DE3751871T2

DE3751871T2 - Guanidinaminoglycosid enthaltende Liposome

Info

Publication number: DE3751871T2
Application number: DE3751871T
Authority: DE
Inventors: Marcel B Bally; Lois E Bolcsak; Pieter R Cullis Pieter Cullis; Andrew S Janoff Andrew Janoff; Jo Ann Jedrusiak; Robert P Lenk; Lawrence D Mayer
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-01-13
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2007-01-14
Also published as: CA1314481C; EP0295248B2; EP0295248A1; IL97538A; EP0498471B1; JP2528153B2; EP0500143A3; ATE141166T1; AU6934587A; AU609711B2; ATE87503T1; DE3785198D1; WO1988004573A1; EP0295248B1; EP0498471A3; JPH01501619A; EP0500143A2; EP0498471A2; EP0295248A4; DE3785198T3

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Aminogycoside, Analoge und Derivate davon in Form von Phosphaten und anderen Salzen sowie das Verfahren zur Herstellung und die Verwendung derselben. Aminoglycosidphosphatliposomen, ihre Herstellung und Verwendung sind insbesondere beschrieben. Guanidino- Aminoglycosid-Liposomen mit Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnissen (m/m) von größer als etwa 9:25 (Äqu.gew.) werden ebenfalls offenbart.

Hintergrund der Erfindung

Aminoglycoside gehören zu einer Verbindungsklasse, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, die Proteinsynthese in Mikroorganismen zu beeinflussen. Aminoglycoside bestehen aus zwei oder mehreren Aminozuckern, die über eine Glycosidbindung mit einem Hexose(oder Aminocyclitol)kern verbunden sind. Die bis jetzt bekannten Hexosekerne sind entweder Streptidin oder 2-Desoxy-streptamin, obgleich andere vorbeschrieben sein können. Die Aminoglycosidfamilien unterscheiden sich duch den am Aminocyclitol gebundenen Aminozucker. So enthält zum Beispiel die Neomycinfamilie drei Aminozucker gebunden am zentralen 2-Desoxystreptamin. Die Kanamycin- und Glutamicinfamilien haben nur zwei am Aminocyclitol gebundene Zucker.
Zu Aminoglycosiden gehören: Neomycin B, Paromomycin, Ribostamycin, Lividomycin, Kanamycin A, Kanamycin B, Amikacin, Tobramycin, Viomycin, Gentamicin C&sub1;, Gentamicin C1a, (Gentamicin C&sub2;, C&sub1;, C1a und Analoge und Derivate davon zusammengefaßt "Gentamicin"), Sisomicin, Netilmicin, Streptomycin und Dihydrostreptomycin.
Streptomycin udn Dihydrostreptomycin, gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer Guanidingruppe, sind als außergewöhnlich zu verstehen bei der Assoziierung mit Liposomen mit höheren Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnissen als die Nichtguanidin-Aminoglycoside. Der Begriff "Nichtguanidin"- Aminoglycoside schließt Aminoglycoside ein, die andere sind als eine Guanidingruppe tragende Aminoglycoside.
Leider wird die Verwendung dieser Verbindungen durch verschiedene Faktoren eingeschränkt. Oft bei ihrer Verwendung darauf gerichtet, die Proteinsynthese in Bakterien zu verhindern, haben die Bakterien eine bemerkenswerte Kapazität gezeigt, gegenüber der Hemmwirkung der Aminoglycoside resistent zu werden. Die Resistenz eines Organismus gegen Aminoglycoside tritt bei einem breiten Berich der Aminogylcoside auf. Ein weiteres Problem bei der Aminglycosidverwendung ist die charakteristische geringe gastrische Absorption und die schnelle Ausscheidung. Die Injektion von Aminoglycosiden führt zu einem schnellen Peak bei der Plasmakonzentration of um 30 bis 90 Minuten herum nach der intramuskulären Injektion, die mit einer Toxizität verbunden ist. Eine andere Einschränkung ist die, daß es mißlingt, mit den Aminoglycosiden das ZNS oder das Auge zu erreichen.
Bei der therapeutischen Verwendung von Aminoglycosiden bei Lebewesen einschließlich des Menschen sind zahlreiche Probleme hinsichtlich der Toxizität festgestellt worden. Zum Beispiel kann die therapeutische Verwendung bei höheren Lebewesen begleitet sein von Ototoxizität, die potentiell sowohl Hör- als auch Vestibularfunktionen miteinbezieht, wie von Nephrotoxizität und einer neuromuskulären Blockade, die in Atemnot kulminiert.
Chemical Abstracts, Bd. 101, Nr. 2, 9. Juli 1984, Columbus Ohio, US; Abstract Nr. 12003w, 5. 294 und Database WPIL, Derwent Publication Ltd. London, GB, AN 85-133430 offenbaren Streptimycin enthaltende Lipsomen mit einem Wirkstoff: Lipid-Verhältnis von bis zu etwa 3:30.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Aminoglycosid in Form eines Phosphatsalzes zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Aminoglycosiden mit verbesserter liposomaler Assoziierung. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von mit Aminoglycosid assoziierten Liposomen. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, die Liposomen im wesentlichen mit dem Aminoglycosid zu assoziieren. Ein zusätzliches Ziel dieser Erfindung besteht in der Bereitstellung von erfindungsgemäßen Liposomen mit einem hohen Aminoglycosid-zu Lipid-Verhältnis besonders bei den Nichtguanidin-Aminoglycosiden. Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung von derartigen Liposomen in einer pharmazeutischen Dosierungsform für die therapeutische Behandlung eines Lebewesens, einschließlich eines Menschen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer intravenös verabreichbaren Form eines Aminoglycosides ohne gleichzeitig unmittelbares Vorhandensein von ungebundenem oder nicht-assoziertem Aminoglycosid bei hohen Plasmaspiegeln.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, daß Aminoglycoside, Analoge und Derivate davon in Form von Phosphatsalzen und Sulfat oder anderen Salzen überraschende nützliche therapeutische Eigenschaften haben. Von Aminoglycosidsalzen wurde gefunden, daß sie besonders angepaßt sind an die Assoziation mit Liposomen. Die Phosphatsalze von Aminoglycosiden können darüber hinaus verminderte akute Toxizität aufweisen. Der Begriff Aminoglycosid ist so zu verstehen, daß er Analoge und Derivate davon einschließt.
Die Verwendung von Aminoglycosid als Phosphat bei der Herstellung von Liposomen mit erhöhter Beladungseffizienz wird im folgenden beschrieben. Dies trifft für Guanidin-Aminoglycoside zu. Der Begriff "assoziiert" soll verstanden werden als immobilisiert auf oder in einem Liposom, innerhalb der wäßrigen Phase eines Liposoms oder innerhalb der Lipidphase eines Liposoms.
Die Gewichte des Aminoglycosides können als tatsächliches Gewicht des Aminoglycosides (tatsächliches Gewicht "tats. Gew.") ausgedrückt werden oder als Äquivalentgewicht oder Basisäquivalentgewicht des Arzneimittelmoleküls, das das Gewicht des Gegenions nicht einschließt (Äquivalentgewicht "Äqu.gew."). Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Herstellung von Aminoglycosidliposomen (einschließlich Streptomycin oder Dihydrostreptomycin) und von Zubereitungen, die derartige Liposomen enthalten und die in einem breiten Bereich von Stärken hergestellt werden können, höher als man sie ohne dieses Verfahren erhalten kann. (Guanidin-Aminoglycosid- Liposomen nach diesem Verfahren erzielen Wirkstoff-zu-Lipid- Äquivalentgewicht-Verhältnisse von mehr als etwa 9:25 (m/m)); beispielsweise mit mehr als etwa 60 mg Streptomycinsulfat/100 mg EPC (tats.Gew.)).
Ein besonderer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, daß die verbesserten Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis-Präparate eine verringerte Verabreichung von Lipid pro Arzneidosis erfordern und somit die mit der Lipidverabreichung verbundene Toxizität vermeiden oder verringern.
Die verstärkte Assoziierung von verfügbarem Arzneimittel mit Liposomen in der Herstellung der Liposomen verringert den Bedarf an Arzneimittel- und Lipidausgangsmaterialien.
Schließlich führt die große Stärke der pharmazeutischen Präparationen dementsprechend zu einem geringeren Volumen und ruft daher geringe Hautschädigungen nach der Verabreichung hervor. Dies ist besonders bei der intramuskulären Verabreichung wichtig.
Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Aminoglycosidphosphat und Aminoglycosidphosphatliposomen werden im folgenden vollständiger beschrieben.
Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Aminoglycosidliposomen durch das modifizierte SPLV-Verfahren, der bevorzugtesten Ausführungsform, die sowohl das Trocknen der Liposomen-Pulver als auch die Stabilisierung der Liposomen erfordern, sind ebenfalls detaillierter nachfolgend beschrieben.
Diese Erfindung beinhaltet Liposomen, die mindenstens ein Lipid und mindestens ein Phosphatsalz eines Aminoglycosids umfassen. Sie schließt weiter unilamellare und multilamellare Vesikel ein, die mit Aminoglycosidphosphaten assoziiert sind, wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, und Sisomycin und Phospholipide wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phasphatidylserin und Phosphatidylglycerol allein oder in Kombination mit anderen Lipiden.
Diese Erfindung beinhaltet Methoden zu Herstellung von Aminoglykosidphosphat-assoziierten Liposomen wie nachfolgend beschrieben und insbesondere den Liposomen, die im wesentlichen mit verfügbarem Aminoglykosidphosphat assoziieren.
Darüber hinaus beinhaltet diese Erfindung das Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Tieren, einschließlich Menschen mit therapeutisch wirksamen Mengen von Aminoglycosidphosphat, liposomal assoziiertem Aminoglycosidphosphat und diesem Phosphat in Assoziiation mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger. Darüber hinaus eingeschlossen ist die Herstellung der Phosphaten von Aminoglycosiden und insbesondere der Phosphate von Streptomycin, Dihydrostreptomycin und Sisomycin. Darüber hinaus eingeschlossen ist in dieser Erfindung Aminoglycosidphosphat und liposomal assoziiertes Aminoglycosid bei der Behandlung von Gram-negativer Pneumonie.
Die erfindungsgemäßen Liposomen beinhalten Liposomen und insbesondere SPLV-Liposomen, die mindestens ein Lipid und mindestens ein Aminoglycosid, bevorzugt in Form eines Sulfatsalzes, umfassen. Weiterhin eingeschlossen sind multilamellare Liposome von Vesikel-Typ, die mit Aminoglycosiden und Phospholipiden assoziiert sind, wie Phosphatidylinositol, Phospatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylglycerol. Diese Erfindung beinhaltet die Methoden zur Herstellung von Aminoglycosid-assoziierten Liposomen und insbesondere Aminoglycosidsulfat-assoziierten Liposomen wie unten beschrieben, und insbesondere der Liposomen, die im wesentlichen mit verfügbarem Aminoglycosidsulfat assoziieren.
Darüber hinaus eingeschlossen sind Guanidin-Aminoglycosid- Liposomen mit Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnissen von mehr als etwa 3:5 (tatsächliches Gewicht/Gewicht des Lipids).
Darüber hinaus eingeschlossen ist in dieser Erfindung die Methode zur Behandlung eines Tiers, einschließlich eines Menschen, mit therapeutischen Dosen von Aminoglycosidliposomen, und darüber hinaus in Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger. Besonders angegeben ist die Behandlung von Gram-negativer Pneumonie.
Diese Erfindung schließt Liposomen ein, die wenigstens ein amphipatisches Lipid enthalten. Diese Erfindung schließt das Verfahren zur Erhöhung der Aminoglycosid-zu-Lipid-Arzneimittel-Verhältnisse in Liposomen des SPLV-Verfahrens ein durch verschiedenartiges Trocknen des Gemisches von Lipid-organischem Lösungsmittel-Aminoglycosid-wäßriger Phase zu Pulver, Stabilisierung des rehydratisierten Pulvers durch Stehen bei 4ºC für wenigstens acht Stunden und vorzugsweise für einen Tag. Diese Erfindung schließt weiterhin ein Gemisch aus Lipid-organischem-Lösungsmittel- Aminoglycosid-wäßriger Phase ein, das über einen Zeitraum von drei bis acht Stunden und vorzugsweise einen Zeitraum von fünf Stunden getrocknet worden ist. Alternativ dazu kann das Gemisch Lipid-organisches Lösungsmittel- Aminogylcosid-wäßrige Phase nur als Aufschlämmung oder Paste getrocknet werden.
Diese Erfindung schließt weiterhin ein die Entfernung von liposomal nicht-assoziiertem Aminoglycosid aus einem Aminoglycosid-Liposom- Präparat durch wenig energieverbrauchende Abtrennverfahren ein, wie Dialyse oder Chromatographie, wodurch viel Energie verbrauchende Methoden wie das Zentrifugieren vermieden werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Verwendung von Aminoglycosid-enthaltenden Liposomen wurde beschrieben in Verbindung mit der Behandlung von Tieren in der US-A-4552803 (Lenk et al). Die überraschenderweise erhöhte Wirksamkeit der Assoziierung von Aminoglycosidphosphat durch Liposomen macht diese Präparate besonders wirksam und effizient.
Liposomen sind Vesikel, bestehend aus Membranen aus einer geschlossenen Doppelschicht, die eine eingschlossene wäßrige Phase enthalten. Lipsomen können eine beliebige Vielfalt unilamellarer Vesikel (die eine Einzelmembran-Doppelschicht besitzen) oder mulitlamellarer Vesikel darsteller (z.B. Zwiebel-ähnliche Strukturen, gekennzeichnet durch konzentrische Membrandoppelschichten, die jeweils von der nächsten durch eine wäßrige Schicht getrennt sind).
Die Aminoglykosidphosphat-Liposomen dieser Erfindung werden durch Verfahren hergestellt, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Die ursprüngliche Liposomherstellung von Bangham et al. (1965, J. Mol. Biol. 13 : 238-252) beinhaltet Suspendieren von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel, das anschließend zur Trockne verdampft wird und einen Phospholipidfilm auf dem Reaktionsbehälter zurückläßt Anschließend wird eine entsprechende Menge einer wäßrigen Phase hinzugegeben, dem Gemisch wird gestattet zu "quellen", und die erhaltenen Liposomen, die aus multilamellaren Vesikeln bestehen (nachfolgend als MLVs bezeichnet), werden durch mechanische Mittel dispergiert. Die Struktur der erhaltenen Membran-Doppelschicht ist so, daß die hydrophoben (nichtpolaren) "Schwänze" des Lipids sich in Richtung der Mittel der Doppelschichten orientieren, während die hydrophilen (polaren) "Köpfe" sich in Richtung zur wäßrigen Phase orientieren. Diese Technik stellt die Basis für die Entwicklung von kleinen beschallten unilamellaren Vesikeln dar (nachfolgend als SUVs bezeichnet), die von Papahadjapoulos und Miller (1967, Biochim. Biophys. Acta. (135 : 624-638) beschrieben wurden, und von großen unlamellaren Vesikeln (nachfolgend als LUVS bezeichnet). Die Lehren von Bangham und die von Papahadjapoulos werden hier durch Verweis aufgenommen.
In der Praxis dieser Erfindung hinsichtlich Aminoglycosdiphosphaten wird eine Klasse von Liposomen bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine im wesentlichen gleichmäßige interlamellare Lösungsverteilung haben. Diese bevorzugte Klasse von Liposomen wurde als stabile plurilamellare Vesikel (SPLV) in der US-A-4522803 (Lenk et al) definiert und schließt monophasische Vesikel ein, wie sie in der US-A-4588578 (Foundtain et al.) beschrieben wurden, sowie eingefrorene und aufgetaute multilamellare Vesikel (FATMLV), wie sie in "Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesides", Mayer et al., Biochima et Biophysica Acta. 817 : 193-196 (1985) beschrieben wurden.
Große unilamellare Vesikel können modifiziert werden unter Verwendung einer Extrudervorrichtung nach einem Verfahren, das in WO 86/00238 beschrieben ist. Um LUVET-Vesikel mittels dieser Technik herzustellen, werden MLVs unter Druck von bis zu etwa 4826 KPa (700 psi) durch ein Membranfilter extrudiert. Diese Vesikel können wenigstens einem Frost-Tau-Zyklus vor der Extrudierung ausgesetzt werden; dieses Verfahren ist in WO 87/00043 beschrieben.
Eine andere Technik, die dazu verwendet wird, Vesikel herzustellen, ist eine, die Umkehrphasen-Verdampfungsvesikel (REV) bildet, Papahadjapoulos et al., US-A-4235871.
Unter dem hier verwendeten Begriff Lipid soll jedes geeignete Material verstanden werden, das eine Doppelschicht bildet, so daß der hydrophobe Teil des Lipidmaterials sich in Richtung der Doppelschicht orientiert, während der hydrophile Teil sich in Richtung der wäßrigen Phase orientiert.
Zwei allgemeine Klassen von Lipidverbindungen sind als Aminoglycosidphosphate in der vorliegenden Erfindung einsetzbar. Die prominentesten Glieder sind hoch-hydrophobe Verbindungen, wie Triglyceride. Maisöl dient als übliche und ökonomische Quelle für Misch-Triglyceride, es können jedoch auch andere pflanzliche Öle verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Palmkernöl, Kokosöl, Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Safloröl, Kakaobutter und ähnlichen. Es können auch spezielle molekulare Spezies angewandt werden. Zu solchen Spezies können gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Trilaurin-, Trimyristin-, Tripalmitin- und Tristearin- oder andere Glycerylester, in der die Fettsäurekettenacyclketten dieser Verbindungen sowie andere Fettsäuren in einer nicht-homogenen Art enthalten sind. Es können auch andere große Klassen langkettiger hydrophober Verbindungen angewendet werden, wie der weite Bereich der Cholesterinester. es ist bereits gefunden worden, daß langkettige organische Gemische, wie Rohvaseline, annehmbare Lipidmaterialien sind.
Weiterhin sind eine Vielzahl von Cholesterinen und anderen Sterinen und deren wasserlöslichen Derivate dazu verwendet worden, Aminoglycosidphosphat-Liposomen zu bilden; siehe speziell WO 86/05977. Mayhew et al., WO 85/00968, veröffentlicht am 14. März 1985, beschreibt ein Verfahren zu Verringerung der Toxizität von Arzneimitteln durch deren Einkapselung in Liposomen, umfassend α-Tocopherol und bestimmte Derivate davon. Es sind auch eine Vielzahl von Tocopherolen und deren wasserlösliche Derivate dazu eingesetzt worden, Liposome zu bilden, siehe CA-A-1 333 049. Bevorzugt aus dieser Gruppe sind Cholesterin-Hemisuccinat und Tocopherol- Hemisuccinat. Die einzige Beschränkung scheint darin zu bestehen, daß ausgewählten hydrophoben Verbindungen, wenn sie mit den anderen Komponeten dieser Erfindung komplexiert sind, in einem speziellen organischen Lösungsmittel löslich sein sollten, das für die Verwendung bei der Herstellung der Liposomen ausgewählt wird.
Die zweite große Klasse von Lipidmaterialien, die in dieser Erfindung als Aminoglycosidphosphat verwendet wird, haben amphipatischen Charakter. Hydrophiler Charakter kann dem Molekül verliehen werden durch das Vorhandensein von Phosphat-, Carboxy-, Sulfat-, Amino-, Sulfhydryl-, Nitro - und anderen ähnlichen. Hydrophobizität kann durch die Einbeziehung von Gruppen verliehen werden, die langkettige gesättigte und ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen und solche Gruppen einschließen, die durch eine oder mehrere aromatische, cycloaliphatische oder heterocyclische Gruppen substituiert sind, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die bevorzugten amphipatischen Verbindungen sind Phosphoglyceride, wobei repräsentative Beispiel Phosphatidycholin, Phosphatidylethanolamin, Lysophosphatidycholin, Lysophosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidinsäure, Dimyristoylphosphatidylglycerin und Diphosphatidylglycerin allein oder in Kombination mit anderen Lipiden einschließen. Ebenso verwendbar sind synthetische gesättigte Verbindungen, wie Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin oder Distearoylphosphatidylcholin oder ungesättigte Spezies wie Dioleolylphosphatidylcholin oder Dilinoleoylphosphatidylcholin. Andere Verbindungen, denen Phosphor fehlt, wie die Glieder der Sphingolipid- und Glycosphingolipid-Familien liegen ebenso innerhalb der Gruppe, die als Lipid bezeichnet wird.
Amphipatische Lipide sind notwendig als primäre liposomales Strukturelement für Aminoglycoside, die durch die modifizierte SPLV- Präparation hergestellt wird, die nachfolgend beschrieben wird. Bei der Bildung von Aminoglycosidliposomen über die modifizierte SPLV-Präparation können diese amphipatischen Lipide mit anderen Lipiden vermischt werden einschließlich Triglyceriden und Sterinen.
Was Phosphataminoglycoside betrifft, so besteht ein Verfahren zur Herstellung der Sterine enthaltenden Liposomen in Zusatz einer Salzform eines organische Säurederivates eines Sterins zu einem wäßrigen Puffer, das in der Lage ist, geschlossene Doppelschichten in einer Menge zu bilden, die ausreichend ist, vollständig geschlossene Doppelschichten zu bilden, die einen wäßrigen Teil einschließen. Eine Suspension multilamellarer Vesikel wird gebildet durch Schütteln des Gemisches. Die Bildung von Vesikeln wird erleichtert, wenn der wäßrige Puffer auch das Gegenion des Salzes in Lösung enthält.
Die Zufuhr von Energie zu der Suspension, z.B. durch Beschallung oder Extrudieren der Vesikel durch eine French-Druckzelle (French Press) oder durch ein poröses Filter mit entsprechender Porengröße wandelt die multilamellaren Sterinvesikel in unilamellare Vesikel um.
Die Liposomen umschließen ein wäßriges Medium, das durch Lipid- Doppelschichten umschlossen wird. Das wäßrige Medium kann zum Beispiel Wasser oder ein gelöstes Salz oder Puffer enthaltendes Wasser sein. Beispiele für derartige Salze oder Puffer können sein Natriumchlorid und Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Zu anderen Puffern gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Borat, Citrat, Tris-HCL (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid) und HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N¹-2-ethansulfonsäure). Puffer können im pH-Bereich von 2,0 bis 14,0 liegen. In der bevorzugten Ausführungsform mit Aminoglycosidphosphat werden die Präparate mit HEPES- Puffer (150 mm NaCl, 20 mm HEPES), pH 7,0, Boratpuffer (100 mm Na&sub2;HCO&sub3;, 50 mm H&sub3;BO&sub3;), pH 8,5, oder Citratpuffer (150 mm Na-Citrat), pH 8,5 hydratisiert.
In einem Liposom-Wirkstoff-Abgabesystem wird das therapeutische Mittel, hier das Aminoglycosid, in dem Liposom eingeschlossen und wird anschließend dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Zum Beispiel siehe Rahman et al., US-Patent Nr. 4,235,871; Schneider, US-A-4224179; Lenk et al., US-A-4522803; und Fountain et al., US-A-4588578.
Pharmazeutische liposomale Präparate werden als bevorzugte Ausführungsform in physiologischer Kochsalzlösung oder in Wasser, gepuffert mit Phosphat oder Citrat, für die Injektion geeignet abgegeben.
Gegebenenfalls können die Aminoglycosidphosphat-Liposomen dehydratisiert werden, wodurch eine Lagerung für längere Zeiträume bis zur Verwendung möglich gemacht wird. Zur Dehydratisierung der Liposomen können eine Standard-Gefriertrocknungsvorrichtung oder ein ähnliches Geräte verwendet werden. Liposomen können auch einfach dehydratisiert werden, indem sie unter verminderten Druck gesetzt werden. Alternativ dazu können die Liposomen und das sie umgebende Medium vor der Dehydratisierung in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Die Dehydratisierung mit vorherigem Einfrieren kann in Gegenwart von einem oder mehreren Schutzzuckern im Präparat durchgeführt werden, und zwar nach dem Verfahren von Janoff et al., WO 86/01103. Beispiele von Schutzzuckern, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Trehalose, Maltose, Sucrose, Glucose, Lactose und Dextran. Alternativ dazu können multilamellare Vesikel dehydratisiert werden mit vorherigem Einfrieren auch ohne Schutzzucker. Wenn die dehydratisierten Liposomen verwendet werden sollen, wird eine Re- Hydratisierung erreicht mittels Verfahren, zu denen eine einfache Zugabe einer wäßrigen Lösung, z.B. destilliertes Wasser, zu den Liposomen, und der dadurch erfolgenden Re-Hydratisierung beinhalten.
Die erfindungsgemäßen Aminoglycoside werden assoziiert mit Liposomen verabreicht und gewünschtenfalls im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger (wie physiologischer Kochsalzlösung oder Phosphatpuffer), ausgewählt unter Berücksichtigung des beabsichtigten Verabreichungsweges und der pharmazeutischen Standardpraxis. Die Dosismengen für Aminoglycoside, wenn sie mit Liposomen assoziiert sind, werden oft über denen für Aminoglycoside allein liegen; die Dosierung wird von dem verschreibenden Mediziner erfolgen unter Berücksichtigung vieler Faktoren, einschließlich des Alters, des Körpergewichtes und des Zustandes des Patienten. Das Verhältnis von aktivem Bestandteil zum Träger hängt natürlich von der chemischen Natur, der Löslichkeit und der Stabilität des Aminoglycosides ab sowie von der beabsichtigten Dosis. Für die pärenterale Verabreichung oder die Injektion über solche Wege wie den intravenösen, den intraperitonialen, den intramuskulären, den subkutanen oder den intramammären Weg werden sterile Lösungen der Liposomzusammensetzung hergestellt. Bei intravenöser Verwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe kontrolliert werden, um das Präparat isotonisch zu halten.
In einem anderen Beispiel ihrer Verwendung können die liposomal assoziierten Aminoglycoside in eine Vielzahl von topischen Dosierungsformen eingearbeitet werden, einschließlich Gelen, Ölen, Emulsionen und ähnlichen, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zum Beispiel kann die Suspension, die das liposomal assoziierte Aminoglycosid enthält, zu der wäßrigen Phase eines Bestandteiles im Liposomenpräparat zugegeben werden. Derartige Präparate können als topische Cremes, Pasten, Salben, Gele, Lotionen und ähnliches für die direkte Applikation verabreicht werden.

1. Phosphatsalze von Aminoglycosiden.

Die Aminoglycoside enthalten jeweils einen oder mehr Aminozucker, die durch glycosidische Bindungen zu einem sechsgliedrigen Basis-Kohlenstoffring verbunden sind. Verschiedene Phosphatsalze können durch Titration mit Phosphatgruppen aufweisenden Säuren gebildet werden. Im allgemeinen ist es leichter, ein Phosphatsalz eines Aminoglycosids zu bilden, als ein Phosphat kovalent an ein Aminoglycosid zu binden.
In Abhängigkeit von einer Anzahl von Faktoren einschließlich der Wahl des Titrationsmittels, des spezifischen Aminoglycosids, des Lösungsmittels und der Temperatur sind theoretisch eine Anzahl von Phosphatsalzen möglich.
Klar können Aminoglycoside mit der Fähigkeit zur Assoziierung mit einer Anzahl von Phosphateinheiten in Graden der Phosphatassoziierung eingesetzt werden. In der Praxis dieser Erfindung haben die bevorzugten Aminoglycoside ein Verhältnis von etwa 1:1.6 zu etwa einem Verhältnis von 1:5 Molekülen Aminoglycosid zu Phosphat. Wie hier verwendet, betrifft Aminoglycosidphosphat ein Aminoglycosid, das mit mindestens einem Phosphat assoziiert ist.

2. Herstellung der Phosphatform

Im allgemeinen kann Aminoglycosidphosphat mit jedem Lösungsmittel hergestellt werden, das sowohl Aminoglycosid als auch Phosphat adäquat löst, jedoch nicht deutlich sauer ist. Wäßrige Lösungsmittel, insbesondere Wasser, sind bevorzugt. Der vorhandene pH ist charakteristisch für die Quelle des Phosphattitrationsmittels und des Aminoglycosids. Phosphatquellen sind Phosphorsäuren und Metallphosphatsalze wie Natrium- oder Kaliumphosphat. Die Temperatur und der Druck sind nicht kritisch, und häufig sind Standardtemperatur und -druck am bequemsten. Die Temperatur sollte nicht die Temperatur übersteigen, bei der das Aminoglycosid stabil bleibt.

3. Herstellung von Aminoglycosidphosphat-Liposomen

Liposomen können nach einer Anzahl der Methoden hergestellt werden, die in den oben einbezogenen Referenzen offenbart sind. Alternativ kann eine Methode zur Herstellung von Liposomen nach dem Verfahren des Mischens einer wäßrigen Phase mit von organischem Lösemittel freiem Lipid eingesetzt werden. Monophasische Vesikel (MPVs) wie in US-Patent Nr. 4,588,578 werden gebildet durch die allgemeine Methode (a) Bilden einer Dispersion eines Lipids in einem organischen Lösungsmittel, (b) Kombinieren der Dispersion mit einem Aminoglycosidphosphat in einer wäßrigen Phase zur Bildung einer biphasischen Mischung, in der die wäßrige Phase eingekapselt werden kann, und (c) Entfernen des organischen Lösungsmittels.
Genauer gesagt wird ein Lipid oder eine Mischung aus Lipiden und einer wäßrigen Komponente zu einem organischen Lösungsmittel oder einer Kombination von organischen Lösungsmitteln in Mengen gegeben, die ausreichen zur Bildung einer Monophase. Das Lösungsmittel oder die Lösungsmittel werden verdampft, bis sich ein Film bildet. Dann wird eine geeignete Menge der wäßrigen Komponente zugegeben, und der Film wird resuspendiert und geschüttelt, um die MPVs zu bilden.
Das organische Lösungsmittel oder die Kombination von Lösungsmitteln, die in dem Verfahren eingesetzt werden können, muß mit Wasser mischbar sein, und sollte nach Mischen mit Wasser die zur Herstellung der MPVs verwendeten Lipide lösen.
Beispielsweise kann ein organisches Lösungsmittel oder eine Mischung von Lösungsmittel, die die folgenden Kriterien erfüllt, im Verfahren eingesetzt werden: (1) 5 ml des organischen Lösungsmittels bildet eine Monophase mit 0,2 ml wäßriger Komponente und (2) das Lipid oder die Mischung von Lipiden ist in der Monophase löslich.
Lösungsmittel, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, jedoch nicht darauf beschränkt, sind Ethanol, Aceton, 2- Propanol, Methanol, Tetrahydrofuran, Glyme, Dioxan, Pyridin, Diglyme, 1- Methyl-2-pyrrolidon, Butanol-2, Butanol-1, Isoamylalkohol, Isopropanol, 2- Methoxyethanol oder eine Kombination von Chloroform und Methanol (z.B. in einem 1:1 Verhältnis v/v).
Die Verdampfung des Lösungsmittels sollte bei geeigneten Temperaturen und Drücken durchgeführt werden, die die Monophase aufrechterhalten und die Verdampfung der Lösungsmittel erleichtern. Tatsächlich sind die gewählten Temperaturen und Drücke nicht abhängig von der Phasenübergangstemperatur des zur Bildung der MPVs verwendeten Lipids. Der Vorteil dieses letzteren Punktess liegt darin, daß Hitze-labile Aminoglycoside, die wünschenswerte Eigenschaften haben, in MPVs eingearbeitet werden können, die hergestellt werden aus Phospholipiden wie Distearoylphosphatidylcholin, das zu üblichen Liposomen nur bei Temperaturen oberhalb der Phasenübergangstemperatur des Phospholipids geformt werden kann.
Stabile plurilamellare Vesikel von Aminoglycosidphosphat, SPLVs, werden wie folgt hergestellt: ein amphipatisches Lipid oder ein Gemisch von Lipiden wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Dieses stellt das erste Gemisch dar. Viele organische Lösungsmittel sind geeignet, Diethylether, halogenierte Kohlenwasserstoffe und Gemische von fluorierten Kohlenwasserstoffen und Ether sind jedoch bevorzugt. Zu dieser Lösung wird eine wäßrige Phase und das einzuschließende Aminoglycosid gegeben. Dieses zweiphasige Gemisch wird durch Emulgieren des wäßrigen Materials im organischen Lösungsmittel in SPLVs umgewandelt, während das Lösungsmittel abgedampft wird. Die Verdampfung kann unter Beschallen mittels einer beliebigen Verdampfungstechnik erfolgen, z.B. Verdampfung durch Überleiten eines Inertgasstromes über das Gemisch, durch Erhitzen oder durch Vakuum. Das Volumen des verwendeten organischen Lösungsmittels muß das wäßrige Volumen übersteigen, so daß das wäßrige Material vollständig in dem Gemisch emulgiert werden kann. In der Praxis kann ein Minimum von grob 3 Volumina Lösungsmittel zu 1 Volumen wäßriger Phase verwendet werden. Tatsächlich kann das Verhältnis von Lösungsmittel zu wäßriger Phase bis zu 100 oder mehr Volumina Lösungsmittel zu 1 Volumen wäßriger Phase variieren. Die Menge an Lipid muß ausreichend sein, so daß sie die Menge überschreitet, die erforderlich ist für den Überzug der Emulsionströpfchen (etwa 40 mg Lipid pro ml wäßriger Phase). Die obere Grenze ist nur begrenzt durch die Praktikabilität und Effektivität, SPLVs können z.B. mit 15 g Lipid pro ml wäßriger Phase hergestellt werden.
Das Verfahren produziert Liposomen mit anderen supramolekularen Organisationen als übliche Liposomen. Erfindungsgemäß kann das gesamte Verfahren in einem Temperaturbereich von etwa 4ºC bis etwa 60ºC durchgeführt werden, unabhängig von der Phasenübergangstemperatur des verwendeten Lipids. Der Vorteil dieses letzteren Punkts liegt darin, daß labile Aminoglycoside, die wünschenswerte Eigenschaften haben, in SPLVs eingearbeitet werden können, die aus einem Phospholipid wie Distearoylphosphatidylcholin hergestellt wurden, die jedoch zu üblichen Liposomen nur bei einer Temperatur oberhalb ihrer Phasenübergangstemperatur geformt werden können.
Zur Bildung von FATMLVs ist ein Beispiel eines geeigneten Verfahrens wie folgt: ein oder mehr ausgewählte Lipide werden auf den Innenwänden eines geeigneten Gefäßes abgelagert, indem die Lipide in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform gelöst werden, und das organische Lösungsmittel anschließend verdampft wird, Zugabe einer wäßrigen Phase, die ein einzukapselndes Aminoglycosidphosphat enthält zu dem Gefäß, Hydratisieren des Lipids mit der wäßrigen Phase und mechanisches Rühren (beispielsweise durch Schwenken oder Vortex) der resultierenden Lipidsuspension zur Herstellung der Liposomen, die dann einem Frost-Tau-Prozess unterworfen werden.
Alternativ können ein oder mehr ausgewählte Lipide dispergiert werden durch Verwendung von mechanischem Rühren in einer wäßrigen Phase zur Herstellung multilamellarer Vesikel (MLVs), die auch dem Frost-Tau-Prozeß unterworfen werden können. Das Verfahren erfordert etwa 1 bis 10 Minuten bei einer Temperatur oberhalb der Gel-/Flüssigkristall-Übergangstemperatur.
Die Lipidkonzentration zur Herstellung von MLVs beträgt mindestens 50 mg/ml wäßriges Lösungsmittel. Bei niedrigeren Konzentrationen ist es schwieriger, multilamellare Vesikel mit einer hohen Einkapselungseffizienz herzustellen. Eine bevorzugte Lipidkonzentration liegt zwischen etwa 100 und 1000 mg/ml wäßriges Lösungsmittel, bevorzugter 100 bis 600 mg/ml und noch bevorzugter 100 bis 400 mg/ml. Weder Detergenz noch organisches Lösungsmittel wird benötigt.
Der Frost-Tau-Zyklus, der in FATMLVs resultiert, erfordert schnelles Einfrieren der dispersen Lipsomenmischung und anschließendes Aufwärmen der gefrorenen Mischung in einem Konstanttemperaturbad bei einer Temperatur, die das Schmelzen der wäßrigen Phase verursacht. Die verwendete Temperatur liegt im allgemeinen über der Übergangstemperatur des Gel- /Flüssigkristall-Übergangs. Ein Konstanttemperaturbad von etwa 25-50ºC, bevorzugt etwa 40ºC ist im allgemeinen effektiv.
Bäder mit flüssigem Stickstoff wurden als besonders wirksam für den Einfrierschritt erkannt. Die Anzahl von Frost-Tau-Zyklen beeinflußt die Eigenschaften der resultierenden FATMLVs. Im allgemeinen sind drei oder mehr, bevorzugt etwa fünf oder mehr Frost-Tau-Zyklen erforderlich, um eine interlamellare osmotische Gleichgewichtsbalance zu erzielen. Etwa fünf Frost- Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff und einem Konstanttemperaturbad bei 40ºC ergeben bevorzugte FATMLVs.

4. Pharmakologische Verwendung von Aminoglycosiden

Die Aminoglycoside können als Breitenspektrum-Antibiotika klassifiziert werden. In Hinblick auf das antibakterielle Spektrum gibt es Ähnlichkeiten unter ihnen, jedoch gibt es auch beträchtliche Unterschiede, daher sollten Generalisierungen vermieden werden. Die Aminoglycoside dieser Erfindung und die liposomal assoziierten Aminoglycoside sind nützlich in therapeutisch wirksamen Dosen bei der Behandlung von gram-negativer Pneumonie.
Aminoglycoside können in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Träger(n) verabreicht werden. Derartige Träger sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Aminoglycoside werden vorzugsweise intramuskulär oder intravenös verabreicht. Ophthalmische Lösungen und Salben sind ebenso erhältlich für topische ophthalmische Applikationen. Cremes sind in vielen Fällen für topische Applikation erhältlich.
Es sind allerdings viele Erwägungen bei der Festlegung einer tatsächlichen Dosis zu treffen, einschließlich des Auftretens von Nierenversagen, des zu verwendenden Aminoglycosides, des Lebewesens und dessen gegenwärtigem Zustand. Eine therapeutisch wirksame Dosis eines Aminoglycosides wird die Dosis sein, die im Hinblick auf die Besonderheit der Applikation das gewünschte Ergebnis bringt. IM- oder IV-Präparate von Aminoglycosidphosphat-assoziierten Liposomen werden bevorzugt als Suspension in einer Kochsalzlösung gegeben.

5. Modifiziertes SPLV-Präparat von Aminoglycosidliposomen mit erhöhtem Wirkstoff-zu-Lipid-Verhaltnis

SPLVS, hergestellt durch ein neues Verfahren, werden wie folgt hergestellt: ein amphipatisches Lipid oder ein Gemisch von Lipiden wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Dieses stellt das erste Gemisch dar. Viele organische Lösungsmittel sind geeignet, Diethylether, halogenierte Kohlenwasserstoffe und Mischungen von halogenierten Kohlenwasserstoffen und Ether sind jedoch bevorzugt, wobei Methylenchlorid besonders bevorzugt ist. Zu dieser Lösung werden eine wäßrige Phase und das Aminoglycosid, das liposomal assoziiert werden soll, zugegeben. Aminoglycosidsulfat ist in diesem Stadium am bevorzugtesten. Diese biphasische Mischung wird dann durch Emulgieren des wäßrigen Materials innerhalb des organischen Lösungsmittels unter Verdampfen des Lösungsmittels und in der bevorzugten Ausführungsform Verdampfen zur Trockne in SPLVS umgewandelt. Das Verdampfen kann mittels einer beliebigen Verdampfungstechnik erfolgen, z.B. Verdampfen durch Überleiten eines Inertgases über die Mischung durch Erhitzen oder durch Vakuum. Trocknen, und insbesondere Trocknen zu Pulver in der bevorzugten Ausführungsform wird erzielt während etwa 3 bis 8 Stunden und bevorzugt mehr als 5 Stunden, und bevorzugt unter Rühren und am meisten bevorzugt unter Rühren bei hoher Geschwindigkeit. Die Trocknungstemperatur liegt zwischen etwa 25º und 45ºC. Die Temperatur muß nicht am oder über dem Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels liegen, der selbstverständlich mit dem Druck des Systems variiert. Mit Methylenchlorid sind etwa 40 C bevorzugt. Falls nicht zum Pulver getrocknet wird, ist Trocknen zu einer Paste oder einer Aufschlämmung akzeptabel. Das Volumen des verwendeten organischen Lösungsmittels muß proportional zum wäßrigen Volumen sein, so daß das wäßrige Material vollständig in der Mischung emulgiert werden kann. In der Praxis kann ein Minimum von grob einem Volumen Lösungsmittel zu einem Volumen wäßrige Phase eingesetzt werden. Tatsächlich kann das Verhältnis von Lösungsmittel zu wäßriger Phase bis zu 100 oder mehr Volumina Lösungsmittel zu ein Volumen wäßriger Phase variieren. Die Menge des Lipids muß ausreichen, so daß die Menge überschritten wird, die notwendig ist zum Überziehen der Emulsionströpfchen (etwa 40 mg Lipid pro ml wäßrige Phase). Die obere Grenze ist lediglich durch die Praktikabilität und Effizienz beschränkt, SPLVs können jedoch mit 15 g Lipid pro ml wäßriger Phase hergestellt werden.
Wenn ein Pulver gebildet wurde, wird das Präparat anschließend re-hydratisiert. Es ist eine Beschränkung dieses Verfahrens, daß dem Material ein Zeitraum für die "Stabilisierung" gestattet wird. Die Temperatur für die Stabilisierung ist nicht kritisch, jedoch ergeben kältere Temperaturen (oberhalb des Gefrierpunktes) einen geringeren liposomalen Abbau. Daher wird die Stabilisierung vorzugsweise bei 4ºC durchgeführt. Der Zeitraum für die Stabilisierung beträgt im Minimum acht Stunden und liegt vorzugsweise bei wenigstens einem Tag. Nach der Stabilisierung kann nicht-assoziiertes Aminoglycosid entfernt werden, was in der bevorzugten Ausführungsform erfolgt.
Die Entfernung von nicht-assoziiertem Aminoglycosid muß in der Weise erfolgen, daß keine nachteilige Wirkung auf die liposomale Struktur erfolgt. Das Dialysieren gegen eine Salzlösung ist ein solcher nicht nachteilig beeinflussender Prozeß mit geringer Energie. Das Zentrifugieren ist ein Prozeß mit hoher Energie, der nachteilig die liposomale Integrität beeinträchtigen kann und daher nicht angewandt werden sollte. Es können auch andere Arten von energiearmen Prozessen eingesetzt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie die Chromatographie.
Vor der Entfernung von nicht-assoziiertem Aminoglycosid können die Liposomen auf Größe gebracht werden. Für die intravenöse Verwendung beim Menschen werden sie vorzugsweise auf eine Größe von 3 bis 5 µm gebracht, die Größe unterhalb des Bereiches, bei dem eine Kapillarblockierung auftreten kann.
Die Einstellung der Größe kann nach einem beliebigen Verfahren erfolgen, einschließlich der Homogenisierung und der Extrudierung beispielsweise durch ein Stahlsieb, geradwegige oder verschlungene Filtration, einschließlich durch Membranfilter aus Polycarbonat und anderen polymeren Substanzen.
Optimale Ergebnisse erfordern, daß das Liposomengemisch vor der Re-Hydratisierung zu einem Pulver getrocknet wird. Ein weiteres Erfordernis für optimale Ergebnisse besteht darin, daß die Liposomen stehen bleiben, um sich über Nacht vor der Entfernung der nicht-assoziierten Aminoglycoside zu stabilisieren. Weiterhin ergeben sich die bevorzugtesten Ergebnisse dieses Verfahrens durch die Verwendung der Sulfatsalzform des Aminoglycosides. Allerdings sind auch Aminoglycosidsalze, einschließlich des Phosphats, Chlorids und des Tartrats in Betracht zu ziehen sowie die freie Base des Aminoglycosids. Innerhalb dieser Erfindung sind auch Aminoglycosidsalze, die mit hydrophoben Resten gebildet werden, in Betracht zu ziehen. Derartige hydrophobe Reste sind Fettsäuren, zum Beispiel Palmitat, Myristat und Stearat.
Durch die vorgenannten Methoden zur Herstellung von Liposomen dieser Erfindung bleibt das in erhöhtem Maße mit Liposomen assoziierte Aminoglycosid nicht frei in Lösung. Unter "im wesentlichen assoziiert" ist zu verstehen, daß nicht mehr als 60 % des in einem Präparat vorhandenen Nichtguanidin-Aminoglycosids nicht mit den Liposomen assoziiert ist.
Aminoglycosid-assoziierte Liposomen und insbesondere Nichtphosphat-Aminoglycoside dieser Erfindung, hergestellt durch die modifizierten SPLV-Präparate, haben erhöhte Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnisse im Vergleich mit der früheren Technik.
Dieses Präparat resultiert in einer Erhöhung der liposomalen Assoziierung für Guanidin-Aminoglycosid-Liposomen, die hergestellt werden durch das erfindungsgemäße Verfahren, wobei solche Guanidin-Aminoglycosid- Liposomen Wirkstoff (freigesetzt)-zu-Lipid-Verhältnisse von mehr als etwa 9:25 (Äquivalentgewicht/Gewicht) mit mehr als etwa 60 mg Streptomycinsulfat (tatsächliches Gewicht) in Assoziation mit 100 mg EPC aufweisen.

Beispiel 1 (Dieses Beispiel ist kein Teil der beanspruchten Erfindung) Herstellung von Aminoglycosidphosphat-Liposomen

Herstellung von Vorläuferliposomen mit verschiedenen Gentamycin- Konzentrationen. 16 Rundkolben wurden in Gruppen zu je 4 aufgestellt. Jede Gruppe enthielt 4 Kolben, jeweils enthaltend 50, 100, 200 und 300 mg Lipid wie Eierphosphatidylcholin (EPC), entweder als dünner Film oder in gepulvertert Form. Die Vesikel in Gruppe 1 wurden mit 50 mg/ml Aminoglycosid (in allen Gruppen) hergestellt. Als erstes wurden 1,0 ml Aliquots von 50 mg/ml Aminoglycosid in die 4 diese Gruppe darstellenden separaten Kolben pipettiert, und sie wurden heftig mit einem Vortex gerührt. Vollständiges Mischen ergab MLV-Präparate, die homogen waren und eine milchige Konsistenz hatten. Diese Proben wurden in Kunststoff-Kryovials gegeben. Die Proben durchliefen dann den Frost-Tau-Prozeß. Dieser Prozeß wurde mit den 3 verbleibenden Gruppen wiederholt.
Die Proben in Gruppe 2 wurden mit 100 mg/ml Aminoglycosid hergestellt und denselben 4 Ausgangsgewichten von EPC. Genauso wurden die 4 Proben in Gruppe 3 mit 200 mg/ml Aminoglycosid und die 4 Proben in Gruppe 4 mit 400 mg/ml Aminoglycosid hergestellt. Das resultierende Set von 16 Proben wurde in Gruppen zu 4 arrangiert, und jede enthielt verschiedene Ausgangsverhältnisse von Lipid und Aminoglycosid.

Frost-Tau-Zyklus.

Die Aminoglycosid:Lipid-Mischungen wurden in Kryovials transferiert, die dann mit einer Kappe verschlossen wurden. Es war jedoch hilfreich, daß das Kryovial-Septum die Bewegung des expandierenden und kontrahierenden Gases während des Frierens und Tauens ermöglicht. Jedes Vial wurde auf einem Metallarm sicher befestigt, der zum Eintauchen des Viais in einen Flüssigstickstofftank verwendet wurde.
Jede Probe wurde heftig geschüttelt, um das Lipid mit dem wäßrigen Aminoglycosid zu mischen. Das Vial wurde sofort in einen Flüssigstickstoffbehälter eingetaucht. Um die Wirkstoff-Lipid- Wechselwirkungen zu verstärken, wurden die Proben gründlich gemischt und hatten beim Einfrieren eine homogene, milchige Konsistenz.
Wenn eine Probe vollständig gefroren war (etwa 1 Minute) wurde das Vial in ein 40ºC Wasserbad gegeben, und vollständig aufgetaut. Nach dem Auftauen wurden die Vials heftig geschüttelt und dann wurde sofort der nächste Frost-Tau-Zyklus gestartet, indem das Vial vor der Phasentrennung zurück in den flüssigen Stickstoff gegeben wurde.
Für beste Ergebnisse wurde ein Minimum von etwa fünf Frost-Tau- Zyklen benötigt; die Einkapselung bestimmter Verbindungen konnte jedoch auch durch Erhöhung der Anzahl der Frost-Tau-Zyklen auf etwa zehn erzielt werden.

Beispiel 2 (Dieses Beispiel ist kein Teil der beanspruchten Erfindung) Modifiziertes SPLV-Präparat von Aminoglycosidliposomen mit erhöhtem Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis Herstellung von Vorläuferliposomen

Ein g Lipid (Ei-Phosphatdycholin "EPC") wurde zu einem Film in einem 500 ml Rundkolben getrocknet. Das Lipid wurde resuspendiert unter Verwendung von etwa 50 ml Methylenchlorid.
Eine wäßrige Lösung von Aminoglycosid wurde zu einem Gemisch gegeben. Die wäßrige Lösung bestand aus 0,5 g Gentamycinsulfat (tats.Gew.) in 9 ml von 0,9 % Kochsalzlösung (Gewicht/Volumen). Das erhaltene Gemisch wurde durch Rühren bewegt. Dieses Verfahren führte zu Vorläuferliposomen.

Trocknen, Re-Hydratisierung und Stehenlassen

Das liposomale Gemisch wurde unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der Druck wurde verringert, jedoch unter dem Sieden gehalten, bis die Probe zu einem Pulver getrocknet war. Dieses Verfahren dauerte etwa vier bis fünf Stunden bei 40ºC. Das Gemisch wurde unter Stickstoff re-hydratisiert mit etwa 9 ml destilliertem Wasser und 41 ml 0,9 % Kochsalzlösung (Gewicht/Volumen). Das Gemisch wurde gerührt, bis eine milchige Farbe erreicht wurde, wobe keine Aggregate oder Materialklumpen vorhanden waren. Dieses Verfahren dauerte zwei Stunden bei etwa 40ºC. Das Gemisch wurde bei 4ºC für einen Tag stehengelassen oder stabilisiert.

Dialysieren

Die Probe wurde anschließend auf eine Größe von etwa 3 µm gebracht durch Extrudieren bei Drücken von bis zu etwa 700 psi durch ein geradwegiges Polycarbonatmembranfilter. Nach der Filtration wurde das Material etwa 2 Tage gegen 0,9 % Kochsalzlösung (Gewicht/Volumen) dialysiert. Die Dialyse entfernte im wesentlichen alles nichtliposomal assoziierte Aminoglycosid.

Claims

1. Liposomen, die mindestens ein Guanidinoaminoglykosid umfassen, das in einem Wirkstoff (Equivalentgewicht)- zu -Lipidverhältnis von mindestens 9 : 25 (m/m) vorhanden ist.

2. Liposomen gemäss Anspruch 1, wobei das Aminoglykosid Streptomycinsulfat ist.

3. Liposomen gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei die Liposomen multilamellar sind.

4. Liposomen gemäss Anspruch 3, wobei die multilamellaren Liposomen SPLV-Liposomen sind.

5. Verfahren zur Herstellung der SPLV-Liposomen germäss Anspruch 4, wobei die Liposomen mindestens ein Guanidinoaminoglykosid umfassen, das in einem Wirkstoff : Lipidverhältnis (Equivalentgewicht) von mindestens 9 : 25 (m/m) vorhanden ist, und wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:

a) Lösen mindestens eines amphipatischen Lipids in organischem Lösungsmittel;

b) Zugabe einer wäßrigen Phase und eines Aminoglykosids zur in Stufe a) gebildeten Lösung zur Bildung einer biphasischen Mischung;

c) Emulgieren der wäßrigen Phase der Mischung aus Stufe b) in der organischen Phase, während die organische Phase verdampft wird; und

d) Trocknen des aus Stufe c) resultierenden Materials.

6. Verfahren aus Anspruch 5, wobei das Trocknen bis zu einem Pulver erfolgt, wobei das Pulver hydratisiert wird und wobei das hydratisierte Material während mindestens etwa 8 Stunden im hydratisierten Zustand gehalten wird.