CN110917216A - 一种牛骨髓卵磷脂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛骨髓卵磷脂的制备方法及其应用。该方法对牛骨髓进行前处理后以氯仿为提取溶剂，室温搅拌提取，离心15 min，合并上清液、收集上层氯仿液、浓缩回收氯仿，浓缩物用体积比为1.5倍的氯仿溶解，再加丙酮沉淀、抽滤，沉淀物用丙酮洗涤，加水复溶，冷冻干燥，得牛骨髓粗提卵磷脂，提取率高达8.50%。经检验表明：该卵磷脂具有清除自由基的能力，即抗氧化活性。从动物副产物中寻找新的抗氧化剂是现代医药和食品行业发展的新方向，因此研究牛骨髓卵磷脂及其衍生物的抗氧化作用，为具有抗氧化性的骨髓卵磷脂的开发利用提供依据，并对动物骨髓资源功能因子的开发提供便利。

Description

一种牛骨髓卵磷脂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种牛骨髓卵磷脂的制备方法及其应用。

背景技术

动物骨骼在我国传统医药中具有悠久的应用历史和良好的疗效，并认为具备较高的食用价值。骨骼化学成分主要以胶原蛋白、油脂、矿物质、硫酸软骨素及卵磷脂等为主，具有抗氧化、抗菌、降血压、免疫调节、促进成骨细胞增殖及治疗类风湿、关节炎、骨折疏松等骨科疾病作用。因前期研究主要集中在珍稀濒危动物骨骼，对常见动物骨骼类的关注力度和食药功能因子开发程度不足，并对骨髓和骨质部分未进行针对性的研究，导致了资源的浪费。

随着现代畜牧业养殖规模的扩大，羊、牛、马及骆驼等大中型家畜动物的副产物、骨骼、内脏器官等资源储藏量增加。生物工程技术与生化药物科学的发展要求研究者们对该类资源的研究与应用不能仅停留在粗加工的水平上，而是要在骨骼深加工制品规模化生产方面有所发展。骨骼约占动物体重的20-30％，可利用资源十分丰富。其中骨髓是骨骼和造血基质的精华，含有蛋白质、脂肪、矿物质、胶原蛋白、软骨素、维生素及卵磷脂等活性物质，对人体有滋补和药理作用，具有补充骨髓、增血、延缓衰老、延年益寿的保健作用。骨骼中虽然含有多种活性成分，这些活性成分具有多种功效，但由于缺乏技术和知识，往往被浪费或加工成附加值极低的产品。之所以骨髓具有很高的药用价值，是因为它富含蛋白质、矿物质(Ca、P、Fe、Zn、Cu等)、硫酸软骨素和卵磷脂等成分。有关牛骨髓化学成分的提取分离和结构鉴定及其相关的药理学研究尚处于初始阶段，尤其是卵磷脂等化合物。

卵磷脂是广泛存在于动植物细胞中的一种重要磷脂。动物体内的卵磷脂主要分布在心、肝、脑、肾、骨髓和卵等组织部位，其类型与人体所需卵磷脂类型最接近，人体易于吸收。磷脂因有多重生物活性(改善心脑血管疾病、健脑、改善和调节脂肪代谢、美容养颜等)受到研究者的青睐，因此开发牛骨髓卵磷脂产品具有较好的前景。

大量研究发现卵磷脂具有抗氧化作用，同时人体所需要的P元素不仅由卵磷脂提供，而且还是必需脂肪酸和胆碱的来源，是磷脂中起营养保健作用的主要成分。卵磷脂是蛋白质和维生素之外的“第三种营养素”。它还担负着细胞的营养代谢、能量代谢和信息传递功能，是生命和健康所必需的物质。在我国卵磷脂被广泛应用于食品、医药、保健品、化妆品中。卵磷脂除了具有抗氧化、抗衰老等功效外，在一些疾病的预防和治疗中也发挥着关键作用。然而，目前市场上使用的大多数是植物来源卵磷脂，尤其是大豆卵磷脂，但大豆卵磷脂具有纯度低、市场卵磷脂供不应求。动物来源的卵磷脂不仅可以丰富市售卵磷脂的种类，还能提高农产品的附加值，带来可观的经济效益。我国对动物卵磷脂的研究仍然处于起步阶段，关于动物卵磷脂的功效作用、提取和分析方法的研究都还不够成熟，这严重限制了动物源卵磷脂的发展。

磷脂提取时，原料不同所采用的提取方法也不同。目前，磷脂提取常用的方法有溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶提取法、固相萃取法等。

(1)溶剂提取法：溶剂提取法是根据在特定溶剂中卵磷脂与其他组分溶解度不同而达到分离提取的目的，是目前国内外学者研究卵磷脂常用的提取方法。该法的关键是找到一个合理的溶剂系统，该溶剂系统满足对卵磷脂具有良好的选择性和溶解性。常用的溶剂有氯仿、乙酸、正己烷及一些低级醇。溶剂提取法制备磷脂具有生产能力强、生产周期短、便于连续操作等优点。

(2)超声波辅助提取法：超声波辅助提取是充分利用超声波辐射压强产生的强烈扰动效应、高加速度、击碎和搅拌作用等效应，使物质分子运动频率和速度增大，增加溶剂穿透力，从而使目标成分进入溶剂的速度加快，促进提取的进行。

(3)微波辅助提取法：微波辅助提取法是指用微波能对与样品相接触的溶剂加热，使磷脂从样品基体中分离出来并进入溶剂，是在传统萃取工艺的基础上强化传热、传质的一个过程。

(4)酶法提取：酶法提取磷脂包括酶水解法和酶催化精致法两种。酶水解法是利用酶的水解作用，使与脂质结合的糖类和蛋白类物质水解，从而使脂质释放出来，提高卵磷脂的得率。该法的主要优势在于在提取磷脂的同时还可能会获取一些具有生物活性的水解蛋白，并且该法无溶剂残留现象，对环境无污染。酶催化精致法是在粗磷脂中利用磷脂酶磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺等转化成卵磷脂，从而大大提高卵磷脂的产量。该法的优势在于可以提高有效成分的纯度。

新疆动植物资源丰富，畜牧业发达，牛是其中资源最为丰富的畜产。以牛骨髓作为生产原料，与现代生物技术相结合进行生物制药，可变废为宝，将新疆得天独厚的生物资源转化为产业优势。因此寻找一种能快速、有效提取牛骨髓卵磷脂的方法具有重要的意义。因此对牛骨髓中具有生物活性的卵磷脂成分进行提取分离优化研究很有必要，通过优化找到一种能够付诸于工业化生产的有效方法，不仅推动动物卵磷脂的发展，也能提高动物副产品的价值。本研究将为动物骨髓抗氧化活性卵磷脂的开发利用提供依据，具有重要的现实意义。

卵磷脂是蛋白质和维生素之外的第三种营养素，担负着细胞的营养代谢、能量代谢和信息传递功能，是生命和健康所必需的物质，还具有抗氧化，自由基有清除能力等活性。

发明内容

本发明目的在于，提供一种牛骨髓卵磷脂的制备方法及其应用，该方法以牛骨髓为原料，将牛骨髓经粉碎处理后加入氯仿，混匀，室温搅拌提取，离心，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿，将浓缩物用体积比为1.5倍的氯仿复溶，再加入丙酮沉淀，抽滤，沉淀用丙酮洗涤，加水复溶，冷冻干燥，即得牛骨髓卵磷脂。通过本发明所述方法卵磷脂提取率高达8.5％，具有营养保健作用，该方法缩短提取时间，提高提取效率，且操作简单，所获得的牛骨髓卵磷脂在制备抗氧化活性的药物中的用途。

本发明所述的一种牛骨髓卵磷脂的制备方法，按下列步骤进行：

a、取4份牛骨髓粉末，每份20g，分别按w/v 1:2、1:4、1:6、1:8的料液比加入氯仿，室温提取2次，每次2h，得到提取液；

b、将步骤a得到的提取液以4000r/min的转速离心15min，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿；

c、将步骤b得到的浓缩物加入1.5倍体积的氯仿复溶，再加入4倍体积的丙酮沉淀，静置12h，抽滤，沉淀，用丙酮洗涤3次，加水复溶，冷冻干燥，得到牛骨髓卵磷脂。

所述方法获得的牛骨髓卵磷脂在制备抗氧化活性的药物中的用途。

通过本发明所述方法得到的牛骨髓卵磷脂纯度高、生物活性强，而且提取方法简单可行，提取全程在室温环境下操作，更好的保留了卵磷脂的活性成分，可应用于抗氧化生物活性药物的制备。

附图说明

图1为本发明料液比对牛骨髓卵磷脂提取率的影响；

图2为本发明牛骨髓卵磷脂提取物的红外吸收光谱图，其中A为1:2；

图3为本发明牛骨髓卵磷脂提取物的红外吸收光谱图，其中B.1:4；

图4为本发明牛骨髓卵磷脂提取物的红外吸收光谱图，其中C.1:6；

图5为本发明牛骨髓卵磷脂提取物的红外吸收光谱图，其中D.1:8；

图6为本发明牛骨髓卵磷脂1:2的2000及5000放大倍数下的SEM图；

图7为本发明牛骨髓卵磷脂1:4的2000及5000放大倍数下的SEM图；

图8为本发明牛骨髓卵磷脂1:6的2000及5000放大倍数下的SEM图；

图9为本发明牛骨髓卵磷脂1:8的2000及5000放大倍数下的SEM图；

图10为本发明牛骨髓卵磷脂对DPPH自由基的清除能力图。

具体实施方式

实施例1

a、取4份牛骨髓粉末，每份20g，按w/v 1:2料液比加入氯仿，室温提取2次，每次2h，得到提取液；

b、将步骤a得到的提取液以4000r/min的转速离心15min，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿；

c、将步骤b得到的浓缩物加入1.5倍体积的氯仿复溶，再加入4倍体积的丙酮沉淀，静置12h，抽滤，沉淀，用丙酮洗涤3次，加水复溶，冷冻干燥，得到牛骨髓卵磷脂。

实施例2

a、取4份牛骨髓粉末，每份20g，按w/v1:4的料液比加入氯仿，室温提取2次，每次2h，得到提取液；

b、将步骤a得到的提取液以4000r/min的转速离心15min，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿；

c、将步骤b得到的浓缩物加入1.5倍体积的氯仿复溶，再加入4倍体积的丙酮沉淀，静置12h，抽滤，沉淀，用丙酮洗涤3次，加水复溶，冷冻干燥，得到牛骨髓卵磷脂。

实施例3

a、取4份牛骨髓粉末，每份20g，按w/v 1:6的料液比加入氯仿，室温提取2次，每次2h，得到提取液；

b、将步骤a得到的提取液以4000r/min的转速离心15min，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿；

c、将步骤b得到的浓缩物加入1.5倍体积的氯仿复溶，再加入4倍体积的丙酮沉淀，静置12h，抽滤，沉淀，用丙酮洗涤3次，加水复溶，冷冻干燥，得到牛骨髓卵磷脂。

实施例4

a、取4份牛骨髓粉末，每份20g，按w/v 1:8的料液比加入氯仿，室温提取2次，每次2h，得到提取液；

b、将步骤a得到的提取液以4000r/min的转速离心15min，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿；

c、将步骤b得到的浓缩物加入1.5倍体积的氯仿复溶，再加入4倍体积的丙酮沉淀，静置12h，抽滤，沉淀，用丙酮洗涤3次，加水复溶，冷冻干燥，得到牛骨髓卵磷脂。

实施例5

甲酯化及GC/MS分析

将实施例1-4制备的任意一种牛骨髓卵磷脂经甲酯化后进行气质联用色谱分析，共鉴定出19种脂肪酸成分；各组分采用峰面积归一化法进行定量分析，结果显示牛骨髓卵磷脂以饱和脂肪酸为主，含量高达90.1％，饱和脂肪酸中主要成分为16-甲基十七烷酸(42.78％)；不饱和脂肪酸含量为9.35％，以(Z)-9-十八碳烯酸(5.01％)为主表1；

表1牛骨髓卵磷脂脂肪酸组成及相对含量

实施例6

将实施例1-4的4种不同料液比提取的卵磷脂在4000-500cm^-1范围内进行了红外光谱分析和研究(图2)；4种卵磷脂均在3440cm^-1附近有O-H伸缩振动；2920cm^-1附近有C-H伸缩振动特征峰；1746cm^-1附近的是C＝O伸缩振动特征峰；1465cm^-1和1380cm^-1为亚甲基的弯曲振动峰。1037cm^-1和1172cm^-1为C-O伸缩振动峰；在722cm^-1处有碳链骨架振动峰；各个部位红外特征吸收峰峰位分配结果如表2所示；通过图谱分析得到卵磷脂的各种特征基团，它们的红外吸收光谱基本相似，出现的特征峰数、峰形和峰的振动频率都基本相同，说明卵磷脂的主要成分是基本相同的；

表2牛骨髓卵磷脂红外光谱峰位分配

实施例7

用扫描电子显微镜(SEM)对实施例1-4任意一种牛骨髓卵磷脂表面结构进行研究：4种料液比制备的牛骨髓卵磷脂在2000及5000放大倍数下的SEM图如图3所示；1:2和1:4料液比制备的牛骨髓卵磷脂呈长条状结构，而1:6料液比制备的以片状为主，表面均较光滑，1:8料液比制备的是条块状结构，由此可得：提取时不同的料液比将会影响牛骨髓油卵磷脂的微观结构，导致不同的微观形态。

实施例8

牛骨髓卵磷脂抗氧化活性：

DPPH·自由基清除能力实验：

准确配制浓度为5mg/mL的卵磷脂提取液，称取7.8864mg DPPH粉末，充分溶于甲醇中，定容于100mL的容量瓶中，其浓度为0.2mmol/L，吸取四种提取比例1:2、1:4、1:6和1:8的样品溶液各1mL于具塞试管中，各加入1mL配制好的DPPH-甲醇溶液，摇匀，室温下避光保存30min，以蒸馏水作为参比，在517nm处测定吸光度；用1mL蒸馏水代替样品溶液作为空白组，用1mL甲醇代替DPPH-甲醇溶液作为对照组；牛骨髓油卵磷脂样品对DPPH自由基的清除率按下式计算：

式中，A₀是空白组吸光度；A_i是样品组吸光度；A_j是对照组吸光度；

本发明涉及的牛骨髓卵磷脂体外抗氧化活性分析表明：当浓度为5mg/mL时，1:2、1:4、1:6、1:8料液比提取的牛骨髓卵磷脂清除DPPH自由基能力分别为17.18％、26.22％、20.19％、15.47％、其中1:4比例所得牛骨髓油卵磷脂清除DPPH自由基能力最强；因此该卵磷脂可以当成一个潜在的抗氧化剂，在食品、医药及保健品领域有广阔的应用前景。本发明可为牛骨髓卵磷脂在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。

Claims (2)

1.一种牛骨髓卵磷脂的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、取4份牛骨髓粉末，每份20g，分别按w/v 1:2、1:4、1:6、1:8的料液比加入氯仿，室温提取2次，每次2h，得到提取液；

b、将步骤a得到的提取液以4000 r/min的转速离心15 min，合并上清液，收集上层氯仿液，浓缩，回收氯仿；

c、将步骤b得到的浓缩物加入1.5倍体积的氯仿复溶，再加入4倍体积的丙酮沉淀，静置12h，抽滤，沉淀，用丙酮洗涤3次，加水复溶，冷冻干燥，得到牛骨髓卵磷脂。

2.一种如权利要求1所述方法获得的牛骨髓卵磷脂在制备抗氧化活性的药物中的用途。

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