CN108822959A - 一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集方法和用途 - Google Patents

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CN108822959A CN201810693528.XA CN201810693528A CN108822959A CN 108822959 A CN108822959 A CN 108822959A CN 201810693528 A CN201810693528 A CN 201810693528A CN 108822959 A CN108822959 A CN 108822959A
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Abstract

本发明提供了一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集方法和用途，该方法将动物骨髓用蒸馏水清洗，去除血瘀和杂物，在冰箱保存使骨髓硬化成块，利用液氮研磨粉碎，采用正己烷提取，减压回收溶剂，过滤，用氢氧化钾甲醇溶液皂化回流2小时，将不皂化物加盐酸酸化，取油层水洗至中性，脱水，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸，再将混合脂肪酸用尿素包合或冷冻结晶法分别制备，得到骨髓油不饱和脂肪酸，经测试，不饱和脂肪酸含量提高至69.22%，饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸比例1/2.250，抗菌，抗氧化活性明显提高。该方法制备的骨髓油不饱和脂肪酸纯度高，清晰透明，液体状态，生物活性强，可作为制备药物、保健品或化妆品的原料及微胶囊化的重要芯材。

Description

一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集方法和用途
技术领域
本发明涉及一种动物骨髓不饱和脂肪酸的制备方法和用途。
背景技术
动物骨骼由骨膜、骨质及骨髓等部分组成。主要化学成分以蛋白，油脂，矿物质等为主。其中骨髓中含有大量的油脂，一般含油量达到90-95％，可利用资源相当丰富。前期对其蛋白类成分研究较多，蛋白提取完后剩下的油脂或骨髓本身所含的油脂化学成分和生物活性研究尚未深入，作用机制和构效关系不明，导致资源二次利用率低，副产物-骨髓资源仍然未能充分利用。
新疆是我国传统的五大牧区之一，拥有极其丰富的牧业资源。具有多种自然存在和地方多年培育的特色畜牧品种，如巴什拜羊、多浪羊、新疆褐牛、伊犁马、疆驴、新疆双峰骆驼等。2016年新疆地方羊、牛、马、骆驼等年底头数分别为3406.60万只、408.17万头、89.01万匹、18.15万头；肉总产量分别为500800吨、424800吨、61655吨、8727吨。如果副产物约25％为计算，2016年从其中可获得的副产物的量分别为23324吨、16992吨、2466.2吨、349.08吨。骨骼占在这些副产物中约15％-20％计算，其中羊骨(1166.2-1554.9吨)、牛骨(849.6-1132.8吨)、马骨(123.31-164.41吨)、骆驼骨(17.454-23.272吨)。这是一笔巨大的资源，但这些畜骨大部分往往被废弃掉，是一个极大的浪费。因此寻找一种能快速、有效富集动物骨髓不饱和脂肪酸的方法具有重要的意义。
目前，动物骨骼除了熬汤或应用饲料外，其他开发利用途径仍然不顺。虽然中药民族药领域有所应用，但这对副产物-骨骼资源的综合利用影响不大。现代研究表明，骨中含有许多功能成分，如蛋白质、脂肪、矿物质(如钙、磷、铁等)、骨胶原、粘多糖、生长素、维生素A、维生素B2等，它们都是人体所需的重要营养保健精华。随着动植物脂肪酸活性的不断开发研究，脂肪酸的营养价值、对心脑血管，肿瘤等疾病的预防作用受到普遍关注。骨油在工业上用途颇广，因动物油脂均有其特有的香味，是其它植物油不能代替的品种，同时也大量用于食品加工行业，如油炸方便面，糕点起酥，速冻食品风味香精等，还可以直接加工硬脂酸、油酸、肥皂、润滑剂、日用化妆品、蜡纸和甘油提取、软胶囊等。这些方法未将骨髓和骨头分开，加工中骨髓有效成分容易失活。因此，骨髓油脂的提取和不饱和脂肪酸的制备对骨类资源产业化开发与功能因子有效利用提供新途径。
发明内容
本发明目的在于，提供一种动物骨髓不饱和脂肪酸的制备方法和用途，该方法将动物骨髓用蒸馏水清洗，去除血瘀和杂物，在冰箱存于4-8小时使骨髓硬化成块，利用液氮研磨粉碎，加入正己烷提取，油经回收，过滤，浓缩除去正己烷后，用氢氧化钾甲醇溶液皂化回流2小时，将不皂化物加盐酸酸化，取油层水洗至中性，脱水，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸，再将混合脂肪酸采用尿素或冷冻结晶法，得到骨髓油不饱和脂肪酸，经测试，不饱和脂肪酸含量提高到69.22％，饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸比例1/2.250，抗菌，抗氧化活性明显提高。该方法制备的骨髓油不饱和脂肪酸纯度，清晰透明，液体状态，生物活性强，可作为制备药物、保健品或化妆品的原料及微胶囊化的重要芯材。
本发明所述的一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集方法，按下列步骤进行：
a、取动物骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4个小时，使骨髓硬化成块，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，将骨髓用蒸馏水清洗3-5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于4-8个小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末包在滤纸筒或布筒里，放入抽提筒内，在抽提筒上加入5倍量的正己烷、石油醚、无水乙醇或无水甲醇后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度70-90℃回流提取8-10小时，得到提取液；
c、将步骤b所得提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体骨髓油；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用7-10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到骨髓油不饱和脂肪酸；
或冷冻结晶法：按体积比1:8将步骤e得到的混合脂肪酸中加入丙酮溶液，置于温度-40℃冷冻24小时，8000pm/r离心，10min，取上清液，在温度40℃旋蒸去除溶剂，得到骨髓油不饱和脂肪酸。
所述方法获得的骨髓油不饱和脂肪酸在制备治疗关节炎，骨折僵硬中的药物外用软膏的用途。
所述方法获得的骨髓油不饱和脂肪酸在制备保健品中的用途。
所述方法获得的骨髓油不饱和脂肪酸在制备化妆品中的用途。
本发明所述的一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集方法，该方法将新鲜动物骨骼预冷4个小时，使骨髓硬化后骨质和骨髓部分分开，收集骨髓部分，用蒸馏水清洗除去血瘀和杂物之后，存于冰箱存于使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末后，在温度80℃条件下置于索氏提取器中加入正己烷回流提取，加入盐酸酸化，收集不皂化物，得到混合脂肪酸，再将混合脂肪酸分别采用尿素或冷冻结晶法，即得到动物骨髓油不饱和脂肪酸；通过对骨髓油不饱和脂肪酸收集率测定，骨髓油不饱和脂肪酸组成测定，抗菌活性测定，抗氧化活性测定，结果表明：所获得的不饱和脂肪酸收集率达到86.91％，含量达到69.22％，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例达到1/2.250，清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼能力74.81％，清除羟基自由能力72.88％，对白色念球菌和大肠杆菌抑制作用较强。该方法得到的骨髓油不饱和脂肪酸纯度较高，生物活性好，而且制备方法简单可行，饱和后活性增强，变为油状状态。可应用于作为药物、保健品或化妆品的原料及微胶囊的芯材。
本发明所述的一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的制备方法，以动物屠宰或日用消费废弃的骨髓资源为原料，以出油率为目标通过不同溶剂，即石油醚，甲醇，正己烷，乙醇制备动物骨髓油，提高了制备的油得率。利用液氮粉碎骨髓原料的方法，可以更好的保存骨髓的活性成分，同时使原料粉碎的更加完全，有利于加快有效成分的溶出速率。根据骨髓组织经常带红细胞等组织和有些血迹，清晰3-5次，除去杂物，提高了骨髓脂肪酸提取制备过程的准确性。参阅其他动物油不饱和脂肪酸富集的方法，最终确定了尿素包合和丙酮冷冻结晶法。本发明所述的技术与其他分子蒸馏，氯化银饱和，超临界CO2等方法，以及其他动物油脂不饱和脂肪酸制备方法相比，操作简单可控，对高级仪器设备要求不高，实验成本较低。
以不饱和脂肪酸含量，活性为前提，采用气象色谱法分析，以已知的骨髓油脂肪酸组成与比例作为参照，选择最佳富集方法。
本发明所述的一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的制备方法，将所制备的骨髓油，骨髓油不饱和脂肪酸进行常规测定，包括脂肪酸组成与含量测定，对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清楚活性。通过本发明所述方法获得的不饱和脂肪酸中，集率达到86.91％，含量达到69.22％，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例达到1/2.250，清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼能力74.81％，清除羟基自由能力72.88％，对白色念球菌和大肠杆菌抑制作用较强。
通过本发明的富集方法得到的不饱和脂肪酸收率较好，含量较高，生物活性强，而且提取、富集方法简单可行，骨髓资源有效利用提供依据，可用于作为优级食用油，食药原料，尤其是软胶囊芯材中原料。
附图说明
图1为本发明工艺流程图；
图2为本发明羊骨髓油总离子图谱；
图3为本发明羊骨髓油尿素包合总离子图谱；
图4为本发明羊骨髓油冷冻结晶总离子图谱；
图5为本发明牛骨髓油总离子图谱；
图6为本发明牛骨髓油尿素包合总离子图谱；
图7为本发明牛骨髓油冷冻结晶总离子图谱；
图8为本发明马骨髓油总离子图谱；
图9为本发明马骨髓油尿素包合总离子图谱；
图10为本发明马骨髓油冷冻结晶总离子图谱；
图11为本发明骆驼骨髓油总离子图谱；
图12为本发明骆驼骨髓油尿素包合总离子图谱；
图13为本发明骆驼骨髓油冷冻结晶总离子图谱；
其中尿素包合或冷冻结晶方法主要是骨髓油中棕榈酸、油酸、硬脂酸含量有影响，冷冻结晶法处理后不饱和脂肪酸含量升高率和饱和脂肪酸含量降低率较为明显。
具体实施方式
实施例1
以牛骨髓粉末为原料，用石油醚提取，其中牛骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、马骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物骨骼样品放置于温度-4℃冰箱4小时，使骨髓硬化成块，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗3次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于4小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末100g包在滤纸筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的石油醚后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度70℃回流提取8小时，得到石油醚提取液；
c、将步骤b所得石油醚提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体骨髓油，将所得骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加体积浓度为10％盐酸酸化，取上面油层，再用7倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到牛骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例2
以牛骨髓粉末为原料，用正己烷提取，其中牛骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、马骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物牛骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于8小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到牛骨髓粉末；
b、将步骤a所得牛骨髓粉末100g包在布筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的正己烷后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度90℃回流提取10小时，得到正己烷提取液；
c、将步骤b所得正己烷提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体牛骨髓油，将所得骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得牛骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到牛骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例3
以牛骨髓粉末为原料，用无水乙醇烷提取，其中牛骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、马骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗4次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于6小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末100g包在滤纸筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的无水乙醇后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度90℃回流提取9小时，得到无水乙醇提取液；
c、将步骤b所得无水乙醇提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体牛骨髓油，将所得牛骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得牛骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用8倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到牛骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例4
以牛骨髓粉末为原料，用无水甲醇提取，其中牛骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、马骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于5小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末100g包在布筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的无水甲醇后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度80℃回流提取10小时，得到无水甲醇提取液；
c、将步骤b所得无水甲醇提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体牛骨髓油，将所得牛骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得牛骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用9倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、冷冻结晶法：按体积比1:8将步骤e得到的混合脂肪酸中加入丙酮溶液，置于温度-40℃冷冻24小时，8000pm/r离心，10min，取上清液，在温度40℃旋蒸去除溶剂，得到牛骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例5
以羊骨髓粉末为原料，用无水甲醇提取，其中羊骨髓粉末可以由牛骨髓粉末、马骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物羊骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于8小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到羊骨髓粉末；
b、将步骤a所得羊骨髓粉末100g包在布筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的无水甲醇后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度70℃回流提取8小时，得到正己烷提取液；
c、将步骤b所得无水甲醇提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体羊骨髓油，将所得骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析；并测定所的骨髓油对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清除活性；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得羊骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到羊骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例6
以羊骨髓粉末为原料，用正己烷提取，其中羊骨髓粉末可以由牛骨髓粉末、马骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物羊骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于8小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到羊骨髓粉末；
b、将步骤a所得羊骨髓粉末100g包在布筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的正己烷后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度70℃回流提取8小时，得到正己烷提取液；
c、将步骤b所得正己烷提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体羊骨髓油，将所得骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析；并测定所的骨髓油对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清除活性；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得羊骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、冷冻结晶法：按体积比1:8将步骤e得到的混合脂肪酸中加入丙酮溶液，置于温度-40℃冷冻24小时，8000pm/r离心，10min，取上清液，在温度40℃旋蒸去除溶剂，得到羊骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例7
以马骨髓粉末为原料，用石油醚提取，其中马骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、牛骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物马骨骼样品放置于温度-4℃冰箱4小时，使骨髓硬化成块，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗4次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于4小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到马骨髓粉末；
b、将步骤a所得马骨髓粉末100g包在滤纸筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的石油醚后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度80℃回流提取9小时，得到石油醚提取液；
c、将步骤b所得石油醚提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体骨髓油，将所得骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析，并测定所的马骨髓油对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清除活性；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加体积浓度为10％盐酸酸化，取上面油层，再用7倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到马骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例8
以马骨髓粉末为原料，用正己烷提取，其中马骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、牛骨髓粉末或骆驼骨髓粉末替换；
a、取动物马骨骼样品放置于温度-4℃冰箱4小时，使骨髓硬化成块，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗4次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于4小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到马骨髓粉末；
b、将步骤a所得马骨髓粉末100g包在滤纸筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的正己烷后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度80℃回流提取9小时，得到石油醚提取液；
c、将步骤b所得正己烷提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体骨髓油，将所得骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析，并测定所的马骨髓油对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清除活性；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加体积浓度为10％盐酸酸化，取上面油层，再用7倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、冷冻结晶法：按体积比1:8将步骤e得到的混合脂肪酸中加入丙酮溶液，置于温度-40℃冷冻24小时，8000pm/r离心，10min，取上清液，在温度40℃旋蒸去除溶剂，得到马骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例9
以骆驼骨髓粉末为原料，用无水甲醇提取，其中骆驼骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、牛骨髓粉末或马骨髓粉末替换；
a、取动物骆驼骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于5小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末100g包在布筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的无水甲醇后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度90℃回流提取8小时，得到无水甲醇提取液；
c、将步骤b所得无水甲醇提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体牛骨髓油，将所得牛骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析，并测定所的马骨髓油对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清除活性；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骆驼骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、冷冻结晶法：按体积比1:8将步骤e得到的混合脂肪酸中加入丙酮溶液，置于温度-40℃冷冻24小时，8000pm/r离心，10min，取上清液，在温度40℃旋蒸去除溶剂，得到骆驼骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例10
以骆驼骨髓粉末为原料，用正己烷提取，其中骆驼骨髓粉末可以由羊骨髓粉末、牛骨髓粉末或马骨髓粉末替换；
a、取动物骆驼骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4小时，使骨髓硬化成块，骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，用蒸馏水清洗5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于5小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末100g包在布筒里，放入抽提筒内，链接圆底烧杯，抽提筒上面加入5倍量的正己烷后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度90℃回流提取8小时，得到无水甲醇提取液；
c、将步骤b所得正己烷提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体牛骨髓油，将所得牛骨髓油取0.1g,经甲酯化处理后，取1mL溶液，进行气相色谱-质谱联用仪GC-MS分析，并测定所的马骨髓油对白色念球菌，大肠杆菌的抑菌活性，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，羟基自由基清除活性；
d、将5％的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骆驼骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10％盐酸酸化，取上面油层，再用10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到骆驼骨髓油不饱和脂肪酸。
实施例11
将实施例1-10中的不同溶剂提取骨髓油结果对比：4种溶剂提取的脂肪酸中不饱和脂肪酸含量均高于饱和脂肪酸，其中石油醚和正己烷、无水甲醇和无水乙醇提取方法所制备的各类脂肪酸组分和含量较接近，但也有一定差别，见表1；
从饱和度来看，4种溶剂提取的骨髓油脂中饱和脂肪酸含量均40％以上，甲醇提取部位含量最高(45.56％。)；主要以肉豆蔻酸(C14:0)，棕榈酸(C16:0)，软脂酸(C17:0)，硬脂酸(C18:0)为主，其中含量最高的是棕榈酸，其次是硬脂酸；单不饱和脂肪酸总含量均50％以上，含量最高的是石油醚部位(54.64％)；主要以肉豆蔻脑酸(C14:1)，(Z)-十六烯酸(C16:1)，顺-10-十七碳一烯酸(C17:1)，油酸(C18:1)为主，其中油酸(C18:1)含量最高。多不饱和脂肪酸含量均2％以上，主要以亚油酸(C18:2)为主，正己烷部位含量最高(3.9％)，比甲醇部位多1.89倍；甲醇提取部位中高级不饱和脂肪酸种类较多。从饱和与不饱和比例来看，排序为：正己烷>石油醚>无水乙醇>无水甲醇。其中正己烷提取部位不饱和脂肪酸含量较高，故选用正己烷作为骨髓油提取溶剂较好；
表1
注:－表示选定的实验条件下该种脂肪酸含量低于0.01％或者未检出；饱和脂肪酸(SFA)等于C14:0、C 15:0、C16:0、C17:0、C18:0之和；单不饱和脂肪酸(MUFA)等于C16:1、C17:1、C18:1、C 19:1、C20:1、C21:1、C26:1之和；多不饱和脂肪酸(PUFA)等于C18:2、C18:3、C20:2、C20:3、C20:4,C20:5之和；不饱和脂肪酸(UFA)等于MUFA与PUFA之和；
4种骨髓粉末正己烷提取后结果对比：按照溶剂筛选结果，选择正己烷为提取溶剂对4种动物骨髓粉末油进行提取；4种骨髓油SFA/UFA比例高低排序为：马骨髓>羊骨髓>牛骨髓>骆驼骨髓；主要饱和脂肪酸组分以棕榈酸和硬脂酸为主；其含量变幅分别为18.57-31.01％、3.50-20.95％，其中骆驼骨髓棕榈酸含量最高，羊骨髓硬脂酸含量最高。不饱和脂肪酸主要以(Z)-9-十八烯酸为主，含量变幅为40.96-58.69％，其中马骨髓含量最高。除了骆驼骨髓外，其他三种骨髓油不饱和脂肪酸含量均高于饱和脂肪酸。因骆驼骨髓本身质地较硬，导致硬脂酸含量较高，见表2；
表2
注:－表示选定的实验条件下该种脂肪酸含量低于0.01％或者未检出；饱和脂肪酸(SFA)等于C14:0、C 15:0、C16:0、C17:0、C18:0之和；单不饱和脂肪酸(MUFA)等于C16:1、C17:1、C18:1、C 19:1、C20:1、C21:1、C26:1之和；多不饱和脂肪酸(PUFA)等于C18:2、C18:3、C20:2、C20:3、C20:4,C20:5之和；不饱和脂肪酸(UFA)等于MUFA与PUFA之和；
4种骨髓油混合脂肪酸经尿素包合后脂肪酸组成与含量结果对比：采用尿素包合法对4种骨髓混合脂肪酸中的不饱和脂肪酸进行富集，4种骨髓混合脂肪酸SFA/UFA比例高低顺序为：马骨髓>羊骨髓>牛骨髓>骆驼骨髓。经尿素处理后棕榈酸、硬脂酸含量有所下降，含量分别为16.81-29.94％、3.09-19.1％；(Z)-9-十八烯酸含量有所提高，变幅为41.18-61.02％，增加率2％，同时出现(Z,E)-9,11-十八碳二烯酸(C18:2)和(Z,Z,Z)-11,14,17-二十碳三烯酸(C20:3)等多不饱和脂肪酸。与其余三种骨髓油相比，经尿素处理后骆驼骨髓中出现一种多不饱和脂肪酸，即：(Z,E)-9,11-十八碳二烯酸。其中马骨髓不饱和脂肪酸含量超过两倍，见表3；
表3
注:－表示选定的实验条件下该种脂肪酸含量低于0.01％或者未检出；饱和脂肪酸(SFA)等于C14:0、C 15:0、C16:0、C17:0、C18:0之和；单不饱和脂肪酸(MUFA)等于C16:1、C17:1、C18:1、C 19:1、C20:1、C21:1、C26:1之和；多不饱和脂肪酸(PUFA)等于C18:2、C18:3、C20:2、C20:3、C20:4,C20:5之和；不饱和脂肪酸(UFA)等于MUFA与PUFA之和；
4种骨髓油混合脂肪酸冷冻结晶后脂肪酸组成与含量结果对比：采用丙酮冷冻结晶法对4种骨髓油混合脂肪酸中的不饱和脂肪酸进行富集。4种骨髓油混合脂肪酸SFA/UFA比例高低顺序为：马骨髓>牛骨髓>羊骨髓>骆驼骨髓；经冷冻结晶处理后棕榈酸含量14.44-26.22％，硬脂酸含量2.80-13.35％，其中硬脂酸含量见效作用较为明显，最高消除率约13％左右。不饱和脂肪酸含量52.34-68.92％,增加率7-10％，其中(Z)-9-十八烯酸(C18:1)含量达47.12-66.01％。冷冻结晶后，与之前的尿素包合等结果相比，骆驼骨髓油SFA/UFA比例发生显著变化，即：不饱和脂肪含量大于饱和脂肪酸，富集效果比尿素处理法有优势。这表明冷冻结晶法能够有效地富集不饱和脂肪酸，见表4；
表4
注:－表示选定的实验条件下该种脂肪酸含量低于0.01％或者未检出；饱和脂肪酸(SFA)等于C14:0、C 15:0、C16:0、C17:0、C18:0之和；单不饱和脂肪酸(MUFA)等于C16:1、C17:1、C18:1、C 19:1、C20:1、C21:1、C26:1之和；多不饱和脂肪酸(PUFA)等于C18:2、C18:3、C20:2、C20:3、C20:4,C20:5之和；不饱和脂肪酸(UFA)等于MUFA与PUFA之和；
表5、表6分别为4种骨髓油、经尿素包合及冷冻结晶后对DPPH和羟自由基有清除作用结果对比，4种骨髓油清除DPPH能力变幅为19.23％-57.23％，清除·OH能力变幅为15.12％-51.63％；经尿素包合后清除DPPH·能力变强，增强幅度为14.91％-17.06％；清除·OH能力也随之增强，增强幅度为14.45％-17.61％；经冷冻结晶处理后清除DPPH·能力增强变幅为17.23％-17.58％；清除·OH能力增强变幅为9.99％-21.25％；。总之，4种骨髓经正己烷提取、尿素包合、冷冻结晶方法处理后所得到的脂肪酸均有抗氧化活性，清除DPPH·能力均高于羟自由基的能力。经过富集后能够使其抗氧化活性明显提高，冷冻结晶处理效果最好；
表5
表6.
表7为4种骨髓油、经尿素包合及冷冻结晶后对金黄色葡萄球菌和白色念球菌抑制结果对比：4种骨髓油均对两种供试菌的生长有不同程度的抑制作用，金黄色葡萄球菌抑制作用强于白色念球菌，通过分析，当分子中增加第二个双键时(亚油酸)抗菌活性增强；在顺、反异构体中，顺式脂肪酸抗菌活性强于反式异构体。经富集不饱和脂肪酸后，顺式脂肪酸含量升高，抗菌活性随着增加，值得一提的是骆驼骨髓油经冷冻结晶后抗菌活性显著的比羊、牛骨髓油强，可能与其中(Z,Z,Z)-6,9,12-十八碳三烯酸(C18:3)等多不饱和脂肪酸起作用有关；
表7
注：+.7-8mm；++.9-10mm；+++.11-12mm；++++.13-14mm.
综上所述，上述4种动物骨髓油有较好的抑菌作用，表明具有较好的生物利用价值。
实施例12
抗氧化活性检测：
1)DPPH自由基清除能力：
取骨髓油、尿素包合、冷冻结晶后油1mg，用无水乙醇配成1mg/mL样品溶液；
将所得到的样品溶液取1ml，加0.2mmol/L DPPH乙醇溶液(1mL)，避光反应，517nm处测吸光度，Ai表示；
将所得到的样品溶液取1ml，加1ml无水乙醇溶液，517nm处测吸光度，Aj表示；
DPPH溶液(1ml)+蒸馏水，以等体积的蒸馏水和无水乙醇混合为空白，A0表示，清除率按公式(1)计算：
2)清除羟基自由基(·OH)的能力：
取骨髓油、尿素包合、冷冻结晶后油1mg，用无水乙醇配成1mg/mL样品溶液；
将所得到的样品溶液取1ml,加6mmol/L FeSO4(1mL)+6mmol/L水杨酸(1mL)乙醇溶液+6mmol/L H2O2(1mL)，混匀，在温度37℃水浴中加热30min，510nm处测吸光度，Ai表示；
将所得到的样品溶液(1mL)+6mmol/L FeSO4+6mmol/L水杨酸(1mL)乙醇溶液+蒸馏水(1mL)，Aj表示；
蒸馏水(1mL)+6mmol/L FeSO4+6mmol/L水杨酸(1mL)乙醇溶液，A0表示，清除率按公式(2)计算：
实施例14
抗菌活性检测：
融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的菌液，使试验菌悬液浓为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固；
用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上；
样品浓度为10mg/ml(100mM)；每孔加样品溶液20μl，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录；
评价：
抑菌作用的判断:
抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用。

Claims (4)

1.一种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、取动物骨骼样品放置于温度-4℃冰箱保存4个小时，使骨髓硬化成块，将骨质和骨髓用手持式切割机和刀具分开，收集骨髓，将骨髓用蒸馏水清洗3-5次，除去血瘀和杂物之后，在温度-20℃冰箱存于4-8个小时，使骨髓硬化成块，剪碎，用液氮冷冻粉碎，得到骨髓粉末；
b、将步骤a所得骨髓粉末包在滤纸筒或布筒里，放入抽提筒内，在抽提筒上加入5倍量的正己烷、石油醚、无水乙醇或无水甲醇后链接冷凝管，置于恒温加热器，在温度70-90℃回流提取8-10小时，得到提取液；
c、将步骤b所得提取液，过滤，旋蒸蒸发除去溶剂，得到黄色澄清液体骨髓油；
d、将5%的氢氧化钾甲醇溶液，置于磁力搅拌器均匀溶解后，加入步骤c所得骨髓油中，在温度72℃下皂化回流2小时，得到皂化液；
e、将步骤d所得皂化液置于分液漏斗中，在室温下冷却，加入4倍量的白开水溶解皂化物，再用正己烷萃取不皂化物，再加10%盐酸酸化，取上面油层，再用7-10倍量的开水多次水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后，旋蒸蒸发，得混合脂肪酸；
f、尿素包合法：按体积比1:1.5将步骤e得到的混合脂肪酸加入尿素甲醇混合溶液，置于恒温加热磁力搅拌器回流40min后，冷却到室温，然后在温度-10℃保存24h，减压抽滤，再用无水乙醇冲洗2-3次，将溶液倒入分液漏斗中加入水，取油层，将油层用开水洗至无尿素，溶液透明无色为止，加入无水硫酸钠脱水，旋转蒸发，得到骨髓油不饱和脂肪酸；
或冷冻结晶法：按体积比1:8将步骤e得到的混合脂肪酸中加入丙酮溶液，置于温度-40℃冷冻24小时， 8000pm/r离心，10 min，取上清液，在温度40℃旋蒸去除溶剂，得到骨髓油不饱和脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的方法获得的骨髓油不饱和脂肪酸在制备治疗关节炎，骨折僵硬中的药物外用软膏的用途。
3.根据权利要求1所述的方法获得的骨髓油不饱和脂肪酸在制备保健品中的用途。
4.根据权利要求1所述的方法获得的骨髓油不饱和脂肪酸在制备化妆品中的用途。
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