CN103338659A - 酵母抽提物的提取残渣的利用方法 - Google Patents

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Abstract

获得一种适用于功能性食品或药品等、品质稳定、除去了甾醇配糖体等杂质的葡萄糖神经酰胺组合物。作为其原料，使用有食用经验、安全且容易收购的原料，以低成本来生产葡萄糖神经酰胺组合物。将从圆酵母等提取酵母抽提物后的酵母残渣作为原料，利用醇类等有机溶剂对其进行提取，从而得到含有葡萄糖神经酰胺的组合物。

Description

酵母抽提物的提取残渣的利用方法
技术领域
本发明涉及一种从酵母来源物获得能够在功能性食品、化妆品、药品等中使用的葡萄糖神经酰胺组合物的方法。另外，本发明还涉及一种利用从酵母提取酵母抽提物后的残渣而获得的葡萄糖神经酰胺组合物，以及含有该葡萄糖神经酰胺组合物的食品等。
背景技术
葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide)是鞘糖脂的一种，在由鞘氨醇碱基与脂肪酸以酰胺键结合的神经酰胺骨架上结合有1分子葡萄糖。葡萄糖神经酰胺广泛分布于动植物、微生物中，当被作为补充剂(supplement)等摄取时，有改善肌肤功能、预防大肠癌等效果，因此，近年来作为健康食品、化妆品、药品等的素材而受到关注。
起初，葡萄糖神经酰胺是从牛脑提取的，但自从发生疯牛病(BSE)以来，已改为利用更安全的植物原料。目前，从蒟蒻飞粉、米糠、麦麸、玉米胚芽等各种原料中提取葡萄糖神经酰胺，并以含有神经酰胺的抽提物的形式在市面上出售。但是，当使用上述这些植物原料时，具有如下问题：原料的品质容易因天气、收获后的保存状况而受到影响；可能因收获量变化而引起供应不稳定或价格波动；由于原料中的葡萄糖神经酰胺的含量少，需要大量的原料，因而为收购原料需要花费大量的成本。
在此背景下，本发明对以在品质方面或供给方面更稳定的酵母作为原料来生产葡萄糖神经酰胺的方法进行了研究。作为研究对象，尽管工业生产规模大的面包酵母、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、以及啤酒残渣中的酵母菌体很有潜在价值，但这些酿酒酵母中没有生产葡萄糖神经酰胺的能力。因此，本发明对其他的Saccharomyces属、Zygosaccharomyces(接合酵母)属、Kluyveromyces(克鲁维)属酵母，以及Pseudozyma属、Candida(假丝酵母)属、Pichia(毕赤酵母)属酵母进行了研究，提出了生产葡萄糖神经酰胺的方法。由于上述酵母可在独立的封闭系统中大量生产，所以与植物原料相比更容易进行品质管理或收购原料。
但是，因为酵母的培养需要投入大量的营养源，并且酵母菌体中葡萄糖神经酰胺的含量与植物一样低，所以有生产成本高，并且产生大量工业废弃物的问题。此外，在用以往的生产方法从酵母获得的葡萄糖神经酰胺组合物中，含有很多甾醇配糖体(sterolglycoside)等难以除去的杂质。而且，由于目前市面上出售的含有葡萄糖神经酰胺的抽提物大部分在食品中使用，所以需要使用有食用经验且安全的酵母种类作为原料，因此，利用酵母来生产葡萄糖神经酰胺存在很多困难。
专利文件
专利文件1：日本特开2004-89047号公报
专利文件2：日本特开2005-312372号公报
专利文件3：日本特开2005-187392号公报
专利文件4：日本特开2006-55070号公报
专利文件5：日本特开2008-245067号公报
专利文件6：日本特开2010-22217号公报
专利文件7：日本特开2010-22218号公报
专利文件8：日本特开2002-519070号公报
专利文件9：日本特开2003-221592号公报
发明内容
本发明的目的在于利用有食用经验，安全性高，并且品质、供给、价格稳定的原料来获得品质优异的葡萄糖神经酰胺组合物。此外，本发明的目的还在于以更低的成本、排出更少工业废弃物的方法来获得葡萄糖神经酰胺组合物。
本发明人为了解决使用前述植物原料或酵母原料时的问题而进行了研究。结果发现，以目前的食品用途中大量生产的酵母抽提物的生产过程中产生的提取抽提物后的酵母残渣作为原料、利用有机溶剂从中进行提取而得到的含有葡萄糖神经酰胺的组合物的杂质少，从而作出了本发明。
作为前述酵母抽提物的原料的酵母，从有食用经验、安全性得到认可、并且葡萄糖神经酰胺含量多的观点考虑，优选圆酵母(Candidautilis)。
具体而言，本发明如下：
(1)一种葡萄糖神经酰胺组合物，从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取而得到。
(2)在上述(1)的葡萄糖神经酰胺组合物中，所述酵母是圆酵母。
(3)一种功能性食品，含有从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取的葡萄糖神经酰胺。
(4)一种药品，含有从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取的葡萄糖神经酰胺。
(5)一种葡萄糖神经酰胺组合物的制备方法，利用有机溶剂从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取。
根据本发明，可以从有食用经验且安全性已经得到认可的圆酵母等的残渣得到杂质少且品质高的葡萄糖神经酰胺组合物。特别是，具有甾醇配糖体等杂质少的优点，因为甾醇配糖体在植物原料中含量多且难于除去。
圆酵母的酵母抽提物适合用作调味料，且已大量生产，本发明可有效利用其残渣，因此，在成本、减少废弃物方面也极有优势。此外，与以农作物作为原料的情况不同，供应不稳定、价格波动、品质变化的风险也少。
具体实施方式
本发明所使用的酵母，只要是含有葡萄糖神经酰胺的酵母即可。特别优选俗称为圆酵母(Torula Yeast)的产朊假丝酵母(Candidautilis)。酵母的培养形式采用批次培养或连续培养中的任意一种。培养用的培养基可以由普通的培养基组成。具体而言，碳源有葡萄糖、乙酸、乙醇、甘油、糖蜜、亚硫酸纸浆废液等，氮源有尿素、氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。磷酸、钾、镁源可以是过磷酸钙、磷酸铵、氯化钾、氢氧化钾、硫酸镁、氯化镁等常用的工业原料。此外，添加锌、铜、锰、铁离子等无机盐。此外，还可以添加维生素、氨基酸、核酸关联物等，还可以添加酪蛋白、酵母抽提物、肉类抽提物、蛋白胨等有机物。培养温度为21～37℃，优选为25～34℃，pH值优选为3.0～8.0，尤其优选为3.5～7.0。由于氨基酸或核酸的生产能力会因培养条件不同而有所变化，所以根据酵母抽提物的产品规格来设定培养条件。
在菌体培养后进行抽提物的提取。在本申请中，将提取抽提物后的酵母作为酵母残渣。提取方法没有特别限制，一般而言，可以采用自体消化法、热水提取法、酶提取法、酸或碱提取法，或者可以将上述方法组合使用。
采用自体消化法提取酵母抽提物时，例如，在55℃搅拌4小时。采用酶提取法时，在细胞壁溶解酶或蛋白酶等的作用下进行搅拌提取。采用酸提取法时，通过用硫酸等调整至酸性后进行提取。采用碱提取法时，调整至碱性后进行提取。或者，也可以在自体消化后(例如在55℃搅拌4小时)组合进行酶提取法等。按前述方法进行提取并分离的水溶性馏分(water-soluble fraction)是酵母抽提物，适宜用作调味料。另一方面，分离除去酵母抽提物后的残渣为酵母残渣。
通过如上所述从酵母中提取抽提物，除去菌体中的蛋白质和核酸，同时还除去甾醇配糖体等一部分脂溶性杂质，得到葡萄糖神经酰胺富集的酵母残渣。本申请通过从上述酵母残渣中提取葡萄糖神经酰胺，不用进行特别的处理，可以得到除去了甾醇配糖体等杂质的葡萄糖神经酰胺组合物。需要说明的是，在本申请中，通过薄层层析法(thin-layer chromatography，TLC)对杂质和葡萄糖神经酰胺进行定性分析，通过高效液相色谱-蒸发光散射检测(highperformance liquid chromatography-evaporative lightscattering detection，HPLC-ELSD)进行定量分析。
提取抽提物后，通过离心分离来回收酵母残渣，通过反复进行使残渣悬浮在蒸馏水中和离心分离来进行清洗。还可以根据需要冷冻干燥或热风干燥清洗后的残渣。将得到的酵母残渣作为来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料。
接着，使用前述原料进行葡萄糖神经酰胺的提取。提取的方法没有限制，但优选可作为食品使用的提取方法。具体而言，可通过日本特开2002-281936号公报中记载的方法进行精制。例如，使用有机溶剂从作为原料的酵母残渣中提取。由于在食品中使用，所以有机溶剂优选乙醇、丙酮、己烷，特别优选乙醇。而且，为了提高提取效率，可以在有机溶剂中添加水、表面活性剂等。在提取中使用的溶剂的量优选为原料的1～30倍。
具体而言，例如，使用相对于来自圆酵母的酵母残渣而言2倍量的90～100％乙醇，搅拌1～24小时，由此进行葡萄糖神经酰胺的提取。提取后，将提取液通过离心分离进行回收、浓缩及冷冻干燥或热风干燥，从而得到葡萄糖神经酰胺组合物。
根据需要，也可以对葡萄糖神经酰胺组合物进行进一步精制，由此生产葡萄糖神经酰胺含量高的组合物或葡萄糖神经酰胺。精制方法可以利用已知的方法来进行精制，例如，可以使用硅胶柱或离子交换树脂柱等柱精制等。
由于本发明的葡萄糖神经酰胺组合物、作为其精制物的葡萄糖神经酰胺含量高的组合物以及葡萄糖神经酰胺是从安全性高的酵母提取的，所以可作为健康食品或补充剂等功能性食品、化妆品或药品等来使用。
实施例
以下通过实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
(TLC条件)
作为前处理，将20mg葡萄糖神经酰胺组合物样品溶解在2ml的0.4N KOH EtOH中，在37℃孵育2小时。孵育后加2ml的0.4NHCl EtOH进行中和，离心分离后4μl上清液用于TLC。对于TLC，使用硅胶板(メルク社制的Silicagel60，层厚为0.25m)，以氯仿∶乙醇∶水＝65∶16∶2(体积比)展开。展开后干燥硅胶板，喷雾茴香醛硫酸试液，加热进行显色。
(HPLC-ELSD条件)
作为前处理，将20mg葡萄糖神经酰胺组合物样品溶解在2ml的0.4N KOH EtOH中，在37℃孵育2小时。孵育后加2ml的0.4NHCl EtOH进行中和，过滤除去盐类后用于HPLC。(色谱)柱采用GLサイエンス社制的Inertsil 100A，通过蒸发光散射检测器(島津制的ELSD-LTII)来检测葡萄糖神经酰胺。溶出溶剂采用氯仿和甲醇∶水＝95∶5(体积比)的梯度。(色谱)柱温度为35℃，流速为1ml/min，漂移管温度为40℃，氮气压力为350kPa。
(酵母的培养)
在预先添加了YPD培养基(酵母抽提物1％、聚蛋白胨2％、葡萄糖2％)的三角烧瓶中进行产朊假丝酵母CS7529株(FERMBP-1656)母种培养，然后将其在装有18L培养基的容量为30L的发酵罐中进行1～2％的植菌。培养基的组成为：葡萄糖4％、磷酸一铵0.3％、硫酸铵0.161％、氯化钾0.137％、硫酸镁0.08％、硫酸铜1.6ppm、硫酸铁14ppm、硫酸锰16ppm、硫酸锌14ppm。在pH值为4.0、培养温度为30℃、通气量为1vvm、搅拌速度为600rpm的培养条件下进行培养，添加氨来控制pH值。菌体培养16小时后，回收培养液，通过离心分离来收集菌体，得到180g湿酵母菌体。
(酵母抽提物的提取)
通过对菌体培养后的湿酵母菌体反复进行悬浮在蒸馏水中和离心分离，来清洗湿酵母菌体。可以将清洗后的湿菌体直接再次悬浮在蒸馏水中，但也可以经冷冻干燥或热风干燥成为干菌体后，再悬浮在蒸馏水中，通过调整至以下条件来进行抽提物的提取。
自体消化法：用1N HCl调整到pH值为5.0后，在55℃搅拌4小时
酶提取法：用1N NaOH调整到pH值为7后，在细胞壁溶解酶(天野エンザイム株式会社制的“ツニカ一ゼ”)或蛋白酶的作用下，在55℃搅拌4小时进行提取
酸提取法：用1N硫酸调整pH值为2以下后，在65℃搅拌2分钟进行提取
碱提取法：用2N NaOH调整pH值为13后，在70℃搅拌20分钟进行提取
实施例1(自体消化法)
将按前述方法培养的菌体经清洗得到的圆酵母干菌体60g悬浮在1L蒸馏水中，用1N HCl调整pH值为5.0。在55℃搅拌4小时提取抽提物，然后离心分离回收酵母残渣，接着将酵母残渣在蒸馏水中悬浮并离心分离，重复3次以清洗酵母残渣。接下来，将清洗后的酵母残渣真空干燥，得到干酵母残渣10.9g，将干酵母残渣作为来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料。将所得到的干酵母残渣全部悬浮在其2倍量的90％乙醇中，在60℃搅拌12小时，提取葡萄糖神经酰胺。通过离心分离回收提取液，与用乙醇清洗3次残渣的清洗液混合并浓缩，从而得到抽提物0.6g。将该抽提物作为葡萄糖神经酰胺组合物，通过HPLC-ELSD分析，结果表明其中含有2.0％的葡萄糖神经酰胺。另外，TLC分析发现，仅在Rf值为0.42附近发现葡萄糖神经酰胺的点，并且没有检测到甾醇配糖体杂质。根据上述这些分析结果，来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料中的葡萄糖神经酰胺含量为0.11％。
实施例2(酶提取法)
将菌体培养后清洗并经热风干燥的圆酵母干菌体60g悬浮在1L蒸馏水中，用1N NaOH调整至pH值为7.0后，在55℃、蛋白酶作用4小时提取酵母抽提物。提取后通过离心分离回收酵母残渣，在蒸馏水中悬浮酵母残渣然后进行离心分离，重复3次以清洗酵母残渣。接下来，真空干燥清洗后的酵母残渣，得到干酵母残渣12.8g，将其作为来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料。将所得到的干酵母残渣全部悬浮在其2倍量的90％乙醇中，在60℃搅拌12小时提取葡萄糖神经酰胺。通过离心分离来回收提取液，与用乙醇清洗3次酵母残渣的清洗液混合并浓缩，得到抽提物0.8g。将该抽提物作为含有葡萄糖神经酰胺的组合物，HPLC-ELSD分析结果表明，其中含有1.6％的葡萄糖神经酰胺。此外，TLC分析发现，仅在Rf值为0.42附近发现葡萄糖神经酰胺的点，并且没有检测到甾醇配糖体杂质。根据这些分析结果，来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料中的葡萄糖神经酰胺含量为0.10％。
实施例3(酸提取法)
将菌体培养后清洗并经热风干燥的圆酵母干菌体60g悬浮在1L蒸馏水中，并用2N硫酸调整至pH值为2.0后，在65℃作用2分钟提取抽提物。提取后通过离心分离回收酵母残渣，在蒸馏水中悬浮酵母残渣并进行离心分离，重复3次以清洗酵母残渣。接下来，将清洗后的酵母残渣真空干燥，得到干酵母残渣11.3g，并将其作为来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料。将所得到的干酵母残渣全部悬浮在其2倍量的90％乙醇中，在60℃搅拌2小时提取葡萄糖神经酰胺。通过离心分离来回收提取液，与用乙醇清洗3次酵母残渣的清洗液混合并浓缩，得到抽提物0.6g。将该抽提物作为含有葡萄糖神经酰胺的组合物，通过HPLC-ELSD分析发现其中含有1.9％的葡萄糖神经酰胺。此外，TLC的分析结果表明仅在Rf值为0.42附近发现葡萄糖神经酰胺的点，并且没有检测到甾醇配糖体杂质。根据这些分析结果，原料中的葡萄糖神经酰胺含量为0.10％。
实施例4(碱提取法)
将菌体培养后清洗并经热风干燥的圆酵母干菌体60g悬浮在1L蒸馏水中，并用2N NaOH调整pH值为13.0后，在70℃作用30分钟提取抽提物。提取后通过离心分离来回收酵母残渣，在蒸馏水中悬浮酵母残渣然后进行离心分离，重复3次以清洗酵母残渣。接下来，将清洗后的酵母残渣真空干燥，得到干酵母残渣12.3g，将其作为来自圆酵母的葡萄糖神经酰胺原料。将所得到的干酵母残渣全部悬浮在其2倍量的90％乙醇中，在60℃搅拌12小时提取葡萄糖神经酰胺。通过离心分离来回收提取液，与用乙醇清洗3次酵母残渣的清洗液混合并浓缩，得到抽提物0.7g。将该抽提物作为含葡萄糖神经酰胺的组合物，通过HPLC-ELSD分析发现，其中含有2.1％的葡萄糖神经酰胺。此外，TLC的分析结果表明仅在Rf值为0.42附近发现葡萄糖神经酰胺的点，且没有检测到甾醇配糖体杂质。根据这些分析结果，原料中的葡萄糖神经酰胺含量为0.12％。
比较例1
将菌体培养后清洗并经热风干燥的圆酵母干菌体20g悬浮在其2倍量的90％乙醇中，在60℃搅拌10小时提取葡萄糖神经酰胺。通过离心分离来回收提取液，与用乙醇清洗3次固体成分的清洗液混合并浓缩，得到抽提物0.9g，将其作为葡萄糖神经酰胺组合物。通过HPLC-ELSD分析发现，含有1.4％的葡萄糖神经酰胺。此外，TLC的分析结果表明，在Rf值为0.42附近发现葡萄糖神经酰胺的点，此外，在Rf值为0.48附近发现杂质甾醇配糖体的点，并且还检测到其他脂质的点。根据这些分析结果，作为原料的圆酵母菌体中的葡萄糖神经酰胺含量为0.06％。
产业可利用性
本发明所得到的葡萄糖神经酰胺组合物杂质少，可直接或进一步精制后作为功能性食品或化妆品的素材来使用。此外，将来如果确定了其药效，也可以将其作为药品的原料使用。

Claims (5)

1.一种葡萄糖神经酰胺组合物，从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取而得到。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖神经酰胺组合物，其特征在于，所述酵母是圆酵母。
3.一种功能性食品，含有从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取的葡萄糖神经酰胺。
4.一种药品，含有从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取的葡萄糖神经酰胺。
5.一种葡萄糖神经酰胺组合物的制备方法，利用有机溶剂从提取酵母抽提物后的酵母残渣中提取。
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