적인 대상과 비교하여, 해당 대상의 성장판에서 적어도 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 및/또는 약 1000%, 또는 이들의 임의의 조합만큼 과발현되고; 및/또는 CXXC5는 성장 관련 질환을 갖지 않는다고 알려진 정상적인 대상과 비교하여, 해당 대상의 성장판에서 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 50배, 및/또는 약 100배, 또는 이들의 임의의 조합만큼 과발현된다.
제41 구체예는 제39 내지 제40 구체예에 있어서, 제27 내지 제38 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 방법을 사용하여 대상을 치료하는 단계를 더 포함하는 적어도 하나의 방법을 포함한다.
제42 구체예는 CXXC5의 활성을 억제하는 방법을 포함하며, 이 방법은 제1 내지 제27 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염, 또는 그것의 대사물질의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 제공하는 단계를 포함한다.
제43 구체예는 제42 구체예에 있어서, 대상이 사람, 동물, 세포, 및/또는 조직을 포함하는 방법을 포함한다. 이 구체예와 관련하여, 세포는 골선조(또는 골형성) 세포를 포함하는 적어도 하나의 타입의 세포를 포함한다.
제44 구체예는 본원에 개시된 전술한 방법 중 어느 하나를 수행하기 위한 키트를 포함한다. 키트의 구성요소는, 제한은 아니지만, 하나 이상의 본원에 개시된 제제/조성물, 시약, 용기, 장치 및/또는 키트 사용 설명서를 포함한다.
제45 구체예는 제44 구체예에 있어서, 하나 이상의 제제/조성물은 제1 내지 제25 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제26 구체예에 따른 적어도 하나의 조성물을 포함하는 키트를 포함한다.
제46 구체예는 대상에서 성장 관련 질환의 존재를 결정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 기준값과 비교하여 상승된 CXXC5 유전자의 발현 수준 및/또는 CXXC5 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함한다.
제47 구체예는 제46 구체예에 있어서, 성장 관련 질환이 성장 장애, 사람 성장 호르몬 결핍, 쿠싱 증후군, 갑상선기능저하증, 영양성 저신장, 자궁내 성장지연, 러셀-실버 증후군, 불균형 저신장, 연골무형성증, 성장 관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증으로부터 선택된, 또는 이들을 포함하는 적어도 하나의 상태를 포함하고; 성장 관련 질환이 성장 관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증으로부터 선택된, 또는 이들을 포함하는 적어도 하나의 상태를 포함하고; 및/또는 성장 관련 질환이 성조숙증을 포함하는 방법을 포함한다.
제48 구체예는 제46 내지 제47 구체예 중 어느 하나에 있어서, 기준값은 성장 관련 질환을 갖지 않는다고 알려진 정상적인 대상에서의 CXXC5 유전자의 발현 수준 또는 CXXC5 단백질의 발현 수준인 방법을 포함한다.
제49 구체예는 제46 내지 제48 구체예 중 어느 하나에 있어서, CXXC5 유전자의 발현 수준 또는 CXXC5 단백질의 발현 수준이 대상, 대상의 성장판, 및/또는 대상의 성장판의 연골세포에서 상승되는 방법을 포함한다.
제50 구체예는 제46 내지 제49 구체예 중 어느 하나에 있어서, CXXC5 유전자의 발현 수준 또는 CXXC5 단백질의 발현 수준이 기준값과 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 및/또는 약 1000%, 또는 이들의 임의의 조합만큼 상승되고; 및/또는 XXC5 유전자의 발현 수준 또는 CXXC5 단백질의 발현 수준이 기준값과 비교하여 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 50배, 및/또는 약 100배, 또는 이들의 임의의 조합만큼 상승되는 방법을 포함한다.
제51 구체예는 제46 내지 제50 구체예 중 어느 하나에 있어서, 제27 내지 제38 구체예 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 방법을 사용하여 대상을 치료하는 단계를 더 포함하는 방법을 포함한다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 특정 구체예를 더 증명하기 위해 포함된다. 일부 구체예는 이들 도면 중 하나 이상을 단독으로 참조하거나 또는 제시된 특정한 구체예들의 상세한 설명과 조합하여 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1A. Wnt/β-카테닌 신호화-활성화된 유전자 시그니쳐에 대한 3- 및 12-주령 래트(GEO: GSE16981)에서의 성장판의 증식 구역으로부터의 마이크로어레이 트랜스크립톰 데이터의 유전자 세트 부화 분석(GSEA)을 나타내는 그래프(상부, MSigDB: M11722 및 하부, MSigDB: M2680)(n=5). NES, 정규화된 부화 점수; ES, 부화 점수; FDR, 오류 발견률.
도 1B. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 래트 성장판(GEO: GSE16981)에서의 Cxxc5 의 상대적 발현 변화를 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=5, *P < 0.05 및 **P < 0.005 vs. 3-주령).
도 1C. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 마우스의 근위경골의 성장판에서의 Cxxc5 및 Runx2의 상대적 mRNA 발현의 qRT-PCR 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, ### P < 0.0005 및 *P < 0.05 vs. 3-주령).
도 1D. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 마우스의 근위경골의 성장판에서 나타낸 단백질의 발현을 나타내는 이뮤노블롯 분석.
도 1E. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 마우스의 근위 경골의 성장판에서 나타낸 단백질의 발현을 나타내는 면역조직화학 분석(좌) 및 정량 분석(평균±s.e.m., n=3, * 또는 # P < 0.05, 및 **P < 0.005 vs. 3-주령)(우). 스케일 바, 50μm.
도 1F. pEGFP-N1 또는 GFP-CXXC5로 트랜스펙션 후 48시간 동안 50 ng/ml 재조합 WNT3A와 함께 알기네이트 비드에서 배양된 ATDC5 세포에서의 Wnt/β 카네닌 경로-표적 유전자 및 연골형성 분화 마커의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCR 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05 및 **P < 0.005).
도 2A. 0, 1, 3, 6, 24, 48, 또는 72시간 동안 100nM E2(17β 에스트라디올)로 처리된 C28/I2 세포에서 나타낸 단백질의 발현을 나타내는 이뮤노블롯팅(위) 및 정량 분석(평균±s.e.m., n=3)(아래).
도 2B. 40시간 동안 100nM E2로 처리된 C28/I2 세포에서 나타낸 단백질의 발현을 나타내는 면역세포화학 염색(좌) 및 형광 강도의 정량 분석(평균±s.e.m., n=3, **P < 0.005 및 ***P < 0.0005)(우). 스케일 바, 100μm.
도 2C. 제6일의 대표 이미지(좌) 및 성장 변화의 정량 분석(평균±s.e.m., n=5, ***P < 0.0005)(우). 스케일 바, 1mm. 6일 동안 100nM E2와 함께 인큐베이션된 경골 조직 배양물(E15.5).
도 2D. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(좌) 및 성장판에서 각 구역 높이의 정량화(평균±s.e.m., n=5, *P < 0.05 및 **P < 0.005)(우). RZ, 휴지 구역; PZ, 증식 구역; HZ, 비대 구역. 스케일 바, 200μm. 6일 동안 100nM E2와 함께 인큐베이션된 경골 조직 배양물(E15.5).
도 2E. β-카테닌 및 CXXC5의 면역조직화학 분석. 스케일 바, 50μm. 6일 동안 100nM E2와 함께 인큐베이션된 경골 조직 배양물(E15.5).
도 2F. H&E 염색의 대표 이미지 및 근위경골의 성장판에서의 BrdU, β-카테닌, 및 CXXC5에 대한 면역조직화학 분석. 3-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스가 3주 동안 주 1회 근육내(i.m.) 주사에 의해 E2 시피오네이트(70 μg/kg)로 치료되었다(n = 3~4). 점선 내의 영역은 성장판 구역을 나타낸다. 스케일 바, 50μm.
도 3A. 12-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스의 경골의 대표 방사선사진.
도 3B. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스의 경골 길이를 나타내는 그래프(평균±s.e.m., 그룹당 n=4~10 마우스, ***P < 0.0005).
도 3C. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스의 근위경골의 성장판의 H&E 염색.
도 3D. 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스의 근위경골의 성장판에서의 각 구역 높이의 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=5, *P < 0.05, **P < 0.005, 및 ***P < 0.0005).
도 3E. 9- 및 12-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스의 성장판에서의 칼럼당 세포수의 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=5, **P < 0.005).
도 3F. 11-주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스의 근위경골 성장판에서 나타낸 단백질의 발현 또는 Runx2에 대한 인시튜 혼성화를 나타내는 면역조직화학 분석.
도 3G. 9-주령 마우스의 근위경골의 성장판에서의 Wnt-표적 유전자 및 연골형성 마커의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCT 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05, **P < 0.005, 및 ***P < 0.0005).
도 3H. 생체내 형광 이미지는 치료된 마우스(H)에서 PTD-DBMP의 존재를 나타낸다. PTD-DBMP(1 mg/kg)가 2주 동안 복강내(i.p.) 주사에 의해 매일 7주령 마우스에게 투여되었다(n=3). 흰색 화살표머리는 경골의 성장판 영역을 나타낸다.
도 3I. 근위경골의 성장판에서의 β-카테닌 및 RUNX2에 대한 면역조직화학 분석을 나타내는 H&E 염색.
도 3J. 성장판의 RZ, PZ, 및 HZ에서의 세포수의 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05 및 **P < 0.005). 스케일 바, 50μm.
도 4A. KY19382의 화학 구조.
도 4B. CXXC5-DVL 상호작용에 대한 KY19382의 효과를 분석하기 위한 시험관내 결합 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3). IC50 값은 용량-반응 곡선으로부터 결정되었다.
도 4C. GSK3β의 키나아제 활성에 대한 KY19382의 효과를 분석하기 위한 시험관내 키나아제 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3). IC50 값은 용량-반응 곡선으로부터 결정되었다.
도 4D. 18시간 동안 지시된 농도의 KY19382와 함께 성장된 HEK293 리포터 세포에서의 TOPFlash 활성의 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=4, **P < 0.005 및 ***P < 0.0005 vs. DMSO-처리된 대조군).
도 4E. 24시간 동안 I3O 또는 KY19382로 처리된 ATDC5 세포에서 나타낸 단백질의 발현을 나타내는 이뮤노블롯 분석.
도 4F. pCMV-FLAG-DVL1 및 pcDNA3.1-CXXC5-Myc로 트랜스펙션 후 4시간 동안 0.1μM KY19382로 처리된 ATDC5 세포에서의 항-Myc로 면역침전된 전 세포 용해액의 이뮤노블롯 분석.
도 4G. 48시간 동안 0.1μM KY19382로 처리된 ATDC5 세포에서의 β-카테닌 수준에 대한 효과를 나타내는 면역세포화학 염색(좌) 및 정량 분석(평균±s.e.m., n = 3, **P < 0.005)(우). 스케일 바, 100μm.
도 5A. 지시된 항체를 사용한 면역조직화학 분석을 나타내는 H&E 염색. KY-19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 7-주령 마우스에게 투여되었다(n=7). 스케일 바, 50μm.
도 5B. 근위경골의 성장판에서의 휴지 구역 및 증식 구역(RZ&PZ) 및 비대 구역(HZ)의 칼럼당 세포수에 대한 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=7, ***P < 0.0005). KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 7-주령 마우스에게 투여되었다(n=7).
도 5C. 성장판에서의 BrdU-양성 세포의 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=5, ***P < 0.0005). KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 7-주령 마우스에게 투여되었다(n=7).
도 5D. 연골/뼈 계면 250μm를 따라 있는 TRAP-양성 포커스의 수에 대한 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05). KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 7-주령 마우스에게 투여되었다(n=7).
도 5E. KY19382로 치료된 마우스의 근위경골의 성장판에서 나타낸 단백질의 발현을 나타내는 이뮤노블롯 분석. KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 7-주령 마우스에게 투여되었다(n=7).
도 5F. KY19382로 처리된 근위경골의 성장판에서의 TRAP 염색(A, F). TRAP, 타르트레이트-저항성 산 포스파타아제. KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 3-주령 마우스에게 투여되었다(n=7). 스케일 바, 50μm.
도 5G. 근위경골의 성장판에서의 휴지 구역 및 증식 구역(RZ&PZ) 및 비대 구역(HZ)의 높이에 대한 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=7, ***P < 0.0005). KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 3-주령 마우스에게 투여되었다(n=7).
도 5H. 성장판에서의 BrdU-양성 세포의 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=5, ***P < 0.0005). KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 3-주령 마우스에게 투여되었다(n=7).
도 5I. 연골/뼈 계면 250μm를 따라 있는 TRAP-양성 포커스의 수에 대한 정량 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05). KY19382(0.1 mg/kg)가 2주 동안 복강내 주사에 의해 매일 3-주령 마우스에게 투여되었다(n=7). n.s., 유의성 없음.
도 5J. 대표 방사선사진이 도시되었고(좌), 경골 길이가 측정되었다(우)(평균±s.e.m., n=7~15, ***P < 0.0005). 점선 내의 영역은 성장판 구역을 나타낸다. 3-주령 마우스에게 10주 동안 매일 KY19382(0.1 mg/kg)이 복강내 주사되었다.
도 6A. 성장판 노화에서의 CXXC5의 역할에 대한 제안된 모델을 나타내는 모식도. 사춘기가 진행되면서 성적 성숙 동안 증가하는 에스트로겐이 CXXC5 발현을 유도하여, DVL 결합을 통해 Wnt/β-카테닌 경로를 저해하며, 그 결과 성장판 노화가 일어난다.
도 6B. 길이방향 뼈 성장의 자극을 위한 KY19382의 작동 모델을 나타내는 모식도. Wnt/β-카테닌 신호화를 활성화할 때 KY19382는 1) GSK3β의 비활성화 및 2) CXXC5-DVL 상호작용의 저해에 의해 이중-표적화 화합물로서 기능하며, 이것은 성장판 노화의 지연 및 길이방향 뼈 성장의 촉진을 가져온다. PPI, 단백질-단백질 상호작용.
도 7A. 마이크로어레이 데이터(GEO: GSE9160)로부터의 사춘기 동안 사람의 성장판에서의 CXXC5 및 CXXC4의 상대적 mRNA 발현의 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=2, *P < 0.05 및 **P < 0.005).
도 7B. 마이크로어레이 데이터(GEO: GSE16981)로부터의 사춘기 동안 래트의 성장판에서의 CXXC5 및 CXXC4의 상대적 mRNA 발현의 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=5, ***P < 0.0005).
도 8. 소분자의 스크리닝 결과를 나타내는 그래프. CXXC5-DVL 상호작용의 억제제를 확인하기 위해 시험관내 결합 분석이 2,280개 화합물(30μM)에 대해 수행되었다. 결합값은 DMSO-처리된 대조군에 대해 정규화된 형광 강도의 퍼센트 비에 의해 계산되었다.
도 9A. DVL PDZ(PDB: 2KAW) 상에서 도킹된 BIO 또는 I3O의 결합 방식을 나타내는 다이어그램이 스틱 모델로서 도시된다. BIO-DVL PDZ 복합체의 구조 시뮬레이션은 잔기 F261, I262, I264, I266, L321, 및 V325가 BIO와의 결합에 연루된다는 것을 나타낸다: 비결합 상호작용(F261, I262, I266, L321, 및 V325) 및 수소 결합(I264).
도 9B. I3O-DVL PDZ 복합체의 구조 시뮬레이션을 나타내는 다이어그램은 잔기 H260, I262, 및 V325가 I30과의 결합에 연루된다는 것을 드러냈다: 비결합 상호작용(I262 및 V325) 및 수소 결합(H260)(B). BE, 결합 에너지.
도 10A. Wnt/β-카테닌 신호화의 활성화를 위한 인디루빈 유도체의 포커스드 디자인을 나타내는 모식도는 인디루빈 백본의 R1 및 R2 자리에서 작용기의 변형이 적용되었다. 합성된 유도체는 다음의 3가지 방식으로 분석되었다: (1) 시험관내 CXXC5-DVL 결합 분석, (2) 시험관내 GSK3β 키나아제 분석, 및 (3) TOPFlash Wnt 리포터 분석.
도 10B. DVL PDZ(PDB: 2KAW) 상에서 도킹된 KY19382의 결합 방식을 나타내는 다이어그램이 스틱 모델로서 도시된다(좌). KY19382-DVL PDZ의 구조-기반 약물작용발생단 특징부에서(청록색, 소수성; 녹색, 수소 결합 어셉터; 자주색, 수소 결합 도너), DVL PDZ의 정전기적 표면은 양으로 하전된 상태는 청색으로, 음으로 하전된 상태는 적색으로, 중성 잔기는 흰색으로 도시된다(우). 이 모델은 DVL PDZ 잔기 G263, I264, I266, L321, R322, 및 V325가 KY19382와의 결합에 연루된다는 것을 나타냈다: 비결합 상호작용(I266, L321, R322, 및 V325) 및 수소 결합(G263, I264 및 V325). BE, 결합 에너지.
도 11A. 연골세포 증식 및 분화에 대한 KY19382의 효과를 나타내는 면역형광 염색. 0.01 또는 0.1μM 농도의 KY19382로 처리된 ATDC5 세포가 48시간 동안 인큐베이션된 후 12시간 동안 50μM BrdU로 처리되고 수집되었다. BrdU 통합이 특이적 BrdU 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 시각화되었다(좌). BrdU-양성 세포가 정량되었다(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05 및 ***P < 0.0005)(우). 스케일 바, 100μm.
도 11B. 대조군 siRNA 또는 Ctnnb1 siRNA로 트랜스펙션 후 3-차원 알기네이트 비드에서 3일 동안 0.1μM KY19382와 함께 인큐베이션된 ATDC5 세포에서의 연골형성 분화 마커의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCR 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n = 3, *P < 0.05, **P < 0.005, 및 ***P < 0.0005).
도 11C. 3-차원 알기네이트 비드에서 3일 동안 1μM KY19382와 함께 인큐베이션된 C28/I2 세포에서의 연골형성 분화 마커의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCR 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05 및 ***P < 0.0005).
도 12. 4시간 동안 0.01, 또는 0.1μM 농도의 KY19382로 처리된 ATDC5 세포에서의 경로-특이적 표적 유전자의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCR 분석을 나타내는 그래프(평균±s.e.m., n=3, *P < 0.05 및 **P < 0.005 vs. DMSO-처리된 대조군). n.s., DMSO-처리된 대조군에 비해 유의성 없음.
도 13A. 관절연골에 대한 KY19382의 효과를 나타내는 H&E 염색. 스케일 바, 100μm.
도 13B. 간 조직에 대한 KY19382의 효과를 나타내는 H&E 염색. 스케일 바, 100μm.
도 13C. 체중에 대한 KY19382의 효과를 나타내는 그래프. 치료 동안 마우스의 체중이 5 내지 7일 마다 측정되었다(평균±s.e.m., n=7~15). n.s., 비히클(대조군)에 비해 유의성 없음.
도 14. 본원에 개시된 인디루빈 유사체의 예들의 화학 구조.
도 15. 본원에 개시된 인디루빈 유사체의 예들의 화학 구조.
도 16. 본원에 개시된 인디루빈 유사체의 예들의 화학 구조.
서열의 간단한 설명
SEQ ID NO. 1. AUUACAAUCCGGUUGUGAACGUCCC
SEQ ID NO. 2. GGGACGUUCACAACCGGAUUGUAAU
SEQ ID NO. 3. UAAUGAAGGCGAACGGCAUUCUGGG
SEQ ID NO. 4. CCCAGAAUGCCGUUCGCCUUCAUUA
SEQ ID NO. 5. AGAGCTACGAGCTGCCTGAC
SEQ ID NO. 6. AGCACTGTGTTGGCGTACA
SEQ ID NO. 7. TGGAAAGCCTGGTGATGATGGTG
SEQ ID NO. 8. TGACCTTTGACACCAGGAAGGC
SEQ ID NO. 9. GAAGACCTCCAGTTTGCAGAGC
SEQ ID NO. 10. TTCAGGATTCCCGCGAGATTTG
SEQ ID NO. 11. CACCTTGACCATAACCGTCTTCAC
SEQ ID NO. 12. CATCAAGCTTCTGTCTGTGCCTTC
SEQ ID NO. 13. AGGGCAGAATCATCACGAAGTGG
SEQ ID NO. 14. GTCTCGATTGGATGGCAGTAGC
SEQ ID NO. 15. GGATGCAGAAGGAGATTACT
SEQ ID NO. 16. CCGATCCCACACAGAGTACTT
SEQ ID NO. 17. GGGACTGGTACTCGGATAAC
SEQ ID NO. 18. CTGATATGCGATGTCCTTGC
SEQ ID NO. 19. GCCTGTCTGCTTCTTGTAA
SEQ ID NO. 20. TGCGGTTGGAAAGTGTTT
SEQ ID NO. 21. TCCACTCGTCCTTCTCAG
SEQ ID NO. 22. TTTAGCCTACCTCCAAATGC
SEQ ID NO. 23. ACAAGCCACAAGATTACAAGAA
SEQ ID NO. 24. GCACCAATATCAAGTCCAAGA
SEQ ID NO. 25. ACCCAGAAGACTGTGGATGG
SEQ ID NO. 26. GGATGCAGGGATGATGTTCT
SEQ ID NO. 27. TGAAGTCTCAGAAGGTGGAT
SEQ ID NO. 28. ATGGCAGAAATAGGCTTTGT
SEQ ID NO. 29. TAAGACACAGCAAGCCAGA
SEQ ID NO. 30. CACATCAGTAAGCACCAAGT
SEQ ID NO. 31. AAGGACAGAGTCAGATTACAGA
SEQ ID NO. 32. GTGGTGGAGTGGATGGAT
SEQ ID NO. 33. AACTGGAAACCTGTCTCTCT
SEQ ID NO. 34. ACAACACACGCACACATC
SEQ ID NO. 35. TTATTTATTGGTGCTACTGTTTATCC
SEQ ID NO. 36. TCTGTATTTCTTTGTTGCTGTTT
SEQ ID NO. 37. YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(p) EDEEE
정의
"약"은 ±10%의 값의 범위를 말하며, 예를 들어 약 1.0은 0.9 내지 1.1의 값을 포함한다.
"CXXC5-DVL 계면"은 CXXC5(CXXC 핑거 단백질 5)와 DVL(디셔벌드) 사이의 상호작용 및/또는 회합을 말하며, 이것은 당업계에 알려진 생물학적 활성들을 유도할 수 있다. 상호작용 및/또는 회합은 대상 내에서 CXXC5-DVL 경로를 활성화할 수 있는 물리적 또는 화학적 상호작용일 수 있다. CXXC5-DVL 계면은 복합체의 형태로 존재할 수 있다.
"성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태"는, 제한은 아니지만, 성장 장애, 사람 성장 호르몬 결핍, 쿠싱 증후군, 갑상선기능저하증, 영양성 저신장, 자궁내 성장지연, 러셀-실버 증후군, 불균형 저신장, 연골무형성증, 성장-관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증을 포함할 수 있다.
"CXXC5-DVL 계면 저해제"는 CXXC5-DVL 계면의 기능 및/또는 활성을 변경하거나 또는 CXXC5-DVL 계면의 입체형태적 변화를 유도하는 제제를 말한다. CXXC5-DVL 계면 저해제의 예들은, 제한은 아니지만, CXXC5와 CVL 사이의 회합/해리를 변경하는 제제 및/또는 CXXC5-DVL 복합체 조립/기능을 저해하는 제제를 포함한다.
"약학적으로 허용됨"은 포유류 및/또는 동물, 더 구체적으로 사람에게 사용하기 위해 미국 FDA나 EMA와 같은 정부 규제당국에 의해 승인됨 또는 승인가능함, 또는 미국 약전이나 다른 일반적으로 인정된 약전에 등록됨을 말한다.
"약학적으로 허용되는 비히클" 또는 "약학적으로 허용되는 담체"는 달리 언급되거나 내포된 의미가 없다면, 제제에 포함될 수 있는 활성 성분(들) 이외의 다른 임의의 성분을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 담체는 투여 방식, 용해성 및 안정성에 대한 담체의 효과, 및 제형의 성질과 같은 요인들을 고려하여 선택한다.
"약학적 조성물"은 CXXC5-DVL 계면 저해제 또는 GSKβ 저해제, 및 CXXC5-DVL 계면 저해제 및/또는 GSKβ 저해제와 함께 대상에 투여되는 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 비히클/담체를 포함한다.
"대상"은 사람(성인 및/또는 아동), 동물, 가축, 세포, 및/또는 조직을 말한다.
"치료적 유효량"은 질환, 또는 질환의 임상적 증상 중 적어도 하나를 치료하기 위해 대상에게 투여되었을 때 해당 질환 또는 그것의 증상의 치료에 영향을 미치기에 충분한 CXXC5-DVL 계면 저해제 또는 GSKβ 저해제의 양을 말한다. 예를 들어 CXXC5-DVL 계면 저해제, GSKβ 저해제의 "치료적 유효량"은 질환 및/또는 질환의 증상, 질환 및/또는 질환 또는 장애의 증상의 중증도, 연령, 체중, 및/또는 치료될 대상의 건강상태, 및 주치의의 판단에 따라 다양할 수 있다.
"치료적 유효 용량"은 대상의 질환 또는 장애에 대해 효과적인 치료가 가능한 용량을 말한다. 치료적 유효 용량은 화합물에 따라, 및 대상에 따라 다양할 수 있고, 대상의 상태 및 송달 경로와 같은 요인들에 의존할 수 있다.
"치료적 양생(들)" 및/또는 "치료적 섭생(들)"은, 제한은 아니지만, 성장호르몬 요법, 성호르몬 요법, 및/또는 수술을 포함한다.
임의의 질환에 대한 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 질환의 임상적 증상 중 적어도 하나의 전도, 완화, 정지, 또는 개선, 질환 또는 질환의 임상적 증상 중 적어도 하나를 얻을 위험의 감소, 질환 또는 질환의 임상적 증상 중 적어도 하나의 진행의 저해, 또는 질환 또는 질환의 임상적 증상 중 적어도 하나의 발생 위험의 감소를 말한다. 일부 구체예에서, "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환을 신체적으로(예를 들어, 인지가능한 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어, 신체적 변수의 안정화), 또는 둘 다의 방식으로 저해하는 것, 및 대상에서 인지될 수 있거나 또는 인지될 수 없는 적어도 하나의 신체적 변수를 저해하는 것을 말한다. 특정 구체예에서, "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 대상이 질환의 증상을 아직 경험하지 않거나 나타내지 않았음에도 불구하고 질환에 노출될 수 있거나 그것에 대한 소인이 있을 수 있는 대상에서 질환 또는 그것의 적어도 하나 이상의 증상의 개시를 지연시키는 것을 말한다.
상세한 설명
본 발명의 원리에 대한 이해를 촉진하기 위해, 바람직한 구체예를 참조하며, 구체적인 언어가 본 발명을 설명하기 위해 사용된다. 본 발명의 범위에 대한 어떤 제한도 의도되지 않으며, 본 발명의 변경, 변형, 및 추가 적용은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 통상적으로 일어날 수 있는 것으로서 고려되고, 본 발명 및 청구항의 범위 내에 들어간다.
종골 성장은 태아 발육기 및 유아기 동안 빠르게 일어나지만, 이후 점차 느려지고 성장판 노화와 함께 사춘기 끝 무렵에는 결국 중지된다.
성장판 노화를 조절하는 메커니즘은 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 최근 몇년 동안 기본적인 임상 연구로부터 축적된 증거는 연골세포 활성 및 상태가 성장판 내에서의 파라크린 신호화에 의해 직접 조절된다는 것을 밝혔다. 또한, Wnt/β-카테닌 신호화가 성장판 성숙, 및 주로 뼈 성장을 저해시키는 Wnt/β-카테닌 신호화의 조절에 연루된 유전자의 돌연변이에서 핵심 요인으로서 대두되었다. 예를 들어, β-카테닌을 암호화하는 Ctnnb1의 연골-특이적 손실은 길이방향 뼈 성장을 저해한다. 추가로, β-카테닌을 탈안정화하는 세린/트레오닌 키나아제인 글리코겐 신타아제 키나아제 3β(GSK3β)의 저해제에 의한 치료는 생체외 배양 시스템에서 경골 신장을 가져왔다. 또한, 게놈-차원 연관 연구에서의 대규모 메타 분석은 성인 신장의 통상적 변이에 기여하는 423개의 유전자좌를 확인했고, AXIN2, WNT4 및 CTNNB1과 같은 Wnt/β-카테닌 경로에 연루된 유전자를 발견했다.
CXXC 핑거 단백질 5(CXXC5)는 Wnt/β-카테닌 신호화의 음성 조절제이며, 세포질에서의 디셔벌드(DVL)의 PDZ 도메인과의 상호작용을 통해 기능한다. CXXC5-DVL 상호작용의 저해는 Wnt/β-카테닌 신호화의 활성화로 인한 골다공증, 피부 상처, 및 탈모를 포함하는 Wnt/β-카테닌 신호화를 수반하는 몇몇 병태생리적 표현형을 개선했다.
본 발명에서, CXXC5 발현이 성장판 노화를 겪고 있는 연골세포에서 점차 증가된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 사춘기 동안 상승되는 성호르몬인 에스트로겐이 CXXC5 발현을 유도했고, 이후 연골세포에서 β-카테닌을 감소시켰다. Cxxc5 -/- 마우스는 후기 사춘기 동안 성장판에서 증진된 연골세포 증식 및 분화를 나타냈고, 성체에서는 더 긴 경골을 나타냈다. 본원에 개시된 결과는 CXXC5가 사춘기때 성장판 노화에 기여한다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명은 대상에서 뼈 성장의 하향조절을 초래할 수 있는 CXXC5-DVL 계면의 신규 기능을 제공한다.
본 발명은 특히, 예를 들어 성장판 노화를 겪고 있는 연골세포에서, Wnt/β-카테닌 경로에 부정적인 영향을 미친다고 생각되는 CXXC5-DVL 계면의 치료적 저해제를 개발하기 위한 개발 플랫폼을 제공한다. 일부 구체예에서, CXXC5-DVL 계면을 저해함으로써 Wnt/β-카테닌 경로를 활성화하는 소분자가 PTD-DBMP(단백질 형질도입 도메인 융합 DVL 결합 모티프 펩타이드)의 결합을 나타내는 형광 강도를 모니터링하는 시험관내 스크리닝 시스템을 사용하여 얻어지며, 이것은 DVL에 결합한 CXXC5의 서열을 함유하고, DVL의 PZD 도메인 위에서 FITC에 콘쥬게이트된다(예를 들어, Kim HY, et al(2016), Small molecule inhibitors of the Dishevelled-CXXC5 interaction are new drug candidates for bone anabolic osteoporosis therapy. EMBO Mol Med 8:375-387을 참조). 흥미롭게도, 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO) 및 인디루빈 3'-옥심(I3O)을 포함하는 몇몇 GSK3β 저해제가 초기 성공작으로서 확인되었다. 또한, 본 발명은 기능적으로 개선된, 그리고 새로 합성된 인디루빈 유도체 KY19382를 제공하며, 이것은 GSK3β 키나아제 활성과 상호작용을 둘 다 효과적으로 저해했다. 이들 기능은 GSK3β 효소 활성 및 시험관내 CXXC5-DVL 결합의 역학적 측정에 의해 각각 확인되었다. 따라서, KY19382는 (1) GSK3β의 저해에 의한 초기 활성화 및/또는 (2) CXXC5-DVL 상호작용의 방해에 의한 신호화의 증진 중 적어도 하나를 통해서 Wnt/β-카테닌 신호화를 효과적으로 활성화했다. 또한, KY19382는 연골세포의 증식 및 분화를 현저히 증진시켰고, 성장판 노화를 지연시킴으로써 청소년기에 해당하는 마우스에서 길이방향 경골 성장을 유도했다. 성장판 노화의 CXXC5-DVL 유도 메커니즘을 확인함으로서, 본 발명은 DVL 결합 모티프를 수반하는 CXXC5-DVL 계면과의 결합에 의한 CXXC5와 DVL의 특이적 상호작용의 저해제에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 플랫폼을 제공한다.
본원에 개시된 구체예들은 대상에서 성장 및/또는 이와 관련된 임상적 상태와 연관된 상태 및/또는 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 치료적 섭생의 부작용 억제에 관한 것이다. 다른 구체예는 성장 관련 질환으로 진단된 대상 또는 성장 장애, 사람 성장 호르몬 결핍, 쿠싱 증후군, 갑상선기능저하증, 영양성 저신장, 자궁내 성장지연, 러셀-실버 증후군, 불균형 저신장, 연골무형성증, 성장-관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증의 상태를 가진 대상을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 화합물 및/또는 조성물 중 어느 하나의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 임상적 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 대상은 성장-관련 질환 또는 이의 유사한 상태로부터 선택된 및/또는 이들을 포함하는 임상적 상태로 진단될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 화합물 및/또는 조성물 중 어느 하나의 복수의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 대상에서 CXXC5-DVL 계면을 저해하는 적어도 하나의 제제를 포함한다. 이들 구체예와 관련하여, CXXC5-DVL 계면을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 제제는 본원에 개시된 적어도 하나의 화합물을 포함한다. 일부 구체예에서, CXXC5-DVL 계면을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 제제는 CXXC5-DVL 계면의 입체형태를 물리적으로 및/또는 화학적으로 파괴할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명에 의해 제공된 약학적 조성물은 대상에의 적절한 투여를 위한 조성물을 제공하기 위해 하나 이상의 약학적으로 허용되는 비히클의 적합한 양과 함께, 본원에 개시된 하나 이상의 조성물의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 비히클은 당업계에 공지 되어있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은, 각각 정해진 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 샤세, 정제, 또는 로젠지와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 시럽, 엘릭시르 또는 물약(draught)과 같은 수성 액체 또는 비수 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 존재할 수 있다. 상기 조성물은 또한 볼루스, 연약(electuary) 또는 페이스트로서 존재할 수 있다. 정제는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 활성 성분을 압축 또는 성형함으로써 제조될 수 있다. 압축정은 적합한 기계에서 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을, 예를 들어 결합제, 비활성 희석제, 윤활제, 붕해제 및/또는 표면활성제와 혼합된 상태에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 주형정(moulded tablet)은 적합한 기계에서 비활성 액체 희석제로 보습된 분말상 활성 성분의 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 자국을 낼 수 있고, 활성 성분의 지연 방출 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 수성 및 비수 멸균 주사 용액을 포함하며, 또한 항산화제, 버퍼, 정균제 및 조성물을 수혜자의 혈액과 등장성으로 만드는 용액, 및 예를 들어 현탁제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비수 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 상기 용액은 단일 단위-용량 또는 다회-용량 용기에 존재할 수 있고, 사용 전에 멸균 액체 담체의 첨가가 필요한 동결건조된 상태로 보관될 수 있다.
약학적으로 허용되는 염은 포유류에서 사용하기에 안전하고 효과적이며 원하는 치료적 활성을 지닌 본 발명에 의해 제공된 화합물들의 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염은 본 발명에 의해 제공된 화합물들에 존재하는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 산 부가 염은, 제한은 아니지만, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함한다. 특정 화합물은 다양한 아미노산과 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적합한 염기 염은, 제한은 아니지만, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연, 및 디에탄올아민 염을 포함한다. 본원에 설명된 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 일부 약학적으로 허용되는 염에 대한 추가의 정보는 Berge, et al., 66 J. PHARM. SCI. 1-19 (1977), Haynes, et al, J. Pharma. Sci., Vol. 94, No. 10, Oct. 2005, pgs.　 2111-2120 등과 같은 문헌을 참조한다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 윤활제(들)를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 윤활제(들)는 약학적 조성물의 성분들이 뭉치는 것과 개시된 조성물을 생성하는 펠릿 프레스에 달라붙는 것을 방지한다. 또한, 윤활제(들)는 펠릿의 형성, 뿐만 아니라 펠릿 프레스로부터 펠릿의 사출이 조성물과 다이 프레스의 벽 사이에 마찰이 적은 상태에서 일어나는 것을 보장한다. 일부 구체예에서, 윤활제(들)는 가공 특징을 개선하기 위해, 예를 들어 조성물의 가요성 증가를 돕기 위해 약학적 조성물에 첨가되며, 이로써 파손이 감소된다.
개시된 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 윤활제의 종류는 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 윤활제는 활석, 실리카, 식물성 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 미네랄 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 식물성 오일, 아연 스테아레이트 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 윤활제는 스테아르산이다.
개시된 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 비히클의 종류는 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 바인더, 필러 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 아스코르브산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈 K-30(포비돈 K-30), 글리세릴 모노스테아레이트(GMS) 또는 글리세릴 모노스테아레이트 염, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 당, 덱스트란, 옥수수 녹말, 2염기성 인산칼슘, 2염기성 인산칼슘 2수화물, 황산칼슘, 인산2칼슘, 인산3칼슘, 락토오스, 미세결정질 셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 만니톨, 염화나트륨, 건조 녹말, 사전젤라틴화된 녹말, 압축가능한 당, 만니톨, 락토오스 일수화물, 녹말, 2염기성 인산칼슘 2수화물, 황산칼슘, 인산2칼슘, 인산3칼슘, 분말상 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 락토오스, 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 만노오스, 덱스트로오스, 갈락토오스, 상응하는 당 알코올 및 다른 당 알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 및 전술한 것들 중 어느 것의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 포비돈 K-30으로도 알려진 폴리비닐피롤리돈 K-30이다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 40,000의 평균 분자량을 가진, 포비돈 K-30으로도 알려진, 폴리비닐피롤리돈 K-30이다(CAS 9003-39-8). 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 글리세릴 모노스테아레이트(GMS) 또는 글리세릴 모노스테아레이트 염, 글리세릴 베헤네이트 및 글리세릴 팔미토스테아레이트로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 글리세릴 모노스테아레이트(GMS) 또는 글리세릴 모노스테아레이트 염이다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 글리세릴 베헤네이트이다. 일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 글리세릴 팔미토스테아레이트이다.
일부 구체예에서, 항산화제는 개시된 조성물의 나머지 성분들의 산화를 방지한다. 산화는, 예를 들어 멸균 동안 일어날 수 있으며, 이때 자유 라디칼이 생성된다. 항산화제, 또는 자유 라디칼 스캐빈저의 첨가는 산화를 유의하게 감소시키고, 대상에서 사용하기에 더욱 약학적으로 허용가능한 조성물을 만든다.
개시된 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 항산화제의 종류는 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 항산화제는 메틸 파라벤 및 그것의 염, 프로필 파라벤 및 그것의 염, 비타민 E, 비타민 E TPGS, 프로필 갈레이트, 아황산염, 아스코르브산(L-아스코르브산, 아스코르브산의 L-거울상이성질체, 비타민 C를 포함함), 나트륨 벤조에이트, 시트르산, 시클로덱스트린, 과산화물 스캐빈저, 벤조산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 그것의 염, 사슬 종결제(예를 들어, 티올 및 페놀), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
사용 또는 치료 방법
본원에 개시된 방법 및 조성물은 CXXC5-DVL 계면 및/또는 GSKβ의 제해제가 치료적 이익을 제공한다고 알려져 있거나 또는 치료적 이익의 제공이 추후 판명되는 질환, 장애, 상태, 및 증상으로 고통받는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 조성물 중 어느 것의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 임상적 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 대상은 성장 장애, 사람 성장 호르몬 결핍, 쿠싱 증후군, 갑상선기능저하증, 영양성 저신장, 자궁내 성장지연, 러셀-실버 증후군, 불균형 저신장, 연골무형성증, 성장 관련 장애, 영양실조 및 전신 질환, 뼈 장애, 및/또는 성조숙증, 및/또는 성장호르몬 요법 및/또는 수술적 치료와 연관된, 그것에 의해 유도된, 또는 그것에 대해 이미 내성인 임의의 다른 상태로부터 선택된 및/또는 이들을 포함하는 임상적 상태로 진단될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 조성물 중 어느 것의 적어도 하나의 추가의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물 중 어느 것의 적어도 하나의 치료적 유효 용량은 경구, 비경구, 정맥내, 흡입 및/또는 경피 방식으로 투여될 수 있다.
또 다른 구체예는 치료적 섭생의 부작용을 감소시키기 위한 방법을 포함할 수 있고, 이 방법은 대상에서 CXXC5-DVL 계면의 활성을 저해 또는 감소시키는 적어도 하나의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상은 수술, 성장 및/또는 성호르몬 요법을 포함하는 적어도 한 번의 치료적 섭생을 받았던 적이 있고, 치료적 섭생으로부터 유래된 적어도 한 차례의 부작용을 경험한 대상이다. 이들 구체예와 관련하여, 부작용은, 제한은 아니지만, 약물 내성 및/또는 재발을 포함할 수 있다.
키트
추가의 구체예에서, 본 발명에 의해 키트가 제공되며, 이러한 키트는 각 조성물이 용기 내에서 멸균된 하나 이상의 약학적 조성물, 대상에게 약학적 조성물을 투여하는 수단, 및 사용 설명서를 포함한다.
일부 구체예는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는 전형적으로 임상적 상태를 치료하기 위해 필요한 둘 이상의 구성요소를 포함한다. 키트의 구성요소는, 제한은 아니지만, 본원에 하나 이상의 개시된 제제/조성물, 시약, 용기, 장치 및/또는 키트 사용 설명서를 포함한다. 따라서, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 본원에 개시된 사전-포장된 키트를 활용함으로써 수행될 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 재료 및 방법 모두에 대한 많은 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
세포 배양 및 시약
마우스 연골형성 셀라인 ATDC6을 RIKEN Cell Bank에서 얻었다. 사람 청소년 늑골 연골세포 셀라인 C28/I2는 Dr. W. U. Kim(한국 카톨릭대학교)에 의해 제공되었다. HEK293-TOP 세포(염색체 통합된 TOPFlash 유전자를 함유하는 HEK293 세포)는 Dr. S. Oh(한국 국민대학교)에 의해 제공되었다. ATDC5 세포를 5% FBS(Gibco)로 보충된 DMEM/F12(1:1)(Gibco, 뉴욕 그랜드아일랜드)에 유지했다. 비대성 분화를 유도하기 위해, ATDC5 세포를 3일 동안 3차원 알기네이트 비드에서 인슐린-트랜스페린-나트륨 셀레나이트(ITS) 보충액(Gibco)과 함께 인큐베이션했다(예를 들어, Kawasaki Y. et al.(2008), Phosphorylation of GSK-3beta by cGMP-dependent protein kinase II promotes hypertrophic differentiation of murine chondrocytes. J Clin Invest 118: 2506-2515 참조). C28/I2 및 HEK293-TOP 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM(Gibco)에 유지했다. 모든 화학물질은 시험관내 연구를 위해 디메틸설폭사이드(DMSO; Sigma-Aldrich, 미주리 세인트루이스)에 용해했다. E2(17β-에스트라디올; Sigma-Aldrich) 치료를 위해, 세포를 24시간 동안 5% 챠콜-스트립된 FBS와 함께 페놀레드 무함유 DMEM/F12에서 배양했고, 이어서 24시간 동안 혈청 무함유 배지에서 배양한 후 실험했다. PTD-DBMP를 Peptide 2.0 Inc(버지니아 샹티이)에 의해 합성했다.
플라스미드, siRNA, 및 트랜스펙션
플라스미드 pcDNA3.1-CXXC5-Myc 및 GFP-CXXC5는 이미 설명되었다(Kim et al, 2015). pCMV-FLAG-DVL1은 Dr. E. H. Jho(한국 서울시립대학교)에 의해 제공되었다. 다음의 siRNA 서열이 ATDC5 세포에 대해 사용되었다:
Ctnnb1(β-카테닌 암호화) siRNA-1,
센스 AUUACAAUCCGGUUGUGAACGUCCC(SEQ ID NO. 1) 및
안티센스 GGGACGUUCACAACCGGAUUGUAAU(SEQ ID NO. 2),
Ctnnb1 siRNA-2,
센스 UAAUGAAGGCGAACGGCAUUCUGGG(SEQ ID NO. 3) 및
안티센스 CCCAGAAUGCCGUUCGCCUUCAUUA(SEQ ID NO. 4)
제조자의 설명서에 따라서, 리포펙타민(Invitrogen, 캘리포니아 칼스배드)을 플라스미드 트랜스펙션에 사용했고, RNAiMax(Invitrogen)를 siRNA 트랜스펙션에 사용했다.
동물
Cxxc5 -/- 마우스는 선행 연구에서 확립되었다(예를 들어, Kim H.Y. et al. (2015) CXXC5 is a negative-feedback regulator of the Wnt/beta-catenin pathway involved in osteoblast differentiation. Cell Death Differ 22:912-920 참조). 에스트로겐에 의한 성장판 노화를 조작하기 위해, 3주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 수컷 마우스에게 3주 동안 70 μg/kg 에스트라디올(E2) 시피오네이트(Sigma-Aldrich) 또는 비히클(면실유)을 주 1회 근육내(i.m.) 주사했다. 길이방향 뼈 성장에 대한 KY-19382 치료 효과를 조사하기 위해, C57BL/6 수컷 마우스를 KOATECH(한국 경기도)에서 구입했다. KY19382(0.1 mg/kg)를 2주 동안 3- 및 7-주령 마우스에게 또는 10주 동안 3-주령 마우스에게 복강내(i.p.) 주사에 의해 매일 투여했다. BrdU 표지화 실험을 위해, 죽이기 24시간 전에 마우스에게 50mg/kg BrdU(Sigma-Aldrich)를 복강내 주사했다. 모든 동물 실험 절차는 연세대학교(한국)의 동물실험위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 의해 승인되었고, 한국 식품의약청의 가이드라인에 기초하여 수행되었다.
방사선사진 및 조직화학 분석
엑스선 장치(KODAK DXS 4000 Pro SYSTEM; Carestream Health Rochester, 뉴욕)를 사용하여 단순 방사선사진을 촬영했다. 조직을 4% 파라포름알데하이드(PFA)에 고정하고, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회하고, 탈수하고, 파라핀에 담그고, 4μm 두께로 절편화했다(Leica Microsystems, 독일 베츨라). 조직 절편을 다시 수화시켰고, H&E, TRAP, 및 면역조직화학(IHC) 염색을 포함하는 추가 분석에 사용했다. IHC 염색을 수행하기 위해, 절편을 30분 동안 80℃에서 시트레이트 버퍼(pH 6.0)와 함께, 37℃에서 30분 동안 0.05% 트립신 작동 용액(pH 7.8)과 함께, 또는 37℃에서 15분 동안 0.5% 펩신(Sigma-Aldrich)과 함께 인큐베이션했다. 다음에, 절편을 실온에서 1시간 동안 5% 정상 염소 혈청(NGS; Vector Laboratories, 캘리포니아 벌링게임) 및 PBS 중의 0.3% 트리톤 x-100으로 차단했다. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색을 위해, 절편을 15분 동안 0.345% H2O2와 함께 인큐베이션했다. 절편을 마우스 1차 항체와 인큐베이션하기 전 마우스 IgG를 M.O.M 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 차단했다. 절편을 다음의 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다: 항-β-카테닌(BD Bioscience, 캘리포니아 새너제이, #610154; 1:50), 항-CXXC5(1:200; 랩 제조) 항-BrdU(DAKO, 캘리포니아 카핀테리아, M0744; 1:200), 항-COL2A1(ThermoFisherScientific, 매사츄세츠, PA5-11462; 1:100), 항-Ki67(Abcam, 영국 캠브릿지, ab15580; 1:200), 및 항-RUNX2(Abcam, ab23981; 1:200). 다음에, 절편을 비오틴화 항-마우스(Vector Laboratories, BA-9200; 1:200) 또는 비오틴화 항-토끼(Vector Laboratories, BA-1000; 1:200) 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 다음에, 아비딘-비오틴 복합체 용액(Vector Laboratories)에서 절편을 인큐베이션하고, DAB 키트(Vector Laboratories)로 3-30분 동안 염색하고, 메틸그린(Sigma-Aldrich)으로 반대염색했다. 모든 인큐베이션은 휴미드 챔버에서 수행되었다. 염색은 ECLIPSE TE2000-U 현미경(Nikon, 일본 도쿄)으로 관찰했다. 형광 염색을 위해, 절편을 4℃에서 하룻밤 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 1시간 동안 실온에서 항-마우스 Alexa Fluor 488(ThermoFisher Scientific, A11008; 1:200) 또는 항-토끼 Alex Fluor 555(ThermoFisher Scientific, A21428; 1:200) 2차 항체와 함께 인큐베이션했다. 다음에, 절편을 5분 동안 DAPI(Sigma-Aldrich)로 반대염색하고, Gel/Mount 배지(Biomeda Corporation)에 장착했다. 모든 인큐베이션은 어두운 휴미드 챔버에서 수행되었다. 형광 신호를 488nm(Alexa Fluor 488), 543nm(Alexa Fluor 555) 및 405nm(DAPI)의 여기 파장에서 LSM700 META 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc., 뉴욕 톤우드)를 사용하여 시각화했다.
면역세포화학
ATDC5 또는 C28/I2 세포를 12-웰 배양 플레이트의 유리 커버슬립 위에 파종했다. 세포를 PBS로 세척하고 15분 동안 실온에서 4% PFA로 고정시켰다. 15분 동안 0.1% 트리톤 X-100으로 투과화를 수행하고 1시간 동안 5% BSA로 차단한 후, 세포를 4℃에서 하룻밤 β-카테닌(1:100) 또는 CXXC5(1:200)에 대해 특이적인 1차 항체와 함께 인큐베이션했다. 세포를 PBS에서 세척하고 1시간 동안 실온에서 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 555 2차 항체(1:100)와 함께 인큐베이션했다. 세포 핵을 10분 동안 DAPI로 반대염색했고, 염색된 샘플을 405-, 488-, 또는 543-nm 여기 파장을 사용하여 LSM700 META 현미경으로 검사했다. BrdU 분석을 위해, 배양된 세포를 BrdU 용액(25μM)과 함께 하룻밤 인큐베이션한 후 BrdU에 대한 항체(1:100) 로 면역세포화학 염색을 수행했다.
이뮤노블롯 분석
세포를 빙냉 PBS로 세척했고, 조직을 액체 질소 중에서 막자사발과 막자로 분쇄한 후 RIPA 버퍼(150mM NaCl, 50mM Tris, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% 나트륨 데옥시콜레이트, 1mM EDTA, 프로테아제 저해제, 및 포스파타아제 저해제) 중에 세포용해했다. 단백질 샘플을 8-12% 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 분리하여 니트로셀룰로오스 막(Whatman)으로 옮겼다. 이뮤노블롯팅을 다음의 1차 항체로 수행했다: 항-β-카테닌(Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아 산타크루즈, CA, sc-7199; 1:3,000), 항-CXXC5(랩 제조; 1:200) 항-Myc 택(MBL, 일본 아이치, M192-3; 1:1,000), 항-FLAG(Sigma-Aldrich, F7425; 1:1,000), 항-p-GSK3β(S9; Cell Signaling Technology, 매사츄세츠 댄버스, 9336S; 1:1,000), 항-COL2A1(Santa Cruz Biotechnology, sc-28887; 1:500), 항-RUNX2(Abcam, ab23981; 1:500), 항-COL10A1(Cosmo Bio, LSL-LB-0092; 1:500), 항-MMP13(Santa Cruz Bio-technology, sc-30073; 1:500), 항-ERK(Santa Cruz Biotechnology, sc-94; 1:3,000) 및 항-α-튜불린(Cell Signaling Technology, 3873S; 1:20,000). 다음에, 샘플을 양고추냉이-퍼옥시다아제-콘쥬게이트 항-마우스(Cell Signaling Technology, 7076; 1:3,000), 항-토끼(Bio-Rad, 1706515; 1:3,000), 또는 항-염소(Santa Cruz Bio-technology; sc-2020; 1:3,000) 2차 항체와 함께 인큐베이션했다. 단백질 밴드를 발광 이미지 분석장치 LAS-3000(Fujifilm, 일본 도쿄)을 사용하여 증진된 화학발광(ECL; Amersham Bioscience, 뉴저지 피스카타웨이)에 의해 시각화했다. 이뮤노블롯 밴드를 Multi-Gauge V3.0 소프트웨어(Fujifilm)를 사용하여 분석했다. 이뮤노블롯으로부터 관심지점(POI)을 표시하고 밀도계를 사용하여 정량했고, 각각의 이뮤노블롯 신호로부터 바탕 신호를 차감했다. 대조군 단백질(α-튜불린 또는 ERK) 로딩에 대한 각 단백질의 강도 비로서 상대적 밀도계 값을 나타냈다.
면역침전
이미 설명된 대로 면역침전을 수행했다(Kim et al, 2015). 단백질-단백질 상호작용을 모니터링하기 위해, WCL 1mg을 16시간 동안 4℃에서 항-DVL1과 단백질 G 아가로오스 비드(GenDEPOT, 텍사스 케이티) 또는 항-Myc와 단백질 A 아가로오스 비드(GenDEPOT)와 함께 인큐베이션한 후, 비드를 RIPA 버퍼로 3번 세척했다. 얻어진 이뮨 복합체를 SDS-PAGE에 의해 분해하고 항체로 이뮤노블롯팅을 수행했다.
경골 기관 배양
마우스 제15.5일 배아(e15.5)로부터 경골을 분리하고, 아스코르브산, β-글리세로포스페이트, BSA, L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 페놀레드 무함유 α-MEM(Gibco)에서 6일 동안 배양했다(Gillespie et al, 2011). 절제 후 경골을 하룻밤 배지 중에서 인큐베이션한 후, E2(Sigma-Aldrich)로 처리했다. 배지와 시약은 48시간마다 교환했다. 경골 이미지를 SMZ-745T 현미경(Nikon)을 사용하여 캡쳐했다. 처리 전과 배양 6일 후에 경골 길이를 측정했다. 다음에, 파라핀 매립을 위한 샘플을 제조해서 절편으로 만들었고, H&E 및 IHC 염색에 의해 분석했다.
리포터 분석
HEK293-TOP 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 파종했다. 세포를 각 화합물로 나타낸 농도로 처리하고 18시간 동안 배양했다. 다음에, 세포를 수거하고, 제조자의 설명서에 따라서 리포터 세포용해 버퍼(Promega, 위스콘신 메디슨) 60μL에서 세포용해했다. 원심분리 후 상청액 20μL를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정했다. 상대적 루시페라아제 활성을 DMSO-처리된 대조군에 대해 정규화했다.
역전사 및 정량적 실시간 PCR
총 RNA를 제조자의 설명서에 따라서 트리아졸 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출했다. RNA 2μg을 1시간 동안 37℃에서 수행된 40μL 반응물 중에서 역전사효소(Invitrogen) 200 유닛을 사용하여 역전사시켰다. 정량적 실시간 PCR 분석(qRT-PCR)을 위해, 얻어진 cDNA(1μL)를 iQ SYBR Green Supermix(Qiagen, 메릴랜드 저먼타운), 10 pmol 프라이머 세트(Bioneer)를 함유하는 10μL 반응 혼합물에서 증폭시켰다. 비교가능한 주기-역치(CT) 방법을 사용했고, β-액틴을 암호화하는 ACTB 또는 GAPDH를 내인성 대조군으로 사용했다. 다음의 프라이머 세트를 사용했다:
Figure pct00018
Figure pct00019
경로-특이적 표적 유전자의 프라이머 세트는 선행 연구에서 설명되었다(Kim et al, 2016).
GSK3β 키나아제 분석
8mM MOPS(pH 7.0), 0.2mM EDTA, 20μM YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(p) EDEEE(포스포-GS2 펩타이드)(SEQ ID NO. 37), 10 mM Mg 아세테이트, 및 [γ-33P-ATP](비 활성 약 500 cpm/pmol, 필요한 만큼의 농도)와 함께 GSK3β(사람)를 인큐베이션했다. Mg-ATP 혼합물을 첨가하여 반응을 개시했다. 실온에서 40분 동안 인큐베이션 한 후 3% 인산 용액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 다음에, 반응물 10μL를 P30 필터매트 위에 스폿팅하고 50mM 인산으로 5분 동안 3번, 메탄올로 1번 세척한 후 건조시켜 섬광 계수를 행했다.
데이터베이스
NCBI의 유전자 발현 옴니버스 데이터베이스(NCBI's Gene Expression Omnibus 데이터베이스, GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에 유전자 발현 프로파일 결과를 기탁했으며, GEO 수탁번호 GSE16981, GSE14007, GSE9160를 통해서 접근가능하다.
신호 강도의 정량
DAB 면역염색을 위해, 면역조직화학 점수(H 점수)의 검증을 자동화된 디지털 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ(National Institutes of Health, 메릴랜드 베세즈다) 및 IHC Profiler plug-in(Varghese et al, 2014)을 사용하여 수행했다. 면역형광 염색을 위해, NIS Elements V3.2 소프트웨어(Nikon)로 강도를 분석했다. 핵의 시각화를 위한 기준으로서 청색 채널을 사용했고, 적색, 녹색, 또는 청색 채널에 대해 역치를 한정했다. 적색 채널 및 녹색 채널에서 따로 평균 강도를 계산했고, 3번의 독립적 실험을 분석하여 평균값을 추산했다.
통계 분석
모든 데이터는 평균±s.e.m.로 표시되며, 샘플의 수는 각 도면 범례에 표시된다. 차이의 통계적 유의성은 짝이없는 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가되었다. 도시된 결과는 적어도 3번의 독립적 실험을 대표한다. 통계적 유의성은 다음과 같이 도면에 표시된다: * 또는 #, P < 0.05; ** 또는 ##, P < 0.005; *** 또는 ###, P < 0.0005.
CXXC5-DVL 상호작용을 저해하는 화합물에 대한 스크리닝
CXXC5-DVL 상호작용을 저해했던 소분자를 확인하기 위해, 시험관내 결합 분석에 의해 화학 라이브러리(2,280개 화합물: ChemDiv에서 1,000개 및 SigmaLOPAC에서 1,280개)를 스크리닝했다(Kim et al, 2016). 정제된 DVL PDZ 도메인 5 mg/ml를 16시간 동안 4℃에서 96-웰 Maxibinding Immunoplate(SPL)의 각 웰에서 인큐베이션했다. 각 웰에 10μM FITC-택 부착 PTD-DBMP를 첨가한 후 화학 라이브러리의 각 화합물 또는 대조군(DMSO)을 30μM의 최종 농도로 각 웰에 첨가했다. 형광 강도를 Fluorstar Optima 마이크로플레이트 리더(BGM Lab Technologies, 독일 오르텐버그)를 사용하여 측정했다. DMSO-처리된 대조군에 대해 정규화된 형광 강도의 퍼센트 비로서 결합값을 계산했다. 19개의 화합물은 CXXC5-DVL 상호작용에 대해 10% 미만의 값을 나타냈다. 이들 화합물 중 BIO 및 I3O를 포함하는 인디루빈 유사체가 확인되었다. 고처리량 스크리닝 결과의 요약이 표 3에 제시된다.
Figure pct00020
가상환경( in silico ) 도킹(플렉서블 도킹)
기지의 리간드 설린닥을 가진 DVL PDZ 도메인의 NMR 구조를 Protein Data Bank(PDB 코드: 2KAW)에서 얻었다. CHARMm 포스 필드를 채택한 Discovery Studio 소프트웨어의 플렉서블 도킹 방법을 사용하여 BIO, I3O, 및 KY19382를 PDZ 도메인의 설린닥 결합 자리에서 도킹시켰다(Dassault Systemes BIOVIA, Discovery Studio Modeling Environment, 2017년 출시, 샌디에고: Dassault Systemes, 2016). 도킹 분석을 위해, 활성 부위를 리간드를 중심으로 하여 10.6Å 구 이내로 한정했고, 수용체-리간드 상호작용을 구성한다고 알려진, 잔기 I264, S265, I266, L321, R324, 및 V325를 포함하는 코어 부위를 다시 한정했다. 도킹 결과에 기초하여, 다양한 점수산정 함수를 결정함으로써 가장 예측가능한 결합 방식의 결합 에너지를 계산했다(Ligscore1_Dreiding, Ligscore2_Dreiding, PLP1, PLP2, PMF, DOCKSCORE).
5,6-디클로로인디루빈-3'-메톡심(KY19382)의 합성
Figure pct00021
반응식 1. 시약: (a) Na2CO3, MeOH, 환류; (b) H2NOCH3HCl, 피리딘, 환류
메탄올(0.025 M) 중의 3-아세톡시인돌(405mg, 2.32 mmol)의 용액에 5,6-디클로로이사틴(500mg, 2.32 mmol)과 탄산나트륨(613mg, 5.79 mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 하룻밤 환류시켰다. 어두운 침전물을 여과하고 수성 에탄올로 세척하고, 에탄올과 H2O 용액(1:1 (v/v))으로 재결정화했다. 원하는 화합물인 5,6-디클로로-인디루빈을 진공 건조시켜 자주색 고체를 63% 수율로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.10 (s, 2H), 8.89 (s, 1H), 10.70 (s, 1H), 7.63 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.60-7.55 (m, 1H), 7.40 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.05-7.01 (m, 1H). 다음에, 피리딘(0.15 M) 중의 5,6-디클로로-인디루빈(200mg, 0.61 mmol)의 용액에 무수 하이드록실아민 염산염(509mg, 6.1 mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 하룻밤 환류시켰다(120℃). 반응 완료 후 용매를 감압하에 증발시키고, 소니피케이션하면서 잔류물을 에틸아세테이트와 물에 완전히 용해시켰다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트(100ml x 2)를 사용하여 추출하고, 포화 수성 중탄산나트륨 용액(200ml)으로 세척하고, 무수 MgSO4에서 건조시켰다. 조 생성물을 메탄올과 헥산 용액으로 재결정화하고, 원하는 생성물인 5,6-디클로로인디루빈-3'-메톡심을 진공 건조시켜 적갈색 고체를 31% 수율로 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.63 (s, 1H), 10.92 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.02 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.41-7.37 (m, 2H), 7.02-6.98 (m, 1H), 6.94 (s, 1H), 4.33 (s, 3H).
5-메톡시인디루빈-3'-옥심(A3334)의 합성
중간 생성물 5'-메톡시-[2,3'-바이인돌리닐리덴]-2',3-디온의 합성
Figure pct00022
5-메톡시이사틴(1000mg, 5.65 mmol)을 250mL 둥근바닥 플라스크에 넣고 메탄올(225mL)로 용해한 후 인독실 아세테이트(989mg, 5.65 mmol)와 탄산나트륨(Na2CO3) (1496mg, 14.11 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 12시간 동안 65℃에서 교반했다. 반응을 TLC(Rf = 0.4, 에틸아세테이트/헥산=1/2(v/v))를 사용하여 종료시키고, 결정 덩어리가 형성될 때까지 얼음 위에서 생성물을 냉각시켰다. 결정이 형성되면 여과에 의해 용매를 제거한 후 여과물을 버리고, 생성물을 용매(에탄올/물=1/1(v/v))로 몇번 세척했다. 생성물을 여과하고 진공 펌프에서 건조시키고 추가 정제 없이 다음 단계에 사용했다.
A3334의 합성
Figure pct00023
5'-메톡시-[2,3'-바이인돌리닐리덴]-2',3-디온(670mg, 2.29 mmol)을 100ml 둥근바닥 플라스크에 넣고 피리딘(27ml)으로 용해한 후 H2NOCH3-HCl(3186mg, 45.85 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 12시간 동안 120℃에서 교반했다. TLC(Rf = 0.5, 에틸아세테이트/헥산=1/2(v/v))를 사용하여 반응을 종료시키고, 반응 용액의 온도를 실온으로 낮춘다. 피리딘 용매의 증발 후, 초음파를 사용하여 30분 동안 생성물을 물과 에틸아세테이트에 용해했다. 생성물을 에틸아세테이트로 2번 추출하고 포화 NaHCO3 용액으로 세척했다. 추출된 용액을 무수 황산마그네슘으로 재수화하고 용매를 증발시키고 메탄올과 핵산을 사용하여 재결정화했다. 생성물을 진공 펌프에서 건조시키면 적색 고체인 A3334가 59% 수율로 얻어질 수 있다(420mg).
인디루빈-3'-옥심(I3O 또는 IO)
Figure pct00024
5,6-디클로로인디루빈-3'-프로필옥심(A3486)
Figure pct00025
5,6-클로로인디루빈-3'-벤질옥심(A3538)
Figure pct00026
(Z)-5'-브로모-6'-니트로-[2,3'-바이인돌리닐리덴]-2',3-디온(A2785)
Figure pct00027
6-니트로-5-트리플루오로메톡시인디루빈-3'-메톡심(A2794)
Figure pct00028
KY19382의 생체내 약동학
동물 연구는 KRIBB의 동물실험위원회에 의해 승인되었다. Koatech Co.(한국 경기도)에서 구입한 특정 병원균 무함유 수컷 Sprague-Dawley(SD) 래트(10주령, 체중 298-315g)에게 KY19382 단일 용량을 정맥내(iv, 1 mg/kg, n = 3) 또는 복강내(ip, 5 mg/kg, n = 3) 경로로 제공했다. 투여를 위해 디메틸아세타미드(DMAC)/폴리에틸렌 글리콜 400(PEG400)(20/80, v/v %)에서 투약 용액을 제조했고, iv 및 ip 경로로 각각 5 및 10 ml/kg의 투약 부피를 투여했다. 각각의 혈장 샘플 100μl 알리쿼트를 제조하고, 카바마제핀(내부 표준)을 함유하는 빙냉 아세토니트릴 3 부피를 첨가했다. 혼합물을 10분 동안 910g에서 원심분리하고 상청액을 LC-MS/MS 분석을 수행했다. Kinetica 4.4.1(Thermo Fisher Scientific, Inc., 미국 매사츄세츠 워번)를 사용하여 혈장 농도-시간 프로파일의 표준 비구획 분석에 의해 약동학 변수를 계산했다. 선형-사다리꼴 방법에 의해 혈장 농도-시간 곡선 아래 면적(AUC)를 계산했다. 전신 혈장 클리어런스(CLP)를 다음의 식으로 계산했다: CLP = 용량/AUCinf. 말단 제거 반감기(t1/2)를 다음의 식으로 계산했다: t1/2 = 0.693/λZ, 여기서 λZ는 말단 배치 속도 상수이다. 정류 상태 분포 부피(VSS)를 다음의 식으로 계산했다: VSS = 용량 x AUMCinf/(AUCinf)2, 여기서 AUMCinf는 무한대로 외삽된 혈장 농도-시간 곡선의 1차 모멘트 아래 면적이다. 생체이용율(F)은 다음의 식으로 계산했다: F(%) = (AUCip/AUCiv)(용량iv/용량ip) x 100.
성장판 노화의 홀마크는 칼럼당 휴지기, 증식성 및 비대성 연골세포 수의 감소 및 인접한 연골세포 칼럼들 사이 공간의 증가와 함께 성장판의 전체 높이의 감소를 포함한다. 일반적으로 특정 세포 프로그램을 말하는 "노화"와 달리, 용어 "성장판 노화"는 나이가 들면서 일어나는 기능의 생리학적 상실을 의미한다(예를 들어, Gafni R.I., et al. (2001) Catch-up growth is associated with delayed senescence of the growth plate in rabbits. Pediatr Res 50:618-623 및 Nilsson, et al. (2004) Fundamental limits on longitudinal bone growth: growth plate senescence and epiphyseal fusion. Trends Endocrinol Metab 15:370-374 참조). 많은 어린이가 성조숙증으로 인해 조기 성장판 노화를 겪고 성인기에 단신이 되지만, 이들 현상의 메커니즘은 아직도 명확하게 이해되지 않고 있다. 최근 연구는 성장판 활성이 성장판 내의 연골세포에서 기능이 발휘되는 파라크린 인자들에 의해 주로 조절된다는 것을 시사한다. Wnt/β-카테닌 신호화가 이들 기능과 연루된다. 그러나, 성장판 노화를 제어하는 분자 메커니즘과 인자들은 아직 조사되지 않았다.
본 발명에서, Wnt/β-카테닌 경로의 음성 피드백 조절제인 CXXC5가 후기 사춘기 동안 성장판 연골세포에서 β-카테닌이 억제됨에 따라 점차 증가했다는 것이 밝혀졌다. 또한, CXXC5의 상향조절은 사춘기가 진행되면서 증가될 수 있는 성호르몬인 에스트로겐에 의해 부분적으로 매개되었다.
CXXC5 발현은 후기 사춘기 동안 성장판에서 점차 증가한다
성장판 노화와 Wnt/β-카테닌 신호화의 연관성을 상세히 밝히기 위해, 유전자 세트 부화 분석을 사용하여 3-주령(사춘기 전 및 조기 사춘기) 및 12-주령(조기 성체기) 래트(GEO: GSE16981)의 성장판에서 Wnt-반응성 유전자의 발현 프로파일을 조사했다. 도 1A를 참조하면, Wnt/β-카테닌 신호화-활성화된 유전자의 시그니쳐가 12주령 래트의 성장판에서 유의하게 하향조절되었다. 또한, Wnt/β-카테닌 신호화의 음성 조절제인 Cxxc5의 mRNA 수준은 사춘기 진행 동안 점차 상승되었으며(GEO: GSE16981)(도 1B), 이는 신호화의 다른 저해제들(Apcdd1, Cxxc4, Dkk2, Igfbp4, Sfrp family, Shisa family, Sost, 및 Wif1)과 비교하여 12주째에 통계적으로 유의한 증가를 나타낸다(표 4).
Figure pct00029
Wnt/β-카테닌 신호화의 음성 조절제로서 또한 기능하는 CXXC5의 구조 및 기능적 유사체인 CXXC4는 CXXC5와 비교했을 때 사춘기인 사람 또는 래트의 성장판 구역에서 유의하게 유도되지 않았다(도 7A 및 7B). 사춘기 기간을 더 상세히 검사하기 위해, 3-, 6-, 9-, 및 12-주령 마우스로부터 근위 경골의 성장판을 수집하고 추가적인 분석을 수행했다. 도 1C를 참조하면, Cxxc5의 상향조절 및 Runx2(Wnt/β-카테닌 신호화-표적화 연골형성 부화 마커)의 하향조절이 3-주령 마우스와 비교하여 후기 사춘기 진행 단계에서 qRT-PCR 분석에 의해 확인되었다. 또한, 이뮤노블룻 분석은 CXXC5가 사춘기 진행중인 마우스의 성장판에서 β-카테닌 및 COL2A1, RUNX2, COL10A1, 및 MMP13을 포함하는 연골형성 마커의 감소에 따라 점차 증가했음을 나타냈다(도 1D). CXXC5와 Wnt/β-카테닌 신호화 간의 역 관계는 3- 내지 12-주령 마우스의 성장판에서의 핵 β-카테닌 및 그것의 표적인 RUNX2의 점진적 감소와 함께 세포질 CXXC5dml의 점진적 증가를 나타내는 면역조직화학 분석에 의해 검증되었다(도 1E). 다음에, Wnt/β-카테닌 경로 및 연골형성 분화에 대한 CXXC5의 억제 효과를 세포 수준에서 검사했다. 도 1F를 참조하면, Wnt/β-카테닌 신호화 표적 유전자 Axin2 및 Wisp1에서의 WNT3A-유도 증가가 CXXC5의 과발현에 의해 억제되었다. 또한, Runx2, Alp, 및 Mmp13과 같은 연골형성 분화 마커에서의 WNT3A-유도 전사 증가도 CXXC5의 과발현에 의해 억제되었다.
CXXC5는 성호르몬인 에스트로겐에 의해 유도된 성장판 노화를 매개한다
성적 성숙에 연루된 호르몬인 에스트로겐은 사춘기때 상승된다고 알려져 있으며 성장판 노화와 관련하여 일정 역할을 한다. 순환계의 주요 에스트로겐 호르몬인 17β-에스트라디올(E2)의 효과를, 사람 연골세포 셀라인 C28/I2에서 CXXC5 발현에 대해 검사했다. 도 2A를 참조하면, E2 처리는 시간-의존적 방식으로 CXXC5의 발현을 유도했고, 24시간째에 최대 수준을 달성한다. 또한, β-카테닌 수준은 E2 처리 24시간 후 감소되었다. 도 2B에 도시된 대로, E2는 세포질 CXXC5를 영구적으로 상승시켰고 세포질 및 핵 β-카테닌을 억제했다. 성장판 노화에 대한 E2의 역할을 생체외 경골 배양 시스템을 사용하여 더 확인했으며, E2 처리 후 성장판에서의 증식 및 비대 구역의 높이 감소에 따른 감소된 경골 길이가 증명되었다(도 2C 및 D). E2-처리된 성장판의 연골세포에서의 세포질 CXXC5의 유도 및 핵 β-카테닌의 감소는 성장판 노화와 Wnt/β-카테닌 신호화 비활성화 간의 이미 확인된 관계를 뒷받침한다(도 2E와 도 1E 비교).
CXXC5 발현 및 성장판 노화와 에스트로겐의 연관성을 검증하기 위해, E2 처리의 효과를 6주령 Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스에서 비교했다. 도 2F를 참조하면, 경골 성장판의 E2-유도된 구조적 노화가 Cxxc5 +/+ 마우스에서는 나타났지만 Cxxc5 -/- 마우스에서는 거의 관찰되지 않았다. 이에 더하여, E2-처리된 Cxxc5 -/- 마우스에서 BrdU 통합 및 β-카테닌 발현에 유의한 변화는 없었다. 이들 결과는 CXXC5가 에스트로겐에 의해 유도되었을 때 성장판 노화를 매개한다는 것을 나타낸다.
CXXC5는 후기 사춘기 동안 길이방향 뼈 성장의 억제에서 핵심 역할을 한다
사춘기가 진행되는 동안 성장판 노화와 관련된 CXXC5의 역할을 더 규정하기 위해, Cxxc5 +/+ 및 Cxxc5 -/- 마우스에서의 길이방향 뼈 성장 및 성장판 노화를 평가했다. 도 3을 참조하면, Cxxc5 -/- 마우스는 12주령때 유의하게 증진된 경골 길이를 나타냈다(도 3A 및 3B). 휴지, 증식, 및 비대 구역 높이의 점진적 감소와 각 구역에서의 연골세포 수의 동반 감소에 의해 모니터링된 바 나이가 들면서 Cxxc5 +/+ 마우스의 성장판은 자연적으로 구조적 노화를 겪었다(도 3C-3E). 그러나, Cxxc5 -/- 마우스의 성장판은 나이가 들면서 결국 구조적 노화를 겪었지만, 이들 노화-관련 변화는 Cxxc5 -/- 마우스에서 유의하게 지연되었다(도 3C-3E). 도 3F를 참조하면, Cxxc5 결실에 의한 성장판 노화의 지연은 11주령 Cxxc5 +/+ 마우스와 비교하여 11주령 Cxxc5 -/- 마우스의 성장판의 연골세포에서 Runx2 mRNA 수준과 함께 Ki67 및 β-카테닌 단백질 수준의 현저한 증가에 의해 더 뒷받침되었다. Wnt/β-카테닌 신호화의 활성화 및 연골형성 분화의 촉진은 9주령 Cxxc5 +/+ 마우스와 비교하여 9주령 Cxxc5 -/- 마우스의 성장판에서의 Wnt/β-카테닌 표적 유전자(Axin2, Fosl1, 및 Wisp1) 및 연골형성 마커(Col2a1, Col10a1, Alp, 및 Runx2)의 상향조절에 의해 더 확인되었다(도 3G).
CXXC5는 DVL과의 결합에 의해 Wnt/β-카테닌 경로의 음성 조절제로서 기능할 수 있다. CXXC5-DVL 상호작용을 방해하는 단백질 형질도입 도메인 융합 DVL 결합 모티프 펩타이드(PTD-DBMP)(Kim et al., 2015)가, 성장판 노화에 대해 Cxxc5의 상실과 유사한 효과를 발휘하는지의 여부를 시험했다. 도 3H를 참조하면, 7주령 마우스(후기 사춘기)의 성장판에의 PTD-DBMP의 주사는 칼럼당 휴지기, 증식성 및 비대성 연골세포의 수를 증가시켰다. PTD-DBMP의 주사는 성장판의 연골세포에서의 β-카테닌 및 RUNX2 수준을 더 증가시켰다(도 3I 및 3J). 종합하면, 이들 결과는 CXXC5가 성장판의 구조적 노화에서 일정 역할을 한다는 것을 시사하며, 이것은 CXXC5-DVL 상호작용의 저해에 의해 획득될 수 있다.
KY19382는 CXXC5-DVL 상호작용과 GSK3β 활성 둘 다에 대한 저해 효과를 통해서 Wnt/β-카테닌 신호화를 활성화한다
PTD-DBMP 기능을 의태하고 성장판 노화를 지연시키는 소분자를 확인하기 위해, CXXC5-DVL 상호작용을 모니터링하는 시험관내 분석 시스템에 의해 화학 라이브러리(ChemDiv에서 1,000개 및 SigmaLOPAC에서 1,280개)로부터 2,280개의 화합물을 스크리닝했다(도 8). 이 스크리닝 시스템에서 GSK3β 저해제라고 알려진 인디루빈 유사체 6-브로모인디루빈-3'-옥심(이후 "BIO")(화합물 8)과 인디루빈-3'-옥심(이후 "I3O")(화합물 12)이 초기 성공작으로서 확인되었다(표 3 및 5 참조)(예를 들어, Meijer L, et al. (2003) GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chem Biol 10: 1255-1266 참조). 도 9에 도시된 대로, BIO와 I3O는 가상환경 도킹 모델링에서 DVL PDZ 도메인(Protein Data Bank [PDB]: 2KAW)과 상호작용했다.
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
기능적으로 개선된 화합물을 얻기 위해, BIO 및 I3O의 구조에 기초하여 인디루빈 백본의 R1 및 R2 자리에서 작용기를 치환함으로써 약 60개의 인디루빈 유도체를 새로 합성했다(도 10A 및 도 14). 이들을 시험관내 CXXC5-DVL 결합 활성, 시험관내 GSK3β 키나아제 활성 및 TOPFlash Wnt 리포터 활성에 대해 평가함으로써, 추가 조사를 위한 최적 화합물로서 5,6-디클로로인디루빈-3'-메톡심(KY19382; 도 4A)을 얻었다. 도 4를 참조하면, KY19382는 시험관내 CXXC5-DVL 상호작용(KY19382의 IC50 = 1.9 x 10-8 M; 도 4B) 및 시험관내 GSK3β 활성(KY19382의 IC50 = 1 x 10-8 M; 도 4C)을 둘 다 현저히 저해했고, TOPFlash Wnt 리포터 활성의 강한 증진(도 4D)을 나타냈다.
DVL PDZ 도메인(Protein Data Bank [PDB]: 2KAW) 상의 KY19382에 대한 가능한 결합 자리를 가상환경 도킹 프로그램을 사용하여 더 특성화했다(도 10B). KY-19382-DVL PDZ 복합체의 구조 시뮬레이션은 KY19382와의 상호작용에 연루된 잔기들이 DBMP-결합 자리와 유사했음을 나타냈다(Kim et al., 2016). BIO 또는 I3O와 비교하여 KY19382-DVL PDZ 복합체의 추산된 결합 에너지는 개선되었다(BIO = -81.80 kcal mol-1 또는 I3O = -75.34 kcal mol-1 vs KY19382 = -97.96 kcal mol-1)(도 9와 도 10B를 비교).
도 4를 참조하면, Wnt/β-카테닌 신호화 경로에서의 KY19382의 역할은 GSK3β 비활성화에 따른 β-카테닌의 증가(도 4E) 및 CXXC5-DVL 상호작용의 중단(도 4F)에 의해 ATDC5 세포에서 β-카테닌의 상승된 핵 전좌가 얻어(도 4G)지는 결과로 부터 더 검증되었다. KY19382 치료에 의한 β-카테닌 경로의 활성화는 GSK3β의 비활성화와 CXXC5-DVL 상호작용의 중단 모두에 의존할 가능성이 높은 것으로 추정된다.
KY19382는 성장판 노화를 지연시키고 길이방향 뼈 성장을 촉진한다
성장판 노화에 대한 KY19382의 효과를 조사하기 위해, 0.1 mg/kg KY19382를 2주 동안 매일 7주령 마우스(후기 사춘기)의 성장판에 복강내 주사했다. 도 5를 참조하면, COL2A1 면역염색에 의해 모니터링된 전체 성장판 높이는 KY19382 치료에 의해 유의하게 증가되었다(도 5A). 이 효과는, BrdU- 및 RUNX2-양성 세포에 의해 각각 평가되었을 때, 칼럼당 증식성 연골세포와 비대성 연골세포의 수가 모두 증가한 것에 의해 확인되었다(도 5A-5C). 이들 효과와 함께 KY19382 치료에 의해 성장판 연골세포에서의 핵 β-카테닌도 극적으로 증가되었다(도 5A). 또한, 이뮤노블롯 분석은 KY19382가 β-카테닌 및 COL2A1, RUNX2, 및 MMP13과 같은 연골형성 마커들을 성장판에서 증가시켰음을 나타냈다(도 5E). 이들 기능적 및 구조적 변화는 성장판 노화를 지연시키는데 있어서 KY19382의 능력을 증명한다.
다음에, 2주 동안 매일 3주령 마우스(조기 사춘기)에게 0.1 mg/kg KY19382를 투여함으로써 빠르게 성장중인 어린 마우스에서의 KY19382의 효과를 시험했다. 전체 성장판 높이의 증가와 함께, COL2A1 발현에 의해 증명된 대로, 각 성장판 구역의 높이 및 BrdU-양성 세포가 KY19382-치료된 마우스에서 상승되었다(도 5F-H). 더 나이든 마우스에서 관찰된 대로, β-카테닌-발현 연골세포도 KY19382 치료에 의해 증가되었다(도 5F).
확장된 HZ(비대 구역)가 지연된 연골 재흡수의 결과였을 가능성을 배제하기 위해, 경골 절편의 TRAP 염색을 수행했다. 도 5I를 참조하면, 성장판/섬유주 계면에서의 TRAP-양성 포커스의 수는 그룹간 차이가 없었으며, 이는 KY19382가 빠르게 성장중인 어린 마우스에서 연골 재흡수에 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 그러나, 7주령 내지 9주령의 KY19382로 치료된 더 나이든 마우스는 비히클-치료된 마우스와 비교하여 상승된 TRAP-양성 포커스를 나타냈다(도 5A 및 5D). 이들 효과는 후기 사춘기 마우스의 노화된 성장판에도 불구하고 골아세포 뼈 형성에 의해 대체될 공간의 준비를 포함하는 성장판 성숙의 전체적인 과정이 KY19382 치료에 의해 활성화되었음을 나타냈다.
도 11을 참조하면, 연골세포 증식에 대한 KY19382의 역할은 KY19382 치료 후 BrdU-양성 ATDC5 세포의 수가 증대된 것에 의해 시험관내 방식으로 더 검증되었다(도 11A). 이에 더하여, 연골형성 마커의 mRNA 수준이 ATDC5 및 C28/I2 세포에서 KY19382에 의해 상향조절되었다(도 11B 및 11C). 도 11B에 도시된 대로, 이들 효과는 siRNA-매개된 Ctnnb1 녹다운에 의해 폐기되었다.
도 12를 참조하면, KY19382-처리된 ATDC5 세포에서 다양한 신호화 경로에 대해 표적 유전자의 mRNA 수준을 측정함으로써 KY19382의 오프-타겟 효과를 또한 조사했다. KY19382는 Fosl1, Wisp1, 및 Axin2와 같은 Wnt/β-카테닌 표적 유전자의 발현 수준을 현저히 증가시켰지만, 다른 경로에 반응하는 나머지 19개 유전자는 그다지 변경되지 않았다. 이들 결과는 KY19382가 Wnt/β-카테닌 경로의 특이적 활성화를 통해 연골세포 증식 및 분화를 촉진한다는 것을 증명한다.
사춘기 전과 조기 사춘기부터 성체기에 이르기까지 포괄적인 효과를 조사하기 위해, 3주령에서 13주령까지의 마우스에게 10주 동안 KY19382를 장기 투여했다. 0.1 mg/kg KY19382로 매일 치료한 그룹은 비히클-치료된 그룹과 비교하여 경골의 길이가 유의하게 증가했다(도 5J). 도 13을 참조하면, KY19382-치료된 마우스의 관절 연골과 간 조직에서 조직학적 비정상은 검출되지 않았다(도 13A 및 13B). 10주의 치료 동안 그룹들에서 체중의 차이는 관찰되지 않았다(도 13C). 종합하면, 이들 데이터는 KY19382가 주목할만한 독성 없이, 빠르게 성장중인 어린 마우스에서 성장판 성숙을 촉진하고 더 나이든 마우스에서는 성장판 노화를 지연시킴으로써 길이방향 뼈 성장을 유도한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 Wnt/β-카테닌 경로의 음성 피드백 조절제인 CXXC5가 후기 사춘기 동안 성장판 연골세포에서의 β-카테닌이 억제됨에 따라 점차 증가했다는 것을 제공한다. CXXC5의 상향조절은 사춘기가 진행되면서 증가될 수 있는 성호르몬인 에스트로겐에 의해 부분적으로 매개되었다. 또한, 에스트로겐-유도 성장판 노화의 폐기가 Cxxc5 -/- 마우스에서 관찰되었으며, 에스트로겐-유도 성장판 노화 및 길이방향 뼈 성장의 후속 종결에서 매개제로서 CXXC5의 역할을 더 특성화했다. CXXC5는 노화 과정 동안 성장판의 연골세포에서의 CXXC5 및 β-카테닌의 발현 패턴의 역 관계와 관련있는 시험관내 및 생체내 연구에서 모두 나타난 대로, Wnt/β-카테닌 신호화를 저해한다.
CXXC5는 세포 종류 및 조직에 따라 세포질 또는 핵에 편재화될 수 있다(Kim et al., 2014; Lee et al., 2015). 본원에 개시된 대로, 성장판 노화 동안 증가된 세포질의 CXXC5는 CXXC5가 세포질에 있는 DVL과의 상호작용을 통해서 그것의 기능을 발휘할 수 있도록 한다. CXXC5와 달리, CXXC4(CXXC5와 구조적 및 기능적으로 유사한 단백질)는 사춘기 진행 동안 성장판에서 유의하게 발현되지 않았으며, 이는 CXXC5가 성장판 노화에서 특이적 역할을 한다는 것을 시사한다.
세포질 CXXC5가 DVL의 PDZ 도메인과의 상호작용을 통해 기능하기 때문에, 본원에서는 CXXC5-DVL 차단 펩타이드인 PTD-DBMP의 사용에 따른 성장판 노화를 지연시키는 약물 개발을 위한 표적으로서의 CXXC5-DVL 상호작용이 확인되고 검증되었다. 성장판 노화를 지연시킴으로써 길이방향 뼈 성장을 유도할 수 있는 소분자를 더 개발하기 위해, CXXC5-DVL 상호작용을 모니터링하는 시험관내 스크리닝 시스템을 사용하여 소분자 라이브러리를 스크리닝했다. GSKβ 저해제로서 작용할 수 있는 인디루빈 유사체 BIO 및 I3O이 잠재적 CXXC5-DVL 저해제로서 확인되었다.
기능적으로 개선된 인디루빈 유도체, 특히 KY19382의 개발은 이들 패밀리의 화합물들이 CXXC5-DVL 상호작용 및/또는 GSK3β 활성의 저해제로서 이중 역할을 가질 수 있음을 확인했다. 본원에 개시된 결과는 KY19382가 연골세포 증식 및 분화의 동반 촉진을 통해서 성장판 노화를 지연시킴으로써 경골의 길이방향 성장을 효과적으로 증가시켰음을 나타냈다. 길이방향 뼈 성장을 증진시키는데 있어서 KY19382의 효능은 빠르게 성장중인 아동기에는 GSK3β의 비활성화에 의한 성장판 성숙의 증진 및 후기 사춘기 기간에는 CXXC5-DVL 상호작용의 방해에 의한 성장판 노화의 지연이라는 이중 기능으로 인한 것일 수 있다.
KY19382는 Wnt/β-카테닌 경로-표적 유전자를 제외한 다른 19개 경로-특이적 유전자의 유의한 활성화의 결여에 의해 관찰된 바 어떠한 유의한 오프-타겟 효과도 나타내지 않았다. 또한, 길이방향 뼈 성장을 유도했던 0.1 mg/kg KY19382의 투여 후 관절 연골에 대한 부작용도 관찰되지 않았다. DVL과의 상호작용을 통해 기능하는 세포질 CXXC5를 표적화하는 것은, 이 접근법이 핵 CXXC5를 표적화할 때 일어날 수 있는 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 가능성이 있기 때문에 추가적인 이익을 제공할 수 있다.
Figure pct00038
본원에 개시된 결과는 사춘기 동안 에스트로겐-유도된 CXXC5가 Wnt/β-카테닌 신호화의 비활성화를 통해서 성장판 노화를 촉진하고 길이방향 뼈 성장을 저해하는데 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다(도 6A). GSK3β를 저해하고 CXXC5-DVL 상호작용을 파괴하는 이중 메커니즘을 통해 Wnt/β-카테닌 신호화를 활성화할 수 있는 소분자를 사용하는 효과적인 접근법은 조기 성장판 노화를 수반하는 성장 지연을 가진 어린이를 위한 새로운 치료 전략일 수 있다(도 6B).
본 발명이 도면 및 전술한 설명에서 상세히 예시되고 설명되었지만, 특성을 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 단지 바람직한 구체예만이 도시되고 설명되었다는 것과 본 발명의 사상에 속하는 모든 변화 및 변형이 보호되길 원한다는 것이 이해된다. 또한, 본 발명은 구체적인 실시예, 이론적 주장, 설명, 및 도해를 사용하여 예시되었지만, 이들 도해 및 수반된 논의는 해당 기술을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원에서 참조된 모든 특허, 특허출원, 및 참조 문서, 과학 논문, 간행물 등은 본 명세서의 명백한 교시와 일치하지 않는 범위까지 그 전체가 본 출원서에 참고로서 포함된다.
<110> CK Biotech Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SUPPRESSING AND/OR TREATING A GROWTH RELATED DISEASE AND/OR A CLINICAL CONDITION THEREOF <130> CKBIO-0002-PCT <150> KR 10-2018-0122511 <151> 2018-10-15 <150> US 62/799,921 <151> 2019-02-01 <150> US 62/799,912 <151> 2019-02-01 <150> US 62/825,363 <151> 2019-03-28 <150> US 62/903,068 <151> 2019-09-20 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ctnnb1 siRNA-1, sense <400> 1 auuacaaucc gguugugaac guccc 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ctnnb1 siRNA-1, anti-sense <400> 2 gggacguuca caaccggauu guaau 25 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ctnnb1 siRNA-2, sense <400> 3 uaaugaaggc gaacggcauu cuggg 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ctnnb1 siRNA-2, anti-sense <400> 4 cccagaaugc cguucgccuu cauua 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB Forward Primer <400> 5 agagctacga gctgcctgac 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB Reverse Primer <400> 6 agcactgtgt tggcgtaca 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL2A1 Forward Primer <400> 7 tggaaagcct ggtgatgatg gtg 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL2A1 Reverse Primer <400> 8 tgacctttga caccaggaag gc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13 Forward Primer <400> 9 gaagacctcc agtttgcaga gc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13 Reverse Primer <400> 10 ttcaggattc ccgcgagatt tg 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2 Forward Primer <400> 11 caccttgacc ataaccgtct tcac 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2 Reverse Primer <400> 12 catcaagctt ctgtctgtgc cttc 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA Forward Primer <400> 13 agggcagaat catcacgaag tgg 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA Reverse Primer <400> 14 gtctcgattg gatggcagta gc 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actb Forward Primer <400> 15 ggatgcagaa ggagattact 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actb Reverse Primer <400> 16 ccgatcccac acagagtact t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alp Forward Primer <400> 17 gggactggta ctcggataac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alp Reverse Primer <400> 18 ctgatatgcg atgtccttgc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1 Forward Primer <400> 19 gcctgtctgc ttcttgtaa 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col2a1 Reverse Primer <400> 20 tgcggttgga aagtgttt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col10a1 Forward Primer <400> 21 tccactcgtc cttctcag 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col10a1 Reverse Primer <400> 22 tttagcctac ctccaaatgc 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ctnnb1 Forward Primer <400> 23 acaagccaca agattacaag aa 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ctnnb1 Reverse Primer <400> 24 gcaccaatat caagtccaag a 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh Forward Primer <400> 25 acccagaaga ctgtggatgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh Reverse Primer <400> 26 ggatgcaggg atgatgttct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp9 Forward Primer <400> 27 tgaagtctca gaaggtggat 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp9 Reverse Primer <400> 28 atggcagaaa taggctttgt 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp13 Forward Primer <400> 29 taagacacag caagccaga 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp13 Reverse Primer <400> 30 cacatcagta agcaccaagt 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx2 Forward Primer <400> 31 aaggacagag tcagattaca ga 22 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx2 Reverse Primer <400> 32 gtggtggagt ggatggat 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9 Forward Primer <400> 33 aactggaaac ctgtctctct 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9 Reverse Primer <400> 34 acaacacacg cacacatc 18 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vegfa Forward Primer <400> 35 ttatttattg gtgctactgt ttatcc 26 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vegfa Reverse Primer <400> 36 tctgtatttc tttgttgctg ttt 23 <210> 37 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phospho-GS2 peptide <400> 37 Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ser Arg His Ser 1 5 10 15 Ser Pro His Gln Ser Glu Asp Glu Glu Glu 20 25

Claims (29)

  1. 식 I의 화합물:
    Figure pct00039

    상기 식에서, X는 선택적으로 R1으로 치환된 O 또는 N이고;
    R1은 선택적으로 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 수소, 하이드록시, 알킬, 알케닐, 또는 알콕시이거나; 또는 R1은 부틸, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 수소, 알킬, 알케닐, 또는 알콕시이고;
    R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 니트로, 할로겐, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시, 할로알콕시, 또는 카복시이다.
  2. 제 1 항에 있어서, X가 N이고, R1이 선택적으로 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 하이드록시 또는 알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R1이 선택적으로 알킬, 알케닐, 할로알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환된 알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00040

    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 식 II의 화합물:
    Figure pct00041

    상기 식에서, R6, R7, R8, R9, 및 R10은 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 할로알킬, 알콕시, 또는
    Figure pct00042
    이고;
    R11은 각각 R12로 치환된, C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, N, 디이미드,
    Figure pct00043

    이고;
    R12는
    Figure pct00044

    이고;
    R13은 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 수소 또는 알킬이고;
    각각의 R14, R15, 및 R16은 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이고;
    X1, X2 및 X3은 독립적으로 탄소, 질소, 산소, 또는 황이다.
  6. 제 5 항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00045

    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 식 III의 화합물:
    Figure pct00046

    상기 식에서, 각각의 R17은 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이고;
    X4 및 X5는 독립적으로 질소, 산소, 또는 황이다.
  8. 제 7 항에 있어서, 각각의 R17이 독립적으로 할로겐 또는 하이드록시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00047

    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 식 IV의 화합물:
    Figure pct00048

    상기 식에서, 각각의 R18 및 R19는 독립적으로 수소; 할로겐; 하이드록시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이다.
  11. 제 10 항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00049

    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 식 V의 화합물:
    Figure pct00050

    상기 식에서, 각각의 R' 및 각 R''는 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이다.
  13. 제 12 항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00051

    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 식 VI의 화합물:
    Figure pct00052

    상기 식에서, 각각의 R20 및 R21은 독립적으로 수소; 할로겐; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 또는 알콕시로 치환된 할로알킬; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 또는 카보닐로 치환된 알킬, 여기서 카보닐은 선택적으로 수소, 할로겐, 알킬, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환됨; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알콕시; 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알케닐; 또는 선택적으로 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 또는 할로알킬로 치환된 알키닐이다.
  15. 제 14 항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00053

    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 CXXC5-DVL 계면을 저해하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 그것의 약학적으로 허용되는 수화물, 염, 대사물질, 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  18. 성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태를 치료하는 방법으로서,
    CXXC5-DVL 상호작용을 감소 및/또는 저해하는 적어도 하나의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계; 또는
    제 1 항 내지 제 16 항에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제 17 항에 따른 적어도 하나의 조성물을 포함하는 적어도 하나의 제제의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 대상에서 CXXC5의 상향조절된 발현을 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 성장-관련 질환 또는 이와 유사한 상태에 대한 위험을 가진 대상을 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 비정상적 성장판 노화를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 성조숙증으로 진단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, CXXC5-DVL 상호작용을 감소 및/또는 저해하는 적어도 하나의 제제는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 및/또는 제 17 항에 따른 적어도 하나의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 18 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 사람 또는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 제제는 경구 또는 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 대상에서 하나 이상의 성장-관련 질환 마커를 검출하는 방법으로서,
    대상으로부터 혈액, 세포, 또는 조직의 샘플을 제공하는 단계; 및
    에스트로겐 및/또는 CXXC5를 포함하는 하나 이상의 마커를 샘플에서 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 성장-관련 질환은 성조숙증인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, CXXC5가 대상에서 과발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. CXXC5의 활성을 억제하는 방법으로서,
    제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염 또는 대사물질의 적어도 하나의 치료적 유효 용량을 대상에게 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
KR1020217014561A 2018-10-15 2019-10-14 성장 관련 질환 및/또는 그것의 임상적 상태를 억제 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법 KR20210060642A (ko)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180122511 2018-10-15
KR20180122511 2018-10-15
US201962799921P 2019-02-01 2019-02-01
US201962799912P 2019-02-01 2019-02-01
US62/799,912 2019-02-01
US62/799,921 2019-02-01
US201962825363P 2019-03-28 2019-03-28
US62/825,363 2019-03-28
US201962903068P 2019-09-20 2019-09-20
US62/903,068 2019-09-20
PCT/IB2019/058749 WO2020079570A1 (en) 2018-10-15 2019-10-14 Compositions and methods for suppressing and/or treating a growth related disease and/or a clinical condition thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210060642A true KR20210060642A (ko) 2021-05-26

Family

ID=70284288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217014561A KR20210060642A (ko) 2018-10-15 2019-10-14 성장 관련 질환 및/또는 그것의 임상적 상태를 억제 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210323918A1 (ko)
EP (1) EP3866787A1 (ko)
KR (1) KR20210060642A (ko)
CN (1) CN113194942A (ko)
WO (1) WO2020079570A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4010337A4 (en) * 2019-11-04 2023-08-23 CK Regeon Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR SUPPRESSING AND/OR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASES AND/OR ASSOCIATED CLINICAL CONDITION
CA3237199A1 (en) 2021-11-02 2023-05-11 Flare Therapeutics Inc. Pparg inverse agonists and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2004285522A1 (en) * 2003-10-28 2005-05-12 Centre National De La Recherche Scientifique Indirubin-type compounds, compositions, and methods for their use
US9511093B2 (en) * 2009-03-23 2016-12-06 The Texas A & M University System Compositions of mesenchymal stem cells to regenerate bone
WO2014152451A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 University Of Rochester Compositions and methods for controlled localized delivery of bone forming therapeutic agents
KR101493324B1 (ko) * 2013-07-11 2015-02-16 연세대학교 산학협력단 인디루빈 유도체를 포함하는 골길이 성장 촉진용 조성물
KR101855423B1 (ko) * 2017-04-18 2018-05-09 주식회사 씨케이바이오텍 인디루빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CN113194942A (zh) 2021-07-30
EP3866787A1 (en) 2021-08-25
WO2020079570A1 (en) 2020-04-23
US20210323918A1 (en) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Khosla et al. The role of cellular senescence in ageing and endocrine disease
Li et al. Lysine methyltransferase SMYD2 promotes cyst growth in autosomal dominant polycystic kidney disease
JP6800750B2 (ja) 固形腫瘍の処置方法
JP6548641B2 (ja) 転移性前立腺癌の治療
Jia et al. Cardamonin reduces chemotherapy-enriched breast cancer stem-like cells in vitro and in vivo
Gleason et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity
US20110268722A1 (en) Combination therapies with mitochondrial-targeted anti-tumor agents
US11179412B2 (en) Methods of treating conditions involving elevated inflammatory response
Mondello et al. Dual inhibition of histone deacetylases and phosphoinositide 3-kinase enhances therapeutic activity against B cell lymphoma
CA2638735A1 (en) Methods to identify inhibitors of the unfolded protein response
US20220211690A1 (en) Methods for treating pten-mutant tumors
Lee et al. SPA0355, a thiourea analogue, inhibits inflammatory responses and joint destruction in fibroblast‐like synoviocytes and mice with collagen‐induced arthritis
WO2020037069A1 (en) Methods of treating liver diseases
KR20210060642A (ko) 성장 관련 질환 및/또는 그것의 임상적 상태를 억제 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법
JP2022539840A (ja) Ｍａｐキナーゼ相互作用セリン／スレオニン－プロテインキナーゼ１（ｍｎｋ１）及びｍａｐキナーゼ相互作用セリン／スレオニン－プロテインキナーゼ２（ｍｎｋ２）の阻害剤、癌治療及び治療的組合せ
US20210403432A1 (en) Compositions and methods for suppressing and/or treating metabolic diseases and/or a clinical condition thereof
Jang et al. Serum and glucocorticoid-regulated kinase 1: Structure, biological functions, and its inhibitors
Pitt et al. Inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling suppresses tumor cell proliferation and neuroendocrine marker expression in GI carcinoid tumors
US9539323B2 (en) Methods and compositions for malic enzyme 2 (ME2) as a target for cancer therapy
AU2014207272A1 (en) Estrogen receptor inhibitors
US10736877B2 (en) Tryptamine-based ship inhibitors for the treatment of cancer
KR101957613B1 (ko) 아릴 아민 치환된 퀸옥살린의 항암 약물로서 용도
US9457016B2 (en) Methods for treating polycystic kidney disease
US20220323452A1 (en) Methods and compositions for inhibiting gapdh
EP4361136A1 (en) Compound for the treatment of glioblastoma