DE68903209T2

DE68903209T2 - Verfahren zur trennung von glycolipiden aus einer lipidmischung und verwendung von den erhaltenen fraktionen.

Info

Publication number: DE68903209T2
Application number: DE8989118183T
Authority: DE
Inventors: Ladislas Colarow
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1989-09-30
Publication date: 1993-05-06
Anticipated expiration: 2009-10-01
Also published as: AU621407B2; EP0365868B1; IE893155A1; EP0365868A3; JP3012259B2; ATE81469T1; PT92133A; CH677494A5; DK536489A; DK536489D0; US5284941A; IE62791B1; FI93123C; DE68903209D1; MY104676A; NO170635C; FI93123B; NO894294L; PT92133B; IE893155L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Glykolipiden aus einem Lipidgemisch mit einem Gehalt an komplex gebundenen Lipiden (CL).
Die komplexen Lipide sind chemische Strukturen, welche in den biologischen Geweben weit verbreitet sind, wo sie eine grundlegende Stellung im Zwischenstoffwechsel und in den Zellen gewisser Organe, wie z.B. dem Gehirn und der Leber, einnehmen. Man unterteilt sie in zwei Hauptklassen: die Phospholipide (PL), welche durch Hydrolyse Mineralphosphate ergeben, wie z.B. das Phosphatidylcholin (PC), das Phosphatidylethanolamin (PE), und das Phosphatidylinosit (PI); und die Glykolipide (GL), deren Strukturbasen Sphingosin, wie z.B. der Cerebroside, Hämatoside, Ganglioside, Glycerin, wie z.B. der Mono- und Digalactosyldiglyceride; oder Sterine, wie z .B. der Sterylglukoside und deren Ester; jeweils wenigstens einen Zuckerrest enthalten. Die Menge an GL in den CL ist im allgemeinen 3 bis 10-mal kleiner als jene der PL.
Die tierischen GL, welche im Gehirn in hoher Konzentration vorliegen, stellen wichtige funktionelle Komponenten der Membranen dar, und sie sind am Intramembrantransport, am zellulären Erkennen, an der Synapsen-Übertragung, am Zellwachstum, an der Fixierung von Hormonen, Enzymen, Bakterien, bakteriellen Toxinen, an malignen Unwandlungen und an vielen anderen biologischen Funktionen beteiligt. Somit finden die GL z.B. Anwendungen in der Medizin, in der Pharmakologie, in der Geriatrie und in der Kosmetik.
Man kann die GL teilweise oder vollständig aus biologischen Geweben mit Hilfe von unterschiedlichen Mischungen organischer polarer Lösungsmittel extrahieren, z.B. mit Chloroform-Methanol, Hexan-Isopropanol, Tetrahydrofuran-Wasser. Gemäß diesen Verfahrensweisen erhält man die GL nur im Gemisch mit den neutralen Lipiden (NL) und den PL, und man bezeichnet diese Extrakte als Gesamtlipidextrakte (TL). Als Variante extrahiert man die biologischen Gewebe zuerst mit Aceton, um daraus einen Großteil der NL zu entfernen, wie z.B. die Triglyceride, Sterine und die freien Fettsäuren, und dann extrahiert man die restlichen Membranlipide mit Hilfe der oben erwähnten polaren organischen Lösungsmittel. Man kann die Auftrennung der TL auf verschiedene Art und Weise fortsetzen. Die am weitesten verbreitete Methode ist das Folch-Verfshren, gemäß welchem man in einem Zweiphasen-Lösungsmittelsystem aus Chloroform-Methanol-Wasser eine obere Phase sammelt, welche den Großteil der Ganglioside, die GL mit mehr als 4 bis 5 Zuckerresten und Spuren von sauren PL (APL) enthält, sowie eine untere Phase sammelt, welche den Großteil der PL, die Ceramide, die Sterylglukoside, die Ceramidmono-, -di- und -trihexoside und alle nicht-polaren Lipide, wie z.B. die Triglyceride, enthält. Die Auftrennung der Lipide ist jedoch keine saubere; so findet man z.B. in beiden Phasen Hämatoside.
Ebenfalls bekannt ist ein großtechnisches Verfahren zum Auftrennen der NL und der CL auf der Basis der Verwendung eines Hexan-Ethanol-Gemisches. Bei anderen Verfahren wendet man die Flüssigkeitschromatographie an; diese haben jedoch den Nachteil einer zu geringen Kapazität, wie z.B. von 30 mg Lipiden je g Silikagel. Ein sehr attraktives Verfahren ist in der Patentanmeldung DE 2 915 614 beschrieben, welches darin besteht, die TL auf Silikagel in die NL und die PL aufzutrennen, ohne jedoch die anderen CL, wie z .B. die Ganglioside oder die GL, zu erwähnen. Im Rahmen dieses Verfahrens werden die NL als jener Teil der TL definiert, welcher in den Kohlenwasserstoffen löslich ist, im Gegensatz zu den PL, welche in den genannten Lösungsmitteln Mizellen bilden. Nur die Mizellen bildenden Lipide lassen sich frei aus dem Silikagel eluieren, während die NL absorbiert verbleiben.
Dieses Verfahren ist jedoch mit Nachteilen behaftet. Tatsächlich bilden viele GL nicht spontan Mizellen in Gegenwart von Kohlenwasserstoffen. Demzufolge bilden sich in den Kohlenwasserstoffen unlösliche, feste Teilchen, welche die Silikagelsäule verstopfen, welche nun die neutralen NL adsorbiert. Demzufolge werden nur die PL quantitativ aus der Säule eluiert.
Die vollständige Rückgewinnung der GL aus Gemischen von CL ist möglich, erfordert aber eine ungewöhnlich lange Zeit. Nach dem geläufigen Verfahren werden die Lipide zuerst während 24 bis 48 h über Phosphorpentoxid vollständig getrocknet, wonach sie mit Essigsäureanhydrid in Pyridin acetyliert werden. Anschließend trennt man die acetylierten GL von den anderen Lipiden durch Flüssigkeitschromatographie auf einer Florisil -Säule ab, man entacetyliert die GL, neutralisiert sie, entfernt die Salze und trocknet schließlich durch Lyophilisieren. Durch dieses Verfahren werden alle PL ebenso wie gewisse GL zerstört, welche basenempfindliche Bindungen enthalten, wie z.B. die Ganglioside mit N-O-Diacetylneuraminsäure. Außerdem erfordert das Verfahren mehrere Tage, ja sogar eine Woche.
In dem Bestreben, für die obgenannten Schwierigkeiten eine Lösung zu finden, ist ein einfaches Flüssigkeitschromatographieverfahren vorgeschlagen worden, welches darin besteht, daß man ein wiederverwendbares Harz herstellt, welches Phenylboronsäure-(PBA)-Gruppen enthält, welche durch kovalente Bindung an eine Matrix aus vernetztem Polystyrol gebunden sind. Dieses Verfahren ist in dem "Journal of Chromatography", Bd. 153, (1978), S. 550 - 552, beschrieben. Das Harz hält selektiv alle GL durch Komplexbildung zwischen den PBA-Gruppen und den cis-Diol-Gruppen des Zuckerteiles der GL fest, wodurch somit ein vollständiges Eluieren der PL und der NL ermöglicht wird. Es folgt ein Entkomplexieren der GL durch ein wässeriges organisches Lösungsmittel. Die Beladungskapazität des Harzes ist jedoch relativ gering, nämlich typischerweise 0,7 bis 7 mg von TL je g oder 0,18 bis 1,8 mg je ml des Harzes (Schüttvolumen). Das für 1 mg der TL erforderliche Volumen des Elutionslösungsmittel ist in der Größenordnung von 2,5 bis 25 ml. Es ist festgestellt worden, daß die im Handel erhältlichen Harzpatronen mit einem Gehalt von 100 mg des Hartes sich zum Abtrennen der PL und der GL als unwirksam erwiesen haben.
Es ist nunmehr gerunden worden, daß man die GL aus einem CL enthaltenden Lipidgemisch durch ein einfaches und die PL nicht zerstörendes Chromatographieverfahren praktisch quantitativ abtrennen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das in Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel befindliche Gemisch durch ein Borsäuregel auf einem wasserunlöslichen Träger aus vernetztem Polyacrylamid führt, um die Glykolipide selektiv zu adsorbieren, und daß man anschließend die Glykolipide von dem Gel mit Hilfe eines Elutionslösungsmittels desorbiert.
Gemäß der Erfindung kann das eingesetzte Lipidgemisch tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein. Als tierische Lipide kann man jene anführen, welche aus der Lösungsmittelextraktion tierischer Gewebe stammen, welche in den Schlachthöfen zur Verfügung stehen, wie z.B. Gedärme, Lungen, Thymusdrüsen, Knochenmark bzw. Rückenmark und vorzugsweise Rinderhirn. Ein anderes interessantes Ausgangsmaterial besteht aus Human-Plazenta oder tierischer Plazenta. Diese Gewebe können in ihrem natürlichen Zustand vorliegen, sie können eingefroren oder dehydratisiert sein. Ein anderes interessantes Ausgangsmaterial, welches in großen Mengen zur Verfügung steht, besteht aus von Casein und Lactose befreiter süßer Buttermilch. Als pflanzliche Lipide kann man als Beispiel natürliche Sojalecithine anführen.
Zum Extrahieren der Lipide aus dem Ausgangsmaterial zerlegt und homogenisiert man dasselbe, z.B. in einer Mühle mit großer Geschwindigkeit und in einem lipophilen, aber mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch. Beispielsweise kann man Tetrahydrofuran, ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser im Volumensverhältnis von 4:1 bis 10:1, ein Gemisch aus Diisopropylether und Isopropanol im Volumensverhältnis von 3: 2, chlorierte Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, Dichlormethan, oder ein Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumensverhältnis von 2:1 verwenden. Selbstverständlich kann man ähnliche lipophile Lösungsmittel und Gemische hievon verwenden. Das Verfahren wird vorzugsweise in der Wärme, bei einer Temperatur von unter 100ºC, z.B. von 50 bis 60ºC, durchgeführt. Anschließend filtriert man die Dispersion, und nach dem Entfernen des Lösungsmittels,z.B. durch Vakuumdestillation bis zur Trockene, sammelt man die Roh-TL. Gegebenenfalls kann man die Roh-TL dadurch reinigen, daß man sie erneut in einem Lösungsmittel auflöst, dann dekantiert und die festen Teilchen abtrennt, die sich abgelagert haben.
Gemäß einer Variante des Extrahierens der Lipide kann man ein nicht-polares Kohlenwasserstofflösungsmittel, z.B. Hexan, verwenden, welches dann bevorzugt wird, wenn das Ausgangsmaterial aus tierischen Geweben besteht, welche durch Lyophilisieren oder Versprühen getrocknet worden sind. In diesem Fall homogenisiert man die Gewebe vollständig in einer Zerkleinerungsmühle, z.B. in Gegenwart von Hexan von Umgebungstemperatur, wonach man die Extraktion der TL, z.B. bei 60 bis 62ºC unter Rühren in einem geschlossenen Reaktor, der mit Rühreinrichtungen versehen ist, fortsetzt. Dann läßt man die Suspension bei Umgebungstemperatur während 1 bis 2 h rasten. Es bildet sich ein Bodensatz, den man vom Überstand abtrennt, wonach man den Bodensatz erneut mit einem nicht-polaren Kohlenwasserstoff behandelt, beispielsweise mit Hexan, wie oben angegeben. Anschließend kann man die vereinigten Überstände in einer Zentrifüge schleudern, oder man läßt sie als Variante während 24 bis 48 h bei Umgebungstemperatur rasten. Man trennt den Bodensatz ab, der sich gebildet hat, dann konzentriert man die klare Lösung bis auf etwa 12 bis 15 % ihres Anfangsgewichtes, z.B. durch Eindampfen unter Vakuum. Man kann das TL-Konzentrat dadurch behandeln, daß man es mit einem gleichen Volumen destillierten Wasser verdünnt, dann das restliche Hexan daraus eliminiert, z.B. durch Verdampfen unter Stickstoff bei 68 bis 70ºC, und die wässerige Emulsion, z.B. durch Lyophilisieren, trocknet. Als Variante kann man das TL-Konzentrat in einer Hexanlösung direkt als Zwischenprodukt für die Herstellung der CL durch Chromatographie, wie nachstehend beschrieben, verwenden. In diesem Fall engt man das die CL enthaltende Eluat bis auf 5 bis 10 % seines Anfangsvolumens ein, nachdem man das Lösungsmittel entfernt hat, dann verdünnt man das Eluat mit einem gleichen Volumen destilliertem Wasser, und man trocknet die Emulsion, z.B. durch Lyophilisieren.
Das Lipidgemisch kann die Gesamtheit der Lipide, nämlich die NL und die CL, enthalten, oder es kann vorzugsweise nur aus den CL bestehen. In diesem Fall trennt man die CL zuvor auf Silikagel in einem nicht-polaren, mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel ab,z.B. in Petrolether, welcher als Elutionslösungsmittel für die CL dient, während die NL auf der Säule verbleiben. Während des Inlösungbringens der Lipide wendet man vorzugsweise eine Beschallung an, um die Lipide vollständig aufzulösen. Die gesammelten CL umfassen insbesondere die PL, die Plasmalogene, Ceramidhexoside, Glyceroglykolipide und Ganglioside. Die NL werden unter Verwendung eines Gemisches polarer, lipophiler Lösungsmittel, z .B. eines Gemisches aus Chloroform und Methanol, von der Säule desorbiert. Die gesammelten NL umfassen insbesondere die Mono-, Di- und Triglyceride, die Fettsäuren, die Tocopherole, die fettlöslichen Vitamine, die Östrogene und die Phytoöstrogene. Man sieht, daß die NL keine GL enthalten, was dann vorteilhaft ist, wenn man die Fettsäuren und die Triglyceride zu sammeln wünscht, welche freie Fettsäuren, insbesondere die Arachidon-, Dihomogammalinolen-, Eicosapentaen- und Docosahexaensäure, enthalten, welche in der Human-Plazenta vorliegen. Nach der Abtrennung eliminiert man die Lösungsmittel bis zur Trockene, z.B. durch Eindampfen unter Vakuum.
Gemaß einer Variante zur Herstellung des Lipidgemisches, welches nur die CL enthält, und welche Variante insbesondere auf die Behandlung der Buttermilchlipide anwendbar ist, behandelt man die süße (nicht-saure), von Casein und Lactose, z.B. durch Diafiltration (Ultrafiltration mit Waschen) befreite Buttermilch, mit einem polaren Lösungsmittel, z.B. Aceton, um daraus die NL abzutrennen, welche in Lösung gehen, wonach man den Rückstand, aus dem man das Aceton entfernt hat, mit einem wenig polaren Lösungsmittel, z.B. mit Methanol, behandelt, und anschließend die Lösung, z.B. durch Verdampfen des Methanols, konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat kann anschließend, wie vorstehend angegeben, auf Silikagel behandelt werden.
Nach einer bevorzugten Variante des Behandelns der Buttermilchlipide extrahiert man die TL aus der von Lactose und Casein befreiten Buttermilch,z.B. mit einem Hexan-Methanol-Gemisch,wonach man - nach Abtrennen des Rückstandes, z.B. durch Mikrofiltration oder Zentrifugation, - anschließend das Lösungsmittelgemisch, z.B. durch Verdampfen, eliminiert. Anschließend behandelt man das TL-Konzentrat mit einem polaren Lösungsmittel, z.B. Aceton, in deutlich geringerer Menge als bei der vorhergehenden Variante, wo die Buttermilch direkt behandelt wird. Man sammelt die unlösliche Fraktion, wonach man daraus das Aceton eliminiert. Diese Variante der Vor-Auftrennung bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu der vorstehend angeführten Variante: Die erforderliche Acetonmenge ist um etwa das 10- bis 12-fache kleiner; das in dem Aceton unlösliche Material enthält etwa 75 bis 80 Gew.-% an CL und nur etwa 20 bis 25 Gew.-% an NL, welche aus Triglyceriden mit einem hohen Schmelzpunkt bestehen, wodurch bis zu 15 mal weniger Silikagel als in dem vorhergehenden Fall erforderlich sind, um die spätere Abtrennung der CL durchzuführen; schließlich umfaßt das im Aceton lösliche Material, welches etwa 40 bis 45 Gew.-% der eingesetzten Buttermilch ausmacht, außerdem Triglyceride, die freien Fettsäuren, die Sterine und den Großteil der riechenden Verbindungen, welche so leichter entfernt werden können. Nach dieser Vor-Auftrennung behandelt man das erhaltene Lipidgemisch, wie vorstehend angegeben, durch Chromatographie auf Silikagel.
Zum Abtrennen der PL von den GL benützt man eine mit Borsäuregel gefüllte Säule.Das Sorptionsmittel ist ein in Wasser und den organischen Lösungsmitteln unlösliches, vernetztes Polymer. Es wird durch Copolymerisation und Vernetzung von Dihydroxyborylanilinomethacrylsäure und 1,4-Butandioldimethacrylat erhalten. Ohne daß die Absicht besteht, auf eine bestimmte Theorie beschränkt zu sein, sei dennoch die Vermutung ausgesprochen, daß die praktisch quantitative Auftrennung der PL und der GL auf die Fähigkeit des Sorptionsmittels zurückzuführen ist, mit den Glykolipiden durch komplexe Bindung der cis-Diole der GL mit den Dihydroxyborylgruppen des Gels Komplexe zu bilden und diese Komplexe in Gegenwart von Wasser wieder aufzulösen. Man bringt das Borsäuregel in einem lipophilen, wasserfreien, mäßig polaren Lösungsmittel in Suspension. Beispielsweise kann man ein Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumensverhältnis von 5:1 bis 2:1, oder von Diisopropylether und Isopropanol im Volumensverhältnis von 4:2 bis 2:2 verwenden.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, werden die PL aus der Säule eluiert, während die GL adsorbiert sind. Man sammelt die PL unter Verwendung des gleichen Elutionslösungsmittels, z.B. des Gemisches aus Chloroform und Methanol in einem Volumensverhältnis von 2: 1, wonach man die Lösungsmittel durch Verdampfen unter Vakuum bis zur Trockene entfernt. Zum Desorbieren der GL von der Säule verwendet man ein Lösungsmittelgemisch, welches ein mit Wasser mischbares, polares, organisches Lösungsmittel und 1 bis 25 Vol.-% an entionisiertem Wasser enthalt. Als Beispiele seien angeführt: ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser im Volumensverhältnis von 10:1 bis 4:1, ein Gemisch aus Tetrahydrofuran, Methanol und Wasser, ein Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser, sowie ein Gemisch aus Dichlormethan, Methanol oder Ethanol und Wasser. Vorzugsweise verwendet man ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser. Man kann die Mengenanteile des Gemisches in dem Maße variieren, wie die Elution voranschreitet, z.B. kann man mit einem Gemisch beginnen, welches reich an organischem Lösungsmittel ist, nämlich typischerweise ein Volumensverhältnis von 10:1 aufweist, und mit einem Gemisch aufhören, welches ein Volumensverhältnis von 4:1 aufweist. Das Tetrahydrofuran bietet den Vorteil, daß es leicht zugleich mit dem Wasswer entfernt werden kann, z.B. während der späteren Lyophilisierung. Benützt man ein Gemisch, welches einen Alkohol enthält, dann wird man nur jene GL herausbekommen, welche in einem Gemisch aus Alkohol und Wasser löslich sind, und außerdem wird es notwendig sein, die Säule anläßlich ihrer Regenerierung mit einem Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser zu waschen.
In gewissen Fällen ist es erwünscht, eine Feinauftrennung der GL durchzuführen. Um dies zu bewerkstelligen, bringt man die GL in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol in Lösung, z.B. in einem doppelwandigen Scheidetrichter, welcher mit Rühreinrichtungen ausgestattet ist, und zwar in der Wärme, z.B. bei 50ºC, zu welchem Scheidetrichter man eine wässerige KCl-Lösung zugibt. Zuerst rührt man rasch, dann verlangsamt man das Rühren. Es bilden sich dann zwei Phasen, namlich eine wässerige, die Ganglioside enthaltende Phase und eine die anderen GL enthaltende organische Phase. Nach Trennung, z.B. durch Abziehen der unteren Phase unter der Einwirkung der Schwerkraft, entfernt man dann die Lösungsmittel daraus, z.B. durch Eindampfen unter Vakuum.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man die PL in nicht-saure PL (NPL) und saure PL (APL) einerseits und die GL in nicht-saure GL (NGL) und saure GL (AGL) anderseits durch Ionenaustauschchromatographie auftrennen. Das Interessante an diesen nachfolgenden Auftrennungen liegt darin, daß nach den herkömmlichen Analysenverfähren, wie z.B. der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), der Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) und der Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) die Detektion und quantitative Bestimmlung der verschiedenen Cl-Fraktionen nicht möglich ist, weil die Anzanl der in den biologischen Extrakten vorhandenen Lipidklassen viel zu hoch ist, um ein wirksames Arbeiten nach diesen Verfahren zu ermöglichen. Eine Elution, durch HPLC, von allen vornandenen Lipidklassen kann nicht ohne Verwendung verschiedener mobiler Phasen und ohne Synthese von Derivaten gewisser Lipide durchgeführt werden. Die vorherige Auftrennung durch ein Ionenaustauscherharz auf der Basis von vernetzter Agarose, insbesondere auf einem Diethylaminoethyl-Sepharosegel von rascher Durchsatzleistung in der Acetatform, ermöglicht die quantitative Auftrennung der GL und der PL in deren verschiedene saure und nicht-saure Fraktionen bei Durchsatzleistungen, die bis zu 10 Bett Volurnenanteilen/h gehen können. Dank dieser Auftrennung kann man anschließend die verschiedenen Fraktionen durch HPTLC, welche mit einer Detektion durch Fluoreszenz kombiniert ist, identifizieren und quantifizieren.
Gemäß einer anderen, besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man z.B. natürliche Sojalecithine ohne vorherige Abtrennung der NL behandeln, und man kann daraus praktisch die GL und die freien Zucker entfernen, indem man diese Sojalecithine über ein Borsäuregel führt. Eine spätere Dialyse der die GL enthaltenden Fraktion gegen entionisiertes Wasser ermöglicht es, daraus die freien Zucker zu entfernen. Man erhält so Phytoglykolipide. Bei einer Variante dieser Ausführungsform nimmt man eine vorherige Abtrennung der NL und der CL auf Silikagel vor, wonach man, ausgehend von den CL, eine Auftrennung der GL und der PL auf Borsäuregel durchführt. Die dabei erhaltenen PL sind frei von Glykolipiden und von freien Zuckern. Sie sind daher nicht mehr mit den üblichen Risken der PL, z.B. in parenteralen Emulsionen, behaftet, und in diesem Zusammenhang ist ihre Zusammensetzung mit jener von Eilecithin vergleichbar.
Mann kann die PL, GL und Ganglioside, deren Zusammensetzung für jedes Gewebe spezifisch ist, aus welchem diese Fraktionen extraniert worden sind, zur Formulierung von Diätzusammensetzungen verwenden, welche insbesondere für die Kinderernährung bestimmt sind.
Man kann die die Ganglioside enthaltenden Fraktionen zur Herstellung von in der Kosmetik verwendbaren Liposomen, oder zur Herstellung von Medikamenten für die Therapie des Nervensystems verwenden.
Man kann die von Phytoglykolipiden befreiten Sojalecithine zur Herstellung von parenteralen Emulsionen verwenden.
Schließlich kann man die NL aus der Human-Plazenta zur Gewinnung von Fettsäuretriglyceriden verwenden, welche GL-frei sind, und welche insbesondere die Arachidon säure, die Dihomogammalinolensäure, die Eicosapentaensäure und die Docosahexaensäure enthalten. Diese Triglyceride können, gemeinsam mit anderen, erfindungsgemäß gewonnenen Fraktionen, insbesondere den PL, GL und den Gangliosiden, zur Herstellung von Diätzusammensetzungen dienen, welche insbesondere für die Kinderernährung bestimmt sind.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht, in welchen sich die Teile und die Prozentsätze auf das Gewicht beziehen, sofern nichts anderes angegeben ist.
In diesen Beispielen wurde die Wirksamkeit der Abtrennung der NL und der CL durch HPTLC anhand von Proben auf mit Silikagel überzogenen Glasplatten der Abmessungen von 10 x 10 cm verifiziert. Die Detektion der verschiedenen Bestandteile der Fraktionen wird durch Fluoreszenz im Vergleich mit wohldefinierten Standardverbindungen vorgenommen.
Die quantitative Abtrennung der GL, ausgehend von CL, ist nach mehreren Verfahren ermittelt worden: HPTLC, Kolorimetrie und Gasphasenchromatographie (GLC). Insbesondere ist die Abtrennung der Glykolipide durch HPTLC durch Detektion mit Orcinol, welches die Zuckergruppen der Glykolipide spezifisch anfärbt, im Vergleich zu reinen GL-Standards festgestellt worden.
Für die Analyse der PL-Fraktion wurde auf die vorherige Auftrennung der PL in NPL und APL durch Ionenaustauschchromatographie und auf die anschließende, spätere Detektion der verschiedenen Komponenten durch HPTLC jeder Fraktion durch Vergleich mit reinen PL-Standards zuruckgegriffen.
Parallel hierzu wurde der Inhalt der GL-Fraktion durch vorherige Ionenaustauschchromatographie und anschließende Analyse der verschiedenen nicht-sauren (NGL) und Sauren Komponenten (AGL) durch HPTLC im Vergleich zu Standardproben verifiziert.

Beispiel 1

1.1 Extraktion der TL aus Rinderhirn

Man homogenisiert 5 kg Rinderhirn in Form eines getrockneten Pulvers durch Zerstäuben in 50 l eines Lösungsmittelgemisches aus Tetrahydrofuran und Wasser in einem Volumensverhältnis von 4:1 bei 20ºC in einem Rotationsmischer bei 10.000 U/min.
Nach 3 bis 5 min setzt man die Extraktion der Hirnlipide in einem geschlossenen Reaktor von 100 l unter Rühren bei 160 bis 250 U/min und bei 50 bis 60ºC während 20 min fort. Man führt die so erhaltene Suspension durch einen mit einem auf 40 bis 50ºC gehaltenen Doppelmantel versehenen Filterbehalter, welcher mit einem einstufigen Papierfilter ausgestattet ist.Man treibt die in dem Filterbehälter zurückgehaltenen festen Teilchen mit 35 l des Gemisches aus Tetrahydrofuran und Wasser im Volumensverhältnis von 4:1 heraus, wobei man das Lösungsmittel auf 40 bis 50ºC hält. Dann engt man die vereinigten Konzentrate, welche den Rohextrakt der Hirnlipide enthalten, bis zur Gewichtskonstanz in einem Vakuumverdampfer bei 65 bis 75ºC ein, wonach man das Restwasser aus dem Lipidkonzentrat durch aufeinanderfolgende Zugaben von 5 l Isopropanol mit anschließendem azeotropem Eindampfen entfernt.

1.2 Reinigung der Rohlipide

Man löst den oben erhaltenen Rohextrakt, welcher 2,68 kg wiegt, erneut in 10 l Tetrahydrofuran auf, wonach man ihn während 10 min in mit Kapseln verschlossenen Flaschen bei 1.500 bis 1.700 g zentrifugiert.Als Variante läßt man den Rohextrakt in Lösung bei Umgebungstemperatur während 24 h rasten, wonach man die abgelagerten Feststoffe abtrennt. Man engt die geklärte Lösung mit Hilfe eines Rotationsverdampfers unter Vakuum bei 65 bis 70ºC bis zur Trockne ein. Man erhält 2,32 kg Hirn-TL und 0,36 kg Nicht-Lipid-Verunreinigungen.

1.3 Isolierung der CL aus Rinderhin

Man füllt eine Glassäule mit einer Länge von 100 cm und einem Innendurchmesser von 21,3 cm, welche 15 l Petrolether von 60 bis 80ºC enthält, mit 4 kg Silikagelteilchen von 0,21 bis 0,062 mm (Maschenweite 70 bis 230), welche in 20 l Petrolether dispergiert sind. Das Silikagel ist zuvor durch eine Behandlung bei 160 bis 165ºC während wenigstens 16 h aktiviert worden. Die Glassäule enthält ein Sinterglasfilter einer Porosität von 100 bis 160 um, um die Silikagelteilchen zurückzuhalten. Man löst die obigen Hirn-TL, nämlich 2,32 kg, unter Rühren in 10 l Petrolether auf, dann beschallt man sie während 2 bis 5 min (250 bis 500 W/kg Lipide), so lange, bis die trübe Lösung klar geworden ist. Man hält die Temperatur der beschallten Probe auf 45 bis 50ºC. Dann führt man sie durch die Silikagelsäure und eluiert die CL vollständig mit Hilfe von 15 bis 30 Litern Petrolether (Eluat 1). Man desorbiert die NL (Eluat 2) von dem Silikagel unter Verwendung von 15 Litern eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumensverhältnis von 1:1.

1.4 Regenerierung des Silikagel-Sorptionsmittels

Man treibt 15 l Methanol, dann 15 bis 20 l entionisiertes Wasser, durch das Sorptionsmittel. Dann trocknet man dasselbe bei 105ºC während 6 h, und dann noch während 18 h bei 160 bis 165ºC, in einem Trockenofen. Schließlich dispergiert man das reaktivierte Sorptionsmittel in 15 l Petrolether, um jeglichen Kontakt mit der Luftfeuchtigkeit zu vermeiden.

1.5 Lyophilisierung der Rinderhirn-CL

Man konzentriert das obige Eluat 1 in einem Rotationsverdampfer von 50 bis 100 l unter Vakuum und bei 50 bis 75ºC bis zur vollständigen Trocknung. Dann setzt man die CL der Einwirkung eines Stickstoffstromes von Umgebungstemperatur während 12 bis 24 h aus, um etwaige Restspuren des Lösungsmittels zu entfernen. Dann homogenisiert man die von ihrem Lösungsmittel befreiten Lipide in destilliertem Wasser (in einer Menge von 5 kg Wasser auf 1 kg CL) von 40 bis 45ºC, wonach man die so erhaltene Emulsion in 1 bis 1,5 cm dicken Schichten auf Platten aus rostfreiem Stahl aufträgt. Dann friert man die Emulsion bei -40ºC ein und lyophilisiert sie. Man erhält so 1,45 kg CL.

1.6 Rückgewinnung der NL

Man konzentriert das Eluat 2 wie im Absatz 1.5 bis zur Trockne. Nach Entfernen des Lösungsmittels wie unter 1.5 ernält man 0,48 kg NL.

1.7 Auftrennung der PL und der GL aus Rinderhirn

Man löst die Rinderhirn-CL, welche wie unter 1.5 oben beschrieben hergestellt worden sind, in einem Gemisch aus Chloroform und Methanol in einem Volumensverhältnis von 4:1 und in einem Mengenverhältnit von 1 g Lipide auf 5 g des Lösungsmittelgemisches auf. Man beschleunigt die Auflösung der Lipide durch Beschallung bei 40 bis 50ºC, worauf man jedwedes Teilchen durch Hindurchführen der Lösung durch ein Büchner-Filter entfernt.
Die verwendete Adsorptionssäule aus Glas, mit einer Länge von 30 cm und einem Innendurchmesser von 5 cm, enthält 2 Bettträger aus Sinterglas mit einer Porosität von 100 bis 160 um und einen Adapter für die Durchsatzleistung, welcher es ermöglicht, die Betthöhe von 15 bis 30 cm zu regeln. Die Säule ist mit einer Niederdruckpumpe (1 bis 2 bar) verbunden, welche über einen Dreiweghahn drei verschiedene Elutionslösungen bei Durchsatzleistungen von 0 bis 60 ml/min fördern kann. Man suspendiert 150 g Borsäuregel in 1.000 ml Tetrahydrofuran, und man gießt die Suspension in die Säule in aufeinanderfolgenden Chargen, wobei man jeglichen Überschuß des Lösungsmittels durch Schwerkrafteinwirkung abfließen läßt. Man stellt den Durchsatz-Adapter auf eine Betthöhe von 20 bis 22 cm ein. Vor der Benutzung wäscht man die Säule mit 3 Bettvolumenanteilen (1.200 bis 1.300 ml) entionisiertem Wasser bei einer Durchsatzleistung von 30 bis 50 ml/min, dann mit 1 Bettvolumenanteil von 0,5 N Chlorwasserstoffsäure, dann mit 3 oder mehr Bettvolumenanteilen entionisiertem Wasser bis zur Erzielung eines neutralen pH-Wertes, mit 3 Bettvolumenanteilen von Methanol und schließlich mit 3 Bettvolumenanteilen eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1.
Als Vorbereitung wäscht man die Säule mit 20 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 4: 1 und bei einer Durchsatzleistung von 20 ml/min. Dann beschickt man die Säule mit der Probe aus Rinderhirn-CL, nämlich mit 30 g Lipiden auf 150 g eines Gemisches aus Chloroform und Methanol in einem Volumenverhältnis von 4:1, bei der gleichen Durchsatzleistung, und dann mit 20 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenvernältnis von 4:1. Man eluiert die PL und die Plasmalogene aus der Säule unter Verwendung von 3 Bettvolumenanteilen (1.200 bis 1.300 ml) eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1 bei einer Durchsatzleistung von 50 ml/min. Zum Eluieren sämtlicher GL, einschließlich z.B. der Ceramidhexoside, Ganglioside und Sulfatide benützt man 3 Bettvolumensanteile eines Gemisches aus Tetrahydrofuran und Wasser im Volumenverhältnis von 4: 1 und bei der gleichen Durchsatzleistung wie für die PL.

1.8 Regenerierung der Borsäuregelsäule nach jedem Einsatz

Man regeneriert die Borsäuregelsäule nach jedem Elutionszyklus unter Verwendung von 3 Bettvolumenanteilen eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenvernältnis von 2:1 und bei einer Durchsatzleistung von 60 ml/min, um das Gel zu dehydratisieren.

1.9 Isolierung der PL und der GL aus Rinderhirn

Man engt die die PL enthaltende Fraktion unter Vakuum bei 65 bis 75ºC bis zur Trockne ein, worauf man sie wie oben (im Absatz 1.5) angegeben lyophilisiert. Man erhält so 950 bis 970 g eines weißen, hygroskopischen Pulvers, welches völlig geruchlos ist.
Man engt die die GL enthaltende Fraktion unter Vakuum bei 70 bis 75ºC so lange ein, bis das Tetrahydrofuran vollständig entfernt worden ist, und man nimmt den Rückstand bis zur Erzielung eines Volumens von 2.500 ml in entionisiertem Wasser auf. Nach der Homogenisierung lyophilisiert man die die Glykolipide enthaltende Emulsion, wie vorstehend beschrieben. Man erhält 480 bis 490 g eines weißen, geruchlosen Pulvers.

Beispiel 2

2.1 Extraktion der Lipide aus von Lactose befreiter Buttermilch

Man befreit frische Buttermilch durch Diafiltration von Lactose und trocknet sie dann durch Versprühen. Das so erhaltene Buttermilchpulver hat die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit (gemessen nach 2 h im Trockenofen bei 102ºC) 2,5 %
Fett (Mojonnier-Methode) 52,9 %
Proteine (N x 6,38) 29,7 %
Lactose (enzymmatisch bestimmt) 8,1 %
Asche 6,8 %
Dann dispergiert man 80 kg Buttermilchpulver in 450 l Aceton von 20 bis 22ºC mit Hilfe eines Homogenisators. Man extrahiert das Fett in einem geschlossenen Reaktor, der mit einem Rührwerk mit einer Schaufel ausgestattet ist, welches sich mit 120 bis 250 U/min dreht. Man hält die Extraktionstemperatur während etwa 20 min auf 20 bis 22ºC, dann filtriert man die Dispersion in einen Behälter, welcher mit einem einstufigen Papierfilter ausgestattet ist. Dann wäscht man die festgehaltenen festen Teilchen mit 300 weiteren Litern Aceton von 20 bis 22ºC. Dann trocknet man die vereinigten Filtrate durch Vakuumverdampfen, und man sammelt 26 kg an neutralen Buttermilch-Lipiden. Dann führt man Stickstoff durch den entfetteten Buttermilchrückstand, der in dem Filterbehälter zurückgehalten worden ist, der während 2 h auf 35 bis 40ºC gehalten worden ist, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen.
Dann dispergiert man die 53 bis 55 kg an Feststoffen aus der entfetteten und von Lösungsmittel befreiten Buttermilch in 560 l Methanol in einem Rotationshomogenisator bei 10.000 U/min, wonach man die Extraktion der Lipide in einem doppelwandigen Reaktor während 20 bis 30 min bei 60 bis 62ºC fortsetzt. Dann führt man die Dispersion durch ein Papierfilter, welches in einem doppelwandigen, geschlossenen Behälter angeordnet ist, und zwar bei 60 bis 62ºC und unter einem Druck von 1,5 bis 2,5 bar, wonach man die auf dem Filter zurückgebliebenen, festen Teilchen mit 80 Litern heißen Methanols austreibt. Dann konzentriert man das methanolische Filtrat bis auf ein Volumen von 40 bis 45 l, und man verdampft das restliche Methanol durch azeotrope Destillation mit 100 bis 150 l Petrolether, der zwischen 60 und 90ºC mit dem Methanol ein azeotropes Gemisch bildet.

2.2 Isolierung der CL der Buttermilch

Man stellt das Volumen des gemäß 2.1 erhaltenen, obigen Konzentrates mit Petrolether auf 100 l ein, wonach man die Lösung während 48 h bei Umgebungstemperatur rasten läßt. Man entfernt allfällige feste Ablagerungen durch Filtration, wonach man die geklärte Petroletherphase durch eine Säule mit einer Länge von 100 cm und einem Innendurchmesser von 35 cm führt, welche 26 kg (entsprechend einem Bettvolumen von etwa 65 l) Silikagel enthalt, wie dies oben im Beispiel 1, Absatz 3, beschrieben ist. Man eluiert sämtliche CL mit 65 bis 70 Liter Petrolether (Eluat 1), während man die adsorbierten Lipide mit 80 1 eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 1:1 desorbiert (Eluat 2). Man engt das Eluat 1 unter Vakuum bis zur Trockne ein, wonach man dasselbe in entionisiertem Wasser dispergiert und, wie im Absatz 5 des Beispiels 1 angegeben, lyophilisiert. Man erhält so 10,2 kg CL. Das bis zur Trockne eingeengte Eluat 2 führt zu 5,1 kg an restlichen NL.

2.3 Auftrennung der PL und der GL aus der Buttermilch

Man führt durch eine Borsäuregelsäule eine 600g-Probe von CL aus Buttermilch, welche gemäß dem obigen Absatz 2.2 erhalten worden sind, und man trennt die PL und die GL gemäß der Verfahrensweise, die im Absatz 7 des Beispiels 1 angegeben ist. Nach dem Einengen bis zur Trockne mit anschließender Lyophilisierung, wie dies Im Absatz 1.9 des Beispiels 1 angegeben ist, erhält man 365 g von PL aus Buttermilch in der Fonn eines geruchlosen, weißlichen Pulvers.

2.4 Reinigung der GL aus der Buttermilch

Man engt die die GL enthaltende Fraktion unter Vakuum ein, um das Tetrahydrofuran vollständig daraus zu entfernen, wie dies im Absatz 1.9 des Beispiels 1 angegeben ist, wonach man den Rückstand mit entionisiertem Wasser bis zur Erzielung eines Volumens von 800 ml wieder aufnimmt. Anschließend dialysiert man die wässerige Lösung der GL gegen entionisiertes Wasser von 4ºC während 24 h, wobei man eine Dialysenmembran verwendet, welche eine Grenze für die Abtrennung von Molekulargewichten von 3.500 Dalton aufweist. Dann lyophilisiert man die Lösung der GL, und man erhält 160 g eines weißen Pulvers aus gerernigten GL, welches weniger als 1 % an freier Lactose enthält. Nach dem Trocknen wiegt das Dialysat 75 g.

Beispiel 3

3.1 Isolierung der CL aus Rinderknochenmark bzw. -rückenmark

Man lyophilisiert 10 kg frisch homogenisiertes Rinderknochenmark bzw. -rückenmark, und man dispergiert durch Homogenisieren die 1,6 bis 1,7 kg an so erhaltener Trockensubstanz in 50 Litern eihes Lösungsmittelgemisches aus Dichlormethan und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:1 bei 20 bis 22ºC. Man extrahiert die TL aus dem Rinderknochenmark bzw. -rückenmark in einem geschlossenen Reaktor, wie im Beispiel 1, Absatz 1. Nach der Filtration und dem Eliminieren des Lösungsmittelgemisches wie im Beispiel 1, Absatz 2, erhält man 0,65 kg an TL, welche man erneut in 2,5 l Hexan auflöst, und welche man, wie im Beispiel 1 angegeben, durch eine Glassäule führt, welche 40 cm lang ist, einen Innendurchmesser von 10 cm aufweist, und welche mit 750 g Silikagel gefüllt ist.
Man eluiert die CL mit 2 l Hexan, während man die NL aus der Säule dadurch desorbiert, daß man durch dieselbe 2 l eines Gemisches aus Chloroform und Methanol in einem Volumenverhältnis von 2:1 laufen läßt. Man lyophilisiert die CL, wie dies im Beispiel 1, Abs.5 angegeben ist, und man ernält 430 g eines geruchlosen, hygroskopischen, weißen Pulvers.

3.2 Auftrennung und Isolierung der GL und PL aus Rinderknochenmark bzw. -rückenmark

Man löst die obigen 430 g an CL aus Rinderknochenmark bzw. -rückenmark in 2.150 g eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol in einem Volumensverhältnis von 4:1, wie im Beispiel 1, Absatz 7, auf. Man trennt die CL in ihre PL- und GL-Fraktionen auf, wie dies im Absatz 1.7 angegeben ist, und zwar ausgehend von 30 g Lipiden auf 150 g Lösungsmittel, und man regeneriert die Borsäuregelsäule nach jedem Zyklus unter Verwendung von 3 Bettvolumenanteilen eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1, wie unter 1.8. Dann konzentriert man unter Vakuum die eluierten bzw. desortierten Fraktionen, und man lyophilisiert dieselben wie unter 1.9. Man erhält so 274 g an PL und 150 g an GL als weiße, geruchlose Pulver.

Beispiel 4

4.1 Abtrennung der GL aus Rinderhirn durch ein Lösungsmittel

Man dispergiert 60 g von GL aus Rinderhirn, welche gemäß Beispiel 1, Absatz 9 hergestellt worden sind, in einem Lösungsmittelgemisch, welches aus 3.200 ml Chloroform und 1.600 ml Methanol besteht, in einem doppelwandigen Scheidetrichter mit einem Fassungsvermögen von 10 l, der mit einem Rührwerk mit einer Achse ausgestattet ist, welches im oberen Teil des Scheidetrichters angebracht ist. Die Achse des Rührwerks ist mit zwei voneinander beabstandeten Blättern ausgestattet, so daß nur das untere Blatt in das Lösungsmittel eintaucht. Man erhöht die Temperatur der Gl-Lösung fortschreitend bis auf 50ºC, dann fügt man 1.200 ml einer 88%igen wässerigen KCl-Lösung hinzu, was zum Eintauchen des oberen Blattes des Rührwerks führt. Man geht von einer Anfangsrührgeschwindigkeit von 300 bis 600 U/min aus, wonach man das Rührwerk auf 5 bis 10 U/min verlangsamt, und man unterbricht das Erhitzen des Scheidetrichters nach 15 min. Es bilden sich zwei Phasen, von denen eine jede fortgesetzt von einem der Blätter umgerührt wird. Nach 8 bis 12 h beobachtet man eine vollständige Abtrennung der Ganglioside von den anderen GL, wenn die obere, wässerige, Ganglioside enthaltende Phase und die untere, die anderen GL enthaltende Phase klar werden. Man läßt die untere Phase aus dem Scheidetrichter unter der Einwirkung der Schwerkraft abfließen, und man sammelt getrennt die obere Phase ein. Die anderen GL in der unteren Phase bestehen aus Monogalactosylceramiden und Sulfatiden.

4.2 Isolierung der GL-Phasen

Man engt die untere Phase, welche alle Sulfatide und die neutralen GL (Monogalactosylceramide) enthalt, unter Vakuum bei 65 bis 75ºC bis zur Trockne ein, wonach man dieselbe wie im Beispiel 1, Absatz 9 angegeben, lyophilisiert. Das Endprodukt ist ein strahlendweißes Pulver, welches aus 49 g an reinen GL (Monogalactosylceramiden und Sulfatiden) besteht. Man engt die obere Phase unter Vakuum bei 65 bis 70ºC bis zur vollständigen Eliminierung der organischen Lösungsmittel ein, wobei man somit das Anfangsvolumen dieser oberen Phase von etwa 2.400 ml auf 300 bis 600 ml einer klaren Lösung reduziert. Anschließend dialysiert man die wässerige Lösung, wie dies im Beispiel 2, Absatz 4, angegeben ist, und dann lyophilisiert man die obere konzentrierte Phase, wie dies im Beispiel 1, Absatz 9, angegeben ist. Das Endprodukt besteht aus 5,1 g eines strahlend-weißen, geruchlosen Pulvers, welches die typischen, nachstehend angeführten Ganglioside aus Rinderhirn enthält, wobei die Abkürzen gemäß Svennerholm und Holmgren verwendet werden:
NeuAcα2T3 Galβl T 3 GalNAcβ1 T4 [NeuAcα2T3] Galβ1 TGlcT Cer (GD1a), NeuAcα2T8 NeuAcα2T3 Galβ1T 4GlcTCer (GD3), NeuAcα2T3 Galβ1 T 3 Gal NAcβ1T4[NeuAcα2T 8 NeuAcα2T 3]Galβ1T 4 GlcTCer (GTlb) und Galβ1T 3 Gal NAcβ1 T4 [NeuAcα2T3]Galβ1 T4 Glc TCer (GM1).

Beispiel 5

Abtrennung der GL aus Buttermilch

Man trennt die gemäß Beispiel 2, Absatz 4 isolierten Buttermilch-GL unter Anwendung des Extraktionsverfährens gemäß Beispiel 4 auf. Man engt die obere, die Ganglioside enthaltende Phase unter Vakuum bei 65 bis 70ºC bis zur vollständigen Verdampfung der organischen Lösungsmittel Chloroform und Methanol ein, wobei das Anfangsvolumen von etwa 2.400 ml auf 300 bis 600 ml reduziert wird. Man dialysiert das wässerige Konzentrat bei 4ºC während 24 h gegen entionisiertes Wasser, wie dies im Beispiel 2, Absatz 4 angegeben ist. Das Endprodukt ist ein strahlendweißes Pulver von 4,8 g, welches im wesentlichen aus typischen Buttermilch-Gangliosiden, wie z.B. GD&sub3; (welche etwa 80 % ausmachen), GM&sub1; (die im Beispiel 4.2 näher erläutert sind) und NeuAc α 2 T3 Galβ 1 T4 Glc TCer (GM3 gemäß Svennerholm und Holmgren) besteht. Sein Gehalt an freier Lactose beträgt weniger als 1 %.
Man konzentriert die untere Phase bis zur vollständigen Trockne, worauf man sie lyophilisiert, wie dies im Beispiel 4, Absatz 2 angegeben ist. Man erhält 46 g eines stranlendweißen Pulvers, welches nur neutrale Glykolipide, wie z.B. Dihexosyl- und Trihexosylceramide enthält, und welches von Lactose frei ist.

Beispiel 6

6.1 Abtrennung der CL aus Humanplazenta

Man extrahiert Humanplazenta mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropylether und Isopropanol im Volumensverhältnis von 3:1, wonach man dieselbe in Hexan bei 55 bis 60ºC beschallt (400 W/100 g Plazenta in 350 ml Hexan), und zwar so lange, bis die anfänglich trübe Lösung klar geworden ist. Man füllt eine 30 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 5,5 cm, welche mit einem Sinterglasfilter ausgestattet ist, mit 100 g Silikagelteilchen von 0,21 bis 0,062 mm (Maschenweite 70 bis 230), die zuvor während 15 h bei 160 bis 165ºC aktiviert und dann in Hexan dispergiert worden sind.
Man führt anschließend die Probe bei 50ºC durch die Säule, wonach man die Elution der CL durch 400 bis 500 ml Hexan (Eluat 1) vervollständigt.
Man desorbiert die NL aus der Säile (Eluat 2), wobei man 500 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 1:1 verwendet. Nach dem Einengen der Eluate 1 und 2 bis zur Trockne unter Vakuum erhält man 55,3 g CL und 44,7 g NL.
Die die CL enthaltende Fraktion hat den Vorteil, daß sie keine Östrogene enthält, welche im allgemeinen die CL begleiten, wenn man die klassischen Verfahren zum Extrahieren und Abtrennen durch Lösungsmittelgemische anwendet.
Zum Regenerieren der Säule treibt man 250 ml Methanol, dann 1.000 ml entionisiertes Wasser durch das Sorptionsmittel, wonach man dasselbe wie oben beschrieben thermisch aktiviert.

6.2 Isolierung der PL und der GL aus Humanplazenta

Man füllt eine Glassäule von 30 cm Länge und mit einem Innendurchmesser von 5,5 cm, welche mit einem Sinterglasfilter ausgestattet ist, mit 100 g Borsäuregel. Man bedeckt das in Suspension in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol im Volumensverhältnis von 2:1 befindliche Gel mit einer etwa 1 cm dicken Schicht aus Quarzsand. Anschließend wäscht man das Sorptionsmittel nacheinander mit 3 Bettvolumenanteilen Methanol, mit 3 Bettvolumenanteilen entionisiertem Wasser, mit 1 Bettvolumenanteil einer 0,5N HCI-Lösung und dann noch mit 10 Bettvolumenanteilen entionisiertem Wasser, bis ein neutraler pH-Wert erreicht worden ist; und man bringt das Gel dadurch in eine lipophile Form, daß man 3 Bettvolumenanteile von Methanol und dann 3 Bettvolumenanteile eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumensvernältnis von 2:1 anwendet.
Man führt durch die Säule 15 g von Humanplazenta-CL, welche wie unter 6.1 angegeben erhalten worden sind, und welche in 60 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1 aufgelöst worden sind. Nach dem Einengen des Eluates unter Vakuum bis zur Trockne erhält man 14 g PL (Eluat 1). Man desorbiert die GL (Eluat 2) aus der Säule unter Verwendung von 600 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Tetranydrofuran und Wasser im Volumensverhältnis von 4: 1. Nach dem Regenerieren der Säule mit 600 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1, dann einem weiteren Durchgang einer zweiten Probe von 15 g Humanplazenta-CL, sowie einem Regenerieren der Säule und schließlich nach dem Durchgang einer dritten Probe von 15 g Humanplazenta-CL, vereinigt man die PL-Fraktionen (das Eluat 1), man entfernt daraus die Lösungsmittel bis zur vollständigen Trockne, und man sammelt 40 bis 42 g Humanplazenta-PL. Nach dem Einengen der die GL enthaltenden, vereinigten Eluate 2 bis zur Trockne bringt man den Rückstand durch Beschallung bei 50ºC erneut in Suspension in Wasser, worauf man, nach dem Lyophilisieren, 3 g Humanplazenta-GL sammelt.

Beispielo 7

Isolierung der Soja-Phytoglykolipide

Man löst 25 g handelsübliches, natürliches Sojalecithin in 75 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 4: 2 auf, wonach man dasselbe wie im Beispiel 6, Absatz 2 angegeben, durch eine Borsäuregelsäule führt. Man erhält so 22,7 g eines Gemisches aus NL und PL und 2,3 g einer Fraktion, welche die Phytoglykolipide sowie die freien Zucker enthält. Nach einer Dialyse und einem Einengen, wie im Beispiel 2, Absatz 4 erhält man 1 g (4 %) an Soja-Phytoglykolipiden, welche von freien Zuckern frei sind.

Beispiel 8

Auftrennung der Soja-PL und -Phytoglykolipide

Man geht von 100 g eines handelsüblichen, natürlichen Sojalecithins aus und trennt daraus eine Fraktion von 40 g, welche die NL enthalt, sowie eine Fraktion von 60 g ab, welche die CL enthält, wie dies im Beispiel 1, Absatz 3 angegeben ist.
Man löst die die CL enthaltende Fraktion durch Beschallung bei 40ºC in 200 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Diisopropylether und Isopropanol im Volumenverhältnis von 3:2 erneut auf, worauf man dieselbe in aufeinanderfolgenden Chargen von 15 g durch eine Borsäuregelsäule führt, welches Borsäuregel in einem Lösungsmittelgemisch aus Diisopropylether und Isopropanol dispergiert ist, und welche Säule 30 cm lang ist und einen Innendurchmesser von 5,5 cm aufweist. Man eluiert die die PL enthaltenden Fraktionen unter Verwendung von zwei Bettvolumenanteilen eines Lösungsmittelgemisches aus Diisopropylether und Isopropanol im Volumenverhältnis von 3:2, und dann von 1 Bettvolumenanteil von Isopropanol.
Man desorbiert die die Phytoglykolipide enthaltenden Fraktionen von der Säule mit 3 Bettvolumenanteilen eines Lösungsmittelgemisches aus Tetrahydrofuran und Wasser im Volumenverhältnis von 4: 1, wie dies im Beispiel 6, Absatz 2 angegeben ist. Nach jedem Zyklus regeneriert man das Sorptionssittel unter Verwendung von 1 Bettvolumenanteil von Isopropanol, dann von 2 Bettvolumenanteilen eines Lösungsmittelgemisches aus Diisopropylether und Isopropanol im Volumenverhältnis von 3:2.
Man sammelt getrennt die vereinigten Fraktionen von PL einerseits und der Phytoglykolipide anderseits, man konzentriert sie unter Vakuum bis zur Trockne, und man erhält 40 g an PL und 20 g an Phytoglykolipiden.
Die so hergestellten PL sind insofern bemerkenswert, als sie frei von Verbindungen sind, welche von Natur aus in den Sojalecithinen vorhanden sind, und welche unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen können.
Sie sind mit den PL aus dem Eigelblecithin vergleichbar, welche arm an Glykolipiden und freien Zuckern sind, was sie attraktiv für die Herstellung parenteraler Emulsionen macht, welche vom menschlichen Organismus gut vertragen werden.

Beispiel 9

9.1 Auftrennen der PL und der GL aus Meerschweinchen-Gedärmen

Man wäscht und homogenisiert dann 7,86 g Meerschweinchen-Gedärme aufeinanderfolgend in 2 x 80 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol in einem Volumenverhältnis von 1: 2, man zentrifugiert das Homogenisat bei 2.500 x g, und man engt den klaren Überstand unter Vakuum bis zur Trockne ein.
Man löst die so erhaltenen 290 mg an Rohlipiden durch Beschallung in 10 ml Tetrahydrofuran auf, man zentrifugiert die Lösung bei 2.500 x g, und man engt dieselbe bis zur Trockne ein, wobei man 250 mg an TL erhält.Man eliminiert die NL ebenso wie die Sterine, freien Fettsäuren und Triglyceride, indem man die TL durch Beschallung in 2 x 2,5 ml Hexan auflöst und die Lösung durch eine Glassäule führt, welche 10 cm lang ist, einen Innendurchmesser von 1 cm aufweist, und welche mit aktivierten Silikagelteilchen von 0,21 bis 0,062 mm (Maschen 70 bis 230) gefüllt ist. So eluiert man quantitativ 190 mg CL mit 25 ml Hexan. Man desorbiert 57 mg NL aus der Säule durch 3 Bettvolumenanteile eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumensverhältnis von 2:1. Anschließend trennt man die CL in 143 mg PL und 47 mg GL auf, wie dies oben im Beispiel 1, Absatz 7 angegeben ist. Nach einer Dialyse gegen entionisiertes Wasser mit anschließender Lyophilisierung erhält man 16,6 mg einer Fraktion aus reinen GL ohne freie Zucker.

9.2 Auftrennung der PL aus Meerschweinchen-Gedärmen in NPL und APL durch Ionenaustausch

Man suspendiert 8, 5 ml von Diethylaminoethyl-Sepharosegel mit rascher Durchsatzleistung in Ethanol, und man füllt damit eine 10 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 1,15 cm. Anschließend wäscht man das Gel mit 30 ml entionisiertem Wasser, dann bringt man es mit 20 ml einer wässerigen 2 M-Natriumacetatlösung in die Acetatform, und man wäscht das Gel nacheinander mit 30 ml entionisiertem Wasser, mit 10 ml Methanol und schließlich mit 10 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1. Man bedeckt das Gel mit einer 7 bis 10 mm dicken Schicht aus Quarzsand. Man führt die Probe aus 143 mg PL aus Meerschweinchen-Dann durch die Säule, und dann eluiert man die nicht-sauren PL mit aufeinanderfolgenden Portionen von 2 x 2 ml, dann 10 ml, eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenvernältnis von 2:1, und schließlich mit 5 ml Methanol. Man hält einen leichten Druck aufrecht, um die Elution zu beschleunigen. Nach dem Entfernen der Lösungsmittel unter Vakuum bis zur Trockne erhält man 107 mg NPL.
Um die auf der Säule zrrückgehaltenen sauren PL zu desorbieren, führt man durch dieselbe 15 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und einer wässerigen 0,8M Natriumacetatlösung (30: 60: 8). Nach dem Einengen der Säurefraktion bis zur Trockne und erneutem Auflösen derselben durch Beschallung in 2 x 1 mi eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1 entfernt man die Salze auf einer Glassäule, welche 10 cm lang ist, einen Innendurchmesser von 1,15 cm aufweist, und welche mit 4 ml von Sephadex G-25-Gel in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 60:30:4,5 gefüllt ist, wobei man die Säule unter leichtem Druck hält. Nach dem Entfernen der Lösungsmittel unter Vakuum bis zur Trockne erhält man 35 mg an APL. Nach jedem Zyklus regeneriert man die Ionenaustauschersäule unter Verwendung von 1 Bettvolumenanteil von Methanol, dann von 2 Bettvolumenanteilen eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volunenverhältnis von 2:1.
Die NPL-Fraktion enthält typischerweise das Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und das Sphingomyelin.
Die APL-Fraktion enthält typischerweise Phosphatidylinosit, Phosphatidylserin, Phosphatidinsäure und Cardiolipin.

9.3 Auftrennen der GL aus Meerschweinchen-Darm in NGL und AGL

Zur Auftrennung der NGL- und AGL-Fraktionen wendet man die im obigen Absatz 9.2 beschriebene Verfanrensweise an. Aus den obigen 16,6 mg (Absatz 9.1) erhält man 11,9 mg NGL und 4,5 mg AGL.
Die dabei erhaltenen NGL sind typischerweise die Ceramidhexoside und die Glykoglycerolipide.
Die dabei erhaltenen AGL sind typischerweise die Sulfatide, die Hämatoside und die Ganglioside.

Beispiel 10

10. 1 Variante der Extraktion der TL aus Rindehirn

Man homogenisiert 8 kg Rinderhirn in der Form eines trockenen Pulvers durch Zerstäuben bei Umgebungstemperatur in 45 kg Hexan in einer Kolloidmühle, wonach man die Extraktion bei 60ºC in einem geschlossenen Reaktor fortsetzt, der mit Schaufelrührwerken ausgestattet ist, welche sich mit 250 U/min drehen.
Nach 30 min Extrahieren läßt man die Suspension während 1 bis 2 h in einem gesonderten Behälter rasten.Man sammelt den Überstand durch Dekantieren, und man extrahiert erneut die Feststoffe, welche sich abgesetzt haben, mit weiteren 30 kg Hexan.
Man läßt den zweiten Extrakt während 1 bis 2 h rasten, man sammelt den Überstand durch Dekantieren, und man vereinigt denselben mit dem vorherigen Überstand. Nachdem die vereinigten Überstände während 24 bis 48 h bei Umgebungstemperatur gerastet haben, ergeben sie eine durchscheinende, flüssige Phase, von der man den festen Rückstand durch vorsichtiges Dekantieren abtrernt.
Dann unterwirft man die flüssige Phase bei 66 bis 70ºC einem Vor-Einengen bis auf 12 bis 15 % des Anfangsvolumens der flüssigen Phase durch Eindampfen unter Vakuum, wonach man das Vorkonzentrat mit einem gleichen Volumen destilliertem Wasser verdunnt. Man eliminiert das Lösungsmittel durch Destillation bei 68 bis 70ºC, man homogenisiert die erhaltene Emulsion, dann friert man sie bei -40ºC ein und lyophilisiert dieselbe. So erhält man 3,32 kg an TL aus Rinderhin in der Form eines geruchlosen, hygroskopischen, beigen Pulvers der Zusammensetzung:
Cholesterin 25 - 27 %
CL 73 - 75 %
davon PL 50 - 53 %
GL 20 - 23 %
davon neutrale GL und Sulfatide 15 - 18 %
Ganglioside 1,5 - 1,8 %

10.2 Variante der Abtrennung der CL und der NL aus Rindehirn

Man verfährt wie unter 10.1 oben, bei der Behandlung von 8 kg pulverförmigen Rinderhirns, bis zum Vor-Einengen der flüssigen Phase. Das Konzentrat in Hexan enthält 3,3 kg TL. Man erzeugt eine Feindispersion durch Beschällung, dann führt man die Dispersion durch eine ännliche Säule wie jene, die im Beispiel 1, Absatz 3 beschrieben ist, und welche mit 3,3 bis 3,5 kg Silikagel beladen ist. Man eluiert anschließend die CL von der Säule mit 20 bis 25 l Hexan, dann unterwirft man das Eluat einem Vor-Einengen bis auf 12 bis 15 % seines Anfangsgewichtes durch Verdampfen des Hexans unter Vakuum. Nach Verdünnung mit dem gleichen Gewicht an Wasser behandelt man die Emulsion wie unter 10.1 oben, was zu 2,45 kg an CL führt, welche enthalten:
PL 70 - 73 %
GL 25 - 28 %
davon neutrale GL und Sulfatide 20 - 25 %
Ganglioside 2 - 3 %
Zum Desorbieren der NL von der Säule benützt man 2 Bettvolumenanteile eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von 2:1, wonach man das Eluat durch Eindampfen unter Vakuum bis auf 5 % von dessen Eigengewicht zu Beginn einengt. Nach einem Verdünnen mit 5 l Hexan engt man die Lösung der NL bis zur Trockne ein, und man erhält 0,88 g eines gelben Pulvers, welches zu mehr als 95 % aus Cholesterin besteht.

Beispiel 11

11.1 Variante der Abtrennung der CL aus Buttermilch

Man befreit süße Buttermilch von Casein und Lactose durch Diafiltration, wonach man sie durch Versprühen trocknet.
Das so erhaltene Buttermilchpulver hat die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit (nach 2 h im Trockenofen bei 102ºC) 3,22 %
Gesamtfeststoffe 96.78 %
davon Gesamtlipide (Mojonnier-Methode) 61,24%
Proteine (N x 6,38) 32,43 %
Lactose (enzymatisch bestimmt) 1,24 %
Asche 1,87 %
Man homogenisiert 100 g dieses Pulvers zweimal, und zwar jedesmal mit 500 ml eines Gemisches aus Hexan und Methanol im Volumenverhältnis von 94:6 während 1 min bei 50ºC in einer Kolloidmühle. Jedesmal zentrifugiert man das Homogenisat während 2 min bei 1.500 x g.
Anschließend engt man den Überstand bis zur Trockne unter Vakuum bei 65ºC ein, und man erhält so 65,2g an TL, welche wegen ihres hohen Prozentsatzes an Butteröl (70 bis 75 %) flüssig bleiben.
Man kühlt die TL auf 40ºC ab, man homogenisiert sie mit dem 1,5-fachen bis 2-fachen ihres Volumens an Aceton (90 bis 130 ml) in einer Kolloidmühle, man läßt sie die Umgebungstemperatur (22 bis 24ºC) erreichen, und dann zentrifugiert man sie während 1 min bei 2.000 x g. Man eliminiert den klaren Überstand, welcher den Großteil der NL und der riechenden Verbindungen enthält. Der gesammelte feste Rückstand enthält die CL. Man löst ihn erneut in Hexan auf, dann engt man ihn durch Eindampfen unter Vakuum ein. Man erhält so 21,7 g eines in Aceton unlöslichen Materials (AIM).
Man suspendiert dieses Material im Dreifachen seines Volumens an Hexan, worauf man daraus die CL (80,6 %) von den NL (19,4 %) durch Adsorptionsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines äquivalenten Volumens an Silikagel (10 bis 11 g) abtrennt.
Man homogenisiert die obigen Buttermilch-CL (17,5 g) im 10-fachen ihres Volumens an destilliertem Wasser, und man lyophilisiert die Emulsion.

11.2 Zweite Variante der Abtrennung der Buttermilch-CL

Man behandelt 7,84 kg eines Buttermilchpulvers der oben unter 11.1 angegebenen Zusammensetzung mit 90 Liter eines Lösungsmittelgemisches aus Hexan und Methanol im Volumensvemältnis von 94:6 unter Rückfluß und unter Rühren. Nach 15 min kühlt man die erhaltene Suspension auf 40ºC ab, dann führt man sie durch ein Mikrofilter, wonach man das Filter mit 10 Litern eines Gemisches aus Hexan und Methanol im Volumensverhältnis von 94:6 wäscht.
Anschließend engt man das Filtrat bis zur Trockne bei 65ºC durch Eindampfen unter Vakuum ein, und man erhält 4,57 kg an TL, welche man auf 40ºC abkühlt, mit dem 2-fachen ihres Volumens an Aceton (10 l) homogenisiert und auf Umgebungstemperatur (22 bis 24ºC) abkühlen läßt.
Nach einem Zentrifugieren während 1 bis 3 min bei 1.500 x g stellt man den klaren Überstand beiseite, welcher den Großteil der NL und der riechenden Verbindungen enthält, man nimmt das in Aceton unlösliche Material (AIM) erneut in 10 Liter Hexan auf, und dann engt man dasselbe bis zur Trockne durch Eindampfen unter Vakuum ein. Man erhält so 1,52 kg AIM.
Man nimmt das AIM erneut in dem 3- bis 4-fachen seines Volumens an Hexan (in 6 bis 7 Litern) auf, worauf man dasselbe durch Adsorptionschromatographie auf Silikagel unter Verwendung von etwa 1 kg des Sorptionsmittels in seine CL (1,16 kg) und in seine NL (0,36 kg) auftrennt. Man samelt das die CL enthaltende Eluat, welches man durch Eindampfen unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockne trocknet. Nach einer Homogenisierung während 5 min bei 40ºC mit dem 9-fachen ihres Volumens an destilliertem Wasser trocknet man die Emulsion durch Lyophilisation.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen von Glykolipiden aus einem Lipidgemisch mit einem Gehalt an komplex gebundenen Lipiden, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel befindliche Gemisch durch ein Borsäuregel auf einem wasserunlöslichen Träger aus vernetztem Polyacrylamid führt, um die Glykolipide selektiv zu adsorbieren, und daß man anschließend die Glykolipide von dem Gel mit Hilfe eines Elutionslösungsmittels desorbiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Lipidgemisch ein Gemisch komplex gebundener Lipide ist, welches nach Abtrennen der neutralen Lipide auf Silikagel erhalten worden ist, und welches von Östrogenen freie Glykolipide und Phospholipide enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Glykolipide über ein Ionenaustauschertharz führt, um die sauren Glykolipide von den nicht-sauren Glykolipiden abzutrennen.

4. Verfahren nach Anspruch 1, daurch gekennzeichnet, daß man die Phospholipide über ein Ionenaustauscherharz führt, um die sauren Phospholipide von den nicht-sauren Phospholipiden abzutrennen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Lipidgemisch aus der Lösungsmittelextraktion von tierischen Geweben, insbesondere von Rinderhin, -thymus oder -knochenmark bzw. -rückenmark, stammt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Lipidgemisch aus der Lösungsmittelextraktion von fetter, von Lactose befreiter Buttermilch stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Buttermilch mit einem polaren Lösungsmittel behandelt, um daraus die neutralen Lipide abzutrennen, welche in Lösung gehen, und daß man anschließend nachdem man den Rückstand zurückgewonnen und das polare Lösungsmittel daraus entfernt hat, denselben mit einem wenig polaren Lösungsmittel behandelt, und daß man, nachdem man dieses wenig polare Lösungsmittel eliminiert hat, das die komplex gebundenen Lipide enthaltende Lipidgemisch durch Adsorptionschromatographie auf Silikagel auftrennt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Buttermilch zuerst mit einem wenig polaren Lösungsmittel behandelt, und daß man, nachdem man den Rückstand abgetrennt hat, die Lösung sammelt, aus der man das Lösungsmittel entfernt, um ein Konzentrat zu erhalten, daß man anschließend das Konzentrat mit einem polaren Lösungsmittel behandelt, daß man dann die unlösliche Fraktion sammelt, daß man daraus das polare Lösungsmittel entfernt, und daß man das die komplex gebundenen Lipide enthaltende Lipidgemisch durch Adsorptionschromatographie auf Silikagel auftrennt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Lipidgemisch aus der Lösungsmittelextraktion von Human-Plazenta oder tierischer Plazenta stammt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Lipidgemisch aus der Lösungsmittelextraktion von Tiergedärmen stammt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Lipidgemisch ein natürliches Sojalecithin ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ganglioside von den anderen Glykolipiden durch Lösungsmittelextraktion der Glykolipide in Gegenwart von Wasser abtrennt, wobei sich die Ganglioside in der wässerigen Phase wiederfinden.